Изучение влияния цитокинов на функции эндотелиальных клеток человека перевиваемой линии EA.Hy926 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Амчиславский, Евгений Игоревич

• Амчиславский, Евгений Игоревич
• кандидат медицинских наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Амчиславский, Евгений Игоревич

СОКРАЩЕНИЯ. ВСТРЕЧАЮЩИЕСЯ В ТЕКСТЕ.

ВВЕДЕНИЕ.,.

Глава! ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ">шгы ангаогснеза.*.II

1.2. Ростовые факторы и цнтокнны, кшпрошфующие процессы автогенезе.

1 „3, Моделирование процесса ивлюгенеза.--.„

1.4. Поиск »утей целенаправленного воздействии на ангиогенез,.„

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Культура энлотелиальных клеток человека линии ЕА.11у92б.»

2.2. Цнгокины. ростовые факторы и пептиды.—

2.3. Определение чувствительности эцдогеяиальных клеток линии ЕА,Ну92б к цктотокс нческому действию различных биологически активных факторов (МТТ-тсст).„„„.,,.,.

2.4 Методы оценки пролиферзтнвной активности эндотелнальных клеток линии EA.11у926.

2.4Л. Оценка цролнфератнвноЛ активности эндотелнальных клеток линии ЕА.Иу926 с помощью окраски крирпип-вноаеюм ,.,„,.-.,

2,4-2. Оценка лросшфсритииной активности эндотелиальных клеток линии

ЕА.Ну92б с помощью окраски CFSE. ,.

2.4.3. Оценка пролнферативной активное! и эндотелналышх клеток линии ЕА.11у92б но включении) бромдсзокснурндина.

2.5. Получение коллагена 1 тиля.

2.6. Оценка миграции -эндотелнлльных клеток линии ЕА.Ну92б.

2,7 Оценка образования лглочелнальнымн клетками линии НА.Ну капилллроподобных структур на Матрнгсле.

2,8 Оценка адгезии эндотслиалышх клеток лнннн ЕА.Ну92б к коллагену I типа. „„

2.9. Оценка продукции ММР-9 зндотелнклышыи клетками лнннн ЕАЛу92б. .4«

2.10. Определение уровни экспрессии ннтетрнновою комплекса и\[13 на поверхности эндотелкальных клеток линии ЕА,Ну926.—.

2.11. Методы статистической обработки,-.,.—

Глади 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Разработка экспериментальной модели для изучения влияния биологически активных препаратов на функции шло км пальник клеток с использованием перевиваемой лнннн эндотслиальных клеток человека ЕА.Ну926----------------, .*--------„„*----------------------------------------.

3,1.1 Разрабо1ка экспериментальной модели оценки пролнферэтнвной активности -шдотелнальных клеток человека линии ЕА.Ну926.

3.1.2. разработка экснериме шальной модели оценки миграннн эндотелмальних клеток человека линии ЕА.Ну926. . „

3.1.3. Разработка ^ксперимекталыюй модели оценки формирования капилляроподобных структур эндотсдиальиымн клетками человека линии ЕА,Ну926.

3.1.4. Разработка экспериментальной модели опенки адгезнн шдотелнальных клеток человека линии ЕА,Ну926 к коллагену 1 типа.

3.1.4,1 Влияние концентрации коллагена 1 типа на адгезию эцдотелнжлышх клеток человека лнннн ЕА.11у926.

3.1,4.2. Влияние длительности инкубации на интенсивность адгезии эндотслиальных клеток человека линии

ЕА-Ну92б к коллагену I типа.

3.2. Влияние ростовых факторов и цнгокиков на функции зндотел нал иных клеток человека лнннн ЕА.Ну926 с использованием разработанной экспериментальной модели.

3,2,1 Влияние ростовых факторов УЕОР, ЬРОР к СМ-СБР на функции ттотелиальных клеток человека линии ЕАЛу^Зб.

3.2.1.1 Влияние ростовых факторов УЕвР. ЬГОИ и ОМ'С^Р на пролиферацию эндотелналькых клеток человека линии ЕА.Ну

3-2.1-2- Влияние ростовых факторов УЕОР, ЬРСР н СМ-СЭР на мж рацию эндотелнальиых клеток человека линии ЕА,Ну926.

3.2.1.3. Влияние ростовых факторов УЕСР и ЬРОР на способность зндотелиальных клеток человека линии ЕАЛу926 формирован, калилляроподобные структуры.

3.2.1.4 Влияние ростовых факторов УЕОР* ЬРСР н СМ-С5Р на адгезию ->ндотслнальных клеток человека линии ЕА,Ну926 к коллагену I тина.

3.2.1-5- Влияние ростовых факторов УЕОР и ЬРСР на экспрессию интегрннового комплекса аур? на поверхности эндотелнальных клеток человека линий ЕАЛу926.

3.2,1.6. Влияние ростовых факторов УЕСР и ЬРСР на продукцию ММРэнлотелиальныын клетками человека линии ЕА.Ну926.

3.2.2. Влияние провоспшипеяыш цнюкннов ТТ^Рп. 11.-8, 1Р№ н 1Р№р на функции эндотелнальных клеток человека линии ЕА-Ну92б.-.,

3.2-2.1 Влияние провоспалнтедьных цитокинов на пролиферацию

•>ндотелиальных клеток человека линии ЕА.Ну926.

3-2.2.2. Влияние провосналителышх цитокинов на мшрапню эндотелнальных клеток человека линии ЕА.Ну926.„,„„.„.».,

3.2.2-3. Влияние цровоспалительных цитокинов на способность эндотелнальных клеток человека линии ЕА.Ну926 формировать капндляроподобные структуры.

3.2.2.4- Влияние провосналительных цитокинов на адпдию эндотелнальных клеток человека линии ЕА11у92б к коллагену I типа.

3-2,2.5 Влияние провосналительных цшокннов на экспрессию интегрннового комплекса а\|}3 на поверхности эндотелнальных клеток человека линии ЕА-Ну92б.„„.»

3.2.2.6. Влияний провосналнтсльных шгтокинов на продукцию ММР-9 линпшиьнши клетками человека л ни и и ЕА.Ну926.

3,2.3. Влияние противовоспалительною ишокина 11,-4 на функции эндотелшьных клеток человека линии ЕАНу926.

3.2.3,1 Влияние противовоспалительного тгтокина 11.-4 ни пролиферацию ->ндотелмальных клеток человека линии ЕА,Ну926. .,

3.2.3.2. Влияние противовоспалительного щпчжииа 11,-4 на миграцию эндотелиальных клеток человека линии ЕА.Ну92б.

3.2.3.3. Влияние противовоспалительного питокина 11.-4 на способность эпдетеяи&лышх клеток человека линии ЕА.Ну926 формировать шшироподобные структуры.

3.2.3.4. Влияние ггротпвовоегшнггелмюго цитокина П.-4 из «дгезяю эндотедиальных клеток человека линии ЕА.Ну92б к коллагену (типа.

3.2.3.5. Влияние противовоспалительного шггокииа 1Ь-4 на экспрессию интегрннового комплекса аурЗ на поверхности эндогелнальных клеток человека л нннн ЕА Л 1у92б.„,.

3.2.3.6. Влияние ирогнвовоспалигельного пигокнна 11-4 на продукцию ММР-9 эндотелнлльнымн клетками человека линии ЕА-Ну926.92'

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ.*.,

ВЫВОДЫ.

СПОСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

СЛИСОК СОКРАЩЕНИЙ

EM - Gavutbiiax ycMGpaiiit

UKM - IHlCKJICTOHHUft MfftpHBC I MK - i."ia.iKOMU!iicHnas KncrKa /IK - ;»cHjipHTH3« mcTKa £¿1 - CJ1HH HM ^CflCTBH*

Mil - MOHOUKT

M<{3 - yaKpcxJjur

Oil - oiTtHHtfcKu n.ioTHO<m>

PA - pcBMirroH^HWfi apipMT

3K - -jiuotcjiiuvittuii (Ciena

3TC - iM6pHoHa.'itnaji tcnfl4Lfl cu&oporKa

DCP - ificicitpsiTHO-<OJicBoB pacreop

CSF - colonystimulaling factor

EGF - epidermal growlh factor aFGF - acid fibroblast growth factor bFGF - basic fibroblast growth factor

BrdU - 5-bromo-dcoxy uridine

CO - cluster designation

CFSE - carboxy-fluorescein diacctatc, succinimidyl ester

FCS - fetal cuff scrum

FSC - forward light scatter

G-CSF - granulocyte colonystimulaling factor

GM-CSF - granulocyte-macrophage colonystimulaling factor

GRO - growth-related oncogene

IIOMEC-I - human dermal microvascular endothelial cells

HIF-I - hypoxia inducible factor

HLfVEC - human umbilical vein endothelial cells

1CAM-1 - intercellular adhesion molecule

IFN - interferon

L - inierkukin

TP-10 - intcrfcron-T-inducible protein-10 IGF-1 - insulin-like growth Factor-1 L1F - leukemia inhibitory factor MCP-J - monocyte chcmoiiiclic protein-1 M-CSF - monocyte colony-stimulating factor M1G - monokine induced by interferon-? MMP - matrix mctaltoprotcinase

VJ7T - 3-[4,5-dimethyJlhiazol-2-yJ]-2,i-diphemJ letrazoJiuirt bromide

NO - nitric oxygen

OD - optical density

PAt-l - plasminogen activator inhibitor

PECAM-) - plsteld entkuheJiaJ ceJJ adhesion molecule-J

PF4 - platelet factor

PDGF - ptutctel derived growth factor

PLGF - placental growth factor

RANTES - regulated on activation, norma) T-ccJJ expressed and secreted SSC - side tight scatter

STAT - signal transducer and activator of transcription IF - tissue factor

TGF/J - transforming growth iaetor p

TlMPs - tissue inhibitor metalloprotcinases

Th - T-lymphocytes helper

TNF - tumor necrosis Factor

TSP'i - thrombospondine-I uPA - urokinase-type plasminogen uPAR - uroklnasc-typc plasminogen activator receptor

VCAM-1 - vascular cell adhesion molecule

VE-cadbrri» - vascular endothelial cadfxrin

VEGF vascular endothelium growth factor vWF von Willebmnd factor

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение влияния цитокинов на функции эндотелиальных клеток человека перевиваемой линии EA.Hy926»

Актуальность проблемы,

Лнгногснез представляет собой многоступенчатый процесс, который включает взаимодействие нескольких типов клеток и медиаторе» в соответствующем мнкроокруженнн, благоприятном для формирования новых сосудов из предсу шествующих. Лнгногснез очень редко происходит при физиологических условиях (циклические процессы в репродуктивной системе, раноэаживдение, обновление волосяного покрова), но может вносить существенный вклад в патогене? ряда патологических процессов {канцерогенез, гемоблдстозы. ревмаюндный артрит, оетсоартрнт. псориаз, нсспсцифнческий язвенный катит, диабетическая ретинопатия). Клетки - участники вослял нтельн о го процесса (Т-личфошгш, моноцит/макрофаги, дендритные клетки, нейтрофилы) участвуют в регуляции ангиотенеза за счет продукции про- и противовоспалительных цитокинов, ростовых факторов, которые влияют на функции эндотел иальных Клеток (ЭК): их пролиферацию, миграцию и дифференпнровку. В связи с тесной сопряженностью процессов воспаления н литогенеза весьма актуальным является изучение характера влияния цитокинов на свойства ЭК и на aiu иогенез в целой.

Н литературе отражены результаты отдельных исследований, свидетельствующие о возможности стнмулнруюшнх н ннгнбнрующнх эффектов цитокииов в отношении ашногенеза. Однако результаты этих исследований чрезвычайно вариабельны. Это связано с многообразием используемых жсоериментальных систем и с гетерогенностью ЭК. D частности, данные, полученные с использованием микрососуднстого эндотелия, отличаются от наблюдений, сделанных на клетках макрососудов. Результаты, полученные на первичных культурах ЭК, отличаются от результатов, полученных на перевиваемых культурах. Эффскш разных шнокннов изучались в разных экспериментальных системах и полученные результаты не сопоставимы.

Цель работы.

Провести изучение влияния росювых факгорои н ци'гокннов на функции ЭК человека с использованием и качестве экспериментальной модели перевиваемой линии клеток ЕЛ.Ну926.

В процессе работы решались следующие додачи:

1. разработать оптимальные методы опенки пролиферативной, миграционной, адгезионной активности ЭК человека линии ЕА.Ну926, экспрессии ими шгтегрнноиош комплекса avß3 и продукции матриксной мсталлоирогеН1ШШ-9,

2. разработать метол количественной оценки способности ЭК человека линии ЕЛ. Ну 926 формировать капил ля рол сдобные структуры;

3. изучнгь влияние ростовых фактором и шпокинов ни функции ЭК с использованием разработанной экспериментальной модели.

Научная новизна работы.

В холе работы была разработана новая экспериментальная модель, которая позволяет проводить изучение влиянии биологически активных веществ ид важнейшие функции ЭК человека линии ЕА,Ну92б. Впервые лровелено сопоставление влияли» основных ростовых факторов и разных цтокинов на свойства ЭК, причастные к антиогенезу. а рамках одной экспериментальной модели. С использованием такого подхода впервые было показано, что IL-8 может играть роль более мощного индуктора пралифератнвиого ответа ЭК, чем ангногсниыс ростовые факторы VEGF и bFGF, Результаты работы позволили выявить новое свойства ростовых факторов VEGF и bFGF - усиливать адгезию ЭК. Впервые выявлены противоречивые характеристики IFN7 и GM-CSF, которые способны избирательно повышать сродство ЭК к коллагену ] типа при отсутствии влияния на лругие свойства

ЭК. Также впервые была [(оказана экспрессии интагринового комплекса а\'рЗ на поверхности ЭК человека линии ЕАЛу92б.

В ходе работы были разработаны ноше модификации методой оценки проднфератншюп активности ЭК с использованием антаяьного внутриклеточного флуоресцентною красителя белка СР5Е и количественной оценки способности ЭК линии ЕАЛу926 формировать юн]илляроподобныс структуры на Матригелс.

Теоретическая и практическая значимость работы,

В ходе работы была разработана новая экснернменталиная модель, которая поз вол»« проводить изучение влияния биологически активных веществ на важнейшие функции ЭК человека линии ЕА-Ну926. Впервые проведено сопоставление влияния основных ростовых факторов и разных щггокиноп на свойства ЭК, причастные к ангиогенезу, » рамках одной экспериментальной модели. С использованием такого подхода впервые было показано, что 1Ь-8 может играть роль более четного индуктора гтролифсршнвного ответа ЭК, чем ангногенные ростовые факторы УЕйР н №№. Результаты работы позволили выявит, новое свойства ростовых факторов Ч'КСР и ЫОГ - усиливать адгезию ЭК. Впервые выявлены противоречивые характеристики ИгМу и СМ-С51\ которые способны избирательно повышать сродство ЭК к коллагену 1 тина при отсутствии влияния на другие свойства ЭК. Также впервые была показана экспрессия ннгсгринового комплекса йу|й на поверхности ЭК человека линии ЕАЛу92б.

В ходе работы были разработаны новые модификации методов опенки пролнферативлой активности ЭК с ж пользованием витального внутриклеточ ного флуоресцентного красителя белка СГБЕ и количественной оценки способности ЭК линии ЕА.Ну92й формирован, капнлляроподобные структуры на Матригелс.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

I, Разработанная экспериментальная модель позволяет проводить комплексное изучение про- и пнтнангиогенных эффектов биологически активных веществ;

2, Ростовые факторы VEGF, bFGF и провоспаянтельныс шггокины TNFa, tL-l{J, 1L-X оказывают однонаправленное стимулирующее дейетвие eta свойства ЭК человека линии ЕА.Ну926, актуальные для ангногенпа.

3. IFNa зарекомендовал себя как ингибитор антигенного потенциала ЭК человека лншш ЕА,Ну92б.

Реяли шин и работы. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них - 3 статьи. Материалы диссертационной работы представлены на научной конференции с международным участием "Дин иммунологии н Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2002, 2003. 2004, 2005 и 2006гг.), на 6вВ и 7ой международной школе иммунологе« им, Дж. Хамфри (Пушнно. 2003 н 2005 гг.), на 12м международном конгрессе по иммунологии "Clinical and Investigative Medicine" (Канада, 2004), ни 18м Американском симпозиуме по иенгндам (США, 2004).

Объем н структура диссертации. Объем работы составляет 121 страницу машинописного текста, включая 32 таблицы н 18 рисунков. Список литературы из 132 наименований

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Амчиславский, Евгений Игоревич

ВЫВОДЫ.

Г Разработана экспериментальная модель с использованием перевиваемой линии эндогел мольных клеток человека ЕЛ Ну926, пригодная для изучения про- и антнангиотеиных эффектов биологически активных веществ;

2. Ростовые факторы УБОР и ЬРбР стимулировали основные свойства эндотелнальных клеток человека линии £А-Ну92б: УЕСР более эффективно стимулировал образование шшдл яро подобных структур, a bFGF сильнее стимулировал пролиферацию клеток jioft линии;

3. Провоспалнтельиый цнтокин TNFo, который в высокой концентрации ингибнровш! пролиферацию клеток линии ЕА.Ну92б, стимулировал все остальные изученные функции эидотеяиальных клеток человека линии ЕАНу926: повышал интенсивность адгезии, мш рации эндотелиальных клеток, экспрессию иите трикового комплекса avp3, продукцию ММР-9 н формирование каннлляроподобных структур in vitro;

4. Провоепалнгельные цитокнны IL-Iji н 1L-8 однонанравлено влияли на свойства эндотелиальных клеток линии ЕА-Ну926, стимулируя пролиферацию, миграцию, продукцию ММР-9 и адгезию клеток к коллагену I тина, но IL-8 обладал наиболее выраженным стнмулнрующим действием на пролнфераштю. а 1L-10 сильнее стимулировал адгезию и продукцию ММР-9,

5, fNFa оказывал а1гтнангиогеинос действие на тндотелнальные клетки линии ЕА Ну92б, ннгпбируя их пролифсра1Н1ю, миграцию и продукцию ММР-9;

6. II.-4 сгнмулнровал пролиферацию ■энлотслиальных клеток человека линии ЕА.Ну926, ие влияя при этом на основные характеристики эндотелиальных клеток, в то время как IFNy проявил наиболее выраженное из весх изученных факторов стнмулнруюшее действие в отношении адгезии клеток линии ЕА Ж 926 к коллагену I тнла

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Амчиславский, Евгений Игоревич, 2007 год

1. Ярнлин, А. А Основы иммунологии. Медицина, 1999. Москва- 607 с,

2. Horst Ibelgayft's СОРЕ bFGP, Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10,3 htwftgpinviiJ^^ j 2002.

3. Horst Ibelgayft's COPE GROa. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10-3.:

4. Horst Ibelgayft's COPE IFNci. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10.3 http://copcwtthcvlokincs.d&'copc.cgi?CK)4927//, 2002.

5. Horst Ibelgayft's COPE IPN&, Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10,3.: http://coi>cw-iUKVtok3nes,cte(<^.cej?Q0493M. 2002.

6. Ц Horst Ibelgayft's COPE IFNy. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10J: http:tfcopewilhcMokincs.cto'cooe.cei?004941 ft. 2002.

7. Horsl Ibelgayft's COPE IP-10 Cytokine Online Palhfinder Encyclopaedia, 10-3.: http./.fcopewithc%1okines-dc/copc.cai?00540j//. 2002.14, Horst Ibelgayft's COPE MIG. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10,3.

8. Horst Ibelgayft's COPE PDGF. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10,3-hnp^vcopewiihcvtokincs,de--copc-cei?007527//. 2002.

9. Horsi Ibelguyffs COPE PF-4. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10.3: hHp://copcwithevtokincs.d&''cope-Cgi?00?582/''. 2002.

10. Horst IbclgayfVs COPE PLGF Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10,3.:

11. Horsi Ibelgavft's COPE TCFp. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10,3,: htlp:.'.'copcwidM.-viokincs.dc,'copc.cBi'?009190//. 2002,

12. Horet Ibelgavft's COPE TNFa. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, !0,3.;http:i7copewithcYtokincs.de/cope.eia70Q9404/'1. 200220, Horsi Ibelgavft's COPE VEGF. Cytokine Online Pathfinder Encyclopaedia, 10J.:

13. Aase, K . Eymboussaki, A., Kaipaincn, A , Otofsson. B. Alitalo, K., and Eriehson, U, Localization of VEGF-B in the mouse embryo suggests a paracrine rale of the growth factor in ihc developing vasculature. Dev Dyn, 215: 12-25, 1999.

14. Angiofillo, A., Sgadari, C-, and Taub, D. Human intcrfcron-induciblc protein 10 is apoleni inhibitor of angiogcncsts in vivo, Journal of Experimental Medicine, 182: 155-162, 1995,

15. Angulo R, Fulchcr D. A. Measurement of Candida-specific histogenesis comparison of carboxyfiuorescctn succimmidyl ester labeling of T cells, thymidine incorporation, and CD69 expression, Cytometry, 34 (3): 143-51,1998.

16. Aucrbach, R., Lewis, R„ Shinncrs. B , Kubai, L. and Akhtar. N. Angiogencsis Assays: A Critical Overview. Clinical Chemistry, 49: 32-40, 2003,

17. Baatout S. Endothelial differentiation using Matrigcl, Antican. Res., 17: 451-456. 1997.

18. Baker, A., Edwards, D„ and Murphy. G. Mctalloprcrteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities, Journal of Cell Science, 115: 3719-3727, 2002,

19. Bikfalvi. A„ Savona, C., Perollet, C„ and Javer/at, S. New insights in the biology of fibroblast growth tactor-2. Angiogenesis, 1:155-173, 1997.

20. BisehoiE J. Approaches to studying cell adhesion molecules in angiogenesis Trends in Cell Biology, 5:69 74, 1995.

21. Brooks, P. C. Role of intcgrins in angiogenesis, Europe Journal of Cancer, 14 2423-2429. 1996.

22. Bussolino. F-. Albini, A., Camussi, and al, e Role of soluble mediators in angiogenesis Europe Journal of Cancer., 32A: 2401-2412. 996.

23. Cat laid, R and Gearing, A. The cytokine facts book. Academic Press edit ion, p 260. London, 1994.

24. Carmeliel. P. Angiogenesis in life, disease and medicine, Nature, 438: 932-936, 2005,

25. Caste.Ion, K-. Hamdi, H-, Sacerio. I., Aoki, A. Kcimey, C-, and Ljubimov, A, Effect of Angiogenic Growth Factor Combinations on Retinal Endothelial Cells. Experimental Eye Rcsearchrcs, 74; 523-535,2002.

26. Clark. D. E. Placental angiogenesis: role of the VEGF family of proteins. Angiogenesis. 2: 309-318, 1998.

27. Couhglin. C., Salhany, K., and Wysoeka, M. lntcrleukin-12 and interleukin-18 synergistically induce murine tumor regression which involves inhibition of angiogenesis- Journal of Clinical Investigation. 10): 1441-1452., 1998.

28. Cramer, D,, Sullivan, Bickncll, R. and Barker, J, Angiogenesis in psoriasis. Angiogenesis, 5: 231-236, 2002.

29. Defilippil P., Truffa G , Steftnuto G. Altnida F. Silcngo L. and Tarone G. Tumor Necrosis Factor CY. and Interferon y Modulate the Expression of the Vitronectin Reccptor (Integrin p3) in Human Endothelial Cells J. of Biol. Chcrn,, 12: 76387645, 1991.

30. Dentelli. P., Del Sorbo, L„ Rosso, A., Mol mar. A,, Garbarino, G„ Cammussi, G., Pegoraro, L.( and Brizzi, M. Human IL-3 stimulates endothelial cell motility and promotes in vivo new vessel formation. J. Immunology, 163: 2151-2159, 1999

31. Dinarello, C, Biological basis for Interleukin-1 in disease. Blood. 87 2095-2147, 1996,

32. Diittcr, J., Hirth, A., Kurowska-Stolarska. M-, Gay, R-. Gay, S. and Distler, O Angiogenic and angiostatic factors in the molecular control of angiogenics. The Quarterly Journal of Nuclcar Medicine. 47: 149-161,2003.

33. IKorak, H. Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a critical cytokine in tumor angiogenesis and a potential target for diagnosis and therapy. J Clin Oncot, 20: 4368-4380.2002.

34. Dvorak, H-, Bronwn, L,, Dctmar. M., and Dvorak, A. Vascular permeability factor1 vascular endothelial growth factor, microvascular hypermcability, and ungiogenesis Am J Pathol, 146: 1029-1039, 1995

35. Perrara, N. Vascular endothelial growth factor: basic science and clinical progress. Endocr Rev, 25: 581-611,2004

36. Ferrara. N. and Kcrbel, R, Angiogenesis as therapeutic target. Nature. 438: 967974,2005.

37. Friesel, R. Komoriya, A„ and Maciag. T. Inhibition of endothelial cell proliferation by gamma-interieron. Journal of Cell Biology, 104: 689-696, 1987.

38. Pulcher D„ Wong S Carboxy fluorescein succmimidyt ester-based proliferative assays for assessment of T cell function in the diagnostic laboratory, J. Cell Biol,, 77(6): 559-64, 1999.

39. Fukushi. J., Ono, M. Morikawa, W„ Iwamoto, Y. and Kuwano. M- The activity of soluble VCAM-I in angiogenesis stimulated by IL-4 and 1L-I3 Journal of Immunology, 165: 2818-2823,2000.

40. Giancotit. F G„ Ruoslahti, E„ and 1028-32 Integrin signaling, Science, 285 1028-1032, 1999.

41. Gimbronc, M„ Nagel, T„ and Topper, J. Perspectives series: cell adhesion in vascular biology. Journal Clinical Investigation. 99: 1809-1813, 1997.

42. Gloe, T. Sohn. H,, Mciningcr. G„ and Pohl. U. Shear strcss-induccd release of basic fibroblast growth factor from endothelial cells is mediated by matrix interaction via integrin av(J3, Journal Biolgical Chemistry, 277: 23453-23458, 2002,

43. Griffiocn, A. W. and Motema, G, Angiogencsis: potentials for pharmacologic intervention in Uic treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation Pharmacological Reviews, 52: 237-268, 2000,

44. Ito Y-. bvamoto Y., Tanaka K-. Okuyama K. and Sugioka Y. A quantitative assay using basement membrane extracts to study tumor angiogencsis in vivo. InL J Cancer, 67: N8-152, 1996.

45. Ilirota, К Kipoxia-induciblc factor I, a master transcription factor of cellular hypoxic gene expression. Journal of Anesthesiology, 16: 150-159, 2002.

46. Horton, M. The avb3 Integrin "Vitronectin Receptor". Int. J. Bioehcm., 29: 721725, 1997.

47. Janeway, C-, Travcrs, P., Walport, M., and Shlomchik, M. (cds.) Immunobiology, 5 edition, p. 732, New York; Garland Publishing, 2001.

48. Jitv, Y-, Lien, W„ Tsai, Yang, G-, Li, С, and Wu, L Distinct regulation of genes by bFGF and VEGF-A in endothelial celts, Angiogencsis, 4: 313-321, 2001,

49. Jones, K.H. and Kniss D.A. Propidium iodide as a nuclear counterstain for immunofluorescence studies on tells in culture. J Histochem and Cytochem., 35(1): 123-125, 1987.

50. Joukov. V., Soma, T„ Jcltseh. M„ Claesson-Welsh, L., Cao, Y. Saksela. O^ Kalkkinen, A., and Alitalo, K. Proteolytic processing regulates receptor specifity and activity of VEGF-C. EMBO J, 16: 3898-3911,1997.

51. Jussila, L, and Alitalo, K. Vascular growth factors and lymphangiogencsis. Physiology Review, 82:673-700,2002.

52. Kirkpatrick, C., Otto. M., Kooten. Т., Krump-Konvalinkova, V., Kriegsmann, J„ and Bittcnger, F. Endothelial cell culture as a tool in bimmaterial research. Journal of Material Science . Materials in Medicine, 10: 589-594, 1999.

53. Klein С, I A new quantitative test method for cell proliferation based on detection of the Kt-67 protein. Jour. Mater. Scicn.: Material in Med . 11: 125-132, 2000.

54. Koflcr, S., Nickel, T., and Wcis. M. Role or cytokines in cardiovascular diseases a focus 0« endothelial responses to inflammation. Clinical Science, 108: 205-213t 2005.

55. Kukk. E,, Lymbousski, A., Tatra, S„ Kaipainen, A,, Jcltsch, M., Joukov. V., and Alitato, K. VEGF-C receptor binding and pattern of expression with VEGFR-3 suggest a role in lymphatic vascular development. Development, 122: 3829-3837, 1996.

56. Kure, H. Physiology of angiogenesis, J Neurooncol, 50: 17-35, 2000.

57. Lee, H. Enhancement of Human Endothelial Cell Adhesion to Type I Collagen by Lysophosphatidic Acid (LPA) and Sphingosme-1-Phosphate (SIP). Taiwania, 49: 67-79,2004.

58. Lcibovich, S, J,, Polverini. P J , Shcpard, H. M-, and a|., e. Macrophage-tnduced angiogenesis is mediated by tumor necrosis Tactor-a, Nature Medicine, 329: 630632, 1987.

59. Li, A„ Dubcy, S., Varney, M„ Dave, B„ and Singh, R, IL-8 Directly Enhanced Endothelial Cell Survival, Proliferation, and Matrix Metalloproteinases Production and Regulated Angiogenesis. The Journal of Immunology. 170: 3369-3376, 2003.

60. Li, A. Dubcy. S„ Vnrney, M. and Singh. R- Intcrleukin-S-lnduced Proliferation. Survival. and MMP Production in CXC'RI and CXCR2 Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Microvascular Research. 64 476-481,2002.

61. Little, D. Fraser, K., Fleming, S„ Mercer, A., and AJ, R, Homologs of vascular endothelial growth factor are encoded by the poxvirus orf virus. J Virol, 68: 84-92, 1994.

62. I.onser, R. von Hippel-Landau disease. Lancct, 361:2059-2067, 2003,

63. Lyons A. B. Analyzing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement ofCFSE dyes dilution. J. Immun Meth,, 243 <1-2); 147-54, 2000

64. Maicr. J„ Morclli, D., and Balsari, A. The differential response of interferon-gamma by normal and transformed endothelial cells. Biochcm Biophys Res Commun, 30; 4239-4243,1995.

65. Maragoudakis, M. K. Angiogenesis: models, modulators, and clinical applications. Vol. 298. p. 571,1998,

66. Mason. J., Lidingston. E„ Ahmad, S„ and Haskard, D, bFGF and VEGF synergistically enhance endothelial cytoproteetion via decay-accelerating factor induction. Am J Physiol Cell Physiol, 282: 578-587, 2002.

67. Miller, K- Issues and challenges for antiangiogcnic therapies. Breast cancer research and treatment. 75; 45-50, 2002,

68. Montana E,, Casaroli-Marana R., Vilaro S. ND Pagan R. Comparative study oF tube assembly in three-dimensional collagen matrix and on Main gel coats. Angiogenics is, 5 167-172,2002.

69. Morgan CD., Mills K.C., Lelkowitz D,L-, l.cikowift S.S. An improved colorimctric assay for tumor necrosis factor using WEH I 164 cells cultured on novel micro!iter plalcs. J. of Immun. Meth., 145: 259-262, 1991.

70. Mukaida, N., Ketlinsky, S. and Matsusuima, K. lncrleukm-8 and other CXC chemokines. In: The cytokine handbook, 4th. Academic Press edition. Vol, 2, pp. 1049-1081.2003.

71. Naldini. A. and Carraro, F. Rote of Inflammatory Mediators in Angiogenesis. Current Drug Target inflammation &. Allergy. 4:3-8. 2005.

72. Natdini. A , Pucci, A„ Bernini* C. and Carraro, F Regulation of Angiogenesis by Till and Th2-Type Cytokines. Current Pharmaceutical Design. 9: 511-519,2003.

73. Nanobashvili.}., Joxkowie/., A„ Neumayer. C., Fugt, A., Sporn, E,, Potierauer, P., and Huk, 1- Comparison of Angiogenic Potential of Human Microvascular Endothelial Cells and Human Umbilical Vein Endothelial Cells. European Surgery, 35: 214-219, 2003.

74. Ncufeld, G , Cohen, T,, Gengrinovjtch. S, and Poltorak, '/- Vascular endothelial growth factor (VEGF) and ils receptors, FASEB J, 13: 9-22, 1999.

75. Nimni, M. Polypeptide growth factors: targeted delivery systems. Biomaterials, 18: 1201-1225, 1997.

76. Niiato, R. E„ Tille, J.-C, Jonezyk, A. Goodman, S, L-. and Peppc. M, S. avb3 and avb5 integrin antagonists inhibit angiogenesis in vitro, Angiogenesis, 6; 105119,2003,

77. Ng L„ McConnetl M„ Tan C.t Downey K, M„ Fisher P A 1993. Interaction of DNA polymerase S, proliferating cell nuclear antigen, and synthetic oligonucleotide template-primers.

78. Nor. 1 E, and Polverini, P J- Role of endothelial cell survival and death signals in angiogenesis. Angiogenesis, 3: 101-116, 1999.

79. Obeso J. . Weber J,, Auerbach R. A. A hcmangioendothctioma-derived cell line: ils use as a model for the study of endothelial cell biology. Lab, Invest,, 63: 259269,1990.

80. Palcolog, E- Angiogenesis: a critical process in the pathogenesis of RA a role for VEGF. British Journal ofRheumatology, 35: 917-920, 1996,

81. Palcolog, E. and Miotla, J, Angiogenesis in arthritis: role in disease pathogenesis and as a potential therapeutic target. Angiogenesis. 2: 295-307, 1999.

82. Papctti. M and Herman, I. Mechanism of normal and tumor-derived angiogenesis. American Journal of Cell Physiology, 282: 947-970, 2002,

83. Pepper, M. Role of the matrix metalloproteinase and plasminogen activator-plasm in systems in angiogenesis. Thromb. Vase, Biol., 21: 1104-1117,2001.

84. Pepper, M. S. and Skobc, M. Lymphalic endothelium: morphological, molecular and functional properties. The Journal of Cell Biology, 163:209-213,2003.

85. Rak. J. Mutant ras oncogene up regúlales VEGP/VPP expression: implications for induction and inhibition of tumor angiogenesis. Cancer Res, 55: 4575-4580, 1995.

86. Rak, J, Filmus. J., and Kcrbcl, R- Reciprocal paracrine interactions between tumor celts and endothelial cells: the 'angiogenesis progression" hypothesis. Euro J Cancer, 32A: 2438-2450, 1996.

87. Renhai. C^ Farenbo, J., Kurimoto, M„ and Cao, Y. Inerleukin-18 acts as an angiogenesis and tumor suppressor, Faseb J, 13: 2195-2202, 1999,

88. Restimaki, A., Narko. K., Enholm. B., Joukov, V., and Alitalo, K. Proinflammotory cytokines regulate the expression of lymphatic endothelialmitogen vascular endothelial growth faclor-C. J Biol Chem, 273; 8413-8418» 1998.

89. Rossant, J. and Howard, L. Signaling pathways in vascular development. Ann Rev Cell Biology . 18: 541-573.2002.

90. Safran, M. and Kaelin, W. H1F hydroxylaiion and the mammalian oxygen-sensing pathway. J Clin Invest, 111; 779-783,2003.

91. Salven, P . Hattori, K , lleissig, B . and Rail». S. Interieuktn-1 (IL-1) promotes angiogencsis in vivo via VEGFR-2 pathway by inducing inflammatory cell VEGF synthesis and secretion. FASEB J Published online, 2Q02

92. Saxgiannidou, L, Zhou, J . and Tuszynski, G The role of thrombospondin-1 in tumor progression. Expcrim Biol Med, 226; 726-733, 2001.

93. Sheppard, D. Endothelial integrins and angiogencsis: no» simple anymore. J Clin Invest. 110:913-914.2002,

94. Sigounas. G., Steiner, M„ and Anagnosfou. A. Synergism of hemopoietic growth factors on endothelial cell proliferation. Angiology. 48: 141-147. 1997.

95. Silvcslrc, J„ 7- Mallat, R. 1 amoral, M. Duriez, A. Tcdgui. and B. Levy. 2001 Regulation of Matrix Metalloproteinase Activity in Ischemic Tissue by lnterleukin-10, Role in Isehemia-Induccd Angiogencsis. Cire Res 89:259.

96. Slaton, J,, Perrottc. P., and Inoue, K. Interfcron-a-mediatcd down-regulation of angiogencsis-rclated genes and therapy of bladder cancer are dependent on optimization of biological dose and schedule. Clinical Cancer Research, 5: 27262734,1999.

97. Stcnn. K and Paus, R, Controls of hair Ibllide cycling Physiology Review, 81 449-494, 2001.

98. Stricter. R. Pohxrini, P. and Kunkel. S. The functional role of the ELT molif in CXC chcmokinc-mediatcd angiogenesis. J Biological Chem, 270: 27348-27357, 1995.

99. Stewart N.T., Byrne K.M., Hosick H.L. Traditional and emerging methods for analyzing cell activity in cell culture. Mcth. of Cel l Science, 22: 67-78,2000.

100. Takohashi, Т., Kalka. C„ and Masuda, H. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nature Medicine, 5: 434-438,1999.

101. Vailhe, В., Vittet, D. and Feige. J. In vitro models of vasculogcncsis and angiogenesis. Laboratory Investigation. SI: 439. 2001.

102. Vandcrslice, p. Munsch, C,. Rachal, E, Erichsen, D„ Sughrue, K-, Truong, A. Wygant, J., Mclntyre, В., Eskin, S,. Tilton, R., and Polverini, P Angiogenesis induced by tumor necrosis factor- is mediated by 4 integrins. Angiogenesis. 2: 265-275, 1998.

103. Vamer, J. A. The rote of vascular cell integrins avb3 and avb5 in angiogenesis. FXS. 79: 361-390, 1997,

104. Vinals, F. and Pouyssegur, J. Transforming growth factor pi (TGF-pi) promotes endothelial cell survival during in vitro angiogenesis via an autocrine mechanism implicating TGF-a signaling. Molccular and Cellular Biology. 21: 7218-7230, 200L

105. Wise, L-, Vcikkola. Т., Mercer, A., Savory, L., Fleming. S , Caesar. C„ Vitaly, A., Makinen, T„ Aiitalo, K., and Stacker, S. Vascular endothelial growth factor