Разработка белкового препарата из клеток костного мозга сибирской косули и изучение его влияния на иммунореактивность животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Федоренко, Татьяна Валериевна

• Федоренко, Татьяна Валериевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Федоренко, Татьяна Валериевна

2.2 Результаты исследований..................................................................... 49

2.2.1 Цитологический состав костного мозга сельскохозяйственных

и диких животных разного возраста.................................................... 49

2.2.2 Иммунобиологический состав костного мозга сельскохозяйственных и диких животных разного возраста.......... 56

2.2.3 Способ выделения белков из клеток костного мозга сельскохозяйственных и диких животных.......................................... 62

2.2.4 Технология получения препарата из клеток костного мозга сибирской косули (ПКМК)................................................................... 66

2.2.4.1 Определение стерильности ПКМК....................................... 68

2.2.4.2 Определение безвредности и оптимальной дозы ПКМК ... 69

2.2.5 Показатели интенсивности эпизоотического процесса в г. Благовещенске Амурской области.......................................... 75

2.2.6 Влияние ПКМК на показатели клеточного иммунитета собак.. 83

2.2.7 Влияние ПКМК на показатели гуморального иммунитета

собак ........................................................................................................ 89

2.2.8 Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов при применении ПКМК у собак................................................... 94

2.2.9 Экономическая эффективность применения биологически активных препаратов из клеток костного мозга.......................... 99

2.2.9.1 Эффективность применения препаратов из клеток костного мозга различных видов животных на лабораторных животных...................................................................... 100

2.2.9.2 Эффективность применения ПКМК в период специфической профилактики собак.................................... 102

2.2.9.3 Экономический ущерб, причиняемый инфекционными болезнями собак в г. Благовещенске.................................... 104

2.2.9.4 Эффективность специфической вакцинопрофилактики с использованием ПКМК..................................................... 106

2.2.9.5 Экономическая эффективность применения ПКМК......... 109

3 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.................... 110

4 ВЫВОДЫ И ПРЕДЛОЖЕНИЯ......................................................... 127

5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.................................................. 129

6 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................ 130

7 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА..................... 147

8 ПРИЛОЖЕНИЯ............................................................... 152

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка белкового препарата из клеток костного мозга сибирской косули и изучение его влияния на иммунореактивность животных»

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Иммунная система является индикатором физиологического состояния организма, она чутко реагирует на изменения условий окружающей среды (В.А. Мищенко с соавт., 2006). Нарушение технологии кормления и содержания, неудовлетворительная экологическая ситуация, воздействие других стрессоров на животных сопровождаются угнетением иммунной системы, снижением естественной резистентности организма и эффективности специфической профилактики различных болезней (А.Г. Шахов и др., 2006). В связи с этим оправдан значительный интерес ученых к разработке и изучению различных средств, способных положительно влиять на функционирование иммунной системы (Г.М. Топурия с соавт., 2011). Одним из вариантов решения столь сложной проблемы является введение в схемы профилактических и противоэпизоотических обработок препаратов, обладающих выраженным иммуностимулирующим эффектом, активизирующих защитные силы организма (А.Г. Хмылов, с соавт., 2006). Большие перспективы имеют иммуномодуляторы эндогенного происхождения, а именно костно-мозговые препараты белковой природы, обладающие стимулирующим действием клеток костного мозга на антителобразование в активную фазу иммунного ответа (В.В. Зарицкая и др., 2008). Несмотря на значительное количество данных препаратов, многие вопросы, касающиеся лечения и профилактики иммунодефицитных состояний, остаются нерешенными. Высокая востребованность в препаратах иммунокоррекции дают основание считать актуальным исследования по разработке и изучению иммунокорректирующих препаратов.

Степень разработанности проблемы. В настоящее время учеными разрабатываются и изучаются различные средства и методы, положительно влияющие на иммунную систему организма животных (Н.М. Колычев, 2003; А.А. Аминова, 2006; М.Ю. Волков, 2006; С.Н. Магер, 2014). Они нашли

успешное применение в схеме профилактических и противоэпизоотических мероприятий (Е.В. Крапивина, 2001; Г.М. Топурия 2003; Ю.Н. Федоров, 2013), с целью повышения общей резистентности и иммунного ответа на различные антигены (С.П. Фисенко и др., 2006; А.Г. Хмылов, с соавт., 2006). Изучены наиболее перспективные иммуномодуляторы эндогенного происхождения многих сельскохозяйственных, домашних и некоторых диких животных (Р.В. Петров, 2000; В.В. Зарицкая, 2006; И.П. Савченкова, 2011).

По данным литературы установлено, что препараты костно-мозгового происхождения превосходят другие иммуномодуляторы, однако способы разработки, методы изучения и применения иммуномодуляторов из костномозговых клеток диких животных изучены недостаточно. Таким образом, актуальность, теоретическая и практическая значимость обусловили выбор темы, определили цель, задачи и структуру работы.

Цель исследований: Изучить особенности влияния препаратов костно-мозгового происхождения на иммунореактивность животных.

Задачи исследований. Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить в сравнении клеточный состав костного мозга трубчатых костей сельскохозяйственных и диких животных и выбрать модель для исследования.

2. Разработать способ получения клеточного косно-мозгового препарата белковой природы сельскохозяйственных и диких животных, определить его безвредность на лабораторных животных.

3. Изучить основные показатели интенсивности эпизоотического процесса по инфекционным заболеваниям собак в г. Благовещенске.

4. Изучить влияние препарата белковой природы из клеток костного мозга сибирской косули на иммунореактивность собак в период специфической профилактики и определить его экономическую эффективность.

5. Разработать рекомендации по применению белковых препаратов из клеток костного мозга и внедрить в сочетании с препаратами для специфической профилактики.

Научная новизна работы. Впервые в условиях Амурской области изучен цитологический состав костного мозга сибирской косули в сравнении с сельскохозяйственными животными. Разработан способ выделения белков из клеток костного мозга сельскохозяйственных и диких животных. Разработана технология изготовления биологически активного препарата белковой природы из клеток костного мозга, определены доза и способ его введения, доказана перспектива использования клеток костного мозга в разработке иммунокорректоров. Подтверждено, что белки клеток костного мозга могут быть в основе иммуномодулирующего препарата. Применение белкового препарата из клеток костного мозга сибирской косули (ПКМК) показало положительные изменения показателей клеточного и гуморального иммунитета животных. Введение в схему вакцинопрофилактики ПКМК уменьшало показатели интенсивности эпизоотического процесса и повысило эффективность специфической иммунопрофилактики против инфекционных болезней собак. Доказана эффективность применения костно-мозговых препаратов, которая показывает более высокие результаты применения ПКМК в сравнении с существующими аналогами из костного мозга диких животных и установлена экономическая эффективность его применения.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как усовершенствованный метод окраски биопрепаратов позволяет достоверно изучать клеточный состав костного мозга диких животных. Для получения стимуляторов антигенных популяций целесообразно брать клеточные популяции сибирской косули и коров, содержащие наибольшее количество иммунокомпетентных клеток. Разработанный препарат позволяет повысить иммунореактивность организма животных. Эндогенные белки

клеток костного мозга являются медиаторами и биостимуляторами клеточного и гуморального иммунитета.

Предложен производству способ выделения белков из клеток костного мозга (патент RU 2553 334, от 18 мая 2015г.).

Подготовлены рекомендации по применению белкового препарата из клеток костного мозга (рассмотрены, одобрены к внедрению и рекомендованы к изданию НТС Дальневосточного ГАУ, протокол №4 от 10 декабря 2015года).

Материалы исследований используются при чтении курса лекций по иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО Дальневосточный ГАУ.

Методология и методы исследований. Методология основана на анализе имеющейся информации по изучению иммунодефицитных состояний и способов повышения иммунореактивности с помощью препаратов эндогенного происхождения, представленной в отечественной и зарубежной литературе. Для достижения поставленной цели были изучены состав и структура костного мозга различных видов животных, разработан и запатентован способ выделения белка из клеток костного мозга с.-х. и диких животных, разработана технология изготовления препарата из клеток костного мозга и изучена его стерильность и безвредность на лабораторных животных. Изучены показатели интенсивности эпизоотического процесса в г. Благовещенске. Изучено влияние белкового препарата на показатели клеточного и гуморального иммунитета домашних животных. Изучена фагоцитарная активность нейтрофилов при применении препарата у собак. Определена экономическая эффективность применения ПКМК в схеме специфической вакцинопрофилактики. В работе использованы следующие методы исследований: клинические, биохимические, биотехнологические, иммунологические, микробиологические, эпизоотические, статистические.

Основные положения, вынесенные на защиту.

1. Клеточный состав костного мозга сельскохозяйственных и диких животных в сравнении.

2. Разработанный и оптимизированный метод получения препарата из клеток костного мозга для повышения иммунореактивности животных, его безвредность.

3. Влияние препарата белковой природы из клеток костного мозга на показатели естественной резистентности и иммунной реактивности организма собак в период вакцинации и его экономическая эффективность.

4. Основные показатели интенсивности эпизоотического процесса по инфекционным болезням собак в г. Благовещенске до и после внедрения ПКМК в схему специфической вакцинопрофилактики.

Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов подтверждается большим объемом исследований, проведенных в период с 2011 по 2015 годы, анализом и статистической обработкой полученных результатов исследований, проведенных на базе кафедры ВСЭЭиМ ФВМЗ Дальневосточного ГАУ и ветеринарных клиник городов Благовещенска и Белогорска Амурской области и города Хабаровска.

Основные положения диссертации и результаты эксперимента доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции посвященной 60-летию ФГОУ ВПО Ижевская ГСХА, доктора с.-х. наук, профессора А.И. Любимова (г. Ижевск, ФГОУ ВПО Ижевская ГСХА, 2010); XII региональной научно-практической конференции «Молодежь XXI века: шаг в будущее» (г. Благовещенск, НОУ ВПО МАП, 2011г.); международной научно-практической конференции (г. Саратов, ФГБОУ ВПО Саратовский ГАУ, 2013г.), научно-практической конференции «Проблемы зоотехнии, ветеринарии и биологии» (г. Благовещенск, ФГБОУ ВПО Дальневосточный ГАУ, 2013г., 2015г., 2016г.); международной научно-практической конференции «Проблемы развития современной науки и пути их решения» (г. Екатеринбург, 2015г.).

Публикации. Основные результаты научных исследований отражены в 11 печатных работах, в том числе в 3-х изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 165 страницах компьютерного набора и состоит из следующих разделов: введения, обзора использованной литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, заключения, списка литературы, списка иллюстративного материала и приложений. Работа включает 31 таблицу, 26 рисунков, 10 приложений. Список литературы включает 163 источника, из них 20 иностранных авторов.

Личный вклад автора. Автором самостоятельно проведен анализ источников научной литературы, теоретическое обоснование задачи, решение основных задач исследования, систематизация, обобщение и интерпретация полученных результатов. Экспериментальные исследования проведены автором лично или в составе научных групп при выполнении НИР. Основные положения диссертации, новизна и практическая значимость сформулированы совместно с научным руководителем. Работа является частью плановых научно-исследовательских работ кафедры ветеринарно-санитарной экспертизы, эпизоотологии и микробиологии Дальневосточного ГАУ по теме - Разработка теоретических основ и мер борьбы с инфекционными и инвазионными болезнями животных на Дальнем Востоке, государственная регистрация темы № 01201159348, 2011г.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

МЛЕКОПИТАЮЩИХ

В настоящее время иммунная система рассматривается как система контроля, обеспечивающая индивидуальность и целостность организма (Л. Йегер, 1990). Иммунная система животных сформировалась в процессе эволюции позвоночных и служит для обеспечения защиты организма от чужеродных агентов как экзогенной, так и эндогенной природы (И.Н. Рыбченко, 2011).

С первых шагов становления иммунологии внимание исследователей всегда привлекали сущность иммунной перестройки организма, эффекторные и регуляторные механизмы иммунного ответа (Е.С. Воронин и др., 2002). Иммунная система является индикатором физиологического состояния организма, она чутко реагирует на изменения условий окружающей среды. Нарушение ее функции рассматривают как один из патогенетических механизмов патологического процесса (В.А. Мищенко с соавт., 2006).

Главная задача иммунной системы - разрушение всех чужеродных антигенов независимо от их патогенности (Г.И. Гилязова и др., 2012). В иммунной системе развитых организмов существует множество способов обнаружения и удаления чужеродных агентов. Этот процесс называется иммунным ответом (А.И. Коротяев, 2008).

В свете современных данных ответная физиологическая реакция иммунной системы на влияние «живых тел и веществ, несущих признаки генетической чужеродности (антиген)» осуществляется в форме механизмов неспецифической резистентности (врожденный иммунитет) и адаптивного иммунитета (иммунный ответ на антигены) (В.В. Макаров, 1999; Н.В. Прозоркина, Л.А. Рубашкина, 2013). К неспецифическим (естественным)

факторам резистентности относят конституциональные факторы и фагоцитирующие клетки, обусловленные врожденными биологическими особенностями и передающиеся по наследству (С.Н. Магер, Е.С. Дементьева, 2014). Неспецифическая (естественная) резистентность включает взаимодействие клеток (ЕК-клетки, макрофаги) и гуморальных факторов (система комплемента, IgG). Далее развивается ранний индуцибельный ответ, во время которого взаимодействуют клетки (активированные макрофаги, ЕК-клетки, нейтрофилы) и гуморальные факторы (цитокины, белки острой фазы), разрушаются инфекционные агенты и продукты их разрушения активируют иммунную систему. Факторы неспецифической резистентности и ранний индуцибельный ответ осуществляют защиту организма в первые 96 часов после инфицирования. В это время начинает развиваться приобретенный или адаптивный иммунный ответ, представляющий собой специфический иммунный ответ и более мощный этап защиты организма (Р.М. Хаитов с соавт., 2001).

Установлено, что иммунный ответ характеризуется накоплением в организме не только белков, специфически реагирующих с антигенами, но и иммунокомпетентных клеток - иммунных лимфоцитов (Е.С. Воронин и др., 2002). Лимфоциты являются ключевыми клетками иммунной системы, обеспечивающими реакции иммунитета (А.М. Земсков, В.М. Земсков, 1994).

Связывание чужеродного антигена с лимфоцитом вызывает иммунный ответ, направленный против этого антигена. При этом некоторые из лимфоцитов дифференцируются в клетки памяти, и при вторичном воздействии того же иммуногена иммунный ответ развивается быстрее и сильнее (G. Mayer, 2007; И.Н. Рыбченко, 2011).

Интенсивность иммунного ответа при поступлении в организм антигена в значительной мере определяется генотипом конкретного организма, количеством и свойством антигенов - их антигенность и иммуногенность, а также состояние регуляторных систем организма. Возможна как внутрисистемная регуляция иммунного ответа (за счет

автономной деятельности иммунной системы), так и вовлечение других систем регуляции (нервной и эндокринной) (А.В. Санин, 1988; Н.М. Колычев, с соавт., 2014).

Автономная система иммунорегуляции у млекопитающих формируется в период внутриутробного развития. В саморегуляторной функции иммунной системы участвуют факторы естественной резистентности (нейтрофилы, моноциты, макрофаги, естественные киллеры, интерфероны, комплемент), которые, как правило, работают на ранних этапах защиты, а также клеточные и гуморальные факторы специфической иммунной системы (Т- и В-лимфоциты, антитела и др.). Специфические механизмы защиты могут включаться на более поздних этапах защитных реакций, как бы «запаздывая». В ряде случаев, когда чужеродные экзогенные антигены или патологические аутоантигены (например, опухолевые) полностью устраняются фагоцитами, естественными киллерами, специфический иммунный ответ вообще не развивается (Н.А. Радчук и др., 1991; Н.В. Прозоркина, Л.А. Рубашкина 2013).

Иммунная система является одной из немногих в организме, которые осуществляют свою главную функцию через "работу" отдельных клеток. Для иммунитета этими "рабочими" элементами являются иммунокомпетентные клетки (Б.В. Пинегин, 2000). Количество основных видов клеток насчитывает несколько штук. Зато производных от них клеток более десятка. Все это приводит к большому разнообразию форм, в зависимости от преимущественного места локализации и выполняемых ими функций. Но все они происходят из одной стволовой клетки красного костного мозга. Причем кроме них из этой клетки происходят клетки крови и ее форменные элементы. Тем не менее различия начинают проявляться буквально с первых делений стволовой клетки (Ш.К. Андерсон, 2007).

В первую очередь это касается наличия включений цитоплазмы. И как результат на первых этапах выделяются две группы клеток. Первые содержат эти включения, а вторые нет. Кроме того, ко вторым относятся клетки-

предшественники эритроцитов и тромбоцитов. Этот главный признак различия послужил для разделения всех клеток иммунной системы на гранулоциты и агранулоциты. Соответственно клетки содержащие включения и клетки, не содержащие их (М.Ш. Азаев и др., 2015). К гранулоцитам относят три основных вида, это нейтрофилы, базофилы и эозинофилы. Соответственно в эту группу входят и производные данных клеток. Агранулоцитами считаются моноциты и лимфоциты (М.В. Земсков,1977).

Нейтрофилы ведут свое происхождение из миелоидной клетки, получившейся при делении полипотентной стволовой клетки-предшественника. От миелоидной клетки также происходят все гранулоциты, эритроциты и тромбоциты. Это обстоятельство обуславливает особенности строения мембраны - обладание большей подвижностью, чем у лимфоцитов. Благодаря этому нейтрофилы, выйдя из красного костного мозга в кровь, могут легко проникать через стенку сосуда в ткань (G. Abbas, 2009; В.А. Лозовой в соавт., 1981; М.Д. Уиллард и др., 2004; Г.М. Крюковская и др., 2012).

Нейтрофил на стадии его формирования представляет собой клетку с ядром в форме колбаски. В его цитоплазме находится большое количество мелких гранул, содержащих различные ферменты и химические соединения. Первые необходимы для переваривания поглощенных чужеродных агентов. Вторые - для "сигнализации" другим клеткам иммунной системы и усиления воспаления. После выхода из красного костного мозга, ядро приобретает сегментарную конфигурацию (Ch.A. Janeway, 1994). Кроме того, на мембране находиться большое количество рецепторов, необходимых для "связи" с другими клетками. При обычных состояниях нейтрофилы выходят в кровь очень небольшим количестве. Специфические сигналы, включая интерлейкин-1 или компоненты белков системы комплемента, мобилизуют выход нейтрофилов из костного мозга в не активированном состоянии. Это происходит в очень большом количестве. Затем при встрече с антигеном

клетки становятся активированными. При этом мембрана приобретает способность к большой подвижности (значит способной осуществлять фагоцитоз), а гранулы цитоплазмы с "сигнальными" веществами перемещаются ближе к внутренней поверхности мембраны Levinson, 2008). Они становятся готовы в любую минуту выпустить эти вещества. Такой процесс может происходить как в крови, так и в тканях, куда способны проникнуть эти клетки за счет своей способности влиять на проницаемость сосудистой стенки (Г.Н. Драник, 2003).

Эозинофилы схожи по строению с нейтрофилами. Они также содержат многочисленные включения цитоплазмы, способны к движению в сторону раздражения (в данном случае к месту выделения специальных сигнальных молекул). Однако между ними существуют и значительные различия. Во-первых, эозинофилы отличаются большей продолжительностью жизни и способности к рециркуляции, то есть несколько раз бывать в одном и том же месте организма. При большинстве инфекций эти клетки не проявляют своих основных функций. Однако при паразитарных заболеваниях играют центральную роль в защите организма. Кроме того, повышение содержания данных клеток в крови наблюдается при гиперчувствительности организма. Так же для эозинофилов характерно содержание некоторых химических веществ, способствующих замедлению воспалительной реакции (В.Дж. Риган, 2000).

Базофилы являются наименьшей по численности группой гранулоцитов - всего около 0-2% от их общего числа. Эти клетки отличаются набором химически активных веществ своих цитоплазматических гранул. По большей части эти вещества способствуют поддержанию условий для воспаления. В частности, они способствуют увеличению проницаемости сосудистой стенки капилляров, а значит, косвенно приводят к развитию отека ткани. (М.Р. Сапин, 1996; Н.В. Прозоркина, 2013).

Моноциты не содержат специальных цитоплазменных включений, но имеют хорошо развитую сеть лизосом - пищеварительных вакуолей. В

каждой такой лизосоме содержится несколько видов ферментов. Это необходимо для тщательного переваривания. Причем эти ферменты способны расщеплять все виды биологического субстрата (А.Б. Полетаев, 2007). Моноциты, выйдя из красного костного мозга, циркулируют в крови несколько часов - от 5-10 часов до суток. При этом продолжительность их жизни не более 4-6 дней. Моноциты очень быстро покидают кровеносное русло и мигрируют в различные ткани. Здесь происходит их превращение в макрофаги. Причем для каждого вида тканей существует свой вид макрофага (Р.В. Петров, 1981). Например, в печени моноциты превращаются в Купферовские клетки печени, которые осуществляют захват чужеродных частиц из печеночных протоков воротной вены. В легких моноциты превращаются в альвеолярные макрофаги. Здесь кроме фагоцитирования частиц, они входят в состав аэрогематического барьер. Попав в соединительную ткань, моноциты становятся свободными гистиоцитами (А.Я. Кульберг, 1985). Таким образом, выполняя не только иммунную функцию, но и участвуя в синтезе основного вещества соединительной ткани. В лимфоузлах моноциты превращаются и становятся макрофагами лимфатических узлов. Если иммунокомпетентные клетки оседают на стенки полостей тела, они становятся макрофагами этих полостей. В брюшной полости это перитонеальный макрофаг, меду листками плевры -плевральный. В случае попадания моноцитов в кости, они становятся основными клетками, которые осуществляют резорбцию костной ткани -остеокласты. Часть моноцитов остается в красном костном мозге, где они становятся макрофагами. Причем, они могут быть как свободными, так и фиксированными. Здесь их основная задача заключается в фагоцитировании не нужных клеток. В том, что моноциты могут превращаться в такое разнообразие макрофагов, играют большую роль ростковые факторы, выделяемые клетками тканей (Г.И. Назаренко, 2000; А. Райт с соавт., 2000; М.А. Медведева, 2009).

Основная роль макрофагов заключается в поглощении чужеродных агентов и презентации его антигенов. Данный механизм одинаков для всех видов макрофагов. Вначале происходит фагоцитоз чужеродного тела с формированием полости или фагосомы. После чего к ней приближаются лизосомы и сливаются с этой фагосомой, что приводит к одной пищеварительной вакуоли, в которой происходит расщепление чужеродного агента. При этом антиген не подвергается никакому разрушению, а в полной целостности доставляется на внешнюю сторону мембраны макрофага. Все это необходимо для лимфоцитов, которые, подойдя к макрофагу "записывают" и "запоминают" структуру антигена (В.Н. Кисленко, 2012;Н.П. Казаринов, 2014).

Лимфоциты являются главными клетками приобретенного иммунитета. Группы клеток (В- и Т-лимфоциты) начинают образовываться в красном костном мозге. Затем Т-лимфоциты покидают его и переходят в вилочковую железу, где происходит окончательное развитие данных клеток. В отличие от них В-лимфоциты остаются и "дозревают". Только полностью сформированные клетки покидают красный костный мозг. В-лимфоциты выполняют роль "фабрики" антител (Р.Г. Госманов с соавт., 2013). Для этого они способны запоминать структуру антигена и на основании его строения происходит образование комплиментарных белковых соединений, способных к обезвреживанию, как самого антигена, так и его носителей. В-лимфоциты способны к длительному существованию в течении нескольких лет и десятилетий. Один активированный лимфоцит (правильно его называть плазматической клеткой) способен производить только антитела одного конкретного вида. При созревании Т-лимфоцитов образуется три вида клеток, которые и выполняют иммунные функции (М.Ш. Азаев с соавт., 2015).

Т-хелперы являются своеобразными арбитрами воспалительной реакции и частично всего иммунного ответа. Они при помощи специальных веществ, производимых их синтетическими органеллами, способны влиять

на работу клеток иммунной системы. Все это приводит к усилению иммунного ответа. Т-супрессоры оказывают противоположное действие. Эти клетки способствуют торможению иммунных реакций. Т-киллеры являются главными клетками, которые участвуют в непосредственном уничтожении чужеродных агентов (В.Г. Скопичев, 2009; Р.И. Сепиашвили, 2011).

Специфические механизмы резистентности при инфекционном процессе имеют также большое значение, поскольку у микроорганизмов, как правило, имеется множество разнообразных антигенных детерминант, которые индуцируют поликлональный иммунный ответ. Биологическая особенность возбудителя, а также входные ворота определяют преимущественный характер иммунного ответа - клеточный или гуморальный. В частности, попадание микроорганизмов, размножающихся внеклеточно, как правило, вызывают гуморальный иммунный ответ (Р.М. Хаитов, 2000).

В ответ на антигенную стимуляцию организм животных способен вырабатывать антитела, которые являются специфичными на каждый из бесчисленных антигенов. Антитела, или иммуноглобулины, - это группа структурно родственных белков с характерными физико-химическими и биологическими клетками и секретируются в кровь или тканевые жидкости. Основная часть иммуноглобулинов относится к гамма-глобулиновой фракции сыворотки (Н.Н. Даричева, 2011).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Федоренко, Татьяна Валериевна, 2017 год

Список таблиц

Таблица 1 - Распределение животных по группам, (n=81)..................... 46

Таблица 2 - Схема эксперимента, собаки в возрасте до 6 месяцев

(n=16)................................................................................. 47

Таблица 3 - Эффективность окраски клеток костного мозга различными методами у различных видов животных молодых особей

(n=3)............................................................................................................. 49

Таблица 4 - Эффективность окраски клеток костного мозга различными методами у различных видов животных

средневозрастных особей (n=3)................................................................. 50

Таблица 5 - Особенность окрашивания клеток костного мозга у

косули (молодых особей) по методу Паппенгейма.................................. 51

Таблица 6 - Клеточный состав костного мозга различных видов

животных молодых особей (M±m), n=3.................................................... 53

Таблица 7 -Индексы соотношения между молодыми и зрелыми

формами........................................................................................................ 56

Таблица 8 - Количество общего белка в составе костного мозга у

различных видов животных, молодых особей г/л, (n=3)........................ 57

Таблица 9 - Фракции общего белка в составе костного мозга у

различных видов животных, молодых особей, (n=3)............................. 58

Таблица 10 - Содержание общего белка и его фракций в составе

костного мозга косули в зависимости от возраста (M+m, n=3)............ 60

Таблица 11 - Содержание общего белка и его фракций в составе

костного мозга лося в зависимости от возраста (M+m, n=3)................. 61

Таблица 12 - Морфологические показатели крови у мышей под влиянием белкового препарата из клеток костного мозга сибирской

косули в зависимости от дозы (n=81)................................................. 70

Таблица 13 - Лейкограмма крови подопытных животных (M± m),

(n=81)......................................................................................................... 71

Таблица 14 - Биохимические показатели крови белых мышей до и после введения препарата из костного мозга сибирской косули........... 73

Таблица 15 - Иммунологические показатели крови белых мышей..... 74

Таблица 16 - Удельный вес инфекционных заболеваний, регистрируемых у собак в ветеринарных клиниках г. Благовещенска

за 2012-2014 гг. (по количеству заболевших)................................ 76

Таблица 17 - Заболеваемость собак инфекционными заболеваниями, регистрируемые в ветеринарных клиниках г. Благовещенска за 20122014 гг................................................................................. 78

Таблица 18 - Летальность собак от инфекционных болезней, регистрируемых в ветеринарных клиниках г. Благовещенска за 20122014 гг................................................................................. 79

Таблица 19 - Смертность собак при инфекционных болезнях, регистрируемых в ветеринарных клиниках г. Благовещенска за 20122014 гг................................................................................. 81

Таблица 20 - Эффективность вакцинации собак от инфекционных болезней регистрируемых в ветеринарных клиниках г.

Благовещенска за 2012-2014 гг.................................................. 82

Таблица 21 - Морфологические показатели крови собак под влиянием белкового препарата из клеток костного мозга сибирской

косули в зависимости от дозы, (n=16), (M±m)............................... 85

Таблица 22 - Иммунобиологические показатели крови собак до и после введения препарата из клеток костного мозга сибирской

косули, (n=16), (M±m)............................................................ 90

Таблица 23 - Изменение фагоцитарной активности нейтрофилов у собак при применении биологически активного препарата ПКМК;

(n=8), (M±n)................................................................................................. 94

Таблица 24 - Эффективность применения ПКЛМ и ПКМК(М±т),

(n=6).............................................................................................................. 100

Таблица 25 - Влияние ПКЛМ и ПКМК на показатели гуморального иммунитета, (М± m), (n=6)........................................................................ 101

Таблица 26 - Эффективность применения препарата из клеток

костного мозга у собак в возрасте до 6 месяцев................................. 102

Таблица 27 - Влияние ПКМК на показатели гуморального

иммунитета, (М± т), (п=8)........................................................................ 103

Таблица 28 - Экономический ущерб от инфекционных болезней

собак в г. Благовещенске за 2012 - 2015 годы............................... 105

Таблица 29 - Экономический ущерб от падежа собак от инфекционных болезней собак в г. Благовещенске за 2012 - 2015

годы................................................................................... 106

Таблица 30 - Эффективность вакцинации собак от инфекционных болезней до и после применения ПКМК в ветеринарных клиниках г.

Благовещенска...................................................................... 107

Таблица 31 - Результаты подбора линий тренда (по заболеваемости собак)................................................................................. 107

8 ПРИЛОЖЕНИЯ

Продолжение приложения А

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ

(19)

ни

(П)

2 553 334(В) С2

ем О

со со

СО 1Л

т см

3

а:

(51) МПК

А23] 1/10 (2006.01) А61К 35/28 (2015.01)

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ

(21)(22) Заявка: 20131Э4870Д0, 23.07.2013

(24) Дата начала отсчета срока действия пателта: 23.07.2013

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 23.07.2013

(43) Дата публикации заявки: 27.01.2015 Бюл. № 3

(45) Опубликовано: 10 06.2015 Бюл. № 16

(56) Список документов, цитированных в отчете о поиске: ВХГ 2298939 С2, 20.05.2007. Ки 2041716 С1,20.08,1995. иА 40805 П. 27.04.2009

Адрес для переписки:

675005, Амурская обл., г.Благовещенск, ул. Политехническая, 86, ФГБОУ ВПО ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

(72) Автор(ы):

Мандро Николай Михайлович (К.Ц), Федоренко Татьяна Валериевна (Ш))

(73) Патентообладатель(и): ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ (1Ш)

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК

(57) Реферат:

Изобретение относится к биохимии. Способ предусматривает извлечение клеток костного мозга, их суспендаровапие, фильтрацию суспензии и центрифугирование фильтрата. Осадки вместе с надосадочными жидкостями подвергают гомогенизации. Затем содержимое центрифужных пробирок фильтруют через капроновые фильтры. Белки раствора высаливают с помощью сульфата аммония при нагревании до 60°С, отстаивают 12 ч при температуре 4°С и центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин. К надосадочной жидкости добавляют 1% раствор трихлоруксусной кислоты, затем также осадок от раствора отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 5 мин. Полученные осадки смывают спиртом и эфиром и высушивают на

КОСТНОГО МОЗГА

часовом стекле. К полученному порошку добавляют 0,9% раствора хлорида натрия, тщательно перемешивают, затем раствор белка подвергают диализу проточной водой в течение 1-2 сут и дистиллированной водой в течение 1 ч. Раствор центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин, полученные осадки смывают спиртом и эфиром, высушивают на часовом стекле. Изобретение обеспечивает упрощение способа выделения общего белка, повышение чистоты целевого продукта, сокращение времени экстракции белка, использование новых технологий, доступность, поскольку клетки костного мозга берут у сельскохозяйственных и диких животных. 3 пр.

73 С

ю сл 01 СО СО со {ь

о

N9

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

675000 г, Благовещенск e-mail: [e-mail]

Ул. Политехническая. 86 тел: [phone]

УТВЕРЖДАЮ

Ректор ФГБОУ ВО Дальневосточный ГАУ, д-р с.-х. наук, профессор _П.В. Тихончук

« ¿С» -г С 2015 г.

КАРТА ОБРАТНОЙ СВЯЗИ

Факультет ветеринарной медицины и зоотехнии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Дальневосточный государственный аграрный университет» подтверждает, что результаты научных исследований по теме «Влияние препаратов из клеток костного мозга сибирской косули на иммунореактивность животных», проведенные Федоренко Татьяной Валериевной, используются в учебном процессе при подготовке студентов по специальности «Ветеринария» и по направлению «Ветеринарно-санитарная экспертиза».

Декан факультета ветеринарной медицины и зоотехнии, д-р с.-х. наук, профессор

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО НАУЧНЫХ ОРГАНИЗАЦИЙ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ НАУЧНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ЗОНАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ» (ФГБНУ ДальЗНИВИ)

Материалы, изложенные в информационном письме Федоренко Татьяны Валериевны на тему «Влияние препарата из костного мозга сибирской косули на иммунореактивность животных» внедрены и используются в научных исследованиях в отделе микробиологии ФГБНУ Дальневосточного зонального научно-исследовательского ветеринарного института.

Информационное письмо рассмотрено на заседании ученого совета ФГБНУ ДальЗНИВИ протокол № 2 от 3 февраля 2015 г.

675005, г. Благовещенск, ул. Северная, 112. Для телеграмм: Благовещенск-5, ДальЗНИВИ E-mail: [e-mail]

тел./факс (41Й-2) 52-21-19, 49-10-31 тел. [phone],49-12-11,49-11 -87

«УТВЕРЖДАЮ» Директор ФГБНУ ДальЗНИВИ,

КАРТА ОБРАТИ«

Зав. отделом микробиологии, к.б.н. '{{{■-

И.С. Шульга

ЦЕНТР ЗДОРОВЬЯ животных ИП Воробьев

Адрес: 675000 г. Благовещенск, ул. Партизанская 43/2 ИНН 280110825882 ОГРНИП 309280107200048 Тел.: [phone]

г.Благовещенск 29.10.2015 г.

АКТ

о внедрении способа повышения общей резистентности и иммунологической реактивности организма во время иммунизации

животных

Способ повышения общей резистентности и иммунологической реактивности организма во время иммунизации животных с помощью препарата из клеток костного мозга нашел применение в практике центра здоровья животных с 15 июня 2015 года по настоящее время. Применение препарата из клеток костного мозга во время вакцинации и ревакцинации собак в возрасте до 6 месяцев показало положительный результат. При исследовании гематологических показателей крови, после использования препарата установлено, что количество иммунокомпетентных клеток повысилось в среднем на 20-30% в сравнении с показателями тех животных, которые не получали препарат, следовательно, эффективность специфической профилактики животных возрастает.

Директор ветеринарной клиники

Ветеринарная клиника

ИП Шарапова

Адрес: г, Белогорск ул. Кирова, 180

ИНН 281602522362 ОГРН 305280433000098 Тел.:[phone]

г. Белогорск

28.09.2015 г.

АКТ

о внедрении способа повышения общей резистентности и иммунологической реактивности организма во время иммунизации

животных

Способ повышения общей резистентности и иммунологической реактивности организма во время иммунизации животных с помощью препарата из клеток костного мозга нашел применение в практике ветеринарной клиники с 15 августа 2015 года по настоящее время. Применение препарата из клеток костного мозга в период вакцинации щенков 2-3-х месячного возраста показало что, после использования препарата общее количество лейкоцитов было выше на 42% по сравнению с показателями щенков не получавших препарат; при исследовании лейкограммы отмечено увеличение количества моноцитов на 20%, эозинофилов на 12% и лимфоцитов на 4,5%, что говорит о повышении общей резистентности в период иммунизации.

Директор ветеринарной клиники

Ветеринарный центр "Пес и Кот" ИП Кольцова

Адрес: г. Хабаровск ул. Профессора Даниловского, 17 ИНН 253910368470 ОГРН 311272108700020 Тел.: [phone] e-mail: [e-mail]

г. Хабаровск

10.09.2015 г.

АКТ

о внедрении способа повышения общей резистентности и иммунологической реактивности организма во время иммунизации

животных

Способ повышения общей резистентности и иммунологической реактивности организма во время иммунизации животных с помощью препарата из клеток костного мозга нашел применение в практике ветеринарного центра "Пес и Кот" с 20 июля 2015 года по настоящее время. Применение препарата из клеток костного мозга в период вакцинации собак в 2-3 месячном возрасте показало положительный результат. При исследовании гематологических показателей крови, после использования препарата установлено, что количество лейкоцитов было выше на 40% по сравнению с показателями собак не получавших препарат, при исследовании лейкограммы отмечено увеличение количества моноцитов на 20%, эозинофилов на 15% и лимфоцитов на 5%, что говорит о активации неспецифического клеточного иммунитета.

Директор ветеринарного центра

М.А. Кольцова

УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ И ПЛЕМЕННОГО ЖИВОТНОВОДСТВА АМУРСКОЙ ОБЛАСТИ 675000, г.Благовещенск, ул. Островского, 96

Тел/факс [phone], 51-52-49, Е-таП:атигуеи1рпя) mail.ru

"26" ноября 2015г.

СПРАВКА

о внедрении в производственных условиях ветеринарных клиник Амурской области способа повышения общей резистентности и иммунологической реактивности организма во время иммунизации животных

Нарушения технологии кормления и содержания, неудовлетворительная экологическая ситуация, воздействие других стрессоров на животных сопровождаются угнетением иммунной системы, снижением естественной резистентности организма и эффективности специфической профилактики различных болезней. Нарушение ее функции рассматривают как один из патогенетических механизмов патологического процесса. В связи с этим оправдан значительный интерес ученых к разработке и изучению различных средств, способных положительно влиять на функционирование иммунной системы. Одним из вариантов решения столь сложной проблемы является введение в схемы профилактических и противоэпизоотических обработок препаратов, обладающих выраженным иммуностимулирующим эффектом, активизирующих защитные силы организма. Большие перспективы имеют иммуномодуляторы эндогенного происхождения, а именно костно-мозговые препараты белковой природы, обладающие стимулирующим действием клеток костного мозга на антителобразование в активную фазу иммунного ответа. Несмотря на значительное количество адъювантов, многие вопросы, касающиеся лечения и профилактики иммунодефицитных состояний, остаются нерешенными. Высокая востребованность в препаратах иммунокоррекции, обусловленная неблагоприятной эпизоотической обстановкой на фоне снижения резистентности животных, дают основание считать актуальным исследования Федоренко Татьяны Валериевны.

Предложенный ей способ повышения общей резистентности и иммунологической реактивности организма во время вакцинации и ревакцинации собак в возрасте до 6 месяцев был испытан на базе ветеринарных клиник городов Благовещенска и Белогорска Амурской области. Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности применения белковых препаратов из клеток

продолжение приложения И

костного мозга в период иммунизации собак. Автором подобрана оптимальная доза введения препарата и доказана его терапевтическая эффективность.

Применение препарата из клеток костного мозга во время вакцинации собак в возрасте до 6 месяцев оказывает положительный результат на организм животных, наблюдается положительная динамика при исследовании показателей крови животных.

Считаем, что работа по изучению влияния препарата из клеток костного мозга, изготовленного Федоренко Т.В., на организм животных носит научный характер и имеет практический интерес.

Начальник управления ветеринарии и племенного животноводства

С.В. Самохвалов

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ФАКУЛЬТЕТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ И ЗООТЕХНИИ

Мандро., Т,В. Федоренко

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ БЕЛКОВОГО ПРЕПАРАТА ИЗ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА

Благовещенск Издательство Дальневосточного ГАУ 2016

-

продолжение приложения К

УДК 619:615.37

Мандро, Н.М. Рекомендации по применению белкового препарата из клеток костного мозга / сост. д-р ветеринар.наук, профессор Н.М. Мандро* Т-В. Федоренко. - Благовещенск: Изд-во Дальневосточного ГАУ, 2016. - 21 с.

В рекомендациях рассмотрены особенности применения белковых препаратов костно-мозгового происхождения. Даны указания по изготовлению и применению препарата из клеток костного мозга. Представлены результаты применения белкового препарата из клеток костного мозга на мышах исобаках. Показана эффективность применения костно-мозговых препаратов.

Предназначены для ветеринарных специалистов, преподавателей и студентов ветеринарных факультетов.

Рецензент - М.Е. Остякова. д-р биол. наук, директор федерального государственного бюджетного научного учреждения «Дальневосточный зональный научно-исследовательский ветеринарный институт»

Рассмотрены, одобрены к внедрению и рекомендованы к изданию

научно-техническим советом Дальневосточного государственного аграрного университета (Протокол №4 от 10 декабря 2015 года).

Издательство Дальневосточного ГАУ 2016