Экспериментальное обоснование комплексного метода адаптивной иммунотерапии злокачественных новообразований тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат медицинских наук Халтурина, Евгения Олеговна

• Халтурина, Евгения Олеговна
• кандидат медицинских наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Халтурина, Евгения Олеговна

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Принципы противоопухолевого иммунитета. Иммунологическая компетентность и рак

1.2. Характеристика эффекторов противоопухолевого иммунитета

1.2.1. Цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), Т-киллеры

1.2.2. Натуральные киллеры (НК)

1.2.3. НКТ-клетки

1.2.4. Лимфокинактивированные клетки киллеры (ЛАК). ЛАК-феномен

1.2.5. Дендритные клетки

1.3.Адоптивная иммунотерапия злокачественных новообразований

1.3.1. ИЛ-2/ЛАК-терапия

1.3.2. TIL-терапия

1.4. Противоопухолевые вакцины на основе антигенпрезентирующих клеток

2. Материалы и методы исследования

2.1. Материалы исследования

2.1.1. Экспериментальные животные

2.1.2. Клеточные линии

2.1.3. Модели опухолей и методика их перевотки

2.1.4. Питательные среды

2.1.5. Реактивы

2.2. Методы исследования

2.2.1. Методика выделения МНК периферической крови

2.2.2. Методика выделения МНК из интактной ткани и из паратуморальной области печени

2.2.3. Методика выделения CD34+ клеток-предшественников из костного мозга и селезенки мышей и человека

2.2.4. Методика выделения МНК из экссудата

2.2.5. Световая микроскопия

2.2.6. Цитологическое исследование

2.2.7. Электронная микроскопия

2.2.8. Окрашивание клеток витальным красителем МТТ.

2.2.9. Цитотоксический тест

2.2.10. Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.2.11. Проточная цитометрия (FACS-анализ) и характеристика антител

2.2.12. Статистические методы 62 3. Результаты собственных исследований

3.1. Способ генерации и особенности иммунофенотипа, морфологии и функциональной активности JIAK клеток

3.1.1 .Способ генерации ЛАК клеток из различных источников

3.1.2. Цитотоксическая активность JIAK

3.1.3. Изучение спонтанной продукции цитокинов ЛАК

3.1.4. Цитологическая характеристика ЛАК

3.1.5. Иммунофенотип ЛАК

3.2. НКТ-клетки

3.3. Способы генерации и характеристика дендритных клеток

3.3.1.Получение ДК из CD34+ предшественников костного мозга,

МНПК и селезенки мышей и человека

3.3.2. Оценка продукции цитокинов ДК различной степени зрелости

3.3.3. Морфологические особенности ДК (цитологическая картина)

3.3.4. Изучение особенностей иммунофенотипа ДК человека и мышей

3.4. Изучение противоопухолевого эффекта совместного применения ДК и ЛАК в системе in vitro

3.5. Исследование противоопухолевой активности ЛАК и аутовакцин на основе ДК на перевиваемых опухолях

4. Обсуждение

5. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальное обоснование комплексного метода адаптивной иммунотерапии злокачественных новообразований»

Актуальность работы. Проблема лечения онкологических заболеваний по сей день остается актуальной для современной медицины. Традиционные методы лечения (хирургический, химио и лучевая терапия) исчерпали свои возможности и в последние годы их эффективность не увеличивается. Поэтому последние десятилетия наблюдается новый всплеск повышенного интереса к иммунотерапии злокачественных опухолей, что, по-видимому, связано со значительными успехами в области иммунологии, онкологии и молекулярной биологии, которые более глубоко раскрыли современные представления об иммунопатогенезе опухолей, механизмах канцерогенеза и регуляции опухолевого роста и подтвердили перспективность развития достаточно нового направления в терапии опухолей - биотерапии. В основе применения метода биотерапии лежит использование естественных для организма веществ или активация естественных механизмов иммунной защиты, то есть этот вид терапии является наиболее патогенетичным по сравнению с существующими традиционными способами лечения злокачественных новообразований.

Однако до настоящего времени в нашей стране получили развитие только отдельные направления этого перспективного метода. Несмотря на то, что биотерапия включает очень разные по характеру методы и подходы, одно из ведущих мест занимают методы, воздействующие на естественный противоопухолевый иммунитет с целью его активации.

В настоящее время существуют два основных направления в иммунотерапии злокачественных новообразований: первое основано на активации неспецифического звена иммунитета посредством цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ), натуральных киллеров (НК), активность которых может быть существенно увеличена под воздействием ИЛ-2 и интерферона, и JIAK-клеток, генерированных in vitro из лимфоцитов крови, селезенки, печени или опухолевого экссудата в присутствии ИЛ-2; второе направление-активация специфического противоопухолевого звена посредством создания лечебных и профилактических вакцин на основе дендритных клеток (ДК).

Одними из наиболее ярких представителей эффекторов неспецифического иммунитета являются ЛАК клетки. Механизм их действия состоит из прямого цитотоксического поражения аутологичных опухолевых клеток, а также их способности синтезировать и высвобождать биологические активные вещества, таких как цитокины, оказывающие регуляторное действие на другие эффекторы иммунной системы. Целесообразность применения цитокинов для иммунотерапии обусловлена эффектами, оказываемыми ими на функции клеточного иммунитета. Так ИЛ-2 усиливает цитотоксическую активность НК, расширяет спектр их цитотоксического действия, индуцирует дифференцировку цитотоксических клеток с широким спектром действия - ЛАК клеток. ЛАК в сочетании с ИЛ-2 уже достаточно продолжительное время используются в иммунотерапии злокачественных новообразований. В клинических исследованиях начальный опыт применения ИЛ2/ЛАК - терапии связан с диссеминированными формами рака (меланома, рак почки, колоректальный рак, лимфома и т.д.). В настоящее время спектр локализаций злокачественных новообразований, при которых эффективна ИЛ-2/ЛАК терапия, значительно расширен. Кроме того, на данном этапе развития биотерапии рака для монотерапии или для совместного применения с ЛАК клетками клинически и экспериментально обосновано применение низких иммуностимулирующих доз цитокинов (до 1 млн. ME), не вызывающих миелодепрессию, иммуносупрессию и других побочных эффектов.

Внедрение ИЛ-2/ЛАК - иммунотерапии в клиническую практику расширяет спектр возможностей противоопухолевого лечения. Помимо того, этот вид терапии имеет преимущества по сравнению с традиционными методами: отсутствие токсичности, хорошая переносимость лечения, возможность применения совместно с другими традиционными методами лечения, а также в случаях лекарственной резистентности, стимуляция местного противоопухолевого клеточного иммунитета, приводящая к лизису опухоли, а также улучшение качества и продолжительности жизни пациентов. По данным современной зарубежной литературы, метод ИЛ2/ЛАК - терапии является универсальным, поскольку возможно его применение практически при любых нозологических формах злокачественных новообразований (меланома, рак легкого, рак яичников, рак желудка и т.д.).

Изложенный выше метод иммунотерапии с использованием JIAK и ИЛ-2 направлен на стимуляцию неспецифического клеточного противоопухолевого иммунитета. JIAK, подобно НК- клеткам, способны лизировать опухолевые клетки антиген-независимым образом и поэтому не требуют сложного этапа антигенной презентации с участием антигенпрезентрующих клеток. В месте с тем, при этом варианте иммунотерапии ЦТЛ, составляющие значительную часть лимфоидной популяции и отвечающие за специфический иммунитет, практически не реализуют своих возможностей. Для активации специфического противоопухолевого иммунитета в последнее время созданы методы получения аутовакцин на основе дендритных клеток (ДК). ДК являются особой популяцией клеток, которая обладает высокой способностью презентировать наивным Т-лимфоцитам специфические опухолевые антигены и делать их иммунными по отношению к клеткам опухоли. Кроме того, ДК способны активировать НК и Т- и В- клетки памяти. ДК генерируются из периферических стволовых клеток, CD34+ предшественников костного мозга, моноцитов/макрофагов периферической крови посредством культивирования с различными цитокиновыми коктейлями. В основном для получения многочисленной популяции ДК, пригодной для клинического применения, используют колониостимулирующие факторы и ИЛ-4, хотя возможны и другие сочетания цитокинов. ДК инкубируются с опухолевыми антигенами (лизат опухолевых клеток), вводятся в организм пациента-опухоленосителя и активируют in vivo специфический противоопухолевый иммунитет. Процедура предварительного поглощения и процессинга антигена ДК, производимая ех vivo, позволяет повысить степень распознавание опухолевых клеток, характеризующихся низкой иммуногенностью, Т-лимфоцитами. Клинические испытания аутовакцин на основе ДК проводятся у больных с распространенными формами злокачественных новообразований, традиционно считающихся чувствительными к иммунотерапии (меланома, рак почки и колоректальный рак). Вместе с тем эта вакцинотерапия может быть использована и при других нозологических формах рака, например, показана ее клиническая эффективность и при раке яичников. Очевидно, что наиболее оптимально применение аутовакцин после проведения радикальной операции и стандартной химиотерпии, т.е. после максимальной циторедукции опухолевой массы. Кроме того, хирургическое вмешательство позволяет получить необходимое количество опухолевой ткани, антигены которой впоследствии будут презентированы ДК.

Наиболее перспективным направлением в развитии биотерапии опухолей следует считать сочетание методов активации специфического и неспецифического иммунитета. Иммунотерапия ЛАК - клетками (в сочетании с малыми (иммуностимулирующими) дозами цитокинов) и аутовакцинами на основе ДК должна проводиться после максимальной циторедукции с целью профилактики рецидивов заболевания и лечения резидуальной болезни. При распространенных формах злокачественных новообразований использование иммунотерапии целесообразно в тех случаях, когда возможно осуществить локальное введение активированных эффекторов иммунитета и цитокинов с целью создания действующей концентрации в области опухолевого роста. Широкое внедрение комбинированного метода ИЛ-2/ЛАК - и вакцинонотерапии в клиническую практику требует проведения экспериментальных исследований, направленных на изучение эффектов межклеточного взаимодействия вводимых эффекторов иммунитета, а таюке проведения стандартизации параметров используемых ЛАК и ДК. Кроме того, необходимо освоение достаточно сложной методики генерации активированных клеток и ДК, требующих достаточного лабораторного оснащения.

Цель и задачи исследования

Цель: экспериментально обосновать применение комплексного метода адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований, основанного на совместном применении J1AK и вакцин на основе ДК.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методику генерации JIAK из различных источников (МНК периферической крови, селезенки, опухолевого экссудата, печени) с использованием разных активаторов.

2. Изучить особенности морфологии, иммунофенотипа и функциональной активности JIAK мышей и человека на разных сроках их культивирования.

3. Исследовать морфологические, фенотипические и функциональные характеристики НКТ- клеток печени.

4. Оценить возможность генерации ЛАК из НКТ печени и изучить их морфофункциональные параметры.

4. Оптимизировать методики вьщеления и культивирования ДК мышей и человека из различных источников с использованием активаторов разного типа.

5. Провести сравнительную характеристику морфофункциональных и иммунофенотипических особенностей ДК различной степени зрелости.

6. Изучить эффективность противоопухолевого действия ЛАК и ДК при их совместном применении в опытах in vitro.

7. Провести экспериментальное обоснование комбинированного применения ДК и ЛАК в опытах на мышах с привитой опухолью СаО-1.

8. Разработать параметры стандартизации ЛАК и ДК человека для клинического применения в области иммунотерапии злокачественных новообразований.

Научная новизна

В результате проведенной работы:

- впервые проведен детальный анализ морфофункциональных и иммунофенотипических характеристик ЛАК клеток, полученных из различных источников (МНК периферической крови, селезенки, опухолевого экссудата, печени) посредством использования разных активаторов (ИЛ-2, ФГА, МП-2);

- впервые исследованы морфологические, функциональные и фенотипические особенности НКТ- клеток печени, а также возможность генерации из них ЛАК с последующим изучением их характеристик;

- впервые проведено сравнительное исследование эффективности комбинированного противоопухолевого действия ДК и ЛАК.

Получены новые данные:

- относительно иммунофенотипических особенностей ДК мышей и человека на различных этапах из созревания и дифференцировки;

- об особенностях цитологического профиля ЛАК и ДК;

- о цитотоксической и НК - активности ЛАК клеток различного происхождения на разных этапах их культивирования при исследовании 4-х соотношений клеток-мишеней/эффекторов (1:0,5; 1:1; 1:2; 1:5).

Уточнены данные:

- относительно оптимальных сроков культивирования ДК мышей и человека для получения популяции зрелых ДК, используемых в целях иммунотерапии и иммунопрофилактики злокачественных новообразований;

- относительно сроков генерации ЛАК, используемых для проведения адоптивной иммунотерапии злокачественных новообразований.

Научно-практическая значимость

Научная значимость настоящей работы заключается:

1. В изучении механизмов активации мононуклеарных клеток периферической крови, селезенки, опухолевого экссудата и печени.

2. В изучении механизмов взаимодействия активированных клеток с ДК различной степени зрелости и дифференцировки.

3. В выявлении закономерностей, причин и сроков активации моноцитов/макрофагов периферической крови, селезенки, экссудата, печени.

4. В создании концепции о взаимосвязи и взаимодействии специфических и неспецифических факторов иммунитета в противоопухолевой защите организма.

Практическая значимость работы заключается:

1. В экспериментальном обосновании целесообразности комбинированного применения ЛАК и ДК для целей биотерапии рака.

2. В предложении основных морфофункциональные и иммунофенотипических параметров ЛАК и ДК человека, которые могут быть использованы для стандартизации методов иммунотерапии и иммунопрофилактики злокачественных новообразований.

3. В обосновании использования для оценки противоопухолевой активности мышиных ЛАК НК - чувствительную клеточную линию эритробластного лейкоза человека К-562.

4. В выявлении новых активаторов, используемых для получения

ЛАК.

Положения, выносимые на защиту:

1. ЛАК могут быть получены из различных источников с использованием активаторов разной природы и обладают характерными особенностями морфологии, иммунофенотипа и функциональной активности.

2. Из пораженной опухолевым процессом печени может быть выделена особая субпопуляция лимфоцитов - НКТ- клетки, экспрессирующая на своей поверхности маркеры Т и НК клеток. Из НКТклеток могут быть получены ЛАК, которые по своей противоопухолевой активности превосходят ЛАК, генерированные из МНК крови.

3. Зрелые ДК обладают антигенпрезентирующей активностью и способны инициировать специфический противоопухолевый ответ.

4. Совместное использование вакцин на основе ДК и ЛАК характеризуется эффектом синергизма и позволяет повысить эффективность противоопухолевой терапии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 5 статей в центральной печати и 8 тезисов в материалах международных конференций и съездов.

1. Обзор литературы

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Халтурина, Евгения Олеговна

5. Выводы

1) Разработана методика получения ЛАК из различных источников (МНК периферической крови, селезенки, опухолевого экссудата, печени) с использованием разных активаторов (ИЛ-2, ФГА, МП-2).

2) ЛАК обладают рядом морфологических особенностей (наличие лимфоидных элементов различной степени зрелости, крупных активированных лимфоцитов типа пролимфоцитов и иммунобластов). Фенотипически ЛАК представляют собой клетки с повышенной экспрессией активационных антигенов CD38 и HLA-DR и молекулы адгезии CD58 и снижением экспрессии дифференцировочных антигенов (CD3, CD4 CD8). НК - активность ЛАК находится в диапазоне от 31,7±8,4% до 100% (при соотношении клеток-мишеней и эффекторов 1:5). ЛАК обладают способностью к продукции основных регуляторных цитокинов (ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-ip).

3) НКТ-клетки выделяются из параметастатических участков печени, обладают высокой спонтанной НК - активностью - гибель 90% опухолевых клеток - и могут быть охарактеризованы как активированные лимфоциты типа иммунобластов. Они экспрессируют на своей поверхности маркеры Т лимфоцитов, маркер НК - клеток CD16 (15-34%) и молекулы адгезии CD57, CD58 (порядка 4050%). Из НКТ клеток посредством ИЛ-2 могут быть генерированы ЛАК с более высоким уровнем экспрессии активационных антигенов CD38 и HLA-DR и цитотоксической активности, чем ЛАК, полученные из МНПК.

4) Оптимизированы методики выделения и культивирования ДК мышей и человека из различных источников (костный мозг, селезенка, МНК периферической крови) с использованием активаторов разного типа (ИЛ-4, ГМ-КСФ, ФНО-а, ЛПС различного происхождения).

5) Особенностями субпопуляции незрелых ДК являются большие размеры клеток, многочисленные вуалевидные отростки, эксцентрично расположенное ядро и вакуолизация цитоплазмы наряду со сниженной способностью к спонтанной продукции цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-ip и ФНО-а) и незначительным уровнем экспрессии молекул адгезии, костимуляции и антигенного представления.

6) Особенностью зрелых ДК является их способность к спонтанной продукции основных регуляторных цитокинов (ИЛ-8, ИЛ-1Р и ФНО-а) и высокие уровни экспрессии рецепторов антигенного представления, костимуляции и адгезии.

7) В опытах in vitro и in vivo показана противоопухолевая активность ДК - вакцин и ЛАК. Наиболее эффективным является их комбинированное применение.

8) Предложены параметры стандартизации ЛАК и ДК для клинического применения.

Практические рекомендации

Согласно полученным экспериментальным данным комбинированное применение вакцин на основе ДК и ЛАК может быть рекомендовано для применения в онкологической практике с целью иммунотерапии и иммунопрофилактики злокачественных новообразований.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Халтурина, Евгения Олеговна, 2004 год

1. Билынский Б. Т., Володько Н. Т., Шпарык А. В. Иммунологические механизмы естественной противоопухолевой резистентности.- К., 1991.

2. Винсент Т. ДеВита, мл. Сэмюэля Хеллмана, Стивена А. Розенберга. Биологические методы лечения онкологических заболеваний,- М., 2002.

3. Гусева С. А., Федько А. А., Волобуева 3. В. Гематол. и трансфузиол. М., 1991, № 2. - С. 10-12.

4. Давыдов М.И., Нормантович В.А., Киселевский М.В., Волков С.М. и др. Адоптивная иммунотерапия при опухолевых плевритах: клинико-лабораторное исследование// Российский онкологический журнал. 2000, № 6.-С. 14-17.

5. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С., Воробьев А. А. Эндогенные иммуномодуляторы. СПб., 1992.

6. Киселевский М.В., Блюменберг А.Г. Адоптивная иммунотерапия рака яичников// Сборник статей, приуроченный к Европейской школе по онкологии.- 2001.- С. 164-176.

7. Кузнецова А.В., Т.И. Данилова, О.П. Гладских, А.А. Иванов, М.А. Пальцев. Дендритные клетки и их использование в иммунотерапии//Молекулярная медицина.- 2003, №3.- С.3-17.

8. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунная недостаточность. Выявление и лечение.-М., 2003.

9. Ломакин М. С. Иммунобиологический надзор. М., 1990.

10. Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е., Долгов В.В., Лабораторная гематология.-М., 2002.

11. Макаренкова В.П., Кост Н.В., Щурин М.Р. Система дендритных клеток: роль в индукции иммунитета и в патогенезе инфекционных,12