Биохимические аспекты формирования барьерного фенотипа эндотелиоцитов человека при совместном культивировании с аллогенными астроцитами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Волгина, Надежда Евгеньевна

• Волгина, Надежда Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Волгина, Надежда Евгеньевна

Содержание

Список сокращений

Актуальность

Глава I. Обзор литературы: модели ГЭБ как инструмент в исследованиях барьера in vitro

Введение

Особенности соединений эндотелиальных клеток

Адгезивные контакты

Плотные контакты

Молекулы адгезии контактов (JAM)

Регуляция плотных контактов

Транспортеры

Роль астроцитов и перицитов в формировании барьера

Моделирование ГЭБ in vitro

Эволюция моделей ГЭБ

Монокультуры

Двумерные модели

Динамические модели

Метод компьютерного моделирования

Типология эндотелиальных клеток

Влияние экзогенных факторов

Параметры оценки барьерного фенотипа эндотелиальных клеток

Заключение

Глава II. Материалы и методы исследования

Получение первичной культуры HUVEC

Подготовка субстрата для культивирования эндотелиальных клеток

Совместное культивирование с астроцитами и с добавлением производного цАМФ

Фиксация и окрашивание клеток на культуральных вкладышах Transwell

Измерение трансэндотелиального сопротивления

Измерение проницаемости

Иммуноцитохимический анализ

Лизаты клеток культуры HUVEC

Диск-электрофорез белков в ДДС-ПААГ

Иммуноблоттинг

Очистка и выделение РНК

Постановка ПЦР

2

Цитотоксичность

Высокоэффективная жидкостная хромотография

Компьютерное моделирование

Определение активности эффлюксного транспортера в культуре ЬШУЕС

Статистический анализ

Глава III. Результаты и обсуждения

Культивирование клеток и иммуноцитохимическая верификация

Совместное культивирование эндотелиоцитов и астроцитов

Анализ экспрессии белков плотных контактов

Анализ экспрессии белков адгезивных контактов

Измерение проницаемости и трансэндотелиального сопротивления

Оценка влияния воспалительных медиаторов

Измерение проницаемости для физиологически активных веществ

Оценка активности обратного транспорта

Глава IV. Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений

Сх43 - коннексин 43 TJ - плотные контакты

VE-cadherin - васкулярно-эндотелиальный кадгерин N-cadherin - нейрональный кадгерин

РЕСАМ-1 - гликопротеин, относящийся к классу молекул клеточной адгезии (platelet endothelial cell adhesion molecule 1) VEGF - фактор роста эндотелия сосудов А

VEGFR-1 (Flt-1) - рецептор 1 типа фактора роста эндотелия сосудов VEGFR-2 (KDR) - рецептор 2 типа фактора роста эндотелия сосудов JAM - молекулы адгезивных контактов

JACOP - биспиральный белок, связанный с межклеточными контактами (junction-associated coil-coiled protein)

G-белки - семейство белков, относящееся к ГТФазам

HUVEC - культура эндотелиальных клеткок вены пуповины человека

MDCK - культура эндотелиальных клеток из почки собаки (Madine Darby Canine

Kidney)

Glut-1 - транспортер глюкозы клеток млекопитающих

P-gp - Р - гликопротеин

TGF - трансформирующий ростовой фактор

GDNF - фактор роста из клеток глии

bFCF - щелочной фактор роста фибробластов

PDGF - тромбицитарный фактор роста

ANG-1 - ангиопоэтин-1

ECGS - добавка для роста эндотелиальных клеток, содержащая экстракт из ткани мозга быка

сАМР - циклический аденозин монофосфат TEER - трансэндотелиальное сопротивление

ECIS - электрический сенсор комплексного сопротивления (Electric Cell-substrate Impedance Sensing)

DAPI - флуоресцентный ядерный краситель 4',6-diamidino-2-phenylindole

Dil - флуоресцентный краситель 1,1 '-октадецил 3,3,3',3-

тетраметилиндокарбоцианин перхлорат

Dil - Ас - LDL - меченый красителем Dil ацетилированный липопротеин низкой плотности

GFAP - глиофибриллярный кислый протеин

4

PBS - фосфатно-солевой буфер рН 7

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ЦНС - центральная нервная система

ДМСО - диметилсульфоксид

ПААГ - полиакриламидный гель

ПВДФ - поливинилиденфторидная мембрана

ПСА - аммония персульфат

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Актуальность

Среднегодовой темп роста рынка лекарственных средств для терапии заболеваний, связанных с нарушением ЦНС, оценивается в 99,3% [3]. Интенсивность развития этой области отчасти обусловлена тем, что доставка препаратов к ГЭБ имеет сложно прогнозируемый результат в аспекте эффективности действия даже при высоких концентрациях лекарств. Хорошо известно, лишь приблизительно 5 % лекарственных препаратов способны проникать через ГЭБ [128], что ставит перед фармакологическими компаниями задачу массового скрининга и отбора потенциальных терапевтических агентов не только путем анализа их физикохимических свойств, но и оценкой в доклинических испытаниях in vivo. Проведение подобных исследований при поиске возможного лекарственного средства лимитируется временем, стоимостью и активной конкуренцией со стороны фармакологических компаний. В связи с этим было разработано стратегически новое направление для тестирования ксенобиотиков и новых биологически активных веществ in vitro с использованием морфофункционального базиса ГЭБ -эндотелиальных клеток.

Особая роль ГЭБ, высокоэффективной биологической системы поддерживающей гомеостаз нервной ткани, предопределяет фенотипические особенности эндотелиальных клеток: наличие межклеточных плотных контактов и экспрессию транспортеров обратного выброса, низкий уровень пиноцитоза и малое количество фенестр [21,52,121,144]. В условиях in vitro клетки теряют свои уникальные характеристики вследствие дедифференцировки, что является неизбежным процессом при изъятии клеток их естественного микроокружения [62]. Онтогенетически первым спутником эндотелиальных клеток является радиальная глия, часть клеток которой в процессе эмбриогенеза трансформируются в звёздчатые астроциты [139, 144]. Являясь своеобразным шлюзом между кровеносным руслом и нервной тканью, астроцитарная глия находится в тесном контакте с аблюминальной поверхностью эндотелиальных клеток и может, по мнению ряда исследователей [2, 114, 192], эпигенетически индуцировать образование специфического барьерного фенотипа церебральным эндотелием. При этом совместное культивирование эндотелиальных клеток с астроцитами приводит к повышению синтеза белков плотных контактов [160, 55, 143, 84], частичному восстанавлению уровеня экспрессии гамма-глютамилтранспептидазы [51, 172, 115], специфических транспортеров гексоз и транспортера обратного выброса [16, 111, 136]. Первостепенность микроокружения была продемонстрирована в опытах по имплантации культивированных астроцитов в области с изначально проницаемым эндотелием, в результате чего в этих участках сосудов плотность белков межклеточных контактов повышалась [84]. Воссоздание этого микроокружения in vitro может способствовать

6

развитию барьерных свойств у изначально небарьерного эндотелия, что свидетельствует о гибкости изменения фенотипа [71] в ответ на стимулирующие факторы. Молекулярная основа таких стимулов не вполне ясна, но известно, что астроциты способны продуцировать комплекс биологически активных веществ (TGF(3, bFGF, GDNF, IL-1, IL-2, IL-6, aTNF и др.), реализация действия которых осуществляется при контакте астроцитов и эндотелиоцитов и проявляется разнонаправлено, прежде всего, в формировании специфической апикально-базальной полярности между этими клетками и концентрированию сигнальных молекул непосредственно у аблюминальной поверхности эндотелия.

В настоящее время существуют различные модели ГЭБ как в структурном, так и в техническом плане, которые совершенствуются в стремлении более точного и полного воспроизведения свойств барьера. Интерес к ним растет не только с практической точки зрения (для прогнозирования проницаемости лекарств через ГЭБ), но и в теоретическом плане, поскольку модели ГЭБ представляются незаменимым инструментом в исследовании молекулярных взаимодействий, лежащих в их основе и регулирующих проницаемость церебрального эндотелия в норме и при патологии.

Цель работы: разработать воспроизводимую in vitro модель гематоэнцефалического барьера на основе сокультивирования эндотелиоцитов пуповинной вены и астроцитов человека, применимую для скрининга проницаемости веществ различной химической природы через гистогематические барьеры, а также для исследований факторов, модулирующих состояния межклеточных контактов и регулирующих транспорт через ГЭБ.

Задачи:

1. Получить чистую культуру эндотелиальных клеток вены пуповины человека, верифицировать её по экспрессии основных маркёров.

2. Получить чистую культуру астроцитов из мозга человека и охарактеризовать по экспрессии основных маркёров.

3. Подобрать оптимальные условия культивирования нецеребральных эндотелиальных клеток и аллогенных астроцитов для возможности реализации эпигенетического влияния.

4. Изучить основные параметры, характерные для фенотипа эндотелиоцитов, формирующих ГЭБ (белки плотных контактов, трансэндотелиальное сопротивление и проницаемость), применительно к культуре эндотелиальных клеток пупочной вены до и после совместного культивирования с астроцитами человека.

5. Исследовать влияние воспалительных медиаторов на экспрессию белков адгезивных контактов (васкулярно-эндотелиальный кадгерин, катенин), а также на уровень трансэндотелиального сопротивления и проницаемости в культурах эндотелиальных клеток, до и после совместного культивирования с астроцитами человека.

6. Изучить перспективы применения модели ГЭБ на основе нецеребральных эндотелиальных клеток и астроцитов человека в качестве тест-системы для количественного анализа проницаемости широкого спектра веществ методом пассивного транспорта.

Научная новизна: впервые на основе сокультивирования нецеребральных эндотелиальных клеток вены пуповины человека с астроцитами человека разработана модель гистогематического барьера, характеризующаяся параметрами сходными с фенотипом эндотелиоцитов, формирующих ГЭБ. Впервые изучены перспективы применения такой модели в качестве тест-системы для количественного анализа проницаемости широкого спектра веществ методом пассивного транспорта, а также возможности регулирования проницаемости через ГЭБ путем модулирования экспрессии белков плотных контактов.

Практическая значимость

Модель ГЭБ на основе эндотелиальных клеток вены пуповины человека, со-культивированных с аллогенными астроцитами, применима для скрининга диффузионной проницаемости различных веществ через гистогематические барьеры в системе in vitro, а также факторов, способных регулировать их резистентность.

Глава I. Обзор литературы: модели ГЭБ как инструмент в исследованиях барьера in vitro

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биохимические аспекты формирования барьерного фенотипа эндотелиоцитов человека при совместном культивировании с аллогенными астроцитами»

Введение

Концепция понимания ГЭБ как физиологически активной границы между кровью и центральной нервной системой начала формироваться в конце 19 века с опытов Пауля Эрлиха. Ученый интравенозно вводил краситель и отмечал его распределение по всех органах животных, исключая ткани мозга. Этот феномен был подтвержден в работах Goldmann, который показал, что при введении трипанового синего в мозг через субарахноидальное пространство происходит окрашивание цереброспинальной жидкости, а периферические ткани остаются бесцветными. Позже в 1941 году Broman выдвинул гипотезу о существовании двух барьерных систем в мозге: представленные хороидным сплетением и церебральными микрососудами. К настоящему времени сформировалось представление о ГЭБ как о морфо-функциональной структуре, являющейся высокоселективным фильтром, поддерживающим гомеостаз мозга [127]. Уникальные свойства эндотелиальных клеток, выстилающих внутреннюю поверхность микрососудов, обеспечивают следующие функции:

- ограничение межклеточного транспорта к тканям мозга потенциально токсичных субстратов благодаря присутствию плотных контактов;

- низкий уровень трансмембранного транспорта вследствие практически полного отсутствия жидкофазного пиноцитоза и фенестрированности эндотелиальных клеток мозга;

- регуляция проникновения в мозг и модификация различных веществ комплексом ферментов (ацетилхолинэстеразы, щелочной фосфатазы, гамма-глютамилтранспептидазы, моноаминных оксидаз);

- метаболическая деградация, активное выведение веществ с помощью транспортеров обратного выброса (ABC, АТФ-зависимые кассетные транспортеры).

Хорошо известно, что ткани мозга характеризуются высоким уровнем метаболизма, особенно в отношении аэробного гликолиза. Вследствие этого, для нормального функционирования ЦНС млекопитающих необходимо постоянство концентрации веществ, в частности глюкозы в интерстициальной жидкости. Степень экспрессии транспортёра глюкозы эндотелиальными клетками и его стереоспецифичное распределение между аблюминальной и люминальной (на аблюминальной мембране от 3 до 4 раз экспрессия выше) мембранами отражает динамику активности ГЭБ. Недавние работы, проведённые в области составления генома, оценивают экспрессию транспортёров в 15 - 20% от общего числа генов ГЭБ [42, 135]. Описаны независимые системы транспорта для гексоз (глюкозы, галактозы), основных, нейтральных и кислых

9

аминокислот, монокарбоксикислот (лактат, пируват, кетоновые тела), пуринов (аденин, гуанин), нуклеозидов (аденозин, гуанозин, уридин), аминов (холин) и некоторых ионов [43, 49, 70, 155]. Эти переносчики высоко стереоселективны и время их действия измеряется миллисекундами.

ГЭБ - это также и иммунологический барьер, который в нормальном состоянии непроницаем для патогенных микроорганизмов, антител и лейкоцитов, но может становиться серьёзной преградой для терапии патологических нарушений. Поэтому при неврологических заболеваниях интерес к ГЭБ как к терапевтической мишени, прежде всего, фокусируется на поиске соединений, успешно преодолевающих барьер и накапливающийся в необходимых для лечения количествах.

Особенности соединений эндотелиальных клеток

Эндотелий - метаболически активный монослой клеток, функционирование которого определяется взаимодействием образующих его клеток как друг с другом, так и с окружающим экстрацеллюлярным матриксом. Фенотипические особенности эндотелия обусловлены локальным микроокружением и определяют морфологическую гетерогенность сосудистой выстилки.

Описано три типа контактов, образуемых эндотелиальными клетками: плотные (TJ), адгезивные, щелевые [17]. Последний тип соединения, опосредующий взаимодействие клетка-клетка, осуществляется тремя белками семейства коннексинов: Сх43, Сх40, Сх37, высокоэкспрессированными в эндотелии. Шесть коннексинов объединяясь, организуют основную структурную единицу щелевого контакта - коннексон, гексагональный агрегат, играющий роль прямого межклеточного канала, по которому ионы и низкомолекулярные вещества диффундируют из клетки в клетку благодаря коммуникации соседних коннексонов. Функциональное значение щелевых контактов велико: они могут служить целям метаболической кооперации клеток, модулируя диаметр внутреннего канала в ответ на действие тока, изменения рН, концентрацию ионов Са2+ и тем самым регулируют электропроводимость мембран, транспорт низкомолекулярных веществ [25].

Наиболее функционально значимыми типами контактов эндотелия считаются адгезивные и плотные (рис.1). Подобные структуры с высокой степенью гомологии характерны и для эпителиальных клеток, на примере которых изучалась молекулярная организация этих соединений, однако контактам эндотелиальных клеток присущи свойства, специфические их топологии. Так, в мозге, где необходим жёсткий контроль проницаемости между кровью и нервной системой, они развиты лучше, особенно в

отношении и в противоположность посткапиллярным сосудам, проницаемым для таких веществ, как брадикинин и гистамин [144, 189].

кровь

■Ч

Claudin

I ^адкомышечные

КЛСГКН

нейроны

М11К|ШГ.1НН

мозг

Рисунок 1. - Схематическое изображение главных компонентов ГЭБ,

формирующих нейроваскулярный комплекс. Упрощенное представление

молекулярной организации плотных и адгезивных межэндотелиальных контактов ГЭБ

Полное формирование данных соединений происходит в процессе постнатального развития, что подтверждается данными in vitro: обнаружение белков адгезии (VE-cadherin, РЕСАМ) становится возможным только после нескольких дней дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в эндотелиальные [165, 144].

Важным является и то, что контакты - динамические структуры. Формируясь как адгезивные комплексы на границе межклеточных коммуникаций, мембранные белки в своём становлении образуют конструкции, напоминающие замочную застёжку, стягивающую латеральные поверхности соседних клеток.

как

Адгезивные контакты

Адгезивные контакты характерны для всего сосудистого русла и представлены в кровеносных, так и в лимфатических сосудах. Эти структуры сформированы трансмембранными адгезионными белками, членами семейства кадгеринов, которые опосредуют гомофильную адгезию и организованы в мультимерные комплексы на границе клеток. Имеют общий план модульного строения: обычно пять иммуноглобулин подобных экстраклеточных доменов, один цитоплазматический домен и

11

цитоплазматический хвост. Кадгерины классифицируют на два субсемейства: тип I, к которому относятся N-, Е-, С- Cadherin и тип II, объединяющий VE-, MN-, OB- Cadherin. Кадгерины - одноцепочечные трансмембранные белки, содержащие высококонсервативный цитоплазматический участок и экстраклеточный домен с Са2+ связывающим мотивом для гомофильного клеточного узнавания.

Васкулярно-эндотелиальный кадгерин, VE-cadherin, как следует из названия, характерен только для эндотелиальных клеток и с момента дифференцировки является их маркёром. Данные о кристаллической структуре [5] свидетельствуют, что VE-cadherin димеризуются латерально в положении цис- и образуют контакты голова - к -голове в транс-положении, обеспечивая физическое сцепление между клеточными мембранами и интрацеллюлярной сетью цитоплазматических протеинов и актиновых филаментов.

Аминокислотный сиквенс васкулярно-эндотелиального кадгерина показал среднюю степень гомологии в строении цитоплазматических и экстраклеточных доменов этого белка и представителей всего семейства кадгеринов, указывающую на строгую специфичность роли молекулы VE-cadherin в межклеточной адгезии и взаимодействии с белками цитоскелета.

Делеция гена, кодирующего этот белок у мышей, приводит к сильным дефектам в развитии сосудистой сети и к смерти эмбрионов на сроке середины беременности [29; 63]. Эндотелиальные клетки, нулевые по VE-кадгерину, разобщены между собой и отделены от базальной мембраны, что приводит к разрушению сосудистого русла и сильным кровоизлияниям. Опыты, проведённые на изолированных аллантоисах [37], показали, что VE-cadherin необходим для стабилизации сосудов и играет важную роль в поляризации и пролиферации эндотелиальных клеток.

Высоким является и уровень экспрессии нейронального кадгерина (N-cadherin) [104]. Интересно, что присутствие васкулярного кадгерина исключает локализацию N-cadherin из адгезивных контактов и обусловливает его диффузное распределение на клеточной мембране. Важный аспект функционирования нейронального кадгерина заключается в обеспечении взаимодействия эндотелиальных клеток с мезенхимальными, экспрессирующими этот белок: перицитами, гладкомышечными клетками и астроцитами. Такие межвидовые клеточные контакты, прежде всего, необходимы для удлинения сосудов, защиты эндотелиальных клеток от апоптоза. Williams с коллегами [186] обнаружили участок в экстраклеточном домене N-cadherin, ответственный за активацию рецептора ростового фактора фибробластов, индуктора клеточного роста. Это дало основание предположению об участии нейронального кадгерина в ангиогенезе.

Кадгерины посредством дистальных участков цитоплазматических доменов их молекул напрямую связаны с ß - катенином и плакоглобином. Эти два структурно

12

близких члена семейства armadillo белков, соединяясь с а - катенином, формируют триаду, комплекс, посредством которого осуществляется взаимодействие с актином цитоскелета (рис.2). В эндотелиальных клетках, не имеющих десмосом, плакоглобулин через десмоплакин может соединять VE-cadherin с виментин-базирующимися промежуточными филаментами, тем самым формируя complexus adhaerents.

Рисунок 2. - Схематическое представление взаимодействия УЕ-сасІЬегіп с цитоплазматическими белками адгезивных контактов. Локализация и функция кадгеринов: гомофильная адгезия между соседними эндотелиальными клетками (УЕ-сагіИегіп), гетерофильное взаимодействие с микроокружением (N-cadheri^l). Роль УЕ-саиЬепп 2 и К-с^Иегіп не ясна[31]

Принятой считается концепция взаимодействия молекул адгезии (интегринов, кадгеринов) с рецепторами ростовых факторов [31], основывающаяся на том, что степень ответа клеток на митогенные стимулы диктуется плотностью роста клеток или составом экстраклеточного матрикса. В случае васкулярно-эндотелиального кадгерина показано, при активации эндотелиоцитов УЕОР, второй рецептор ростового фактора (УЕОРЯ2) связывается с комплексом VE-cadherin/p-catenin, что имеет два важных последствия. Во-первых, фосфорилирование рецептора в присутствии тирозина кадгерина значительно снижается, ингибируется активация протеинкиназ (МАРК) и индуцируется клеточная пролиферация [96]. Во-вторых, фосфорилирование тирозина VE-cadherin снижает степень ассоциации белка с Р-саіепіп и актиновым цитоскелетом, что в свою очередь вызывает повышение проницаемости УЕОР-активированных эндотелиальных клеток [53].

Данные о функциональной роли VE-cadherin указывают на его участие в процессах реагирования эндотелиальных клеток на давление сдвига путём образования механо-

13

чувствительного комплекса, состоящего из молекул белков РЕСАМ-1 (напрямую передаёт механические воздействия),VEGFR2 (активирует фосфотидил инозитол 3-ОН киназу) и самого кадгерина [174]. Посредническая функция кадгеринов в передаче сигналов и их способность к кластернизации в области контактов усиливает действие различных эффекторов на клетки.

О непосредственном участии Р-катенина в образовании барьерного фенотипа эндотелиальными клетками в литературе не сообщается, однако опыты, проведенные на дефицитных мышах, свидетельствуют об активном участии этого белка в стабилизации сосудистого русла в процессе эмбрионального и постнатального развития. Ключевая роль Р" катенина заключается в контроле Wnt сигнального пути путем транслокации молекулы белка в клеточное ядро и активации транскрипционных факторов, регулирующих экспрессию генов, среди которых могут быть и гены белков плотных контактов.

Функция интегринов, трансмембранных белков клеточной поверхности, содержащих нековалентно связанные аир- гетеродимеры, заключается в обеспечении межклеточной адгезии и узнавания экстраклеточного матрикса с помощью RGD мотива. При дефиците av или Р8 субъединиц интегрина у мышей наблюдается вазодилатация на ранних стадиях развития и мозговое кровоизлияние, что является следствием нарушения во взаимодействии эндотелиальных клеток и астроцитов при формировании церебральных сосудов. Способность к трехмерной конформации интегринов приводит к передаче сигнала на актиновый цитоскелет через линкерные молекулы (паксилин, винкулин, талин, a-актинин). Показано, что при фокальной церебральной ишемии интегрины оказываются супрессированы, что свидетельствуют об их важности в поддержании целостности сосудистого русла.

Адгезивные контакты в эндотелиальных клетках - ключевая структура в отношении таких свойств как: проницаемость для растворов или воспалительных цитокинов, контактное ингибирование клеточного роста, апоптоз.

Плотные контакты

Впервые плотные контакты были описаны в 1963 году с помощью электронной микроскопии как некая структурная особенность плазматической мембраны и названы zonula occludens. На изображениях, полученных с помощью техники тонкого среза, плотные контакты выглядят как цепь последовательных участков слияния мембран соседних клеток, однако при высоком увеличении становится очевидным, что слияния мембран как такового не происходит. Граничное положение плотных контактов между апикальными и базолатеральными поверхностями клетки определяет их роль в ограничении латерального межклеточного пространства, межклеточной диффузии

14

растворов (барьерная функция), препятствии свободному перемещению и смешиванию функционально различных внутримембранных белков (функция ограждения), что способствует поддержанию полярности мембраны.

Уровень экспрессии плотных контактов высок в эпителиальных и эндотелиальных клетках, однако, несмотря на гомологичность белков их образующих, ошибочно полностью полагаться на полную идентичность без учёта особенностей организации эндотелия.

2опи11а осс1ис1епз (20-1) -первый внутриклеточный компонент плотных контактов, описанный в 1986 году. В последующие годы были проведены исследования, направленные на поиск интегральных протеинов - партнёров Z0-\, привёдшие к открытию трансмембранного белка - окклюдина, за которым последовал целый ряд работ в этой области, свидетельствующих о комплексности структурной организации контактов [58, 119].

Окклюдин был идентифицирован с помощью моноклональных антител, (полученных к белкам контактов фракции печени цыплёнка) как белок с молекулярной массой 65 кДа, содержащий две экстраклеточные петли и четыре мембрано-сопряжённых домена с располагающимися в цитоплазме амино- и карбокси- терминальными участками (рис.3) [59]. Результаты расшировки аминокислотной последовательности окклюдина различных видов позвоночных показали высокий уровень гомологии в первой экстраклеточной петле, содержащей несколько глициновых и тирозиновых остатков, и в карбокситерминальном хвосте. Окклюдин 1В - альтернативный сплайс - вариант, имеющий вставку в 56 аминокислот, его субклеточная локализация и тканевое распределение не отличаются от таковых у окклюдина. Степень фосфорилирования цитоплазматического домена окклюдина определяет его ассоциацию с клеточной мембраной и проницаемость барьера [59]. Обе экстраклеточные петли, трансмембранный и С-концевой участки окклюдина важны в контроле межклеточной проницаемости, Ы-терминальный домен регулирует миграцию нейтрофилов, обеспечивает констелляцию плотных контактов и их барьерную функцию. Окклюдин локализуется специфически в плотных контактах эпителиальных и эндотелиальных клеток, в последних уровень его экспрессии соотносится с проницаемостью различных сегментов сосудистого русла: высокий в церебральном эндотелии и значительно более низкий в тканях, не относящихся к нервной системе [72].

Рисунок 3. - Расположение экстраклеточных и цитоплазматических доменов окклюдина в клетке [39]

Результатом делеции окклюдина у мышей является задержка в формировании фенотипа и постнатальном росте. Удивительно, что при этом сами плотные контакты хорошо развиты и отмечается нормальное трансэпителиальное сопротивление. По-видимому, экспрессия других белков контактов, таких как: клаудин-3(с1аисНп-3), ZO-1, сосудистый эндотелиальный кадгерин (VE-кадгерин) и а-катенин (a-catenin), могут компенсировать отсутствие окклюдина. Однако у дефицитных мышей наблюдается гиперплазия эпителия желудка, кальцификация в различных областях мозга и атрофия тестикул, что указывает на роль окклюдина не только в построении плотных контактов, но и в участии в важных физиологических процессах: регуляции дифференцировки эпителиальных клеток, контроле клеточного апоптоза посредством митоген -активированных протеин киназ и Akt сигнального пути [146].

Семейство клаудинов объединяет более 20 небольших по молекулярной массе белков (22-24 кДа), имеющих общий план строения: четыре трансмембранных домена, две внеклеточных и одну внутриклеточную петлю и находящиеся в цитоплазме N-терминальный (2-6 аминокислот) и С-концевой участок (21-63 аминокислот), который несёт сайт для связывания цитоплазматических белков ZO-1, ZO-2, ZO-3, MUPP1, PATJ через PDZ мотив [120] (рис.4).

Рисунок 4. - Схематическое изображение клаудина: WWCC мотив экстраклеточной петли белка консервативен между членами семейства клаудинов, тогда как цитоплазматический хвост, относительно постоянной длины, содержит вариабельные домены [177].

Клаудины 1 [120], 3 [119], 5 [122] специфичны для мозга и могут формировать каналы с приблизительным размером в 10 А, посредством которых осуществляется транспорт молекул воды через контакты.

Гиперэкспрессия клаудина в фибробластах приводит к сборке плотных контактов в сочетании с повышенной ассоциацией с окклюдином, а значит, клаудин ответственен за «комплектацию» плотных контактов. Делеция 5 изоформы белка у мышей приводит к их гибели примерно через 10 часов после рождения. При этом происходит формирование сосудов мозга, возможно, благодаря компенсаторному синтезу клаудина 12, структуры плотных контактов, однако наблюдается повышенная проницаемость гемато-энцефалического барьера в отношении малых молекул <800 Да [122]. Таким образом, нет сомнений, что клаудин 5- ключевой регулятор в обеспечении целостности плотных соединений и функции ГЭБ.

Пожалуй, самые изучаемые внутриклеточные компоненты плотных контактов -члены семейства мембрано-ассоцированных гуанилат киназ (MAGUK), которым присуще разнообразие модульного строения, периферическая связь с мембраной и формирование молекулярного комплекса в структуре плотных контактов или синапсах.

Моноклональные антитела R26.4C, полученные к белкам контактов из фракции печени, узнают специфически антиген, массой 220-225 кДа. Этот протеин, назван zonula occludens (ZOl) за его подобие поясу, стягивающему мембраны соседних клеток в месте

их контакта [164]. Распределение 20-1, 20-2, 20-3 зависит от типа клеток их экспрессирующих, в отношении 20-1 наибольшее количество белка локализовано в протяжённых комплексах контактов, характерных для эпителиальных и эндотелиальных клеток мозга и артерий. Экспрессия 20-1 наблюдается в астроцитах и фибробластах, не формирующих плотные контакты [80], и в перинуклеарной зоне.

20-1 и его гомологи содержат PDZ мотив, который необходим для заякоривания трансмембранных белков в актине цитоскелета. 20-1 существует в двух сплайс вариантах, содержащих домен длиной 80 -а- аминокислот [187]: а + изоформа преимущественно встречается в эпителии, в то время как а ~ изоформа найдена в эндотелии, клетках Сертоли, щелевидной диафрагме почечных клубочков. Регуляция 20-1 является кальце-зависимой [154], как только белок локализуется в плотных контактах, он становится нерастворимым в неионных детергентах благодаря крепкому сцеплению с компонентами актинового цитоскелета [4].

20-2, 20-3 гомологичны 20-1 в аминокислотной последовательности и имеют одинаковую структурную организацию: три РБ2, БНз гуанилат-киназный домены, участки, обогащенные кислыми и пролиновыми группами. 20-2, имеющий молекулярную массу 160 кДа и ранее считавшийся белком специфическим для плотных соединений, как оказалось, может точечно локализоваться в адгезивных контактах неэпителиальных клеток [79] и более того, смещаться к ядру, где возможно, взаимодействует с факторами транскрипции, вовлекаясь в сигнальную передачу к белкам контактов.

20ЫАВ (20-1 ассоцированный нуклекислотно - связывающий протеин) вместе с циклин-зависимой киназой 4 участвует в регуляции клеточной пролиферации [10].

В ряде исследований показано функционирование 20-1 в качестве шаперона при формировании комплекса плотных контактов [133] и его участие в организации межклеточных адгезий путём кооперации с трансмембранными белками, а, следовательно, и в контроле эндотелиальной проницаемости.

Еще одним белком, опосредующим взаимодействие с актином цитоскелета, является сравнительно недавно открытый белок МСОР, аминокислотная последовательность которого близка к таковой у цингулина, еще одного периферического компонента плотных крнтактов. В целом адапторные белки необходимы для реализации клеточного сигналинга, регуляции формирования плотных контактов, установления клеточной полярности.

Молекулы адгезии контактов ^АМ)

Получили своё название благодаря субклеточной локализации и участии в адгезии. Член семейства, 1АМ-А, представляет собой 32 кДа гликопротеин, состоящий из

18

экстраклеточного участка, трансмембранного сегмента и короткого цитоплазматического хвоста [113]. Блокирование антителами к рекомбинантному фрагменту молекулы приводит к снижению сопротивления [108, 103], что коррелирует с ролью JAM-A в функционировании плотных контактов. Было показано в опытах in vitro и in vivo на моделях воспаления у мышей участие этого белка в накоплении лейкоцитов путём трансэндотелиальной миграции в подкожной зоне [113] и цереброспинальной жидкости [45].

Экстраклеточный фрамент JAM-A представлен двумя Ig-подобными доменами с амино-концевым и карбокси-терминалным фолдингом. В растворах рекомбинантный белок, полученный ко всему экстраклеточному участку JAM-А, связывается гомофильно, сам белок адгезии формирует параллельные и нековалентные гомодимеры, которые могут экспонироваться на клеточной поверхности для гомофильного взаимодействия [18]. JAM-А однако опосредует не только гомо-, но и гетеро-фильную адгезию как различных, так и лейкоцитарных аьРг интегринов и прикрепление белков сигма1 реовирусов [15] .

Описаны три молекулы семейства: JAM-A (JAM-1, JAM), JAM-C (JAM-3), JAM-B(JAM-2), имеющие 30-40% аминокислотную гомологию [17]. Специфическая локализация в эндотелии характерна для JAM-C и JAM-B, но преимущественно в крупных венах и лимфатических сосудах. Члены семейства молекул адгезии содержат PDZ-мотив, через который осуществляется связывание сигнальных молекул с комплексом плотных контактов, что указывает на роль этих белков в обеспечении полярности эндотелиальных клеток и поддержании их барьерного фенотипа [9].

Регуляция плотных контактов

Протеин киназа С (РКС) является главным регулятором формирования плотных контактов и их стабилизации [166]. Белок Z01 содержит 34 РКС фосфорилирующиеся консервативные последовательности, что дает основание считать данный белок проводником в передаче сигнала к цитоплазматической поверхности межклеточных контактов [147]. Было показано, что частичное взаимодействие серин-специфичной протеин киназы с SH3 доменом Z01, вызывает разрушение целостности плотных контактов путем активирования MAP - киназы [190].

Активность плотных контактов регулируется посредством внутри- и внеклеточного кальция. При удалении из среды ионов Са2+ наблюдается временное понижение сопротивление и повышение проницаемости [175]. Увеличение уровня внутриклеточного Са2+ приводит к активации киназы легких цепей миозина, что вызывает разворачивание цепи миозина II и сокращение клетки.

При обработке эндотелиальных клеток цАМФ наблюдается элиминирование цитоплазматических стяжек волокон актина и сокращение количества стресс-фибрилл, на количественном уровне повышается сопротивление [54]. Фосфорилирование цАМФ осуществляется протеинкиназой А (РКА), контролирующей свойства плотных контактов, силу межклеточной адгезии, взаимодействие между плазматической мембраной и цитоскелетом [91].

Сигнальные молекулы, непосредственно влияющие на организацию актинового цитоскелета, особенно интересны в аспекте регуляции функции плотных контактов. Мутанты нокаутные по белкам RhoA и Racl, относящимся к GTP-связывающим протеинам, характеризовались практически полным отсутствием барьерной функции вследствие дезорганизации белков (окклюдин, Z01) в структуре плотных контактов и нарушениях в актиновом цитоскелете [88]. Эксперименты с использованием культуры HUVEC продемонстрировали, что именно ROCK-зависимая трансдукция является мишенью для действия таких воспалительных агентов, как бактериальный токсин, что приводит к повышению проницаемости [54].

Фосфорилирование трансмембранных и вспомогательных белков играет важную роль в создании и регуляции плотных контактов. Окклюдин и ZO1 могут быть фосфорилированы по сериновым, треониновым и тирозиновым остаткам [147]. Сообщается [190], что повторная организация белков в плотные контакты после их дезинтеграции коррелирует с активацией фосфорилирования окклюдина преимущественно по сериновым и тирозиновым остаткам [175]. Chen с коллегами [35] на культуре клеток MDCK, трансформированных геном Ras, показали наличие в цитоплазме окклюдина, клаудина-1, ZO-1, но отсутствие их экспрессии в межклеточных контактах. После проведения ингибирования МАРК сигнальных путей восстанавливалась экспрессия белков в плотных контактах вместе с фосфорилированием окклюдина и ZO-1.

В передаче сигнальных каскадов к плотным контактам участвуют мембранно-ассоцированные гуанилат-киназно-подобные протеины (GUKs). Был идентифицирован транскрипционный регулятор - связывающий нуклеиновые кислоты ZO-1-ассоцированный протеин (ZONAB), локализующийся в ядре и плотных контактах [162]. ZO-1 и ZONAB контролируют эндогенную экспрессию гена ЕгЬВ-2 (кодирует рецепторы эпидермального ростового фактора), регулируют межклеточную проницаемость, что позволяет предположить, что включение ZO-1b сигнальную трансдукцию приводит к экспрессии специфического гена.

Являясь динамичными структурами, плотные контакты подвергаются изменениям в уровне их экспрессии, субклеточной локализации, посттрансляционной модификации,

белок-белковых взаимодействиях, что дает возможность реагировать на физиологические и патологические условия.

Транспортеры

Для удовлетворения потребностей мозга в энергии необходимы ферментные и транспортные системы, осуществляющие доставку в мозг белков, глюкозы, гормонов, аминокислот, нуклеозидов и других питательных веществ, а также обеспечивающие поддержание электролитического баланса, выведение из мозга продуктов обмена.

Маркером эндотелия церебральных микрососудов считается Gluti, стереоселективный трансмембранный белок-переносчик D-глюкозы, характеризующийся высокой межвидовой гомологией (90% идентичности у свиньи, курицы и человека). С помощью электронной микроскопии локализация Gluti была определена как на люминальной, так и на аблюминальной мембранах [116], кроме того обнаружен его внутриклеточный пул, что указывает на возможный механизм значительных модуляций транспорта глюкозы в мозг.

Аминокислоты в ЦНС являются не только строительными блоками для биосинтеза белков, но и выступают в качестве нейротрансмиттеров (глутамат, аспартат, глицин, ГАМК) и их предшественников: серотонина (триптофан), катехоламинов (тирозин), N0 (аргинин). Так, уровень экспрессии изоформы I транспортера крупных нейтральных аминокислот (LAT I) в 100 раз выше в мозге, чем в других органах.

Из монокарбоксильных транспортеров для ГЭБ наиболее характерен МСТ1, входящий в белковое семейство, насчитывающее более 8 членов у млекопитающих. Наиболее метаболически значимым субстратом для этих протон-зависимых переносчиков является лактат - конечный продукт гликолиза.

Р-гликопротеин (P-gp), относящийся к семейству АТФ-зависимых кассетных транспортеров, первоначально был обнаружен в клетках опухоли, резистентных к химиотерапии, а позже и в системах транспорта нормального ГЭБ человека. Функция этих белков состоит в ограничении воздействия на нервную ткань различных потенциально токсических агентов путем выведения из клетки ксенобиотиков против градиента концентрации.

Особый интерес представляет исследование транспортных систем для нейрофармокологии, поскольку даже пройдя ГЭБ, психотропные вещества могут быть пассивно выведены с током цереброспинальной жидкости, подвергнуты метаболической деградации, активному выведению с помощью транспортеров активного выброса Pgp и MRP. В настоящий момент усилия многих научных групп концентрируются на поиске специфических для церебрального эндотелия ферментов и белков-переносчиков.

21

Роль астроцитов и перицитов в формировании барьера

Непосредственный контакт церебрального эндотелия с отростками астроцитарной глии in vivo лег в основу представления о том, что одним из главных стимулирующих факторов в процессе построения барьерного фенотипа эндотелиальными клетками являются астроциты. Во многих работах описан эффект значительного повышения синтеза белков плотных контактов [143, 44,84, 71], активации ферментов гамма-глютамил транспептидазы, Na+, К+ - АТФазы, щелочной фосфатазы [142], транспортера глюкозы [116] при совместном культивировании эндотелиальных и глиальных клеток. Кондиционированная астроцитами среда вызывает повышение трансэндотелиального сопротивления наряду с экспрессией НТ7, нейротелина, упомянутых выше ферментов, катализирующих перенос аминокислот и фосфора [160, 185, 124].

Широкий спектр продуцируемых астроцитами физиологически активных веществ, включающим нейротрансмиторы, цитокины, хемокины, ростовые факторы, селективные модуляторы, объясняется разнообразием коммуникаций клеток нервной системы. Это может быть продолжительный индуктивный эффект, влияющих на фенотипические свойства клеток или краткосрочная передача сигнала. Изучение межклеточного взаимодействия in vivo крайне затруднительно ввиду сложности строения ГЭБ. Для этих целей используются модели барьера, с помощью которых было установлено, что продуцируемые глией трансформирующий ростовой фактор (TGF), фактор роста из клеток глии (GDNF), основной ростовой фактор фибробластов (bFGF), ангипоэтин-1 (ANG-1) стимулируют развитие ГЭБ-характеристик в культивируемых эндотелиальных клетках [78]. Один из путей сигнальной трансдукции, приводящий к изменениям в молекулярном профиле эндотелиальных клеток связан с изменением внутриклеточного Са , повышение концентрации которого вызывает ряд изменений в эффекторных белках, что приводит к фосфорилированию белков цитоскелета и открытию плотных контактов [189, 75].

Физико-химические свойства мембраны эндотелиальных клеток во многом зависят от влияния глии. Было показано, что при культивировании с глией содержание жирных аминокислот в липидном составе мембран эндотелиальных клеток становится превалирующим, что соответствует ситуации in vivo. Продукция астроцитами экстраклеточного матриксного гепарин сульфат протеогликана - агрина, необходимого для кластернизации ацетилхолиновых рецепторов в моторных нейронах необходима для симметричной поляризации эндотелиальных клеток и астроцитов, что является условием непроницаемости ГЭБ [14, 180].

Важным открытием в поиске кислород-регулируемых факторов, влияющих на развитие ГЭБ, стала идентификация src-супрессирующего С-киназного субстрата

22

(SSeCKS), продуцируемого астроцитами [101]. Повышение экспрессии этого фактора приводит к снижению синтеза VEGF in vitro, что справедливо и для условий in vivo. Низкий уровень SSeCKS на ранних стадиях эмбриогенеза значительно повышается к периоду постнатального развития, когда процессы ангиогенеза затухают и продукция VEGF снижается. В то же время SSeCKS стимулирует экспрессию в астроцитах ангиопоэтина-1, предшественника фактора дифференцировки эндотелиальных клеток, вызывающего группировку белков ZO-1, claudin-1 непосредственно на границах межклеточных контактов. Как сообщается, SSeCKS синтезируется астроцитами в ответ на PDGF-BB, продуцируемый эндотелием [36]. В этом контексте интересно отметить, что эндотелиальные клетки обеспечивают развитие астроцитов из их предшественников путем экспрессии эндотелоцитами ангиогенных кровеносных сосудов фактора, ингибирующего лейкозы (leukemia inhibitory factor, LIF) [118]. Таким образом, общий сценарий взаимной регуляции представляется таким: церебральный ангиогенный эндотелий вызывает дифференцировку астроцитов посредством продукции LIF и синтеза ими SSeCKS через экспрессию PDGF-BB. В свою очередь, астроциты снижают уровень VEGF и повышают содержание Ang-1, останавливая ангиогенные процессы и стимулируя становление барьерного фенотипа.

В процессе онтогенетического развития специализация барьерного фенотипа церебрального эндотелия происходит раньше, нежели развитие и созревание астроцитов из радиальной глии. Доказательством тому, что астроциты не единственный фактор, обладающий эффективным потенциалом действия на эндотелиальные клетки, служит присутствие астроцитов в циркумвентрикулярных органах, капилляры которых не формируют барьер. В противоположность в сосудах мозговых оболочек, являющихся частью ГЭБ, отсутствует какой-либо контакт с астроцитами [52].

Перициты являются спутниками эндотелиальных клеток уже на ранних стадиях их развития и характерны преимущественно для капилляров ЦНС. Долгое время функция перицитов in vivo оставалась непонятной [156], но к настоящему времени доказана их способность индуцировать барьерный фенотип. Совместное культивирование эндотелиальных клеток и перицитов приводит к повышению трансэндотелиального сопротивления, снижает проницаемость для макромолекул. Эксперименты с использованием иммортализованной линии перицитов взрослой крысы показали, что продуцируемый перицитами ангиопоэтин-1 стимулирует экспрессию окклюдина, интегрального белка плотных контактов [74]. Sundberg убедительно показал, что роль ангиопоэтина-1 в формировании сосудов в процессе развития может быть расширена до его функциональной регуляции и после завершения процессов ангиогенеза во взрослом мозге [167]. Кроме того, перициты повышают активность P-gp in vitro в церебральном

23

эндотелии, уровень синтеза трансформирующего ростового фактора бета 1 (TGF-b) [48], образуют механическую опору стенок сосудов, состоящую из ламинина, фибронектина, коллагена, тромбоспондина и тенасцина [151]. Важность перицитов в структуре ГЭБ подчеркивается иногда встречающимся в литературе названием «вторая линия защиты», тогда как «первой» является астроглия.

Моделирование ГЭБ in vitro

В начале 2000 годов группа Partridge в рамках программы поиска веществ, предназначенных для терапии заболеваний, связанных с нарушением ЦНС, призвали сфокусировать внимание исследователей на доставку лекарственных препаратов через ГЭБ с количественной оценкой проницаемости наиболее перспективных из них через барьер [129]. С тех пор это направление развилось в самостоятельную отрасль с применением достижений комбинаторной химии и высокопроизводительного скрининга, в результате чего было открыто огромное количество фармакологически активных молекул с перспективными биофармацевтическими свойствами.

Большинство доступных методов доставки препаратов к ЦНС достаточно рискованны, высокоинвазивны, могут иметь необратимые побочные эффекты или быть ограниченны временем, недостаточным для реализации терапевтического эффекта. Очевидна была необходимость в создании подходящей и воспроизводимой модели ГЭБ для дальнейших исследований на этапе разработки веществ и их оценки в предклинических испытаниях.

Первое успешное выделение церебральных микрососудов из мозга быка [87] положило начало масштабной работе по развитию и применению моделей ГЭБ in vitro, как инструмента для изучения физиологии, фармокологии и патофизиологии ГЭБ. В этом аспекте наиболее актуальными кажутся вопросы, касающиеся возможности предсказания проницаемости лекарственных средств через ГЭБ, дисфункции ГЭБ в патогенезе различных нервных заболеваний, анализа и оптимизации новых лекарственных средств. Серьёзность задач исследований обуславливает ряд требований, которым должны удовлетворять модели барьера in vitro. Прежде всего, ограничение межклеточной проницаемости для растворов веществ с различной трансэндотелиальной проницаемостью как метод скрининга широкого спектра активных соединений, чувствительность которого должна оставаться постоянной. Необходимо воспроизведение физиологически естественной архитектуры клетки, общих морфологических свойств, таких как: площадь поверхности межклеточных контактов, пространственное распределение субклеточных органелл и транспортеров, степень интеграции белков плотных контактов с образованием единых протяженных цепей на границах клеток. В той же мере важна экспрессия

24

функционально активных транспортеров: P-glycoprotein, осуществляющего активный эффлюкс из клеток, системы транспорта нейтральных аминокислот (L-system), монокарбоксильных кислот (МСТ) и других переносчиков с определением конкретных субстратов для них. Применение моделей в качестве инструмента для тестирования и отбора потенциальных лекарственных препаратов, предопределяет масштабность исследований, а следовательно, и потребность в большом количестве клеточных культур, технически простом плане конструкции моделей, абсолютной воспроизводимости и точности получаемых результатов. Достаточно сложно удовлетворить всем перечисленным критериям при создании модели in vitro, поэтому возможны вариации в их построении, определяемые целями конкретных исследований.

Эволюция моделей ГЭБ

Монокультуры

В конце 70-х двумя группами ученых под руководством Panula и DeBault были получены первые культуры церебральных эндотелиальных клеток и вскоре после признания важности роли астроцитов в развитии барьера, развилось целое направление моделирования ГЭБ [170, 98, 143]. Конструкция моделей-монокультур основывается на упрощенном представлении структуры барьера и представляет собой эндотелиальные клетки, культивируемые на полупроницаемой мембране пластиковой вставки Transwell. Несомненными достоинствами этой конструкции является её простота, возможность тестирования большого количества веществ вне зависимости от их химической природы в короткие сроки и ограничивается только доступностью источника эндотелиальных клеток. Благодаря фиксированному объему среды во внутреннем и внешнем отсеках, эта система идеальна для описания кинетических процессов транспорта с помощью уравнения Михаэлиса-Ментен [23]. Как известно, церебральные эндотелиальные клетки в отсутствии естественного микроокружения теряют многие из ключевых свойств (специфические транспортеры, полноценно развитые плотные контакты), обуславливающих их барьерный фенотип, что ведет к увеличению проницаемости. Так

проницаемость сахарозы для мономерной модели варьирует от 10"4 до 10° см с"1 против

6 8 1

10-10"° см с" , наблюдаемых in vivo [64]. Не физиологичным является и то, что эндотелиальные клетки оказываются подвержены влиянию компонентов сыворотки не только с люминальной, но и с аблюминальной стороны. Как следствие, происходит ускорение де-дифференцировки клеток, особенно при их длительном культивировании и росте числа пассажей. В отсутствии антимитотических факторов (ламинин, давление потока среды) наблюдается тенденция к образованию мультислоев эндотелиальными клетками в результате их ненаправленного роста [38, 196].

25

Двумерные модели

Эволюционный шаг в развитии моделирования ГЭБ in vitro был сделан с применением глиальных клеток в качестве необходимого строительного блока для конструирования модели, воспроизводящей условия in vivo (рис.5).

Рисунок 5. - Схематическое представление двумерной модели барьера, где эндотелиальные клетки растут на внутренней поверхности культурального вкладыша, астроциты - на дне лунки [33]

Совместное культивирование с астроцитами способствует развитию плотных контактов эндотелиальными клетками, целостных (непрерывных) по всему периметру клеточной мембраны, стимулирует экспрессию специфических маркеров церебральных эндотелиоцитов, включая щелочную фосфатазу, транспортеры глюкозы (Glut-1), трансферина (ОХ-26), транспортер обратного выброса Р-гликопротеин (P-gp) [98]. Подобные эффекты влияния астроцитов могут реализоваться при совместном культивировании, когда эндотелиоциты и астроциты разделены мембраной Transwell, радиус пор которой определяет наличие или отсутствие физического контакта между ними. Широко используется и кондиционированная среда астроцитов, которая содержит набор ростовых факторов, способствующих поддержанию барьерных свойств эндотелиальных клеток. Преимущества сокультивирования эндотелиоцитов и астроцитов перед монослоем эндотелиальных клеток очевидны: повышение трансэндотелиального сопротивления, снижение проницаемости для сахарозы, пролонгация барьерных характеристик церебральных эндотелиоцитов. В целом, такая двумерная модель удобна для изучения физиологии ГЭБ, взаимодействия эндотелия и глии. Главным недостатком ее является статичность, отсутствие сил, имитирующих ток крови в сосудах. Эту

проблему призваны решать динамические модели, воспроизводящие комплекс химических и физических взаимодействий, характерных для условий in vivo.

Динамические модели

В естественных условиях эндотелиальные клетки постоянно подвержены давлению потока, тангенциальной силе, создаваемой потоком крови при ее движении вдоль апикальной поверхности мембраны клеток. Влияние этого фактора на эндотелиальные клетки осуществляется на структурном и функциональном уровнях и включает такие важные процессы, как: ориентация клеток по направлению движения потока, индукция или супрессия ряда генов [181, 93], синтез вазоактивных веществ, улучшение клеточной адгезии и ограничение митоза [12, 106], изменение клеточного метаболизма [105]. Церебральные эндотелиоциты, культивируемые в условиях турбулентного потока характеризуются большим количеством микрофиламентов, наличием эндоцитозных пузырьков и клатриновых кавеол [12], на генетическом уровне увеличивается синтез глюкозоаминогликанов, экспрессия белков плотных контактов. Таким образом, биомеханические силы, генерируемые током крови вносят значительный вклад в формирование свойств ГЭБ и для их реализации in vitro разработаны достаточно элегантные технические решения.

Динамические модели ГЭБ воспроизводят практически физиологические условия культивирования эндотелиальных клеток и астроцитов в капиляроподобных структурах, которые функционально и анатомически воссоздают церебральные микрососуды (рис.6). Искусственные капилляры представляют собой покрытые пронектином полые полипропиленовые волокна диаметром всего 600 мкм и с радиусом пор 0, 64 мкм. Они соединены с резервуаром, в котором находится ростовая среда посредством проницаемой для газов трубки. Автоматически контролируемый насос создает пульсирующий ток среды через капилляры со скоростью от 1 до 50 мл/мин, что соответствует давлению сдвига 1-5 мкН/см . Характер волнового движения среды, затухающего по ходу движения в полной мере воспроизводит гемодинамические условия in vivo. В таких условиях эндотелиальные клетки полностью сохраняют свою морфологию, следствием чего являются высокие значения трансэндотелиального сопротивления (до 1200 Ом* см ) и значения проницаемости лекарственных препаратов, близкие к in vivo [38].

Astrocyte w/enfoot

Endothelium

Cross section o( lumen

DIV-BBB Cartridge

DIV-BBB System

Рисунок 6. - Конструкция динамической модели ГЭБ [38]

В значительной степени масштабность использования динамических моделей ГЭБ сдерживают особенности их конструкции, требующие больше технических навыков и времени для подготовки данной системы к работе. Кроме того, изучение кинетики распределения веществ внутри искусственных капилляр осложняется пульсирующим током среды. Однако, несмотря на эти ограничения, описано успешное применение динамических моделей в области молекулярных [112], фармакологических [130, 148, 157], морфологических, функциональных исследований [161, 92, 116].

Метод компьютерного моделирования

Преодоление ГЭБ для ЦНС препаратов определяет эффективность их действия как терапевтических средств, в то время как периферически действующие препараты должны быть абсолютно недоступны для мозга во избежание побочных эффектов. Методы, основывающиеся на компьютерном моделировании, позволяют осуществлять быстрый и недорогой анализ (скрининг) химически различных веществ в аспекте их проницаемости через ГЭБ в масштабах огромных библиотек, содержащих десятки тысяч соединений. Трансцеллюлярная пассивная диффузия и/или опосредованный переносчиками транспорт - два пути, посредством которых осуществляется доставка терапевтических агентов в мозг [50]. Определение успешности достижения забарьерного пространства этими веществами с применением метода компьютерного моделирования основывается на их физикохимических параметрах (растворимости, липофильности, молекулярной массе, водородсвязывающей способности и заряде) и подчиняется правилу Липински. Согласно

этому положению, известному также как правило 5, низкая проницаемость ожидается у веществ с более 5 водород-донорными связями, 10 водород - акцепторными связями, логарифмом распределения соединения между мозгом и кровью, превышающим 5 и молекулярным весом выше 500 Да [107]. Данный подход на стадии разработки лекарственного препарата позволяет проанализировать базы данных разных классов химических веществ для выбора необходимой структуры будущего вещества с определением активности его функциональных групп. Учитывая масштабность подобных исследований и их стоимость, на данном этапе возможно применение искусственных моделей, представляющих собой две несмешивающиеся фазы: воду и органический неполярный растворитель, между которыми оценивается распределение молекул тестируемого препарата. В качестве гидрофобного слоя чаще выступает октанол, обладающий амфифильными характеристиками, близкими к таковым у фосфолипидов, образующих клеточную мембрану [102]. Признанная научным сообществом, эта система широко используется в разработке лекарственных препаратов для ЦНС и в оценке токсичности при систематическом введении в мозг. Однако неизменность, стационарность данной модели не соответствует динамичности мембраны клетки при взаимодействии с растворами различных веществ. Кроме того, отсутствует сродство к белкам плазмы, систем активного выброса, рецепторов и транспортеров.

В последние годы особенно популярным стал метод измерения проницаемости через параллельные искусственные мембраны (parallel artificial membrane permeability assay PAMPA), предложенный впервые в 1998 году Kansy и коллегами. Анализ проводится с помощью конструкции, напоминающий «сандвич» по принципу построения: в 96-луночный планшет опускается 96-луночный фильтр, толщина мембраны которого составляет 125 мкм. Фильтр покрывается 2% раствором любого липида в органическом растворителе, что дает возможность варьировать состав такой биомембраны [90]. Это, пожалуй, один из наиболее простых и коммерчески доступных способов оценки пассивной проницаемости. Однако данные коэффициента распределения, получаемые при использовании этого подхода, существенно не отличаются от результатов использования системы октанол-вода, что в значительной мере лимитирует независимое от других методов использование PAMPA на стадиях поиска лекарственного препарата [60].

Проведение дальнейших этапов в процессе разработки терапевтического препарата требует использование клеточных моделей как инструмента, наиболее точно отражающего ситуацию in vivo.

Типология эндотелиальных клеток

Источник получения эндотелиальных клеток - основной параметр выбора, задающий направление исследования, определяющий ожидаемые результаты и обуславливающий определенную конструкцию моделей ГЭБ.

Наиболее распространенными являются первичные культуры эндотелиальных клеток из мозга млекопитающих: грызунов, вследствие доступности материала, возможности использования трансгенных животных (мыши), наличия целого спектра антител и хорошо охарактеризованной генетической карты. Однако крупный рогатый скот - самый популярный источник клеток среди исследователей, несмотря на менее изученный молекулярно-биохимический профиль. Это объяснимо, прежде всего, количеством выделяемых клеток: 200 миллионов из мозга быка и 1 миллион из мозга крысы, что гарантирует однородность культуры, (как следствие меньший разброс данных), сокращение времени и стоимости на проведение манипуляций по получению первичной культуры. По понятным этическим причинам использование человеческого мозга в качестве ресурса церебральных эндотелиоцитов крайне ограниченно и сводится к материалу, получаемому в ходе биопсии [24], который не вполне правильно считать здоровой тканью.

Сложная процедура получения эндотелиальных клеток из микрососудов и что более важно, короткий жизненный цикл клеток с сохранением их барьерных характеристик, послужили началом создания и развития нескольких клеточных линий. Одна из наиболее известных и широко применяемых в практике линий RBE4 получена трансфекцией крысиных церебральных эндотелиоцитов плазмидой, содержащей El А ген аденовируса [142]. Было показано, что клетки линии RBE4 сохраняют многие свойства ГЭБ: активность гамма-глютамил транспептидазы и щелочной фосфатазы [142], экспрессию P-gp [137], что обусловило использование линии в изучении сигнальных каскадов [56, 158, 194], регуляции транспортера обратного выброса [132, 193], клеточной миграции [13], измерении проницаемости [126]. Идентичными характеристиками обладает и другая линия церебральных эндотелиоциотов крысы GP8, иммортализованная с помощью онкогенного большого Т-антигена SV40 [128]. Повторная трансфекция этой линии плазмидой со вставкой гена устойчивости к пуромицину [137] привела к созданию линии GPNT с высоким уровнем экспрессии Р-гликопротеина. Коммерчески доступной и практически значимой в изучении сигналинга [100] и проницаемости [169, 125] является линия мыши b-end 3-5.

Наибольшую ценность результатов представляют линии человеческого происхождения, наиболее изученная из них SV-HCEC в аспекте фенотипа ГЭБ. Эта линия использовалась в ряде работ по изучению адгезивных свойств клеток и транспорта

30

глютатиона, но не показала желаемой воспроизводимости результатов и высоких значений трансэндотелиального сопротивления (TEER: 40 Ом*сш2). Недавно была создана новая линия, трансформированная Т-антигеном вируса SV-40, клетки которой экспрессируют окклюдин, клаудин-5, некоторые транспортеры захвата и обратного выброса [149].

Благодаря генетическим изменениям иммортализованные линии приобретают способность к неограниченному росту даже после достижения монослоя в культуре, вследствие чего барьерный фенотип формируется не в полной степени. Поэтому желательно валидация данных, полученных с помощью искусственных линий с результатами in vivo или с моделями, использующими первичные культуры.

В аспекте функционального подхода к изучению ГЭБ существует большое количество публикаций с использованием различных типов эпителиальных и эндотелиальных клеток нецеребрального происхождения. Линия MDCK, полученная из почки собаки, обладает показателями сопротивления и проницаемости, которые коррелируют со значениями церебральных эндотелиоцитов. Однако структура плотных контактов эпителиальных клеток принципиально отличается от эндотелиальных, что выражается в преимущественной экспрессии клаудина-1 вместо клаудина-5, наличием белка ZO-3, который не экспрессируется в эндотелии. Наиболее доступный ресурс эндотелиальных клеток - большая вена пуповины человека. Этот источник, занимающий промежуточное положение между крупными сосудами (аортой) и микроваскулярными, обладает рядом преимуществ, к которым можно отнести: простоту выделения первичной культуры, широкий спектр выбора антител, специфически взаимодействующих с антигенными детерминантами, презентированными на клетках. Несмотря на отсутствие многих свойств, характерных для барьерного фенотипа, эндотелиальные клетки пуповинного происхождения - подходящая модель для изучения архитектуры и формирования межклеточных контактов [97].

Влияние экзогенных факторов

Скорость роста клеток, их дифференцировка во многом определяется средой культивирования, главный компонент которой - сыворотка, полученная из крови животных. Известно, что фибронектин, ростовые факторы, гормоны и белки внеклеточного матрикса содержатся в сывортке и влияют на жизненный цикл клеток. В исследованиях, проведенных группой авторов под руководством Chang [34], было показано, что результатом воздействия сыворотки на ретинальные эпителиальные клетки является нарушение целостности формирования плотных контактов, снижение сопротивления. Полученная с помощью матрично-активированной лазерной десорбции

31

MALDI 67 кДа фракция сыворотки, оказывающая влияние на трансэндотелиальное сопротивление [123], была идентифицированная как матриксная металлопротеиназа второго типа. Митогенный эффект сыворотки во многом зависит от источника ее получения и от происхождения культуры клеток, которые подвергаются её воздействию. Так сыворотка теленка и быка вызывает снижение сопротивления в культуре эндотелиальных клеток из микрососудов свиньи, в то время как лошадиная и человеческая сыворотки не изменяют этот показатель.

Действие глюкокортикоидов считается признанным фактором, повышающим барьерные свойства эндотелиальных клеток в аспекте трансэндотелиального сопротивления и проницаемости [85, 191]. Ростовая среда, обогащенная добавлением стероидов, снижает общий уровень продукции матриксных металлопротеиназ, которые вызывают деградацию экстраклеточных матриксных белков и как следствие, приводят к уменьшению адгезивных контактов между клетками и субстратом. В опытах in vitro показана способность гормонов замедлять ангиогенный процесс путем ингибирования продукции VEGF и простагландинов [110]. Эффект действия глюкокортикоидов осуществляется посредством их рецептора, связывающегося со специфической последовательностью на 5-концевом участке ДНК гена-мишени, вызывая его транскрипцию [19]. Таким образом, гормоны осуществляют регуляторную функцию экспрессии ряда белков.

Параметры оценки барьерного фенотипа эндотелиальных клеток

К серьезным патологическим заболеваниям приводит повышение проницаемости ГЭБ вследствие нарушений в структуре экстраклеточного матрикса плазматической мембраны [141, 134]. Негативно заряженный гликокаликс, взаимодействуя с белками матрикса и рецепторами интегринов, запускает сигнальные каскады, влияющие на экспрессию белков плотных контактов [171]. Было показано, что при обработке фактором некроза опухоли (TNF-a) монослоя эндотелия, культивированного на фибронектине, наблюдается повышение проницаемости наряду с утратой фибронектина из экстраклеточного матрикса [184]. Воспалительный цитокин индуцирует экспрессию 96-кДа матриксной металлопротеиназы, что вызывает разрушение межклеточных контактов, их перегруппировку, изменения в экспрессии адгезивных белков, матриксных рецепторов, протеолитическую деградацию экстраклеточного матрикса. В этой связи представляется особенно важным интеграция эндотелиальных клеток и глии в нейроваскулярную единицу, функциональный элемент, осуществляющий динамическую регуляцию состава гликокаликса. тем самым обеспечивая нормальный рост и развитие клеток.

Разнообразие существующих моделей ГЭБ требует адекватной оценки воспроизводимости характеристик барьера in vitro. Признанными критериями при анализе полноценности развития плотных контактов является трансэндотелиальное сопротивление (TEER) и проницаемость для гидрофильных веществ (сахароза). Наиболее популярный метод измерения сопротивления производится с применением полупроницаемых мембран, разделяющих культуральный планшет на два отдела: апикальный (верхний), которым является поверхность фильтра и базолатеральный (нижний) - дно пластикового планшета. Как только эндотелиальные клетки, растущие на полупроницаемом фильтре, сформировали монослой, проводят измерение сопротивления с помощью коммерчески доступных электродов. Уровень значений транэндотелиального сопротивления in vivo от 2 до 8 кОм*см2 [19] не может воспроизвести ни одна модель барьера, но хорошим

л

результатом считаются показатели в несколько сотен Ом*см . В лаборатории Audus and Borchardt [67, 8] на первичной культуре эндотелиальных клеток из микрососудов быка получены значения 160-200 Ом*см2, при совместном культивировании с астроцитами сопротивление возрастает до 800 Ом*см [33], добавление гидрокортизона в бессывороточную среду х линии эндотелиальных клеток из мозга свиньи приводит к данным в 600-1000 Ом «см2 [73]. Другой метод измерения сопротивления основывается на полном анализе импеданса между клеткой и субстратом ECIS, (electrical cell substrate impedance sensing). Эндотелиальные клетки культивируются на поверхности электрода и сопротивление определяется скачком напряжения между рабочим электродом и вспомогательным. Монослой клеток с низкой межклеточной проницаемостью характеризуется значением в 10000 Ом [68]. Однако использование такого метода возможно только в монокультурах.

Наряду с измерением электрического сопротивления необходимо оценить проницаемость монослоя эндотелия для веществ с известной молекулярной массой. Флуоресцеин натрия (М=376 Да) и декстран, меченный FITC - наиболее используемые трейсеры. Относительная проницаемость рассчитывается после измерения концентрации вещества с меткой, прошедшего через монослой клеток и учитывает площадь активной поверхности (монослоя) и временной интервал. Значения проницаемости в степени 10"6 см/сек для флуоресцеина натрия свидетельствует о качественности построения модели барьера.

Заключение

При разработке стратегии доставки лекарственных средств в мозг необходимо принимать во внимание не только их связывание со специфическим рецептором для вовлечения в процессы функционирования нервной системы, но и прохождение таких

33

агентов через ГЭБ как ключевой фактор терапии. Многие лекарственные кандидаты не могут применяться для лечения заболеваний ЦНС вследствие их низкой концентрации в мозге даже при введении максимально допустимых терапевтических доз. На стадиях предклинических испытаний потенциальных лекарственных препаратов веществ, обладающих терапевтическим эффектом, проводится многоэтапный скрининг большого количества веществ, важной стадией которого является определение проницаемости через барьер. Ценным инструментом в этом анализе служат модели ГЭБ in vitro, которые позволяют минимизировать эксперименты in vitro с животными, сократить сроки и стоимость исследований.

В церебральном эндотелии, формирующем гематоэнцефалический барьер, ключевым морфофункциональным элементом, определяющим барьерные, транспортные и сигнальные функции являются межклеточные плотные контакты (tight junctions), образованные трансмембранными и цитоплазматическими белками. Синтез этих белков, формирование и поддержание функции плотных контактов напрямую зависит от микроокружения церебрального эндотелия. Непосредственный контакт церебрального эндотелия с отростками астроцитарной глии in vivo лег в основу представления о том, что главным стимулирующим фактором в процессе построения барьерного фенотипа эндотелиальными клетками являются астроциты. Доказательством тому служат опыты по имплантации культивированных астроцитов в области с изначально проницаемым эндотелием, в результате чего в этих участках сосудов плотность белков межклеточных контактов повышалась [71, 84].

Изучение ГЭБ с позиции чисто анатомической перешло в категорию исследования физиологии и функциональной активности этой структуры, во многом благодаря эффективности работы, выполненной in vivo. Однако развитие представлений о ГЭБ на клеточном и молекулярном уровне требовало определенной изолированности объектов исследования от множества факторов, оказывающих влияние in vivo. Таким образом, сформировалось целое направление в экспериментальной методологии с появлением новых процедур получения первичных культур клеток, условий их культивирования, технических приемов для мониторинга функций барьера.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Волгина, Надежда Евгеньевна

Выводы

1. Последовательное применение гомогенизации препарата интимы пупочной вены человека, ферментативной диссоциации гомогената и фракционирования клеточной суспензии дает возможность получить культуру эндотелиоцитов, характеризующуюся поглощением ацетилированного протеина низкой плотности и визуализируемую антителами к фактору фон Виллебранта.

Последовательное применение гомогенизации ткани мозга плода человека, ферментативной диссоциации гомогената и фракционирования клеточной суспензии позволяет получить культуру астроцитов, характеризующуюся высоким уровнем экспрессии GFAP.

2. Ко-инкубирование препарата культуры эндотелиоцитов человека с астроцитами человека в системе для совместного культивирования клеток Trans Well в течение 7-10 дней позволяет получить культуру эндотелиоцитов, характеризующуюся специфическими свойствами эндотелиоцитов гематоэнцефалического барьера, проявляющимися в повышении параметров трансэндотелиального сопротивления, снижении диффузной проницаемости, а также интенсификации экспрессии белков плотных межклеточных контактов.

3. Количественный иммуноблоттинг лизата эндотелиальных клеток после 7-10 суточного сокультивирования их с клеточным препаратом культуры астроцитов человека позволяет достоверно детектировать повышение уровня экспрессии белков плотных контактов: ZO-1 на 50±3%, окклюдина на 44,4±5,2%, клаудина-5 на 70,6±8,4% по сравнению с эндотелиоцитами небарьерного фенотипа.

Количественный анализ параметров трансэндотелиального сопротивления и проницаемости монослоя эндотелиоцитов после ко-культивирования в системе Trans Well в течение 7-10 дней дает возможность детектировать достоверное увеличение резистентности на 41,5±2,9 % по сравнению с культурой эндотелиоцитов не барьерного фенотипа. При этом проницаемость монослоя эндотелиоцитов для натрий флуоресцеина достоверно снижается на 36±3,1%.

4. Уровень экспрессии генов белков плотных контактов коррелирует с результатами иммуноблоттинга и свидетельствует о повышении синтеза белков при совместном культивировании эндотелиальных клеток и человеческих астроцитов: для окклюдина в 3,3±0,4 раз, для клаудина - 5 в 7,4±0,3 раз и ZO-1 в 1,3±0,1 раза по сравнению с монокультурой HUVEC.

Количество мРНК белков адгезивных контактов (VE-кадгерина и Р-катенина), определенное методом ОТ-ПЦР, не зависит от условий культивирования эндотелиальных клеток, а определяется степенью конфлюентности монослоя.

5. Воздействие биологически активных медиаторов воспаления - брадикинина, тромбина и гистамина на монослой эндотелиоцитов после ко-культивирования с астроцитами человека в системе Trans Well в течение 7-10 дней в меньшей степени (15,2±1,5% для тромбина, 17,8±1,6 для гистамина, 5,8±0,8 для брадикинина) снижает трансэндотелиальное сопротивление и экспрессию белков адгезивных контактов - VE-кадгерина, р-катенина по сравнению с монослоем эндотелиоцитов небарьерного фенотипа.

6. Количественный анализ коэффициентов проницаемости монослоя эндотелиоцитов после ко-культивирования с астроцитами человека в системе Trans Well для фармакологических препаратов с различными трансбарьерными эффлюксными характеристиками: верапамила, домперидона, карбамазепина, атенолола и феназона, позволил обосновать возможность применения подобной системы для количественного анализа проницаемости широкого спектра веществ методом пассивного транспорта.

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю Владимиру Павловичу Чехонину за стратегическое планирования работы, неоценимые советы на каждом этапе развития направления, Ольге И. Гуриной за практическое руководство и помощь на протяжении всей работы, Владимиру П. Баклаушеву за помощь в освоении иммунохимических методов. Отдельно отметить вклад Надежды Ф. Гриненко в осуществлении практической части работы и высокий уровень обучения культуральным методам, Филиппа А. Кошкина за проведение молекулярных методов исследования, Анатолия Б. Левинского за помощь в оценке концентрации анализируемых препаратов, Клавдии Павловне Ионовой и сотрудникам вивария за помощь в работе с животными.

Заключение

При разработке стратегии доставки лекарственных средств в мозг необходимо принимать во внимание не только их связывание со специфическим рецептором для вовлечения в процессы функционирования нервной системы, но и прохождение таких

33 агентов через ГЭБ как ключевой фактор терапии. Многие лекарственные кандидаты не могут применяться для лечения заболеваний ЦНС вследствие их низкой концентрации в мозге даже при введении максимально допустимых терапевтических доз. На стадиях предклинических испытаний потенциальных лекарственных препаратов веществ, обладающих терапевтическим эффектом, проводится многоэтапный скрининг большого количества веществ, важной стадией которого является определение проницаемости через барьер. Ценным инструментом в этом анализе служат модели ГЭБ in vitro, которые позволяют минимизировать эксперименты in vitro с животными, сократить сроки и стоимость исследований.

В церебральном эндотелии, формирующем гематоэнцефалический барьер, ключевым морфофункциональным элементом, определяющим барьерные, транспортные и сигнальные функции являются межклеточные плотные контакты (tight junctions), образованные трансмембранными и цитоплазматическими белками. Синтез этих белков, формирование и поддержание функции плотных контактов напрямую зависит от микроокружения церебрального эндотелия. Непосредственный контакт церебрального эндотелия с отростками астроцитарной глии in vivo лег в основу представления о том, что главным стимулирующим фактором в процессе построения барьерного фенотипа эндотелиальными клетками являются астроциты. Доказательством тому служат опыты по имплантации культивированных астроцитов в области с изначально проницаемым эндотелием, в результате чего в этих участках сосудов плотность белков межклеточных контактов повышалась [71, 84].

Изучение ГЭБ с позиции чисто анатомической перешло в категорию исследования физиологии и функциональной активности этой структуры, во многом благодаря эффективности работы, выполненной in vivo. Однако развитие представлений о ГЭБ на клеточном и молекулярном уровне требовало определенной изолированности объектов исследования от множества факторов, оказывающих влияние in vivo. Таким образом, сформировалось целое направление в экспериментальной методологии с появлением новых процедур получения первичных культур клеток, условий их культивирования, технических приемов для мониторинга функций барьера.

Глава II. Материалы и методы исследования

Получение первичной культуры HUVEC

Для получения первичных культур эндотелиоцитов из вены пуповины человека использовали модификацию методики, описанной Eric A.Jaffe [40] .

Биологический материал получали из акушерской клиники в соответствии с этическими нормами, с согласия рожениц. Полость вены промывали DPBS (Invitrogen) до полного удаления крови, заполняли 0,2% раствором коллагеназы в DPBS и подвергали ферментативной диссоциации. Пуповину переносили в стакан с DPBS, содержащим 0,9тМ СаС12, 0,493 тМ MgCl2, 5,56 тМ глюкозу, 0,327 шМ пируват натрия и инкубировали при 37°С 20 минут. После инкубации раствор коллагеназы, содержащий клетки собирали в пробирку 50 мл; оставшуюся коллагеназу собирали перфузией вены 20 мл среды 199 (Invitrogen). К собранному элюату добавляли среду 199 с 10% эмбриональной сыворотки теленка (FBS) и центрифугировали 10 минут при 250 g. Супернатант удаляли, осадок клеток суспендировали в DMEM/F12 (Invitrogen), содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2тМ L-глютамина, 20 ng/мл bFGF (Sigma), 120 мкг/мл гепарина, ростовую добавку для роста эндотелиальных клеток больших сосудов - LSGS (Invitrogen), 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Клетки культивировали в культуральных пластиковых флаконах, 25 см2 (Corning-Costar) при 37°С во влажной атмосфере с 5% СОг. Культуры пассировали с использованием раствора трипсин (0,02%) -ЭДТА (0,01%). Чистоту культур оценивали по типичной для эндотелиальных клеток морфологии (cobblestone) с помощью фазово -контрастной микроскопии, экспрессии антигена вон Виллебрандта (fvW) и захвату липопротеина Dil-Ac-LDL.

Выделение астроцитов из неонатального мозга

Работа выполнялась на абортивном материале, все операции вплоть до ферментативной диссоциации проводились на холоду в стерильных условиях с использованием среды и буфера, содержащих антибиотик.

Применяли адаптированную нами методику, описанную David Weinstein [ 182].

Осторожным скольжением закрытых ножниц вдоль черепа производили скальпирование, освобождались от кожных покровов. При максимальном угловом наклоне лезвий ножниц разрезали череп по обеим сторонам от его основания до венечного шва, достигнув положения которого, производили поперечный разрез, избавляясь тем самым от переднего отдела мозга. Далее отделяли мозжечок от прилежащих затылочных долей полушарий головного мозга и переносили его в чистую чашку Петри с небольшим количеством буфера PBS с добавлением глюкозы. Удаление мозговых оболочек

35 производили под контролем стереомикроскопа Leica, эта процедура снижает вероятность контаминации фибробластами, поэтому важно было избавиться от несущих капилляры мембран. Дважды промывали мозжечок буфером PBS с глюкозой в новой чашке Петри и далее добавляли раствор трипсина - ДНКазы в объёме необходимом, чтобы покрыть весь мозжечок (6 мл), переносили стерильно запечатанную чашку в термокамеру на 3 мин с температурой 37°С. После инкубации с ферментами отмывали двухкратно буфером, вновь добавляли раствор ДНК-азы и осторожно суспендировали ткань. По мере того, как суспензия становилась более гомогенной, отделяли супернатант от осадка. Для этого производили 10 циклов суспендирования - неполного осаждения, надосадок переносили в 50 мл флакон (Corning) и ещё раз повторяли процедуру. Собранный таким образом гомогенат проводили через фильтр 20 мкм (Fisher) и собирали клеточную суспензию в. 15 мл флакон (Corning), после чего осуществляли фракционирование в течение 1 мин на 150g с соблюдением теплового режима 4°С. Для разделения на градиенте плотности Перкола ресуспендировали полученный осадок в растворе ДНК-азы с PBS, обогащенном добавлением глюкозы и MgSC>4 (соотношение 1:1) и осторожно наносили на сформированный градиент, центрифугировали 10 мин на 150g и 4°С. Обогащенная астроцитами фракция мигрирует в 30% градиент Перколла и оказывается верхним слоем в флаконе. Прогретым на огне концом пастеровской пипетки отбирали фракцию астроцитов, клетки которой вследствие адгезии друг к другу представляли единую взвесь и отделялись от прилежащего слоя нейрональных клеток. Перенесенная в свежий флакон 15 мл суспензия астроцитов доводилась до верхнего объема PBS с глюкозой и центрифугировалась при 150 g в течении 10 минут. Осадок ресуспендировали в среде DMEM/F12 (Invitrogen) с добавлением 2 % FBS (Invitrogen), производили подсчет клеток в камере Горяева с применением трипанового синего и высаживали клетки на покрытый поли-Ь-лизином культуральный флакон 25 см2 в количестве 5-Ю4 клеток/мл. Помещали в инкубатор в условия влажной атмосферой воздуха и температуры 37С.

Для избавления культуры астроцитов от нейронов проводили дополнительный этап очистки. Спустя 3 часа после процедуры выделения герметично закрытый культуральный флакон помещали на платформу с возратно-поступательным движением 200 rpm Открепившиеся клетки наблюдали с помощю фазово-контрастной микроскопии и затем отмывали средой DMEM/F12 , после чего свежая культуральная среда добавлялась в флакон. Клетки культивировали в среде DMEM/F12 с 10% FBS, пенициллином (100 ед/мл) и стрептомицином (100 мкг/мл). Через каждые пять пассажей проверяли экспрессию глиофибриллярного кислого белка (GFAP) и нестина.

Прописи спользованных в ходе процедуры реактивов сведены в таблицу 1.

Реагент Пропись состава Режим хранения

Раствор ДНКазы 7,5 мг ДНКазы (Worthington) в DMEM/F12 -20°С

Раствор трипсина - ДНКазы 50 мг трипсина (TRL, trypsin, Worthington), 5 мг ДНКазы (DP, DNase, Worthington) в 15 мл PBS/глюкозы, с содержанием 5 мг/мл MgS04 и добавлением 90 мкл NaOH. -20°С

Буфер PBS с добавлением глюкозы 900 мл lxPBS без Са2+ Mg2+, 2 г глюкозы, рН до 7,4 1М НС1 и добавляли дистиллированную деонизированную воду до 1 л. +4°С

Изоперколл 90 мл Перколла (Pharma Biotech), 10 мл 10х PBS +4°С

Перколл 30 % 30 мл изоперколла, 60 мл PBS с глюкозой +4°С

Перколл 60 % 60 мл изоперколла, 30 мл PBS с глюкозой +4°С

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Волгина, Надежда Евгеньевна, 2013 год

Список литературы

1. Abott N., Dolman D.E., Drndarski S., Fredriksson S. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes // Methods Mol Biol. 2012. Vol.814. P. 415-430.

2. Aird W. Endothelial cell heterogeneity // Cold Spring Harb Perspect Med. 2012. Vol.2(l) doi: 10.1101/cshperspect.a006429.

3. Alavijeh M., Chishty M., Qaiser M.Z., Palme A. Drug metabolism and pharmacokinetics, the blood-brain barrier, and central nervous system drug discovery // NeuroRx. 2005. №4. P.554 -571.

4. Anderson J., Stevenson B., Jesaitis L. Characterization of ZO-1, a protein component of the tight junction from mouse liver and Madin-Darby canine kidney cells // J Cell Biol. 1988. Vol.106 . P.l 141-1149.

5. Angst B., Marcozzi C., Magee A. The Cadherin superfamily: diversity in form and function //J. Cell Sei. 2001. Vol. 114. P. 629-641.

6. Antonetti D., Barber A., Khin S. Vascular permeability in experimental diabetes is associated with reduced endothelial occludin content: vascular endothelial growth factor decreases occludin in retinal endothelial cells // Diabetes. 1998. Vol.47(12). P. 1953-1959.

7. Atkins B.G., Mukesh K. J., Hamik A. Vascular cell lineage determination and differentiation. Endothelial differentiation. Molecular mechanism of specification and heterogeneity // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2011. Vol. 31. P. 1476 - 1484.

8. Audus K., Rose J., Wang W., Borchardt R. Brain microvessel endothelia cell culture systems. In " Introduction to the bloodbrain barrier: methodology, biology and pathology" Pardridge WM (Ed). Cambridge, UK: Cambridge University Press .1998 . P.86-93.

9. Aurrand-Lions M., Duncan L., Ballestrem C. et al. JAM-2, a novel immunoglobulin superfamily molecule, expressed by endothelial and lymphatic cells // J Biol Chem . 2001. Vol. 276. P.2733-2741.

10. Balda M., Garret M., Matter K. The ZOl-assotiated Y-box factor ZONAB regulates epithelial cell proliferation and cell density // J Cell Biol. 2003. Vol.160. P. 423-432.

11. Balda M., Matter K. The tight junction protein ZO-1 and an interacting transcription factor regulate ErbB-2 expression //EMBO J. 2000. Vol.l9(9). P.2024-2033.

12. Ballermann B., Ott M. Adhesion and differentiation of endothelial cells by exposure to chronic shear stress: a vascular graft model // Blood Purif. 1998. Vol.13. P. 125-134.

13. Barakat S., Turcotte S., Demeule M. et al.Regulation of brain endothelial cells migration and angiogenesis by P-glycoprotein/caveolin-1 interaction // Biochem Biophys Res Commun. 2008. Vol.372. P. 440^146.

14. Barber A., Lieth E. Agrin accumulates in the brain microvascular basal lamina during development of the blood-brain barrier // Dev Dyn. 1997. N1. P. 62 - 74.

15. Barton E., Forrest J., Connolly J. et al. Junction adhesion molecule is a receptor for reovirus // Cell. 2001. Vol.104. P. 441—451.

16. Bauer B., Hartz A., Fricker G., Miller D. Modulation of p-glycoprotein transport function at the blood-brain barrier // Exp. Biol. Med. 2005. Vol. 230. P. 118-127.

17. Bazzoni G., Dejana E. Endothelial cell-to-cell junctions: molecular organization and role in vascular homeostasis // Physiol Rev. 2004. Vol.84. P. 869-901.

18. Bazzoni G., Martinez-Estrada O., Mueller F. et al. Homophilic interaction of junctional adhesion molecule // J Biol Chem. 2000 . Vol. 275. P. 30970-30976.

19. Beato M. Gene regulation by steroid hormones // Cell. 1989. N3. P.335- 344.

20. Beckers C. and oth. Nuclear targeting of P-catenin and pl20ctn during thrombin induced endothelial barrier disfunction // Cardiovasc Res. 2008. Vol.79. P. 679 - 688.

21. Begley D. J., Bradbury M. W., Kreuter J. The blood-brain barrier and drug delivery to CNS. - NewYork: Marcel Dekker Inc., 2000.

22. Behrens J. Functional interaction of beta-catenin with the transcription factor LEF-1 // Nature. 1996. Vol.382. P. 638 - 642.

23. Berezowski V., Landry C., Lundquist S. et al. Transport screening of drug cocktails through an in vitro blood-brain barrier: is it a good strategy for increasing the throughput of the discovery pipeline? // Pharm. Res. 2004. Vol. 21. P. 756-760.

24. Bernas M. et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier // Nat Protoc. N7. 2010. P.1265- 1272.

25. Beyer E. Gap junctions // Int.Rev.Cytol. 1993. Vol. 137. P. 1-37.

26. Boswell C., Majno G., Joris I., Ostrom K. Acute endothelial cell contraction in vitro: a comparison with vascular smooth muscle cells and fibroblasts // Microvasc Res. 1992. Vol.43(2). P.178-191.

27. Burnette N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A //Analytical biochemistry. 1981. Vol. 112. P. 195-203.

28. Butt A., Jones H., Abbott N. Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study // J Physiol (Lond). 1990. Vol.429. P.47- 62.

29. Carmeliet P. et al. Targeted deficiency or cytosolic truncation of the VE-cadherin gene in mice impairs VEGF-mediated endothelial survival and angiogenesis // Cell. Vol.98. P. 147157.

30. Cattelino A. et all. The conditional inactivation of the beta-catenin gene in endothelial cells causes a defective vascular pattern and increased vascular fragility // J. of Cell Biol. 2003. Vol. 162. P. 1111-1122.

31. Cavallaro U., Cristofori G. Cell adhesion and signaling by cadherins and Ig-CAMs in cancer. // Nat Rev Cancer. 2004. Vol.4. P. 118-132.

32. Ceballos G., Rubio R. Coculture of astroglial and vascular endothelial cells as apposing layers enhances the transcellular transport of hypoxanthine // J Neurochem. 1995. Vol.64(3). P.991-999.

33. Cecchelli R., Dehouck B., Descamps L.et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier // Adv Drug Deliv Rev. 1999. Vol. 36. P. 165-178.

34. Chang C., Wang X, Caldwell R. Serum opens tight junctions and reduces ZO-1 protein in retinal epithelial cells // J Neurochem. 1997. N2. P.859 - 867.

35. Chen Y., Lu Q., Schneeberger E., Goodenough D. Restoration of tight junction structure and barrier function by down-regulation of the mitogenactivated protein kinase pathway in ras-transformed Madin-Darby canine kidney cells // Mol Biol Cell. 2000 . Vol.11(3). P.849-862.

36. Coats S., et al. Ligand-specific control of src-suppressed C kinase substrate gene expression // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. Vol.297. P. 1112-1120.

37. Crosby et al. VE-cadherin is not required for the formation of nascent blood vessels but acts to prevent their disassembley // Blood. 2005. Vol.105. P.2771-2776.

38. Cucullo L., McAllister M., Kight K. et al. A new dynamic in vitromodel for the multidimensional study of astrocyte-endothelial cell interactions at the blood-brain barrier // Brain Res. 2002. Vol. 951. P.243-254.

39. Cummins P. M. Occludin: one Protein, many forms // Mol and Cell Biol. 2012. Vol.32. P. 242-250.

40. Davis J., Crampton S., Hughes C. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC). // J. Vis. Exp. 2007. (3), el83, DOI: 10.3791/183.

41. Davson H., Oldendorf W.H. Transport in central nervous system // Proc. Royal Soc. Med. 1967. Vol.60. P. 326-328.

42. De Boer A., Van der Sandt I., Gaillard The role of drug transporters at the blood-brain barrier // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2000. Vol. 43. P. 629-656.

43. Dean M., Hamon Y., Chimini G. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.// J Lipid Res - 2001 - Vol. 42. - P. 1007-1017.

44. Dehouck M., Meresse S., Delorme P. et al. An easier, reproducible and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro // J. Neurochem. 1990. Vol.54. P. 17981801.

45. Del Maschio A., De Luigi A., Martin-Padura I., et al. Leukocyte recruitment in the cerebrospinal fluid of mice with experimental meningitis is inhibited by an antibody to Junctional Adhesion Molecule (JAM). //J Exp Med. 1999. Vol.190. P. 1351-1356.

46. Demeule M. et al. Drug transport to the brain: key roles for the efflux pump P-glycoprotein in the blood-brain barrier // Vase Pharmacol. 2002. Vol.38. P. 339 - 348.

47. Desai S., Marroni M., Cucullo L. Mechanisms of endothelial survival under shear stress // Endothelium. 2002. Vol.9. P. 89-102.

48. Dohgu S. et al. Brain pericytes contribute to the induction and up-regulation of blood-brain barrier functions through transforming growth factor-beta production // Brain Res. 2005. N2. P. 208-215.

49. Dwyer D., Vannucci S., Simpson I. Expression, regulation, and functional role of glucose transporters (GLUTs) in brain // Int Rev Neurobiol. 2002. Vol.51. P. 159-88.

50. Ecker G., Noe C. In silico prediction models for blood-brain barrier permeation // Curr Med Chem. 2004. N11. P. 1617- 1628.

51. El Hafny B., Bourre J., Roux F. Synergistic stimulation of gamma-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities by retinoic acid and astroglial factors in immortalized rat brain microvessel endothelial cells // J.Cell Physiol. 1996. N3. P. 451-460.

52. Engelhardt B. Development of the blood-brain barrier // Cell and tissue research. 2003. Vol. 314(1). P. 119-129.

53. Esser S., Lampugnani M., Corada M., Dejana E., Risau W. Vascular endothelial growth factor induces VE-cadherin tyrosine phosphorylation in endothelial cells // J Cell Sei. 1998. Vol. 111. P.1853-1865.

54. Essler M., Staddon J., Weber PC. Aepfelbacher M. Cyclic AMP blocks bacterial lipopolysaccharide-induced myosin light chain phosphorylation in endothelial cells through inhibition of Rho/Rho kinase signaling // J Immunol. 2000. Vol. 164(12). P.6543-6549.

55. Estrada C., Bready J., Berliner J., et al. Astrocyte growth stimulation by a soluble factor produced by cerebral endothelial cells in vitro // Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 1990. Vol.49(6). P.539.

56. Fabian G., Szabo C. Expression of G-protein subtypes in cultured cerebral endothelial cells // Neurochem Int. 1998. N2. P. 179 - 185.

57. Ferguson J. E., Rusty W. K., Patterson C. Mechanisms of endothelial differentiation in embryonic vasculogenesis // Arterioscler Thromb Vase Biol. Vol. 25. P.2246 - 2254.

58. Frey A., Meckelein B., Weiler-Güttler H. et al. Pericytes of the brain microvasculature express gamma-glutamyl transpeptidase // Eur J Biochem. 1991. Vol.202(2). P.421-429.

59. Furuse M., Hirase T., Itoh M. et al. Occludin: a novel integral membrane protein localizing at tight junctions // Journal of Cell Biology. 1993. Vol. 123(6). P. 1777-1788.

91

60. Galinis-Luciani D., Nguyen L., Yazdanian M. Is PAMPA a useful tool for discovery? // J. Pharm. Sei. 2007. Vol.11. P.2886-2892.

61. Galliard P. et al. Astrocytes increase the functional expression of P-glycoprotein in an in vitro model of blood-brain barrier // Pharm Res. 2000. Vol. 17(10). P. 1198 - 1205.

62. Garberg P., Ball M., Borg N. et al. In vitro models for the blood-brain barrier // Toxicology in vitro. 2005. Vol. 19(3). P. 299-334.

63. Gory-Faure S. et al. Role of vascular-endothelial-cadherin in vascular morphogenesis // Development. 1999. Vol.126. P.2093-2102.

64. Grant G., Abbott N., Janigro D. Understanding the physiology ofthe blood-brain barrier: in vitro models //News Physiol. Sei. 1998. Vol. 13. P. 287-293.

65. Greenwood J., Pryce G., Devine L. et al. SV40 large T immortalized cell lines of the rat blood-brain and blood-retinal barriers retain their phenotypic and immunological characteristics // J Neuroimmunol. 1996. Vol. 71. P.51-63.

66. Gumbiner B.M. Signal transduction of beta-catenin // Curr Opin Cell Biol. 1995. Vol.7. P. 634 - 640.

67. Gumbleton M., Audus K. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier // J Pharm Sei. 2001. Vol.90. P.1681-1698.

68. Hartmann C., Zozulya A., Wegener J., Galla H. The impact of glia-derived extracellular matrices on the barrier function of cerebral endothelial cells: an in vitro study // Exp Cell Res. 2007. N7. P. 1318 - 1328.

69. Haseloff R.F. et al. In search of the astrocytic factor(s) modulating blood-brain barrier functions in brain capillary endothelial cells in vitro // Cell Mol Neurobiol. 2005. Vol.25. P. 25-39.

70. Hawkins R., O'Kane R., Simpson I., Vina J. Structure of the blood-brain barrier and its role in the transport of amino acids // J. Nutr. 2006. Vol.136. P.218-226.

71. Hayashi Y.et al. Induction of various blood-brain barrier properties in non-neural endothelial cells by close apposition to co-cultured astrocytes // Glia. 1997. Vol.19. P. 13-26.

72. Hirase T., Staddon J., Saitou M. et al. Occludin as a possible determinant of tight junction permeability in endothelial cells//J Cell Sei. 1997. Vol.110. P. 1603-1613.

73. Hoheisel D., Nitz T., Franke H., et al. Hydrocortisone reinforces the blood-brain properties in a serum free cell culture system // Biochem Biophys Res Commun.1998. Vol.247. P.312-315.

74. Hori S., Ohtsuki S., Hosoya K., Nakashima E., Terasaki T. Pericyte-derived angiopoietin-1 multimeric complex induces occludin gene expression in brain capillary endothelial cells through Tie-2 activation in vitro // J Neurochem. 2007. Vol.89. P.503-513.

92

75. Huber J., Egleton R., Davis T. Molecular physiology and pathophysiology of tight junctions in the blood-brain barrier // Trends Neurosci. 2001. Vol.24. P.719-725.

76. Hurl stone A., Clevers H. T-cell factors :turn-ons and turn-offs // EMBO J. 2002. Vol.21. P.2303-2311.

77. Hurwitz A., Berman J., Rashbaum W., Lyman W. Human fetal astrocytes induce the expression of blood-brain barrier specific proteins by autologous endothelial cells // Brain Res. 1993. Vol.625(2). P.238-43.

78. Igarashi Y. et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier // Biochem. Biophys.Res. Commun. 1999. Vol. 261. P.108-112.

79. Itoh M., Morita K., Tsukita S. Characterization of ZO-2 as a MAGUK family member associated with tight as well as adherens junctions with a binding affinity to occludin and alpha catenin // J Biol Chem. 1999. Vol. 274. P.5981-5986.

80. Itoh M., Nagafuchi A., Yonemura S. et al. The 220-kD protein colocalizing with cadherins in non-epithelial cells is identical to ZO-1, a tight junction-associated protein in epithelial cells: cDNA cloning and immunoelectron microscopy // J Cell Biol. 1993. Vol. 121. P. 491-502.

81. Iwahana M., Utoguchi N., Mayumi T., Goryo M., Okada K. Drug resistance and P-glycoprotein expression in endothelial cells of newly formed capillaries induced by tumors // Anticancer Res. 1998. Vol.18. P. 2977-2980.

82. Izumi Y., Hirose T., Tamai Y. et al. An atypical PKC directly associates and colocalizes at the epithelial tight junction with ASIP, a mammalian homologue of Caenorhabditis elegans polarity protein PAR-3 // J Cell Biol. 1998. Vol.l43(l). P.95-106.

83. Jaffa A., Miller B., Rosenzweig S. Bradykinin induces tubulin phosphorylation and nuclear translocation of MAP kinase in mesangial cells // Am J Physiol. 1997 . Vol. 273(6 Pt 2).

P.916-924.

84. Janzer R., Raff M. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells // Letters to Nature. 1987. Vol. 325. P. 253-257.

85. Jarden J., Dhawan V., Moeller J. The time course of steroid action on blood-to-brain and blood-to-tumor transport of 82Rb: a positron emission tomographic study // Ann Neurol. 1989. N3.P. 239-245.

86. Jolliet P. et al. Evidence of lowest brain penetration of an antiemetic drug, metopimazine compared to domperidone, metoclopramide and chlorpromazine using an in vitro model of the blood-brain barrier // Pharmacological Research. 2007. Vol. 56. P. 11-17.

87. Joo F., Karnushina I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain // Cytobios. 1973. Vol. 8(29). P. 41-48.

88. Jou T., Nelson W. Effects of regulated expression of mutant RhoA and Racl small GTPases on the development of epithelial (MDCK) cell polarity // J Cell Biol. 1998. Vol.l42(l).

P.85-100.

89. Kallmann B. et al. Characteristic gene expression profile of primary human cerebral endothelial cells // FASEB J. 2002. Vol. 16(6). P. 589-591.

90. Kansy M., Senner F., Gubernator K. Physicochemical high throughput screening: parallel artificial membrane permeation assay in the description of passive absorption processes // J. Med. Chem. 1998.Vol.7. P. 1007-1010.

91. Kovbasnjuk O., Szmulowicz U., Spring K. Regulation of the MDCK cell tight junction // J Membr Biol. 1998. Vol.l61(l). P.93-104.

92. Krizanac-Bengez L., Kapural M., Parkinson F. et al. Effects of transient loss of shear stress on blood-brain barrier endothelium: role of nitric oxide and IL-6 // Brain Res. 2003. Vol. 977. P.239-246.

93. Krizanac-Bengez L., Mayberg M., Janigro D. The cerebral vasculature as a therapeutic target for neurological disorders and the role of shear stress in vascular homeostasis and pathophysiology // Neurol. Res. 2004. Vol. 26. P.846-853.

94. Krum J.M., Kenyon K.L., Rosenstein J.M. Expression of blood-brain barrier characteristics following neuronal loss and astroglial damage after administration of anti-Thy-1 immunotoxin // Exp.Neurol. 1997. Vol.146. P.33 -45.

95. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 227(5259). P. 680-685.

96. Lampugnani M.G. et al. Contact inhibition of VEGF-induced proliferation requires vascular endothelial cadherin, beta-catenin, and the phosphatase DEP-1/CD148 // J Cell Biol. 2003. Vol.161. P. 793-804.

97. Langford D., Hurford R., Hashimoto M. et al.Signalling crosstalk in FGF2-mediated protection of endothelial cells from HIV-gpl20 // BMC Neurosci. 2005. Vol 6. P.8.

98. Laterra J. Guerin C., Goldstein G. Astrocytes induce neural microvascular endothelial cells to form capillary-like structures in vitro // J Cell Physiol. 1990. N2. P. 204 - 215.

99. Lee G., Dallas S., Hong M., Bendayan R. Drug transporters I central nervous system: brain barriers and brain parenchyma considerations // Pharmacol Rev. 2001.Vol. 53. N4. P.569 -596.

100. Lee H., Chang Y., Tu Y., Huang C. CREB activation mediates VEGF-A's protection of neurons and cerebral vascular endothelial cells // J Neurochem .2010. Vol. 113. P.79-91.

101. Lee S. et al. SSeCKS regulates angiogenesis and tight junction formation in blood-brain barrier // Nat Med. 2003. N7. P. 900-906.

102. Leo A., Hansch C., Elkins D. Partition coefficients and their uses // Chem. Rev. 1979. Vol.71 (6). P. 525-616.

103. Liang T., Demarco R., Mrsny R. et al. Characterization of huJAM: evidence for involvement in cell-cell contact and tight junction regulation // Am J Physiol Cell Physiol. 2000. Vol. 279. P. 1733-1743.

104. Liaw C., Cannon C., Power M., et al. Identification and cloning of two species of cadherins in bovine endothelial cells // EMBO. 1990. Vol.9. P. 2701-2708.

105. LiedtkeW. Et al. GFAP is necessary for the integrity of CNS white matter architecture and long-term maintenance of myelination // Neuron. 1996. Vol.17. P. 607 - 615

106. Lin K., Hsu P., Chen B., Yuan S. Molecular mechanism of endothelial growth arrest by laminar shear stress // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol.97. P.9385-9389.

107. Lipinski C., Lombardo F., Dominy B., Feeney P. Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings // Adv. Drug Delivery Rev. 1997. Vol.23. P.3-25.

108. Liu Y., Nusrat A., Schnell F., et al. Human junction adhesion molecule regulates tight junction resealing in epithelia // J Cell Sci. 2000. Vol.113. P.2363-2374.

109. Livak J., Thomas D. Analysis of relative gene expression data using Real-Time Quantitative PCR and the 22DDCT method // Methods. 2001. Vol. 25. P.402^108.

110. Logie J. Glucocorticoid-mediated inhibition of angiogenesis changes in human endothelial cells is not caused by reductions in cell proliferation or migration // PLoS ONE 5(12): el4476. doi:10.1371/journal.pone.0014476

111. Mann G., Yudilevich D., Sobrevia L. Regulation of amino acid and glucose transport in endothelial and smooth muscle cells // Physiol. Rev. 2003. Vol.83. P. 183-252.

112. Marroni M., Marchi N., Cucullo L. et al. Vascular and parenchymal mechanisms in multiple drug resistances lesson from human epilepsy // Curr. Drug Target. 2003. Vol. 4. P. 297-304.

113. Martin-Padura I., Lostaglio S., Schneemann M. et al. Junctional adhesion molecule, a novel member of the immunoglobulin superfamily that distributes at intercellular junctions and modulates monocyte transmigration // J Cell Biol. 1998. Vol.l42(l). P.117-127.

114. Matthew A., Owens G. Epigenetic control of smooth muscle cell differentiation and phenotypic switching in vascular development and disease // Annu Rev Physiol. 2012. Vol.74. P. 13-40.

115. Maxwell K., Berliner J.A, Cancilla P.A. Induction of gamma-glutamyl transpeptidase in cultured cerebral endothelial cells by a product released by astrocytes // Brain Res. 1987. Vol. 2. P. 310-314.

116. McAllister M., Krizanac-Bengez L., Macchia F. et al. Mechanisms of glucose transport at the blood-brain barrier: an in vitro study // Brain Res. 2001. Vol.904. P.20-30.

117. Meyer S., Hoppner W., Seitz H. Transcriptional and post-transcriptional effects of glucose on liver phosphoenolpyruvate-carboxykinase gene expression // Eur J Biochem. 1991. Vol.202(3). P.985-991.

118. Mi H., Haeberle H., Barres B. Induction of astrocyte differentiation by endothelial cells //J. Neurosci. 2001. Vol. 21. P. 1538-1547.

119. Mitic L. Anderson J. Molecular architecture of tight junctions // Annu Rev Physiol. 1998. Vol. 60. P.121-142.

molecular characterization and role in drug disposition / You G., Morris M. (Eds). New Jersey.

2007. P. 223 - 262.

120. Morita K., Furuse M., Fujimoto K., Tsukita S. Claudin multigene family encoding four-transmenbrane domain protein components of tight junction strands // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. Vol.96. P.511-516.

121. Nag S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. In: "The blood-brain barrier" Nag S. (Eds) - Humana Press. Inc., 2003.

122. Nitta T., Hata M., Gotoh S. et al. Size-selective loosening of the blood-brain barrier in claudin-5-deficient mice.// J Cell Biol - 2003 - Vol.161- P.653-660.

123. Nitz T, Eisenblatter T, Psathaki K, Galla H.Serum-derived factors weaken the barrier properties of cultured porcine brain capillary endothelial cells in vitro. // Brain Res. 2003. Vol.981. P.30.

124. O'Donnell M., Martinez A., Sun D. Cerebral microvascular endothelial cell Na-K-Cl cotransport: Regulation by astrocyte-conditioned medium // Am J Physiol. 1995. Vol. 268. P.747-754.

125. Omidi Y., Campbell L., Barar J. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies // Brain Res. 2003. Vol. 990. P. 95-112.

126. Pan W., Yu Y., Cain C. et al.Permeation of growth hormone across the blood-brain barrier // Endocrinology. 2005. Vol. 146. P.4898^t904.

127. Pardridge W. Blood-brain barrier biology and methodology // Journal of neurovirology. 1999. Vol.5(6). P. 556-569.

128. Pardridge W. M. Why is the global CNS pharmaceutical market so under-penetrated? // Drug Discov. Today. 2002. N1. P. 5-7.

129. Pardridge W. Non-invasive drug delivery to the human brain using endogenous blood-brain barrier transport systems. // Pharm Sci Technol Today. 1999. Vol. 2. P.49-59.

130. Parkinson F., Friesen J., Krizanac-Bengez L., Janigro D. Use of a three-dimensional in vitro model of the rat blood-brain barrier to assay nucleoside efflux from brain // Brain Res. 2003. Vol.980. P.233-241.

131. Pekny M. Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAP-deficient mice // Glia. 1998. N22. P. 390 - 400.

132. Pilorget A., Demeule M., Barakat S. Modulation of P-glycoprotein function by sphingosine kinase-1 in brain endothelial cells // J Neurochem. 2007. Vol.100. P. 1203-1210.

133. Rajasekaran A., Hojo M., Huima T., et al. Catenins and zonula occludens-1 form a complex during early stages in the assembly of tight junctions // J Cell Biol. 1996. Vol.132. P. 451-463.

134. Rascher G., Fischmann A., Kroger S.Extracellular matrix and the blood-brain barrier in glioblastoma multiforme: spatial segregation of tenascin and agrin // Acta Neuropathol (Berl). 2002. Vol. 104. P.85-91.

135. Redzic Z. Molecular biology of the blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: similarities and differences // Fluods barrier CNS. 2011. Vol. 8(1). doi:10.1186/2045-8118-8-3.

136. Regina A. et al. Factor(s) released by glucosedeprived astrocytes enhance glucose transporter expression and activity in rat brain endothelial cells // Biochim. Biophys. Acta. 2001. Vol.1540. P.233-242.

137. Regina A., Koman A., Piciotti M. Mrpl multidrug resistance-associated protein and P-glycoprotein expression in rat brain microvessel endothelial cells // J Neurochem . 1998. Vol.71. P.705-715.

138. Renart J., Reiser J., Stark J.R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specifity and antigen structure // Proc Natl Acad Sci USA. 1979. Vol. 76. P. 3116 - 3120.

139. Ribatti D., Nico B., Crivellato E., Artico M. Development of the blood-brain barrier: A historical point of view // The Anatomical Record Part B: The New Anatomist. 2006. Vol. 289(1). P. 3-8.

140. Risau W., Hallmann R., Albrecht U., Henke-Fahle S. Brain induces the expression of an early cell surface marker for blood-brain barrier-specific endothelium // EMBO J. 1986. Vol.5(12). P.3179-83.

141. Rosenberg G., Estrada E., Kelley R., Kornfeld M. Bacterial collagenase disrupts extracellular matrix and opens blood-brain barrier in rat // Neurosci Lett. 1993. Vol. 160. P. 117-119.

142. Roux F. et al. Regulation of g-glutamyl transpeptidase and alkaline phosphatase activities in immortalized rat brain microvessel endothelial cells // J Cell Physiol. 1994. Vol.159. P. 101-113.

143. Rubin L., Hall D., Porter S. et al. A cell culture model of the blood-brain barrier // Journal of Cell Biology. 1991. Vol.115(6). P. 1725-1735.

144. Rubin L., Staddon J., The cell biology of the blood-brain barrier // Annual review of neuroscience. 1999. Vol. 22(1). P. 11-28.

145. Rudini N. And oth.VE-cadherin is a critical endothelial regulator of TGF-ß signaling // EMBO J. 2008. Vol.27. P. 993 - 1004.

146. Saitou M., Furuse M., Sasaki H. et al. Complex phenotype of mice lacking occludin, a component of tight junction strands // Mol Biol Cell. 2000. Vol.11. P.4131^142.

147. Sakakibara A., Furuse M., Saitou M. et al. Possible involvement of phosphorylation of occludin in tight junction formation // J Cell Biol. 1997. 137(6). P.1393-1401.

148. Salvetti F., Cecchetti P., Janigro D. Insulin permeability across an in vitro dynamic model of endothelium // Pharm. Res. 2002. Vol.19. 445^50.

149. Sano Y., Shimizu F., Abe M. et al. Establishment of a new conditionally immortalized human brain microvascular endothelial cell line retaining an in vivo blood-brain barrier function. // J Cell Physiol. 2010. Vol.225. P. 519-528.

150. Schaeffer R., Gong F., Bitrick M., Smith T. Thrombin and bradykinin initiate discrete endothelial solute permeability mechanisms // Am J Physiol. 1993. Vol.264(6 Pt 2). P. 17981809.

151. Schor A., Canfield A., Sloan P., Schor S. Differentiation of pericytes in culture is accompanied by changes in the extracellular matrix // In vitro Cell Dev Biol. 1991. N8. P. 651 -659.

152. Seulberger H., Lottspeich F., Risau W. The inducible blood—brain barrier specific molecule HT7 is a novel immunoglobulin-like cell surface glycoprotein // EMBO J. 1990. Vol.9(7). P.2151-2158.

153. Sharom J. Multidrug resistance protein: P-glycoprotein. in drug transporters:

154. Siliciano J., Goodenough D. Localization of the tight junction protein, ZO-1, is modulated by extracellular calcium and cell-cell contact in Madin-Darby canine kidney epithelial cells // J Cell Biol. 1988. Vol.107. P. 2389-2399.

155. Simpson I., Carruthers A., Vannucci S. Supply and demand in cerebral energy metabolism: the role of nutrient transporters // J. Cereb Blood Flow Metab. 2007. Vol.27. P.1766-1791.

156. Sims D. The pericyte - a review//Tissue Cell. 1986. Vol. 18. P. 153-174.

157. Sinclair C., Krizanac-Bengez L., Stanness K. et al. Adenosine permeation of a dynamic in vitro blood-brain barrier inhibited by dipyridamole // Brain Res. 2001. Vol. 898. P.122-125.

158. Smith J., Drewes L. Modulation of monocarboxylic acid transporter-1 kinetic function by the cAMP signaling pathway in rat brain endothelial cells // J Bio Chem. 2006. N4. P.2056 -2060.

159. Sobue K. et al. Induction of bloodbrain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. //Neurosci Res. 1999. Vol. 35. P.155-164.

160. Sobue K., Yamamoto N., Yoneda K. et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors // Neuroscience research. 1999. Vol. 35(2). P.155-164.

161. Stanness K., Guatteo E., Janigro D. A dynamic model of the bloodbrain barrier in vitro // Neurotoxicology. 1996. Vol. 17. P. 481-496.

162. Stevenson B., Begg D. Concentration-dependent effects of cytochalasin D on tight junctions and actin filaments in MDCK epithelial cells // J Cell Sci. 1994. Vol.l07(Pt 3). P.367-375.

163. Stevenson B., Keon B. The tight junction: morphology to molecules. // Annu Rev Cell Dev Biol. 1998. Vol. 14. P. 89-109.

164. Stevenson B., Siciliano J., Mooseker M., Goodenough D. Identification of ZO-1: a high molecular weight polypeptide associated with the tight junction (zonula occludens) in a variety of epithelia // J Cell Biol. 1986. Vol.103. P.755-766.

165. Stewart P. Development of the blood-brain barrier. In: «Morphogenesis of Endothelium», W. Risau, G. Rubanyi (Eds). Amsterdam: Harwood Academic- 2000 - P. 109-122.

166. Stuart R., Nigam S. Regulated assembly of tight junctions by protein kinase C // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. Vol.92(13). P. 6072-6076.

167. Sundberg C., Kowanetz M., Brown L., Detmar M., Dvorak H. Stable expression of angiopoietin-1 and other markers by cultured pericytes: phenotypic similarities to a subpopulation of cells in maturing vessels during later stages of angiogenesis in vivo // Lab Invest. 2002. N4. P. 387-401.

168. Taddei A. and oth. Endothelial adherns junctions control tight junctions by VE-cadherin-mediated upregulation of claudin -5 // Nature cell biology. 2008. Vol. 10. P. 923 - 934.

169. Tan K., Dobbie M., Felix R. et al.A comparison of the induction of immortalized endothelial cell impermeability by astrocytes // Neuroreport. 2001. Vol. 12. P. 1329-1334.

170. Tao-Cheng et al. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia //J Neurosci. 1987. N10- P. 293 -299.

171. Tilling T., Engelbertz C., Decker S. Expression and adhesive properties of basement membrane proteins in cerebral capillary endothelial cell cultures // Cell Tissue Res. 2002. Vol.310. P.19-29.

172. Tio S., Deenen M., Marani E. Astrocyte-mediated induction of alkaline phosphatase activity in human umbilical cord vein endothelium: an in vitro model // Eur.J.Morphol. 1990 Vol.28 (2-4). P. 289-300.

173. Tontsch U., Bauer H. Glial cells and neurons induce blood-brain barrier related enzymes in cultured cerebral endothelial cells // Brain Res. 1991. Vol.539(2). P.247-53.

174. Trizma E. et al. A mechanosensory complex that mediates the endothelial cells response to fluid shear stress // Nuture. 2005. Vol. 437. P.426-431.

175. Tsukamoto T., Nigam S. Role of tyrosine phosphorylation in the reassembly of occludin and other tight junction proteins. // Am J Physiol. 1999. Vol. 276(5 Pt2). P.737-750.

176. Tsukita S., Furuse M. Overcoming barriers in the study of tight junction functions: from occludin to claudin // Genes Cells. 1998. Vol.3(9). P.569-573.

177. Turksen K., Troy T. - C. Barriers built on claudins // J of Cell Sci. 2004. Vol. 117. P. 2435 - 2447.

178. Wan C., Jackson J., Pirmoradi F., Chiao M., Burt H. Increased accumulation and retention of micellar paclitaxel in drug-sensitive and P-glycoprotein-expressing cell lines following ultrasound exposure // Ultrasound Med Biol. 2012. Vol. 38. P.736-744.

179. Wang Y., Zhang J., Yi X., Yu F. Activation of ERK1/2 MAP kinase pathwayinduces tight junction disruption in human corneal epithelial cells // Exp Eye Res. 2004. Vol.78(1). P.125-136.

180. Warth A., Kroger S., Wolburg H. Redistribution of aquaporin-4 in human glioblastoma correlates with loss of agrin immunoreactivity from brain capillary basal laminae // Acta Neuropathol. 2004. N4. P. 311-318.

181. Wasserman S., Topper J. Adaptation of the endothelium to fluid flow: in vitro analyses of gene expression and in vivo implications // Vase. Med. 2004. Vol.9. P.35-45.

182. Weinstein D. Isolation and purification of primary rodent astrocytes // Curr Protocol in Neuroscience. 1997. P.351-359.

183. Wells W., Bonetta L. Endothelial tight junctions form the blood-brain barrier // J.Cell Biol. 2005. Vol.l69(3). P. 378-379.

184. Wheatley E., Vincent P., McKeown Longo P., Saba T. Effect of fibronectin on permeability of normal and TNF-treated lung endothelial cell monolayers. // Am J Physiol. 1993. N1. P.90 -96.

185. Wijsman J., Shivers R. Immortalized mouse brain endothelial cells are ultrastructurally similar to endothelial cells and respond to astrocyte-conditioned medium. // In Vitro Cell Dev Biol Anim. 1998. Vol.34. P.777-784.

186. Williams E., Williams G., Howell F. et al. Identification of an N-cadherin motif that can interact with the fibroblast growth factor receptor and is required for axonal growth // J. Biol Chem. 2001. Vol.276. P. 43879^3886.

187. Willott E., Balda M., Heintzelman M., et al. Localization and differential expression of two isoforms of the tight junction protein ZO-1 // Am J Physiol Cell Physiol. 1992. Vol.262 P. 1119-1124.

188. Wolburg H. et al. Brain endothelial cells and the glio-vascular complex // Cell Tissue Res. 2009. Vol. 335(1). P. 75-96.

189. Wolburg H., Lippoldt A. Tight junctions of the blood-brain barrier: development, composition and regulation. // Vase Pharmacol. 2002. Vol.38. P.323-337.

190. Wong V. Phosphorylation of occludin correlates with occludin localization and function at the tight junction. // Am J Physiol. 1997. Vol.273(6 Pt 1). P. 1859-1867.

191. Yamada K., Ushio Y., Hayakawa T. et al. Effects of methylprednisolone on peritumoral brain edema. A quantitative autoradiographic study // J Neuroserg. 1983. N4. P.612 - 619.

192. Yan M., Matouk C., Marsden P. Epigenetics of the vascular endothelium // J Appl Physiol. 2010. Vol. 109(3). P.916-26.

193. Yu C., Kastin A., Tu H. TNF activates P-glycoprotein in cerebral microvascular endothelial cells // Cell Physiol Biochem. 2007. Vol. 20. P.853-858.

194. Zhang Y., Wu X., He Y. Melanocortin potentiates leptin-induced STAT3 signaling via MAPK pathway // J Neurochem. 2009. Vol. 110. P.390-399.

195. Zhurinsky J., Shtutman M., Ben-Ze'ev A. Plakoglobin and beta-catenin: protein interactions, regulation and biological roles // J Cell Sei. 2000. Vol.113. P. 3127 - 3139.

196. Ziegler T., Nerem R. Effect of flow on the process of endothelial cell division. // Arterioscler. Thromb.1999. Vol. 14. P. 636-643.