Обоснование переработки гаммаруса Балтийского моря (Gammarus lacustris) методами биотехнологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.04, кандидат технических наук Григорьева, Евгения Васильевна

• Григорьева, Евгения Васильевна
• кандидат технических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат технических наук Григорьева, Евгения Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Современное хитинсодержащее сырье и перспективы его переработки.

1.2. Современные технологам получения хитина/хитозана и возможности комплексной переработки хитинсодержащего сырья.

1.2.1. Химический способ получения хитина/хитозана:.•.

1.2.2. Электрохимический способ получения биополимеров.

1.2.3. Ферментативный (биотехнологический) способ получения хитина/ хитозана

1.2.4. Нетрадиционные способы получения хитина и хитозана.

1.2.5. Комплексные технологии по переработке хитинсодержащего сырья.

1.3. Состояние и перспективы развития технологий белковых гидролизатов.

1.4. Применение хитина и хитозана в промышленности.•.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Обоснование переработки гаммаруса Балтийского моря (Gammarus lacustris) методами биотехнологии»

Актуальность работы. Природные биополимеры хитин и хитозан все шире применяются в различных отраслях промышленности, что обусловлено ртх уникальным химическим составом и свойствами (биосовместимость, нетоксичность, биоде-градируемость, сорбционность и др.). Традиционным сырьем для получения данных продуктов являются панцирьсодержащее сырье (ПСС), образующееся при разделке промысловых ракообразных (крабы, криль, креветки, раки и др.). Несмотря-на то, что* запасы ПСС достаточно стабильны, отмечена положительная динамика новых источников получения хитина. В последние годы изучены насекомые (пчелиный подмор, надкрылья тараканов, майских жуков), кораллы, термиты и др., для которых разработаны специальные технологии. [16, 84, 85,119,189,190].

Однако в акватории Балтики традиционное ПСС отсутствует, а переработка новых источников по причине их небольших запасов, специфики технологии и низкого выхода готовой продукции не развилась выше кустарного уровня.

В Балтийском море, Куршском и Вислинском заливах, озерах Калининградской области в большом количестве обитает недоиспользуемый в промышленности - ра-чок-бокоплав гаммарус (Саттагш /ясмя/га). Относительно высокое содержание (2530%) и малая толщина (100 - 500 мкм) панциря облегчают процесс его диспергирования, необходимого при всех способах получения хитина. С учетом оценки его запасов и высокой способности рачка к размножению данную сырьевую базу можно считать потенциально значимой в регионе для получения хитина [19,90, 112, 113].

Принимая во внимание факт присутствия в составе гаммаруса, помимо хитина, также других ценных компонентов (белки, липиды, пигменты, минеральные вещества и др.), целесообразным является-его комплексная переработка методами биотехнологии с получением хитина и дополнительного белкового гидролизата, представляющего ценность для кормовой промышленности. Мировые тенденции в данной сфере направлены на инновации с применением природных систем, максимальное сохранение биопотенциала сырья, регулируемость процессов, что предопределяет актуальность введения биотехнологической составляющей в базовую химико-экстракционную технологию хитина.

Несмотря на актуальность применения хитозана в пищевой, медицинской и других сферах производства, внедренных решений не очень много, что объясняется как дефицитом биополимеров, так и отсутствием качественных разработок.

Вопросами совершенствования производства и применения хитина и хитозана занимались многие ученые: Албулов А.И., Быков В.П., Варламов В.П., Вихорева Г.А., Во-долажская C.B., Гамзазаде А.И., Дацун В.М., Куприна Е.Э., Маслова Г.В., Немцев С.В:, Новиков М.Ю., Нудьга Л.М., Сафронова Т.М., Третениченко Е.М., Hirano S., Johnson E.L., Kaeßmann H:J. Muzzarelli R.A. A., Peniston C.P., Peter M.G., Struszczyk H и др.

Однако в известных трудах отсутствуют технологические решения по комплексной переработке гаммаруса балтийского, имеющего специфические особенности состава и свойств. На сегодня не изучены биотехнологический потенциал данного сырья, его «поведение» при автоэнзимолизе, что не позволяет однозначно применять известные способы для его безотходной переработки. Отсутствуют также способы стабилизации активной-биодепротеинирующей системы, отличающиеся безопасностью и инертностью к ферментам, а также определенным биологическим потенциалом, позволяющим в период ферментации повышать биологическую ценность конечных продуктов. В литературе нет данных по функциональным свойствам получаемых из гаммаруса биополимеров, рациональных областях и конкретных технологиях их применения. Не разработаны соответствующие аппаратурные требования, необходимые для внедрения результатов исследования.

С учетом сказанного представляется актуальным получать хитин и хитозан из балтийского гаммаруса с применением усовершенствованного способа его комплексной переработки. Потенциал совершенствования резервирован- в сфере фер-ментирования, где рациональным является синергетическое использование совокупности автоэнзимолиза и фитотехнологий наряду со вторичными ресурсами АПК. В процессах экстракции и биодеградации сегодня в пищевой и медицинской отраслях с успехом применяются фитокомпозиции (лекарственные растения, фитосборы и др.), а также продукты переработки молока (творожная и подсырная сыворотки, пахта и т.д.), обладающие полифункциональными свойствами.

На стадии автоэнзимолиза рациональным является введение в качестве жидкой фракции гидромодуля молочной творожной сыворотки или раствора натуральных компонентов алоэ. Последние надежно подавляют гнилостные процессы, развивающиеся при деструкции белков гаммаруса, но не ингибируют ферменты рачка. При этом повышается качество процесса и целевых продуктов, что обусловливается физико-химическим взаимодействием ценных компонентов системы друг с другом, приводящее к аддитивности их биопотенциалов. В'итоге в автолизируемой системе проявляется устойчивый антисептический эффект, образующийся бульон имеет высокое качество за счет приобретения приятных органолептических свойств и ценных компонентов (флавоноиды, гликозиды, алкалоиды, витамины, минеральные, липид-ные и др. природные вещества), в технологии хитина становится возможной последующая ускоренная традиционная дообработка сырья при получении дополнительного продукта - обогащенного биоавтогидролизата с высокими функциональными свойствами. По совокупности эффектов в целом снижается агрессивная химическая нагрузка процесса, повышается комплексность переработки гаммаруса и уровень использования его биопотенциала.

Переработка региональных запасов гаммаруса по новой технологии позволит снизить биологические загрязнения курортных зон Балтийского моря, повысить их экологический уровень, выпустить на региональный рынок доступные ценные биополимеры, обладающие определенными достоинствами, что в итоге будет способствовать решению важных социальных задач страны - обеспечение здоровья нации и внедрение комплексных безопасных технологий.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в разработке из балтийского гаммаруса на основании автоэнзимолиза и использования биоконсервантов эффективной технологии целевого продукта хитозана и биологически ценного гидроли-зата.

Для достижения поставленной цели решались следующие основные задачи:

1. Изучение техно-химических свойств балтийского гаммаруса и обоснование возможности его комплексной переработки с применением предварительного автоэнзимолиза в условиях биоконсервирования;

2. Исследование, моделирование и оптимизация технологического процесса автоэнзимолиза, как предварительного депротеинирования, при использовании молочной сыворотки и раствора компонентов алоэ;

3. Формализация и обоснование оптимальных параметров деминерализации полуфабриката хитина, направляемого в обработку после автоэнзимолиза гаммаруса;

4. Исследование состава и функциональных свойств полученного* хитозана в технологии рыбы холодного бездымного копчения и при синтезе медицинских биопленок;

5. Получение биологически ценного гидролизата из белковой части гаммаруса и исследование его качества; ' |

6. Разработка комплексной схемы переработки гаммаруса и рекомендаций по применению конечных продуктов;

7. Производственная апробация технологической рекомендации по адгезионному копчению;

8. Оценка эффективности разработки;

9. Подготовка нормативной документации на технологический процесс и готовые продукты из балтийского гаммаруса.

Научная новизна работы. Обосновано совершенствование биотехнологического метода получения хитина, хитозана и биоавтогидролизата из недоиспользуемого хитинсодержащего сырья - балтийского гаммаруса, сущность которого заключается в его предварительном автоэнзимолизе в среде биоконсервантов при последующих однократных процессах деминерализации и депротеинизации, что позволяет получать функциональные конечные продукты, осуществлять процесс комплексно и безопасно. Установлены высокая автопротеолитическая способность тканей сушеного рачка и характер деструкции тканей в биореакционной автосистеме, представляющей собой дисперсию измельченного гаммаруса в водной среде биоконсерванта. Обоснована рациональность применения молочной творожной сыворотки и раствора компонентов алоэ, биологически активные вещества которых надежно предотвращают микробиологическую порчу белковой части автосистемы, не влияя на активность ее ферментов: Разработаны математические модели процессов автоэнзимолиза гаммаруса и деминерализации полуфабриката хитина, адекватно связывающие факторы процессов с качеством конечных продуктов и позволяющие его регулировать по органолептическим и физико-химическим показателям. Исследованы основные качественные характеристики хитина и хитозана (минеральный состав, степень деацетилирования, молекулярная- масса, вязкостные свойства растворов, термическая устойчивость, микробиологические показатели). Изучено качество дополнительного продукта? комплексной переработки гаммаруса -биоавтогидролизата, содержащего в сохраненном виде биокомпоненты гаммаруса и натуральные биоконсерванты. Установлены. минеральный и жирно-кислотный составы рачка и биоавтогидролизата, представленные рядом ценных микроэлементов, моно- и полиненасыщенных жирных кислот. Показана рациональность и функциональность использования хитозана в пищевых и медицинских целях. Разработана математическая модель состава коптильного геля, содержащего в качестве структурообразователя хитозан. Исследован антисептический эффект биомедицинских пленок на основе хитозана, предназначенных для предотвращения воспалительных процессов кожи.

Новизна технологического решения подтверждена Патентом РФ № 2318831 «Способ комплексной переработки рачка гаммаруса» (см. Приложение 7).

Практическая значимость работы. Разработана комплексная технология переработки балтийского гаммаруса, позволяющая получать хитин, хитозан и биовто-гидролизат, обладающие высокими качественными характеристиками, приоритет которой подтвержден Патентом РФ № 2318831 «Способ комплексной переработки рачка гаммаруса».

Разработан проект нормативной документации на изготовление из балтийского рачка хитина, хитозана и биоавтогидролизата, что позволяет получать ценные биологически активные вещества из нового сырья практически безотходно, комплексно, по эффективным технологиям. Предложены модели процессов и методики их расчетов, которые способны регулировать выход и качественные характеристики готовых продуктов. Разработаны практические рекомендации по использованию получаемых биологически активных веществ и композиций в технологии пищевых, медицинских и кормовых продуктов.

Действенность разработанных рекомендаций положительно апробирована в производственных условиях ИП «Черба» (Калининградская обл., п. Васильково) в технологии бездымного копчения рыбы. В условиях Гамбургского университета показана антисептическая функциональность хитозана в составе медицинских биопленок.

Материалы работы использованы в учебном процессе подготовки студентов, магистрантов и-аспирантов, пищевых специальностей ФГОУ ВПО «Калининградский государственный технический- университет», а также студентов Гамбургского университета (Германия), занимающихся технологиями высокомолекулярных биополимеров.

Проведена оценка экономической и социальной целесообразности реализации разработанной комплексной технологии переработки гаммаруса и применения целевых продуктов.

На защиту выносятся:

• Результаты обоснования.автоэнзимолиза с биоконсервированием в технологии комплексной переработки гаммаруса при получении хитина и хитозана.

• Зависимости формирования качества хитина и хитозана в процессе переработки гаммаруса, установленные на основных этапах технологии.

• Параметры качества, обосновывающие функциональность, достоинства и безопасность готовых продуктов переработки гаммаруса.

13 1

Апробация работы; Результаты выполненных исследований были представлены на коллоквиуме по макромолекулярной химии (Freiburg im: Breisgau, 2005), ПГ Международной научной конференции «Биотехнология: состояние и перспективы г; развития», (Москва, 2005); НПК/«Значение биотехнологии дляздорового питания и решения: медико-социальных проблем», (Калшшнград, 2005), фирме Байерсдорф АО (Hamburg, 2005), VIII Международной конференции «Современные- перспективы в исследовании хитина и хитозана», (Казань, 2006), Международном симпозиуме «Биоматериалы» и 29-ом «Гамбургском симпозиуме по макромолекулярной химии» Hamburg, 2006), Научно-практической конференции «Пищевая и морская биотехнология: проблемы и перспективы», (Калининград, 2006), V Международной научной конференции «Инновации в науке и образовании 2007», «У.М.Н.И.К.», (Калининград, 2007), ГШ Международной научно-технической конференции «Низкотемпературные и пищевые технологии в; XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007), заседаниях кафедры.пищевой биотехнологии ФГОУ ВПО «КГТУ» 2005-07 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 научных работ, в том числе 1 Патент РФ.

Структура и объем работы; Диссертация включает введение, литературный обзор, методическую и экспериментальную части, выводы, список использованной литературы и приложения. Работа изложена на 235 страницах стандартного текста, содержит 50 таблиц, 60 рисунков, 8 приложений, ссылки на 216 литературных источников, в том числе 79 работ зарубежных авторов:

Заключение диссертации по теме «Технология мясных, молочных и рыбных продуктов и холодильных производств», Григорьева, Евгения Васильевна

Результаты исследования микробио;ю1"ичсских показателей приведены в табл. 3:14. л •.'/.■■- ■ . Таблица3.14

Микробиологические показатели хитозана, полученного изтаммаруса Наименование показателя Нормативный показатель Фактическое, содержание

Мезофильные аэробные и факультативно анаэробные микроорганизмы, КОЭ в 1г продукта^ не более 4*10- 3^8* 104 ;

Бактерии группы Е. соЩ Pr. vulgaris- S. aureus : в-1 г продукта Г. • .• * , ; - • • не. • допускается;; не . • обнаружены

Патоген! u>ie, в том числе сальмонеллы, ; микроорганизмы в 25г продукта /не допускается* не обнаружены

Плесневые фибы клеток в 1г, не более 2*102 1,8*10" ;

Сравнивая полученные данные с регламентированными в СанПин 2.3.2.1078-01 [103], можно констатировать, лпо но данным: санитарно-гигиеническим показателям полученньш )штозан соотве1,ствукуг требованиям, предъявляемым к биологически активным добавкам, применяемым в пищевой промышленности.

3153: Физико-химические характеристики;:

Особый интерес представляют значения, химических показателей полученных веществ. Достаточно высокий уровень содержания минеральных компонентов (0,981,51 %), среди; которых, как показали: наши исследования' (см. гл. 3.2), большая доля приходится на кальций,, позволяет говорить о целесообразности использования полученных хитина/хитозана в составе лечебно-профилактических добавок,-предназначенных для коррекции питания? в случае нарушений опорногдвигательных функций,; а именно - в качестве источника минеральных веществ биологическогопроисхождения.

Анализ данных, приведенных в табл. 3:15; показывает, что хитозан, полученный из гаммаруса, независимо от способа его конечного депротеинирования, отличается высокой степенью деацетилирования (СД. составляет 92,8 и 94,6%). Это свидетельствует о еговысоких функциональных возможностях, как полимера, способного к быстрому растворению в кислотных растворах.

По показателям рЫ и кинематической вязкости полученные биополимеры также «вписываются» в существующий банк свойств, установленных для различных по происхождению данных веществ. Так, значение вязкостной характеристики 1 %-го раствора хитозана, приготовленного в 1%-м растворе уксусной кислоты (27 сПз), позволяет рекомендовать данный полимер не только в качестве структурообразующей? добавки, обеспечивающей свойства загустителей и гелеобразователей; в системах, а также в со. ставе функциональных растворов, способных быстро биодеградировать и обладающих повышенной растворимостью (например, в качестве носителя лекарственных-веществ, экологического сорбента, в рецептуре пищевых продуктов и т.д.) [9; 39,154,169]: Результаты определения сгенсни деацетилирования (СД) хитозана мегодом

ЯМР. Степень дезацетилирования хитозана - это отношение количества глюкозамин-ных звеньев к общему числу мономерных звеньев в молекуле полимера СД хитозана -один из важнейших показателей его качества, определяющий уровень и скоросгь растворения биополимера в разбавленных кислотных растворах. Свойства хитозана, а, следовательно; и обласп> его использования значительно зависят от степени деацетилиро-вания: Поэтому очень важно определить этот показатель как можно точнее.

Ниже приведены результаты исследований, проведенные методом протонного ядерно-магнитного резонанса, позволяющие из: соотношения, интегральной площади отдельных пиков ядер водородных атомов; используя: специальные формулы, вычислить СД хитозана (см. гл. 2.2).

В данном методе исследования проводятся в режиме анализа полученных физических характеристик относительно молекулярного строения вещества На рис. 3.9 приведена структурная формула хитозана с расстановкой позиций отдельных атомов, что позволяет распознавать отдельные сигналы водородных атомов спектров полимера.

Рис. 3.9. Структурная формула хитозана с позициями атомов ррт

Рис. 3.10. Спектр ЯМР 'il хитозана (образец 1)

400 MHz, D20 + DCl): ô (ррт) = 0,00 (TMSP); 2,08 (s, CH3-ацетил); 3,23 (t, H2 - деацетилиро-ван); 3,62-3,98 (m, H2-6); 4,52 (HOD); 4,93 (d, H1-D деацети-лирован), T=70°C

Рис. 3.11. Спектр ЯМР ^ хитозана (образец 2)

400 MHz, D20 + DCl): S (ppm) = 0,00 (TMSP); 2,05 (s, CH3-ацетил); 3,23 (t,H2- деацетилиро-ван); 3,78-3,93 (m, H 2-6); 4,52 (HOD); 4,92 (d, H 1-D деацетили-рован), T = 70 °C

H 2/6 ppm

Спектры хитозана (образец 1 и 2), представленные на рис. ЗЛО - 3.11, показывают идентичное распределение атомов гликозидного кольца и ацетильной группы, входящей в боковую цепь полимера. Спектр 'н позволяет через различные соотношения сигналов атомов вычислить среднюю степень деацетилирования (СД) полимера. При этом традиционно используют три основные формулы (180, 190, см. также гл. 2.2) для расчета Точность определения СД в большей степени зависит от качества полученного спектра и его обработки, и может колебаться в незначительных пределах. На рис. 3.12-представлены сравнительные ЯМР спектры 1Н хитозана (образец 1 и 2).

Рис. 3.12. Сравнительный спектр химических сдвигов ЯМР ]Н хитозана образец 1 и 2), при 70 °С

На рис, 3.13 - 3.14 представлены широкополосные ЯМР 13С спектры хитозана (образец 1 и 2), позволяющие определить молекулярное строение вещества и рассчитать СД полимера. Ввиду относительно низкой молекулярной массы хитозана пробы были измерены без деградации полимера. Первый спектр получен при растворении хитозана в дейтерированной соляной кислоте (ОС1) во избежание наложения (перекрывания) ацетильной группы полимера и уксусной кислоты.

С4 СЗ сб

С2

2000 iL.^uJi-â ULy

T ™ ^^щг wf

НИЗШИМ 0 ppm

1 7

Рис. 3.13. Спектр ЯМР С хитозана (образец 1 )

100 MHz, DiO + DCl): 57,16 (s, C2); 61,65 (s, C6); 71,22 (s, C3); 75,95 (s, C4);

78,45 (s, C5); 98,65 (s, Cl)

CH3 от уксусной кислоты c=o от уксусной кислоты

С4 м«1 et»

11

Рис. 3.14. Спектр ЯМР ' С хитозана (образец 2, в уксусной кислоте)

100 MHz, Dp + CDtCOOD): 22,70 (CHrAcOH); 57,01 (s, C2); 61,30 (s, C6); 71,58 (s, C3); 75,76 (s, CA); 78,10 (s, C5); 90,00 (s, Cl); 170,46 (C=0, уксусная кислота)

На рис. 3.14 отображен спектр хитозана, растворенного в уксусной кислоте, где и наблюдаются пик перекрытия СН3 группы по краю спектра. Обе пробы показывают практически идентичное распределение сигналов отдельных атомов гликозидного кольца. Соотношение интенсивности сигналов к площади поверхности пиков спектра позволяет вычислить СД хитозана.

В представленной работе степень деацетилирования рассчитывали принимая во > внимание спектры протонного ядерно-магнитного резонанса (см. табл. 3.15).

Определение молекулярной массы.

Молекулярную массу (ММ) хитозана определяли двумя методами (см. гл. 2.2). На рис. 3.15 представлены результаты определения ММ методом капиллярной вискозиметрии двух образцов хитозана. На диаграмме показана зависимость концентрации кислотных растворов полимера от специфической вязкости. Расчетные значения молекулярной массы занесены в табл. 3.15.

600 п

550 с; 500

450 и 400

О.

П 350

300

250

5,Е-05 3,Е-04 5.Е-04 7,Е-04 Концентрация с (г/мл)

9,Е-04

Рис. 3.15. Кривые растворов хитозана (образец 1 и 2) для определения молекулярной массы методом капиллярной визкозиметрии

На рис. 3.16-3.17 отображены данные проб хитозана (образец 1 и 2), молекулярная масса которого определялась хроматографически, в части распределения частиц исследуемого вещества по молекулярной массе. Видно, что молекулярно-массовое распределение пробы хитозана (образец 1) лежит в пределах от 2,2x104 до 1,6x106 г/моль, а для пробы (образец 2) - в диапазоне от 6,3x104 до 3x106 г/моль. Видно, что кривая распределения молекулярной массы (Мо1шаззе), приведенная на рис. 3.17, имеет тенден циго к подъему, что может свидетельствовать об абсорбционном эффекте.

Образец 1

----DRJ

-*- MALLS • Molmasse

Элюируемый объем (мл)

Рис. 3.16. Графическое отображение сигналов: светорассеивающего (MALLS), концентрационного (DRf) и распределения молекулярной массы (Molmasse) хитозана (образец 1), установленных методом жидкостной гельпроникающей хроматографии

Образец 2

Элюируемый объем (мл) я-MALLS V • Molmasse

Рис. 3.J7. Графическое отображение сигналов: светорассеивающего (MALLS), концентрационного (DR1) и распределения молекулярной массы (Molmasse) хитозана (образец 2), установленных методом жидкостной гельпроникающей хроматографии

Расшифровкаприведенных выше данных позволяет усгановитьколичественные значения молекулярных масс (М№) анализируемых биополимеров (образец 1 и2: метод вискозиметрии - 165 и 244 кДа; метод хроматографии - 140 и 190 кДа), которые свидетельствуют об их среднем уровне [189,190,204]. Этот уровень дает основание рекомендовать» полученные вещества: также в технологии еще более1 низкомолекулярного (вплоть до; олишаминосахаров) хитозана, ^.следовательно; его водорастворимых форм -и соответствующих биологически активных композиций: Данное направление сегодня чрезвычайно актуально как в пищевой промышленности, так и медицине:

В^табл. З Л 5; приведены .обобщенные значения , физико-химических показателей двух образцов хитозана;

Заключение

Благодаря развитию теории и прикладных методов науки о биополимерах постоянно- возрастают возможности получения и применения уникальных природных полиаминосахаров — хитина и хитозана. Последние постепенно вытесняют синтетические аналоги из различных отраслей промышленности, приобретая устойчивую популярность и доверие у населения. Данная, ситуация обуславливает необходимость и рациональность изыскания новых сырьевых источников и технологий получения названных продуктов. В основе более совершенной технологии должна находиться комплексная переработка хитинсодержащего сырья, предусматривающая передовые методы его обработки (автодеградацию, биоконсервирование, щадящую химическую экстракцию, лиофильную сушку и др.). При получении биополимеров из нового биологического сырья необходимо, прежде всего, изучить его состав и функционально-технологические свойства конечных продуктов - молекулярную массу, вязкость, наличие примесей и т.д., а также функциональные свойства (способность растворяться, формировать гели, проявлять барьерные свойства и др.) Знание данных характеристик позволит обосновать рациональные направления использования целевых продуктов и тем самым открыть новые возможности в их применении.

Высокое содержание хитина в рачке гаммарусе и устойчивые сырьевые запасы в Балтийском регионе позволяют отнести его к доступному и перспективному источнику получения заданных биополимеров. Комплексная технология переработки данного рачка с применением автоэнзимолиза в биоконсервированной системе позволит максимально полноценно переработать данное сырье в щадящих условиях, получая наряду с функциональными хитином и хитозаном важный дополнительный продукт — биоавто-гидролизат, предназначенный для кормовых и микробиологических целей.

На реализацию сказанного направлена данная диссертационная работа, задачи которой последовательно и логично отражают достижение поставленной цели.

2.1. Схема исследований

Экспериментальные работы выполнялись в соответствии с аналитической схемой, приведенной на рис. 2:1.

Анализ современного состояния вопроса^ обзор литературных источников; обоснование актуальности работы

Формулирование целей и задач исследований .

Сравнительный анализ технологиихитина/хитозана Обоснование биотехнологического подхода в производстве хитина/хитозана из гаммаруса;

Изучение процесса получения хитин^хитозана с применением промышленных и собственных ферментов гаммаруса Ж

Обоснование областисугцествования, моделирование и оптимизация процесса а втоэнзимолиза гаммаруса методом математического планированияэксперимента

-. "' "' " "■"' ~~~~

Разработка технологической схемы получения <; хитина/хитозана из гаммаруса с применением процесса автоэнзимолиза и биоконсервирования Ж

Изучение качественных характеристики физико-хймических свойств хитина и хитозана изваттагиз 1асив1гт Ж ж

Обоснование технологии получения белкового гидролизата и его характеристика у= ~—

Разработка рекомендаций по практическому использованию полученного хитозана и белкового гидролизата

Р^^отма-провкга-НД не! хитин/хитозан пищевой, полученный при комплексной переработке гаммаруса с применением автоэнзймолйза'с биоконсервированием: у.

Разработка йсходныхтребований на технологическое оборудование для изготовления хитина/хитозана и белкового гидролизата

3.

Производственные испытания хитозана Ж

Получение опытной партии рыбы холодного копчения с применением геля на основе хитозана (ламинированной) и определение качества готовой продукции И

Получение :хитозановых мембран для медицинских целей и изучение их функциональных свойств Ж

Обоснование-эффективности разработки

Рис. 2.1. Схема экспериментальных исследований

2.2. Методики исследований

В экспериментальных образцах гаммаруса, полуфабрикатах и готовых продуктах (хитин, хитозан, белковый гидролизат, рыба холодного копчения, хитозановые пленки и др.) определяли следующие показатели качества:

2.2.1. Органолептические показатели (внешний вид, цвет, запах, вкус) оценивали по ТУ 15-01-472-87, ТУ 9289-067-00472124-97, ТУ 15-1207-96 на рыбу х/к ламинированную, а также с применением специально разработанных органолептических балловых шкал (см. гл. 3).

2.2.2. Физико-химические характеристики:

2.2.2.1. Массовые доли воды, жира (липидов), общего азота, минеральных веществ (золы), отдельных микроэлементов определяли по ГОСТ 7636.

2.2.2.2. Качественный и количественный состав тяжелых металлов и микроэлементов оценивали методом атомно-абсорбционной спектроскопии по ГОСТ 30178-96 [164, 184, 185]. Сущность данного-метода заключается в-растворении пробы и введении ее растворов в виде аэрозоля в пламя для'испарения в графитовом анализаторе с целью получения светопоглощающего атомарного пара (термическое разложение растворенной пробы на атомы), его облучении источником света, разложении света и выделении линии поглощения. Далее осуществлялась оценка оптической плотности стандартных и анализируемых растворов, определение градуировочной характеристики и расчет концентрации определяемого компонента. При анализе тяжелых металлов хитозана также был использован метод атомно-абсорбционной спектроскопии, включающий пламенную и графитную техники измерения с использованием паров охлаждающего агента. Исследования проводились на оборудовании Perkin Elmer 5000, Perkin Elmer 4100 ZL и Spectro Merc Hg-Analysator (Германия, Гамбургский университет).

2.2.23. Определения содержания хитина в гаммарусе и продуктах его переработки вели методом, основанным на выделении частиц хитина растворителем и определении в них азота макрометодом по ГОСТ 7636.

2.2.2.4. Определение протеолитической активности собственных ферментов гаммаруса формольиым титрованием. Сущность метода заключается в определении массовой доли азота концевых аминогрупп методом формольного титрования.

Определение активности ферментного препарата протосубтилина Г20Х проводили по методу Ансона по ГОСТ 20264.4. Сущность метода заключалась в оценке активности коммерческого фермента протосубтилина по количеству тирозина, содержащегося в продуктах протеолиза, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой.

2.2.2.5. Определение массовой доли частиц депротеинизированого панциря проводили по ГОСТ 7636. Метод основан на выделении панциря из анализируемого продукта щелочным гидролизом и весовом определении его.

2.2.2.6. Определение выхода Д-глюкозаминахлоргидрата хитина вели путем гидролиза хитина концентрированным раствором соляной кислоты для выделения образовавшегося Д-глюкоэаминахлоргидрата с последующим определением его массовой доли [106,125].

2.2.2.7. Определение степени деацетилирования хитозана (СД) вели двумя методами.

1. Потенциометрическое титрование [88, 190]. Определение СД основано на обратном алкалиметрическом потенциометрическом титровании хлористого водорода, связанного с аминогруппами молекул хитозана, в солянокислом растворе, который проводили автоматически с помощью титриметрической установки и вручную с помощью бюретки и рН-метра. Раствор продукта титровали раствором гидроокиси натрия, вычисляли разность объемов титранта, которая соответствует значению объема титранта, пошедшего на титрование солянокислого хитозана (с/Кд<аои в см ). СД (в %) вычисляли по формуле:

203,2-100)

СД = с

42,0 +1000 ■ --—

С -¿V

V КаОН и * КаПИ У

1) где: то - масса хитозана в навеске, г;

Скюн ~ точная концентрация раствора гидроокиси натрия, моль/дм3; dVNaOH - объём- раствора гидроокиси- натрия; пошедший на титрование аминогрупп, см3;

203,2; 42,0; 100; 1000 - пересчётные коэффициенты.

2. Метод1Н;13С ядерно - магнитного резонанса (ЯМР) [42, 146, 151, 155, 180]. Метод основан на взаимодействии: внешнего магнитного поля с ядрами; молекул,, имеющими магнитный момент (ядрами с ненулевым спином). К ним относятся 'Н, l3C, 15N, 35Р и другие. ЯМР на ядрах 'Н в настоящее время наиболее развит и получил название протонный магнитный резонанс (FIMP): Возбуждение: ядер осуществляют не "постоянной волной", а. с помощью короткого импульса продолжительностью в несколько микросекунд: В результате импульсной: спектроскопии - получают изображение затухающих резонансных колебаний; в котором смешаны все сигналы от всех резонирующих ядер - так называемый "спад свободной индукции" (PID,/га? indiiction decay). Для преобразования! данного спектра используют математические методы (так называемое Фурье-преобразование); по которому любая функция может быть представлена в виде суммы множества гармонических колебаний. Г

Измерения образцов проводили на приборе Bruker Avance 400 Spectrometer (Rheinstetten; Германия) при температуре 70°С. Время релаксации, составляло - 5 секунд. .

СД хитозана (в %) рассчитывали по формуле (2) [180]:

СД(%) = Г-- —-1-100 (2)1

J [то + нлс/ъ) w

2.2.2.8. Определение молекулярной массы, хитозана расчетным методом вели с предварительным измерением- вязкости уксуснокислых растворов;^ полимера [49, 50, 106, 178]. Динамическую вязкость определяли, капиллярнымвискозиметром. Уббелоде тип 1с на приборе фирмы Schott-Geräte (Hofheim, Германия): Сущность метода заключается в измерениишремени истеченияюпределенного объема испытуемой; жидкости под влиянием силы тяжести. Навеску хитозана растворяли в уксусной кислоте и/или в ацетатном буферном растворе (0,5М СН3СООН/ 0,2 М NaOH). Измерения производили при постоянной температуре, равной 25°С, поддерживаемой с помощью термостата.

В ходе измерения получали ряд зависимости специфической вязкости от концентрации уксуснокислого раствора хитозана, необходимых для вычисления индекса Штаудингера [г|]. Это величина характеризует вязкостные характеристики системы «полимер-растворитель». Штаудингер-индекс (Staudinger index) исследуемого раствора хитозана (в мл/л) вычисляли по калибровочному графику (рис. 2.2).

112.00 -,

110,00

108,00

106,00 ь. С 104,00

102,00

Л * 100,00

9В,00

96,00

94,0(/^

92,00

6.00Е-03 7,00Е -03 8.00Е-03 9.00Е-03 1.00Е-02 1.10Е-02 1.20Е-02 1.30Е-02 Концентрация с [г/мл ]

Рис. 2.2. Зависимость Штаудингер-индекса tjq/c от концентрации раствора с

Для определения Штаудингер-индекса прямую зависимости концентрации измеряемого раствора от специфической концентрации г^ проводили до пересечения с осью ординат [г|] с последующим использованием полученных значений в уравнении (3): = [77] + Кп [i]f • с Уравнение Хаггинса [178] (3) с

Молекулярную массу (ММ) полимера рассчитывали по уравнению Марк-Хаувинка (Mark-Houwink) [177,178] (4):

H = VMe (4) где: [т|] - индекс Штаудингера, мл/л; кл, а — соответствующие константы;

М- вискозиметрическая молекулярная масса пробы, г/моль. Подставляя параметры коэффициентов в уравнение Тербоича [172, 190] (5), получаем:

77] = 3,5 • 10"2 • М0 76 (Terbojevich) (5)

2.2.2.9. Определение молекулярной массы хитозана* методом жидкостной гель-проникающей хроматографии'[7, 170, 175, 188, 190] вели на специальной комбинированной установке, включающей SEC (Size Exclusion Chromatography), MALLS (Multi Angle Laser Light Scattering) и DRI (Differential Refractometer).

Для подготовки пробы к анализу определенное количество хитозана растворяли в ацетатном буферном растворе (0,5 M НАс/0,2 M NaAc). Полученный раствор фильтровали с помощью нейлонового фильтра (размер пор 11 мкм). Разделение раствора хитозана на компоненты проводили с помощью четырех хроматографических колонок TSK-PWXL (30,40, 50, 60) фирмы TosoHaas (Stuttgart, Германия). При измерениях также использовали рассеивающий фотометр фирмы Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, USA, с He-Ne-лазером (Ào = 632,8 nm). Определение концентрации раствора проводили с помощью дифференциального рефрактометра фирмы Shodex RI SE-71 (Showa Denko, Tokyo, Япония). Для вычисления- полученных данных использовали прирост показателя преломления, равный для*хитозана dn/dc = 0,19 [172]. Расчет вели с использованием пакета программы Astra 4.9.1.

2.2.2.10i Устойчивость* хитозана (хитозановых мембран)к тепловому воздействию определяли методом дифференциально-термического анализа (ДТА), основанного на регистрации изменения массы образца в зависимости от его температуры в условиях программированного изменения температуры среды. Возможны два способа проведения ДТА: 1 - изотермический, т.е. проводимый при постоянной температуре печи, и 2 - динамический, основанный на изменении температуры печи во времени при постоянной скорости нагрева. Последний был реализован в данной работе. В'результате эксперимента были получены, дифференциально-термическая (ДТА) и термогравиметрическая (ТГ) кривые зависимости изменения массы образца от температуры.

При подготовке к анализу образец хитозана массой 20 мг или хитозановой пленки (10мм х 10мм) сжигали в печи (температура от 22°С до 300°С) при скорости нагревания пробы 0,2 и 5 К/мин. Измерения проводили на дериватографе STA 409, NETZSCH (Германия). Обработку данных осуществляли с помощью программы NETZSCH Proteus — Thermal Analysis.

2.2.2.11. Исследования реологических свойств биополимеров-вели по оценке 1-4% растворов хитозана в уксусной кислоте [49, 67,111,147, 149, 166, 171, 177]. Вязкость и вязко-эластичные свойства растворов хитозана, их характер текучести определяли по изменению величины динамической вязкости растворов. Определения проводили на свежее при готовленных растворах полимера, а также хранившихся в течение 1-4 суток.

Для проведения измерений пробу хитозана (1-4 г) растворяли в 1% -м растворе уксусной (или 0,5М/0,2М ацетатном буферном растворе) в течение 1-3 ч. Полученный раствор исследовали на реометре ТА Instruments Rheometric Series ARES Rheometer (TA Instruments, Newcastle, DE, USA) с использованием фиксируемых насадок (плата-плата (plate and plate) диаметром 25 и 50 мм, определяя зависимость эффективной вязкости раствора хитозана от скорости сд вига.

2.2.2.12. Определение жирнокислотного состава липидной фракции сушеного гаммаруса и белкового гидролизата определяли методом капиллярной газовой хроматографии [137] на газовом хроматографе HP 6890 Series GC System (Германия). Подготовка пробы основана на предварительной экстракции жира в экстракторе (типа Сокслета) с последующим щелочным гидролизом триглицеридов до свободных жирных кислот и получением реакцией этерификации метиловых эфиров жирных кислот. Хроматографическое разделение метиловых эфиров жирных кислот проводили на газовом хроматографе HP 6890 Series GC System (Германия) (см. рис 2.3, табл. 2.1) с пламенно-ионизационным детектором и установленной капиллярной колонкой фирмы J&WDB-WAXEtr длинною 30 метров, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиною фазы 0,25мкм. Обработку хроматограмм проводили с использованием программного обеспечения HP-Chem Station.

Технические характеристики хроматографа HP 6890 Series GC System (Германия) представлены в табл. 2.1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат технических наук Григорьева, Евгения Васильевна, 2008 год

1. Адлер Ю.П. Планирование эксперимента при поиске оптимальных условий / Ю.П. Адлер, ЕБ. Маркова, Ю.П. Грановский. М., 1976: - 280 с.

2. Т. Албулов > А.И. Хитозан в косметике. Хитин и хитозан Получение, свойства- и . применение / А.И:;Албулов, АЖ Самуйленко,.М.А. Фролова: М:, 2002. - С. 360-363. "V .-v-' • •

3. Абдулин В.Ф! Технология и свойства биополимера хитозана из панциря речного рака:, автореф. дисс. .канд. техн. наук: 05^17.06 Технология! и переработка полимеров и композитов / Сарат. ГТУ; В.Ф. Абдулин. - Саратов, 2006. - 20 с.

4. Т.М. Сафронова. М:, ВИИРО,. 1993. - С. 60-75. ' V

5. Борисочкина Л.И: Безотходные технологии нерыбных объектов / Л.И. Борисочкина//Рыбное хозяйство. 1989. - №6. - С. 89-92.1.. Быканова О.Н. Перспективы использования, хитозана в качестве БАД к пище /

6. О.Н. Быканова, С.Н; Максимова, Г.А. Тарасенко // Современные перспективы» в исследовании хитина и хитозана: седьмая междунар. конф. (12-17 июня): материалы / КГГУ. Казань, 2006. - С. 275-276:

7. Быков В.П.Технологаякомплексной переработки панцирьсодержащих отходов. криля / В.П. Быков, В.М. Быков, С.В. Немцев // Краткие результаты научной деятельности института за1988 г. /ВНИРО:.- Москва; 1988:- С. 22-25:,

8. Быков В.П: : Сырье рыбной- промышленности и комплексная - технология антарктического криля:/. Быков: B.I I. // Технология: переработки гидробио!пов: междунар.конф.:материальг/ВНИРО.-Москва,1994.-С.35-42

9. Быков В.П: Состояние исследований и перспективы организации-производства хитозана из ракообразных / Быков ВЛ1. //Технология рыбных продуктов: труды / ВНИРО. Москва, 1997. - С. 208-221. \

10. Быков В.П: Получение хитозана из гаммаруса; / В.П. Быков, Д.И. Фурман // Новые перспективы в исследовании: хитина? и хитозана: пятая науч. конф.: материалы / ВНИРО. -1999. С. 18-21.

11. Быкова В.М. Сырьевые источники и способы- получения?хитина?и; хитозана.' Хитин и хитозан. Получение, свойсгваиприменение/ В.М. Быкова, С.В. Немцев. М:, 2002: - С. 7-23.

12. Василькова Г.М. Производство пищевых шдролизатов из объектов морского промысла / Г.М. Василькова, А.Пг Ярочкин // Рыбное хозяйство. 1983. - №5. - С. 65-67:

13. Вихорева Г.А. Плёнки и волокна на основе хитина и его производных. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / F.A. Вихорева, JT:C. Ральбрайх. -М., 2.002.-С. 254-279.

14. Водолажская С.В: Гаммарус перспективный источник для получения хитина; хитозана и белковых гидролизатов, / С.В. Водолажская, ИЛО. Козлова, Е.Э. Куприна// Академия. - 1997. - №4. - С. 56-57.

15. Водолажская С.В. Технология получения белковых гидролизатов электрохимическим способом1 для производства микробиологических питательных сред: автореф. дисс. канд. техн. наук / СПбГТИ (ТУ); С.В. Водолажская. СПб, 2001. - 20 с.

16. Горовой Л.Ф., Косяков В.Н. Сорбционные свойства хитина и его производных. Хитин и хитозан: получение, свойства, применение / Л.Ф. Горовой,- В.Н. Косяков; под ред. К.Г. Скрябина, В.П. Варламова. М., 2002. - С. 368.

17. ГОСТ 7636-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Методы анализа. М., 1985. -142 с.

18. ГОСТ 7631-85 Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приема, методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний. М., - 1985.

19. ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Методы определения дрожжей и плесневых грибов. М., - 1988.

20. ГОСТ 28560-90 Продукты пищевые. Метод выявления- бактерий рода Proteus, Morganetta, Providencia. М., - 1990.

21. ГОСТ Р* 50474-93 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечной палочки (колиформных бактерий). М., -1993.

22. ГОСТ Р 50480-93' Продукты пищевые. Метод выявления бактерий' рода Salmonella.-Ы.,-\99Ъ.

23. ГОСТ 10444.2-94 Продукты пищевые. Методы выявления и определения Staphylococcus aureus. М., - 1994.

24. ГОСТ 10444.15-94 Продукты пищевые. Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. М.,1994.

25. ГОСТ 30178-96 Сырье и продукты пищевые. Атомно-абсорбционный метод определения токсичных элементов. М., - 1996.

26. Государственная фармакопея СССР XI издания. М., 1987. - ч. 1,2.

27. Грезе И.И. О количестве хитина и кальцита в панцирях бокоплавов (АтрЫросЬ, Саттапска) / И.И. Грезе // Зоологический журнал. 1967. — Т. ХЬУ1, Вып.11. -С. 1655-1658.

28. Григорьева-Е.В. Жирнокислотный состав липидной фракции рачка гаммаруса и получаемого из него белкового биоавтогидролизата' / Е.В. Григорьева, О.Я. Мезенова // Рыбная промышленность. М., 2007. - №2. - С. 26-28.

29. Григорьева Е.В. Комплексная переработка балтийского гаммаруса с целью получения хитина, хитозана и белкового гидролизата / Е.В. Григорьева, О Л. Мезенова // Известия вузов. Пищевая технология Краснодар, 2007. - №3. - С. 3032.

30. Григорьева Е.В. Комплексная переработка балтийского гаммаруса с целью получения хитина, хитозана и белкового гидролизата / Е.В. Григорьева, ОЛ.

31. Мезенова // V Международная научная конференция, посвящ. инновациям в науке и образовании 2007 (23-25 оьсг.): доклады номинации «У.М.Н.И. К.» /КГТУ. Калининград, 2007. - С. 71-74.

32. Понтер X. Введение в курс спектроскопии ЯМР / X. Понтер. М., 1984. - Гл. 14,10.

33. Дацун В.М. Вторичные ресурсы рыбной промышленности. Использование высокоминерализованных отходов / В.М. Дацун. М., 1995. - 96 с.

34. Дацун В.М. Биологически активные вещества. Технология продуктов из гидробионтов / В.М. Дацун, Б.Н. Семенов; под ред. Т.М. Сафроновой, В.И. Шендерюка. М., 2001. - С. 448-486. ■

35. Дацун В.М. Кормовые продукты. Технология продуктов из гидробионтов / В.М. Дацун М., Колос, 2001. - С. 403-432.

36. Дехант И. ИК спектры полимеров / И. Дехант, Р. Данц M., 1976. - 463 с.

37. Децина А.Н. Белковые гидролизаты / А.Н. Децина, А.Г. Бачинский, В.И. Байбаков // Обзорн. инф. / ВНИИСЭНТИ. М., 1985. - Вып. 3. - 68 с.

38. Дутова E.H. Техническая микробиология рыбных продуктов / E.H. Дутова, М.М. Гофгарм, И.И. Призренова М., 1976. - 266 с.

39. Евдокимов И.А. Физико-химические характеристики растворов хитозана / И.А. Евдокимов, C.B. Василисин, JT.P. Алиева // Вестник СевКавГТУ, Сер. Продовольствие. 2003. - №1(6).

40. Евдокимов И.Н. Молекулярные механизмы вязкости жидкости и газа. 4.1, Основные понятия / И.Н. Евдокимов, Н.Ю. Елисеев.—М., 2005. 59 с.

41. Инструкция по санитарно-микробиологическому контролю производства пищевой продукции из рыбы и морских беспозвоночных (МЗ СССР № 5319-91

42. ОТ22:02.91).-м;,-.1991. • -.':"■;'; . . '

43. Куприна Е.Э. Способы получения и активации хитина и; хитозана. Хитин и хитозан. Получение, свойства и применение / Е.Э. Куприна, С.В. Володажская; под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова. М., 2002; - С. 44-63.

44. Курко В.И. Метода исследования процесса копчения и копченых продуктов / В.И. Курко М.,1977. - Вып. 192. ;

45. Курко В.И. Основы бездымного копчения /В.И. Курко. М., 1984; - Вып. 232.

46. Лебская Т.К. Химический состав и биохимические свойства гидробионтов прибрежной зоны Баренцева и Белого морей / Т.К. Лебская, Ю.В; Двинин, Л.Л.1. ■■ •• . • ■ ■•;; ■ ■■;■••-.•■. •.'■.■ . " ■ ■. мв - ' '. . • .: . . ■ . .

47. Констнтинова. Мурманск, ПИНРО, 1998. - С. 102-108. .

48. Г. Фармакогнезия: уч. Пособие / под ред. Г.П. Яковлева. СПб., 2006: - С.522-525.

49. Людгрюс Л.Л. Возможности использования ферментных .препаратов врыбообработке / Л.Л. Людгрюс //' ЦНИИГЭИРХ. Серия «Обработка рыбы и морепродуктов». - М., 1982: - Вып. 10. - С. 16-21.

50. Максимова О.Н. Антимикробная активность разномолекулярного хитозана в ' пищевых средах / С.Н. Максимова,. Е.В. Ситникова, ИЛ I. Ким и др. //

51. Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана: седьмаямеждунар. конф. (12-17 июня): материалы/Казань, 2006.- С. 296-298; ч

52. Мезенова О.Я. Разработка способа горячего копчения рыбы с применением коптильных препаратов и электростатического поля: дисс. канд. техн. наук:: 05.18.04 Технология мясных, молочных и рыбных продуктов / КТИРПХ; О.Я.

53. Мезенога:-Калининград, 1986;-248 с; •69: Мезенова О.Я. Научные основы. и технологии производства копченых продуктов: уч. пособие/ КГТУ;Ь^Я. Мезенова.-Калининград,,1997.-134с.,

54. Мезенова О.Я. Обоснование принципов технологии рыбных продуктов при использовании дифференциальных жидких коптильных сред / Мезенова О Л. -Калининград, 2000. 287 с.

55. Мезенова* ():Я. Получение хитина; и хитозана* из балтийского гаммаруса / О.Я. Мезенова, A.C. Лысова; Е.В. Григорьева // Наука, и образование — 2003:• Всероссийская 11ауч.-тех11. конф.: .материалы / М1 '1У. Мурманск, 2003. - 4:4. - С.• 202. .

56. Мезенова 0:Я. Технология получения хитин/хитозана из сушеного-гаммаруса с применением автоферментолиза / ОЛ: Мезенова, A.C. Лысова; Е.В. Григорьева,; С.М. Вильт// Известия Kl ТУ: научный журнал. 2004: - №5. - С. 72-76.,

57. Мезенова О.Я. Биотехнологический способ получения < хитозана: из Гаммаруса Балтийского>7 О.Я. Мезенова, A.C. Лысова; Е.В: Григорьева // Биотехнология:. состояние: и перспективы развития:, третий междунар. Конгресс: материалы. / Москва, г 2005.-С. 29.

58. Мезенова 0:Я. Совёршенствование.технологии хитина/хитозана из балтийского гаммаруса:/ ©^.Мезенова; E.B; Григорьева?// Современные перспективы в исследовании; хитинам и хитозана: восьмая; междунар. конф. (12-17 июня): материалы / Казань, 2006. С. 40-42.

59. Мезенова ОЛ. Технология комплексной^ переработки гаммаруса / О.Я. Мезенова, Е.В. Григорьева//Рыбная промышленность. 2006. - №3. - С. 22-23:178 л /.У

60. Мезенова О.Я. Биотехнология; морепродуктов / О.Я. Мезенова, Л.С. Байдалинова, А.С. Лысова М., 2006. - 560 с.

61. Мищукова Л.М. Химический состав; и. энергетическая ценность озерного бокоплава / А.М. Мищукова// Гидрологический журнал. 1986. - Т.22. - №1. - С.. ■ 61-64. ■ ' • / . . ■■ ; . . " .,;• .'' .

62. Моделирование и оптимизация технологических процессов- производства продуктов питания путем математического планирования эксперимента: метод, указания /КТТУ; О.Я: Мезенова. Калининград, 1995. - 50 с.

63. Немцев С.В. Хитозан из подмора новый продукт! пчеловодства / С.В. Немцев,-ОДО. Зуева,-.РЖ ^сма1улин//Ичел6юдстао:--2001с.--№5:.- 'С/50^5Ь85. , 11емцев С.В. Кутикула жуков станет новым источником хитина и хитозана / С.В.

64. Немцев, О.Ю. Зуева, В.Я. Исмаилов, В.П. Варламов // Современные иерсиекгавьт в исследовании хитш!а и хитозана: седьмая междунар. конф. (15-18 сент.): материалы / ВНИРО. СПб, 2003. - С. 36-38.

65. Неумывакин И.П. Алоэ. Мифы и реальность / И.П. Неумывакин. М., 2007. -128с.

66. Новиков М.Ю. Кинетика реакции деацетилирования хитина и хитозана / М.Ю. Новиков, Т.А. Орлова, И.Е. Веронина // Изв. Высш. Учебн. Завед., Сер. Пищевая Технология. -1990. №5. - С. 54.

67. Нудьга JI.M. Получение хитозана и изучение его фракционного состава / Л.М: 1 Нудьга, Е.А. Плиско, С.Н. Данилов // Журнал органической химии. — 1971. Т.1. XLI.-C. 111.

68. Панова B.C. Биохимический состав некоторых беспозвоночных / B.C. Панова, ' И.К. Трубачева, В.П. Барашков // Гидробиологический'журнал. 1982. - Т. 18; -№4. - С. 58-62.

69. Пат. 4199496 США, Способ получения хитозана / К.П. Пенистон, Э.Л. Джонсон. Перевод с англ. КЕЧ9121 ( Patent US 4199496 А). - Киев. -1984. - 20 с.

70. Пат. 2000066 РФ, Способ переработки мелких ракообразных с получением хитозана / В.П. Быков и др. (Россия). -1992.

71. Пат. 2123269 РФ, Способ безотходной комплексной переработки хитинсодержащего сырья / С.В. Левоньков, Н.М. Купина, Ю.Г. Блинов (Россия). -2003.

72. Пат. 2318831 РФ, Способ комплексной переработки рачка гаммаруса / О.Я.

73. Мезенова, Е.В. Григорьева (Россия). 2006.

74. Перетрухина А.Т. Практикум по общей микробиологии / А.Т. Перетрухина. -Мурманск. 1998. - 171 с.

75. Ржавская Ф.М. Жиры рыб и морских млекопитающих / Ф.М. Ржавская. М., 1976.-470 с.

76. Рогов И.А. Электрофизические методы обработки пищевых продуктов / И.А. Рогов.-М:, 1988.-272 с.

77. Роговина С.З. Твердофазная модификация хитина и хитозана в. условиях механического воздействия. Хитин и хитозан. Получение, свойства, и применение / С.З. Роговина; под ред. Т.М.' Сафроновой, В.И: Шендерюка. М., 2002. -С. 64-78.

78. ЮГ. Розенталь А.Д: Биотехнологические основы, переработки панциря антарктического криля: автореф. дисс. канд. биол. наук / ЛТИ им. Ленсовета; А.Д. Розенталь. Ленинград, 1988. - 17 с.

79. СалемОмер А. Разработка технологии получения хитина и хитозана из сепиона каракатицы: автореф.*дисс:. канд. техн. наук / А. Салем Омер Москва, 1995. -24 с.

80. СанПиН 2.3.2.1078-01- Гигиенические требования» безопасности и пищевой ^ ценности пищевых продуктов. М., 2001 i

81. Сафронова Т.М. Биохимические свойства хитинсодержащего сырья / Т.М. Сафронова, Г.П. Выговская, Т.Д: Щеголева // Э.И: ЦНИИТЭИРХ. М., 1974. -Вып.11.-С. 3-7.

82. Сафронова Т.М. Аминосахара промысловых рыб и беспозвоночных и их роль в формировании качества продукции / Т.М. Сафронова. М., 1980. - 280 с.

83. Сафронова Т.М. Производство кормовых, технических и медицинскихпродуктов из криля / Т.М. Сафронова, В.М. Дацун, В.Д. Богданов. Владивосток,1985.-71 с.

84. Сафронова Т.М. Применение хитозана в производстве пищевых продуктов. Хитин и хитозан.1 Получение, свойства и применение / Т.М. Сафронова; под ред. Т.М. Сафроновой, В.И. Шендерюка. М., 2002.- С. 346-359.

85. Семенова Н.К. Разработка технологии консервирования хитинсодержащих отходов переработки ракообразных / Н.К. Семенова. Владивосток, 1999: - 30 с.

86. Сенкевич Т. Молочная сыворотка: переработка и использование вагропромьпшгенном комплексе / Т. Сенкевич, K.JI Ридель. М., 1989. - 253 с.

87. Сидорчук Н.В. Использование некоторых белковых гидролизатов для приготовления питательных сред / Н.В. Сидорчук, Г.И. Яринова, H.H. Лизько // Микробиологическая промышленность. -1971. №8. - С. 11-13.

88. Скляр А.М. Исследование реологических свойств разбавленных и умеренно концентрированных растворов хитозана / А.М. Скляр, А.И. Гамзазаде, JI.3. Роговина // Новое в реологии: материалы XI Всесоюзного симпозиума по реологии // Суздаль, 1981. С. 86.

89. Скопцов В.А. Рост, обмен озерного бокоплава при разных температурах /

90. B.АСкопцов // Экология. -1981. №2. - С. 97-98.

91. Современные тенденции в способах получения и применения хитина и хитозана / Е.Э. Куприна, И.Ю. Козлова, К.Г. Тимофеева // Серия Обработка рыбы и морепродуктов: инф. пакет ВНИПКИЭИАСУРХа. М., 1999. - Вып. 3(1). - 60 с.

92. Спиридонов A.A. Планирование эксперимента: уч. пособие / A.A. Спиридонов, Н.Г. Васильев. Свердловск, 1975. - 150 с.

93. Справочник Антарктический криль / под ред. В.М. Быкова М., 2001. - 208 с.

94. Справочник по химическому составу и технологическим свойствам водорослей, беспозвоночных и морских млекопитающих./ под ред. В.П. Быков. М., 1999. - С. 118.

95. Стыскин E.J1. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / E.J1. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде М., 1986. - 213 с.

96. Султанов 3.3. Производство микробиологических питательных сред из отходов / 3.3. Султанов, М.М. Меджидов, Э.Д. Степанова // Рыбное хозяйство. 1991. - №6.1. C.74-75.

97. Телишевская Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение / Л.Я. Тслишевская. М., 2000.—296 с.

98. ТУ 15-02-538-89 Хитин для производства Д(+)-глюкозамина гидрохлорида. М., 1989. • '■/'.■'.' '.■■"■/:•:.,. ' .: , у126. '1У 9289-067-00472124-97 Хитозан пищевой. М, 1997. • .

99. ТУ 9289-003-42260732-97 Гаммарус для.промышленной переработки. М.', 1997:128: ТУ 9283-024-0476492-2002 Гаммарус кормовой сушеный. М.,2002.

100. Утеушёв Р.Р. Разработка технологии/ комплексной, переработки панцирьсодержащего сырья из ракообразных Волга-Каспийского . региона: автореф. дисс. канд. техн. наук / Астраханский I ТУ; Р.Р. Уюушев. Москва,2006.-26с. ■• '■■:;•■,.':.;• .v . ; ■■'■:. ' '

101. Феофилова Е.П. Хитин мицелиальных грибов: методы выделения, идентификации и физико-химические свойства / Е.П: Феофилова, В.М. Терешина, A.C. Менорская // Микробиология. -1995. Т. 64. - №1. - С. 26-30.

102. Феофилова Е.П. Перспективные источники получения хитина из природных объектов / Е.П: Феофилова, В.М. Терешина // Новые перспективы висследовании хитина и хитозана: V Всероссийская конф. (25-27 мая): материалы / ВНИРО. Москва-Щелково, 1999. - С. 76-78.

103. Франченко Е.С. Получение и использование хитина и хитозана из ракообразных / Е.С. Франченко, М.Ю. Тамова. Краснодар. - 2005. - 110 с.

104. Франченко Е.С. Получение хитозана из панциря речных раков / Е.С. Франченко, М.Ю. Тамова, ИМ." Сорокоумов и др. // Известия высших учебных заведений. Сер. Пищевая технология.»-2005. 5-6(288-289). - С. 125-126.

105. Цибизова М.Е. Разработка технологии получения белковых продуктов из отходов t рыбообрабатывающих предприятий: дисс. канд. техн. наук / Астраханский РТУ; М.Е. Цибизова. Астрахань, 2001. - 24 с.136. www.zoomir.spb.ru. гаммарус

106. Adam K.P. Analytik biogener Arzneistoffe. Phaimazuetische Biologie / K.P.' Adam, H. Becker. Stuttgart, 2000: - Band 4.

107. Advances in Chitin science, Volume IV, EUCHIS'99 The European Chitin Society / M.G. Peter. Potsdam, 2000. - 650 p.

108. AI-Bahra M.M. Darstellung von Chitinderivaten zur antimikrobiellen Ausrüstung von Textilien: Dissertation / Technische Hochschule Aachen; M.M- AI-Bahra. Aachen, 2004.-234 S.

109. Arndt K.-F. Polymer Charakterisierung / K.-F. Arndt, G. Müller. Dresden, Merseburg, 1996. "

110. Balau L. Physico-chemical properties of Chitosan films / L. Balau, G. Lisa, M: I. Popa // Central European J.of Chemistiy. 2004. - 2(4). - P. 638-647.

111. Bandemer H. Statistische Versuchsplanung/H: Bandemer, A'. Bellmann Stuttgart, 1994.-164 S.

112. Burchard W. Static and dynamic light scattering from branched polymers and biopolymers/ W. Burchard//Advances inPolymer Science. 1983,48. - P. 1-124.

113. Barnard J.L. & CH:M. Barnard. Freshwater Amphipoda of the world. I. Evolutionary Patterns, II. Handbook and bibliography / Barnard J.L. & CH:M. Barnard: Mt. Vernon, 1983.-830 p.

114. Callaghan P.T. H-l NMR! spectroscopy of polymers under shear and extensional flow / P.T. Callaghan, A.M. Gil//Rheologica Acta:-1999. 38(6). -P. 528-536.

115. Clasen* C. Formation and Characterisation of Chitosan Membranes / C. Clasen, T.A. Wilhelms, W.-M. Kulicke // Biomacromolecules. 2006. - 7(11). - P. 3210 - 3222.

116. Claußen T. Antibakterielle Aktivität der Chitosanhaltigen Wundauflage Chitoskin in vitro / T. Claußen, P. Mayer, P. Heisig // Zeitschrift fur die Wundversiegelung. 2006. -Nr.6. - S. 230-234.

117. Dais P. High-field 13G-NMR spectroscopy of b-D-glucans, amylopectin, and glycogen / P. Dais, A.S. Perlin // Carbohydr. Res. -1982. -100. P: 103-116.

118. Dostovalova A.I. Chitosanous gel influence on<microbe semination of burned wound / A.I. Dostovalova, V.N. Iljina // Sibirien Consilium: 2004. - №6 (36). - P. 48-51.

119. Dumitriu S. Polymeric Biomaterials /S. Dumitriu. Sherbrooke, Quebec, Canada, 2002. - 1168p.

120. Dumitriu S. Polysaccharides — Structural diversity and fiinctional versatility (2.ed.) / S. Dumitriu New York, 2005. - 1204 p.

121. Elbert A. Solid-state NMR spectroscopy of chitin and chitosan. Chitin Handbook / A. Elbert, H. Fink; ed. by R.A.A. Muzzarelli, M.G. Peter. Ancona, Italy, 1997. - P. 137

122. Eurorean Pharmacopoeia 5.0, Volum 1,01/2005.

123. Global Fish Standarts, Fish News, 1961. P. 28.

124. Gnelinski V. Verdampfung, Kristallisation, Trocknung: mit 30 Übungsbeispielen / V. Gnelinski, A. Mersmann, F. Thurner. Braunschweig, 1993. - 260 S.

125. Grigoryeva E.V. Das Verfahren zur Chitosan Gewinnung aus dem baltischen Krebs Gammarus lacustris / E.V. Grigoryeva, OJ. Mezenova // Chemie Ingenieur Technik. - 2007. - 79(8). - P. 1189-1194.

126. Grigoryeva E. Rationelles Verfahren zur Chitosan Gewinnung aus dem baltischen Krebs Gammarus lacustris / E. Grigoryeva, O. Mezenova // Die Ernährung. - 2008: — V.32 (l).-C. 16-22.

127. Gröber A. Biochemische und1- strukturelle Charakterisierung des chitinbindenden Proteins (CHB1): Dissertation / Universität Osnabrück; A. Gröber. Osnabrück, 2001. -156 S.

128. Günter H. NMR-Spektroskopie / H. Günter. Stuttgart, 1983. - 357 S:

129. Hillmann. P. Spurenanalytische Bestimmung von Schwermetallen mittels der Gaschromatographie / P. Hillmann. -1992. 104 S.

130. Hu R, Statistische Versuchsmethodik / R. Hu. -1994. 15 S.

131. Hwang J.K. Rheological properties of chitosan solutions / J.K. Hwang, H.H. Shin // Korea-Australia Rheology J: Vol. 12, Nr. 3A - P.-175-179.

132. Jaswal A.S. Amino acid hydrolysate from crab prosessing waste / A.S. Jaswal // J. Food Sei. 1990. - V.55(2). - P. 379-386.

133. Jolles P. Chitin and Chitinases / P. Jolles. Basel, 1999.-340 p.

134. Khan T.A. Reporting degree of deacetylation values of chitosan: the influence of analytical methods / T.A. Khan, K.K. Peh, H.G. Ching // J. Pharm Pharmaceut Sei.2002.-5(3).-P. 205-212.

135. Klein J. Chromatographie zur Bestimmung der Molmasse- und Teilchengrößenverteilung von Polymeren / J. Klein, W.-M. Kulicke, J. Hollmann. -Heidelberg, 1998. S. 317-349.

136. Knarr M. Rheologische Untersuchung und Modellierung der Sol-Gel-Charakteristika von Methylcellulose und kappa-Carrageenan: Dissertation / Universität Hamburg, FB Chemie; M. Knarr. Hamburg, 2003. - 221 S.

137. Knop S. Synthese und Charakterisierung von Symplex-Membranen zur Pervaporationvon Alkohol-Wasser-Mischungen: Dissertation / Universität Hamburg, FB Chemie; S.j

138. Knop. Hamburg, 2000. - 161 S.

139. Köblitz T. Die schonende Trocknung von temperaturempfindlichen Granulaten im Hochfrequenzfeld: Dissertation / Nürnberger Technischer Universität; T. Köblitz. — Nürnberg, 1984. -142 p.

140. Kraeber GmbH & CO, Pharmazeutische Rohstoffe. cited; Available from: http://www.kraeber.de/en/products/.

141. Kratochvil P. Classical light scattering from polymer solutions / P. Kratochvil. Elsivier Science Publishers B. V, 1987. - 334 p.

142. Krön S. Herstellung, Charakterisierung und Anwendung von kurzkettigen Chitosanen: Dissertation / Universität Kiel; S. Krön. Kiel, 2003. -166 S.

143. Kulicke W.M. Fließeigenschaften von Stoffen und Stoffgemischen / W.M. Kulicke. -Basel, Heidelberg, New York, 1987. 488 S.

144. Kulicke W.-M. Viscometry of Polymers and Polyelectrolytes / W.-M. Kulicke, C. Clasen. Berlin, Heidelberg, New York, - 2004. - 120 p.

145. Lavertu M. A vailidated 'H-NMR method for the determination of the degree of deacetylation of chitosan / M. Lavertu, Z. Xia // J. of Pharm, and Biochem. Anal. — 2003.-32.-P. 1149-1158.

146. Lengerken; J. Qualität und: Qualitätskontrolle bei,: Futtermitteln:; Methodik. Analytik. Bewertung/J! Lengerken.-2003;-314 p.

147. Linden G. New ingredients, in: food processing. . Biochemistry and; agriculture / G. Linden, D. Lorient Cambridge, England, 2000. - p. 100^117. ■1831. Liu H. Chitosan kills bacteria through; celllmembi^edknage'/ H; Liu, Y. Du: M., X.

148. Wang // infc J. of Food Microbiology. 2004. - 95(2). -P. 147-155. :

149. Nakashima^T. Mechanical Properties and Antimicrobial Efficacy of Chitosan Films / T. Nakashima, M: Matsuo, Y. Bin//Biocontrol Science.- 11(1). 2006:

150. S.P. Meyers, K.S. Lee // J; Agr. and Food Chem. -1989. 37(3). - P. 575-579.

151. Oetjen G.-W. Gefriertrocknen / G.-W. Oetjen. Weinheim, 1997. - 251 S.

152. Patent DE 4322956 AI, Folie aus Chitosan zur Wundversiegelung und Verfahren zu ihrer Herstellung/H:-J: Kaeßman (Germany), 1995.196: Patent DE 19530689 AI, Verfahren zur Herstellung, von Chitosan / Loth, Fritz (Germany), 1998.

153. Patent EP 0817803 Bl, Verfahren zur Aktivierung, von Polysaccharieden, danach hergestellte Polysaccharide und deren Verwendung / K. Ties (Germany). 1998.

154. Patent DE 102004047 115 B3, Verfahren zur Herstellung einer Wundauflage;/ W.M. Kulicke, T.A. Wilchelms (Germany), 2006.

155. Polymer Handbook. 4 ed./ed.-byJ. Brandrup, E.H: Immergut.-New York, 1999. 200: Produktnormen zur GMP-Regelung für den Tierfuttersektor GMP 14; 17-08-2005.

156. Ratajska M. The degree of deacetilation of chitosan: Optimization of the IR method / . M. Ratajska, M.H. Stms/czyk, S. Boiyriicc, M.G. Peter, F. Loth, // Polimeiy. 1997.

157. Vol.42(9). P. 576-579. , '

158. Revol J.-F. Effect of Degree of deacetylation of Chitin: on the Properties; of Chitin Crystallites / J.-F. Revol, J. Marchessault, R. H: Li //J. Appl. Polym. Sei. -1997. 65.

159. P.373-380. .,'.';v: ;V . ; ■203; Ritohie A.H. Preparation of fish protein hydrolysates / A.H. Ritohie, I.M. Mackie // Animal. l;eed Sci.Techn:-1982. Vol.7(2). - P. 125-133. ; ' ; V.-;'

160. Roberts G.F.A. Chitosan production routes and 'their in determining the' structure and properties of the product / G.F.A-. 'Roberts // Advances in cMtin; science, 7th ICCC (3-5 ' Sept.).-Lyon,France, 1997.-P.22-31. .

161. Rohstoffe K.G.G.P.Ghitosan: icited;Available from:. .- http://www.kraeber.de/en/products/| ' .

162. Struszezyk M.H. Herstellung von• Chitosan und«einige Anwendungen: Dissertation / Universität Potsdam; M.H: Struszezyk. Potsdam, 2000. -198 S.

163. Taschenbuch, für Lebensmittelchemiker: Lebensmittel, Bedarfsgegenstände, Kosmetika, Futtermittel / ed. by F. Wolfgang. Berlin, 2006. - 1162 p.

164. Tarky W. Protein hydrolysate from fish waste / W. Tarky, O.P. Agarwala, G.M. Pigott //J. Food Sei. -1973. V.38(6). - P. 917-918.

165. Tsai G.-J. Antibacterial Activity of Shrimp Chitosan against Escherichia coli / G.-J. Tsai, W-H. Su // J. of Food Protection. -1999. 62. - P. 239-243.

166. Uragami Z. Material Scince of Chitin and Chitosan / Z. Uragami, S. Tadashi, G. Tokura -2006.-277 p.

167. Wilhelms T.A. Neuartige hydrophile makromolekulare Netzwerke: Dissertation / Universität Hamburg; T.A. Wilhelms-Hamburg, 2005. 276 S.

168. Yamada T. Microbial Synthesis of Hyaiuronan and Chitin: New Approches / T. Yamada, T. Kawasaki // J. of Bioscience and Bioengineering. 2005. - Vol. 99(6). - P. 521-528.

169. Zakaria H. Chitin deacetylasen aus marinen Bakterien. Begutachtung Schwerpunkt Meeresbiotechnologie / H. Zakaria // Bericht. 2000.

170. Zotkin M. A. Thermal Modifikation and Study of the Structure of Chitosan Films / M. A. Zotkin, G.A. Vikhoreva, T.V. Smotrina // Fibre Chemistiy. 2004. -Nr. 1 - P. 16-20.