Влияние Т-регуляторных клеток на киллерные свойства активированных лимфоцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат медицинских наук Велижева, Надежда Павловна

• Велижева, Надежда Павловна
• кандидат медицинских наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Велижева, Надежда Павловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность работы.

Цель и задачи исследования.

Научная новизна.

Научно-практическая значимость.

Положения, выносимые на защиту.

Публикации по теме диссертации.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Материалы исследования-.

2.1.1 Источники получения МЛ.

2.1.2 Клеточные линии.39^

2.1.3 Питательные среды.

2.1.4 Реактивы.

2.2 Методы исследования.

2.2.1 Методика выделения МЛ из периферической крови больных и здоровых доноров.

2.2.2 Методика выделения МЛ из опухолевых экссудатов больных.

2.2.3 Генерация активированных лимфоцитов.:.

2.2.4 Морфологическое исследование.

2.2.5 Цитотоксический тест.

2.2.6 Оценка пролиферативной активности.

2.2.7 Проточная цитометрия (ТАС8-анализ) и характеристика антител.

2.2.8 Выделение СБЗ+ Т-лимфоцитов.

2.2.9 Иммуномагнитная сепарация.регуляторных С04+СЭ25+ Т-лимфоцитов.

2.2.10 Иммуномагнитная сепарация регуляторных

СБ4+СВ25+С0127с1!т/- Т-лимфоцитов.

2.2.11 Иммуномагнитная сепарация регуляторных СБ25+С049с1-Т-лимфоцитов.

2.2.12 Выделение НК клеток.

2.2.13-Флюоресцентная микроскопия.

2.2.14 Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.2.15- Статистические методы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Морфологическая, иммунофенотипическая и функциональная характеристика активированных лимфоцитов, генерированных из мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров.

3.1.1 Цитотоксическая активность ЛАК.

3.1.2 Пролиферативная активность ЛАК.

3.1.3 Цитокиновый профиль ЛАК.

3.1.4 Анализ иммунофенотипа ЛАК.

3.1.5 Морфология ЛАК.

3.2 Сравнительная характеристика иммунофенотипа ЛАК, генерированных из MJI периферической крови здоровых доноров и пациентов с распространенными формами злокачественных новообразований.

3.2.1 Содержание CD4+CD25+ Т-лимфоцитов в ЛАК, генерированных из МЛ периферической крови больных и здоровых доноров.

3.2.2. Анализ распространенности Foxp3+ Трег в ЛАК, генерированных из МЛ периферической крови больных и здоровых доноров.

3.2.3. Анализ распространенности Foxp3+ Трег в ЛАК, генерированных из МЛ опухолевых экссудатов больных.

3.3 Выделение отдельных субпопуляций лимфоцитов с использованием различных вариантов иммуномагнитной сепарации.

3.3.1 Выделение НК.

3.3.2. Иммуномагнитная сепарация Т-регуляторных клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние Т-регуляторных клеток на киллерные свойства активированных лимфоцитов»

Актуальность работы

Несмотря на длительную историю и несомненные достижения, развитие методов адоптивной иммунотерапии остается приоритетными направлением в онкологии. В основе применения метода лежит использование иммунотропных веществ и активация врожденного и адаптивного звеньев иммунной системы [7, 10].

Основным-; преимуществом:. иммунотерапии является относительно низкая токсичность [16] и возможность достижения противоопухолевого эффекта при формировании у пациентов лекарственной резистентности: При этом! стимуляция? иммунитета; может приводить не только» к лизису опухолевых клеток, но и повышать качество жизни больных [19, 20, 44].

В настоящее время существуют два направления в иммунотерапии', злокачественных новообразований; Первое основано на; активации адаптивного звена противоопухолевого иммунобиологического надзора« посредством создания« профилактических и лечебных вакцин на основе дендритных клеток- (ДК) и трансфецированных Т- лимфоцитов; экспрессирутощих специфический Т-клеточный- рецептор, к поверхностным опухолевым антигенам. Второе направление — активация эффекторов врожденного клеточного противоопухолевогш иммунитета, натуральных киллеров (НК) [24]. Активность НК может быть существенно увеличена под воздействием цитокинов, таких как интерлейкина-2 (ИЛ-2) или интерферон-у, (ИФН-у) |7]. Из лимфоцитов периферической крови, селезенки или опухолевого? экссудата экстракорпорально, в присутствии ИЛ-2 могут быть генерированы лимфокин-активированные киллеры (ЛАК), обладающие высокой цитотоксичнотью по отношению к опухолевым клеткам. Механизм действия ЛАК состоит из прямого цитотоксического поражения аутологичных опухолевых клеток, а также их способности синтезировать и высвобождать биологические активные вещества, такие как цитокины, оказывающие регуляторное действие на другие эффекторы иммунной системы [45].

Внедрение ИЛ-2/ЛАК-иммунотерапии в клиническую практику расширяет спектр возможностей противоопухолевого лечения. Однако, несмотря на определенные успехи, которые были достигнуты в последние десятилетия [19, 22, 26, 31], в клинической практике остается-, проблема недостаточной эффективности иммунотерапии, обусловленная формированием феномена периферической толерантности' [52, 67]. Способность опухоли «ускользать» от иммунологического надзора* (отсутствие, специфических антигенов, высокая скорость деления» злокачественно трансформированных клеток, секреция супрессорных факторов) и низкая биодоступность составляют ключевую проблему иммунотерапии![¡53 - 55].

Для повышения^ эффективности иммунотерапии в онкологии необходимо , активировать эффекторные клетки; (ЦТЛ, НК, Тх), предотвратить.развитие процессов иммунологической, толерантности! и* нивелировать состояние иммуносупрессии, развивающееся на фоне опухолевой прогрессии. (

Стимуляция иммунной системы пациента может быть достигнута посредством'адоптивного'переноса ЛАК клеток, которые используются для иммунотерапии злокачественных новообразований с 1980-х годов. ЛАК характеризуются высокой' пролиферативной способностью, выраженной цитотоксичностью и хорошей переносимостью» при различных способах введения пациентам.

Ранее, адоптивная иммунотерапия с использованием ИЛ-2 или комбинации этого цитокина с ЛАК применялась, главным образом, для лечения иммуночувствительных распространенных форм злокачественных новообразований, таких как меланома, рак почки, и в ряде случаев исследователям удавалось достичь противоопухолевых эффектов [20, 23, 28, 29]. Расширенные рандомизированные исследования не показали высокой эффективности применения ИЛ-2 и JIAK при системном введении, что не позволило широко применять данный способ лечения [33].

В РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН в последние годы проводятся клинические исследования по оценке эффективности и безопасности ИЛ-2/ЛАК терапии при локальном и локорегиональном введении при лечении злокачественных плевритов, асцитов и перикардитов [44, 45]. Локальное (внутриполосное) введение ЛАК позволяет создать оптимальное соотношение опухолевых клеток и активирвоанных лимфоцитов для достижения цитотоксического эффекта. Сочетание ЛАК с ИЛ-2 позволяет стимулировать киллерную активнсоть лимфоцитов опухолевого экссудата [46]. Под воздействием ИЛ-2 происходит нарастание доли клеток, экспрессирующих а-субъединицу рецептора^ данного цитокина CD25, в том числе субпопуляции CD4+CD25+ клеток [49, 62, 71; 83]. В этих условиях существует вероятность стимуляции в культуре Т-регуляторных (CD4+CD25+Foxp3+)'клеток (Трег), с супрессорной актвинсотью [75, 87]. Однако до сих пор остается дискуссионным вопрос об' уровне" содержанияв популяции ЛАК подтипа- CD4+GD25+Foxp3+ Трег и их влиянии на цитотоксическую активность эффекторов противоопухолевого иммунитета [77, 90, 108]. В связи с этим одним из перспективных направлений повышения эффективности НК и ЛАК является выделение обогащенных киллерных субпопуляций или удаление супрессоров. Для этих целей могут быть использованы современные методы иммуномагнитной сепарации, клиническое применение которых нуждается в экспериментальном обосновании.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является оптимизация метода генерации активированных лимфоцитов с использованием иммуномагнитной сепарации.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. исследовать морфофункциональные и иммунофенотипические особенности ЛАК;

2. оценить целесообразность выделения обогащенной субпопуляции НК из популяции ЛАК;

3. провести сравнительный анализ эффективности методов выделения Т-регуляторных клеток из ЛАК;

4. оценить целесообразность удаления субпопуляции БохрЗ+ Т-регуляторных клеток из популяции ЛАК, полученных из лимфоцитов крови больных и здоровых доноров, а также из злокачественных выпотов;

5. определить уровень содержания Т-регуляторных клеток, экспрессирующих транскрипционный фактор БохрЗ, в периферической крови здоровых доноров и у пациентов с распространенными формами злокачественных новообразований; I

6. изучить содержание СБ4+С025+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток . в злокачественных экссудатах больных с различными локализациями первичного опухолевого процесса;

7. оценить влияние СВ4+СБ25+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток на киллерную активность ЛАК. I I

Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследования морфофункциональных и иммунофенотипических характеристик ЛАК и определения соотношения в них различных субпопуляций лимфоцитов

Впервые выполнена сравнительная оценка содержания;

Ш4+СШ)25+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток в периферической крови ' " ■ г здоровых доноров (1)' пациентов (2) с распространенными формами; злокачественных новообразований и больных (3) со злокачественными! выпотами. .

Впервые выполнена оценка влияния : СВ4+С025+17охрЗ+ Т-регуляторных клеток на функциональные и фенотипические особенности; активированных лимфоцитов;

Впервые проанализирована целесообразность и результативность, различных: сжкюбов выделения ПК. и ЕохрЗЧ- Т-регуляторных клеток из активированных лимфоцитов:

Уточнены данные относительно источников;получения и оптимальных, сроках генерации; ЛАК. для* адоптивной иммунотерапии* злокачественных новообразований: , , . .•,

Научно-практическая значимость

Полученные данные расширяют существующие представления о механизме- цитоксичности и роли различных субпопуляций лимфоцитов в реализации киллерной активности эффекторов противоопухолевого иммунитета. Установлено, что; суирессорная субпопуляция . С©4СШ5+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток обнаруживается; главным1 образом, в злокачественных выпотах и; оказывает ингибирующее воздействие: на активность эффекторов врожденного иммунитета.

Результаты исследования позволяют оптимизировать режимы и сроки генерации ЛАК из различных источников, которые могут использоваться для целей адоптивной- иммунотерапии- злокачественных новообразований. Показано, что элиминация; Т-регуляторных клеток с помощью метода; иммуномагнитной сепарации позволяет существенно повысить цитотоксичность активированных лимфоцитов по отношению к аутологичным опухолевым клеткам злокачественных выпотов.

Результаты работы будут использоваться при проведении клинических испытаний адоптивной иммунотерапии у пациентов со злокачественными выпотами (опухолевыми плевритами, асцитами и перикардитами).

Положения, выносимые на защиту

ЛАК, полученные из различных источников, обладают характерными морфофункциональными особенностями и представлены субпопуляциями эффекторных и регуляторных лимфоцитов.

Лимфоциты злокачественных экссудатов пациентов содержат значительное количество С04+СЭ25+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток с подтвержденной супрессорной активностью.

При генерации ЛАК, полученных из мононуклеарных лейкоцитов периферической крови и злокачественных экссудатов пациентов, с увеличением времени инкубации возрастает численность субпопуляции

СБ4+С025+РохрЗ+ Т-регуляторных клеток, подавляющих пролиферативные, киллерные и цитотоксические свойства активированных лимфоцитов.

Соотношение в культуре активированных лимфоцитов эффекторных (НК, НКТ, Тх) и регуляторных субпопуляций С04+С025+РохрЗ+ Трег с выраженными супрессорными свойствами определяет конечную эффективность и цитотоксичность ЛАК.

Обогащение активированных лимфоцитов эффекторными клетками за счет элиминации СБ4+СВ25+РохрЗ+ Т-регуляторных лимфоцитов с использованием иммуномагнитной сепарации повышает киллерную активность ЛАК.

Публикации по теме диссертации

В отечественных и зарубежных печатных изданиях опубликовано 7 научных работ.

В журналах, рекомендованных В АК:

1. Лебединская О. В. Влияние препарата "Профеталь" на дифференцировку и функциональную активность мононуклеарных лейкоцитов человека / Лебединская О. В., Велижёва Н. П., Доненко Ф: В;, Черешнев В; А., Родионов С. Ю., Ахматова Н. К., Шубина И. Ж., Киселевский М. В. // Клеточные технологии, в биологии и медицине: — 2006: — № 2. — С 108 — 116. ; V

2. Eebedinskaya О. V. Effect of "Profetal" on differentiation and functional activity of human: mononuclear leukocytes / Lebedinskaya О. V., Lebedinskaya E. A., Velizheva N. P., Donenko F. V., Akhmatova N. K., Shubina I. Zh., Kiselevskii M. V., Ghereshnev V. A., Rodionov S; Yu: // Bulletin Of Experimental Biology And Medicine. - 2006. - Vol: 141. - №4. - P. 53 6-543.

3; , Велижева H. П. Противоопухолевая цитотоксическая. активность лимфокин-активированных киллеров . / Н. ГГ. Велижева, О. С. Жукова, О. В; Лебединская, И. Ж. Шубина, Е. А. Лебединская, М. Bi Киселевский // Сибирский онкологический журнал: - 2008. - Т. 25. — №1. - G. 39 - 44.

4. Чикилева И.О. Содержание Т-регуляторных лимфоцитов CD4+CD25+Eoxp3-b в популяции' лимфокин-активированных киллеров / Чикилева И.О., Велижева II. П., Шубина И. Ж., Титов К. С., Киселевский М. В. // Вестник РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. - 2008. -Т. 19. -№3. - С. 16-25. ' :

5. Тезисы доклада . И. П. Велижева, И. Ж. Шубина, М. В. Киселевский. CD4+/CD254- Т-регуляторные клетки и адоптивная ИЛ-2/ЛАК-терапия злокачественных опухолей // Российский Биотерапевтический Журнал. - 2008. - Т.7. -№1. - С. 4.

6. Глава «CD4+/CD25+ . Т regulatory cells» Irina Zh. Shubina, Nadezhda P. Velizheva, Mikhail V. Kisclevsky в Atlas Effectors of Anti-Tumor

Immunity. Mikhail V. Kiselevsky (ed.) // Springer Science+Business Media B-2008.-P. 65-73.

7. Лебединская О. В. Динамика накопления и морфология CD4+/CD25+T-KJieTOK в популяции лимфокин-активированных киллеров / Лебединская О. В., Велижева Н. П., Чикилева И. О., Годовалов А. П., Киселевский М. В. // Морфологические ведомости. — 2010. — №3. — С. 24 — 29.

Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийских конференциях Отечественные противоопухолевые препараты 2008 и 2011.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Велижева, Надежда Павловна

выводы

X. ИЛ-2 позволяет получить из мононуклеарных клеток периферической крови здоровых доноров или опухоль-ассоциированных лимфоцитов злокачественных экссудатов активированные лимфоциты. с киллерными свойствами, избирательными в отношении трансформированных клеток различного гистогенеза. 2. Активированные ИЛ-2 лимфоциты отличаются: повышенной' экспрессией активационных антигенов: CD25, OD38 и HLA-DR,' молекул адгезии CD57, CD58 и сниженной экспрессией общих дифференцировочных антигенов лимфоцитов GD3, CD4, CD8. Субпопуляция CD 16+/CD56+HK характеризуется высоким уровнем экспрессии молекул NKG2D и NKp30.

3. Обогащенная- субпопуляция.: НК, полученная методом иммуномагнитной сепарации в отсутствие- хелперных лимфоцитов и измененного . рецепторнош ' аппарата; характеризуется низкой, пролиферативной активностью и обладает цитотоксичностью, идентичной; исходной популяции ЛАК. ' : 1 ■ V

4. Опухоль-ассоциированные лимфоциты злокачественньк экссудатов, характеризуются "высоким , исходным' содержанием; Foxp3+ Т-регуляторных клеток (11,4±2,2%), .численность которых, возрастает при дальнейшем культивировании с ИЛ-2 на >30%.

5. Применение метода иммуномагнитной?: сепарации позволяет извлекать субпопуляцию Foxp3+CD25+CD49d-peryjni горных клеток с подтвержденной супрессорной активностью, что достоверно на 21% (91 ±7%) против 69±11%, р<0,05) повышает цитотоксичность. активированных ИЛ-2 опухоль-ассоциированных лимфоцитов. " ! 6. Генерация ЛАК из; мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров с использованием'; ИЛ-2 не приводит к значимому увеличению содержания супрессорной популяции CD4-l-CD25+Foxp3-i-Tper.

7. Иммуномагнитная сепарация Т-регуляторных клеток, генерированных' из опухоль-ассоциированных. лимфоцитов^ приводит к повышению цитотоксичности ЛАК в отношении аутологичных опухолевых клеток. '■ . , ;г . . . .

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Согласно полученным данным в случае повышенного содержания в злокачественных экссудатах больных CD4+CD25+Foxp3+ Т-регуляторных клеток, а также при повышенной распространенности данной субпопуляции лимфоцитов в культуре JIAK для усиления киллерной активности JIAK рекомендуется обогащение культуры активированных ex vivo лимфоцитов эффекторными клетками путем удаления субпопуляции Foxp3+ Трег, с применением метода иммуномагнитной сепарации.

Результаты проведенных исследований показали, что популяции аллогенных ЛАК не содержат значимого количества Трег. Поэтому включение в схему иммунотерапии аллогенных активированных лимфоцитов позволяет не только снизить количество ИЛ-2, необходимого для внутриплеврального или внутрибрюшного введения пациенту, но дополнительно уменьшает вероятность стимуляции регуляторных CD4+CD25+Foxp3+ Т-клеток, исходно повышенных в злокачественных выпотах пациентов.

В отсутствии аллогенных лимфоцитов для повышения противоопухолвой эффективности ИЛ-2/ЛАК терапии на основе опухоль-ассоциированных лимфоцитов больного из популяций ЛАК рекомендуется удаление Т-регуляторных клеток с фенотипом CD4+CD25+Foxp3+, обладающих выраженными супрессорными свойствами, которые вызывают торможение пролиферации, угнетение продукции цитокинов и снижение цитотоксической и киллерной активностей эффекторных клеток.

Внутриплевральная и внутрибрюшная адоптивная ИЛ-2/ЛАК терапия с использованием популяции обогащенных активированных лимфоцитов после проведения дополнительных исследований по изучению ее безопасности и клинической эффективности может быть рекомендована как один из этапов комбинированного и (или) комплексного лечения больных с диссеминированными злокачественными новообразованиями.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Велижева, Надежда Павловна, 2011 год

1. Whiteside Т. L., Herberman R. В. Role of human natural killer cells in health and disease. Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 1994. - Vol. 1, № 2. -P. 125-133.

2. Whiteside T. L., Herberman R.B. The biology of human natural killer cells. -Ann! 1st. Super Sanita. 1990. - Vol. 26, №.4. - P. 335-48.3; Natural killer cells: characteristics and regulation of activity / Herbermani

3. R.B:, Djeu J., Kay H.D., Ortaldo JiR., Riccardi C., Bonnard G.D., Holden H. Т., Fagnani R., Santoni A., Puccetti P. // Immunol Rev. 1979. - 44:431. P. 70.i

4. Kiessling R., Klein E., Wigzell H. Natural killer cells in the mouse. I.• i

5. Lanier L. L. NK cell recognition. Annual Rev. Immunol. - 2005. - Vol. 23. - P.' 225-274.

6. Activation, coactivation, and costimulation, of resting human natural killer cells / Bryceson Y. Т., March M. E., Ljunggren H. G., Long E. O.' // Immunol

7. Rev.-2006.-Vol. 214.-P. 73-91.i

8. Hogan P. G., Hapel A. J., Doe W. F. Lymphokine-activated and natural killericell activity in human intestinal mucosa. J. Immunol. - 1985. - Vol. 3. -P. 1731 - 8.

9. Jicha D. L., Mulé J. J., Rosenberg S. A. Interleukin 7 generates antitumor cytotoxic T lymphocytes against murine sarcomas with efficacy in cellular adoptive immunotherapy. J. Exp. Med. - 1991. -Vol. 174(6).-P. 1511-5.

10. Rosenberg S. A., Lotze M. T., Muul L. M. A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-activated killer cells and interleuldn-2 or high-dose interleukin-2 alone. -N. Engl. J. Med. — 1987. -Vol. 316.-P. 889-97.

11. Rosenberg S. A., Lotze M. T., Muul L. M. Observations on the systemic administration of autologous lymphokine-activated killer cells and recombinant interleukin-2 to patients with metastatic cancer. N. Engl. J. Med. - 1985.-V. 313.-P. 1485-92.

12. Kimura H., Yamaguchi Y. Adoptive immunotherapy with LAK cell and IL-2 against primary lung cancer. Nippon Geka Gaklcai Zasshi. - 1989. - Vol. 90(9).-P. 1459-62.

13. Intravenous interleukin-2 in patients over 65 with metastatic renal carcinoma / Négrier S., Mercatello A., Bret M., Thiesse P., Blay J. Y., Coronel B., Merrouche Y., Oskam R., Franks C. R., Clavel M. // Br. J. Cancer. 1992. -Vol. 65(5).-P. 723-726.

14. Exploitation of alloreactive NK cells in adoptive immunotherapy of cancer / Ruggeri L., Mancusi A., Capanni M , Martelli M. T. Velardi A. // Curr. Opin. Immunol.-2005.-Vol. 17.-P. 211 -7.

15. Ruggeri L., Capanni M., Urbani E. et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science. —2002. -Vol. 295.-P. 2097- 100.

16. Ren X. B., Yu J. P., Cao S. et al. Antitumor effect of large doses Reactivated HLA haploidentical peiipheral blood stem cells on refractory metastatic solid tumor treatment. Cancer Biothci Radiopharm. — 2007. — Vol. 22.-P. 223 -34.

17. Dudley M. E., Yang J. C., Sherry R., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J. Clin. Oncol. - 2008. - Vol. 26. -P. 5233 - 9.

18. Dudley M. E., Wunderlich J. R., Robbins P. F., et al. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science. - 2002. - Vol. 298. - P. 850 - 4.

19. Rosenberg S. A. The emergence of modern cancer immunotherapy. Ann. Surg. Oncol. - 2005. - Vol. 12. - P. 344-6.

20. Rosenberg S. A., Restifo N. P., Yang J. C., et al. Adoptive cell transfer: a clinical path to effective cancer immunotherapy. Nat. Rev. Cancer. - 2008. -Vol. 8.-P. 299-308.

21. Intrapleural administration of interleukin-2 for the treatment of patients with malignant pleural mesothelioma: A phase II study / Astoul P., Picat J. D., Viallat J. R., Boutin C. // Cancer. 1998. - Vol. 10. - P. 2099 - 104.

22. Freedman R. S., Edwards C. L., Kavanagh J. J., et al. Intraperitoneal adoptive immunotherapy of ovarian carcinoma with tumor-infiltiating lymphocytes and low-dose recombinant interleukin-2: A pilot trial. J. Immunother. — 1994. — Vol. 3.-P. 198- 10.

23. Van Herpen С. M., De Mulder P. H. Locoregional immunotherapy in cancer patients: review of clinical studies. Ann. Oncol. - 2000. - Vol. 11(10). — P. 1229-39.

24. Intrapleural administration of interleukin 2 in pleural mesothelioma: a phase Ii1. study / Eggermont A. M., Punt C. J., Slingerland R., Gratama J. W., Oosterom R., Oskam R.3 Bolhuis R. L., and Stoter G. // Br. J. Cancer. 1995. -Vol. 72, №5.-P. 1283-88.

25. Masotti A., Fumagalli L., Morandini G. C. Intrapleural administration of recombinant interleukin-2 in non-small cell lung cancer with neoplastic pleural effusion. Monaldi Arch. Chest. Dis. - 1997. - Vol. 52, №3. -P. 225-8.

26. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клинико-лабораторное исследование / Давыдов М. И , Нормантович В. А.,

27. Киселевский М. В., Волков С. М. и др. // Российский онкологический журнал. 2000. - № 6 - С. 14 - 17.

28. Киселевский М. В. Адоптивная иммунотерапия при злокачественных опухолях. Вестник РАМН. 2003. - № 1. - С. 40 - 44.

29. Treatment of 121 patients with malignant effusion due to advanced lung cancer by intrapleural transfer of autologous or allogenic LAK cells combined with rIL-2 / Liu X., Li D., Zhang C., Ba D., et al. // Med. Sci. J. 1993. -Vol. 8.-P. 186- 189.

30. Stewart J. A., Belinson J. L., Moore A. L., et al. Phase I trial of intraperitoneal recombinant interleukin-2/lymphokine-activated killer cells in patients with ovarian cancer. Cancer Res. - 1990. - Vol. 19. - P. 6302-10.

31. Steis R. G., Urba W. J., Vander Molen L. A., et al. Intraperitoneal lympholcine-activated killer-cell and interleukin-2 therapy for malignancies limited to the peritoneal cavity. J. Clin. Oncol. - 1990. - Vol. 10. — P.1618-29.

32. Infiltration of interleukin-2-inducible killer cells in ascitic fluid and pleural effusions of advanced cancer patients / Blanchard D. K., Kavanagh J. J., Sinkovics J. G., Cavanagh D., Hewitt S. M., Djeu J. Y. // Cancer Res. 1988. -Vol. 48.-P. 6321-27.

33. Lucivero G., Pierucci G., Bonomo L. Lymphocyte subsets in peripheral blood and pleural fluid. Eur. Respir. J. - 1988. -Vol. 1. - P. 337-340.

34. Adoptive immunotherapy of malignancies / Shubina I. Zh., Bliumenberg A. G., Volkov S. M., Demidov L. V., Kiselevskii M. V. // Vestn. Ross. Akad. Med. Nauk. 2007. - Vol. 11. - P. 9 - 15.

35. Escape of human solid tumors from T-cell íecognition: Molecular mechanisms and functional significance / Marineóla F. M., Jaffee E. M., Hicklin D. J., Ferrone S. // Adv. Immunol. 2000. - P. 181 - 273.

36. Finke J., Ferrone S., Frey A., et al. Where have all the T cells gone? Mechanisms of immune evasion by tumors. — Immunol. Today. — 1999. — Vol. 4.-P. 158-60.

37. Mechanisms responsible for signaling and functional defects / Reichert Т. E., Rabinowich H., Johnson J. Т., Whiteside T. L. // J. Immunother. 1998. — Vol. 4.-P. 295-306.

38. Inge T. H., Hoover S. K., Susskind B. M., et al. Inhibition of tumorspecific cytotoxic T-lymphocyte responses by transforming growth factor beta 1. -Cancer. Res. 1992. - Vol. 6. - P. 1386-92.

39. Grayson G., Ladisch S. Immunosuppression by human gangliosides. II. Carbohydrate structure and inhibition of human NK. activity. — Cell. Immunol. 1992. - Vol. 1. -P. 18-29.

40. Forni G., Giovarelli M., Santoni A. Lymphokine-activated tumor inhibition in vivo. I. The local administration of interleukin 2 triggers nonreactive lymphocytes from tumor-bearing mice to inhibit tumor growth. J. Immunol. - 1985.-Vol. 2.-P. 1305-11.

41. Wang R. F. Regulatory T cells and innate immune regulation in tumor immunity. Springer Semin. Immunopathol. — 2006. — Vol. 1. - P. 17- 23. — Epub. — 2006. - Jul 13. — Review. - Erratum in: Springer Semin Immunopathol. - 2006. - Vol. 1. - P. 77.

42. Wang R. F., Miyahara Y., Wang H. Y. Toll-like receptors and immune regulation: implications for cancer therapy. — Oncogene. 2008. — Vol. 27, №2.-P. 181-9.

43. Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumor microenvironment of patients with pancreas or bieast adenocarcinoma / Liyanage, U.K., Moore T. T., Joo H. G., Tanaka Y. I lenmann V., Doherty

44. G., Drebin J. A., Strasberg S. M., Eberlein T. J., Goedegebuure P. S., and Linehan D. C. // J. Immunol. 2002. - Vol. 169. - P. 2756-2761.

45. CD4+CD25+ Immune Regulatory Cells Are Required for Induction of Tolerance to Alloantigen via Costimulatory Blockade / Patricia A., Taylor A., Noelle R. B., and Blazara B. R. // J. Exp. Med. 2001. - Vol. 193, № 11. -P. 1311-1318.

46. Sakaguchi, S. Regulatory T cells: key controllers of immunologic self-tolerance. Cell. - 2000. - Vol. 101. - P. 455-458.

47. Fehervari Z., Sakaguchi S. CD4+Tregs and immune control. O Clin. Invest. -2004. - Vol. 114, N. 9 - P. 1209 - 1217.

48. Sakaguchi, S. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic self-tolerance and negative control of immune responses. Annu. Rev. Immunol. 2004. - Vol. 22. - P. 531-562.

49. Sakaguchi S. Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+ regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self. Nat Immunol. - 2005. -Vol. 6.-P. 345-352.

50. Autoimmune disease as a consequence of deverojpmental'abrtoi;maility,,b,f'a,T-li cell subpopulation / Asano M., Toda M., Sal<^agtichi"'N.j; Sakaguchi S. If J, ExpV Med. 1996. - Vol. 184. - P. 387-396. ' ' V- '^', ' V'."V, ^ 1'""' S^' * ''it*''' 1 J

51. Immunologic self-tolerance maintained by -CD2 ,CD naturally Anergic and <■' suppressive T cellsinduction of autoimmune disease'by breaking their• ' ' i •' ' ' 111anergic/suppressive state / Takahashi T., Kuniyasu Y., Toda M.,, Sakaguchi\\

52. N., Itoh M., Iwata M., Shimizu J., Sakaguchi S. // Int. Immunol. 19,98: -Vol. 10. - P. 1969-1980. ' ' V ■

53. Shevach E.M. Regulatory T cells in autoimmmunity. Annu. Rev. Immunol.- 2000. Vol. 18. - P. 423-449.i

54. CD4+CD25+ T cells inhibit both the induction and effector function of autoreactive T cells and represent a unique lineage of immunoregulatory cells / Suri-Payer E., Amar A. Z., Thornton A. M., Shevach E. M. // J. Immunol. -1998. Vol. 160 -P. 1212-1218.

55. Shimizu J., Yamazaki S., Sakaguchi S. Induction of tumor immunity by removing CD25+CD4+ T cellsa common basis between tumor immunity and autoimmunity. J. Immunol. - 1999. - Vol. 163. - P. 5211-5218.

56. Shevach E. M. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nat. Rev. Immunol. - 2002. - Vol. 2. - P. 389- 400.

57. Human CD4(+)CD25(+) thymocytes and peripheral T cells have immune suppressive activity in vitro / Stephens L. A., Mottet C., Mason D., Powrie F. // Eur. J. Immunol. 2001. - Vol. 31. - P. 1247-1254.

58. Zou L., Barnett B., Safah H., et al. Bone marrow is a reservoir for CD4+CD25+ regulatory T cells that traffic through CXCL12/CXCR4 signals.- Cancer Res. -2004. Vol. 64.-P. 8451-8455.

59. Wei S., Kryczek I., Zou W. Regulatory T-cell compartmentalization and trafficking. Blood. - 2006. - Vol. 108, № 2. - P. 426-431.

60. Ahmadzadeh M., Rosenberg S. A. IL-2 administration increases CD4+CD25high Foxp3+ regulatory T cells in cancer patients. Blood. -2006.-Vol. 107.-P. 2409-2414.

61. Sereti I., Imamichi H., Natarajan V., et al. In vivo expansion of CD4CD45RO-CD25 T cells expressing Foxp3 in IL-2-treated HIV-infected patients.-J. Clin. Invest.-2005.-Vol. 115.-P. 1839-1847.

62. Zhang H., Chua K. S.3 Guimond M., et al. Lymphopenia and interleukin-2 therapy alter homeostasis of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nat Med. — 2005.-Vol. 11.-P. 1238-1243.

63. Cesana G. C., DeRaffele G., Cohen S., et al. Characterization of CD4+CD25+ regulatoiy T cells in patients treated with high-dose interleukin-2 for metastatic melanoma or renal cell carcinoma. J. Clin. Oncol. — 2006. — Vol. 24.-P. 1169-1177.

64. Bacteria-triggered CD4+ T regulatory cells suppress Helicobacter hepaticus-induced colitis / Kullberg M. C., Jankovic D., Gorelick P. L., Caspar P., Letterio J. J., Cheever A. W., Sher A. // J. Exp. Med. 2002. - Vol. 196. -P. 505-515.

65. Antony P. A, Restifo N. P. CD4+CD25+ T regulatory cells, immunotherapy of cancer, and interleukin-2. J. Immunother. - 2005. - Vol. 28. - P. 120128.

66. Control of NK cell functions by CD4+CD25+ regulatory T cells / Ralainirina N., Poli A., Michel T., Poos L., Andres E., Hentges F., Zimmer J. // Journal of Leukocyte Biology. 2007. - Vol. 81. - P. 144-153.