Влияние цитокинов и их сочетаний на экспрессию поверхностных молекул и секрецию хемокина IL-8 эндотелиальными клетками линии ECV304 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Соколов, Дмитрий Игоревич

• Соколов, Дмитрий Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2001

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Соколов, Дмитрий Игоревич

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Провоспалительные цитокины Ю

1.2. Противовоспалительные цитокины

1.3. Механизмы взаимодействия цитокинов при их сочетании

Глава 2. Материалы и методы

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Влияние цитокинов и их сочетаний на экспрессию поверхностных 46 маркеров человеческими эндотелиальными клетками линии ECV

3.1.1. Влияние цитокинов и их сочетаний на экспрессию ICAM-1 46 клетками линии ECV

3.1.2. Влияние цитокинов и их сочетаний на экспрессию молекул 59 HLA-A,B,C клетками линии ECV

3.1.3. Влияние цитокинов и их сочетаний на экспрессию молекул HLA- 60 DR и CD95 клетками линии ECV

3.2. Влияние цитокинов и их сочетаний на секрецию IL-8 63 человеческими эндотелиальными клетками линии ECV

3.3. Влияние EL-8 на экспрессию 1САМ-1 клетками линии ECV

3.4. Влияние цитокинов и их сочетаний на секрецию TL-8 76 человеческими эндотелиальными клетками линии ECV304 и клетками линии HL-60 при их совместном культивировании

Глава 4. Обсуждение

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние цитокинов и их сочетаний на экспрессию поверхностных молекул и секрецию хемокина IL-8 эндотелиальными клетками линии ECV304»

Актуальность проблемы.

Изучение цитокинов стало одной из актуальных проблем современной иммунологии. В последние годы преобладает развитие молекулярно-биологических аспектов этой проблемы. Большие успехи достигнуты в детализации генетического детерминирования продукции цитокинов, экспрессии их рецепторов и трансдукции сигналов активации. Непрерывно возрастает количество вновь идентифицированных молекул цитокинов и их рецепторов, усложняется схема цитокиновой регуляторной сети. Но при этом сравнительно мало внимания уделяется изучению взаимодействия разных цитокинов, их кооперативных эффектов. Между тем, в естественных условиях организма любая клетка продуцирует и секретирует целый набор цитокинов. Каждый цитокин способен индуцировать синтез и секрецию нескольких других цитокинов. Поэтому клетки в кровяном русле и в лимфоидных тканях испытывают на себе действие «цитокиновых коктейлей», каждый из компонентов которых обладает собственной биологической активностью и способностью к синергидному или антагонистическому взаимодействию с другими компонентами.

Чувствительность клетки к действию цитокинов зависит от экспрессии цитокиновых рецепторов, путей внутриклеточной трансдукции сигналов активации и от других биологических особенностей клеток. В последние годы в качестве клеток-мишеней цитокинов привлекают внимание эндотелиальные клетки. Эндотелиальные клетки испытывают на себе действие провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, продуцируемых лейкоцитами крови, клетками лимфоидных тканей. Они отвечают на действие цитокинов усилением экспрессии поверхностных адгезионных молекул и секрецией собственных цитокинов, в частности, хемокинов. Литературные данные, касающиеся экспрессии цитокиновых рецепторов на эндотелиальных клетках и влияния на них цитокинов, весьма противоречивы.

Цель работы. Сравнительное изучение изменений экспрессии поверхностных молекул ICAM-1, HLA-A,B,C, HLA-DR, CD95 и секреции хемокина IL-8 эндотелиальными клетками под влиянием цитокинов и их сочетаний.

Задачи исследования:

1. Разработать адекватный цели исследования вариант экспериментальной модели культивирования клеток перевиваемой линии ECV304, позволяющий проводить параллельное изучение экспрессии их поверхностных молекул и секреции ими цитокинов.

2. С использованием разработанного варианта экспериментальной модели изучить секрецию эндотелиальными клетками хемокина IL-8: спонтанную и индуцированную стандартным стимулятором форболмиристатацетатом (ФМА) и отдельными цитокинами.

3. С использованием разработанного варианта экспериментальной модели изучить экспрессию клетками линии ECV304 поверхностных молекул ICAM-1, HLA-А,В,С, HLA-DR и CD95: конститутивную и индуцированную стандартным стимулятором ФМА и отдельными цитокинами.

4. С использованием того же варианта экспериментальной модели провести сравнительное изучение влияния отдельных цитокинов и их сочетаний на экспрессию клетками линии ECV304 адгезионной молекулы ICAM-1 и на секрецию ими хемокина IL-8.

5. Разработать вариант экспериментальной модели совместного культивирования эндотелиальных клеток линии ECV304 и моноцитоподобных клеток линии HL-60, позволяющий изучить влияние цитокинов на секрецию хемокина IL-8 в условиях кокультуры клеток.

Научная новизна работы.

Для оценки ответа эндотелиальных клеток (перевиваемой линии ECV304) на действие цитокинов впервые использован комплексный подход с параллельным определением изменений экспрессии адгезионных молекул (ICAM-1) и секреции хемокина (IL-8). С использованием такого подхода впервые показана избирательность действия некоторых цитокинов: интерфероны усиливали только экспрессию поверхностных молекул, GM-CSF ингибировал только секрецию IL-8 эндотелиальными клетками. Результаты работы позволили выявить новые биологические эффекты IFNy и IL-10, не соответствующие характеристикам провоспалительных и противовоспалительных эффектов. Впервые на модели эндотелиальных клеток получены экспериментальные доказательства того, что повышение экспрессии адгезионных молекул ICAM-1 под влиянием TNFa и IL-ip не зависит от параллельного усиления секреции хемокина IL-8. При изучении сочетанного действия цитокинов впервые показано, что в составе смесей с провоспалительными цитокинами IFNy и IL-10 приобретают новые свойства, не проявляющиеся при их раздельном использовании.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Выявленные на экспериментальной модели эндотелиальных клеток стимулирующие эффекты IL-10 и ингибирующие эффекты IFNy свидетельствуют об условности разделения цитокинов на провоспалительные и противовоспалительные. На той же экспериментальной модели получены экспериментальные доказательства автономного характера влияния цитокинов на экспрессию адгезионных молекул ICAM-1, с одной стороны, и на секрецию хемокина TL-8, с другой стороны.

Накопленные новые характеристики биологической активности TNFa, IL-1J3, IFNy, IL-10, GM-CSF, IFNa и их сочетаний, отражающие их влияние на эндотелиальные клетки, могут быть использованы при разработке методов цитокинотерапии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Изученные цитокины различаются между собой по способности усиливать экспрессию адгезионных молекул ICAM-1 на поверхности эндотелиальных клеток линии ECV304: в наибольшей степени она возрастает под влиянием TNFa и IL-ip, в меньшей степени - под влиянием IFNy и не изменяется в присутствии IL-8, IFNa и GM-CSF.

2. Изученные цитокины различаются между собой по способности стимулировать секрецию хемокина IL-8 эндотелиальными клетками линии ECV304: в наибольшей степени она возрастает под влиянием TNFa и IL-ip, слабо увеличивается под влиянием FL-10, под влиянием GM-CSF снижается, а в присутствии IFNy или IFNa не изменяется.

3. Провоспалительные цитокины TNFa и IL-1(3 являются синергнетами при действии на эндотелиальные клетки линии ECV304: оба цитокина стимулируют и экспрессию поверхностных молекул ICAM-1, и секрецию хемокина 1L-8, в сочетании дают аддитивный стимулирующий эффект, устойчивый к нивелирующему действию IFNy, IL-10 и их сочетания.

4. После предварительной инкубации клеток линии ECV304 с IL-10 они отвечают на действие провоспалительных цитокинов более выраженным усилением экспрессии ICAM-1, но более слабым приростом секреции IL-8. 8

Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на XVII International Congress of Allergology and Clinical Immunology (Сидней, Австралия, 2000), доложены на 4-й научной конференции с международным участием "Дни иммунологии в Санкт-Петербурге" (Санкт-Петербург, 2000), на 5-й английской школе иммунологов им. Дж. Хэмфри (Пущино, 2000), на научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины», посвященной 110-летию НИИ ЭМ РАМН (Санкт-Петербург, 2000).

Диссертационная работа апробирована на научной конференции отдела иммунологии НИИЭМ РАМН 29 января 2001 г.

Объем и структура диссертации. Объем работы составляет 117 страниц машинописного текста, включая 14 таблиц и 20 рисунков. Список литературы состоит из 168 наименований, из них 10 работ принадлежит отечественным авторам и 158 - зарубежным.

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Соколов, Дмитрий Игоревич

выводы.

1. Среди изученных цитокинов TNFa и IL-ip в наибольшей степени усиливают экспрессию адгезионных молекул ICAM-1 на поверхности эндотелиальных клеток линии ECV304, в меньшей степени она возрастает под влиянием IFNy и не изменяется в присутствии IL-8, GM-CSF, IFNa, IL-10, IL-4.

2. Среди изученных цитокинов TNFa и IL-1 р в наибольшей степени стимулируют секрецию хемокина IL-8 эндотелиальными клетками линии ECV304, слабо возрастает она под влиянием EL-10, под влиянием GM-CSF секреция хемокина IL-8 снижается, а в присутствии IFNy, IFNa, IL-4 не изменяется.

3. Среди изученных цитокинов только IFNy и IFNa повышают уровень экспрессии молекул HLA-A,B,C на поверхности эндотелиальных клеток линии ECV304.

4. TNFa и IL-lp в сочетании проявляют выраженный синергизм при стимулирующем действии на секрецию хемокина IL-8 и на экспрессию поверхностной адгезионной молекулы ICAM-1 клетками линии ECV304, их аддитивный стимулирующий эффект устойчив к нивелирующему действию IFNy, IL-10 и их сочетания.

5. Предварительная инкубация клеток линии ECV304 с IL-10 изменяет ответ клеток на действие TNFa и IL-1(3: более выраженным становится усиление экспрессии ICAM-1, но более слабым оказывается прирост секреции IL-8.

6. Повышение экспрессии адгезионных молекул ICAM-1 на поверхности эндотелиальных клеток линии ECV304 под влиянием TNFa и IL-ip не зависит от параллельного усиления секреции хемокина IL-8.

7. Сочетание IFNy и IL-10 не приводит к их взаимной ингибиции. смесь этих двух цитокинов усиливает экспрессию ICAM-1 на клетках линии ECV30 и потенцирует стимулирующие эффекты TNFa и IL-ip в отношении экспрессии ICAM-1.

1.4. Заключение.

Как видно из обзора литературы достаточно подробно изучены физико-химические характеристики цитокинов и их рецепторов, расшифрована их первичная структура, описано пространственное строение молекул цитокинов, описан широкий спектр клеток-мишеней и биологических эффектов цитокинов. В последнее время уточняются представления о внутриклеточных событиях, трансдукции сигналов активации, происходящих вслед за связыванием цитокина с его рецептором.

Традиционный подход к цитокинам как к медиаторам иммунной системы определил преимущественное изучение иммунокомпетентных клеток в качестве продуцентов и мишеней цитокинов. Показанное в последние годы вовлечение эндотелиальных клеток в процессы воспаления и иммунный ответ, участие этих клеток во взаимодействии с фагоцитами и лимфоцитами привлекают внимание к изучению влияния цитокинов на эндотелиальные клетки. Имеющиеся в литературе данные по этому поводу малочисленны и весьма противоречивы.

Наименее изученными остаются биологические эффекты различных комбинаций цитокинов. Имеются лишь единичные данные о влиянии цитокинов и их комбинаций в условиях кокультуры клеток.

В связи с вышеизложенным, наиболее актуальной задачей представляется изучение кооперативных эффектов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в отношении эндотелиальных клеток и их кокультур с мононуклеарными фагоцитами.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки.

Работа выполнена с использованием клеток перевиваемых линий ECV304, HL-60.

Перевиваемая линия ECV304 человеческих эндотелиальных клеток представляет собой спонтанно трансформированные клетки вены пупочного канатика (HUVEC) [148, 149]. В отличие от эндотелиальных клеток вены пупочного канатика клетки линии ECV304 не требовательны к условиям культивирования и не нуждаются в присутствии в питательной среде ростовых факторов, так как способны секретировать собственные аутокринные ростовые факторы. Более того, клетки линии ECV304 имеют постоянный уровень конститутивной экспрессии определенных молекул на цитоплазматической мембране, не изменяющийся от пассажа к пассажу, как это было показано в случае постепенного снижения экспрессии CD34 на HUVEC [51]. Клетки линии ECV304 обладают рядом характеристик, свидетельствующих об их принадлежности к эндотелию. Клетки линии ECV304 обладают морфологией эндотелиальных клеток, образуя характерный монослой по типу «булыжной мостовой». Клетки линии ECV304 экспрессируют тромбомодулин (CD141), рецепторы витронектина (CD51). Для клеток линии ECV304, как и для HUVEC, характерна слабая конститутивная экспрессия CD 142 (tissue factor, TF), которая усиливается под действием TNFa с максимумом через 4-6 часов, но возвращается к начальному уровню через 16 часов после стимуляции [122]. И на тех, и на других клетках обнаружена экспрессия молекул ulex europeaus agglutinin-1 lectin (UEA-1 lectin), vimentin, cytokeratin 7, маркера эндотелиальных клеток CD49b, CD49c, CD49f, CD54, CD55, CD105, CD106, CD141, CDwl45, CDwl46, CDwl47, HLAI [75, 93, 111].

Ранее было показано, что TNFa в синергизме с IL-1 Р индуцирует продукцию IL-6, IL-8, GM-CSF, МСР-1 эндотелиальными клетками коронарных артерий или легочной артерии человека и HUVEC [139]. У клеток линии ECV304 также была выявлена способность отвечать на воздействие TNFa продукцией IL-8 [51].

ОСС^ЙСКЛ» f

41 I 1

HUVEC и ECV304 имеют ряд общих характеристик, но 4!меют и существенные различия. У этих клеток в отсутствие стимуляции различен репертуар поверхностных молекул. Так, было показано, что только HUVEC экспрессируют von Willebrand Factor (vWf), CD31, CD34, CD 109, CD140b, CD143 [75, 111]. С другой стороны, только клетки линии ECV304 экспрессируют маркеры, характерные для эпителиальных клеток: cytokeratin 6, 8, 10, 17, 18, 19 [111]. Только клетки линии ECV304 секретируют urokinase-type plasminogen activator (u-PA). Уровень секреции ингибитора активатора плазминогена I (PAI-I) и тканевого активатора плазминогена (t-PA) клетками линии ECV304 ниже примерно в 8 раз по сравнению с HUVEC [148]. Клетки линии ECV304 не экспрессируют такой характерный маркер эндотелия как vWf, хотя в цитоплазме этих клеток обнаружены характерные для эндотелиальных клеток тельца Вейбеля-Палада [75, 93].

Е-селектин не определяется на нестимулированных HUVEC и клетках линии ECV304, однако обработка ЛПС в течении 4 часов индуцировала его экспрессию на HUVEC, но не на ECV304 [55, 75, 108]. HUVEC более активно по сравнению с ECV-304 захватывают и метаболизируют модифицированные (ацетилированные) липопротеиды низкой плотности посредством скевенджер рецептора [75, 148, 149].

Показано, что, IFNy в низких концентрациях способен усиливать пролиферацию клеток линии ECV304, в то время, как этот цитокин тормозит пролиферацию HUVEC и при высокой концентрации способен вызвать их апоптоз [98].

Несмотря на выше перечисленные фенотипические и функциональные отличия линии ECV304 от HUVEC использование этой перевиваемой линии оправдано стандартными характеристиками, не изменяющимися от пассажа к пассажу.

К сожалению, весной 2000 года на сайтах банков клеточных линий Европы и США появились сообщения о том, что при анализе ДНК клеток была выявлена идентичность клеток линии ECV304 с клетками линии Т-24 карциномы мочевого пузыря человека (American Tissue culture collection (ATTC) и European collection of animal cell cultures (ECACC)). Однако многие лаборатории настаивают на выявлении у клеток линии ECV304 типичных биомаркеров эндотелиальных клеток: фактора VIII, телец Вейбеля-Палада, формирование трубок в Метригеле.

Существует другая линия клеток EA.hy926, которая является гибридомой между HUVEC и клетками эпителиомы А549, полученная в 1983 году. У этой линии выявлены все основные биомаркеры эндотелиальных клеток. На протяжении семнадцати лет она интенсивно использовалась в качестве модели эндотелиальных клеток при изучении: экспрессии поверхностных молекул, продукции хемокинов, адгезии лейкоцитов, механизмов ангиогенеза.

Перевиваемая линия HL-60 ведет свое происхождение от клеток периферической крови, полученных от человека с острой промиелоцитарной лейкемией [45]. Клетки линии HL-60 обладают лимфобластоидным типом роста, и представлены миелобластами и промиелоцитами, экспрессирующми моноцитарно-макрофагальные и гранулоцитарные поверхностные антигены. Под влиянием форболмиристатацетата морфология клеток линии HL-60 изменяется на макрофагоподобную с образованием кластеров и образованием псевдоподий, параллельно снижается активность миелопероксидазы и повышается секреция лизоцима [83, 84]. IFNy также изменяет морфологию клеток линии HL-60 на макрофагоподобную и индуцирует экспрессию моноцитарных поверхностных маркеров [92]. Исходно клетки HL-60 несут некоторые маркеры лимфоидных клеток, но также экспрессируют Fc-рецепторы, рецепторы для компонентов комплемента и проявляют фагоцитарную активность и чувствительность к хемоаттрактантам. Кроме того, они имеют рецепторы к IL-4, IFNy и два типа рецепторов к TNFa [76, 78]. Два последних цитокина подавляют пролиферацию клеток линии HL-60 [84, 135]. IFNy и TNFa подавляют синтез миелопероксидазы F1L-60, но после удаления этих цитокинов из среды экспрессия гена миелопероксидазы может вернуться к прежнему уровню. G-CSF, напротив, повышает экспрессию гена миелопероксидазы. [84, 92] Клетки линии HL-60 секретируют аутокринные ростовые факторы, а после стимуляции ТНФ-a или ИФН-у могут секретировать TNFa [84, 135].

Клетки всех перечисленных выше перевиваемых линий имеют подтвержденную принадлежность к соответствующим линиям. Отсутствие инфицированности (в том числе, микоплазмой) контролировалось.

Клетки перевиваемых линий культивировали в среде RPMI 1640 («Serva», Heidelberg/NY), содержащей 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки («Биолот», С.-Петербург), 50 мкг\мл сульфата гентамицина (АО «Самсон», С.-Петербург), 2 мМ L-глутамина («ICN», США), 20 мМ HEPES («ICN», США). Для культивирования использовали пластиковые флаконы объемом 50 мл («Sarstedt», Австрия). Смену среды клеткам линий FEL-60 производили через день. Клеткам линий HL-60, представляющим собой суспензионную культуру, истощенную среду заменяли частично. Клетки линии ECV304 являются монослойной культурой, требующей пересева, в среднем, 1 раз в 3-4 дня.

Пересев клеток осуществляли путем обработки монослоя смесью 0,25% растворов трипсина и версена («Биолот», С.-Петербург) в соотношении 1:3.В работе использовали 96-луночные плоскодонные планшеты («Greiner», Австрия). Клетки, культивируемые в планшетах, держали в эксикаторе во влажной (98% влажности) атмосфере с 5% С02 при +37°С. Клетки, культивируемые в пластиковых флаконах держали в термостате при той же температуре.

Цитокины.

В работе использовали рекомбинантные препараты человеческих цитокинов TNFa -«Рефнолин» (специфическая активность препарата 1ЕД - 0,06 нг), IFNy - «Гаммаферон», IFNa - «Реаферон» (НПО «Фермент», «Sanitas», Литва) коммерческий рекомбинантный препарат человеческого GM-CSF - «Leucomax» (специфическая активность препарата 1ЕД -0,09 нг) («Schering-Plough»), рекомбинантный человеческий IL-ip (специфическая активность препарата 1ЕД - 0,01 нг) (любезно предоставлен А.С. Симбирцевым, НИИ особо чистых биопрепаратов, С.-Петербург), рекомбинантный человеческий IL-4 (специфическая активность препарата 1ЕД - 1 нг) («Sigma», США), рекомбинантный человеческий IL-8 (любезно предоставлен А.С. Симбирцевым, НИИ особо чистых биопрепаратов, С.Петербург), рекомбинантный человеческий IL-10 (специфическая активность препарата 1ЕД - 1 нг) («Sigma», США). В качестве стандартного индуктора активации клеток использовали форболмиристатацетат (ФМА) («Sigma», США). В соответствии с литературными данными для проведения экспериментов нами была выбрана концентрация TNFa 400 ЕД\мл [69, 153, 154], EL-lp 100 ЕД\мл [20, 106, 150], IFNa 400 ЕД\мл и 1000 ЕД\мл [106, 150], GM-CSF 100 ЕД\мл и 1000 ЕД\мл [134], IL-10 100 ЕД\мл [44, 87, 162], IFNy 400 ЕД\мл [57, 69], IL-4 100 ЕД\мл [152].

Протокол исследований.

Использовали суточную культуру клеток ECV304, для этого клеточную суспензию тщательно ресуспендировали в культуральной среде и помещали в лунки плоскодонного 96-луночного планшета («Sarstedt», Австрия) в концентрации ЗхЮ4 клеток на лунку и культивировали сутки во влажной атмосфере с 5% СОг при +37°С для получения однородного монослоя. На следующий день к монослою клеток, не меняя культуральной среды, добавляли цитокины или их комбинации, после чего культивирование продолжали в течение 24-48 часов. Все эксперименты проводили в присутствии 10 мкг\мл полимиксина В, который ингибирует ЛПС-индуцируемую секрецию цитокинов. Одновременно с добавлением в культуральную среду цитокинов в отдельной серии экспериментов добавляли моноклональные антитела против IL-8 ("Sigma", США) в различных концентрациях, после чего культивирование продолжали в течение 24 часов. После окончания инкубации собирали образцы культуральных жидкостей и замораживали (-20°С) для последующего определения количества IL-8 с помощью ИФА, используя стандартные коммерческие наборы («Цитокин», С.Петербург), и выражали в пг/мл. Этот раздел работы выполнен совместно с сотрудниками НИИ особочистых биопрепаратов А.С.Симбирцевым и А.Ю.Котовым, за что автор выражает им глубокую признательность. Монослои клеток в 96-луночном планшете использовали для определения экспрессии поверхностных молекул ICAM-1, HLA-A,B,C, HLA-DR, CD95 при помощи модификации иммуноферментного анализа (клеточный ИФА). После инкубации клетки линии ECV304 фиксировали, внося в каждую лунку по 100 мкл 0,05% раствора глутаральдегида («Reanal», Венгрия), приготовленного на забуференном физиологическом растворе (рН=7,2). Затем клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут и отмывали один раз в 150 мкл забуференного физиологического раствора (рН=7,2), содержащего 0,05% твин-20 («Serva», Германия). Зафиксированные клетки инкубировали в течение 1 часа во влажной атмосфере с 5% СОг при +37°С в присутствии мышиных моноклональных антител специфичных к CD54/ICAM-1 (клон ICO-184), или к HLA-A,B,C (клон ICO-53), или к HLA-DR (клон ICO-1), или к CD95 (клон ICO-160), любезно предоставленных А.Ю.Барышниковым (НПЦ МедБиоСпектр, г.Москва). Моноклональные антитела растворяли в среде RPMI 1640 содержащей 5% ЭТС и 0,1% NaNs и вносили в лунки в объеме 100 мкл. В контрольные лунки вносили среду такого же состава не содержащую моноклональных антител. После инкубации клетки отмывали пять раз забуференным физиологическим раствором (рН=7,2), содержащим 0,05% твин-20, после чего в каждую лунку добавляли поликлональные антитела к иммуноглобулинам мыши, меченые пероксидазой хрена (НИИ вакцин и сывороток, С.-Петербург). После инкубации в течение 1 часа во влажной атмосфере с 5% СОг при +37°С и 5-кратной отмывки забуференным физиологическим раствором (рН=7,2), содержащим 0,05% твин-20, проводили дополнительную инкубацию в течение пяти минут в темноте с 100 мкл субстрат-хромогенной смеси, состоящей из 1 мг ортофенилендиамина («Sigma», США) в 1 мл цитрат-фосфатного буфера (рН=5), с добавлением 0,06% перекиси водорода. Цветную реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 100 мкл 1М серной кислоты. Оптическую плотность учитывали с помощью автоматического спектрофотометра («SLT-Spectra»,

45

Австрия) при длине волны 492 нм. Экспрессию молекул на клетках ECV304 выражали в единицах оптической плотности. Средние значения оптической плотности в контрольных лунках (OD = 0,090±0,02) принимали за фон и вычитали из всех остальных значений оптической плотности.

Методы статистической обработки материала.

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи методов параметрической статистики [5, 6, 7, 9]. При этом проводили вычисление средней, стандартного отклонения, ошибки среднего, критерия Стьюдента, критерия Пирсона, критерия Спирмена, используя компьютерную программу STATISTIC А 5.0.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Влияние цитокинов и их сочетаний на экспрессию поверхностных маркеров человеческими эндотелиальными клетками линии ECV304.

3.1.1. Влияние цитокинов и их сочетаний на экспрессию ICAM-1 клетками линии ECV304.

Клетки линии ECV304 характеризовались сравнительно постоянным уровнем конститутивной экспрессии молекул ICAM-1, который в среднем составил 0,812+0,06 (п=50) независимо от времени культивирования клеток от 24 ч. до 48 ч.

Форболмиристатацетат в концентрации 100 нг\мл вызывал достоверное усиление экспрессии ICAM-1 у клеток линии ECV304 (р<0,01) (Таблица 2).

Из цитокинов, использованных нами в данной работе, наиболее выраженным дозозависимым стимулирующим действием на экспрессию ICAM-1 у клеток линии ECV304 обладал TNFa в концентрациях 10 ЕД\мл, 100 ЕД\мл, 400 ЕД\мл, 1000 ЕД\мл (Рисунок 1). Прирост уровня экспрессии ICAM-1 по отношению к исходному уровню экспрессии имел одинаковое значение через 24ч. и через 48ч. инкубации (Таблица 2). Эффект TNFa был достоверно выше эффекта форболмиристатацетата (р<0,05). Результаты, полученные при титровании, учитывались при выборе концентрации цитокина для проведения дальнейших экспериментов.

Несколько менее выраженным дозозависимым стимулирующим действием на экспрессию ICAM-1 у клеток линии ECV304 обладал IL-1 (3 в концентрациях 10 ЕД\мл, 100 ЕД\мл, 1000 ЕД\мл (Рисунок 2). Стимулирующий эффект 1L-1 [5 имел транзиторный характер. Пик экспрессии достигался к 24 ч. инкубации, а затем экспрессия достоверно снижалась к 48 ч. инкубации. (р<0,001) (Таблица 2). Эффект IL-ip не отличался от эффекта форболмиристатацетата (р>0,05). Результаты, полученные при титровании, учитывались при выборе концентрации цитокина для проведения дальнейших экспериментов.

IFNa в концентрациях 100 ЕД\мл, 400 ЕД\мл, 1000 ЕД\мл не оказывал никакого влияния на конститутивный уровень экспрессии ICAM-1 (Таблица 2) через 24ч. инкубации.

Результаты, полученные при титровании, учитывались при выборе концентрации цитокина для проведения дальнейших экспериментов.

GM-CSF в концентрациях 100 ЕД\мл, 400 ЕД\мл, 1000 ЕД\мл, 2000 ЕД\мл не оказывал никакого влияния на конститутивный уровень экспрессии ICAM-1 ни через 24ч., ни через 48ч. инкубации (Рисунок 3). Результаты, полученные при титровании, учитывались при выборе концентрации цитокина для проведения дальнейших экспериментов.

Стимулирующий эффект смеси двух стимулирующих монокинов IL-ip+TNFa через 24 ч. не отличался от стимулирующего эффекта TNFa, но был достоверно выше эффекта одного IL-ip (р<0,001). При дальнейшей инкубации к 48 ч. стимулирующий эффект смеси IL-1+TNFa оказался достоверно ниже эффекта одного TNFa (п=4, р<0,05), оставаясь достоверно выше эффекта одного IL-ip (р<0,01). (Рисунок 4). Сочетание стимулирующего провоспалительного цитокина TNFa с GM-CSF привело к достоверному снижению его стимулирующего действия на экспрессию ICAM-1 клетками линии ECV304 через 24 ч. (п=8, р<0,01), но к 48 ч. инкубации ингибирующее влияние GM-CSF нивелировалось (Рисунок 3).

Стимулирующий эффект смеси монокинов TNFa+IFNa через 24 ч. инкубации не отличался от стимулирующего эффекта TNFa (р>0,05) (Таблица 2).

Стимулирующий эффект смеси монокинов IL-lp+IFNa через 24 ч. инкубации не отличался от стимулирующего эффекта IL-ip (р>0,05) (Таблица 2).

Противовоспалительный цитокин IL-10 в концентрациях 50 ЕД\мл, 100 ЕД\мл, 200 ЕД\мл не оказывал никакого влияния на конститутивный уровень экспрессии ICAM-1 (Таблица 2) ни через 24ч., ни через 48ч. инкубации. Результаты, полученные при титровании, учитывались при выборе концентрации цитокина для проведения дальнейших экспериментов.

Стимулирующий эффект TNFa не изменялся при его комбинации с IL-10 и инкубации клеток лини ECV304 в присутствии смеси TNFa+IL-Ю. (Таблица 2). Стимулирующий эффект TNFa также не изменялся в случае инкубации клеток лини ECV304 в его присутствии в течение 24 ч. и последующей обработке IL-10 в течение 24 ч. Однако в случае предобработки клеток линии ECV304 IL-10 в течение 24 ч. и последующей обработки TNFa в течение 24 ч. стимулирующий эффект достоверно повышался (р<0,001) (Таблица 3).

Стимулирующий эффект IL-1J3 не изменялся при инкубации клеток лини ECV304 в присутствии смеси IL-ip+IL-Ю (Таблица 2). Стимулирующий эффект IL-ip не изменялся в случае инкубации клеток линии ECV304 в его присутствии в течение 24 ч. и последующей

48

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Соколов, Дмитрий Игоревич, 2001 год

1. Галактионов В.Г. Иммунология,- Москва: Издательство Московского университета, 1998. -479 с.

2. Климов А.Н., Никульчева Н.Г. Липиды, липопротеиды и атеросклероз,- Санкт-Петербург: Питер Пресс, 1995. -304 с.

3. Литвин С. Иммуногенетика человека. Пер. с англ.- Москва: Мир, 1994. -т. 1. -492 с.

4. Новиков B.C. Программированная клеточная гибель,- Санкт-Петербург: Наука, 1996. -276 с.

5. Поллард Дж. Справочник по вычислительным методам статистики. Пер. с англ.- Москва. Финансы и статистика, 1982. -344 с.

6. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика,- Минск: Вышэйшая школа, 1973. -320 с.

7. Рунион Р. Справочник по непараметрической статистике: современный подход. Пер. с англ.- Москва: Финансы и статистика, 1982. -198 с.

8. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы,-СПб.: Гиппократ, 1992. -256 с.

9. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях.-Москва: Медицина, 1975. -295 с.

10. Фрейдлин ИС. Иммунная система и ее дефекты,- Санкт-Петербург: НТФФ «Полисан», 1998. -112 с.

11. Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia.// Horst Ibelgaufts' Hypertext Information Universe of Cytokines. Version 4.0 (IFNa).- http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi73158,- 1999.

12. Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia.// Horst Ibelgaufts1 Hypertext Information Universe of Cytokines. Version 4.0 (TNFa). ).- http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi73124,— 1999.

13. Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia.// Horst Ibelgaufts' Hypertext Information Universe of Cytokines. Version 4.0 (IL-10).- http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi73267,- 1999.

14. Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia.// Horst Ibelgaufts' Hypertext Information Universe of Cytokines. Version 4.0 (IL-4).- http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi73250.// 1999.

15. Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia.// Horst Ibelgaufts' Hypertext Information Universe of Cytokines. Version 4.0 (GM-CSF).- http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi72602,- 1999.

16. Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia.// Horst Ibelgaufts1 Hypertext Information Universe of Cytokines. Version 4.0 (IL-8).- http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi73265,- 1999.

17. Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia.// Horst Ibelgaufts' Hypertext Information Universe of Cytokines. Version 4.0 (IFNy).- http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi73172,- 1999.

18. Cytokines Online Pathfinder Encyclopaedia.// Horst Ibelgaufts' Hypertext Information Universe of Cytokines. Version 4.0 (IL-1). http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi73212,- 1999.

19. Abot S.E., Kaul A., Stevens C.R., Blake D.R. Isolation and culture of synovial microvascular endothelial cells. Characterization and assessment of adhesion molecule expression.// Arthr. Rheum.- 1992,- Vol.35, No.4.- P.401-406.

20. Armstrong C.A., Тага D.C., Hart C.E., Kock A., Luger T.A. et al. Heterogeneity of cytokine production by human malignant melanoma cells.// Exp Derm.- 1992,- Vol.1, No.l.- P.37-45.

21. Amman V., Stemme S., Rymo L., Risberg B. Interferon-gamma modulates the fibrinolytic response in cultured human endothelial cells.// Thromb Res.- 1995,- Vol.77, No.5,- P.431-440.

22. Atamas S., Choi J., Yurovsky V.V., White B. An alternative splice variant of human IL-4, IL-472, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation.// J Immunol.- 1996,- Vol.156.- P.435-441.

23. Austin J.M. New insights into the mobilisation and phagocytic activity dendritic cells.// J Exp Med 1996,- Vol.183.- P.1287-1292.

24. Baarsh M.J., Wannemueler M.J., ThomasW.M., Murtaugh M.P. Detection of tumor necrosis factor-a from porcine alveolar macrophages using an L929 fibroblast bioassay.// J Immun Meth.- 1991,- Vol.140, No.199.- P.15-22.

25. Baumhueter S., Singer M.S., Henzel W, Hemmerich S., Renz M. et al. Binding of L-selectin to the vascular sialomucin CD34.// Science.- 1993,- Vol.262.- P.436-438.

26. Bauvois В., Rouillard D., Sanseau J., Weitzerbin J. IFN-y transformig growth factor-bl differently regulate fibronectin and laminin receptors of human differentiating monocytic cells.// J Immunol.- 1992,- Vol.148, No.12.- P.3912-3919.

27. Bennett M.R., Littiewood T.D., Hancock D C., Evan G.I., Newby A.C. Down-regulation of the c-myc proto-oncogene in inhibition of vascular smooth-muscule cell proliferation: a signal for growth arrest?// Biochem.- 1994,- Vol.302, No.Pt3.- P.701-708.

28. Billian A. Interferon-g: biology and role in pathogenesis.// Advances in Immunology.- 1996,1. Vol.62.-Р.61-130.

29. Buchsbaum M.E., Kupper T.S., Murphy G.F. Differential induction of intercellular adhesion molecule-1 in human skin by recombinant cytokines.// J Cut Path.- 1993,- Vol.20, No.l.- P.21-27.

30. Buelens C., Verhasselt V., De Groote D., Thielemans К, Goldman M. et al. Human dendritic cell responses to lipopolysaccharide and CD40 ligation are differentially regulated by interleukin-10.//Eur J Immunol.- 1997,- Vol.27, No.8.-P. 1848-1852.

31. Calder K.L., Prickett T.C.R., McKenzie J.L., Hart D.N.I. Analisis of cytokine and cytokine receptor production by human dendritic cells.// Adv Exp Med & Biol.- 1993,- Vol.329.- P.260-265.

32. Callard R.E. ,Gearing A.J.H. The Cytokine Facts Book. London: Academic Press. 1994,- 260 P

33. Caux C., Massacrier C., Vanbervliet В., Dubois В., Kooten C.V. et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking.//J Exp Med.- 1994,- Vol.180, No.4.- P. 1263-1272.

34. Caux C., Liu Y.I., Banchereau J. Recent advances in the study of dendritic cells and follicular dendritic cells.// Immunology Today.- 1995 Vol.16.- P.2-5.

35. Cella M., Sallusto F., Lanzavecchia A. Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells.// Cur Opin Immunol.- 1991 Vol.9.- P. 10-16.

36. Chakrabarti D., Huang X., Beck J., Henrich I., McFarland N. et al. Control of islet intercellular adhesion molecule-1 expression by interferon-alpha and hypoxia.// Diabetes.- 1996,- Vol.45, No.10,- P.1336-1343.

37. Chan M.M. Inhibition of tumor necrosis factor by curcumin, a phytochemical.// Biochem Pharm.- 1995,- Vol.49, No ll.-P. 1551-1556.

38. Chen C.C. ,Manning A.M. TGF-beta 1, IL-10 and IL-4 differentially modulate the cytokineinduced expression of IL-6 and IL-8 in human endothelial cells.// Cytokine.- 1996,- Vol.8, No.1,-P.58-65.

39. Collins S.J., Gallo R.C., Gallagher R.E. Continuous growth and differentiation of human myeloid leukaemic cells in suspension culture.// Nature.- 1977,- Vol.270, No.5635,- P.347-349.

40. Cumberbatch M. ,Kimber I. Tumour necrosis factor-alpha is required for accumulation of dendritic cells in draining lymph nodes and for opti-mal contact sensitization.// Immunology.-1995,- Vol.84, No.l.- P.31-35.

41. Curfs J.H.A.J., Meis J.F.G.M., Hoogkamp-Korstanje J.A.A. A primer on cytokines: sources, receptors, effects and inducers.// Clin Microb Rev.- 1997,- Vol.10, No.4.- P.742-780.

42. De Beaux A.C., Maingay J.P., Ross J.A., Fearon K.C., Carter D.C. Interleukin-4 and interleukin-10 increase endotoxin-stimulated human umbilical vein endothelial cell interleukin-8 release.//J Interferon Cytokine Res.- 1995,- Vol.15, No.5.- P.441-445.

43. De Smedt Т., Van Mechelen M., De Becker G., Urbain J., Leo O. et al. Effect of interleukin-10 on dendritic cell maturation and function.// Eur J Immunol.- 1997,- Vol.27, No.5.- P. 1229-1235.

44. Delia D., Lampugnani M.G., Resnati M., Dejana E., Aiello A. et al. CD34 expression is regulated reciprocally with adhesion molecules in vascular endothelial cells in vitro.// Blood.-1993,- Vol.81, No.4.- P.1001-1008.

45. Detmar M., Tenorio S., Hettmannsperger U., Ruszczak Z., Orfanos C.E. Cytokine regulation of proliferation and ICAM-1 expression of human dermal microvascular endothelial cells in vitro.// J Invest. Dermatol.- 1992,- Vol.98, No.2.-P.147-153.

46. Donnelly R.P., Freeman S.L., Hayes M P. Inhibition of IL-10 expression by IFN-y up-regulatestranscription of TNF-a in human monocytes.// J Immunol.- 1995,- Vol.155, No.3.- P. 14201427.

47. Doukas J. ,Pober J.S. IFN-y enhances endothelial activation induced by tumor necrosis factor but not interleukin-1.//J Immunol.- 1990,- Vol.145, No.6.- P.1727-1733.

48. Downing L.J., Strieter R.M., Kadell A.M., Wilke C.A., Austin J.C. et al. IL-10 regulates thrombus-induced vain wall inflammation and thrombosis.// J Immunol.- 1998,- Vol. 161,-P.1471-1476.

49. Eissner G., Kirchner S., Lindner H., Kolch W., Janosch P. et al. Reverse signaling through transmembrane TNF confers resistance to lipopolysaccharide in human monocytes and macrophages.// J Immunol 2000 - Vol. 164, No. 12,- P.6193-6198.

50. Essner R., Rhoades K., McBride W.H., Morton D.L., Economon J.S. IL-4 down-regulates IL-1 and TNF gene expression in human monocytes.// Journal of Immunology.- 1989,- Vol.142, No.11,- P.3857-61.

51. Fernandez-Botran R. ,Chilton P.M. The production of soluble Interleukin 4 receptors is preferentially regulated by the murine Th2 cell subset.// Cytokine.- 1997,- Vol.9, No.3.- P. 166177.

52. Fiehn C., Paleolog E.M., Feldmann M. Selective enhancement of endothelial cell VCAM-1 expression by interleukin-10 in the presence of activated leucocytes.// Immunology.- 1997,-Vol.9I, No.4,- P.565-571.

53. Francisco J.A., Kiener P.A., Moran-Davis P., Letbetter J.A., Siesall P.A. Cytokine activation sensitizes human monocytic and endothelial cells to the cytotoxic effects of an anti-CD40 immunotoxin.// J Immunol.- 1996,- Vol.157, No.4,- P.1652-1658.

54. Gamble J.R., Khew-Goodall I., Vadas M.A. Transforming growth factor-? inhibits E-selectin expression on human endothelial cells.// J Immunol.- 1993,- Vol.150, No. 10,- P.4494-4503.

55. Gessani S. ,Belardelli F. IFN-y expression in macrophages and its possible biological significance.//Cytokine & Growth Factor Rev.- 1998,-Vol.9, No.2.-P. 117-123.

56. Goebeler M., Yoshimura Т., Toksoy A., Ritter U., Brocker E.B. et al. The chemokine repertoireof human dermal microvascular endothelial cells and its regulation by inflammatory cytokines.// J Invest Dermatol.- 1997.- Vol. 108, No.4.- P.445-451.

57. Golding S., Emery P, Young S.P. Tenidap-modulated proinflammatory cytokine activation of monocyte cell line.//J Immunol.- 1995,-Vol.154.-P.5384-5390.

58. Goto ML, Kirisawa R., Tajima M., Takahashi K., Iwai H. A bioassay for bovine interleukin-1 by the A375 cell growth inhibition.// J Veterinary Medical Science.- 1995,- Vol.57, No.3.- P.523-525.

59. Grabbe S., Beissert S., Schwarz Т., Granstein R.D. Dendritic cells as initiators of tumor immune responses: a possible stratagem for tumor immunotherapy?// Immunol Today.- 1995,- Vol.16, No.3.- P.117-121.

60. Hancock W.W., Adams D.H., Wyner L.R., Karnovsky M.J. CD4(+) mononuclear cells induce cytokine expression, vascular smooth muscle cell proliferation and artherial occlusion after endothelial injury.// Am J Pathol.- 1994,-Vol.145, No.5,-P. 1008-1014.

61. Heiman A.S. ,Allen-Gipson D. Cytokines potentiate human eosinophil superoxide generation in the presence of N(omega)-nitro-L-arginine methyl ester.// Int J Immunopharmacol.- 2000,-Vol.22, No.2,- P.171-181.

62. Hsu H.-Y., Nicholson A.C., Hajjar D.P. Inhibition of macrophage scavenger receptor activity by tumor necrosis factor- is transcriptionally and post-transcriptionally regulated.// J Biol Chem.-1996,- Vol.271, No. 13,- P.7767-7773.

63. Hughes S.E. Functional characterization of the spontaneously transformed human umbilical vein endothelial cell line ECV304: use in an in vitro model of angiogenesis.// Exp Cell Res-1996,-Vol.225, No.1.-P.171-185.

64. Ikegami H., Arai N., Moriyasu J., Taniguchi M., Tsusaki K. et al. Analysis of the site on a TNF-a molecule which affects type II TNF receptor binding in human cells.// Lymphokine Cytokine Res 1993,- Vol.12, No.3.- P.173-180.

65. Jaattela M. Biologic activities and mechanisms of action of tumor necrosis factor-a/cachectin.// J Lab Invest.- 1991,- Vol.64, No.6.- P.724.

66. Jahnke A. ,Johnson J.P. Intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) is synergistically activated by TNF-a and IFN-y responsive site.// Immunology.- 1995,- Vol.193.- P.305-314.

67. James E. ,Darnell Jr. STATs and Gene Regulation.// Science.- 1997,- Vol.277, No. 1630,-P.1635.

68. Janeway Ch.A., Travers P. Immunobiology. London.: Current Biology Ltd. 1994,- 516 p.

69. Jones Т., Stern A., Lin R. Potential role of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor as vaccine adjuvant.// Eur J Clin Microbiology & Infectious Diseases.- 1994,- Vol.13, No.Suppl.-P.S47-53.

70. Kasugai I. ,Yamada M. Regulation of myeloperoxidase gene expression by the tumor promoter 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in human leukemia HL-60 cells.// J Biochem.- 1986,-Vol.100, No.2,- P.381-388.

71. Kawano S., Tatsumi E., Yoneda N., Nagata S., Yamaguchi N. Suppression of gene expression of myeloperoxidase (MPO) by g-interferon (IFN-y) in HL 60.// Lymphokine Cytokine Res-1993,-Vol.12, No.2,- P.81-85.

72. Keishnaswamy G., Kelly J., Yerra J., Smith J.K., Chi D.S. Human endothelium as a sourse of multifunctional cytokines: molecular regulation and possible role in human disease.// J. of Interferon & Cytokine Res.- 1997,- Vol.19.-P.91-104.

73. Komatsu S., Flores S., Gerritsen M.E., Anderson D.C., Granger D.N. Differential up-regulation of circulating soluble and endothelial cell intercellular adhesion molecule-1 in mice.// Am J Pathol.- 1997,- Vol.151, No.l.- P.205-214.

74. Krakauer T. IL-10 inhibits the adhesion of leukocytic cells to IL-1-activated human endothelial cells.// Immunol Lett.- 1995,- Vol.45, No. 1-2,- P.61-65.

75. Lanzavecchia A. Mechanisms of antigen uptake for presentation.// Immunology 1996,- Vol.8,-P.348-354.

76. Libby P. ,Hansson G.K. Involvement of the immune system in human atherogenesis: current knowledge and unanswered questions.// Lab. Invest.- 1991,- Vol.64, No.l.- P.5-15.

77. Lischke A., Moriggl R., Brandlein S., Berchtold S., Kammer W. et al. The interleukin-4 receptor activates STAT5 by a mechanism that relies upon common gamma-chain.// J Biol Chem.- 1998,- Vol.273.- P.31222-31229.

78. Littman B.H. ,Sanders K.M. Effects of vitamin D3 and IFN-y on the synthesis of the second complement component, C2, by a human myeloid leukemia (HL-60) cell line.// J Immunol.-1988,- Vol.140, No.9,- P.3082-3085.

79. Lopez-Pedrera C., Jardi M., Ingles-Esteve J., Munoz-Canoves P., Dorado G. Characterization of tissue factor expression on the human endothelial cell line ECV304.// Am J Hematol.- 1997,1. Vol.56, No.2,- P.71-78.

80. Lukacs N.W., Strieter R.M., Elner V., Evanoff H.L., Burdick M.D. et al. Production of chemokines, interleukin-8 and monocyte chemoattractant protein-1, during monocyte: endothelial cell interactions.// Blood.- 1995,- Vol.86, No.7.- P.2767-2773.

81. Lusti-Narasimhan M., Power C.A., Allet В., Alouani S., Bacon K.B. et al. Mutation of Leu25 and Val27 introduces CC chemokine activity into interleukin-8.// J Biol Chem.- 1995 Vol.270, No.6,- P.2716-2721.

82. Lutz M.B., Assmann C.U., Girolomoni G., Ricciardi-Castagnoli P. Different cytokines regulate antigen uptake and presentation of a precursor dendritic cell line.// Eur J Immunol.- 1996,-Vol.26, No.3.- P.586-594.

83. Maier J.A., Morreli D., Balsari A. The differential response to interferong by normal and transformed endothelial cells.// Biochem Biophys Res Commun.- 1995,- Vol.214, No.2,- P.582-588.

84. Mantovani A., Garianda C., Introna M., Vecchi A. Regulation of endothelial cell function by pro- and anti-inflammatory cytokines.// Transpl Proceed.- 1998,- Vol.30.- P.4239-4243.

85. Mason J.C. ,Haskard D.O. The clinical importance of leucocyte and endothelial cell adhesion molecules in inflammation.// Vascular Medicine Review.- 1994,- Vol.5.- P.249-275.

86. Massard G., Tongio M.M., Wihlm J.M., Morand G. The dendritic cell lineage: a ubiquitous antigen-presenting organization.// Annals of Thoracic Surgery.- 2000,- Vol.61, No.l.- P.252-258.

87. McKenzie J.L., Calder V.L., Starling G.C., Hart D.N. Role of tumour necrosis factor-alpha in dendritic cell-mediated primary mixed leucocyte reactions.// Bone Marrow Transpl.- 1995,-Vol.15, No.2,- P. 163-171.

88. Melrose J., Tsurushita N., Liu G., Berg E.L. IFN-y inhibits activation-induced expression of E- and P-selectin on endothelial cells.//J Immun.- 1998,- Vol. 161,- P.2457-2464.

89. Moser В., Barella L., Mattei S., Schumacher C., Boulay F. et al. Expression of transcripts for two interleukin 8 receptors in human phagocytes, lymphocytes and melanoma cells.// Biochem J.- 1993,- Vol.294 (Pt 1).- P.285-292.

90. Munro I.M., Pober J.S., Cotran R.S. Recruitment of neutrophils in the local endotoxin response: association with de novo endothelial expression of endothelial leukocyte adhesion molecule-1.// Lab. Invest.- 1991,- Vol.64, No.2,- P.295-299.

91. Murata Т., Noguchi P.D., Puri R.K. Receptors for IL-4 do not associate with common g chain, and induces the phosphorylation of JAK2 tyrosine kinase in human colon carcinoma cells.// J Biol Chem.- 1996,- Vol.270.- P.30829-30836.

92. Murdoch C., Monk P.N., Finn A. Cxc chemokine receptor expression on human endothelial cells.// Cytokine.- 1999,- Vol.11, No.9.- P.704-712.

93. Mutin M., Dignat-George F., Sampol J. Immunologic phenotype of cultured endothelial cells: quantitative analysis of cell surface molecules.// Tissue Antigens.- 1997,- Vol.50, No.5,-P.449-458.

94. Nyhlen K., Linden M., Andersson R., Uppugunduri S. Corticosteroids and interferons inhibit cytokine-induced production of IL-8 by human endothelial cells.// Cytokine.- 2000,-Vol.12, No.4,- P.355-360.

95. Paleolog E.M., Delasalle S.A.J., Buurman W.A., Feldman M. Functional activities of receptors for tumor necrosis factor-a on human vascular endothelial cells.// Blood.- 1994,-Vol.84, No.8,- P.2578-2590.

96. Peters J.H., Xu H, Ruppert J., Ostermeier D., Friedrichs D. et al. Signals required for differentiating dendritic cells from human monocytes in vitro.// Adv Exp Medicine & Biology.-1993,- Vol.329.-P.275-280.

97. Peters J.H., Gieseler R.K., Thiele В., Steinbach F. Dendritic cells: from ontogenetic orphans to myelomonocytic descendants.// Immunol Today.- 1995,- Vol.17, No.6,- P.273-277.

98. Pirila L. ,Heino J. Altered integrin expression in rheumatoid synovial lining type В cells: in vitro cytokine regulation of albl, a6bl and avb5 integrins.// J Rheumatol.- 1996,- Vol.23, No.10,-P.1691-1698.

99. Polunovsky V.A., Wendth C.H., Ingbar D.H., Peterson M.S., Bitterman P.B. Induction endothelial cell apoptosis by TNF-a modulation by inhibitors of protein synthesis.// Exp Cell Res.- 1994,- Vol.214.- P.584-594.

100. Qin Z., Noffz G., Mohaupt M., Blankenstein T. Interleukin-10 prevents dendritic cell accumulation and vaccination with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor gene-modified tumor cells.// J Immunol.- 1997,- Vol.159, No.2.- P.770-776.

101. Ramasamy S., LipkeD.W., Meclain C.J., Hennig B. Tumor necrosis factor reduces proteoglycan synthesis in culture endothelial cells.// J Cellular Physiology.- 1995,- Vol.162, No. 1,-P. 119-126.

102. Reverdiau P., Jarousseau A.C., Thibault G., Khalfoun В., Watier H. et al. Tissue factor activity of syncytiotrophoblast plasma membranes and tumoral trophoblast cells in culture.// Thromb. Haemost.- 1995,- Vol.73, No.l.- P.49-54.

103. Robaye В., Mosselmans R., Fiers W., Dumont J.E., Galand P. Tumor necrosis factor induces apoptosis (programmed cell death) in normal endothelial cell in vitro.// Am J Pathol.-1991,- Vol.138, No.2.- P.447-453.

104. Romagnani S. Thl/Th2 cells.// Inflamm Bowel Dis.- 1999,- Vol.5, No.4.- P.285-294.

105. Ruppert J., Schutt C., Ostermeier D., Peters J.H. Down-regulation and release of CD14 on human monocytes by IL-4 depends on the presence of serum or GM-CSF.// Adv Exp Medicine & Biology.- 1993,- Vol.329.- P.281-286.

106. Sabatini M., Chavez J., Mundy G.R., Bonewold L.F. Stimulation of tumor necrosis factor release from monocytic cells by the A375 human melanoma via granulocyte-macrophage colony-stimulating factor.// Cancer Res.- 1990,- Vol.50, No.9.- P.2673-2678.

107. Sakai T.T., Jablonsky M.J., DeMuth P.A., Rama Krishna N., Jarpe M.A. et al. Proton NMR sequence-specific assignments and secondary structure of a receptor binding domain of mouse g-interferon.//Biochem.- 1993,-Vol.32, No.21.-P.5650-5655.

108. Sakamoto O., Hashiyama M., Minty A., Ando M., Suda T. Interleukin-13 selectivelysuppresses the growth of human macrophage progenitors at the late stage.// Blood.- 1995,-Vol.85, No. 12,- P.3487-3493.

109. Salmi M. ,Jalkanen S. Different forms of human vascular adhesion protein-1 (VAP-1) in blood vessels in vivo and in cultured endothelial cells; implications for lymphocyte-endothelial cell adhesion models.// Eur J Immunol.- 1995,- Vol.25.- P.2803-2812.

110. Santiago-Schwarz F., Divaris N., Kay C., Carsons S.E. Mechanisms of tumor necrosis factor-granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-induced dendritic cell development.// Blood.- 1993,- Vol.82, No. 10,- P.3019-3028.

111. Santiago-Schwarz F., Rappa D.A., Laky K., Carsons S.E. Stem cell factor augments tumor necrosis factor-granulocyte-macrophage colony-stimulating factor-mediated dendritic cell hematopoiesis.// Stem Cells.- 1995,- Vol.13, No.2.- P.186-197.

112. Savage C.O.S., Brooks C.J., Adu D., Richards G., Howie A.J. Cell adhesion molecule expression within human glomerular and kidney organ culture.// J Pathol.- 1997,- Vol.181, No.l.- P.111-115.

113. Shen C.-H. ,Stavnezer J. Interaction of Stat6 and NF-kB: Direct Association and Synergistic Activation of Interleukin-4-Induced Transcription.// Molecular and Cellular Biology.- 2001,-Vol.18, No.6,- P.3395-3404.

114. Simionescu M. ,Simionescu N. Proatherosclerotic events: pathobiochemical changes occuring in the arterial wall before monocyte migration.// The FASEB Journal.- 1993,- Vol. 7,-P.1359.

115. Sirony M., Munoz C., Pollicino Т., Sibony A., Sciacca F.L. et al. Divergent effects of interleukin-10 on cytokine production by mononuclear phagocytes and endothelial cells.//' Eur J Immunol.- 1993,- Vol.23, No.10.- P.2692-2695.

116. Strieter R.M, Koch A.E., Antony V.B., Fick R.B., Standiford T.J. et al. The immunopathology of chemotactic cytokines: the role of interleukine-8 and monocyte chemoattractant protein-1.// J Lab Clin Med.- 1994,- Vol.123, No.2.- P.183-197.

117. Stuhlmeier K M., Tarn C., Csizmadia V., Bach F.H. Selective suppression of endothelial cell activation by arachidonic acid.//Eur J Immunol.- 1996,- Vol.26, No.7,- P. 1417-1423.

118. Sugamura K., Asao H., Kondo M., Tanaka N., Ishii N. et al. The common ??chain for multiple cytokine receptors.// Adv Immunol.- 1996,- Vol.59.- P.225-277.

119. Szabolcs P., Avigan D., Gezelter S., Ciocon D.H., Moore M.A. et al. Dendritic cells and macrophages can mature independently from a human bone marrow-derived, post-colony-forming unit intermediate.//Blood.- 1996,- Vol.87, No. 11,- P.4520-4530.

120. Takahashi R ,Sawasaki Y. Letter to editor.Human endothelial cell line, ECV304, produces pro-urokinase.// In Vitro Cell Dev. Biology.- 1991,- Vol.27 A.- P.766-768.

121. Takahashi R ,Sawasaki Y. Letter to editor. Rare spontaneously transformed human endothelial cell line provides useful research tool.// In Vitro Cell Dev. Biology.- 1992 -Vol.28A.- P.380-382.

122. Tengku-Muhammad T.S., Cryer A., Rauji D.P. Synergism between interferon g and tumour necrosis factor a in the regulation of lipoprotein lipase in the macrophage J774.2 cell line.// Cytokine.- 1998,- Vol.10, No.l.- P.38-48.

123. Terui Y., Ikeda M., Tomizuka H., Kasahara Т., Ohtsuki T. et al. Activated endothelial cellsinduce apoptosis in leukemic cells by endothelial interleukin-8.// Blood.- 1998,- Vol.92, No.8,-P.2672-2680.

124. Thornhill M.H. ,Haskard DO. IL-4 regulates endothelial cell activation by IL-1, tumor necrosis factor or IFN-y.// J Immunol.- 1990,- Vol.145, No.3.- P.865-872.

125. Thornhill M.H., Wellicom S.M., Mahiouz D.C., Lanchbury J.S.S., Kyang-aung U. et al. Tumor necrosis factor combines with IL-4 or IFN-y to selectively enhance endothelial cell adhesiveness for T-cell.// J Immunol.- 1991,- Vol. 146, No.2,- P.592-598.

126. To S.S., Newman P.M., Hyland V.J., Robinson B.G., Schrieber L. Regulation of adhesion molecule expression by human synovial microvascular endothelial cells in vitro.// Arthr Rheum.- 1996,- Vol.39, No.3.- P.467-477.

127. Tominaga A., Takaki S., Hitoshi Y., Takatsu K. Role of interleukin 5 receptor system in hematopoiesis: molecular basis for overlapping function of cytokines.// Bioassays.- 1992,-Vol.14, No.8,- P.527-533.

128. Villarette L.H. ,Remick D.G. Nitric oxide regulation of IL-8 expression in human endothelial cells.// Biochem Biophy Res Commun.- 1995,- Vol.211, No.2.- P.671-676.

129. Voara R., Romero L.I., Karasek M.A. Interleukin-10 induces E-selectin on small and large blood vessel endothelial cells.// J Exp Med.- 1996,- Vol. 184, No.3.

130. Wang L.M., Michieli P., Lie W.R., Liu F., Lee C.C. et al. The Insulin Receptor Substrate-lrelated 4PS substrate but not the IL-2R chain is involved in IL-13 mediated signal transduction.//Blood.- 1995,- Vol.86.-P.4218-4227.

131. Weber С., Negrescu E, Pietsh A., Fraukenberger M., Zieglerheitbrock H.M.L. et al. Inhibitors of protein tyrosine kinase suppress TNF-stimulated induction of endothelial cell adhesion molecules.// J Immunol.- 1995,- Vol.155, No.l.- P.445-451.

132. Weber C., Erl W, Pietsch A., Weber P.C. Aspirin inhibits nuclear factor-kappa В mobilization and monocyte adhesion in stimulated human endothelial cells.// Circulation.-1995,- Vol.91, No.7,- P. 1914-1917.

133. Yong K., Cohen H., Khwaja A., Jones H.M., Linch D.C. Lack of effect of granulocyte-macrophage and granulocyte colony-stimulating factors on cultured human endothelial cells.// Blood.- 1991,- Vol.77, No.8.-P.1675-1680.

134. Zhou L.J. ,Tedder T.F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells.// Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA.- 1996,-Vol.93, No.6,- P.2588-2592.1. БЛАГОДАРНОСТИ

135. Автор выражает благодарность А.С. Симбирцеву и А.Ю. Котову за любезно предоставленные IL-1 |3 и IL-8, а также за научное сотрудничество; Полосухиной Е.Р. и Барышникову А.Ю. за помощь при оценке экспрессии поверхностных маркеров активации.

136. Огромное спасибо П.Г. Назарову и Е.П. Киселевой за рецензирование работы, полезные советы и замечания. Хочется выразить благодарность всем сотрудникам отдела иммунологии НИИЭМ РАМН, за внимание и неоценимую помощь при выполнении этой работы.

137. Пользуясь случаем, хочется поблагодарить Е.Ю. Никитину и Т.А. Крылову -моих первых наставников, научивших меня культуральной работе.

138. Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю Ирине Соломоновне Фрейдлин за переданные мне знания, профессиональный опыт и помощь на всех этапах работы.