Механизмы регенеративных эффектов пегилированной гиалуронидазы при хроническом гепатите тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат медицинских наук Маркова, Туяна Сергеевна

• Маркова, Туяна Сергеевна
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Маркова, Туяна Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гепатопротекторы: классификация, механизмы действия, 13 эффективность (краткая характеристика)

1.2. Современные представления о функциях и закономерностях 18 жизнедеятельности стволовых клеток

1.2.1. Общая характеристика стволовых клеток

1.2.2. Стволовые клетки печени

1.2.3. Мезенхимальные стволовые клетки

1.3. Фармакологическая стратегия регенеративной медицины

1.4. Гиалуроновая кислота: биологическая роль и метаболизм

1.5. Фармакологические свойства гиалуронидазы и регуляция 50 функций прогениторных клеток с ее помощью

1.6. Нанотехнология электронно-лучевого синтеза

1.7. Заключение 62 ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 64 ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение специфической гепатопротекторной активности 81 пегилированной гиалуронидазы

3.1.1. Исследование влияния курсового введения тетрахлоруглерода 81 на морфофункциональное состояние печени

3.1.1.1. Общие изменения состояния экспериментальных животных и 81 печени

3.1.1.2. Ферментативная активность сыворотки крови

3.1.1.3. Морфологические изменения печени

3.1.2. Изучение влияния пегилированной гиалуронидазы на

морфофункциональное состояние печени после курсового введения тетрахлоруглерода

3.1.2.1. Общие изменения состояния экспериментальных животных и 84 печени

3.1.2.2. Ферментативная активность сыворотки крови

3.1.2.3. Морфологические изменения печени 85 3.2. Изучение механизмов гепатопротекторного действия

пегилированной гиалуронидазы

3.2.1. Изменение состояния различных пулов прогениторных клеток 86 при хроническом токсическом гепатите

3.2.1.1. Содержание КОЕ-Ф и МСК в костном мозге

3.2.1.2. Содержание КОЕ-Ф и МСК в периферической крови

3.2.1.3. Содержание регионарных паренхиматозных (КОЕ-Печ) 87 клеток-предшественников в печени

3.2.2. Изменение секреторной функции клеток микроокружения 87 тканей при хроническом токсическом гепатите

3.2.2.1. Продукция ростовых факторов, активных в отношении 87 тканеспецифичных регионарных СК, клетками печени

3.2.2.2. Продукция суммы факторов хоминга клетками 87 микроокружения костного мозга и печеночной ткани

3.2.2.3. Продукция БОР-1 -фактора клетками микроокружения 88 костного мозга и печеночной ткани

3.2.3. Влияние пегилированной гиалуронидазы на состояние пула 89 стволовых клеток в условиях хронического гепатита

3.2.3.1. Содержание КОЕ-Ф и МСК в костном мозге

3.2.3.2. Содержание КОЕ-Ф и МСК в периферической крови

3.2.3.3. Содержание регионарных паренхиматозных (КОЕ-Печ) 90 клеток-предшественников в печени

3.2.4. Влияние пегилированной гиалуронидазы на секреторную

функцию клеток микроокружения тканей при хроническом токсическом гепатите

3.2.4.1. Продукция ростовых факторов, активных в отношении 90 тканеспецифичных регионарных СК, клетками печени

3.2.4.2. Продукция суммы факторов хоминга клетками 90 микроокружения костного мозга и печеночной ткани

3.2.4.3. Продукция 8БГ-1-фактора клетками микроокружения 91 костного мозга и печеночной ткани

3.2.5. Изучение влияния Пэг-ГД на восприимчивость прогениторных

клеток к регуляторным стимулам 3.3. Влияние пегилированной гиалуронидазы на систему крови при 93 моделировании хронического токсического гепатита

3.3.1. Изменения системы крови при хроническом токсическом 93 гепатите

3.3.1.1. Картина периферической крови

3.3.1.2. Картина костномозгового кроветворения

3.3.1.3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников

3.3.2. Влияние пегилированной гиалуронидазы на систему крови при 95 хроническом гепатите

3.3.2.1. Картина периферической крови

3.3.2.2. Картина костномозгового кроветворения

3.3.2.3. Состояние пула кроветворных клеток-предшественников 96 ГЛАВА 4 ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 13

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АлАТ - аланинаминотрансфераза

АсАТ - аспартатаминотрансфераза

ГАГ - гликозаминогликаны

ГД - гиалуронидаза

ГК - гиалуроновая кислота

ГСК - гемопоэтическая стволовая клетка

ГИМ - гемопоэзиндуцирующее микроокружение

Г-КСФ - гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГМ-КСФ - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий

фактор

ИЛ - интерлейкин

иПСК - индуцированная плюрипотентная стволовая клетка

КОЕ-ГМ - колониеобразующая единица гранулоцитарно-макрофагальная

КОЕ-Э - колониеобразующая единица эритроидная

КОЕ-Ф - колониеобразующая единица фибробластная

КОЕ-Печ - колониеобразующая единица печени

КСА - колониестимулирующая активность

МСК - мезенхимальная стволовая клетка

ОК — овальная клетка

ОКК - общее количество миелокариоцитов

ОКЛ - общее количество лейкоцитов

ПЭГ - полиэтиленгликоль

Пэг-ГД - пегилированная гиалуронидаза

СК - стволовая клетка

СФМ - сумма факторов миграции

ТХУ - тетрахлоруглерод

ФРФ - фактор роста фибробластов-1-основной ФСК - фактор стволовой клетки

XT - хронический гепатит

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЭСК - эмбриональная стволовая клетка

CD - кластер дифференцировки

EGF - (epidermal growth factor) эпидермальный фактор роста

FGF - (fibroblast growth factor) фактор роста фибробластов

HGF - (hepatocyte growth factor) фактор роста гепатоцитов

LIF - (leukemia inhibitory factor) фактор, ингибирующий лейкемию

МАРС - (multipotent adult progenitor cells) мультипотентные клетки-

предшественники взрослых

NGF - (nerve growth factor) фактор роста нервов

NO - оксид азота

РН-20 - тестикулярная гиалуронидаза

SCF - (stem cells factor) фактор стволовой клетки

SDF-la - (stromal derived factor-la) стромальный фактор la

TGF- a,(3 - (transforming growth factor-a,|3) трансформирующий фактор роста a,P

TNF-a - (tumor necrosis factor) фактор некроза опухоли а

VCAM-1 - (vascular cell adhesion molecule-1) сосудистая молекула клеточной адгезии-1

VEGF - (vascular endothelial growth factor) фактор роста эндотелия сосудов VSEL - (very small embryonic-like) эмбрионально-подобные малые стволовые клетки

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы регенеративных эффектов пегилированной гиалуронидазы при хроническом гепатите»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Хронический гепатит представляет собой тяжелое распространенное заболевание печени, при котором недостаточная способность органа к регенерации зачастую приводит к замещению функционирующей паренхимы соединительной тканью, нарушению его структурной организации и развитию цирроза печени [Маянский Д.Н., Зубахин A.A., 1998; Павлов Ч.С., 2007; Глушенков Д.В., Павлов Ч.С., Маевская М.В., Ивашкин В.Т., 2008; Абдурахманов Д.Т., 2010]. Фармакологическое действие существующих гепатопротекторных лекарственных средств направлено преимущественно на защиту, либо стимуляцию сохранившихся клеточных элементов печени [Венгеровский А.И., Саратиков A.C., 1988; Венгеровский А.И., Батурина Н.О., Чучалин B.C. и др., 1996; Белобородова Э.И., Венгеровский А.И., Лившиц И.К. и др., 2009; Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Богомолов П.О. и др., 2012; Удут В.В., Венгеровский А.И., Коршунов Д.А., Каркищенко H.H., 2012]. Однако данная концепция фармакологического вмешательства в ряде случаев оказывается несостоятельной. Зачастую не удается, не только восстановить морфофункциональное состояние органа, но и предупредить прогредиентный характер течения патологического процесса [Байматов В.Н., 1998; Лучшев В.И., Санин Б.И., Жаров С.Н., 2004; Блюм Х.Е., 2005; Крель П.Е., Цинзерлинг О. Д., 2009]. Низкая эффективность существующих гепатопротекторных средств определяет необходимость разработки принципиально новых патогенетически обоснованных методов терапии патологических состояний печени.

Полученные в последние годы сведения о свойствах и закономерностях жизнедеятельности мультипотентных клеток-предшественников открыли возможность развития нового направления в лечении многих заболеваний - с помощью клеточной терапии [Сухих Г.Т., Малайцев В.В., И.М. Богданова и др., 2002; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2006; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; Liu M., Han Z.C., 2008; Williams A.R., Hare J.M., 2011]. При этом

наиболее физиологичным подходом к решению задач регенеративной медицины является фармакологическая стимуляция эндогенных стволовых клеток (CK) [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2006; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов ВВ. и др., 2009а; Epstein O.I., Zyuz'kov G.N., Sotnikova N.V. et al., 2005; Zyuz'kov G.N., Gur'yantseva L.A., Simanina E.V. et al.., 2007; Dygai A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V. et al., 2011]. Ранее в ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН в экспериментах in vitro и in vivo была показана возможность модификации функций прогениторных клеток различных классов с помощью нативной гиалуронидазы [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др., 2007а; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2009а]. Основной мишенью данного фермента является гиалуроновая кислота (ГК), представляющая собой наиболее распространенный гликозаминогликан в организме, связывающий in situ посредством специфических рецепторов (CD44, RHAMM) клетки-предшественники различных классов [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003; Nedvetzki S., Gonen E., Assayag N. et al., 2004; Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S. et al., 2004; Zhu H., Mitsuhashi N., Klein A. et al., 2006]. В определенных условиях гиалуронидаза способна расщеплять ГК межклеточного матрикса до полимеров, активирующих процессы клеточного деления и дифференцировки, а также вызывать усиление индуцируемого внешними факторами выхода CK в кровь [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2007, 2008; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; 2012; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003].

Учитывая вышесказанное, весьма перспективным представляется разработка оригинального подхода управления регенераторным потенциалом тканей за счет модификации свойств ГК с помощью гиалуронидазы. Вместе с тем значительное количество ингибиторов данного фермента в организме [Максименко А. В., Щечилина Ю. В., Тищенко Е. Г., 2001; Пушкарь Д.Ю., Зайцев A.B., Сегал A.C., 2006; LeBoeuf R.D., Raja R.H., Fuller G.M., Weigel P.H., 1986; Afify A.M., Stern M., Guntenhöner M., Stern R., 1993] предопределяет

возможность стимуляции родоначальных клеток с помощью его введения in vivo лишь в дозах существенно превышающих терапевтически допустимые [Волкова М.А., 1998; Козлов В .А., Сенников C.B., 2004; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Б., 2009; Anderson J.А., 1992], что делает невозможным создание на основе нативной гиалуронидазы безопасного средства для регенеративной медицины.

В то же время существует нанотехнология электронно-лучевого синтеза [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2010, 2011, 2012; Vereschagin E.I., Khan D.H., Troitsky A.W. et al., 2001], позволяющая получать конъюгаты биологически активных веществ с низкомолекулярными носителями - иммобилизированные лекарственные средства, которые в отличие от своих нативных аналогов белковой природы оказываются практически неиммуногенными и нетоксичными. Указанные свойства при этом определяются «перекрытием» молекулами носителя (в качестве которого наиболее предпочтительным является использование полиэтиленгликоля (ПЭГ)) антигенных детерминант белков, что делает их практически невидимыми для элементов системы иммунного надзора [Delgado С., Francis G.E., Fisher D., 1992; Avgoustakis К., 2004; Maullu С., Raimondo D., Caboi F. et al., 2009; Huang Z., Ni C., Chu Y., Wang S. et al., 2009]. Более того, данные конструкции оказываются еще в значительной степени защищенными от протеолитических ферментов, что определяет возможность их эффективного перорального использования, представляющего собой наиболее комплаентный путь приема средств для регенеративной медицины [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др., 2008; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; Gol'dberg E.D., Dygai A.M., Zyuz'kov G.N. et al., 2008].

Исходя из вышеизложенного, весьма актуальным представляется изучение возможности стимуляции процессов восстановления ткани печени при ее хроническом поражении путем активации функций эндогенных прогениторных клеток с помощью иммобилизированной (пегилированной) формы гиалуронидазы (Пэг-ГД).

Цель исследования. Выявить гепатопротекторные свойства пегилированной гиалуронидазы, вскрыть роль модификации функций прогениторных клеток в развитии терапевтических эффектов и изучить механизмы их регуляции в условиях моделирования хронического токсического гепатита.

Задачи исследования:

1. Изучить влияние Пэг-ГД на морфофункциональное состояние печени в условиях экспериментального хронического токсического гепатита.

2. Определить состояние пулов клеток-предшественников различных классов в печени, костном мозге и периферической крови при введении Пэг-

гд.

3. Оценить изменение секреции факторов роста печеночных колониеобразующих единиц (КОЕ-Печ) элементами микроокружения печеночной ткани и восприимчивости прогениторных элементов к регуляторным стимулам под воздействием Пэг-ГД.

4. Вскрыть влияние Пэг-ГД на продукцию хемоаттрактантов родоначальных клеток элементами микроокружения костного мозга и печеночной ткани.

5. Оценить состояние периферической крови и костномозгового кроветворения при введении Пэг-ГД на фоне моделирования хронического токсического гепатита.

Научная новизна. Впервые выявлены выраженные гепатопротекторные эффекты пегилированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы. Обнаружено значительное уменьшение выраженности воспалительно-некротических и склеротических морфологических изменений в печени и снижение содержания щелочной фосфатазы в сыворотке крови при пероральном введении данного средства. Показано, что в основе выявленного противовоспалительного, противосклеротического и антихолестатического

действия Пэг-ГД лежит стимуляция регенераторных процессов печеночной ткани, связанная с активацией регионарных КОЕ-Печ и направленной миграцией мультипотентных мезенхимальных СК костного мозга в орган-мишень. При этом развитие указанных феноменов определяется возрастанием выработки клеточными элементами микроокружения гуморальных факторов, стимулирующих КОЕ-Печ, на фоне повышения их восприимчивости к регуляторным стимулам, а также падением продукции хемоаттрактантов СК стромальными клетками костного мозга при увеличении их выработки элементами микроокружения печени. Продемонстрировано, что мобилизация мультипотентных СК из гемопоэтической ткани, вызванная введением Пэг-ГД при моделировании хронического гепатита, не сопровождается значимым «негативным» влиянием на систему крови.

Практическая значимость. На основании результатов исследований подготовлен отчет для Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения РФ о специфической активности пегилированной с использованием оригинальной технологии гиалуронидазы (разработанной ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН, г. Томск совместно с ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г. Новосибирск) для получения разрешения на ее клинические исследования в качестве гепатопротектора.

Полученные данные фундаментального характера о закономерностях функционирования клеток-предшественников различных классов в условиях патологии печени, а также сведения о механизмах действия изучаемого средства - аналога регулятора функций прогениторных клеток, внесли существенный вклад в развитие фармакологической стратегии регенеративной медицины и могут использоваться для разработки новых медицинских клеточных технологий.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на VI, VII и VIII Региональных конференциях молодых ученых

им. академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2011, 2012, 2013 гг.); IV Съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (г. Казань, 2012 г); конференции молодых ученых ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии» (Томск, 2012 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 7 -в реферируемых журналах, рекомендуемых перечнем ВАК; получено 2 патента на изобретение: патент (RU) № 2439147 «Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток» (опубл. 10.01.2011, Бюл. № 1) и патент (RU) на изобретение № 2477752 «Способ стимуляции дифференцировки стволовых клеток печени in vitro в тканеспецифичном направлении» (опубл. 20.03.2013, Бюл. № 8).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 171 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав, выводов, приложения и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает 308 источников, из них 100 отечественных и 208 иностранных.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гепатопротекторы: классификация, механизмы действия, эффективность (краткая характеристика)

Рациональная фармакотерапия заболеваний печени является одной из наиболее обсуждаемых в практике гастроэнтерологов и терапевтов проблемой. Данное обстоятельство связано с высокой распространенностью вирусных, токсических, лекарственных, алкогольных, аутоиммунных поражений печени. По данным Всемирной организации здравоохранения, в мире более 2 млрд. человек с патологией печени. Каждый год в странах СНГ регистрируется от 500 тыс. до 1 млн. человек, страдающих заболеваниями гепатобилиарной системы [Морозов С.Ю., 2009; Ганичева Л.М., Рогов В.А., 2010]. Снижение физической активности, несбалансированная диета, ожирение, сахарный диабет, курение, злоупотребление алкоголем, прием большого количества лекарственных средств играют важную роль в развитии патологии печени [Афанасьев В.В., Лукьянова И.Ю., 2006].

Согласно МКБ 10, поражения печени классифицируются на 2 большие группы: 1-я группа включает поражения печени инфекционного генеза (поражения специфическими гепатотропными вирусами и неспецифическими инфекционными агентами); 2-я группа обусловлена токсическим поражением печени (алкогольная болезнь; хронический гепатит, включая, аутоиммунный) [Овчаров В.К., 2010].

Многофункциональность печени определяет постоянное воздействие на нее большого количества неблагоприятных факторов, способствующих появлению нарушений энергетического, белкового, липидного, углеводного обменов, холестазу и пр. [Минушкин О.Н., 2002], и как следствие зачастую

/

«срыву» компенсационных процессов и развитию тех или иных патологических состояний.

Терапия заболеваний печени предполагает этиотропную (обычно при вирусных гепатитах с целью подавления репликации и элиминацию возбудителя) и патогенетическую терапию. Патогенетическая терапия проводится препаратами, обозначенными термином «гепатопротекторы». Рге1з1§ Я. (1970 г) сформулировал требования, предъявляемые к идеальному гепатопротектору. В частности, данное средство должно: полностью абсорбироваться при ' приеме внутрь; иметь эффект «первого прохождения» через печень; обладать способностью связывать токсины (или предотвращать образование токсинов); уменьшать воспаление и подавлять фиброгенез; стимулировать регенераторную способность печени; улучшать метаболизм; и обладать экстенсивной (т.е. связанной с количественным, а не качественным изменением) энтерогепатической рециркуляцией [Рге1з!§ Я., 1970]. Тот факт, что описание идеального гепатопротектора появилось еще в 1970г., а соответствующего ему препарата до сих пор не существует, свидетельствует о безусловной сложности данной проблемы [Грацианская А.Н., 2010].

Группа гепатопротекторов весьма гетерогенна и включает вещества различного происхождения, химического строения и с разными механизмами действия. Кроме того, несмотря на многолетний клинический опыт и большое количество проведенных научных исследований, границы их применения до сих пор окончательно не определены. Отношение к гепатопротекторам в медицинской среде варьирует от рассмотрения их в качестве эффективных базисных препаратов до полного неприятия, как средств с недоказанной терапевтической активностью [Буеверов А.О., 2002].

Общепринятой классификации гепатопротекторов на сегодня не существует. В зависимости от химической структуры и происхождения препарата выделяют несколько групп гепатопротекторов: препараты растительного происхождения, в основном, содержащие биофлавоноиды

расторопши, куркумы, бессмертника, артишока, дымянки, ольхи и др. (Карсил, Легалон, Силибор, Хофитол, Гепабене, Лив-52 и др.); препараты животного происхождения (Сирепар, Витогепат, Эрбисол и др.); препараты фосфатидилхолина и липосомальные (Эссенциале, Ливолин форте, Липин, Лиолив, Лецитин, Фосфоглив); препараты, содержащие аминокислоты (Гептрал, Гепа-мерц, Глутаргин, Орницетил, Бетаин Цитрат и др.); препараты синтетического происхождения (Антраль, Тиотриазолин, Тиоктацид и др.); гомеопатические средства (Галстена, Хепель, Гепар композитум) [Морозов С.Ю., 2009].

Более 50% фармацевтического рынка всех гепатопротекторов составляют фитопрепараты. Это связано с их широким спектром действия, минимальным количеством побочных эффектов, доступностью в ценовом отношении. Центральное место среди гепатопротекторов растительного происхождения занимают препараты флавоноидов расторопши пятнистой. Терапевтическое действие данных средств связывают с их антиоксидантным и мембраностабилизирующим влиянием, определяемым способностью семихинонового радикала улавливать свободные радикалы (система фенол-семихинон-хинон) [Шульпекова Ю.О., 2004]. К сожалению, в настоящее время проведение сравнительных рандомизированных клинических исследований эффективности растительных препаратов практически невозможно. Это объясняется как сложностью оценки функционального состояния антиоксидантной системы каждого участника исследования, так и различиями в метаболизме и характере действия фитопрепаратов. Таким образом, объективных данных эффективности применения гепатопротекторов растительного происхождения на сегодняшний день нет [Rodez J., 1991; Ушкалова Е.А., 2004; Шульпекова Ю.О., 2004].

Около 15% рынка гепатопротекторов принадлежат фосфолипидным и липосомальным препаратам. Механизм действия препаратов данной группы связан с ключевой ролью фосфолипидов в структуре клеточных и

субклеточных мембран, и их способностью влиять на функции поврежденных гепатоцитов путем предоставления необходимого субстрата [Нидерау К., 1998; Ивашкин В.Т., 2007].

Гепатопротекторы на основе аминокислот, также представляют собой источники «строительного материала» и участники биологических реакций. Так, Адеметионин, являясь производным метионина, предоставляет субстрат для реакций трансметилирования, одной из которых является синтез фосфатидилхолинов в детоксикационных реакциях транссульфурирования, а также в реакции аминопропилирования, занимающей важное место в формировании структур рибосом и процессах пролиферации гепатоцитов. Аргинин, входящий в состав большинства аминокислотных гепатопротекторов, принимает участие в синтезе белка, других аминокислот и их производных, в цикле образования мочевины и метаболизме аммиака, а бетаин способствует иммобилизации жиров из печени, что особенно важно при ее жировой инфильтрации [Оковитый С. В., 2004].

Препараты животного происхождения в настоящее время применяются редко, что связано с их низкой эффективностью, а также сложностью и недостаточным уровнем их очистки [Минушкин О.Н., 2002].

Кроме того, существуют комплексные гомеопатические препараты, не имеющие отношения к ортодоксальной фармакологии.

При этом в ходе экспериментального сравнительного исследования эффективности различных гепатопротекторов при подсчете коэффициента гепатопротективной активности был сделан вывод, что ни один из препаратов не обладает комплексным гепатопротективным действием, проявляющемся в нормализации всех функций и показателей [Ситников И.Г., Федоров В.Н. и др., 2004].

Более того, исходя из заключений докладов конгресса «Панамериканской гастроэнтерологической недели» в 2002 году следует [АА81Л), 2002], что применение гепатопротекторов при патологии печени у человека

безосновательно, доказательств их клинической эффективности нет. Все средства данной фармакологической группы следует относить к дополнительной и альтернативной медицине. При этом необходимо их дополнительное изучение с целью поиска научного обоснования, без которого данные средства не могут включаться в стандартизованные протоколы лечения хронических диффузных заболеваний печени различного генеза [Мараховский Ю. X, Рубенс Ю.П., 2004].

Исходя из вышеизложенного следует, что фармакологическое действие существующих гепатопротекторов обусловлено собственным антиоксидантным эффектом и потенциированием эндогенных антиоксидантных систем гепатоцитов; ингибированием фосфолиполиза с уменьшением продукции лизофосфолипидов и восстановлением нормального спектра фосфолипидов мембран; улучшением депонирования ионов Са2+, а также улучшением матриксной барьерной функции цитолеммы, мембран митохондрий, эндоплазматического ретикулума и лизосом [Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков A.C., 1999]. При этом анализ литературы позволяет говорить о том, что использование данных средств далеко не всегда соответствует принципам доказательной медицины, а существующие результаты доклинических и, особенно, клинических наблюдений являются лишь отдельными фрагментами классических подходов фармакологии [Ивашкин В.Т., 2002].

Таким образом, фармакологическое действие существующих гепатопротекторных лекарственных средств направлено преимущественно на защиту, либо стимуляцию сохранившихся клеточных элементов печени. Однако данная концепция фармакологического вмешательства в ряде случаев оказывается несостоятельной. Зачастую не удается, не только восстановить морфофункциональное состояние органа, но и предупредить прогредиентный характер течения патологического процесса. В связи с этим представляется актуальным разработка оригинальных лекарственных средств с принципиально новыми патогенетически обоснованными механизмами действия.

1.2. Современные представления о функциях и закономерностях жизнедеятельности стволовых клеток

1.2.1. Общая характеристика стволовых клеток

Бурное развитие биомедицинской науки в конце XX века позволило значительно продвинуться вперед в понимании свойств и закономерностей жизнедеятельности поли (мульти) потентных клеток-предшественников организма - стволовых клеток (СК). При этом с их терапевтическим применением связывают большие надежды на лечение целого ряда заболеваний, в том числе и путем создания новых органов. В 1999 году журнал "Science" назвал открытие СК человека третьим по значимости событием XX века в области медицины после двойной спирали и программы «геном человека».

Термин «стволовая клетка» впервые был предложен еще в 1908г. на съезде гематологического общества в г. Берлине выдающимся русским ученым А.А. Максимовым. Он предположил существование клеточных элементов (морфологически схожих с лимфоидными клетками) в костном мозге, являющихся родоначальниками всех клеток крови [Максимов А.А., 1925]. Однако только с развитием новых методов и технологий удалось выявить данную популяцию клеток, сначала из злокачественных тканей (линия клеток Hela) [Scherer William F., Jerome T. Syverton, 1951], a позднее из кроветворной ткани (метод селезеночного колониеобразования, вязкие и полутвердые культуры ткани) в условиях in vivo и in vitro [Till J. E., McCulloch E.A., 1961].

В настоящее время под СК понимают особый вид клеток, обладающих уникальной способностью к самоподцержанию и дифференцировке во многие специализированные клеточные элементы. Следует отметить, что в строгом понимании термина «стволовая клетка» предполагает лишь очень узкий круг тоти- и/или плюрипотентных клеточных элементов. Понятие «тотипотентный»

обозначает способность таких клеток давать начало новому организму, а плюрипотентных - дифференцироваться в любые без исключения клетки организма. Однако исторически применение этого термина в литературе подразумевает, как правило, его отношение ко всем прогениторным элементам, обладающим относительно высоким пролиферативным и дифференцировочным потенциалом. Таким образом, под термином «прогениторные клетки» подразумевают гетерогенную популяцию клеток-предшественников, включающую в себя и СК, и их частично детерминированные и коммитированные производные.

Наибольшим терапевтическим потенциалом обладают эмбриональные СК (ЭСК) [Thomson J. A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S. et al., 1998; Fischbach G.D., Fischbach R.L., 2004; Wang L., Li L., Menendez P. et al., 2005; Репин B.C., 2001]. Основными свойствами ЭСК являются их плюрипотентность, т.е. способность к дифференцировке во все известные виды соматических клеток, встречающиеся в живом организме и экспрессия таких факторов, как Oct4, Sox2, Tert, Utfl и Rexl [Carpenter M.K, Rosier Е., Rao M.S., 2003], а также неограниченный пролиферативный потенциал с сохранением исходного фенотипа.

В то же время в 1970-е гг. А.Я. Фриденштейн с соавторами обнаружили эти клетки во взрослом организме - в мезенхиме (строме) костного мозга мышей [Friedenstein A., Owen M., 1988]. Данные элементы обладали способностью к самообновлению и дифференцировки в элементы костной, хрящевой, фиброзной и жировой ткани и были названы - мезенхимальными (стромальными) стволовыми клетками. При этом в настоящее время под данным термином понимают мультипотентные клетки-предшественники, и он не отражает происхождения и ограниченную возможность гистогенетического развития их лишь в мезенхимальном направлении [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2012]. Более того, доказано наличие данных элементов во многих органах и тканях организма [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009, 2012].

CK соматических тканей млекопитающих составляют существенный восстановительный резерв в организме и обеспечивают регенерацию тканей в ответ на физиологическую убыль клеток, либо их гибель, вызванную повреждающим фактором [Hofstetter С., Schwarz Е., Hess D. et al., 2002]. Данные элементы способны к длительному пребыванию в покоящемся состоянии (фазе Go-клеточного цикла), а при стимуляции - к самовоспроизведению с сохранением мультипотентности обеих дочерних клеток (симметричное деление) либо к неэквальному делению, когда одна из клеток сохраняет стволовость, а другая коммитируется и выходит в дифференцировку [Bjornson C.R., Rietze R.L., Reynolds В.А. et al., 1999].

Причем, на сегодня экспериментально доказана возможность дифференцировки определенных резидентных (оседлых) стволовых клеток в специфические элементы тканей, отличных от тех, в которых они локализованы.

Так, показано, что гемопоэтическая CK способна дифференцироваться во все клеточные элементы крови, а также давать начало клеткам печени [Peterson В.Е., Bowen W.C., Patrene K.D. et al., 1999], нейральная CK, производными которой являются нейроны и глиальные элементы, может служить источником коммитированных гемопоэтических предшественников [Bjornsen C.R., Rietze R.L., Reynolds В.А. et al., 1999], а мезенхимальная CK, дающая начало клеткам костной, хрящевой и жировой тканей, способна дифференцироваться в специализированные элементы нервной ткани [Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G., 1999]. Более того, существует предположение о существовании во взрослом организме очень небольшого количества плюрипотентных предшественников, способных дифференцироваться практически во все клетки, производные всех трех эмбриональных листков. Так, в костном мозге были обнаружены очень мелкие, подобные эмбриональным (very small embryonic-like (VSEL)) плюрипотентные стволовые клетки (Oct-4+ SSEA-l+Sca-l+Lin~CD45~ ) [Ratajczak M.Z., Zuba-Surma E.K., Wysoczynski M. et al., 2008]. Поддержание

популяции CK зависит от действия автономных регуляторов, контролирующих их деление под действием внешних сигналов, а также экспрессию (степень активации и проявления деятельности) тех или иных генов [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; 2012]. Кроме того, чрезвычайно важным представляется наличие у стволовых клеток уникальной способности под влиянием микроокружения покидать тканевую нишу, где они находятся в «спокойном» состоянии, попадать в кровоток и в последующем оседать в необходимом для организма в данный момент месте, развиваясь затем в направлении, программируемом новым микроокружением [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; 2012].

При этом, несмотря на то, что VSEL активно вырабатывают протоонкоген Oct4, авторы исследования утверждают, они гораздо менее опасны в отношении возможности опухолевой трансформации, чем иПСК клетки (индуцированные плюрипотентные стволовые клетки) и ЭСК [Ratajczak M.Z., Shin D.M., Liu R. et al., 2010].

Впервые методика репрограммирования соматических клеток в плюрипотентные стволовые клетки была разработана проф. Yamanaka из Киотского университета [Takahashi К., Yamanaka S., 2006]. Суть метода сводится к трансфекции взрослой клетки четырьмя генами (ОСТ4, SOX2, c-MYC и KLF4), которые кодируют факторы транскрипции, связанные с плюрипотентным состоянием эмбриональных клеток. Полученные в результате такой обработки иПСК клетки обладают схожей с ЭСК морфологией, ростовыми свойствами и экспрессировали специфические маркеры, присущие ЭСК. В дальнейшем был проведен ряд экспериментальных работ группами ученых разных стран по усовершенствованию вышеописанного метода. В настоящее время продемонстрирована возможность дифференцировки in vitro иПСК во многие специфические виды клеток, такие как кардиомиоциты [Zhang J., Wilson G.F., Soerens A.G. et al., 2009], гепатоциты [Song Z., Cai J., Liu Y. et al., 2009], эпителий сетчатки и пр. [Osakada F., Jin Z.B., Hirami Y. et al., 2009].

Данные исследования имеют огромное значение для регенеративной медицины, поскольку дают возможность избежать ряда этических проблем, связанных с получением и использованием специфичных для конкретного пациента линий ЭСК. Тем не менее, одна из возникших уже на ранних этапах работы проблем обусловлена потенциальным мутагенным эффектом при использовании ретровирусных конструкций в процессах дедифференцировки соматических клеток человека. Потребуются дальнейшие исследования для выявления преимуществ использования данного подхода [Holden С., Vogel G., 2008].

Несмотря на ряд общих функциональных характеристик и закономерностей жизнедеятельности различных типов CK, их отдельные популяции все же значительно различаются между собой по фенотипическим признакам и выраженности экспрессии тех или иных функций.

1.2.2. Стволовые клетки печени

Известная феноменальная способность печени восстанавливать свой рост и массу после повреждений различной этиологии, а также поддерживать постоянство структуры и функции, связана с уникальными свойствами ее паренхиматозных клеток - гепатоцитов [Furnus С.С., Inda A.M., Andrini L.B. et al., 2003]. Гепатоциты млекопитающих представляют собой дифференцированные полиплоидные клетки, которые при нормальных условиях стабильно находятся в фазе Go/ Gj клеточного цикла. Длительность существования таких митотически инертных гепатоцитов соответствует продолжительности жизни человека [Урываева И.В., 2001]. Однако в случае утраты части паренхимы печени гепатоциты проявляют практически безграничную способность к размножению при чрезвычайно высокой скорости регенерации - от 70 до 80% клеточной массы паренхимы печени восстанавливается за 5-6 дней. В экспериментах с введением четырехлористого углерода (CCI4) показано, что даже при его восьмикратном использовании с

интервалом в 1 месяц происходит полное обновление пораженной печеночной ткани [Фактор В.М., Урываева И.В., 1980]. На трансгенных мышах (ALuPA, Fah-/-) доказано, что зрелые гепатоциты по сравнению с другими соматическими клетками имеют больший лимит Хейфлика, проявляя способность более чем к 100 репликативным циклам и полностью репопулируют печень у животных 6-8 трансплантационного поколения [Sandgren Е.Р., Palmiter R.D., Hechel J.L., 1991]. Следовательно, гепатоциты характеризуются способностью к самоподдержанию на протяжении всей жизни организма, что является одной из основных характеристик CK и позволяет рассматривать дифференцированную паренхимальную клетку печени как унипотентную CK [Laconi Е., 2000].

Между тем при заболеваниях печени, особенно при их хроническом течении, зачастую наблюдается угнетение пролиферации гепатоцитов, что, как полагают, является результатом воздействия повреждающего фактора на фоне низкого исходного уровня адаптационных резервов организма к этому фактору. В результате в печени нарушается адекватность соотношения вырабатываемых про- и противовоспалительных цитокинов, про- и антифибриногенных факторов (матриксметаллопроетиназ и их тканевых ингибиторов), и таким образом имеет место нарушение способности к регенерации и фиброзирование печени [Wynn Т.А., 2008].

В то же время существуют регионарные стволовые клетки в печени. Данные элементы составляют так называемый факультативный стволовой резерв печени, поскольку их дифференциация начинается только тогда, когда блокировано деление полиплоидных гепатоцитов, что убедительно показано в экспериментах с дипином и ретрорсином [Gordon G.L., Coleman W.B., Hixon D.C. et al., 2000].

Впервые о возможности существования CK в печени было высказано в 1958 году J. Wilson и Е. Leduc [Wilson J.W., Leduc E.H., 1958], которые изучали регенерацию печени мышей на фоне хронического повреждения метионином.

Они установили, что при длительном хроническом повреждении печени целостность паренхимы может восстанавливаться, несмотря на отсутствие пролиферации гепатоцитов. На основании полученных данных было высказано предположение, что регенерация паренхимы может происходить за счет малодифференцированных клеток. В настоящее время эти данные подтверждены на различных экспериментальных моделях. При этом наиболее распространенными моделями активации стволового компартмента печени являются повреждение органа (3-галактозамином, дипином, диэтилнитрозамином и ацетилфлуорином. При воздействии на печень перечисленных химических веществ нарушается целостность паренхимы и одновременно блокируется репопуляция гепатоцитов [Chen Y.-K., Zhao Х.-Х., Li J.-G. et al., 2006].

Долгие годы одной из наиболее распространенных была теория, рассматривающая в качестве СК печени так называемые «овальные клетки» (ОК), предположительно располагающиеся в начальных отделах желчевыводящих путей - канальцах Геринга, и обладающие свойствами бипотентности (давать начало как гепатоцитам, так и холангиоцитам) [Theise N.D., Saxena R., Portmann B.C. et al., 1999]. У крыс OK напоминают эмбриональные гепатобласты, которые экспрессируют маркеры как желчных протоков, так и гепатоцитов, а также а-фетопротеин [Fausto N., Campbell J.S., 2003]. OK активируются в случае истощения репликационного потенциала гепатоцитов в ответ на токсическое воздействие и их количество коррелирует с тяжестью поражения печени [Lowes K.N., Brennan В.А., Yeoh С.С, 1999].

Также за последние годы выделяли две другие популяции регенерирующих печень клеток: малые гепатоциты и непаренхимные эпителиальные клетки печени. Впервые малые гепатоциты были описаны и выделены Митакой с соавт. из непаренхимной фракции печени в 1995 г [Mitaka Т., Kojima Т., Mizuguchi Т., 1995]. Данные клетки обладают меньшим размеров, чем обычные гепатоциты, могут размножаться и превращаться в зрелые гепатоциты в

условиях in vitro [Sidler Pfandler M.A., Hochli M., Inderbitzin D., 2004]. Популяция непаренхимиых эпителиальных клеток печени была обнаружена у взрослых крыс в 1984 г [Tsao M.S., Smith J.D., Nelson K.G., 1984]. Пересадка данных элементов в печень крыс приводит к формированию гепатоцитов, экспрессирующих типичные гепатоцитарные маркеры - альбумин, альфа-1-антитрипсин, тирозиновую трансаминазу и трансферрин [Grisham JW, Coleman WB, Smith GJ., 1993].

Кроме того, в 2007 году была опубликована статья, в которой в качестве CK печени впервые рассматривались перисинусоидальные клетки (называемые также звездчатые клетки, липоциты, клетки Ито). Именно эти элементы находятся в печени в непосредственном контакте с гепатоцитами и создают микрооркужение как для фетального печеночного гемопоэза, так и для дифференцировки гепатоцитов и холангиоцитов в ходе пренатального развития [Гумерова A.A., Киясов А.П., Калигин М.С. и др., 2007].

На протяжении долгих лет считалось, что клетки Ито играют важную роль только в развитии фиброза и цирроза печени [Burt A.D., 1993; Burt A.D., Le Bail В., Balabaud С. et al., 1993; Friedman S.L., 2000]. Данное заключение основывалось на обнаружении их активации при повреждении печени, проявляющейся в усилении экспрессии десмина, пролиферации и трансдифференцировке в клетки подобные миофиброб ластам, экспрессирующие а-гладкомышечный актин и синтезирующие значительные количества межклеточного вещества, в частности, коллагена I типа [Ramadori G., Veit T., Schwogler S. et al., 1990]. Однако результаты последних лет показали, что клетки Ито являются важнейшим участником восстановления паренхимы в ходе регенерации печени за счет вырабатываемых ими макромолекул межклеточного матрикса и его ремоделирования, а также продукции факторов роста [Kim Т.Н., Mars W.M., Stolz D.B. et al., 1997; Friedman S.L., 2008].

Важнейшим из данных факторов является митоген клеток печени - фактор роста гепатоцитов (HGF) [Schirmacher P., Geerts A., Pietrangelo A. et al., 1992; Maher J.J., 1993], необходимый для пролиферации, выживания и подвижности клеток [Gohda Е., Tsubouchi H., Nakayama H. et al., 1986; Gohda E., Tsubouchi H., Nakayama H. et al., 1988; Weidner K.M., Arakaki N., Hartmann G. et al., 1991]. Кроме него клетки Ито вырабатывают фактор стволовых клеток (SCF - stem cell factor) [Fujio К., Evarts R.P., Hu Z. et al., 1994], трансформирующий фактор роста-a, эпидермальный фактор роста (EGF) [Mullhaupt В., Feren A., Fodor E. et al., 1994], а также плейотрофин [Asahina К., Sato H., Yamasaki С. et al., 2002] и эпиморфин, который появляется в них после частичной гепатоэктомии [Yoshino R., Miura К., Segawa D. et al., 2006].

Важную роль во взаимодействии между гепатоцитами и клетками Ито, помимо паракринных механизмов, играют межклеточные контакты этих клеток с гепатоцитами. Было показано, что совместное культивирование клеток Ито и эпителиальных предшественников стимулирует дифференцировку последних в альбумин-продуцирующие гепатоциты [Nagai H., Terada К., Watanabe G. et al., 2002].

Кроме того, установлена способность клеток Ито влиять на дифференцировку гемопоэтических клеток-предшественников путем секреции таких факторов, как эритропоэтин [Eckardt K.U., 1996] и нейротрофин [Passino М.А., Adams R.A., Sikorski S.L. et al., 2007]. Помимо этого при изучении фетального гемопоэза крысы [Киясов А.П., Гумерова А.А., Билалов М.М., 1997] и человека [Гумерова А.А., Киясов А.П., Калигин М.С. и др., 2007] выявлена их ключевая роль в формировании гемопоэзиндуцирующего микроокружения экстрамедулярных очагов кроветворения. При этом клеткам Ито также отводят важное значение в привлечении гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) в фетальную печень. Данный феномен осуществляется за счет экспрессии на фетальных клетках Ито молекул VCAM-1 - сосудистой молекулы клеточной адгезии [Kubota H., Yao H., Reid L.M., 2007], необходимой

для поддержания адгезии гемопоэтических прогениторов к стромальным клеткам костного мозга [Miyake К., Medina К., Ishihara К. et al., 1991], а также стромального фактора-la (SDF-la), являющегося основным хемоаттрактантом для кроветворных стволовых клеток [Wright D.E., Bowman Е.Р., Wagers AJ. et al., 2002]. Кроме того, клетки Ито влияют на мезенхимальные стволовые клетки (МСК), способствуя их дифференцировке в гепатоцитоподобные элементы (накапливающие гликоген и экспрессирующие а-фетопротеин, цитокератин 18 и глютаминсинтетазу) [Deng X., Chen Y-X., Zhang J.P. et al., 2008].

Существуют и иммунофенотипические доказательства принадлежности клеток Ито к ранним прогениторным элементам. В частности, экспрессия Oct4 - характерного для плюрипотентных CK [Kordes С., Sawitza I., Muller-Marbach A. et al., 2007], и C-kit - рецептора к фактору стволовых клеток (SCF) [Гумерова A.A., Киясов А.П., 2007].

При этом основную роль в формировании микроокружения для данных клеток, в том числе их «ниш», некоторые исследователи связывают с пространством Диссе, образованном протеинами базальной мембраны, эндотелиальными клетками и гепатоцитами. Эндотелиоциты при этом синтезируют растворимый SDF-la, связывающийся с CXCR4 клеток Ито и стимулирующий их миграцию [Sawitza I., Kordes С., Hausinger D., 2009].

Однако существуют работы, ставящие под сомнение теорию, рассматривающую вышеописанные клетки в качестве, по крайней мере, единственных истинных CK печени. Была обнаружена возможность образования гепатоцитов из кроветворной стволовой клетки, т.е. из клетки не энто-, а мезодермального происхождения [Petersen В.Е., Bowen W.C., Patrene K.D. et al., 1999]. При этом основными факторами дифференцировки: на этапе формирования зачатка печени был определен фактор роста фибробластов-4 (FGF-4) [Duncan S.A., 2000], а на более поздних - фактор роста гепатоцитов (HGF) [McLin V.A., Zorn. A.M., 2006]. Более того, была установлена возможность миграции CK костного мозга в печень, сопровождающаяся

экспрессией в них специфических печеночных генов, а также способность к гибридизации (химеризации) путем слияния с гепатоцитами (fusion-феномен) [Tripodi A., Salerno F., Chantarangkul V. et al., 2005] и клетками Ито [Senzolo М., Burra P., Cholonqitas E. et al., 2006].

Вместе с тем участие в процессах регенерации СК костного мозга не ограничивается их пластичностью. Данные элементы способны оказывать свое действие через продукцию гуморальных факторов (TNF-a, HGF, TGF-|3, MMPs (1,2, 9), FGF-2,7, SCF, VEGF (А и В), интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-6, LIF, ИЛ-10), оксид азота) [Espíritu J.D., 2000].

Таким образом, сведения литературы указывают на активное участие СК костного мозга в процессах репаративной регенерации печени при ее значительном повреждении. При этом в условиях физиологической регенерации клетки костного мозга, по-видимому, не играют значительной роли [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2006; Ярыгин К.Н., 2008].

Исходя из вышеизложенного можно предположить, что полноценная регенерация поврежденной печени взрослого организма при несостоятельности самих гепатоцитов, во многом, зависит не только от состояния пула регионарных СК печени, но и от их взаимодействия с элементами микроокружения органа, а также от миграции прогениторных клеток тканей-депо в пораженную ткань и образования из них тканеспецифичных клеток, либо элементов микроокружения.

1.2.3. Мезенхимальные стволовые клетки

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) человека считаются одним из самых перспективных видов популяции стволовых клеток для клеточной терапии широкого спектра заболеваний и тканевой инженерии благодаря тому, что данные тканеспецифические элементы обладают максимальным диапазоном дифференцировки [Гольдберг Е. Д., Дыгай A.M.,

Жданов и др., 2007а]. Этот тип взрослых CK присутствует во многих тканях, однако, наиболее значительной и мобильной популяцией данных клеточных элементов в организме являются мезенхимальные CK костного мозга [Гольдберг Е. Д., Дыгай A.M., Жданов и др., 2007а; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; 2012].

В 2005 году Комитетом мезенхимальных и тканевых стволовых клеток международного общества клеточной терапии (Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the international Society for Cellular Therapy) [Horwitz E.M., Le Blanc K., Dominici M. et al., 2005; Dominici M., Le Blanc К., Mueller I. et al., 2006] были установлены «минимальные» критерии, специфичные для МСК: иммунофенотип, представленный Thy-1 (CD90), эндоглин (CD 105), ecto-5'-nucleotidase (CD73), VCAM-1 (CD 106) и рецептор гиалуроновой кислоты (CD44) в сочетании с отсутствием или низким уровнем экспрессии CD34, CD45, CD14 или CDllb и CD79, или CD19 и HLA-DR, а также способность адгезироваться к поверхности культуральной посуды и дифференцироваться как минимум в трех ортодоксальных направлениях: остео-, адипо- и хондрогенном [Dominici M., Le Blanc К., Mueller I. et al., 2006].

Вместе с тем, как и другие прогениторные клетки, МСК несут на своей поверхности ряд типоспецифичных и неспецифичных антигенов. Одним из первых поверхностных маркёров был открыт белок STRO-1 [Dennis R.J., Merriam A., Awadallah A. et al., 1999; Dennis J.E., Carbillet J.P. et al., 2002]. В работах Carter R.A. et al. описаны мультипотентные мезенхимальные клетки с фенотипом CD 106 (VCAM-1) [Carter R.A., Wicks I.P., 2001]. С помощью антител к CD 106 можно выделить до 1,4% клеток из популяции STRO-1-позитивных МСК [Gronthos S., Zannettino A.C., Hay S.J. et al., 2003]. Так же идентифицированы такие маркёры МСК как CD70, CD73, CD 105. На поверхности мезенхимальных стволовых клеток отсутствуют антигены гемопоэтических клеток: CD45, CD34 и CD 14 [Pittenger M.F., Mackay A.M. et al., 1999]. Ещё одним антигеном является СОбЗ-лизосомальный мембранный

гликопротеин [Stewart К., Monk P., Walsh S. et al., 2003]. Он задействован в процессах миграции, адгезии, пролиферации и дифференцировки [McCulloucgh В., Рерра D., Monk P.N. et al., 1996]. Кроме того, выделяют и другие эпитопы, стойко экспрессирующиеся на поверхности МСК. CD10-CALLA (common acute lymphocytic leukemia antigen) - маркёр ранних предшественников лимфоидной ткани человека [Shipp М.А., Look А.Т., 1993], CD 13 - аминопептидаза N, обнаружен на моноцитах и коммитированных предшественниках миелоидной ткани [Shipp М.А., 1993], CD29 - интегрин ß-1 [Wu X., Miyake К., Medina K.L. et al., 1994] и CD44 - Pgpl (phagocytic glycoprotein - 1/hyaluronate receptor) [Miyake K., Medina K.L., Hayashi S. et al., 1990; Simmons P.J., Torok-Storb В., 1991; Gronthos S., Fraklin D.M., Leddy H.A. et al., 2001], а также CD44 -рецептор для гилуранана и остеопантина, которые играют ведущую роль в формировании внеклеточного вещества [Minguell J.J., 1993; Yamazaki М., Nacajima F., Ogasawara A. et al., 1999; Minguell J.J., Erices A., Conget P., 2001].

Аналогичным образом обстоит дело и с дифференцировкой МСК. Показана способность МСК различного происхождения дифференцироваться в клетки экто- и эндодермального происхождения: нервной, мышечной, эпителиальной ткани, что предполагает наличие у МСК потенциала плюрипотентных стволовых клеток [Barry F., Boynton R. E., Liu В. et al., 2001; Bianco P., Riminucci M., Gronthos S. et al., 2001; Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E., 1997; Gronthos S., Zannettino A. C., Hay S. J. et al., 2003; Pittenger M.F., Mackay A., Beck S. et al., 1999]. Дифференцировку МСК в том или ином направлении в системе in vitro можно добиться путем добавления специфических факторов. Так, остеогенную дифференцировку можно вызвать при добавлении в культуру ß-глицерофосфата и аскорбиновой кислоты, адипогенез - за счет введения дексаметазона, изобутилметилксантиана и метиндола, хондрогенез стимулируют трансформирующим фактором роста-а (TGF-а), миогенез и кардиомиогенез - аскорбиновой кислотой, дексаметазоном

и 5-азацитидином [Jaiswal N., Haynesworth S., Caplan A., et al., 1997; Pittenger M., Mosca J., Mcintosh К., 2000].

Установлено, что мезенхимальные клетки костного мозга вырабатывают большое количество ростовых факторов, интерлейкинов и хемокинов [Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I., 1992], а также такие компоненты межклеточного матрикса как фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны [Chichester С.О., Fernandez M., Minguell J.J., 1993; Prockop D.J., 1997].

Не менее важной биологической особенностью МСК является их низкая иммуногенность, способность к миграции в очаг повреждения, гемопоэзстимулирующая и иммуномодулируюгцая активности, что в совокупности позволяет рассматривать их в качестве индукторов/регуляторов репаративных процессов [Majumbar М.К., Keane-Moore M., Buaner D. et al., 2003; Зубов Д.А., Оксимец B.M., 2008]. Так, в настоящее время активно обсуждается возможность использования МСК с целью ускорения восстановления кроветворения и профилактики развития реакции «трансплантант против хозяина» при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам гемобластозами после высокодозовой химиотерапии [Ball L.M., Bredius R.G.M., Lankester A.C. et al., 2008; Le Blanc К., 2006], разрабатываются новые подходы по использованию МСК для восстановления репаративного остеогенеза [Деев Р.В., Гололобов В. Г., Цупкина Н. В., 2004; Зорин В.Л., Зорина А.И., Черкасов В.Р., 2004; Шевцов В.И., Чиркова A.M., Дьячков А.Н., 1999], а также способы терапии ряда других патологий [Аскаров М.Б., Шумаков В.И., Онищенко H.A., 2009; Черных Е.Р., Шевела Е.Я., Останин A.A., 2007].

Свойство самоподдержания популяции МСК было доказано в лаборатории профессора Д. Прокопа [Prockop D., Sekiya I., Colter D., 2001]. В своих исследованиях эта группа показала высокую пролиферативную способность МСК in vitro при полном сохранении основных свойств этих клеток, фенотипа и дифференцировочного потенциала [Prockop D., Sekiya I., Colter D. et al., 2001].

При этом для предотвращения спонтанной дифференцировки МСК при культивировании МСК в среду следует добавлять фактор роста фибробластов [Tsutsumi S., Shimazu A., Miyazaki К. et al., 2001]. Вместе с тем следует отметить, что популяции МСК весьма неоднородны у разных видов млекопитающих, и даже животные одного вида, но разных линий имеют существенно отличный друг от друга фенотип. Более того, они значительно различаются и по функциональным и морфологическим свойствам, в том числе и среди МСК костного мозга. В частности, некоторые исследователи костномозговые МСК разделяют: популяцию RS-1 - это мелкие активно пролиферирующие клетки, экспрессирующие Oct-4 (один из маркеров ЭСК), их доля составляет около 1% [Pochampally R., Neville В., Schwartz Е. et al., 2004]; и две субпопуляции: одна из них, мажорная, составляет около 98% и определяет основные свойства популяции; другая, минорная, составляет до 2% и получила название мультипотентных взрослых клеток-предшественников (multipotent adult progenitor cells, МАРС) [Jiang Y., Vaessen В., Lenvik T. et al., 2002]. Показано, что в МАРС происходит экспрессия транскрипционных факторов Oct-4 и Rex-1 - факторов, характерных для ЭСК. Однако не доказано, являются МАРС отдельной популяцией стволовых клеток во взрослом организме или они являются МСК, прошедшими путь дедифференцировки в условиях in vitro [Jiang Y., Vaessen В., Lenvik Т. et al., 2002]. Гетерогенность клеток, входящих в состав колоний, отчетливо проявляется по отношению к их пролиферативной активности. Так, одни МСК способны к 3-4 удвоениям, тогда как другие - к 15 и более [Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E., 1997; Phinney D. G., Kopen G., Isaacson R. L. et al., 1999].

На морфологию МСК и на степень экспрессии поверхностных маркёров в условиях in vitro большое влияние оказывает состав питательной среды, а также такие факторы как пространственное распределение клеток, компонентны межклеточного матрикса и способ культивирования [Gregory С.А., Ylostalo J., Prockop D.J., 2005].

МСК, как и другие прогениторные клетки, способны при воздействии факторов мобилизации, покидать свою тканевую «нишу», циркулировать в кровотоке, и «оседать» в тканях с дальнейшей их дифференцировкой [Сухих Г.Т. Малайцев В.В., Богданова И.М. и др., 2002; Kawada H., Fujita J., Kinjo К. et al., 2004; Зюзьков Г.Н., Суслов H. И., Жданов В.В. и др., 2005; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2006]. В то же время в условиях оптимальной жизнедеятельности организма регенерация тканей (физиологическая) осуществляется в подавляющем большинстве случаев за счет собственных (регионарных) СК [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009, 2012].

Миграция МСК из костного мозга в органы в большинстве случаев происходит только тогда, когда происходит опустошение (истощение) в периферическом компартменте системы МСК при действии экстремальных факторов (стрессе, повреждениях, травмах, патологических процессов [Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И., Жданов В.В. и др., 2005; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2006; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009, 2012]. Известно, что миграция эндогенных МСК в зону повреждения определяется рядом цитокинов и хемокинов (ГМ-КСФ, Г-КСФ, ФСК совместно с Г-КСФ, SDF-1, ИЛ-8 и др.). В настоящее время наиболее хорошо изученным фактором хоуминга стволовых и прогениторных клеток костного мозга является Г-КСФ, а также фактор стромальных клеток (stromal-derived factor-la, SDF-1 a). SDF-1 a вырабатывается стромальными клетками многих такней. Экспрессия как SDF-la, так и его рецептора CXCR4 повышается при гипоксии и тканевых травмах [Ceradini D.J., Kulkarni A., Callaghan M.J., 2004]. Установлено, что CXCR4 - рецептор, связывающий SDF, который в ряде случаев используется в качестве маркера стволовых и прогениторных клеток [Chute J.P., 2006]. Показано, что при генетическом дефекте SDF-la у мышей отмечаются грубые нарушения процесса гемопоэза уже на ранних стадиях эмбриогенеза [Nagasawa T., Hirota S., Tachibana К. et al., 1996], связанные с нарушением миграции ГСК из органов раннего гемопоэза (печени, желточного мешка) в костный мозг. В то же время

повышение экспрессии SDF-la у трансгенных мышей, напротив, вызывает выраженную постоянную мобилизацию ГСК в системный кровоток [Hattori К., Heissig В., Rafii S., 2001].

При этом, несмотря на то, что клетки поврежденных тканей в большом количестве секретируют SDF-la, зачастую имеет место нарушение хоуминга клеток за счет расщепления N-терминального пептида CXCR4 протеолитическими ферментами (сериновые протеазы, катепсин G, эластазы и металлопротеиназы). При этом контроль за выходом депонированного внутриклеточного CXCR4 на мембрану клетки помогает избежать чрезмерного их протеолиза и дизадаптации механизмов миграции CK. Кроме того, взаимодействие SDF-la с рецептором определяется рядом других факторов: фибронектином, фибриногеном, тромбином, состоянием гиалуроновой кислоты, сфингозин-1-фосфатом и др. (усиливают хемотаксис CXCR4+ клеток по градиенту концентрации SDF-la) [Григорян A.C., 2006].

Наряду с костным мозгом, значительное количество мезенхимальных предшественников содержит жировая ткань. Данная популяция клеток, наряду с МСК костномозгового происхождения, способна к дифференцировке в различные клеточные типы под действием специфических факторов [Сухих Г.Т., Малайцев В.В., Богданова И.М. и др., 2002; Rajkumar К., Modric Т., Murphy L.J., 1999]. В то же время участие данной популяции в регенерации тканей путем мобилизации CK из резервных источников вызывает некоторые сомнения, что связано с отсутствием в жировой ткани цитоархитектоники, которая теоретически могла бы способствовать быстрому выходу CK в сосудистое русло, как это наблюдается в гемопоэтической ткани (диаметр капилляров, их фенестрированность и пр.) [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 20116].

1.3. Фармакологическая стратегия регенеративной медицины

Бурное развитие биомедицинской науки в области клеточных технологий в последние десятилетия позволило осуществить значительный «прорыв» в понимании биологии поли (мульти) потентных клеток-предшественников организма - стволовых клеток (CK) и возможности развития нового направления в лечении целого ряда заболеваний - клеточной терапии [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2006; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов ВВ. и др., 20096; Дыгай A.M., Артамонов A.B., Бекарев A.A. и др., 2011; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; Сухих Г.Т., Малайцев В.В., Богданова И.М., Дубровина И.В., 2002]. Считается, что ее методы найдут применение в лечении различных заболеваний сердечно-сосудистой системы, органов желудочно-кишечного тракта, нервной, эндокринной систем и опорно-двигательного аппарата [Kang S., Zhou С., Koga Y., Baba Т., 2003].

Согласно современным представлениям, организм животных обладает уникальным свойством лимитировать количество делений клеток с высоким пролиферативным потенциалом. В оптимальных условиях данное обстоятельство закономерно приводит к потере дочерними клетками возможности безграничной репопуляции и позволяет избежать их злокачественной либо доброкачественной трансформации [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 20116]. Однако механизмы, ограничивающие число делений, зачастую оказываются несостоятельными в отношении экзогенных и даже аутологичных МСК, что при введении низкодифференцированных популяций извне может привести к их безудержной пролиферации в организме реципиента и, как следствие -туморогенности [Torsvik A., Rjasland G.V., Svendsen А., 2010]. Клетки, извлеченные из физиологического местопребывания и адекватно неподготовленные (у них не переключается экспрессия генов, ответственных за проявление различных функций), при выполнении задач, «требуемых» от них

незамедлительно, безусловно, могут давать существенные сбои в своем развитии. Кроме того, при таком роде пересадках хорошо известны осложнения иммунного характера, в том числе, связанные с развитием реакции «трансплантат против хозяина» [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 20116]. Существенен для осторожного и взвешенного отношения к проведению трансплантаций материала, содержащего СК, и факт отсутствия пока технологий, позволяющих быть абсолютно уверенным в «оседании» пересаженных структур непосредственно в органе, нуждающемся во вмешательстве. Таким образом, клеточная терапия (в прямом понимании этого термина - трансплантация клеточного материала), хотя и открывает принципиально новые возможности медицины, но имеет лишь весьма отдаленные перспективы.

В то же время существует предложенная сотрудниками ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН альтернативная - фармакологическая стратегия клеточной терапии, заключающаяся в стимуляции функций эндогенных стволовых клеток с помощью фармакологических агентов [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., 2006; Дыгай A.M., Верещагин Е.И., Зюзьков Т.Н. и др., 2009; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2012]. При этом, учитывая тот факт, что наиболее перспективным направлением в настоящее время является разработка препаратов на основе аналогов эндогенных регуляторов функций - цитокинов, гормонов и других биологически активных веществ, наиболее физиологичным и целесообразным представляется проведение клеточной терапии с помощью лекарственных средств, подражающих действию естественных регуляторных систем функционирования СК в организме [Dygai A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V. et al., 2012].

При этом научной основой, обеспечившей целесообразность разработки данного направления регенеративной медицины, явились результаты фундаментальных исследований, проводимых в ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН по изучению роли различных пулов клеток-предшественников в

развитии и разрешении патологических процессов. Анализ данных, полученных на различных моделях патологических состояний (инфаркт миокарда [Ставрова JI.A., Фомина Т.И., Плотников М.Б. и др., 2005], хронический гепатит [Эпштейн О.И., Зюзьков Г.Н., Сотникова Н.В. и др., 2005], сахарный диабет [Ермакова H.H., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., 2007], энцефалопатии различного генеза [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2006; Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И., Дыгай A.M. и др., 2005], кожная рана [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., 2006]), показал во всех случаях развитие практически однотипных реакций со стороны прогениторных клеток, что свидетельствовало об их неспецифическом характере. Не зависимо от характера повреждений имела место активация мультипотентных CK гемопоэтической ткани, представляющей собой основное депо данных элементов в организме, которая, однако, не сопровождалась их мобилизацией в периферическую кровь. При этом повышения функциональной активности региональных предшественников органов-мишеней оказывалось недостаточным для компенсации вызываемых повреждений [Дыгай A.M., Артамонов A.B., Бекарев A.A. и др., 2011; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2011а]. Данные результаты позволили сотрудникам ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН сформулировать «Концепцию о недостаточности и несостоятельности механизмов регенерации глубокого резерва, связанных со CK тканей-депо» [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. 2011а; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2012]

С другой стороны, осуществление данного подхода стало возможным благодаря обнаружению и выделению субстанций, обладающих способностью активировать CK взрослого организма в их «тканях-депо», и вызывать выход в кровь [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др., 2008; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009].

На моделях инфаркта миокарда [Ставрова J1.A., Фомина Т.И., Плотников М.Б. и др., 2005], хронического гепатита [Эпштейн О.И., Зюзьков Г.Н.,

Сотникова H.B. и др., 2005], сахарного диабета [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009], энцефалопатий различного генеза [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2006; Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И., Дыгай A.M. и др., 2005] и кожной раны [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н., 2006] была

продемонстрирована высокая эффективность стимуляции миграционных

\

процессов мультипотентных CK костного мозга в органы-мишени Г-КСФ, сопряженная с его в разной степени выраженными терапевтическими эффектами. При этом последние, в свою очередь, определялись дифференцировкой мигрировавших CK либо в специализированные паренхиматозные клеточные типы, либо в элементы микроокружения, опосредованно ускоряющие течение репаративных процессов поврежденных тканей [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2011а; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2012].

Кроме того, была предпринята попытка управления регенераторным потенциалом CK путем воздействия на межклеточный матрикс. При этом наиболее эффективной является модификация свойств гиалуроновой кислоты (являющейся наиболее распространенным гликозаминогликаном в организме, связывающим in situ CK посредством специфических рецепторов [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2009а; Nedvetzki S., Gonen Е., Assayag N. et al., 2004; Noble P.W., 2002; Stern R., 2003; Zhu H., Mitsuhashi N., Klein A. et al., 2006] с помощью гиалуронидазы [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др., 2007а; Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M. и др., 2007; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др., 2008, 2009а; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов ВВ. и др., 20096].

Кроме того, показано выраженное кардиопротективное действие совместного применения SCF с Г-КСФ в терапии экспериментального инфаркта миокарда [Orlic D., Kajstura J., Chimenti S. et al., 2001].

Имеются литературные данные о положительном влиянии эритропоэтина на регенерацию миокарда после экспериментального инфаркта [Joyeux-Faure

M., Godin-Ribuot D., Ribuot С., 2005; Lipsic Е., Schoemaker R.G., van der Meer P. et al., 2006; Koul D., Dhar S., Chen-Scarabelli С. et al., 2007]. При этом в зоне ишемии отмечалось меньшее количество апоптозных клеток на фоне повышения экспрессии рецептора ЕРО и SDF-1. Предполагается, что эритропоэтин приводит к мобилизацции c-Kit+ и CD34+ стволовых клеток через усиленную экспрессию SDF-1 [Klopsch С., Furlani D., Gäbel R. et al., 2009]. Кардиопротективное действие эритропоэтина также связывают с эффектом неоваскуляризации [Hirata A., Minamino T., Asanuma H. et al., 2006; Prunier F., Pfister O., Hadri L. et al., 2007].

В разной мере выраженная активация плюрипотентных стволовых клеток в эксперименте показана под влиянием ряда других цитокинов (ГМ-КСФ, ФРФ, тромбопоэтин и др.) [Haas R., Murea S., 1995; Varas F., Bernad A., Bueren J.A., 1996].

В целом, полученные результаты свидетельствуют не только о принципиальной возможности модификации функций прогениторных клеток с помощью различных фармакологических агентов, созданных на основе эндогенных регуляторов, приводящих к ускорению регенерации тканей, но и о высокой перспективности их использования для терапии различных дегенеративных заболеваний.

1.4. Гиалуроновая кислота: биологическая роль и метаболизм

Гиалуроновая кислота (ГК, гиалуронат, гиалуронан) -мультифункциональный несульфатированный гликозаминогликан,

формирующий структурные основы межклеточного матрикса. ГК - линейный полимер из повторяющихся дисахаридных единиц, состоящих из глюкуроновой кислоты и N-ацетилгликозамина, соединенных поочерёдно ß( 1 —>4) и ß(l—>3)-гликозидными связями (рис.1). Молекула гиалуроновой кислоты может содержать до 25 000 таких дисахаридных звеньев.

Рис. 1. Повторяющееся дисахаридное звено гиалуроновой кислоты.

Природная гиалуроновая кислота имеет молекулярную массу от 5000 до 20000000 Да. В теле человека весом 70 кг в среднем содержится около 15 г ГК, треть из которой преобразуется (расщепляется или синтезируется) каждый день [Stern R., 2004].

В организме млекопитающих гиалуроновая кислота встречается повсеместно, являясь одним из основных компонентов межклеточного вещества, содержится во многих биологических жидкостях (слюне, синовиальной жидкости и т.д.). Вместе с тем она существенно отличается от других молекул гликозаминогликанов, по своим размерам, физико-химическим свойствам и особенностям синтеза [Prehm Р., 1984].

Синтез ГК осуществляется за счет 3 разных, но сцепленных гиалуронан-синтаз, HAS1, HAS2 и HAS3 [Itano N., Kimata К., 2002].

Данные ферменты со сложно устроенными трансмембранными доменами синтезируют ГК во внутренней поверхности плазмы мембраны вне комплекса Гольджи. Во время процесса синтеза, растущая полимерная цепь за счёт поочерёдного присоединения к исходному полисахариду глюкуроновой кислоты и N-ацетилглюкозамина, выделяется через мембрану в межклеточное пространство. Это обстоятельство противоречит способам синтеза других ГАГ, которые после синтеза ковалентно связываются к основаниям белков в комплексе Гольджи, образуя протеогликаны, и секретируются за счет существующих внеклеточных механизмов. Цепи ГК могут быть прикреплены к

поверхности клетки с помощью ферментов синтаз, либо через связывание поверхностных клеточных рецепторов, таких как CD44 или RHAMM (receptor for hyaluronic acid mediated motility). Таким образом, цепочки молекулы гиалуроновой кислоты во внеклеточном матриксе могут достигать огромных

5 7

размеров, до 10 и 10'Да. За счёт большой молекулярной массы и отрицательного заряда ГК создаёт определённую рыхлость ткани, а также место для подвижности клетки, уменьшает межклеточные контакты, тем самым препятствут межклеточной коммуникации и обладает способностью придавать подвижность клеткам воздействуя на их цитоскелет через высокоаффинные для неё рецепторы [Bourguignon L.Y., Zhu H., Shao L., Chen, Y.W., 2001].

Особенно в большом количестве ГК отмечается в межклеточном веществе эмбриональных и опухолевых тканей. Также имеет место временное увеличение содержания ГК в тканях в ранние сроки после повреждения [Longaker М.Т., Chiu E.S., Adzick N.S. et al., 1991]. При этом до недавнего времени считалось, что ГК - продукт исключительно стромальных клеток. Однако было показано, что эпителиальные клетки также могут синтезировать данный глюкозаминогликан [Pasonen-Seppanen S., Karvinen S., Torronen К. et al., 2003].

Внутри клетки ГК находится в специфических гранулах. По принципу гранул, содержащих гликоген, предлагается ввести понятие «гиалуросомы». Впервые в работах Mian N. (1986) описаны мультипротеиновые мембран -ассоциированные комплексы, в которых происходили процессы синтеза ГК. По мнению авторов, предполагается, что подобные структуры могут выполнять функцию «гиалуросом», в связи с их изоляцией от плазмы мембраной [Mian N., 1986].

В то же время ГК входит в состав гликокаликса клеток и является составной частью некоторых рецепторов к биологически активным веществам [Henry С. В., Duling В. R., 1999]. Всё это обеспечивает процессы морфогенеза в период эмбрионального развития, а также процессы восстановления

утраченных клеток в процессе обновления тканей и восстановления утраченных клеточных элементов в результате повреждения [Hood J.D., Cheresh D.A., 2002; HynesR.O., 2002].

Полученные в последние годы экспериментальные данные позволили значительно расширить представления о значении ГК в организме. При этом на сегодняшний день ей отводится роль не только «наполнителя» межклеточного пространства. В настоящее время известно, что ГК участвует в контроле таких процессов, как воспаление, репарация кожи, клеточная дифференцировка, ангиогенез и др.

Особенно значимо наблюдение о том, что молекулы ГК различной длины оказывают разные эффекты. Так, показано, что короткие цепи ГК обладают антиапоптотическим действием, стимулируют ангиогенез, являются индукторами белков теплового шока (ММ ~ 400-10000), более длинные -миграцию клеток и их пролиферацию (на примере фибробластов) (ММ ~ 50000100000), а высокомолекулярная ГК (ММ > 500000) вызывает противоположный эффект, подавляя ангиогенез, ингибируя клеточную миграцию, пролиферацию, а также продукцию интерлейкина-lß и простагландина Е2 клетками микроокружения [Termeer С., Sleeman J.P., Simon, J.С., 2003].

Однако убедительного объяснения данного феномена на сегодняшний день не существует, так же как не обнаружено и других систем, кроме системы «ГК - рецептор», которые могли бы менять характер сигнала при его передаче в зависимости от размера молекулы лиганда. Все лиганды к рецепторам адгезии условно можно разделить на группы белковой и не белковой природы. Так, к лигандам белковой природы относятся коллаген, фибронектин, витронектин, фибриноген и ламинин [Van der Flier А., Sonnenberg А., 2001]. Не протеиновыми являются такие соединения как гепарансульфат, хондроитинсульфат, кератинсульфат и гиалуроновая кислота [Heino J., Kapyla J., 2009].

В настоящее время считается, что основной рецептор ГК - CD44, который играет одну из ключевых ролей в процессах адгезии, пролиферации и дифференцировки клеток [Schmidt S, Friedl P., 2010]. CD44 -высокогликозилированный протеин, входящий в суперсемейство адгезивных молекул. На поверхности клетки рецептор экспрессируется в виде стандартной изоформы (CD44s) на всех типах клеток (в том числе и на прогениторных клеточных элементах) [Turley Е.А., Noble P.W., Bourguignon L.Y., 2002]. Данный антиген участвует в процессах дифференцировки, пролиферации, клеточной миграции, ангиогенеза, а также обеспечивает выведение некоторых протеаз на поверхность клетки [Schmidt S, Friedl P., 2010; Iczkowski K.A., 2011].

Гиалуроновая кислота связывается с рецептором CD44 через гиалуронан-связывающий экстрацеллюлярный домен (эктодомен) [Banerji S., Wright A.J., Noble M. et al., 2007]. Цитоплазматическая часть CD44 связана с тирозинкиназой c-Src, которая в свою очередь активирует через фосфорилирование протеин кортактин, связанный с актином цитоскелета [Bourguignon L.Y., Zhu H., Shao L., 2001]. Таким образом, через вторичные мессенжеры CD44 оказывает влияние на изменения состояния цитоскелета клетки [Singleton P.A., Bourguignon L.Y., 2004].

Молекула CD44 связана также с белками внутриклеточного матрикса через ГТФазы RhoA и Racl. Комплекс, состоящий из внутриклеточного домена CD44 и RhoA, связывается с Rho-киназой (ROK), что приводит к фосфорилированию и активации белков цитоскелета. Благодаря этому обеспечивается возможность подвижности клетки в межклеточном пространстве [Oliferenko S., Kaverina I., Small J. V., 2000]. Через G-белок Rae CD44 активирует металлопротеиназу AD AMI 7. Это приводит к изменению конфигурации клетки, вследствие чего в зоне механического растяжения клеточной мембраны активируются Са2+-каналы и происходит внеклеточный приток ионов Са2+. В результате поступления ионов Са2+ начинает действовать металлоротеиназа ADAM 10, что

в итоге сопровождается расщеплением эктодомена CD44, облегчая отделение клетки от ГК [Nagano О., Murakami D., Hartmann D. et al., 2004].

Помимо адгезирующей функции, CD44 выполняет роль ко-фактора для сигнальных рецепторов, таких как рецептор для c-Met (тирозин-киназы мезенхимально-эпителиального транзиторного фактора), к рецептору эпидермального фактора роста -ß (EGF-ß) [Orian-Rousseau V., Chen L., Sleeman J.P., 2002]. По данным Dimitroff C.J et al. (2001), на поверхности гемопоэтических прогениторных клетках CD34+ представлена гликозилированная изоформа CD44, которая служит лигандом для L- и Е-селектинов [Dimitroff C.J., Lee J.Y., Rafii S. et al., 2001]. Кроме того, с рецептором CD44 (с более слабой способностью связывания) способны связываться молекулы коллагена I и VI типов, фибронектин и ламинин, а также клеточные растворимые формы рецепторов, такие как Е- и L-селектин [Naor D., Nedvetzki S., Walmsley M. et al., 2007].

Впервые RHAMM (Receptor for HA Mediated Motility, CD 168) был описан в 1982 году [Turley Е.А., 1982] как поверхностный рецептор, обеспечивающий ГК-зависимую клеточную подвижность. Молекула RHAMM может выполнять функции как внутри клетки, так и будучи экспрессированной на её поверхности. Однако растворимая форма рецептора может вызвать арест клеточного цикла на фазах G2/M, подавляя экспрессию Cdc2/Cyclin В1 -комплекса протеинкиназы, крайне необходимого для осуществления митоза клетки [Mohapatra S., Yang X., Wright J.A., et al., 1996]. Внутриклеточный RHAMM также может функционировать как онкоген [Hall C.L., Yang В., Yang X., et al., 1995].

Механизм действия рецептора RHAMM на поверхности клетки на подвижность стволовой клетки связывают с функционированием молекул ERK1 и ERK2 (extracellular-regulated kinase 1, 2) [Hornberg, J.J., Binder В., Bruggeman F.J. et al., 2005]. В свою очередь ERK1 и ERK2 тесно связаны с изоформами МАРК (киназ), которые активируются под действием Мек-1 или -2

и регулируют сигнальные пути, контролирующие клеточную подвижность, ремоделирование цитоскелета и процесс миграции клеток в культуре [Bost F., Aouadi M., Carón L., Binetruy В., 2005]. В связи с этим, при отсутствии рецептора RHAMM нарушается процесс активации каскада ERK1,2, что приводит к невозможности миграции и адгезии клеточных элементов. Это подтверждается тем, что в культуре фибробластов, нокаутных по гену Rhamm (Rh-/-), наблюдается нарушение и/или полное отсутствие процессов митоза [Tolg С., Hamilton S.R., Nakrieko К.А. et al., 2006].

Предполагается, что внутриклеточная фракция RHAMM может непосредственно влиять на клеточную подвижность через прямое воздействие на цитоскелет клетки во время или после митотического деления [Cho R.J., Huang M., Campbell M.J. et al., 2001]. При обработке культуры фибробластов антителами против RHAMM подавляется подвижность клеток [Turley Е.А., Noble P.W., Bourguignon L.Y., 2002].

Гиалуроновая кислота и два ключевых гена HAS2 и RHAMM играют важную роль на ранних стадиях эмбриогенеза человека. В эмбриональных клетках наблюдается наибольший уровень синтеза RHAMM, по сравнению с более дифференцированными клетками. Ингибирование функций внутриклеточного RHAMM приводит к потере плюрипотентных свойств клетки и её жизнеспособности [Choudhary M., Zhang X., Stojkovic P. et al., 2007].

Помимо рецепторов к ГК на поверхности клетки имеются также гиалуронан-связывающие рецепторы внутри самой клетки. Все они входят в большую группу белков-гиаладгеринов. Кроме основных рецепторов CD44 и RHAMM в данную группу входят такие молекулы как CDC37 [Grammatikakis N., Grammatikakis A., Yoneda M. et al., 1995], RHAMM/IHABP [Assmann V. et al., 1998]. Рецептор CDC37 связан с протеинкиназами Raf и pp60v-Src-protein и представляет собой одну из главных молекул, регулирующих клеточный цикл [Grammatikakis N., Grammatikakis A., Yoneda M. et al., 1995; Huang L., Grammatikakis N., Toole B.P., 1998]. Гиалурон-связывающая молекула Р-32

также принимает участие в регуляции деления клетки, и одной из основных её функций является регуляция сплайсинга РНК [Gupta S., Batchu R.B., Datta К., 1991].

У млекопитающих ферментативное разрушение ГК является результатом активности гиалуронидазы. Под действием данного фермента происходит «пошаговое» уменьшение ГК на определенный квант длины и образование полимеров, способных оказывать различное влияние на многие биологические процессы и функциональную активность клеточных элементов [Дыгай А. М., Зюзьков Г. Н., Жданов В. В., 2009а; Noble P.W., 2002].

Первая классификация гиалуронидаз была представлена в работах Karl Meyer [Meyer К., 1971]. Было выделено три основных группы данного фермента.

Гиалуронидазы бактерий (Е.С. 4.2.99.1) - эндо-Р-ацетил-гексозаминидазы, которые функционируют как ß-элиминазы, с образованием дисахаридов в виде конечных продуктов. Большинство ферментов данной подгруппы имеют субстратную специфичность для ГК;

Гиалуронидазы - эндо-Р-глюкуронидазы (Е.С. 3.2.1.36) обнаружены у пиявок, а также у некоторых других паразитов и ракообразных. Конечными продуктами данного вида гиалуронидаз являются тетра- и гексасахара;

Гиалуронидазы млекопитающих (Е.С. 3.2.1.35). Гидролитическими продукатими их действия также являются тетра- и гексасахара. Они лишены абсолютной субстратной специфичности, так как способны к гидролизу других ГАГ (помимо гиалуроновой кислоты), таких как хондроитина и хондроитин-сульфата (CSs) видов C4-S и C6-S, хотя реакция расщепления данных субстратов идет более медленно.

Гиалуронидазы млекопитающих могут быть дополнительно подразделены на две группы: нейтрально-активные и кислотно-активные. Существует шесть гиалуронидаза-подобных генов в геноме человека, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4, HYALP1 и PH20/SPAM. Экспрессия каждого типа фермента уникальна

и зависит от типа ткани. Три гена (HYAL1, HYAL2, и HYAL3) расположены рядом на хромосоме 3р21.3, которые кодируют гиалуронидазы- 1 (Нуа1-1), Нуа1-2, и Нуа1-3 соответственно. Другие три гена HYAL4, PHYAL1 (псевдоген), и SPAM1 (Sperm Adhesion Molecule-1) группируются подобным способом на хромосоме 7q31.3. Они кодируют соответственно Нуа1-4 (данный ген у человека подвергается только транскрипции, трансляция отсутствует), и РН-20 (тестикулярная гиалуронидаза) [Csoka, А.В., Frost, G.I., Stern, R. 2001].

Известно, что Hyal-1 является основным лизосомальным ферментом и расщепляет гиалуроновую кислоту до тетрасахаридов [Frost G. I., Csóka А.В., Wong Т. et al., 1997]. На примере культур клеток НЕК 293 показано, что деградация ГК при участии Hyal-1 наблюдалась только внутри клетки, а активность Нуа1-1 строго зависит от наличия рецептора CD44 [Harada Н., Takahashi М., 2007].

Наследственный дефект отсутствия Нуа1-1 в литературе описан как мукополисахаридоз IX типа [Triggs-Raine В., Salo Т.J., Zhang Н. et al., 1999].

Hyal-2 связана с плазматической мембраной через гликозилфосфатидилинозитол (GPI), однако определённая часть Нуа1-2 существует также и в растворимой форме [Rai S.K., Duh F.M., Vigdorovich V. et al., 2001]. Hyal-2 расщепляет до конечных продуктов достаточно крупные молекулы ГК весом приблизительно 20 кДа, или содержащих приблизительно 50 дисахаридных единиц. Функционирование Нуа1-2, также как и Нуа1-1, зависит от наличия на клетке рецептора к CD44 [Harada Н., Takahashi М., 2007].

По результатам исследований на мышах нокаутных по гену Нуа12-/-показано, что эти животные являются жизнеспособными и фертильными. Однако фенотипически у данных мышей отмечается нарушение формирования костей, а также со стороны крови отмечается тромбоцитопения и внутрисосудистый гемолиз. Умеренная анемия сопровождается закономерным увеличением эритроидных прекурсоров в периферичесакой крови. При этом отмечается накопление железа в проксимальных канальцах почек. Накопления

ГК в соматических тканях не наблюдалось. Также у knockout мышей было выявлено 10-кратное увеличение содержания гиалуроновой кислоты в сыворотке крови. Однако при этом в периферических тканях накопления ГК не отмечалось. Последний факт связывают с компенсаторным функционированием других гиалуронидаз [Jadin L., Wu X., Ding H. et al., 2008].

Расщепление макромолекул ГК происходит за счёт последовательного действия сначала Нуа1-2 на поверхности клетки, а затем Нуа1-1 уже внутри лизосом. Первоначальная дефрагментация молекулы ГК происходит на поверхности клетки мемрбан-связанной Нуа1-2 до полимеров массой 20 кДа, далее фрагменты транспортируются внутрь клетки непосредственно в лизосомы, где Hyal-1 дефрагментирует промежуточные молекулы до дисахаридных остатков [Stern R., 2004; Harada H., Takahashi M., 2007]. Функционирование гиалуронидаз напрямую зависит от рН среды. Оптимум функционирования Нуа1-2 составляет рН 6.0-7.0 [Bourguignon, L. Y. et al., 2004].

На сегодняшний день имеется мало сведений относительно Нуа1-3. В небольшом количестве экспрессия Нуа1-3 отмечена в хондроцитах, в фибробластах (в процессе их дифференцировки в хондроциты) и в ткани яичек и костного мозга [Nicoll S.B., Barak О., Csoka А.В. et al., 2002]. Повышение экспрессии Hyal-3, также как и Нуа1-2, регулируется провоспалительными цитокинами, такими как IL-1 и TNF [Flannery C.R., Little C.B., Hughes C.E. et al., 1998]. По результатам исследования Hyal3-knockout (Hyal3-/-) мышей, были отмечены только небольшие изменения в толщине межальвеолярных стенок в тканях лёгких в возрасте особей 12-14 месяцев. В связи с этим принято считать, что Нуа1-3 не играет существенной роли в конститутивном расщеплении гиалуронидазы [Atmuri V., Martin D.C., Hemming R. et al., 2008].

PH-20 (тестикулярная гиалуронидаза) обнаружена в придатках яичка, в небольших количествах в молочных железах, в плаценте и тканях эмбриона [Beech D.J., Madan А.К., Deng N. et al., 2002]. PH-20 является относительно специфическим для ткани яичек. Изначально фермент синтезируется в виде

полипептида с молекулярной массой 64 кДа. В процессе созревания спермы молекула процессируется на два фрагмента связанных дисульфидными связями, с массами в 41-47 кДа и 27 кДа соответственно. Фермент имеет отдельный домен, необходимый для связывания с zona pelúcida в момент оплодотворения. Таким образом, РН-20 разрушает матрикс фолликулярного эпителия яйценосного бугорка (cumulus), который содержит в большом количестве гиалуроновую кислоту, и тем самым обеспечивает проникновение сперматозоида. В отличие от других гиалуронидаз данный энзим функционирует как в кислой, так и нейтральной среде [Kang W, Zhou С, Koga Y, Baba T., 2010].

Показано, что фрагментация ГК происходит при различных патологических процессах [Uchiyama H., Dobashi Y., Ohkouchi К., 1990].

В то же время в тканях и сыворотке крови существует значительное количество ингибиторов данных ферментов. При этом последствия уменьшения действия фермента могут быть собственно как негативными, так и позитивными. Например, ингибирование гиалуронидазы флавоноидами обуславливает их использование в качестве противоядия при укусах некоторых насекомых и змей [Kuppusamy U.R., Das N.P., 1991].

Одним из наиболее известных инактиваторов гиалуронидазы в сыворотке крови является гепарин. Предполагается, что подавление ферментативной активности фермента гепарином осуществляется за счёт формирования гидрофобных взаимодействий и перестройки водородных связей в молекуле гиалуронидазы. Подобное подавление гликолитической активности гепарином возможно избежать при модификации молекулы гиалуронидазы за счёт присоединения поверхностных функциональных аминогрупп фермента к альдегиддекстрану [Максименко А. В., Щечилина Ю. В., Тищенко Е. Г. и др., 2001].

Помимо гепарина, извстно также о существовании ещё одного ингибитора гиалуронидаз - inter-a-inhibitor (lai), найденного в бычьей сыворотке. Молекула

Ial представляет собой магний-содержащий термолабильный фермент с высокой молекулярной массой. Он относится к семейству ингибиторов протеаз плазмы типа Кунитца, с молекулярной массой от 130 до 240 кДа [Chen L., Zhang H., Powers R.W. et al., 1996]. Оригинальная изоформа Ial состоит из двух тяжёлых и одной лёгкой цепи. Три полипептидные цепи ковалентно связаны хондроитинсульфатной цепью. В эксперименте на мышах уровень ингибитора повышается при введении четырёххлористого углерода, а также ИЛ-1, индукторов острой фазы воспаления [Mio К., Stern R., 2002].

1.5. Фармакологические свойства гиалуронидазы и регуляция функций прогениторных клеток с ее помощью

В настоящее время существует несколько официнальных препаратов гиалуронидазы. Широкое распространение получили «Лидаза» и «Ронидаза». Данные препараты получают из семенников крупного рогатого скота (тестикулярная гиалуронидаза). «Лидаза» представляет собой лиофилизированный порошок и используется как для парентерального (подкожного, внутримышечного), так и ингаляционного применения. При проведении гель-фильтрации «Лидазы» возможно получение электрофоретически относительно гомогенного препарата. Его сравнительная молекулярная масса составляет 60-68 кДа. По другим литературным данным молекулярная масса гиалуронидазы может находиться в интервале 60-90 кДа. рН-оптимум ферментативной деполимеризации гиалуроновой кислоты приходится на рН 5,0-6,0 [Максименко А. В., Щечилина Ю. В., Тищенко Е. Г., 2001].

В современной клинической практике препараты гиалуронидазы с осторожностью применяют у онкологических больных, т.к. по различным данным увеличение эндогенных гиалуронидаз кореллирует с опухолевой прогрессией [Lokeshwar V.B., Rubinowicz D., Schroeder G.L. et al., 2001]. Однако

согласно другим исследованиям совместное применение препаратов гиалуронидазы с противоопухолевыми препаратами способствует более эффективному воздействию последних [Klocker J., Sabitzer H., Raunik W. et al., 1998]. Это обеспечивается как за счёт лучшего проникновения цитостатических препаратов, так и противоопухолевых свойств самого энзима [Beckenlehner К., Bannke S., Spruss T. et al., 1992]. Более того, в эксперименте показано, что рост опухолевых клеток, трансплантированных SCID-мышам (SCID - тяжелые комбинированные иммунодефицита), значительно регрессирует при введении гиалуронидазы [Shuster S., Frost G.I., Csoka A.B. et al., 2002].

Вместе с тем, выявленные на примере фибробластов и магрофагов свойства полимеров ГК с различной молекулярной массой оказывать разное влияние на «клеточное поведение» [Noble P.W., 2002; Stern R., 2003] послужило основой для инициирования изучения возможности управления ростовым потенциалом прогениторных клеток путем дозированного расщепления данного гликозаминогликана с помощью введения разных доз гиалуронидазы in vivo.

В ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН был проведен цикл фундаментальных исследований, при которых в условиях in vitro и in vivo была показана возможность модификаций функций прогениторных клеток различных классов с помощью нативной гиалуронидазы [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н, 2007а, б; Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M. и др., 2007]. В частности, было показано, что введение относительно низких доз нативной гиалуронидазы (1000 ЕД/кг) приводит к существенному возрастанию функциональной активности как коммитированных стромальных и кроветворных, так и мультипотентных мезенхимальных клеток-предшественников в гемопоэтической ткани. Указанные изменения определяются образованием под действием фермента большого количества низко- и среднемолекулярных форм ГК, способных стимулировать процессы пролиферации и дифференцировки клеточных элементов [Noble P.W., 2002;

Stern R., 2003], а также потенцированием специфической активности ростовых факторов, активных в их отношении, за счет модификации свойств рецепторов клеток-мишеней под влиянием гиалуронидазы [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 20116, 2012].

В то же время увеличение степени деградации ГК за счет использования высоких доз фермента (5000 ЕД/кг) приводит к разобщению процессов их пролиферации и дифференцировки. Полученные результаты свидетельствуют о значительном нарушении функционирования прогениторных элементов в данном случае, в том числе, ГК гликокаликса клеток и их рецепторов к биологически активным веществам, в состав которых входит ГК [Henry C.B., Duling, B.R., 1999].

Вместе с тем, учитывая потенциальную важную роль CK тканей-депо в восстановлении пораженных органов, особенно интересными представляются сведения о влиянии гиалуронидазы на процесс их выхода в циркуляцию. При этом, несмотря на то, что у фермента нет самостоятельной мобилизующей активности, его использование на моделях стимуляции выхода CK в кровь (с помощью Г-КСФ) и при экстремальных воздействиях приводит к значительному усилению выраженности данного феномена. При этом максимальные изменения регистрируются со стороны мультипотентных МСК, обладающих наибольшим ростовым и регенеративным потенциалом [Сухих Г.Т., Малайцев В.В., И.М. Богданова и др., 2002; Augello A., Kurth Т.В., De Bari С., 2010]. Так, совместное введение гиалуронидазы с Г-КСФ (наиболее эффективного среди известных мобилизующего фармакологического агента) сопровождается повышением количества циркулирующих МСК до 1000% от фона, что в 3 раза выше, чем при использовании только Г-КСФ [Дыгай А. М., Зюзьков Г. Н., Жданов В. В., 20096].

При этом обнаружено, что реализация данных феноменов определяется исключительно влиянием фермента на строму гемопоэтической ткани. В то время как функциональная активность самих клеток-предшественников после

воздействия гиалуронидазы, напротив, существенно возрастает, что, безусловно, представляется важным в плане возможного практического использования фракции мононуклеаров периферической крови, полученной после совместного применения Г-КСФ и гиалуронидазы, для их трансплантации [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 20096].

Кроме того, при изучении влияния фермента на систему крови и фармакологическую активность гемостимуляторов было выявлено, что гиалуронидаза усиливает специфическое действие Г-КСФ на функциональную активность КОЕ-ГМ, и эритропоэтина на КОЕ-Э [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 20116].

Причем указанные сдвиги со стороны пула родоначальных клеток сопровождаются закономерными изменениями картины костного мозга и периферической крови, заключающимися в стимуляции процессов кроветворения в норме и при моделировании цитостатической миелосупрессии [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др., 2008, 20096]. Указанное обстоятельство косвенно свидетельствует о высокой сопряженности всех этапов развития прогениторных элементов под влиянием гиалуронидазы (от предшественников до зрелых клеток) [Дыгай А. М., Зюзьков Г. Н., Жданов В. В., 20096].

Более того, для изучения сохранности функциональной способности СК к реализации ростового потенциала после воздействия на них ГД были проведены эксперименты по сравнительному изучению терапевтической активности мононуклеаров периферической крови, полученных после введения Г-КСФ и совместного применения цитокина с ферментом [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 20096, 20106]. Эксперименты проводились в условиях цитостатической миелосупрессии, вызванной 5-фторурацилом. В ходе работы была показана значительно более высокая эффективность трансплантанта, полученного после введения обоих препаратов. При этом механизмами, лежащими в основе регенерации кроветворной ткани являлось не

только увеличение пула кроветворных прекурсоров, но и быстрое структурно-функциональное восстановление гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 20096].

Таким образом, введение гиалуронидазы способно приводить к выраженной стимуляции процессов пролиферации и дифференцировки стволовых клеток различных классов, и их мобилизации в периферическую кровь. При этом факторами, определяющими развитие указанных феноменов, является не только модификация свойств межклеточного матрикса, но и изменение секреторной и связывающей способностей клеточных элементов микроокружения, а также свойств самих клеток-предшественников. Причем, что касается последнего обстоятельства, то оно заключается как в повышении их адгезивной способности, так и в существенном повышении восприимчивости к регуляторным стимулам [Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., Жданов В.В., 20076; Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., Жданов В.В., 20116].

В целом, сведения литературы свидетельствуют о возможности рассмотрения гиалуронидазы в качестве средства для регенеративной медицины. Однако белковая природа фермента, как и других эффективных эндогенных регуляторов функций прогениторных клеток, а также значительное количество факторов его деградации в организме, предопределяет возможность стимуляции эндогенных родоначальных клеток с помощью его введения in vivo лишь в дозах существенно превышающих терапевтически допустимые, что изначально делает невозможным широкое практическое применение данного фермента в качестве препарата для лечения дегенеративных заболеваний, когда предполагается длительное, многократно повторяющимися курсами, введение фармакологического агента [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009; Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., Жданов В.В. и др., 20116]. В связи с этим в мире активно ведется поиск путей снижения токсических эффектов модификаторов функций стволовых клеток, в том числе с помощью нанотехнологий.

1.6. Нанотехнология электронно-лучевого синтеза

В настоящее время известны и достаточно активно разрабатываются шесть основных нанотехнологических платформ в фармакологии, различающихся по физико-химической структуре создаваемых с их помощью конструкций: наносферы, нанооболочки (представленные в основном липосомами), полимеросомы, дендримеры, полимерные мицеллы и конъюгаты полимер-лекарственное вещество [Дыгай А.М., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2010а, 20116; Kim B.Y., Rutka J.T., Chan W.C., 2010; Nakhlband A., Barar J., Bidmeshkipour A. et al., 2010]. Основными задачами создания нанотехно логичных лекарственных веществ во всех случаях являются: преодоление тканевых барьеров, уменьшение побочных эффектов (токсичности, аллергенности) и повышение эффективности (в основном за счет увеличения времени жизни лекарственного препарата в организме). Кроме того, активно исследуется проблема обеспечения адресной доставки лекарственных веществ, которая, однако, в настоящее время далека от ее практического решения. При этом следует отметить, что подавляющее большинство указанных направлений находится лишь на ранней стадии развития и имеют пока исключительно научное значение.

В то же время существуют и реальные достижения в области применения нанотехнологий в фармакологии, в первую очередь, связанные с хорошо зарекомендовавшими в клинике конъюгированными с полиэтиленгликолем (ПЭГ) препаратами на основе белков (пегасис, пегфилграстим, мирцера и др.), а сам ПЭГ зарегистрирован U.S. Food and Drug Administration (FDA) в качестве нетоксичного средства для мультицелевого, в том числе пищевого, назначения (с указанием практически отсутствия токсичной дозы) [Kobbe G., Bruns I., Fenk R. et al., 2009; Mallorquí J., Gutiérrez-Gallego R., Segura J. et al., 2010]. .

ПЭГ амфифильный и химически инертный полимер, состоящий из повторяющихся единиц оксида этилена. Полимер разделяют на два основных

класса: линейный и разветвленный, с двумя или одной свободной гидроксильной группой на концах. Реакция пегиляции начинается с активации молекулы ПЭГ (присоединение электрофильных реактивных групп к ОН-группе), сопровождающейся дальнейшим присоединением функциональных реактивных групп активированного полимера к определенным структурам белка, как правило, к амино-, сульфгидрйльной или другой нуклеофильной группе [Hamidi M., Azadi A., Rafïei P., 2006]. Высокая гидрофильность молекулы ПЭГ приводит к появлению принципиально новых физико-химических свойств измененного пептида. Наличие атомов водорода позволяет одной молекуле ПЭГ связывать 2-3 молекулы воды, тем самым, при присоединении, по крайней мере, нескольких молекул ПЭГ, формируется «водное облако» вокруг пегилированной частицы, увеличивающее ее гидродинамический радиус. Указанные изменения существенно повышают растворимость и биодоступность модифицированной молекулы, а также защищают ее от опсонизирующих факторов и фагоцитоза, обеспечивая «невидимость» для системы мононуклеарных фагоцитов, иммуноглобулинов и факторов комплемента за счет перекрытия антигенных детерминант (эпитопов) [Maullu С., Raimondo D., Caboi F. et al., 2009; Huang Z., Ni С., Chu Y., Wang S. et al., 2009].

Таким образом, пегилированные препараты становятся более стабильными, растворимыми, с более значительным периодом полувыведения из организма, чем их немодифицированные аналоги, и практически неиммуногенными [Дыгай A.M., Артамонов A.B., Бекарев A.A. и др., 2011; Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2011а]. При этом во всех случаях для их получения применяется технология пегилирования химического синтеза, которая, несмотря на успешность ее использования, имеет и ряд существенных недостатков. Химический синтез конъюгатов «полимер-лекарство» является весьма сложным многоступенчатым и дорогостоящим технологическим процессом, с применением высокотоксичных реагентов, требующих

использование многочисленных стадий очистки с целью получения гомогенной популяции модифицированных молекул.

В то же время существует нанотехнология радиационного (электроннолучевого) синтеза (разработана совместно Институтом ядерной физики СО РАН, Институтом цитологии и генетики СО РАН и ООО «Саентифик фьючер менеджмент»), позволяющая получать практически нетоксичные и неиммуногенные белковые препараты [Артамонов A.B., Бекарев A.A., Верещагин Е.И. и др., 2010а,б]. Более того, данные вещества оказываются еще в значительной степени защищенными от протеолитических ферментов, что делает возможным их эффективное пероральное использование.

В ходе разработки данной технологии было доказано, что гидрофильные полимеры, такие как полиэтиленгликоль, гидроксиэтиленкрахмал, поливинилпирролидон и другие под воздействием направленного потока ускоренных электронов с заданными свойствами могут быть связаны с биологически активными веществами путем адсорбции на их поверхности или образования стойких химических связей [Артамонов A.B., Бекарев A.A., Верещагин Е.И. и др., 20106]. При этом может происходить значительная модификация свойств «активного начала», способная приводить к повышению его стабильности, увеличению периода полувыведения, снижению токсичности и увеличению избирательности действия за счет качественных изменений фармакокинетических и фармакодинамических параметров [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2011а]. При этом в основе появления новых эффектов у препаратов, представляющих собой белки, конъюгированные с полимерами, лежат изменения их физико-химических свойств и стереохимической структуры [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 201 la; El-Komy М.Н., Widness J.A., Veng-Pedersen P., 2011].

Воздействие ионизирующего излучения приводит к активации в молекуле полимера реакционных групп и их взаимодействию с атомами азота Е-аминогруппы лизина или имидазольной группы гистидина в белковых

молекулах, что приводит к образованию химических, в том числе ковалентных связей. При этом, варьируя дозой облучения можно получать конъюгаты, имеющие различную массу и стереохимическую структуру. Длительность процесса получения конъюгатов с разнообразным дизайном лекарственных препаратов составляет 2-10 мин, а процесс получения конъюгатов может быть одно- или двух стадийным. В случае если белковая, полисахаридная или олигонуклеотидная структура (фармакологически активное вещество) остается стабильной в условиях облучения, то процесс образования конъюгатов можно проводить в один этап путем облучения смеси водного раствора полимерного носителя и лекарственного вещества. Если же при радиационном воздействии биологически активное соединение теряет свои фармакологические свойства -используется двухступенчатый подход: облучение только полимерного носителя с последующим смешиванием его с активной формой лекарственной субстанции [Артамонов A.A., Гришин О.В., Троицкий A.B. и др., 2006].

Применение описанной технологии позволяет создавать устойчивые водорастворимые конъюгаты полимеров и белковых фармакологических препаратов размерами 20-100 нм, обладающих еще и значительной устойчивостью к протеолитическим ферментам. Данная технология успешно применяется для получения, в том числе энтеральных форм некоторых биологически активных веществ - фармакологических агентов. При этом исследование методом электронно-парамагнитного резонанса полученных конъюгатов показало отсутствие каких-либо парамагнитных частиц (радикалов, ионов и т.д.) в получаемых растворах белок - ПЭГ [Дубровин A.B., Мирошников П.Н., 2010].

Использование указанной технологии при совместном участии ООО «Саентифик фьючер менеджмент» (г. Новосибирск) и НИИ фармакологии СО РАМН (г. Томск) позволило разработать целый ряд новых фармакологических средств, обладающих, в той или иной мере, уникальными характеристиками и

преимуществами перед существующими аналогами (нативными соединениями).

В настоящее время в Федеральной службе по надзору в сфере здравоохранения и социального развития зарегистрирован и выпускается промышленностью препарат Тромбовазим (ООО «Саентифик фьючер менеджмент», Россия), представляющий собой иммобилизированные с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза на ПЭГ, с молекулярной массой 1,5 кДа, протеазы, продуцируемые Bacillus Subtilis [Артамонов A.A., Гришин О.В., Троицкий A.B. и др., 2006].

В экспериментальных и клинических исследованиях показано, что внутривенное и пероральное введение Тромбовазима приводит к уменьшению концентрации в кровотоке тромбогенного фибрина, снижению степени тромбинемии и нормализации показателей внутрисосудистого микротробообразования [Буевич Е.И., Котовщикова Е.Ф., Сюльжина E.H. и др., 2009].

Синтезированы и исследуются препараты, полученные с использованием данной технологии для лечения сахарного диабета и его осложнений: иммобилизированный инсулин, проинсулин и С-пептид [Артамонов A.B., Родионов П.И., 2008].

Кроме того, продемонстрирована возможность создания высокоэффективных, в том числе и при пероральном приеме, гемостимулирующих средств. В частности, был разработан иммобилизированный с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза эритропоэтина-а. На модели миелосупрессии, вызванной введением карбоплатина, показано, что как подкожное, так и пероральное его применение приводит к значительной стимуляции эритропоэза, определяемой повышением пролиферативной активности и скорости созревания эритроидных клеток-предшественников [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2011в].

Особый интерес среди средств, разработанных с помощью данной технологии, представляет препарат для регенеративной медицины -пегилированная гиалуронат-эндо-Р-Ы-ацетилгексозаминидаза (тестикулярная гиалуронидаза) [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др., 2011г]. На сегодняшний день в мировой литературе не описано веществ, обладающих столь выраженным действием на столь значительное количество функций родоначальных элементов и механизмы их регуляции.

Сотрудниками ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН в эксперименте продемонстрирована выраженная стимулирующая активность данного соединения в условиях in vivo и in vitro в отношении клеток-предшественников различных классов. Показано, что введение имГД интактным животным в очень низких дозах (1 ЕД/мышь и ниже), в том числе перорально, сопровождается значительной активацией мультипотентных и коммитированных (мезенхимальных и кроветворных) родоначальных элементов костного мозга, представляющего собой основное депо CK в организме, и регионарных CK различных органов [Чайковский A.B., Зюзьков Г.Н., 2010].

Кроме того, активно разрабатываются и другие иммобилизированные под воздействием ионизирующей радиации биологически активные вещества: олигонуклеотиды, соматотропный гормон, интерферон-у, интерлейкин-2 и пр. При этом во всех случаях выявлена в разной мере выраженная специфическая фармакологическая активность данных соединений и показано отсутствие общей и специфической токсичности, свидетельствующее об их высокой безопасности [Артамонов A.B., Бекарев A.A., Верещагин Е.И. и др., 20106].

Таким образом, нанотехнология электронно-лучевого (радиационного) синтеза позволяет получать высокоэффективные и максимально безопасные, низкоиммуногенные и практически нетоксичные, фармакологические средства, представляющие собой соединения белковой природы, конъюгированные с низкомолекулярными носителями. Кроме того, полученные с помощью

ионизирующей радиации вещества оказываются в значительной степени защищенными от воздействия протеолитических ферментов, что делает возможным их использование per os - наиболее простым, удобным и «популярным» у потенциальных потребителей способом - в виде таблеток, капсул, суспензий, суппозиториев. При этом наличие альтернативных путей .введения белковых препаратов особенно актуальным представляется для средств регенеративной медицины, так как в данном случае предполагается весьма длительное использование фармакологических агентов [Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., 2009].

Вместе с тем известно, что процесс манипуляции разнородными субстанциями на молекулярном уровне с использованием физических факторов, обладающих высокой энергией, может сопровождаться существенными изменениями стереохимической структуры исходных веществ и зачастую приводить к непредсказуемой модификации их свойств [Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др., 2008]. Данное обстоятельство, особенно, учитывая результаты экспериментальных исследований, свидетельствующие о строгой обусловленности свойств пегилированных соединений природой и структурой исходного вещества [Caliceti P., Veronese F.M., 2003], делают, во многом, невозможным точное прогнозирование фармакологических свойств конъюгатов ПЭГ - лекарственное средство.

В связи с этим разработка препаратов, получаемых с помощью ионизирующего излучения, требует не только исследования их специфической активности и токсичности в рамках существующих рекомендаций по доклиническому изучению новых фармакологических веществ [Хабриев Р.У., 2005], но и глубокого изучения механизмов действия, что, помимо, большого научного интереса, представляет собой в данном случае еще и важный фактор для определения оптимальных режимов применения фармакологических агентов подобного рода.

1.7. Заключение

Фармакологическое действие существующих гепатопротекторов направлено преимущественно на защиту, либо стимуляцию сохранившихся клеточных элементов печени. Однако данная концепция фармакологического вмешательства в ряде случаев оказывается абсолютно несостоятельной. В связи с этим актуальным представляется разработка гепатопротекторов с принципиально иными механизмами действия, среди которых особый интерес представляет активация «глубокого резерва» регенерации, связанного с эндогенными прогениторными элементами печени и стволовыми клетками тканей-депо.

Полученные в последние годы сведения о специфических эффектах гиалуронидазы в отношении функций прогениторных клеток различных классов свидетельствуют о высокой эффективности управления их ростовым потенциалом с помощью данного фармакологического агента. Вместе с тем значительное количество факторов деградации фермента в организме предопределяет возможность стимуляции эндогенных родоначальных клеток с помощью его введения in vivo лишь в дозах существенно превышающих терапевтически допустимые, что делает невозможным создание на основе нативной гиалуронидазы безопасного средства для регенеративной медицины.

Вместе с тем несомненную перспективу имеет разработка пегилированного с использованием нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы. Известно, что получаемые указанным способом белковые препараты обладают повышенной устойчивостью к факторам деградации на фоне резкого снижения их токсичности. Кроме того, пегилированные с применением ионизирующей радиации субстанции оказываются в значительной степени защищенными от воздействия протеолитических ферментов, что делает эффективным их использование per os, представляющее

собой наиболее комплаентный путь введения средств для регенеративной медицины.

В связи с вышеизложенным весьма актуальным представляется создание гепатопротекторного средства на основе пегилированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы. При этом, учитывая абсолютную новизну разработки препарата для регенеративной медицины на основе модификатора функций СК, стимулирующего, в том числе и их выход из костного мозга (во многом, определяющего состояние системы крови, обеспечивающей поддержание гомеостаза и течение восстановительных процессов в организме), необходимым является не только детальное изучение гепатопротекторных эффектов средства и механизмов их развития, но и исследование его влияния на процессы кроветворения.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Маркова, Туяна Сергеевна

ВЫВОДЫ:

1. Введение пегилированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы при моделировании хронического токсического гепатита оказывает выраженное противовоспалительное, противосклеротическое и антихолестатическое действие.

2. Механизмом терапевтического действия Пэг-ГД является стимуляция регенераторных процессов в печени, связанная с активацией регионарных печеночных клеток-предшественников и направленной миграцией мультипотентных мезенхимальных СК костного мозга в орган-мишень.

3. Реализация компенсаторных изменений функционирования резервных систем клеточного обновления в печени при введении Пэг-ГД связана с возрастанием выработки клеточными элементами микроокружения гуморальных регуляторов, стимулирующих КОЕ-Печ, на фоне повышения их восприимчивости к регуляторным стимулам.

4. Отсутствие мобилизации клеток-предшественников костного мозга в периферическую кровь при моделировании хронического токсического гепатита связано с повышением продукции совокупности факторов, обеспечивающих кооперацию СК с элементами микроокружения, несмотря на снижение выработки ими 80Р-1. При этом не наблюдается усиления хоминга в печень циркулирующих в кровотоке регенераторно-компетентных клеток вследствие уменьшения синтеза связывающих их веществ стромальными элементами печени.

5. Мобилизация в периферическую кровь и миграция костномозговых клеток-предшественников в пораженную патологическим процессом ткань печени под влиянием Пэг-ГД определяется снижением продукции хемоаттрактантов СК стромальными клетками костного мозга на фоне увеличения их выработки элементами микроокружения органа-мишени.

6. Введение Пэг-ГД в условиях моделирования хронического гепатита сопровождается увеличением содержания кроветворных прекурсоров в гемопоэтической ткани на фоне падения скорости их созревания. При этом наблюдается кратковременное уменьшение числа нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге и ускорение восстановления количества нейтрофилов в периферической крови.

1.7. Заключение

Фармакологическое действие существующих гепатопротекторов направлено преимущественно на защиту, либо стимуляцию сохранившихся клеточных элементов печени. Однако данная концепция фармакологического вмешательства в ряде случаев оказывается абсолютно несостоятельной. В связи с этим актуальным представляется разработка гепатопротекторов с принципиально иными механизмами действия, среди которых особый интерес представляет активация «глубокого резерва» регенерации, связанного с эндогенными прогениторными элементами печени и стволовыми клетками тканей-депо.

Полученные в последние годы сведения о специфических эффектах гиалуронидазы в отношении функций прогениторных клеток различных классов свидетельствуют о высокой эффективности управления их ростовым потенциалом с помощью данного фармакологического агента. Вместе с тем значительное количество факторов деградации фермента в организме предопределяет возможность стимуляции эндогенных родоначальных клеток с помощью его введения in vivo лишь в дозах существенно превышающих терапевтически допустимые, что делает невозможным создание на основе нативной гиалуронидазы безопасного средства для регенеративной медицины.

Вместе с тем несомненную перспективу имеет разработка пегилированного с использованием нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы. Известно, что получаемые указанным способом белковые препараты обладают повышенной устойчивостью к факторам деградации на фоне резкого снижения их токсичности. Кроме того, пегилированные с применением ионизирующей радиации субстанции оказываются в значительной степени защищенными от воздействия протеолитических ферментов, что делает эффективным их использование per os, представляющее собой наиболее комплаентный путь введения средств для регенеративной медицины.

В связи с вышеизложенным весьма актуальным представляется создание гепатопротекторного средства на основе пегилированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы. При этом, учитывая абсолютную новизну разработки препарата для регенеративной медицины на основе модификатора функций СК, стимулирующего, в том числе и их выход из костного мозга (во многом, определяющего состояние системы крови, обеспечивающей поддержание гомеостаза и течение восстановительных процессов в организме), необходимым является не только детальное изучение гепатопротекторных эффектов средства и механизмов их развития, но и исследование его влияния на процессы кроветворения.

ГЛАВА 2

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты были выполнены на 74 беспородных крысах, массой 250300 г, и 298 мышах линии CBA/CaLac обоего пола в возрасте 2-х месяцев, массой 18-20 г. Мыши 1 категории, конвенциональные линейные животные, получены из отдела экспериментальных биологических моделей ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (сертификат имеется).

С целью исключения сезонных колебаний изучаемых показателей все эксперименты были проведены в осенне-зимний период. До начала исследования экспериментальных животных выдерживали в течение недели на обычном пищевом режиме по 15-20 особей в пластиковых клетках. Условия содержания соответствуют стандартам, указанным в руководстве Principles on Good Laboratory Practice «Принципы надлежащей лабораторной практики» (идентичен GLP OECD). Животных подвергали эвтаназии (безболезненное умерщвление животного), которая была произведена ответственным лицом в соответствии с требованиями, принятыми в институте, путем ингаляции С02.

Распределение животных по сериям экспериментов в соответствии с поставленными задачами представлено в таблице 1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Маркова, Туяна Сергеевна, 2013 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:

1. Абдурахманов Д.Т. Противовирусная терапия и регресс фиброза печени при хроническом гепатите В // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2010. - №1. - С. 14-20.

2. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М.: Медицина, 1990. -382 с.

3. Артамонов A.B., Бекарев A.A., Верещагин Е.И. и др. Средство, увеличивающее резерв стволовых клеток в организме // Бюл. изобр. - 2010а. -№ 34 (Патент (RU) № 2405822).

4. Артамонов A.B., Бекарев A.A., Верещагин Е.И. и др. Средство для регенеративной медицины // Бюл. изобр. - 20106. - №35 (Патент (RU) № 2406528).

5. Артамонов A.A., Гришин О.В., Троицкий A.B. и др. Способ получения водорастворимого иммобилизированного ферментного препарата протеаз // Бюл. изобр. - 2006. - №6 (Патент (RU) № 2270861).

6. Артамонов A.B., Родионов П.И. Способ получения препарата инсулина для перорального применения // Бюл. изобр. - 2008. - №4 (Патент (RU)№ 2316339).

7. Аскаров М.Б., Шумаков В.И., Онищенко H.A. Мультипотентные стромальные мезенхимальные клетки аутологичного костного мозга ускоряют заживление длительно незаживающих язв желудка // Вестник хирурнии им И.И. Грекова. - 2009. - №2. - С.22-26.

8. Афанасьев В.В., Лукьянова И.Ю. Анализ фармакогенеза и алгоритм определения побочного действия лекарств на примере комбинаций глиатилина, фосфолипидов и цитофлавина: Доклады на 1-й Всероссийской конференции клинической фармакологии. Спб.: ВМедА, 2006.

9. Байматов В.Н. Морфологические и биохимические изменения в организме животных и человека при патологии печени / Под ред. В.Н. Байматова, Э.Г. Давлетова. М.: 1998. - 186с.

10. Белобородова Э. И., Венгеровский А. И., Лившиц И. К., Белобородова Е. В., Бурковская В. А., Кузьменко Д. И., Пурлик И. Л. Применение отечественного гепатопротектора липроксола в комплексном лечении у больных хроническим вирусным гепатитом // Сибирский медицинский журнал (Томск). - 2009. - №4-1. - С. 76-78.

11. Блюм Х.Е. Гепатоцеллюлярная карцинома: современное состояние проблемы // Рос. журн. гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. -2005.-Т. 2, № 14.-С. 33-41.

12. Буеверов А.О. Место гепатопротекторов в лечении заболеваний печени // Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол. и колопроктол. - 2002. -№ 4. - С. 21-25.

13. Буевич Е.И., Котовщикова Е.Ф., Сюльжина E.H. и др. О состоянии эндотелия при остром инфаркте до и после приема тромбовазима // Тромбоз, гемостаз и реология. - 2009. - №3. - С. 33-37.

14. Венгеровский А.И., Саратиков A.C. Механизм действия гепатопротекторов при токсических поражениях печени // Фармакология и токсикология. - 1988. - № 1. - С. 89-92.

15. Венгеровский А.И., Батурина Н.О., Чучалин B.C. и др. Влияние гепатопротекторов, содержащих полифенолы, на течение экспериментального хронического гепатита // Химико-фармацевтический журнал. - 1996. - №2. - С. 3-4.

16. Венгеровский А.И., Маркова И.В., Саратиков A.C. Доклиническое изучение гепатозащитных средств // Ведомости фармакологического комитета. - 1999. - №2.-С. 9-12.

17. Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - № 4. - С. 80-84.

18. Ганичева JI.M., Рогов В.А. Тенденции развития российского и регионального волгоградского рынков гепатопротекторных лекарственных средств за 2006-2010 гг. //Бюл. Волгоградского науч. центра РАМН. - 2010. -№3.-С. 71-83.

19. Глушенков Д.В., Павлов Ч.С., Маевская М.В., Ивашкин В.Т. Возможности эластометрии и фибротеста в диагностике цирроза печени // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2008. - Т. 18, №1, прил. №31 -С.9.

20. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии с атласом микрофотограмм. Томск : Изд-во Том. ун-та, 1989. — 369 с.

21. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культур ткани в гематологии / Под ред. доктора мед. наук Новицкого В.В. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1992.-272 с.

22. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Удут В.В. и др. Закономерности структурной организации систем жизнеобеспечения в норме и при развитии патологического процесса. Томск, 1996. - 304 с.

23. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск: STT, 1999. - 128 с.

24. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. Участие мезенхимальных клеток-предшественников в заживлении ран на модели кожного лоскута // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2006. - №3. -С. 132-134.

25. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Гипоксия и система крови. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006. - 142 с.

26. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др. Роль гиалуронидазы в регуляции функций мезенхимальных клеток-предшественников// Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007а. - №2. - С. 115-119.

27. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. Механизмы мобилизации мезенхимальных клеток-предшественников гранулоцитарным колониестимулирующим фактором и гиалуронидазой // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 20076. - №12. - С. 652-656.

28. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др. Формирование реакций системы крови под влиянием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008.- № 6. - С. 628-633.

29. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. и др. Фармакологические аспекты регенеративной медицины //Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - Прил. 2. - С. 14-21.

30. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др. Способ увеличения резерва стволовых клеток в организме // Бюл. изобр. - 2009а. - № 6 (Патент (RU) № 2347583).

31. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. и др. Способ стимуляции миелопоэза // Бюл. изобр. - 20096. - №25 (Патент (RU) № 2366452).

32. Готье С.В., Мойсюк Я.Г., Хомяков С.М., Ибрагимова О.С. Развитие органного донорства и трансплантации в Российской Федерации в 2006-2010 годах // Вестник транспл. и искусств, органов. - 2011. - Т. 13, № 2. - С. 6-20.

33. Грацианская А.Н. Гепатопротекторы в клинической практике: прогепар // Фарматека. - 2010. - №2. - С. 50-51.

34. Григорян A.C. Роль миграционной оси SDF-1-CXCR4 в хоминге клеток-предшественников и метастазировании злокачественных опухолей // Клеточная трансплантол. и тканевая инженерия. - 2006. - №4. - С.32-38.

35. Гумерова A.A., Киясов А.П., Калигин М.С. и др. Участие клеток Ито в гистогенезе и регенерации печени // Клет. Транспл. и Ткан. Инженерия. - 2007. - Том 2, №4. - С. 39-46.

36. Деев Р. В., Гололобов В. Г., Цупкина Н. В. Гистогенетический принцип создания тканеинженерных конструкций скелетных тканей. Вопросы морфологии XXI века. Вып. 1: Сб. научн. тр., посвященный 100-летию каф. мед. биологии СПбГМА им. И. И. Мечникова. СПб.: СПбГМА им. И. И. Мечникова; ДЕАН, 2008. - 114-119 с.

37. Дубровин A.B., Мирошников П.Н. Исследование взаимодействия полиэтиленгликоля с белковыми молекулами при облучении пучком электронов: Сборник материалов XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 12-16 апреля 2010.-55 с.

38. Дыгай A.M., Артамонов A.B., Бекарев A.A. и др. Нанотехнологии в фармакологии. М.: Издательство РАМН, 2011. - 136 с.

39. Дыгай A.M., Клименко H.A., Гумилевский Б.Ю., Гольдберг Е.Д. Роль Т-лимфоцитов в механизмах активации гемопоэзиндуцирующего микроокружения при воспалении // Бюл. эксперим. биологии и медицины. -1992.-№5,-С. 514-516.

40. Дыгай A.M., Верещагин Е.И., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Мадонов П.Г., Симанина Е.В., Ставрова JI.A., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Мирошниченко Л.А., Минакова М.Ю., Ермакова H.H., Фирсова Т.В. Мобилизация прогениторных клеток в кровь с помощью иммобилизированного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2009. - №2. - С. 63-66.

41. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н. Клеточная терапия: новые подходы // Наука в России - Москва: Изд-во «Наука», 2009. - Том. 169. - №1. С. 4-8.

42. Дыгай A.M., Зюзьков Т.Н., Жданов В.В., Верещагин Е. И., Удут Е. В., Хричкова Т. Ю., Симанина Е. В., Ставрова Л. А., Андреева Т. В., Минакова М. Ю., Мадонов П. Г., Киншт Д.Н. Регуляция функций прогениторных клеток с

помощью гиалуронидазы // Вестник Российской академии медицинских наук -2009а.-№11.-С. 6-9.

43. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Влияние трансплантации мононуклеаров периферической крови, полученных с использованием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы, на регенерацию кроветворной ткани при миелосупрессии // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 20096. - №3. - С. 136-142.

44. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Мобилизация стволовых клеток пегилированным с помощью нанотехнологии гранулоцитарным колониестимулирующим фактором как модель изучения процессов миграции прогениторных элементов// Биомедицина. - 2010а. - №1. - С. 17-23.

45. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Способ получения клеточного материала для трансплантации при миелосупрессии // Бюл. изобретений. - 20106. - №18 (Патент (RU) № 2392947).

46. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Способ определения продукции факторов хоминга стволовых клеток // Бюл. изобретений. - 2010в. -№ 26 (Патент (RU) № 2399664).

47. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Иммобилизированный гранулоцитарный колони естимулирующий фактор. Фармакологические свойства и перспективы использования. Томск: ООО «Печатная мануфактура», 2011а.- 149 с.

48. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Влияние иммобилизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы на чувствительность прогениторных клеток к регуляторным факторам // Клет. технол. в биол. и мед. - 20116. - №1. - С. 47-50.

49. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Гемостимулирующие свойства иммоблизированного с помощью нанотехнологии электроннолучевого синтеза эритропоэтина // Бюл. эксперим. биол. - 2011 в. - №2. - С. 207-210.

50. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов B.B. и др. Гепатопротекторные эффекты иммоблизированной с помощью нанотехнологии электронно-лучевого синтеза гиалуронидазы и механизмы их развития // Бюл. эксперим. биол. — 2011г.-№1.-С.86-90.

51. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. и др. Методические указания по изучению специфической активности средств для регенеративной медицины // Руководство по проведению доклинических исследований новых лекарственных средств / Под ред. А.Н. Миронова. М.: Гриф и К, 2012. -15351560 с.

52. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Гурто Р.В. Жданов В.В., Удут Е.В., Мирошниченко JI.A., Чайковский A.B., Маркова Т.С., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Минакова М.Ю., Агафонов В.И. Гуморальные механизмы регуляции функций прогениторных клеток в условиях хронического гепатита // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2012. - Т. 154, №9. - С. 278.

53. Ермакова H.H., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. Механизмы изменений систем клеточного обновления при экспериментальном сахарном диабете // Бюл. Сибирского отделения РАМН. - 2007. - №6. - С. 72-77.

54. Зайцев Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. М.: Наука, 1984. - 424 с.

55. Зорин В.Л., Зорина А.И., Черкасов В.Р. Дермальные фибробласты: разнообразие фенотипов, физиологических функций, возможности терапевтического применения // Косметика&медицина. - 2011. - №2. - С. 12-24.

56. Зубов Д. А., Оксимец В.М. Цитокиновая иммунорегуляция репаративной регенерации костной ткани культивированными мезенхимальными стволовыми клетками. // Травма. - 2008. - Т.9, № 2.1. - С. 145-153.

57. Зюзьков Г.Н., Суслов Н.И., Дыгай A.M. и др. Роль стволовых клеток в адаптации к гипоксии и механизмы нейропротективного действия

гранулоцитарного колониестимулирующего фактора // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С. 202-208.

58. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M. и др. Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007.- № 12. - С. 690-695.

59. Ивашкин В.Т. Болезни печени и желчевыводящих путей / Под редакцией В.Т. Ивашкина. М.: ООО «Издательский дом «М-Вести», 2002.

60. Ивашкин В.Т. Рациональная фармакотерапия заболеваний органов пищеварения / Под общей редакцией В.Т. Ивашкина. М.: Литтерра, 2007.

61. Ивашкин В.Т., Маевская М.В., Богомолов П.О., Никитин И.Г., Буеверов А.О., Лапшин A.B. Результаты открытого сравнительного рандомизированного исследования ОРИОН: оценка эффективности отечественных препаратов Альтевир и Фосфоглив в комбинированной терапии больных хроническим гепатитом С // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 2012. - Т.22, №6. - С.27-37.

62. Киясов А.П., Гумерова A.A., Билалов М.М. Экспрессия цитокератинов в пре-и постнатальном онтогенезе// Онтогенез. - 1997. - Т.28, №5. - С. 389-93.

63. Кост Е.А. Справочник по клиническим лабораторным исследованиям / Под ред. Кост Е.А. М.: Медицина, 1975. - 383 с.

64. Козлов В.А. Система цитокинов: Теоретические и клинические аспект / Под ред. В.А. Козлова, C.B. Сенникова. - Новосибирск: Наука, 2004. - 324 с.

65. Крель П.Е., Цинзерлинг О.Д. Внепеченочная локализация вируса гепатита С: особенности клинических проявлений и прогностическая значимость // Терапевтический архив.- 2009.- № 11.- С. 63-69.

66. Куртова A.B., Эстрина М.А., Алексеев С.М. и др. Экспрессия CXCR4 и эффективность мобилизации CD34+ гемопоэтических стволовых клеток // Клет. технологии в биологии и медицине. 2007. - Т. 2, № 3. - С. 51-56.

67. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1973. - 344 с.

68. Лучшев В.И., Санин Б.И., Жаров С.Н. Вирусный гепатит С глобальная проблема нашего времени // Рос. мед. жур. - 2004. - № 3. - С. 40-45.

69. Максименко А. В., Щечилина Ю. В., Тищенко Е. Г. Модифицированная декстраном гиалуронидаза резистентна к ингибированию гепарином // Биохимия. - 2001. - Т. 66, № 4. - С. 563-572.

70. Максимов A.A. Основы гистологии. М., Л., Госиздат, 1925.

71. Мараховский Ю.Х., Рубенс Ю.П. Гепатопротекторы: потенциальные возможности и ограничения защиты печени // Медицина. - 2004. - № 1 (44). - С. 9-13.

72. Маянский Д.Н., Зубахин A.A. Клеточно-молекулярные механизмы формирования цирроза печени // Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. - 1998. - № 6. - С. 6-12.

73. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. Меньшикова B.B. М.: Медицина, 1987. - 368 с.

74. Меркулов Г.А. Курс патологогистологической техники. Л.: Изд-во «медицина», 1969. 422 с.

75. Минушкин О.Н. Некоторые гепатопротекторы в лечении заболеваний печени // Лечащий врач. - 2002. - №6. - С. 55-58.

76. Морозов С.Ю. Гепатопротекторы в практике врача-клинициста // Русский медицинский журнал. - 2009. - №1. - С.25.

77. Натан Д.Г., Зифф К.А. Регуляция кроветворения // Гематол. и трансфузиол. - 1994. - Т. 39, № 2. - С. 3-10.

78. Нидерау К. Интерферон и эссенциальные фосфолипиды в лечении хронических вирусных гепатитов В и С// Росс. Ж. гастроэнтерол. Гепатол. И колопроктол. - 1998. - Т. 26, №1. - С. 62-64.

79. Овчаров В. К. МКБ-10 / Под ред. В.К. Овчарова, М.В.Максимова, 2010.

80. Оковитый С. В. Клиническая фармакология гепатопротекторов // Гепатология. - 2004. - Вып.З. - С. 32-37.

81. Павлов Ч. С. Принципы диагностики и подходы к терапии фиброза и цирроза печени // Болезни органов пищеварения: прилож. к журн «Русский медицинский журнал». - 2007. - Т.9, № 1. - С. 11-15.

82. Пушкарь Д.Ю., Зайцев A.B., Сегал A.C. Лонгидаза в терапии хронического простатита // Иммунология. - 2006. - № 27(2). - С. 119-21.

83. Репин B.C. Эмбриональная стволовая клетка: от фундаментальной биологии к медицине// Усп. физиол.наук. - 2001. - Вып. 32. - С. 3-19

84. Сейфулла Р.Д., Тимофеев А.Б., Орджоникидзе З.Г. и др. Проблемы использования нанотехнологии в фармакологии // Экспер. и клинич. фармакол. -2008.-№1.-С. 61-69.

85. Ситников И.Г., Федоров В.Н., Шошин A.A., Яльцев A.B., Бохонов М.С. Гепатопротективные препараты: новый подход к терапии парентеральных гепатитов В и С. / Сборник научных работ к 60-летию Ярославской государственной медицинской академии. 2004 - С. 322-326.

86. Ставрова Л.А., Фомина Т.И., Плотников М.Б., Алиев О.И., Сотникова Н.В., Эпштейн О.И., Сергеева С.А., Гурьянцева Л.А., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д. Фармакологическая регуляция функциональной активности стволовых клеток при восстановлении миокарда в постинфарктном периоде // Клеточные технологии в биологии и медицине. -2005.-№4.-С. 189-193.

87. Сухих Г.Т., Малайцев В.В. Нейральная стволовая клетка: биология и перспективы нейротрансплантации // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2001. - №3. -С. 244-255.

88. Сухих Г.Т., Малайцев В.В., Богданова И.М., Дубровина И.В. Мезенхимальные стволовые клетки // Бюл. эксперим. биол. и мед. - 2002. - Т. 133., №2.-С. 124-131.

89. Удут В.В., Венгеровский А.И., Коршунов Д.А., Каркищенко H.H. Влияние гепатопротекторов фосфолипидной природы на биоэнергетику и

перекисное окисление липидов печени при экспериментальной патологии, вызванной парацетамолом // Биомедицина. - 2012. - №1. - С. 120-127.

90. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских исследованиях. М.: Медицина, 1975. - 297 с.

91. Урываева И.В. Репликативный потенциал гепатоцитов и стволовые клетки печени // Известия АН. Серия биологическая,6. - 2001. - С.728-737.

92. Ушкалова Е.А. Место эссенциальных фосфолипидов в современной медицине // Гастроэнтерология. - 2004. - №10 (73). - С. 35-42.

93. Фактор В.М., Урываева И.В. Полиплоидизация гепатоцитов мыши при многократных воздействиях четыреххлористым углеродом // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 1980. - №11. - С.614-616.

94. Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей редакцией профессора Р.У. Хабриева. - 2 изд., перераб. и доп. М.: ОАО Изд-во «Медицина», 2005. - 832с.

95. Шевцов В.И., Чиркова A.M., Дьячков А.Н. Морфологическая характеристика ранних стадий репаративного процесса при замещении дефектов костей черепа методом дозированной дистракции (сообщение 1) // Вестник травматологии и ортопедии им. H.H. Приорова. - 1999. - № 4. - С. 56 -61.

96. Шульпекова Ю.О. Флавоноиды расторопши пятнистой в лечении заболеваний печени // Русский Медицинский Журнал. - 2004. - Т. 12, № 5. - С. 248-250.

97. Чайковский A.B., Зюзьков Г.Н. Механизмы гемостимулирующих эффектов иммобилизированной с помощью нанотехнологии электроннолучевого синтеза гиалуронидазы // Сиб. онкол. Журн. - 2010. - Прил.1. - С. 108-109.

98. Черных Е.Р., Шевела Е.Я., Останин А.А. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных гемобластозами // Гематология и трансфузиология. - 2008. - №2. - С.32-37.

99. Эпштейн О.И., Зюзьков Г.Н., Сотникова Н.В. и др. Механизмы гепатопротекторного эффекта препарата сверхмалых доз антител к гранулоцитарному колониестимулирующему фактору // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - №4. - С. 194-198.

100. Ярыгин К.Н. Роль резидентных и циркулирующих стволовых клеток в физиологической и репаративной регенерации печени // Патол. физиол. и экспер. терапия. - 2008. - № 1. - С. 2-7.

101. Afify A.M., Stern М., Guntenhoener М., Ster R. Purification and characterization of human serum hyaluronidase // Arch. Biochem. Biophys. -1993. -Vol. 305, N2.-P. 434-441.

102. Aiuti A., Webb I.J., Bleul C. et al. The chemokine SDF-1 is a chemoattractant for human CD34+ hematopoietic progenitor cells and provides a new mechanism to explain the mobilization of CD34+ progenitors to peripheral blood // J. Exp. Med. - 1997. - Vol. 185. - P. 111-20.

103. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents // JAMA. -1992. - Vol. 268. - P. 2845-2857.

104.Asahina K., Sato H., Yamasaki C. et al. Pleiotrophin/heparin-binding growth associated molecule as a mitogen of rat hepatocytes and its role in regeneration and development of liver// Am. J. Pathol. - 2002. - Vol. 160. - P. 2191205.

105. Assmann V., Marshall J.F., Fieber C., Hofmann M., Hart I.R. The human hyaluronan receptor RHAMM is expressed as an intracellular protein in breast cancer cells // J. Cell. Sci. - 1998. - Vol. 111 (Pt 12). - P. 1685-1694.

106.Atmuri V., Martin D.C., Hemming R., Gutsol A., Byers S., Sahebjam S., Thliveris J.A., Mort J.S., Carmona E., Anderson J.E., Dakshinamurti S., Triggs-Raine

B. Hyaluronidase 3 (HYAL3) knockout mice do not display evidence of hyaluronan accumulation // Matrix Biol. 2008. - Vol. 27, N 8. - P. 653-660.

107. Augello A., Kurth T.B., De Bari C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches // Eur. Cell. Mater. - 2010. -Vol. 1(20).-P. 121-33.

108. Avigdor A., Goichberg P., Shivtiel S., Dar A., Peled A., Samira S., Kollet O., Hershkoviz R., Alon R., Hardan I., Ben-Hur H., Naor D., Nagler A., Lapidot T. CD44 and hyaluronic acid cooperate with SDF-1 in the trafficking of human CD34+ stem/progenitor cells to bone marrow // Blood. - 2004. - Vol. 103, N 8. - P. 29812989.

109. Avgoustakis K. Pegylated poly(lactide) and poly(lactide-co-glycolide) nanoparticles: preparation, properties and possible applications in drug delivery // Curr. Drug. Deliv. - 2004. - Vol. 1, N 4. - P. 321 -333.

110. Ball L.M., Bredius R.G.M., Lankester A.C., Schweizer J., Heuvel-Eibrink M.M. Third party mesenchymal stromal cell infusions fail to induce tissue repair despite successful control of severe grade IV acute graft-versus-host disease in a child with juvenile myelo-monocytic leukemia // Leukemia. - 2008. - Vol. 22(6). -P. 1256-1257.

111. Banerji S., Wright A.J., Noble M., Mahoney D.J., Campbell I.D., Day A.J., Jackson D.G. Structures of the Cd44-hyaluronan complex provide insight into a fundamental carbohydrate-protein interaction // Nat. Struct. Mol. Biol. - 2007. - Vol. 14, N3.-P. 234-239.

112. Barry F., Boynton R. E., Liu B., Murphy J. M. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components // Exp Cell Res. - 2001. - Vol. 268 (2). - P. 189200.

113. Beckenlehner K., Bannke S., Spruss T., Bernhardt G., Schonenberg H., Schiess W. Hyaluronidase enhances the activity of adriamycin in breast cancer

models in vitro and in vivo // J. Cancer Res. Clin. Oncol. - 1992. - Vol. 118. - P. 591-596.

114. Beech D.J., Madan A.K., Deng N. Expression of PH-20 in normal and neoplastic breast tissue // J. Surg. Res. - 2002. - Vol. 103. - P. 203-207.

115.Belperio J.A., Keane M.P., Arenberg D.A., Addison C.L., Ehlert J.E., Burdick M.D., Strieter R.M. CXC chemokines in angiogenesis // J. Leukoc. Biol. - 2000. - Vol. 68(1). - P. 1-8.

116. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P. G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications // Stem Cells. - 2001. - Vol. 19(3).-P. 180-92.

117. Bjornson C.R., Rietze R.L., Reynolds B.A., Magli M.C., Vescovi A.L. // Science. - 1999. - Vol. 283. - P. 534-537.

118.Bonnefoix T., Bonnefoix P., Callanan M., Verdiel P, Sotto JJ. Graphical representation of a generalized linear model-based statistical test estimating the fit of the single-hit Poisson model to limiting dilution assays // J. Immunol. - 2001. - Vol. 167(10).-P. 5725-30.

119.Bost F., Aouadi M., Caron L., Binetruy B. The role of MAPKs in adipocyte differentiation and obesity // Biochimie. - 2005. - Vol. 87, № 1. - P. 51-56.

120.Bourguignon, L.Y., Zhu, H., Shao, L., and Chen, Y.W. CD44 interaction with c-Src kinase promotes cortactin-mediated cytoskeleton function and hyaluronic acid-dependent ovarian tumor cell migration //J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276. - P. 7327-7336.

121. Bourguignon L.Y., Singleton P.A., Diedrich F., Stern R., Gilad E. CD44 interaction with Na+-H+ exchanger (NHE1) creates acidic microenvironments leading to hyaluronidase-2 and cathepsin B activation and breast tumor cell invasion // J. Biol. Chem. - 2004. - Vol. 279, N 26. - P. 26991-27007.

122.Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. Growth kinetics, self-renewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during

extensive subcultivation and following cryopreservation 11 J. Cell Biochem. - 1997 -Vol. 64, N 2. - P.278-294.

123. Burt A.D. Cellular and molecular aspects of hepatic fibrosis // J. Pathol. -1993. - Vol. 170 (2). - P. 105-14.

124. Burt A.D., Le Bail B., Balabaud C., Bioulac-Sage P. Morphologic investigation of sinusoidal cells // Semin. Liver Dis. - 1993. - Vol. 13(1). - P. 21-38.

125.Caliceti P., Veronese F.M. Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly (ethylene glycol)-protein conjugates // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2003. -Vol.55, N 10.-P. 1261-1277.

126. Carpenter M.K, Rosier E., Rao M.S. Characterization and differentiation of human embryonic stem cells // Stem Cells and Cloning. - 2003. - Vol. 5(1). - P. 7988.

127. Carter R.A., Wicks I.P. Vascular cell adhesion molecule 1 (CD106): a multifaceted regulator of joint inflammation // Arthritis Rheum. - 2001. - Vol. 44. -P. 985-994.

128.Ceradini D.J., Kulkarni A., Callaghan M.J. Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxia gradients through HIF-1 induction of SDF-1 // Nature Med. -2004.-Vol. 10.-P. 858-864.

129. Chen L., Zhang H., Powers R.W., Russell P.T., Larsen W.J. Covalent linkage between proteins of the inter-alpha-inhibitor family and hyaluronic acid is mediated by a factor produced by granulosa cells // J. Biol. Chem. - 1996. - Vol. 271, N32.-P. 19409-19414.

130. Chen X., Li Y., Wang L., Katakowski M., Zhang L., Chen J., Xu Y., Gautam S., Chopp M. Ischemic rat brain extracts induce human marrow stromal cell growth factor production //Neuropathology. - 2002. - Vol. 22. - P. 275-279.

131. Chen S., Revoltella R., Papini S., Michelini M., Fitzgerald W., Zimmerberg J., Margolis L. Multilineage differentiation of rhesus monkey embryonic stem cells in three-dimensional culture systems //Stem Cells. - 2003. - Vol. 21. - P. 281-295.

132. Chen Y.-K., Zhao X.-X., Li J.-G. et al. Ductular proliferation in liver tissues with severe chronic hepatitis B: An immunohistochemical study // World J. Gastroenterol. - 2006. - Vol.12 (9). - P.1443-1446.

133. Chichester C.O., Fernández M., Minguell J.J. Extracellular matrix gene expression by human bone marrow stroma and by marrow fibroblasts // Cell Adhes Commun. - 1993. - Vol. 1, N 2. - P. 93-99.

134. Cho R.J., Huang M., Campbell M.J., Dong H., Steinmetz L., Hampton G., Elledge S. J., Davis R. W., Lockhart D. J. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle // Nat. Genet. - 2001. - Vol. 27(1). - P. 48-54.

135. Choudhary M., Zhang X., Stojkovic P., Hyslop L., Anyfantis G., Herbert M., Murdoch A.P., Stojkovic M., Lako M. Putative role of hyaluronan and its related genes, HAS2 and RHAMM, in human early preimplantation embryogenesis and embryonic stem cell characterization // Stem Cells. - 2007. - Vol. 25, N 12. - P. 3045-3057.

136. Chute J.P. Stem cell homing // Curr. Opin. Hematol. - 2006. - Vol. 13. - P. 389-406.

137.Csóka A.B., Frost G.I., Stern R. The six hyaluronidase-like genes in the human and mouse genomes // Matrix Biol. - 2001. - Vol. 20. - P. 499-508.

138. Delgado C., Francis G.E., Fisher D. The uses and properties of PEG-linked proteins // Crit. Rev. Ther. Drug Carr. Syst. - 1992. - Vol. 9. - P. 294-304.

139. Deng X., Chen Y-X., Zhang J.P. et al. Hepatic stellate cells modulate the differentiatin of bone marrow mesenchymal stem cells into hepatocute like cells// J. Cell. Physiol. - 2008. - Vol. 217. - P. 138-44.

140. Dennis J.E., Merriam A., Awadallah A., Yoo J.U., Johnstone B., Caplan A.I. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse // J. Bone Miner Res. - 1999. - Vol. 14, N 5. - P. 700-709.

141. Dennis J.E., Carbillet J.P., Caplan A.I., Charbord P. The STRO-1+ marrow cell population is multipotential // Cells Tissues Organs. - 2002. - Vol. 170, N 2-3. -P. 73-82.

142.Dimitroff C.J., Lee J.Y., Rafii S., Fuhlbrigge R.C., Sackstein R. CD44 is a major E-selectin ligand on human hematopoietic progenitor cells // J. Cell Biol. -2001.-Vol. 153.-P. 1277-1286.

143.Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F.C., Krause D.S., Deans R.J., Keating A., Prockop Dj., Horwitz E.M. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells // The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8. - P. 315-317.

144. Duncan S.A. Transcriptional regulation of liver development // Dev. Dyn. -2000. - Vol. 219. - P.131-42.

145. Dygai A.M., G. N. Zyuz'kov, V. V. Zhdanov, E. V. Udut and L. A. Miroshnichenko, et al. Effect of Hyaluronidase Immobilized Using Electron-Beam Synthesis Nanotechnology on Sensitivity of Progenitor Cells to Regulatory Factors // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2011. - Vol. 151,№ 1. - P. 150153.

146. Dygai A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V., Udut V.V., Artamonov A.V., Bekarev A.A., Minakova M.Yu. Immobilized Using Nanotechnology of Electron-Beam Synthesis Regulators of Progenitor Cells Functions: Remedies of New Generation for Regenerative Medicine // Recent Patents on Regenerative Medicine (Online). - Bentham Science Publishers, Volume 3, Issue 1, January 2012, [BSP/RPRM/E-Pub/00042].

147.Eckardt K.U. Erythropoietin production in liver and kidneys// Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. - 1996. - Vol. 5 (1). - P. 28-34.

148.El-Komy M.H., Widness J.A., Veng-Pedersen P. Pharmacokinetic analysis of continuous erythropoietin receptor activator disposition in adult sheep using a target-madiated, physiologic recirculation model and a tracer interaction methodology // Drug Metab. Dispos. - 2011. - Vol. 39, N 4 - P.603-609.

149.El-Shoubaki H., Bener A., Al-Mosalamani Y. Factors Influencing Organ Donation and Transplantation in State of Qatar // Transplantationsmedizin. - 2006. -Vol. 18.-P. 97.

150. Epstein 01, Zyuz'kov GN, Sotnikova NV, Stavrova LA, Fomina TI, Vetoshkina TV, Sergeeva SA, Dubskaya TY, Dygai AM, Gol'dberg ED. Mechanisms of hepatoprotective effect of preparation containing superlow doses of antibodies to granulocytic colony-stimulating factor // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2005. - Vol. 140, № 5. - P. 598-602.

151. Espiritu J.D. Pulmonary embolism in a patient with coagulopathy from endstage liver disease // Chest. - 2000. - Vol. 117. - P. 924-925.

152.Fausto N., Campbell J.S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation // Mech Dev. - 2003. - Vol. 120(1). - P. 117-30.

153.Fischbach G.D., Fischbach R.L. Stem cells: science, policy, and ethics //J. Clin. Invest. -2004. - Vol. 14.-P. 1364-1370.

154.Flannery C.R., Little C.B., Hughes C.E., Caterson B. Expression and activity of articular cartilage hyaluronidases // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1998.-Vol. 251.-P. 824-829.

155. Friedenstein A., Owen M. Stromal stem cells: marrow derived osteogenic progenitors // CIBA Found. Symp. - 1988. - Vol. 136. - P. 42-60.

156. Friedman S.L. Molecular regulation of hepatic fibrosis, an integrated cellular response to tissue injury // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - P. 2247-50.

157. Friedman S.L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver // Physiol. Rev. - 2008. - Vol. 88. - P. 125-72.

158. Frost G.I., Csoka A.B., Wong T., Stern R.. Purification, cloning, and expression of human plasma hyaluronidase // Biochem. Biophys. Res. Commun. -1997.-Vol. 236, N 1. - P. 10-15.

159. Fujio K., Evarts R.P., Hu Z. et al. Expression of stem cell factor and its receptor, c-kit, during liver regeneration from putative stem cells in adult rat// Lab. Invest. - 1994.-Vol. 70.-P. 511-6.

160. Furnus C.C., Inda A.M., Andrini L.B. et al. Chronobiology of the proliferative events related to angiogenesis in mice liver regeneration after partial hepatectomy // Cell Biol. Int. - 2003. - Vol. 27, N 4. - P. 383-386.

161. Gao F., Okunieff P., Han Z., Ding I., Wang L., Liu W., Zhang J., Yang S., Chen J., Underhill C.B., Kim S., Zhang L. Hypoxia-induced alterations in hyaluronan and hyaluronidase // Advances in experimental medicine and biology. - 2005. - Vol. 566.-P. 249-56.

162.Gohda E., Tsubouchi H., Nakayama H. et al. Human hepatocyte growth factor in plasma from patients with fulminant hepatic failure // Exp. Cell. Res. -1986.-Vol. 166.-P. 139-50.

163.Gohda E., Tsubouchi H., Nakayama H. et al. Purfication and partial characterization of hepatocyte growth factor from plasma of patient with fulminant hepatic failure. - 1988. - Vol. 81. - P. 414-9.

164. Gol'dberg E.D., Dygai A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V. Pharmacological regulation of functional activity of progenitor cells // International Congress «EUROMEDICA-HANNOVER-2008» Hannover, 2008. - P. 99-100.

165. Gordon M.Y. Extracellular matrix of the marrow microenvironment // Brit. J. Haematol. - 1988. - Vol. 70. - P. 1-4.

166. Gordon G.L., Coleman W.B., Hixon D.C., Grisman J.W. Liver regeneration in the rats with retrorsine induced hepatocellular injury proceeds through a novel cellular response // Am. J. Pathol. - 2000. - Vol. 156. - P.607-619.

167. Grammatikakis N., Grammatikakis A., Yoneda M., Yu Q., Banerjee S.D., Toole B.P. A novel glycosaminoglycan-binding protein is the vertebrate homologue of the cell cycle control protein, Cdc37 // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270, N 27. -P. 16198-16205.

168. Gregory C.A., Ylostalo J., Prockop D.J. Adult bone marrow stem/progenitor cells (MSCc) are preconditioned by microenvironmental «niches» in culture: a two-ctage hypothesis for regulation of MSC fate// Sci. STKE. - 2005. -Vol. 294.-P. 37.

169.Grisham JW, Coleman WB, Smith GJ. Isolation, culture, and transplantation of rat hepatocytic precursor (stem-like) cells // Proc Soc Exp Biol Med. - 1993. - Vol. 204. - P. 270-279.

170. Gronthos S., Franklin D. M., Leddy H. A., Robey P. G., Storms R. W., Gimble J. M. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells // J. Cell Physiol. - 2001. - Vol. 189, N 1. - P. 54-63.

171. Gronthos S., Zannettino A.C., Hay S.J., Shi S, Graves S.E., Kortesidis A., Simmons P.J. Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow // J. Cell Sci. - 2003. - Vol. 116 (9). - P. 1827-1835.

172. Gupta S., Batchu R.B., Datta K. Purification, partial characterization of rat kidney hyaluronic acid binding protein and its localization on the cell surface // Eur. J. Cell Biol.- 1991.- Vol. 56, N 1.-P. 58-67.

173. Haas R., Murea S. The role of granulocyte colonóy-stimulating factor in mobilization and transplantation of peripheral blood progenitor and stem cells// Cytokines Mol. Ther. -1995. - Vol. 1(4). - P. 249-70.

174. Hall C.L., Yang B., Yang X., Zhang S., Turley M., Samuel S., Lange L.A., Wang C., Curpen G.D., Savani R.C., Greenberg A.H., Turley E.A. Overexpression of the hyaluronan receptor RHAMM is transforming and is also required for H-ras transformation // Cell. - 1995. - Vol. 82. - P. 19-26.

175.Hamidi M., Azadi A., Rafiei P. Pharmacokinetic consequences of pegylation // Drug Delivery. - 2006. - Vol.13, N 6. - P. 399-409.

176.Harada H., Takahashi M. CD44-dependent intracellular and extracellular catabolism of hyaluronic acid by hyaluronidase-1 and -2 // J. Biol. Chem. - 2007. -Vol. 282, N 8. - P. 5597-5607.

177.Hattori K., Heissig B., Rafii S. The regulation of hematopoietic stem cell and progenitor mobilization by chemokine SDF-1 // Leuk Lymphoma. - 2003. - Vol. 44, N4.-P. 575-582.

178.Heino J., Kapyla J. Cellular receptors of extracellular matrix molecules // Curr. Pharm. Des. - 2009. -Vol. 15(12).-P. 1309-1317.

179. Henry C. B., Duling B. R. Permeation of the luminal capillary glycocalyx is determined by hyaluronan // Am. J. Phyiol. - 1999. - Vol. 277. - P. 508—514.

180.Hirata A., Minamino T., Asanuma H. et al. Erythropoietin enhances neovascularization of ischemic myocardium and improves left ventricular dysfunction after myocardial infarction in dogs// J. Am. Coll. Cardiol. - 2006. - Vol. 48(1).-P. 176-184.

181. Hofstetter C.P., Schwarz E., Hess D. Marrow stromal cells from guiding strands in the injured spinal cord promote recovery // Proc Natl Acad Sci USA. -2002. - Vol. 99. - P. 2199-2204.

182.Holden C., Vogel G. Cell biology. A seismic shift for stem cell research // Science. - 2008. - Vol. 319. - P. 560-563.

183.Hornberg, J.J., Binder B., Bruggeman F.J., Schoeberl B., Heinrich R., Westerhoff H. V. Control of MARK signaling: from complexity to what really matters // Oncogene. - 2005. - Vol. 24. - P. 5533-5542.

184.Horwitz E.M., Le Blanc K., Dominici M., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F.C., Deans R.J., Krause D.S., Keating A. Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement // International Society for Cellular Therapy. Cytotherapy. - 2005. -Vol. 7. - P. 393395.

185. Hood J.D., Cheresh D.A. Role of integrins in cell invasion and migration // Nat Rev Cancer. - 2002. - Vol. 2. - P. 91-100.

186. Huang L., Grammatikakis N., Toole B.P. Organization of the chick CDC37 gene // Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273, N 6. - P. 3598-3603.

187. Huang Z., Ni C., Chu Y., Wang S. et.al. Chemical modification of recombinant human keratinocyte growth factor 2 with polyethylene glycol improved biostability and reduces animal immunogenicity // J. Biotechnol. - 2009. - Vol.142, N3-4.-P. 242-249.

188.Hynes R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines // Cell. -2002,-Vol. 110.-P. 673-687.

189. Iczkowski K.A. Cell adhesion molecule CD44: its functional roles in prostate cancer // Am. J. Translx. Res. -2010. - Vol. 3, N1. - P. 1-7.

190. In't Anker P.S., Noort W.A., Scherjon S.A. et al . Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogenous multilineage differentiation potential // Haematologica. - 2003. - Vol. 88. - P. 845-852.

191.Itano N., Kimata K. Mammalian hyaluronan synthases // IUBMB Life. -2002.-Vol. 54.-P. 195-199.

192.Jaiswal N., Haynesworth S., Caplan A., Bruder S. Osteogenic differentiation of purified, culture-expanded human mesenchymal stem cells in vitro //J. Cell. Biochem. - 1997. - Vol. 64. - P. 295-312.

193. Jiang Y., Vaessen B., Lenvik T., Blackstad M., Reyes M., Verfaillie C. Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle, and brain. // Exp. Hematol. - 2002. - Vol. 30. - P. 896-904.

194. Joyeux-Faure M., Godin-Ribuot D., Ribuot C. Erythropoietin and myocardial protection: what's new?// Fundam. Clin. Pharmacol. - 2005. - Vol. 19 (4).-P. 439-46.

195.Kang W., Zhou C., Koga Y., Baba T. Hyaluronan-degrading activity of mouse sperm hyaluronidase is not required for fertilization? // J. Reprod. Dev. -2010.-Vol. 56, N 1.-P. 140-144.

196.Kawada H., Fujita J., Kinjo K., Matsuzaki Y., Tsuma M., Miyatake H., Muguruma Y., Tsuboi K., Itabashi Y., Ikeda Y., Ogawa S., Okano H., Hotta T., Ando K., Fukuda K. Nonhematopoietic mesenchymal stem cells can be mobilized and differentiate into cardiomyocytes after myocardial infarction //Blood. - 2004. - Vol. 104.-P. 3581-3587.

197. Kim T.H., Mars W.M., Stolz D.B. et al. Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat // Hepatology. - 1997. - Vol. 26 (4). -P.896-904.

198. Kim B.Y., Rutka J.T., Chan W.C. Nanomedicine// N. Engl. J. Med. - 2010. - Vol. 363, N 25. - P. 2434-2443.

199.Klocker J., Sabitzer H., Raunik W., Wieser S., Schumer, J. Hyaluronidase as additive to induction chemotherapy in advanced squamous cell carcinoma of the head and neck//Cancer Lett. - 1998.-Vol. 131.-P. 113-115.

200. Klopsch C., Furlani D., Gabel R., Li W., Pittermann E., Ugurlucan M. et al. Intracardiac injection of erythropoietin induces stem cell recruitment and improves cardiac functions in a rat myocardial infarction model// J. Cell. Mol. Med. - 2009. -Vol. 13(4).-P. 664-79.

201.Kobbe G., Bruns I., Fenk R. et.al. Perfilgrastim for PBSC mobilization and autologous haematopoietic SCT // Bone Marrow Transplant. - 2009. - Vol. 43, N. 9. -P. 669-677.

202.Kopen G.C., Prockop D.J., Phinney D.G. Marrow stromal cells migrate throughout forebrain and cerebellum, and they differentiate into astrocytes after injection into neonatal mouse brains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96. -P. 10711-10716.

203. Kordes C., Sawitza I., Muller-Marbach A. et al. CD133+ hepatic stellate cells are progenitor cells// Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - Vol. 352 (2). -P. 410-7.

204. Koul D., Dhar S., Chen-Scarabelli C., Guglin M., Scarabelli T.M. Erythropoietin: New Horizon in Cardiovascular Medicine// Recent Patents in Cardiovasc. Drug Dis. - 2007. - Vol. 2. - P. 1-7.

205. Kubota H., Yao H., Reid L.M. Identification and characterization of vitamin A-storing cells in fetal liver: implications for functional importance of hepatic stellate cells in liver development and hematopoiesis// Stem Cells. - 2007. - Vol. 25. - P. 2339-49.

206. Kuppusamy U.R., Das N.P. Inhibitory effects of flavonoids on several venom hyaluronidases // Experientia. - 1991. - Vol. 47. - P. 1196-1200.

207. Laconi E. Differential grown: from carcinogenesis to liver regeneration // Am. J. Pathol. - 2000. - Vol. 156. - P. 389-392.

208. Lau A.S., Lehman D., Geertsma F.R., Yeung M.C. Biology and therapeutic uses of myeloid hematopoietic growth factors and interferons // Pediatr. Infect. Dis. J. - 1996. - Vol. 7. - P. 563-575.

209. LeBoeuf R.D, Raja R.H., Fuller G.M., Weigel P.H. Human fibrinogen specifically binds to hyaluronic acid // J . Biol. Chem. - Vol. 261. - P. 12586-12592.

210. Le Blanc K., Gotherstrom C., Ringden O., Hassan M., McMahon R., Horwitz E., Anneren G., Axelsson O., Nunn J., Ewald U., Norden-Lindeberg S., Jansson M., Dalton A., Strom E., Westgren M. Fetal mesenchymal stem-cell engraftment in bone after in utero transplantation in a patient with severe osteogenesis imperfecta //Transplantation. - 2005. - Vol. 79. - P. 1607-1614.

211. Le Blanc K. Mesenchymal srtomal cells: tissue repair and immune modulation // Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8, No 6. - 559-561.

212.Levitsky J. American Association for the Study of Liver Diseases - 53rd Annual Meeting. 1-5 November 2002, Boston, MA, USA // IDrugs. - 2003. - Vol. 6(1).-P. 30-3.

213. Lipsic E., Schoemaker R.G., van der Meer P., Voors A.A., van Veldhuisen D.J., van Gilst W.H. Protective effects of erythropoietin in cardiac ischemia: from bench to bedside// J. Am. Coll. Cardiol. - 2006. - Vol. 48. - P. 2161-2167.

214.Lokeshwar V.B., Rubinowicz D., Schroeder G.L., Forgacs, E., Minna J.D., Block N.L., Nadji M., Lokeshwar B.L. Stromal and epithelial expression of tumor markers hyaluronic acid and HYAL1 hyaluronidase in prostate cancer // J. Biol. Chem. - 2001. - Vol. 276. - P. 11922-11932.

215. Longaker M.T., Chiu E.S., Adzick N.S., Stern M., Harrison M.R., Stern R. Studies in fetal wound healing. V. A prolonged presence of hyaluronic acid characterizes fetal wound fluid //Ann. Surg. - 1991. - Vol. 213. - P. 292-296.

216. Lowes K.N., Brennan B.A., Yeoh C.C, Olynyk J.K. Oval cell numbers in human chronic liver diseases are directly related to disease severity // Am J Pathol. -1999.-Vol. 154. - P.537-541.

217. Maher J J. Cell-specific expression of hepatocyte growth factor in liver. Upregulation in sinusoidal endothelial cells after carbon tetrachloride // J. Clin. Invest.- 1993.-Vol. 91.-P. 2244-52.

218.Majumbar M.K., Keane-Moore M., Buaner D. et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells // J. Biomed. Sci.-2003.-Vol. 101.-P. 3722-9.

219.Mallorquí J., Gutiérrez-Gallego R., Segura J. et.al. New screening protocol for recombinant human erythropoietins based on differential elution after immunoaffmity purification // J. Pharm. Anal. - 2010. - Vol. 51, N 1. - P. 255-259.

220. Maullu C., Raimondo D., Caboi F. et.al. Site-directed enzymatic PEGylation of the human granulocyte colony-stimulating factor // FEBS J. - 2009. -Vol. 276, N 22. - P. 6741-6750.

221. McCulloucgh B., Peppa D., Monk P.N. Skubitz, K.M. and Partridge L.J. A role for CD63 in signal transduction // Immunol. - 1996. - Vol. 89(1). - OM 114.

222. McLin V.A., Zorn. A.M. Molecular Control of Liver Development // Clin. Liver Dis.-2006.-Vol.10.-P. 1-25.

223. Meyer K. Hyaluronidases. In Boyer, P.D. (Ed.)// The Enzymes. - 1971. -Vol. 5.-P. 307-320.

224. Miyake K., Medina K., Ishihara K. et al. A VCAM-like adhesion molecule on murine bone marrow stromal cells mediates binding of lymphocyte precursorsin culture//J. Cell Biol. - 1991. - Vol. 114.-P. 557-65.

225.Mian N. Analysis of cell-growth-phase-related variations in hyaluronate synthase activity of isolated plasma-membrane fractions of cultured human skin fibroblasts // Biochem. J. - 1986. - Vol. 237. - P. 333-334.

226. Minguell J.J. Is hyaluronic acid the «organizer» of the extracellular matrix in marrow stroma?//Exp. Hematol. - 1993. - Vol. 21, N l.-P. 7-8.

227. Minguell J.J., Erices A., Conget P. Mesenchymal stem cells // Exp. Biol. Med. (Maywood). - 2001 - Vol. 226, N 6. - P. 507-520.

228. Mio K., Stern R. Inhibitors of the hyaluronidases // Matrix Biol. - 2002. -Vol. 21, N1.-P. 31-37.

229. Mitaka T., Kojima T., Mizuguchi T., Mochizuki Y. Growth and maturation of small hepatocytes isolated from adult rat liver // Biochem Biophys Res Commun. -1995.-Vol. 214.-P. 310-317.

230. Mohapatra S., Yang X., Wright J.A., Turley E.A., Greenberg A.H. Soluble hyaluronan receptor RHAMM induces mitotic arrest by suppressing Cdc2 and cyclin B1 expression//J. Exp. Med. - 1996. - Vol. 183, N4-P. 1663-1668.

231. Mullhaupt B., Feren A., Fodor E., Jones A. Liver expression of epidermal growth factor RNA. Rapid increases in immediate-early phase of liver regeneration// J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269. - P. 19667-70.

232. Nagai H., Terada K., Watanabe G. et al. Differentiation of liver epithelial (stem-like) cells into hepatocytes induced by coculture with hepatic stellate cells// Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2002. - Vol. 293(5). - P. 1420-5.

233. Nagano O., Murakami D., Hartmann D., De Strooper B., Saftig P., Iwatsubo T., Nakajima M., Shinohara M., Saya H. Cell-matrix interaction via CD44 is independently regulated by different metalloproteinases activated in response to extracellular Ca2 influx and PKC activation // J. Cell Biol. - 2004. - Vol. 165, N 6. -P. 893-902.

234.Nagasawa T., Hirota S., Tachibana K., Takakura N., Nishikawa S., Kitamura Y., YoshidaN., Kikutani H., Kishimoto T. Defects ofB-cell lymphopoiesis and bone-marrow myelopoiesis in mice lacking the CXC chemokine PBSF/SDF-1 // Nature. - 1996. - Vol. 382, N 6592. - P. 635-638.

235. Nakhlband A., Barar J., Bidmeshkipour A. et al. Bioimpacts of antiepidermal growth factor receptor antisense complexed with polyamidoamine dendrimers in human lung epithelial adenocarcinoma cells// J. Biomed. Nanotechnol. -2010,-Vol. 6, N4.-P. 360-369.

236. Naor D., Nedvetzki S., Walmsley M., Yayon A., Turley E.A. et al. CD44 involvement in autoimmune inflammations: the lesson to be learned from CD44-

targeting by antibody or from knockout mice // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 2007. - Vol. 1110.-P. 233-247.

237. Nedvetzki S., Gonen E., Assayag N. et.al. RHAMM, a receptor for hyaluronan-mediated motility, compensates for CD44 in inflamed CD44-knockout mice: A different interpretation of redundancy // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. -2004. - Vol. 101, N 52. - P. 18081-18086.

238. Nicoll S.B., Barak O., Csoka A.B., Bhatnagar R.S., Stern R. Hyaluronidases and CD44 undergo differential modulation during chondrogenesis // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2002. - Vol. 292. - P. 819-825.

239. Noble P.W. Hyaluronan and its catabolic products in tissue injury and repair // Matrix Biol. - 2002. - N 21. - P. 25-29.

240. Oliferenko S, Kaverina I, Small JV, Huber LA. Hyaluronic acid (HA) binding to CD44 activates Racl and induces lamellipodia outgrowth // J. Cell Biol. -2000. - Vol. 148, N 6. - P. 1159-1164.

241. Orian-Rousseau V., Chen L., Sleeman J.P., Herrlich P., Ponta H. CD44 is required for two consecutive steps in HGF/c-Met signaling // Genes Dev. - 2002. -Vol. 16 (23).-P. 3074-3086.

242. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Limana F., Jakoniuk I., Quaini F., Nadal-Ginard B., Bodine D.M., Leri A., Anversa P. Mobilized bone marrow cells repair the infracted heart, improving function and survival // Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. -Vol. 98.-P. 10344-10349.

243. Osakada F., Jin Z.B., Hirami Y. et al. In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small-molecule induction // J. Cell Sci. - 2009. -Vol. 122.-P. 3169-79.

244. Pasonen-Seppanen, S., Karvinen, S., Torronen, K., Hyttinen, J.M., Jokela, T., Lammi, M.J., Tammi, M.I., and Tammi, R. EGF upregulates, whereas TGF-beta downregulates, the hyaluronan synthases Has2 and Has3 in organotypic keratinocyte cultures: correlations with epidermal proliferation and differentiation //J. Invest. Dermatol.-2003.-Vol. 120.-P. 1038-1044.

245.Passino M.A., Adams R.A., Sikorski S.L., Akassoglou K. Regulation of hepatic stellate cell differentiation by the neurotrophin receptor p75NTR// Science. -2007.-Vol. 315.-P. 1853-56.

246. Petersen B.E., Bowen W.C., Patrene K.D. et al. Bone marrow as a potential source of hepatic oval cells // Science. - 1999. - Vol. 284. - P.l 168-70.

247. Phinney D. G., Kopen, G., Isaacson R. L., Prockop D. J. Plastic adherent stromal cells from the bone marrow of commonly used strains of inbred mice: variations in yield, growth, and differentiation// Journal of Cellular Biochemistry. -1999. - Vol. 72. - P. 570-585.

248. Pittenger M., Mackay A., Beck S., Jaiswal R., Douglas R., Mosca J., Moorman M., Simonetti D., Craig S., Marshak D. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells //Science. - 1999. - Vol. 284. - P. 143-147.

249. Pittenger M., Mosca J., Mcintosh K. Human mesenchymal stem cells: progenitor cells for cartilage, bone, fat and stroma //Curr. Top. Microbiol. Immunol. -2000.-Vol. 251.-P. 3-11.

250. Preisig R. Liver protection therapy // Schweiz Rundsch Med Prax. - 1970. -Vol. 59, N45.-P. 1559-1560.

251. Pochampally R., Neville B., Schwartz E., Li M., Prockop D. Rat adult stem cells (marrow stromal cells) engraft and differentiate in chick embryos without evidence of cell fusion // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2004. - Vol. 101. - P. 92829285.

252. Pochampally R., Horwitz E., Digirolamo C., Stokes D., Prockop D. Correction of a mineralization defect by overexpression of a wild-type cDNA for COL1A1 in marrow stromal cells (MSCs) from a patient with osteogenesis imperfecta: a strategy for rescuing mutations that produce dominant-negative protein defects //Gene Ther. - 2005. -Vol. 12.-P. 1119-1125.

253. Prehm P. Hyaluronate is synthesized at plasma membranes // Biochem. J. -1984. - Vol. 220. - P. 597-600.

254.Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues // Science. - 1997- Vol. 276, N 5309. - P. 71-74.

255.Prockop D., Sekiya I., Colter D. Isolation and characterization of rapidly self-renewing stem cells from cultures of human marrow stromal cells //Cytotherapy. - 2001. - Vol. 3. - P. 393-396.

256.Prunier F., Pfister O., Hadri L., Liang L., Del Monte F., Liao R. et al. Delayed erythropoietin therapy reduces post-MI cardiac remodeling only at a dose that mobilizes endothelial progenitor cells// Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. -2007. - Vol. 292. - P. H522-H529.

257. Rai S.K., Duh F.M., Vigdorovich V., Danilkovitch-Miagkova A., Lerman M.I., Miller A.D. Candidate tumor suppressor HYAL2 is a glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored cell-surface receptor for jaagsiekte sheep retrovirus, the envelope protein of which mediates oncogenic transformation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - Vol. 98, N 8. - P. 4443^1448.

258.Rajkumar K., Modric T., Murphy L.J. Impaired adipogenesis in insulin-like growth factor binding protein-1 transgenic mice // J. Endocrinol. - 1999. - Vol. 162, N3,- P. 457-465.

259. Ratajczak M.Z., Zuba-Surma E.K., Wysoczynski M., Ratajczak J., Kucia M. Very small embryonic-like stem cells: characterization, developmental origin, and biological Significance // Exp Hematol. - 2008. - Vol. 36 (6). - P. 742-751.

260. Ratajczak M.Z., Shin D.M., Liu R., Marlicz W., Tarnowski M., Ratajczak J., Kucia M. Epiblast/germ line hypothesis of cancer development revisited: lesson from the presence of Oct-4+ cells in adult tissues // Stem Cell Rev. - 2010. - Vol. 6 (2). - P.307-16.

261.Ramadori G., Veit T., Schwogler S. et al. Expression of the gene of the alpha-smooth muscle-actin isoform in rat liver and in rat fat-storing (ITO) cells // Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. - 1990. - Vol. 59. - P. 349-57.

262.Rodez J., eds / Oxford textbook of clinical hepatotology. Oxford University Press. - 1991.-N2.- P. 875-902.

263.Sandgren E.P., Palmiter R.D., Hechel J.L. Complete hepatic regeneration after somatic deletion of an albumin plasminogen activator transgene // Cell. - 1991. -Vol. 66.-P. 245-256.

264. Sawitza I., Kordes C., Hausinger D. The niche of stellate cells within rat liver// Hepatology. - 2009. - Vol. 50.

265. Schirmacher P., Geerts A., Pietrangelo A. et al. Hepatocyte growth factor/hepatoprotein A is expressed in fat-storing cells from rat liver but not myofibroblast-like cells derived from fat-storing cells // Hepatology. - 1992. - Vol. 15.-P. 5-11.

266. Schmidt S., Friedl P. Interstitial cell migration: integrin-dependent and alternative adhesion mechanisms // Cell Tissue Res. - 2010. - Vol. 339, N1 - P.83-92.

267. Senzolo M., Burra P., Cholonqitas E., Burroughs A.K. New insights into the coagulopathy of liver disease and liver transplantation // World J. Gastroenterol. -2006. - Vol. 12 (48). - P. 7725-7736.

268. Scherer William F., Jerome T. Syverton, George O. Gey. Viral Multiplication in a stable strain of human malignant epithelial cells (strain HELA) derived from an epidermoid carcinoma of the cervix // J. Experimental Medicine. -1951.-Vol. 97.-P. 695-715.

269. Shipp M.A., Look A.T. Hematopoetic differention antigenes that are membrane-associated enzymes: cutting is the key! // Blood. - 1993. - Vol. 82, N 4. -P. 1052-1570.

270. Shuster S., Frost G.I., Csoka A.B., Formby B., Stern R. Hyaluronidase treatment reduces tumor size in human xenografts in SCID mice // Int. J. Cancer. -2002.-Vol. 102.-P. 192-197.

271. Sidler Pfandler M.A., Hochli M., Inderbitzin D., Meier P.J., Stieger B. Small hepatocytes in culture develop polarized transporter expression and differentiation // J Cell Sci. - 2004. - Vol. 117. - P. 4077-4087.

272. Simmons P.J., Torok-Storb B. CD34 expression by stromal precusors in normal human adult bone morrow // Blood. - 1991. - Vol.78. - P.2848.

273. Singleton P.A., Bourguignon L.Y. CD44 interaction with ankyrin and IP3 receptor in lipid rafts promotes hyaluronan-mediated Ca2 + signaling leading to nitric oxide production and endothelial cell adhesion and proliferation // Exp. Cell Res. -2004.-Vol. 295.-P. 102-118.

274. Song Z., Cai J., Liu Y. et al. Efficient generation of hepatocyte-like cells from human induced pluripotent stem cells // Cell Res. - 2009. - Vol. 19. - P. 123342.

275. Stern R. Devising a pathway for hyaluronan catabolism: are we there yet? // Glycobiology. - 2003. - Vol. 13, N 12. - P. 105-115.

276. Stern R. Hyaluronan catabolism: a new metabolic pathway // Eur. J. Cell Biol. - 2004. - Vol. 83. - P. 317-325.

277. Stewart K., Monk P., Walsh S. et al. STRO-1, HOP-26 (CD63), CD49a and SB-10 (CD166) as markers of primitive human marrow stromal cells and their more differentiated progeny: a comparative investigation in vitro // Cell Tissue Res. -2003.-Vol. 313.-281-290.

278. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors // Cell. - 2006. -Vol. 126 (4). - P.652-5.

279.Termeer C., Sleeman, J.P., Simon, J.C. Hyaluronan-magic glue for the regulation of the immune response? // Trends Immunol. - 2003. - Vol. 24. - P. 112114.

280. Theise N.D., Saxena R., Portmann B.C. The canals of Hering and hepatic stem cells in humans // Hepatology. - 1999. - Vol.30. - P. 1425-1433.

281. Thomson J. A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S. S. et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts// Science. - 1998. -Vol. 282.-P. 1145-1147.

282. Till J. E., McCulloch E.A. A direct measurement of the radioctivity of normal mouse bone marrow cells // Radiat. Res. - 1961. - Vol. 14. - P. 213 - 222.

283. Tolg C., Hamilton S.R., Nakrieko K.A., Kooshesh F., Walton P., McCarthy J.B., Bissell M.J., Turley E.A. Rhamm-/- fibroblasts are defective in CD44-mediated ERK1,2 motogenic signaling, leading to defective skin wound repair // J. Cell Biol. -2006. - Vol. 175, N 6. - P. 1017-1028.

284. Torsvik A., Rjasland G.V., Svendsen A. Spontaneous malignant transformation of human mesenchymal stem cells reflects cross-contamination: putting the research field on track - letter // Cancer Res. - 2010. - Vol. 70 (15). - P. 6393-6.

285. Triggs-Raine B., Salo T.J., Zhang H., Wicklow B.A., Natowicz M.R. Mutations in HYAL1, a member of a tandemly distributed multigene family encoding disparate hyaluronidase activities, cause a newly described lysosomal disorder, mucopolysaccharidosis IX // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1999. - Vol. 96. - P. 6296-6300.

286. Tripodi A., Salerno F., Chantarangkul V., Clerici M., Cazzaniga M., Primignani M., Mannuccio Mannucci P. Evidence of normal thrombin generation in cirrhosis despite abnormal conventional coagulation tests // Hepatology. - 2005. - Vol. 41(3). - P. 553-8.

287. Tsao M.S., Smith J.D., Nelson K.G., Grisham J.W. A diploid epithelial cell line from normal adult rat liver with phenotypic properties of 'oval' cells // Exp Cell Res. - 1984. - Vol. 154. - P. 38-52.

288. Tsutsumi S., Shimazu A., Miyazaki K., Pan H., Koike C., Yoshida E., Takagishi K., Kato Y. Retention of multilineage differentiation potential of mesenchymal cells during proliferation in response to FGF //Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2001. - Vol. 288. - P. 413-419.

289. Turley E.A. Purification of a hyaluronate-binding protein fraction that modifies cell social behavior // Biochem Biophys Res Commun. - 1982. - Vol. 108. -P.l 016-1024.

290.Turley E.A., Noble P.W., Bourguignon L.Y. Signaling properties of hyaluronan receptors // J. Biol. Chem. - 2002. - P. 4589^4592.

291.Uchiyama H., Dobashi Y., Ohkouchi K., Nagasawa, K. Chemical change involved in the oxidative reductive depolymerization of hyaluronic acid // J. Biol. Chem. - 1990. - Vol. 265. - P. 7753-7759.

292. Van der Flier A., Sonnenberg A. Function and interactions of integrins // Cell Tissue Res. - 2001. - Vol. 305 (3). - P. 285-298.

293.Varas F., Bernad A., Bueren J.A. Granulocyte colony-stimulating factor mobilizes into peripheral blood the complete clonal repertoire of hematopoietic precursors residing in the bone marrow of mice // Blood. - 1996. - Vol. 88, N 7. - P. 2495-2501.

294. Vereschagin E.I., Khan D.H., Troitsky A.W. et al. Radiation technology in the preparation of polyethylene oxide hydrophilic gels and immobilization of proteases for use in medical practice // Arch. Pharm. Res. - 2001. - Vol. 24. - P. 229233.

295. Wang L., Li L., Menendez P. et al. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development // Blood. - 2005. - Vol. 17. - P. S0006-4971.

296. Weidner K.M., Arakaki N., Hartmann G. et al. Evidence for the identity of human hepatocyte growth factor // PNAS USA. - 1991. - Vol. 88. - P. 7001-5.

297. Wilson J.W., Leduc E.H. Role of cholangioles in restoration of the liver of the mouse after dietary injury// J. Pathol. Bacteriol. - 1958. - Vol.76. - P.441-449.

298. Wright D.E., Bowman E.P., Wagers A.J. et al. Hematopoietic stem cells are uniquely selective in their migratory response to chemokines// J. Exp. Med. -2002. -Vol. 195.-P. 1145-54.

299. Wu X., Miyake K., Medina K.L., Kincade P.W., Gimble J.M. Recognition of murine integrin beta-1 by a rat anti-stromal cell monoclonal antibody// Hybridoma. - 1994. - Vol. 13, N 5. - 409-416.

300. Wu G., Nolta J., Jin Y., Barr M., Yu H., Starnes V., Cramer D. Migration of mesenchymal stem cells to heart allografts during chronic rejection //Transplantation. - 2003. - Vol. 75. - P. 679-685.

301. Wynn T.A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis // J. Pathol. -2008. - Vol. 214. - P. 199-210.

302.Yamazaki M., Nakajima F., Ogasawara A., Moriya H., Majeska R. J., Einhorn T. A. Spatial and temporal distribution of CD44 and osteopontin in fracture callus // J Bone J. Surgery. - 1999. - Vol. 3. - P. 508-515.

303. Yoshino R., Miura K., Segawa D. et al. Epimorphin expression and stellate cell status in mouse liver injury// Hepatol. Res. - 2006. - Vol. 34. - P. 238-49.

304. Zhang J., Wilson G.F., Soerens A.G. et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells // Circ. Res. - 2009. - Vol. 104. -P. e30-e41.

305. Zhu H., Mitsuhashi N., Klein A., Barsky L.W., Weinberg K., Barr M.L., Demetriou A., Wu G.D. The Role of the Hyaluronan Receptor CD44 in Mesenchymal Stem Cell Migration in the Extracellular Matrix // Stem Cells. - 2006. -Vol. 24, N4.-P. 928 -935.

306.Zyuz'kov G.N., Dygai A.M., Gol'dberg E.D., Zhdanov V.V., Suslov N.I. Role of stem cells in adaptation to hypoxia and mechanisms of neuroprotective effect of granulocytic colony-stimulating factor // Bulletin of Experimental Biology and Medicine.-2005.-Vol. 140, №5,- P. 606-611.

307. Zyuz'kov G.N., Dygai A. M., Gol'dberg E. D., Zhdanov V. V. Role of hyaluronidase in the regulation of hemopoiesis // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2007. - Vol. 144, № 6. - P. 840-845.

308. Zyuz'kov G.N., Gur'yantseva L.A., Simanina E.V. et al. Effect of dimethylsulfoxide on the functions of mesenchymal and hemopoietic precursors // Bulletin of Experimental Biology and Medicine - 2007. - Vol. 143, № 4. - P. 535538.