Влияние нейротрофического фактора головного мозга BDNF на состояние сетчатки в эксперименте тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат медицинских наук Бакаева, Лариса Мевлединовна

• Бакаева, Лариса Мевлединовна
• кандидат медицинских наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Бакаева, Лариса Мевлединовна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Современные биотехнологические методы коррекции патологии заднего отрезка глаза.

1.2. Нейротрофический фактор головного мозга - BDNF в

1.3. Нейротрофический фактор головного мозга - BDNF в экспериментальной офтальмологии.

1.4. Методы генно-клеточной терапии в экспериментальной офтальмологии с использованием BDNF.

1.5. Нейротрофический фактор мозга BDNF в клинико-диагностической офтальмологии.

1.6. Клеточные и органотипические культуры как экспериментальная модель.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Экспериментальные исследования на органотипических культурах сетчатки.

2.1.1. Характеристика экспериментального материала.

2.1.2. Методы исследования органотипических культур сетчатки.

2.2. Экспериментальные исследования на животных.

2.2.1. Характеристика экспериментального материала.

2.2.2. Методы исследования.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ НЕЙРОТРОФИЧЕСКОГО ФАКТОРА

ГОЛОВНОГО МОЗГА BDNF НА ОРГАНОТИПИЧЕСКИЕ КУЛЬТУРЫ СЕТЧАТКИ.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ РЕКРМБИНАНТНОГО BDNF И КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ ЕГО ЭКСПРЕССИИ НА СОСТОЯНИЕ СЕТЧАТКИ

В ЭКСПЕРИМЕНТЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние нейротрофического фактора головного мозга BDNF на состояние сетчатки в эксперименте»

Актуальность проблемы. В настоящее время одной из важнейших медико-социальных проблем в отечественной и зарубежной офтальмологии является патология сетчатки и зрительного нерва, приводящая к значительному снижению зрения, слепоте и инвалидности.

Функциональная реабилитация сетчатки и зрительного нерва при патологии различного генеза в настоящее время остается актуальной задачей офтальмологии.

Одной из основных причин слепоты и слабовидения в настоящее время в развитых странах является центральная инволюционная дистрофия (Beatty S. et al., 2001; Perry W.Y., 2002; Thornton J. et al., 2005; Clemons Т.Е. et al, 2005). В возрасте старше 40 лет заболевание развивается в 25-40% случаев, старше 60 лет - в 58-100% случаев (Klein R., Klein В., 2002). Первичная инвалидность при центральной инволюционной дистрофии регистрируется у лиц в работоспособном возрасте в 11% случаев, в возрасте старше 60 лет - в 28% случаев (Либман Е. С. И др., 2006). Многочисленные исследования, проведенные в последние годы, указывают на прогрессирующее увеличение числа пациентов с центральной инволюционной дистрофией сетчатки (Либман Е.С. и др., 2000; La-Heij Е.С., 2001; Мошетова Л. К. и др., 2006). Korner-Stiefbold U., 2001.

Патология глазного дна воспалительной этиологии также является одной из основных причин инвалидности по зрению, что обусловливает социальную значимость этой группы заболеваний (Либман Е.С.и др., 2000; Южаков A.M. и др., 2000; Архипова Л.Т., 2006). В восстановительном лечении нуждаются от 50 до 90 % инвалидов по зрению при крайне незначительной реализации этой потребности в большинстве регионов - не более 13 % (Либман Е.С. и др., 2000; 2005).

За последнее десятилетие отмечено повышение в 2 раза уровня инвалидности с частичной атрофией зрительного нерва. Возросла доля трудноустранимой приобретенно-наследственной офтальмопатологии. У детей основными причинами слепоты и слабовидения остаются частичная атрофия зрительного нерва, дистрофия сетчатки и амблиопия, которые в детской глазной патологии составляют от 19,4 до 32,4% (Либман Е. С., 2000).

Несмотря на успехи, достигнутые в современной офтальмологии, слабовидение, слепота и инвалидность по зрению продолжают неуклонно возрастать. За последние 20 лет численность слепых и слабовидящих во всем мире увеличилась на 12 миллионов человек (Либман Е. С. И др., 2006).

Поиск и разработка новых методов лечения является актуальной проблемой офтальмологии.

Большие возможности для восстановления структуры и функции поврежденных тканей открывает регенеративная медицина с использованием нейротрофических факторов.

BDNF - это белок с молекулярной массой 13 килоДальтон, который принадлежит к классу цитокинов, семейству факторов роста и подсемейству нейротрофинов; экспрессируется в глиальных и, преимущественно, в нейрональных клетках. Впервые этот фактор был описан в 1987 г.

BDNF играет важную роль в развитии и функционировании ЦНС и существенное имеет значение в развитии ее различных патологических состояний. В работах, посвященных исследованиям нейродегенеративных заболеваний, ишемических повреждений и травм ЦНС установлено, что BDNF обладает выраженными нейропротективными свойствами, угнетает клеточный апоптоз, препятствует гибели нейронов и стимулирует рост холинэргических нервных волокон.

Результаты проведения первых зарубежных экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что BDNF в условиях патологии и повреждения выполняет функции нейропротектора и сохраняет жизнеспособность фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки. Однако, незначительное число исследований, их единообразие (используемые экспериментальные модели, в основном - глаукомная и повреждение зрительного нерва, способ введения фактора - интравитреальный) и некоторая, при этом, противоречивость полученных результатов (уменьшение количества TrkB рецепторов ганглиозных клеток сетчатки при интравитреальном введении BDNF животным без офтальмопатологии; увеличение жизнеспособности клеток при повторных инъекциях по результатам одних авторов и некоторый дозозависимый эффект по результатам других авторов) позволяют только сделать предположение о том, что BDNF является реальным претендентом на роль нейропротектора в лечении патологии заднего отрезка глаза. Для подтверждения этого предположения и получения в дальнейшем рекомендаций по внедрению BDNF в клиническую практику необходимо проведение детальных, всесторонних исследований его влияния на ткани глаза в условиях без повреждения, повреждения и патологии различного генеза, при различных дозах и способах его введения. Необходимо выявить наиболее оптимальные и полезные свойства BDNF в различных условиях и исключить его возможные отрицательные эффекты.

В настоящее время в различных областях биологии и медицины широко проводятся исследования, направленные на изучение возможностей применения генетически модифицированных клеток с трансфицированными генами нейротрофических факторов (BDNF, NT-3, GDNF и т.д.).

Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена.

Предполагается, что применение методов генно-клеточной терапии в офтальмологии может быть одним из самых приоритетных направлений, так как в этой области риск нежелательной трансфекции (переноса генетической информации) из-за относительной изолированности структур глазного яблока и риск онкогенеза, так как большинство клеток в тканях глаза не претерпевают деления, являются минимальными.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что генно-клеточные конструкции с геном BDNF, также как и рекомбинантный BDNF, в условиях патологии и повреждения выполняют нейропротективные функции и сохраняют жизнеспособность фоторецепторов и ганглиозных клеток сетчатки. Однако единичное число исследований позволяет сделать тоже только предположение о возможности применения генно-клеточных конструкций в лечении патологии заднего отрезка глаза. Кроме того, в работах используются только аденовирусные и аденовирусоассоциированные векторы, перед мировой же практикой в настоящее время стоит серьезная проблема замены вирусных векторов на более безопасные носители. В связи с этим необходимо проведение дальнейших, более детальных и всесторонних исследований, направленных на оптимизацию генно-клеточных конструкций, изучение возможности' их применения в условиях повреждения и патологии различного генеза, различной степени выраженности, при различных дозах и способах введения.

В связи с этим- цель исследования - изучить влияние рекомбинантного BDNF и клеточных систем-его экспрессии на состояние сетчатки в эксперименте.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить влияние рекомбинантного BDNF на состояние органотипических культур сетчатки.

2. Оценить характер изменений биоэлектрической активности интактной сетчатки экспериментальных животных и состояние ее структурной организации при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии.

3. Определить сроки жизнеспособности (переживания) клеточных систем экспрессии BDNF в тканях глаза и особенности их функционирования при различных способах введения в нормальных условиях и в; условиях лазерного повреждения сетчатки.

4. Изучить динамику биоэлектрической активности сетчатки при различных способах введения рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии на модели лазерного повреждения.

5. Оценить морфофункциональное состояние сетчатки после: ее лазерного повреждения в зависимости от применения рекомбинантного BDNF, клеточных систем его экспрессии и различных способов их введения.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

На основании проведения исследования влияния рекомбинантного BDNF на состояние органотипических культур сетчатки животных и человекам и применения различных способов культивирования установлено, что при. его концентрации 100 нг/мл увеличивается клеточная жизнеспособность в культурах, развиваются процессы активной, клеточной миграции и роста (3-1II-. тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы.

Установлено^ что рекомбинантный BDNF, особенно при супрахориоидальном способе введения, способствует активному восстановлению ретинального электрогенеза при его угнетении в результате инструментальной травмы предварительно интактной сетчатки; клеточные системы экспрессии BDNF при супрахориоидальном введении вызывают повышение ее функциональной активности до суперномальных значений с последующей нормализацией; показателей.

В условиях рети налы юго повреждения выявлено; что BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых, зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза.

Установлено, что генно-инженерные конструкции типа G7-1M и НЕК 293 обладают высокой жизнеспособностью при интравитреальном способе их введения и способностью к активной миграции к зоне повреждения.

Выявлено, что при супрахориоидальном способе введения рекомбинантного BDNF угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки.

Показано, что при супрахориоидальном использовании клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293, в течение первых двух недель сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при применении клеточной системы экспрессии НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения.

На основании данных гистоморфометрического анализа установлено; что наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем, экспрессии BDNF, особенно НЕК 293.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые в экспериментальной офтальмологии в качестве клеточных систем экспрессии BDNF для изучения влияния фактора на состояние сетчатки использованы генно-инженерные конструкции типа G7-1M и НЕК 293.

Установлено, что рекомбинантный BDNF в дозе 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1M и НЕК 293 в дозе 500 000 при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения являются безопасными - не оказывают токсического действия на ткани глаза, не вызывают аллергических реакций и реакций иммунного отторжения при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения; что в условиях ретинального повреждения BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза и наиболее высокий морфофункциональный результат наблюдается при использовании клеточных систем экспрессии BDNF.

Полученные результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о целесообразности и перспективности проведения дальнейших исследований^ связанных с использованием BDNF в клинической практике, и являются базой для разработки практических подходов его использования в офтальмологии.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В органотипических культурах сетчатки животных и человека при их культивировании с рекомбинантным BDNF в- концентрации 100 нг/мл повышается, уровень клеточной жизнеспособности; увеличивается зона; роста; активируются процессы клеточной миграции: и формирования (З-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков; .

2. Генно-инженерные конструкции? G7-1 М и НЕК 293; используемые в качестве клеточных систем экспрессии BDNF, обладают высокой- жизнеспособностью и способностью к активной миграции в условиях лазерного повреждения сетчатки.

3. При интравитреальном и: супрахориоидальном? способах введения, рекомбинантный BDNF в, дозе: 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1М и НЕК 293 в дозе 500 ООО являются безопасными, так как не вызывают аллергических реакций, реакций иммунного отторжения и не токсичны для тканей глаза; наличие у BDNF в условиях ретинального повреждения? нейропротекторных свойств, степень выраженности? которых, зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза:

4. Процесс активного восстановления электрогенеза? при его угнетении в результате инструментальной травмы, предварительно интактной сетчатки, при? интравитреальном и супрахориоидальном способах введения BDNF; повышение функциональной активности сетчатки до суперномальных значений с последующей нормализацией показателей при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF.

5. Наличие при применении рекомбинантного BDNF, особенно супрахориоидальном способе его введения, менее выраженного и более отсроченного эффекта угнетения функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении; при супрахориоидальном применении клеточных систем экспрессии BDNF - на ранних сроках более высокой функциональной активности сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при применении клеточной системы экспрессии НЕК 293 - более высокого функционального результата на протяжении длительного периода времени.

6. Наличие при лазерном повреждении сетчатки активно протекающих репаративных процессов при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF, особенно НЕК 293.

Апробация работы

Основные положения диссертации* доложены и обсуждены на совместных научно-практических конференциях ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» и кафедры глазных болезней ГОУ ВПО Московского государственного медико-стоматологического университета, на юбилейной научно-практической конференции1 "Федоровские чтения - 2007" (Москва, 2007), на 8-ой Всероссийской научно-практической конференции "Федоровские чтения - 2008" (Москва, 2008). Апробация диссертации проведена на научно-клинической конференции ФГУ МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова Росмедтехнологии» (протокол клинической конференции от 16 октября 2009г.)

ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 1 в журнале, рекомендованном ВАК РФ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка, 3 таблицы. Работа состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, заключения и выводов. Библиография включает 251 литературных источников, из них 51 отечественных и 200 зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Бакаева, Лариса Мевлединовна

ВЫВОДЫ

1. В органотипических культурах сетчатки при культивировании с BDNF в концентрации 100 нг/мл увеличивается клеточная жизнеспособность, развиваются процессы активной клеточной миграции и роста [З-Ш-тубулин иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; зона роста эксплантатов на 21 и 30 сутки больше, чем в контроле, соответственно, в 2 и 3 раза.

2. Рекомбинантный BDNF, особенно при супрахориоидальном способе введения, способствует активному восстановлению электрогенеза сетчатки при его угнетении в ответ на инструментальную травму предварительно интактной сетчтакщклеточные системы экспрессии BDNF при супрахориоидальном введении вызывают повышение ее функциональной активности - амплитуда в-волны ЭРГ увеличивается до суперномальных значений с нормализацией показателей к 21 суткам.

Изменений структуры сетчатки, нетипично расположенных клеток при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения рембинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии не выявлено.

3. Клеточные системы экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293 обладают высокой жизнеспособностью, особенно при интравитреальном способе введения (до 30 суток) и способностью к активной миграции в зону повреждения сетчатки.

4. При супрахориоидальном способе введения рекомбинантного BDNF угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки - на 7 сутки эксперимента амплитуда а- и в-волн ЭРГ в опытных глазах выше, чем в контрольных на 23 и 21%, соответственно; на 14 сутки - на 14% и 28%; на 30 сутки наблюдаются менее существенные различия.

5. При супрахориоидальном способе введения клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293 в течение первых двух недель после лазерного повреждения сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при использовании клеточной системы экспрессии НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения - на 30 сутки амплитуда а- и -в-волны ЭРГ выше, чем у животных с клеточной конструкцией G7-1M в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, и выше, чем у животных с супрахориоидальным введением рекомбинантного BDNF в 1,3 раза.

6. Наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF, особенно НЕК 293; на 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии G7-1M и НЕК -293 меньше, чем в контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и в опытных глазах с рекомбинантным BDNF в 1,5 раза.

7. Рекомбинантный BDNF в дозе 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1М и НЕК 293 в дозе 500 000 являются безопасными, не оказывают токсического действия на ткани глаза, не вызывают аллергических реакций и реакций иммунного отторжения при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения; в условиях ретинального повреждения BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых зависит от способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа состояла из двух экспериментальных разделов.

Первый раздел работы был посвящен изучению влияния BDNF на органотипические культуры сетчатки. В работе было использовано 72 эксплантата сетчатки человека.Преимуществами роллерного метода культивирования являются максимальная сохранность цитоархитектоники и межклеточных взаимоотношений; отсутствие клеточного влияния культуральной среды. В связи с тем, что, несмотря на значительные преимущества, роллерный метод культивирования имеет некоторые недостатки (отсутствие ясной морфологической картины в центре «ретинальных телец» и высокая трудоемкость) в работе был использован второй метод культивирования - в прикрепленном виде.

BDNF добавлялся в среду в концентрации 100 нг/мл - эффективная концентрация, которая была определена предварительно в экспериментах с культивацией клеток сетчатки и определением их жизнеспособности. Культивирование производилось в течение 30 суток.

Для оценки полученных результатов проводился микроскопический морфологический анализ - определялась способность клеток выселяться, мигрировать, давать отростки и дифференцироваться. Для количественной оценки роста культивируемых эксплантатов использовался индекс площади (ИП) - отношение площади эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток к исходной площади эксплантата. Значение ИП выражалось в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100 %. Проводился анализ клеток на жизнеспособность с использованием флуорохромных красителей (акридинового оранжевого - окрашивает живые клетки и пропидия йодистого - окрашивает ядерную ДНК гибнущих клеток) путем определения отношения количества жизнеспособных клеток к общему числу клеток. Оба исследования проводились на 7, 14, 21 и 30 сутки культивирования. Затем проводилось иммуногистохимическое исследование (метод непрямого иммуногистохимического окрашивания) с использованием коктейля моноклональных мышиных антител к маркеру нейробластов - (3-Ш тубулину и поликлональных кроличьих антител к маркеру глиальных клеток - кислому глиальному фибриллярному белку - GFAP; затем смеси вторичных антител к иммуноглобулину кролика, меченых Техасским красным (красное свечение при зеленом освещении) и антител к иммуноглобулину мыши меченых Су 2 (зеленое свечение при синем освещении).

В течение первых 5-7 суток культивирования происходило оседание и распластывание эксплантатов сетчатки человека по дну культуральной чашки; небольшое количество клеток выселялось из эксплантата на дно. По результатам анализа клеток сетчатки на жизнеспособность на 7 сутки в эксплантатах, культивируемых без BDNF, было выявлено наличие обширных очагов клеточной гибели, как внутри, так и на поверхности эксплантатов. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, очагов клеточной гибели были значительно меньше.

На 14 день культивирования происходило дальнейшее выселение клеток из эксплантата на дно культуральной чашки и их расселение по значительной территории. По результатам окраски на жизнеспособность в эксплантатах сетчатки, культивируемых без BDNF, наблюдалось значительное расширение зон клеточной гибели внутри эксплантатов и разрушение неприкрепленных краевых участков эксплантатов; нарушение структуры и некроз в краевых зонах. В прикрепившихся эксплантатах при культивировании с BDNF, в отличие, от контроля, очагов клеточной гибели найдено не было. Выявлено небольшое количество погибших клеток в краевых участках эксплантата, не прикрепившихся к дну чашки. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, начинали формироваться многочисленные длинные разветвленные отростки, выходящие за пределы эксплантатов. В контроле формировалось незначительное количество коротких отростков.

На 17 и, особенно, на 21 сутки культивирования продолжалось выселение клеток из эксплантата на дно чашки. В эксплантатах, культивируемых с BDNF, происходило дальнейшее увеличение числа отростков, их длины и разветвленности. В эксплантатах, культивируемых без BDNF, число и длина отростков практически не увеличивались. Окраска на жизнеспособность показала, что в эксплантатах, культивируемых с BDNF, на 21 сутки наблюдается небольшое расширение зон клеточной гибели, тогда как в контроле остается лишь небольшое количество живых клеток вблизи кровеносных сосудов и на поверхности эксплантатов.

На 30 сутки культивирования в зоне расселения клеток из эксплантатов, культивируемых с BDNF, образовывались пучки сильно разветвленных отростков, длина которых была значительно больше, чем на 21 сутки. На препаратах, иммуногистохимически окрашенных на GFAP и Tubulin, определялось наличие утолщений на тубулин позитивных отростках. В эксплантатах, культивируемых в присутствии BDNF, было найдено большое количество GFAP иммунонегативных - (ЗШ-тубулин иммунопозитивных клеток с аксоноподобными тубулин-позитивными отростками, распространяющимися за пределы тела эксплантата. За пределами эксплантата волокна распространялись по поверхности выселившихся клеток, но за зону их распространения не выходили. Образование обширных сетей отростков вне эксплантата наблюдалось в местах наибольшей плотности выселившихся клеток. Наличие экспрессии {3111-тубулина свидетельствует о принадлежности данных клеток к нейрональному ряду. В контроле клетки, экспрессирующие [З-Ш-тубулин, были выявлены только в глубине эксплантатов и в очень незначительном количестве. Аксоноподобные (З-Ш-тубулин позитивные отростки были очень тонкие, определялись только в теле эксплантата и никогда не выходили за его пределы, в отличие от опыта.

В эксплантатах сетчатки крыс, культивируемых с BDNF и без него, получены результаты сходные с результатами, полученными на сетчатке человека.

По результатам количественного анализа установлено, что индекс площади эксплантатов, культивируемых с BDNF, на 14, 21 и 30 сутки инкубации достоверно увеличивается соответственно на 25, 40 и 70%. В контроле этот показатель остается практически без изменений.

Количественный анализ жизнеспособности клеток сетчатки показал, что в эксплантатах, культивируемых с BDNF, через 30 суток культивирования жизнеспособными остаются 64% клеток, в контроле клеточная жизнеспособность не превышала 10%.

В условиях роллерного культивирования на 14 день инкубации в эксплантатах сетчатки с BDNF наблюдалось образование длинных, не разветвленных отростков, выходящих за пределы культивируемого образца при концентрации BDNF в культуральной среде - 100 нг/мл. В контроле и при меньшей концентрации BDNF (50 нг/мл) видимых различий обнаружено не было.

Таким образом, по результатам исследования было установлено, что в органотипических культурах сетчатки при культивировании с BDNF в концентрации 100 нг/мл развиваются процессы активной клеточной миграции и роста (З-Ш-тубулип иммунопозитивных аксоноподобных отростков нейрональной природы; на 21 и 30 сутки, соответственно, увеличиваются, по сравнению с контролем, зона роста эксплантатов в 2 и 3 раза, клеточная жизнеспособность - в 3 и 4 раза.

Второй раздел работы - изучение влияния BDNF на состояние сетчатки экспериментальных животных.

Работа проводилась на 55 кроликах (110 глаз) породы Шиншилла серый (половозрелые животные, весом 2,5-3,0 кг). Проведено два экспериментальных исследования, каждое из которых включало несколько серий экспериментов.

В первом экспериментальном фрагменте работы проводилось исследование результатов применения рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения. Было выполнено две серии экспериментальных исследований. В пеой серии эксперимента было произведено однократное введение рекомбинантного BDNF в дозе 100 нг в 0,1 мл сбалансированного физиологического р-ра (СФР) интравитреально (4 глаза) и супрахориоидально (4 глаза) в такой же дозе в 0,02 мл СФР. Во второй серии эксперимента интравитреально и супрахориоидально вводили виде суспензии клеточные системы экспрессии нейротрофического BDNF - G7-1M в дозе 500 тыс. в 0,1 и 0,02 мл СФР, соответственно (3 и 4 глаза) и НЕК 293 в количестве 500 тыс. в 0,1 и в 0,02 мл СФР, соответственно (3 и 4 глаза). В контрольный глаз вводили 0,02мл. СФР (4 глаза).

Во втором экспериментальном фрагменте работы проводилось исследование влияния рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии на состояние сетчатки животных с лазерным повреждением (очаговыми дистрофическими изменениями) сетчатки при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения. Было выполнено две серии экспериментальных исследований. В первой серии эксперимента на следующий день после лазерного повреждения BDNF вводили интравитреально (7 кроликов - 7 глаз) в дозе 100 нг в 0,1 мл сбалансированного физиологического р-ра (СФР) и в такой же дозе в 0,02 мл СФР супрахориоидально (7 кроликов - 7 глаз). Во второй серии эксперимента интравитреально и супрахориоидально вводили клеточные системы экспрессии нейротрофического BDNF - G7-1M в дозе 500 тыс. в 0,1 и 0,02 мл СФР, соответственно (3 глаза и 7 глаз) и НЕК 293 в виде суспензии в количестве 500 тыс. в 0,1 и 0,02мл СФР, соответственно (3 глаза и 6 глаз).

В контрольный глаз на всех этапах и во всех сериях работы вводили объем сбалансированного физиологического раствора, эквивалентный используемому опытному объему в каждом конкретном случае.

В работе использовалась модель лазерного повреждения - модель очаговых дистрофических изменений сетчатки. С помощью аргоновой лазерной установки производилось лазерное повреждение обоих глаз. Коагуляты наносились в нижней половине глазного дна, по 200 коагулятов на каждом экспериментальном глазу. Средняя мощность излучения составляла 300 мВт, длительность экспозиции 0,1 сек, диаметр пятна 200 мкм.

Повреждение сетчатки при сверхпороговом лазерном воздействии характеризуется, как правило, нарушением ультраструктуры клеток вплоть до изменения архитетектоники хориоретинальной области. Повреждение сетчатки как результат прямого термического воздействия развивается в пигментном эпителии, сопровождается некрозом ядер в наружном зернистом слое, некрозом внутренних и наружных сегментов фоторецепторов (Seiler М. et al., 1991).

Используемые в работе клеточные системы экспрессии BDNF были разработаны в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН (д.б.н. Павлова Г.В., к.б.н. Рыбалкина Е.Ю., к.б.н. Ревищин А.В.)

Клеточная система экспрессии BDNF - G7-1M - генно-инженерная конструкция на основе вектора CaSper, которая содержит ген человеческого мозгового нейротрофического фактора, поставленный под промотор гена белка теплового шока, благодаря которому он активируются при температуре 37°С. Конструкция вводится в эмбрионы дрозофилы линии Df(l)w67c23(2)- Методом блот-гибридизации по Саузерну подтверждается, что конструкция с геном BDNF встраивается в геном линии G7-1M, методом блот-гибридизации по Нозерну -наличие экспрессии встроенного гена и установлено, что экспрессия мРНК, индуцированная повышением температуры до температуры теплового шока -37°С происходит на всех стадиях эмбрионального развития. Для ксенотрансплантации используются диссоциированные клетки нервной системы личинок.

Преимуществами клеточной системы экспрессии BDNF - G7-1M - промотор являются невирусное происхождение и наличие регулируемой структуры -активация при температуре 37°С, что обеспечивает высокий уровень синтеза продукта и кратковременность действия системы - срок жизни трансгенных эмбриональных нервных клеток менее месяца, отсутствие склонности клеток -носителей к делению, оказывает антиглиозное действие (Павлова Г.В., 2009).

Клеточная система экспрессии НЕК 293 - генно-инженерная конструкция, синтезированная на основе вектора EGFP-N1, содержащего CMV промотор и маркерный ген флуоресцентного белка GFP (зеленый); в вектор встраивается нейральный человеческий ген BDNF. В результате чего получается конструкция, несущая гены BDNF и GFP под общим CMV промотором. Клетки линии НЕК293 трансфицированы плазмидой, содержащей химерный ген BDNF/GFP и ген устойчивости к неомицину (NEO). Трансфекция проводится с помощью реагента «ExGen 500 in vitro Transfection Reagent» (Fermentas) в соответствии с протоколом фирмы. Для получения стабильно трансфицированных клеток проводится селекция на среде содержащей неомицин (500 мкг/мл). Все отобранные клетки при анализе на флуоресцентном микроскопе имеют зеленое свечение при рассматривании с системой фильтров для FITC. Анализ полученных культур проводился методом Саузерн-блот анализа. Для проверки нормальной транскрипции РНК проведился Нозерн-блот анализ, свидетельствующий о том, что ген BDNF нормально работает во всех вариантах. Данная конструкция обеспечивает более длительную продукцию нейротрофического фактора и также, как G7-1M оказывает антиглиозное действие (Павлова Г.В., 2009).

Для визуализации клеточный материал перед трансплантацией окрашивался ядерным люминесцентным красителем бизбензимидом.

В ходе эксперимента животных обследовали с использованием традиционных методик биомикроскопии и офтальмоскопии, производились фоторегистрация глазного дна и электроретинографические исследования для объективной оценки степени и характера изменений функционального состояния сетчатки.

Клиническая оценка состояния переднего отрезка глаза проводилась по признакам наличия или отсутствия воспалительной и аллергической реакций. Клиническая оценка состояния глазного дна проводилась по признакам купирования отека в области поврежденного участка, степени пигментации коагулятов, которые оценивали по бальной системе, разработанной Н.В.Пак (2004 г.). Электрофизиологические исследования в первом экспериментальном фрагменте проводили до введения, на 1-е, 7-е, 14-е и 21 сутки после введения BDNF, во втором - до коагуляции, на 7-е, 14-е и 30 сутки после введения BDNF. Выведены животные из эксперимента в первом фрагменте были на 21 сутки, во втором - на 14-е и 30-е сутки. На энуклеированных глазах проводилось патогистологическое исследование и морфометрический микроскопический анализ (измерения были проведены на 20-30 срезах, содержащих лазерное повреждение). Для визуализации клеточного материала при его супрахориоидальном введении производили окрашивание ядерным люминесцентным красителем бизбензимидом. Морфологические и иммуногистохимические исследования проводились в лаборатории нейрогенетики и генетики развития Института биологии гена РАН (к.б.н. Ревищин А.В.).

Клинически за все время наблюдения за животными со стороны переднего отрезка глаза, как в опыте, так и в контроле патологических изменений не наблюдалось. Отмечалось только наличие умеренной гиперемии конъюнктивы, преимущественно в зоне вмешательства, сохранявшейся в течение 4-5 дней. При офтальмологическом обследовании на глазном дне после введения BDNF и клеточных систем его экспрессии не было выявило никаких изменений.

По результатам электрофизиологического исследования в первые сутки после введения во всех экспериментальных группах отмечалось угнетение функциональной активности наружных слоев сетчатки. Было выявлено умеренное снижение амплитуды а-волны ЭРГ на 15-20% и в-волны - на 25-30% от индивидуальной исходной нормы. Существенных отличий по данным ЭРГ в опыте и контроле в указанный период времени выявлено не было, что позволило нам расценить полученные результаты как ответную реакцию наружных слоев сетчатки на интраокулярную инъекцию. На 7 сутки в первой серии эксперимента в опытных глазах наблюдалось постепенное восстановление электрогенеза, на 14 сутки амплитуда а- и в-волн приближалась к исходному уровню, более активно процесс восстановления происходил при супрахориоидальном введении BDNF. На 7-14 сутки во второй серии эксперимента наблюдалось наличие умеренных супернормальных значений амплитуды в-волны ЭРГ, на 21 день амплитуда в-волны соответствовала исходным значениям. В контроле на 7 сутки было выявлено наличие более выраженной депрессии - а-волна ЭРГ была снижена на 20-25% от исходных значений, в-волна - на 30-35%. Восстановление электрогенеза наблюдалось на 21 сутки.

В результате проведения гистологических исследований при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения BDNF никаких изменений структуры сетчатки выявлено не было, нетипично расположенных клеток в супрахориоидальном пространстве и стекловидном теле не обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения не выявлено. При интравитреальном введении клеток G7-1M и НЕК 293 с трансгеном BDNF в стекловидном теле было выявлено наличие единичных, рассеянно расположенных клеток; основная масса клеточного материала была расположена в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней. Клетки распределялись единично и группами, плотность их распределения резко уменьшалась по мере удаления от места введения. В ткани сетчатки эктопически расположенных нетипичных клеток обнаружено не было. При супрахориоидальном введении клеточных систем G7-1M и НЕК 293 с трансгеном BDNF, окрашенных бизбензимидом, на 21 день после трансплантации определялось наличие единичных клеток с люминесцентным свечением, расположенных в хориоидее, в наружных и внутренних слоях сетчатки, но в основном определялось лишь остаточное диффузное свечение в ткани сетчатки, что свидетельствует о разрушении трансплантируемого клеточного материала.

Таким образом, на основании клинико-функциональных и морфологических исследований нами было установлено, что рекомбинантный BDNF в дозе 100 нг и клеточные системы его экспрессии G7-1M и НЕК 293 в дозе 500 тыс. не оказывают токсического действия на ткани глаза, не вызывают аллергических реакций и реакций иммунного отторжения без проведения иммуносупрессии и являются оптимальными для интравитреального и супрахориоидального введения. Выявлено, что жизнеспособность клеточных систем экспрессии более продолжительная при интравитреальном способе введения (не менее 21 дня), располагаются они в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней и не мигрируют. Установлено, что рекомбинантный BDNF, особенно при супрахориоидальном способе его введения, быстро компенсирует возникающую ответную реакцию сетчатки на травмирующее инструментальное воздействие, клеточные системы экспрессии BDNF при супрахориоидальном способе введения, несмотря на более короткий период жизнедеятельности, вызывают повышение ее функциональной активности.

Во втором экспериментальном фрагменте работы проводилось исследование влияния рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии на состояние сетчатки животных с лазерным повреждением сетчатки при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения.

Через сутки после лазерной коагуляции отмечалось наличие поверхностной и глубокой сосудистой инъекции, которая сохранялась в течение 4-5 дней, других изменений со стороны переднего отрезка глаза выявлено не было на протяжении всего срока наблюдения. Достоверных различий по состоянию глазного дна и каких-либо временных различий между опытными и контрольными глазами выявлено не было.

В первой экспериментальной серии была получена следующая динамика электрогенеза сетчатки. На 7 сутки после лазерного повреждения при интравитреальном способе введения BDNF амплитуда а- и b-волны ЭРГ на OD составляла в среднем 58% и 85% от исходной величины, на OS - 45% и 70% соответственно. На 14 и 30 сутки эксперимента угнетение ЭРГ продолжало постепенно увеличиваться. При интравитреальном способе введения в опытных глазах сохранялись незначительно более высокие значения амплитуды а- и вволн. Наиболее значительная разница между опытом и контролем наблюдалась при супрахориоидальном способе введения BDNF. Амплитуда а- и в-волны в опыте составляла на 7 сутки 61% и 89% от исходной величины, на 14 сутки - 52% и 78%, соответственно, в контроле - на 7 сутки 48% и 68%, на 14 сутки - 38 и 50%. На 30 "сутки показатели ЭРГ при супрахориоидальном способе введения были на 10% выше, чем при интравитреальном.

Полученные данные по ретинальному электрогенезу в первой серии эксперимента свидетельствуют о том, что при использовании BDNF, особенно супрахориоидальном способе его введения угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным, чем в контрольной группе и развивается в более отдаленные сроки. На 7 сутки эксперимента амплитуда а- и в-волн ЭРГ в опытных глазах выше, чем в контрольных на 23 и 21%, соответственно; на 14 сутки - на 14% и 28%; менее существенные различия (10%) наблюдаются на 30 сутки.

Во второй серии эксперимента наиболее высокая функциональная активность сетчатки в течение первых двух недель сохранялась при использовании клеточных систем экспрессии BDNF, разница с контролем являлась статистически достоверной. На 7 сутки эксперимента при введении G7-1М амплитуда а- и b-волны ЭРГ на OD составляла в среднем 70% и 93% от исходной величины, на OS - 1% и 67% соответственно; при введении НЕК 293 -на OD - 63% и 96% от исходной величины, на OS - 48% и 63% соответственно. В течение следующей недели наблюдалось незначительное снижение ЭРГ на экспериментальных глазах - амплитуда а- и -в-волны на 14 сутки при введении G7-1M составляла 61% и 80% соответственно, при введении НЕК -293 - 62% и 88%. На 30 сутки показатели ЭРГ у животных с клеточной конструкцией НЕК -293 снижались, но продолжали оставаться на достаточно высоком уровне, амплитуда а- и -в-волны была выше, чем у животных с клеточной конструкцией G7-1M в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, и выше, чем при супрахориоидальном способе введения рекомбинантного BDNF 1,3 раза.

Таким образом, данные ЭФИ второй серии экспериментов свидетельствуют о том, что при использовании клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293, в течение первых двух недель сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора; при использовании НЕК 293 высокий функциональный результат наблюдается и в отдаленные сроки наблюдения.

При проведении микроскопического анализа срезов сетчатки экспериментальных животных в опытных и контрольных глазах в зонах лазерного воздействия было выявлено наличие дегенеративных изменений. По размерам и степени выраженности поражения участки существенно различались. Наблюдалось наличие небольших (50-300 микрометров) участков, соответствующих единичному локальному лазерному поражению и, в ряде случаев участков, расположенных по периферии, с глубокой дегенерацией и значительной площадью поражения.

Дегенеративные очаги представляли собой хорошо ограниченное нарушение архитектоники с вовлечением в процесс всех слоев сетчатки, сопровождающееся разрушением и дезорганизацией фоторецепторного слоя, большинства нейронов в наружном и внутреннем ядерных слоях.

Формирование крупных очагов дегенерации на периферии могло быть связано со случайным повреждением сосуда, в результате чего развивается ишемическая дегенерация дистально расположенных областей сетчатки, кровоснабжаемых данным сосудом. В связи с этим дополнительно для объективной оценки полученных результатов эксперимента нами отдельно производился анализ первичных (менее 300 микрометров) очагов дегенерации.

В первой серии эксперимента в результате морфометрического анализа было выявлено, что на 14 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах был меньше, чем в контрольных, при интравитреальном способе введения рекомбинантного BDNF - в 5 случаях из 7, при супрахориоидальном - во всех. Статистически достоверные различия между опытом и контролем наблюдались в 28% и 57% случаев, соответственно. На 30 сутки эксперимента по результатам морфометрического анализа достоверных различий по размерам зон первичной лазерной дегенерации выявлено не было. Нетипично расположенных клеток в супрахориоидальном пространстве и стекловидном теле не было обнаружено, нарушений структуры сетчатки и пигментного эпителия в месте введения BDNF выявлено не было.

Во второй серии эксперимента при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF, независимо от типа конструкции, средний размер первичных очагов дегенерации на 14 сутки в опытных глазах был меньше, чем в контрольных у всех животных. Статистически достоверные различия между опытом и контролем были выявлены в 57% и 67% случаев, соответственно. На 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии G7-1M и НЕК -293 был меньше, чем в контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и опытных глазах с рекомбинантным BDNF в 1,5 раза

При интравитреальном введении клеток G7-1M и НЕК 293 с трансгеном BDNF в стекловидном теле было выявлено наличие единичных, рассеянно расположенных клеток; основная масса клеточного материала была расположена в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней. Клетки распределялись единично и группами, плотность их распределения увеличивалась по направлению к заднему полюсу глаза, до зоны лазерного повреждения. В ткани сетчатки были обнаружены эктопически расположенные нетипичные клетки. При супрахориоидальном введении клеточных систем G7-1М и НЕК 293, окрашенных бизбензимидом, на 14 сутки после трансплантации было выявлено наличие немногочисленных клеток с люминесцентным свечением, расположенных в хориоидее, в наружных и внутренних слоях сетчатки, на 30 сутки в основном определялось остаточное диффузное свечение ткани сетчатки, что свидетельствует о разрушении трансплантируемого клеточного материала к этому сроку.

Таким образом, на основании данных иммуногистохимических исследований установлено, что при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения BDNF никаких изменений структуры сетчатки не наблюдается жизнеспособность клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293, как и в нормальных условиях более продолжительная при интравитреальном способе введения (до 30 суток), располагаются они в непосредственной близости от внутренней поверхности сетчатки или на ней, способны к миграции, тропны к очагу поражения.

На основании данных ЭРГ установлено, что при использовании рекомбинантного BDNF, особенно супрахориоидальном способе его введения угнетение функциональной активности сетчатки при ее лазерном повреждении является менее выраженным и развивается в более отдаленные сроки; на 7 сутки эксперимента при супрахориоидальном способе введения BDNF амплитуда а- и в-волн ЭРГ в опытных глазах выше, чем в контрольных на 23 и 21%, соответственно; на 14 сутки - на 14% и 28%; менее существенные различия наблюдаются на 30 сутки. При супрахориоидальном использовании клеточных систем экспрессии BDNF - G7-1M и НЕК 293, в течение первых двух недель после лазерного повреждения сохраняется более высокая функциональная активность сетчатки, чем при использовании рекомбинантного фактора, независимо от типа клеточной системы; при использовании НЕК 293 высокий функциональный результат сохраняется и в более отдаленные сроки наблюдения - амплитуда а- и -в-волны выше, чем у животных с клеточной конструкцией G7-1М в 1,5 и 1,6 раза, соответственно, и выше, чем при супрахориоидальном способе введения рекомбинантного BDNF в 1,3 раза.

На основании данных гистоморфометрического анализа установлено, что на 14 сутки эксперимента при интравитреальном и супрахориоидальном способах введения BDNF средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах в 28% и 57% случаев, соответственно, достоверно меньше, чем в контрольных; при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии

BDNF - G7-1M и НЕК 293 в 57% и 67% случаев, соответственно; на 30 сутки эксперимента средний размер первичных очагов дегенерации в опытных глазах животных с клеточными системами экспрессии G7-1M и НЕК -293 меньше, чем в контрольных, соответственно, в 1,3 и 1,5 раза и опытных глазах с рекомбинантным BDNF в 1,5 раза.

Полученные результаты измерений свидетельствуют о том, что наиболее активно репаративные процессы при лазерном повреждении сетчатки происходят при супрахориоидальном введении клеточных систем экспрессии BDNF, особенно НЕК 293.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о безопасности рекомбинантного BDNF и клеточных систем его экспрессии G7-1M и НЕК 293 при интравитреальном и супрахориоидальном способах их введения; о том, что в условиях ретинального повреждения BDNF обладает нейропротекторными свойствами, степень выраженности которых зависит способа доставки фактора, концентрации и длительности его пребывания в тканях глаза. Наиболее высокий морфофункциональный результат наблюдается при использовании клеточных систем экспрессии BDNF, вероятно, в связи с тем, что поддерживается высокий уровень содержания фактора на протяжении длительного периода времени; при использовании клеточной системы экспрессии G7-1M, в отличие от НЕК -293, результаты являются менее стабильными, что может быть связано с нестабильностью самой систем.

97

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Бакаева, Лариса Мевлединовна, 2010 год

1. Ашмарин И.П., Стукалов П.В. // Нейрохимия. М., Институт биомедицинской химии РАМН.- 1996. С. 470.

2. Бажин А.В., Григорян Э.Н., Тихомирова Н.К. и др. Иммунохимическое изучение локализации кальций-связывающего белка рековерина в сетчатке тритона Pleurodeles waltl // Изв. АН. Сер. биол. 2002. - № 4. - С. 427-436.

3. Гаврилова Н.А., Шпак А.А., Дегтярева М.В., Полякова М.А.Исследование содержания нейротрофического фактора головного мозга у больных первичной глаукомой // ХХП Международный симпозиум физиологических проблем адаптации: Материалы. М. - 2007. - С. 498-500.

4. Григорян Э.Н., Иванова И.П., Поплинская В.А. Обнаружение новых, внутренних источников регенерации нейральной сетчатки после ее отслойки у тритонов. I. Морфологическое и количественное исследования // Изв. АН. Сер. биол. 1996. № 3.- С. 319-332.

5. Григорян Э.Н., Поплинская В.А. Обнаружение внутренних источников регенерации нейральной сетчатки после ее отслойки у тритонов. II. Радиоавтографическое исследование // Изв. АН. Сер. биол. 1999. № 5. С. 583-591.

6. Григорян Э.Н., Антон Г.Дж. Появление и распределение белка нейрофиламентов НФ-200 в трансдифференцирующихся клетках пигментного эпителия и других клетках глаза в процессе регенерации сетчатки у тритонов // Онтогенез. 1993. Т. 24. № 4. С. 39—52.

7. Гундорова Р.А., Швецова Н.Е., Иванов А.Н., Цапенко И.В., Федоров А.А., Зуева М.В., Танковский В.Э., Рябина М.В. Модель ишемии сетчатки:клинико-функциональное и гистологическое исследование // Вестн.офтальм., 2008.- № 3.- С. 18-23.

8. Дижур A.M., Некрасова Э.Н., Филиппов П.П. Новый специфичный для фоторецепторных клеток белок с молекулярной массой 26 кДа, способный связываться с иммобилизованным делипидизированным родопсином // Биохимия. 1991. Т. 56. Вып. 2. С. 225 - 229.

9. Краснов М.С., Григорян Э.Н., Ямскова В.П., и др. Исследование адгезивных белков из нейральных тканей глаза 8-ми дневных куриных зародышей // Онтогенез. 2000. Т. 31. № 5.- С. 368-373.

10. Куликов А.В., Жданов Р.И. (2000). Вопр. биол. мед. и фармацевт, хим. 1,- С. 42-47.

11. Культура нервной ткани. Под ред. Ю. М. ЖАБОТИНСКОГО. М., «Медицина», 1977, С. 184

12. Курышева Н.И., Гаврилова Н.А., Аникина А.Ю. Исследование нейротрофического фактора BDNF у больных первичной глаукомой // Глаукома. №4.- 2006. - С. 9-15.

13. Лопашов Г.В., Строева О.Г. Развитие глаза в свете экспериментальных исследований. М.: Изв. АН СССР. 1963.- С. 205.

14. Методы культуры клеток для биохимиков // Под редакцией д-ра биол. наук В. Ю. Полякова. Перевод с английского канд. биол. наук М. А. Панова. М. -«Мир», 1983,-С. 256

15. Панова И.Г. Цитоструктура и цитохимия пигментного эпителия сетчатки. // Изв. АН. Сер. биол. 1993. № 2.- С. 165-190.

16. Симирский В.Н., Григорян Э.Н., Миташов В.И., Михайлов А.Т. Синтез кристаллиноподобных антигенов в эпителии роговицы, радужке и сетчатке взрослых амфибий // Онтогенез. 1984. Т. 15. № 4.- С. 439 440.

17. Строева О.Г. Морфогенез и врожденные аномалии глаза млекопитающих. 1971. М.: Наука,- С. 242.

18. Челышев Ю.А., Черепнев Г.В., Сайткулов К.И. Апоптоз в нервной системе //

19. Онтогенез. 2001. Т.32. № 2.- С. 118-129.

20. Шпак А.А., Гаврилова Н.А., Ланевская Н.И., Дегтярева М.В.Нейротрофический фактор головного мозга у больных первичной глаукомой // Офтальмохирургия. №4.- 2006.- С. 14-16.

21. Энгельгардт Н.В. Метод флюоресцирующих антител и его применение для обнаружения тканевых антигенов на срезах // Иммунохимический анализ. 1968. М.: Медицина,- С. 165-188.

22. Ямсков И.А., Ямскова В.П. Фармакологические препараты нового поколения на основе гликопротеинов клеточного микроокружения // Росс, хим. журн. 1998. Т. 42. № 3.- С. 85-90.

23. Ямскова В.П., Ямсков И.А. Механизм биологического действия физико-химических факторов в сверхмалых дозах // Росс. хим. журн. 1999. Т. 43. № 3.- С. 74-79.

24. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Новый класс биологических регуляторов многоклеточных систем — цитомедины //Успехи соврем.биологии.- 1983.-Т.96.- №3.- С.339-352.

25. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы. (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения). СПб.: Наука.-1996.

26. Трофимова С.В. Применение пептидных биорегуляторов при лечении диабетической ретинопатии// Автореф.дис. канд.мед.наук. СП6.-1999.

27. Васильева Л.А. Применение ратилина для лечения пигментной периферической аьиотрофии сетчатки. Автореф. дис.канд.мел.наук. СПб.-1992.

28. Журавлева Л.В. Новые биорегуляторы в лечении центральных инволюционных дистрофий сетчатки // Вопросы офтальм.- Самара.- 1994.-С.49-50.

29. Максимов И.Б. Комплексная пептидная коррекция при микрохирургическом лечении травм глаза и их последствий // Автореф. дис.д-ра мед.наук. -М.-1996.- С. 43.

30. Гаврилова Н.А. Патогенетические механизмы развития диабетической ретинопатии, диагностика ранних стадий, прогноз и профилактика развития, дифференцированный подход к лечению// Автореф. дис.д-ра мед.наук. -М.- 2004.- С. 47.

31. Харинцева С.В. применение ретилина при лечении тромбозов центральной вены сетчатки // Регуляторные пептиды в норме и патологии. — Чита, 1991. -С. 90-91.

32. Даниличев В.Ф., Васильева JI.B. Терапия препаратом сетчатки при пигментной периферической абиотрофии сетчатки // Офтальмол. журн. -1992-№3.-С. 108-111.

33. Даниличев В.Ф., Максимов И.Б. Травмы и заболевания глаз: применение ферментов и пептидных биорегуляторов. Минск: Наука и техника., 1994. -С. 223.

34. Анисимов В.Н., Арутюнян А.В., Хавинсон В.Х. Антиоксидантная роль эпиталамина и мелатонина // Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма. СПб., 1996.- С. 111-112.

35. Анисимова Г.В., В.Х. Хавинсон. Применение ретиналамина в лечении дистрофических заболеваний сетчатки // Съезд офтальмологов России 7-й: Тез.докл. М., 2000.- Ч.2.- С. 301.

36. Дятлов Р.В., Красовская И.Е., Лызлова Л.В. и др. Антиоксидантное действие эпифизарных геропротекторов мелатонина и эпиталамина // Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма . -СПб., 1996.- С. 39-40, 132-133.

37. Беляев B.C., Госен Ж.Х. Реваскуляризация в профилактике и лечении дистрофий сетчатой оболочки и зрительного нерва // Актуальн. Вопросы офтальмол. Сборник научных трудов. Харьков.-1985.- С. 30-32.

38. Чеглаков Ю,А., Багров С.Н., Ларионов Е.В. и др. Ксенотрансплантаты для лечения пациентов с «сухой» инволюционной хориоретинальной макулодистрофией// Офтальмохирургия.- 1996.-№2.- С.14-18.

39. Шпак Н.И. Новая техника операции реваскуляризации сосудистой оболочки глаза при пигментной дегенерации снтчатки, тромбозах и атрофии зрительного нерва// Офтальм. журн.- 1977.-№3. С.224-227.

40. Тюриков Ю.А. Модифицированная реваскуляризация сосудистой оболочки глаза // Вестн. офтальм. 1982. - №2.- С.46-47.

41. Галимова В.У., Мулдашев Э.Р. Новый способ реваскуляризации хориоидеи // Офтальм. журн. 1981.-№5.- С.308-309.

42. Басинский С.Н. Изменение гемодинамики у больных открытоугольной глаукомой и их коррекция. Дисс. доктора медицинских наук. 1991.- С. 248.

43. Нестеров А.П., Басинский С.Н. Новый метод введения лекарственных препаратов в задний отдел тенонова пространства //Вестн.офтальмол. 1991. №5.- С.11-14.

44. Нестеров А.П., Свирин А.В., Басинский С.Н., Исаев A.M. Применение коллагеновых губчатых препаратов в офтальмохирургии// Методические рекомендации. М. 1998. С. 17.

45. Шилкин Г.А., Ярцева Н.С., Миронова Э. с соавт. Результаты пересечения поверхностной височной артерии у больных преглаукомой и начальной открытоугольной глаукомой // Офтальмол. журнал. 1989. № 2.- С.93-96.

46. Краснов М.М., Шмырева В.Ф., Переверзина O.K., Шершнев В.В. Перспективы применения декомпрессионных операций на зрительном нерве при атрофиях сосудистого генеза. //Вестн.офтальмол. 1990. Т. 106. №4.- С.22-24.

47. Краснов М.М., Шмырева В.Ф., Мостовой Е.Н. Декомпрессионные операции на зрительном нерве при глаукоматозной атрофии. //Актуальные вопросы патологии заднего отдела глаза. Тезисы докладов. Одесса 1989.- С. 159-160.

48. Пак Н.В. Влияние трансплантации нейральных стволовых клеток на процессы регенерации сетчатки в эксперименте // Дис. .канд.мед.наук. -М.-С. 2004.- 180.

49. Гундорова Р.А., Ченцова Е.В., Купрашвили И.Т., Зуева М.В., Цапенко И.В.,

50. Либман Е. С. Состояние и динамика слепоты и инвалидности вследствие патологии органа зрения в России // 7-й Съезд офтальмологов России : тезисы. М., 2000. - Т. 2. - С. 219.

51. Abe S., Eguchi G. An analysis of differentiative capacity of pigmented epithelial cells of adult newt iris in clonal cell culture // Dev. Growth Differ. 1977. V.19. -P. 309-317.

52. Acevedo M.C., Ortiz J.R. Effect of serum, fibronectin and laminin on cell morphology and growth of Xenopus laevis dorsal iris cells in vitro // J. Cell Biol. 1989. V.109. № 4.- P. 324a.

53. Albers K., Fuchs E. The molecular biology of intermediate filament proteins // Internat. Rev. Cytol. 1992. V. 134.- P. 243 279.

54. Arenas E., Persson H. Neurotrophin-3 prevents the death of adult central noradrenergic neurons in vivo //Nature. 1994. Vol. 367, N 6461.- P.368-371.

55. Banker G.A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture // Science. 1980. Vol.209, N 4458.- P.809-810.

56. Bartrup J.T., Moorman J.M., Newberry N.R. BDNF enhances neuronal growthand synaptic activity in hippocampal cell cultures 11 Neuroreport. 1997. Vol. 8, N. 17.-P.3791-3794.

57. Bissell M.J., Hall H.G., Parry G. How does the extracellular matrix direct gene expression? // J. Theor. Biol. 1982. V.99.- P. 31-68.

58. Brady R., Zaidi S. I., Mayer C., Katz D.M. BDNF Is a Target-Derived Survival Factor for Arterial Baroreceptor and Chemoafferent Primary Sensory Neurons // J. Neuroscience. 1999. Vol. 19, N6.- P. 2131-2142

59. Buchi E.R. Cell death in the rat retina after a pressure-induced ischemia-reperfusion insult: an electron microscopic study. I. Ganglion cell layer and inner nuclear cell layer // Exp. Cell Res. 1992. V. 55.- P. 605-613.

60. Caffe AR, Soderpalm AK, Holmqvist I, van Veen T. A combination of CNTF and BDNF rescues rd photoreceptors but changes rod differentiation in the presence of RPE in retinal explants. Invest Ophthalmol Vis Sci 2001; 42.- P.275-82.

61. Castellani V.,Bolz J. Opposing roles for neurotrophin-3 in targeting and collateral formation of distinct sets of developing cortical neurons // Development. 1999. Vol.126, N.15.- P. 3335-3345.

62. Chen H, Weber A. J. Expression of glial fibrillary acidic protein and glutamine synthetase by Mtiller cells after optic nerve damage and intravitreal application of brain-derived neurotrophic factor // Glia. 2002 Apr 15;38(2).- P. 115-25.

63. Chen H., Weber A J. BDNF Enhances Retinal Ganglion Cell Survival in Cats with Optic Nerve Damage // Investigative Ophthalmology and Visual Science.2001;42.- P.966-974

64. Cheng L, Sapieha P, Kittlerova P, Hauswirth WW, Di Polo A. TrkB gene transfer protects retinal ganglion cells from axotomy-induced death in vivo . J Neurosci 2002; 22 (10).- P. 3977-3986.

65. Cheon E.W., Saito T. Choline acetyltransferase and acetylcholinesterase in the normal, developing and regenerating newt retinas // Dev. Brain Res. 1999. V. 116.-P. 97-109.

66. Conner J.M. Lauternborn J.C. Yan Q. et al. Distribution of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) protein and mRNA in the normal adult rat CNS: Evidence for anterograde axonal transport // J. Neurosci. 1997. Vol.17, N.7.- P. 2295-2313.

67. Cook В., Lewis G.P. Fisher S.K., Adler R. Apoptotic photoreceptor degeneration in experimental retinal detachment // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. V. 36. N 6.- P. 990-996.

68. Cunningham B.A. Cell adhesion molecules as morphoregulators // Current Opinion in Cell Biology. 1995. V.7.-P. 628-633.

69. Dai X., Lercher L.D., Clinton P.M. et al. The trophic role of oligodendrocytes in the basal forebrain // J. Neurosci. 2003. Vol.23, N13.-P. 5846-5853.

70. Defoe D.M., Matsumoto В., Besharse J.C. Reconstitution of the photoreceptor-pigment epithelium interface: L-glutamate stimulation of adhesive interactions and rod disc shedding after recombination of dissociated Xenopus laevis eyecups

71. Exp. Eye Res. 1992. V. 54.- P. 903-911.77. demonstration of acetylcholinesterase // Histochemistry. 1987. V.86. P. 531-532.

72. Donato R. Functional role of S-100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type // Biochim et Biophys Acta (BBA) / Mol. Cell Res. 1999. V. 1450. № 3.-P. 191-231.

73. Dreyfus C.F., Dai X., Lercher L.D. et al. Expression of neurotrophins in the adult spinal cord in vivo // J. Neurosci.Res. 1999. Vol.56, N1- P.1-7.

74. Durany N., Michel Т., Kurt J., Cruz-Sanchez F.F., Cervas-Navarro J., Riederer P. Brain-derived neurotrophic factor and neurotrophin-3 levels in Alzheimer's disease brains // Intern. J Dev. Neurosci. 2000. Vol.18, N 8.- P. 807-813.

75. Egensperger R., Maslim J., Bisti S., et al. Fate of DNA from retinal cells dying during development: uptake by microglia and macroglia (Muller cells) // Dev. Brain Res. 1996 Nov 22. V. 97(1).- P. 1-8.

76. Eguchi G. Lens transdifferentiation in the vertebrate retinal pigmented epithelial cells // Prog. Ret. Res. 1993. V. 12.- P. 205-230.

77. Feigenspan A., Bormann J., Wassle H. Organotypic slice culture of the mammalian retina // Visual Neurosci. 1993. V.10.- P.203-217.

78. Ferrer I., Ballabriga J., Marti E., Pozas E., Alberch J., Arenas E. BDNF up-regulates TrkB protein and prevents the death of CA1 neurons following transient forebrain ischemia // Brain Pathol. 1998.Vol. 8. N 2.- P.253-261.

79. Finlay D., Wilkinson G., Kypta R., et al. Retinal cultures // Methods Cell Biol. 1996. V.51.-P. 265-283.

80. Foreman D.M., Pancholi S., Jarvis-Evans J., et al. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. // Exp. Eye Res. 1996. V.62(5).- P. 555-564.

81. Friedman W.J., Black I.B., Kaplan D.R. Distribution of the neurotrophins brain-derived neurotrophic factor, neurotrophin-3 and neurotrophin-4/5 in the postnatal rat brain: An immunocytochemical stady // Neuroscience. 1998. Vol. 84, N1.-P.101-114.

82. Fu D., O'Neill R. A. Monosaccaride composition analysis of oligosaccharides

83. Galuske R.A., Kim D.S., Castren E. et al., Brain-derived neurotrophic factor reversed experience-dependent synaptic modifications in kitten visual cortex // Europ.J.Neurosci. 1996.Vol.8, N.7.- P. 1554-1559.

84. Garrido R., King-Pospisil K., Son K.W., Hennig В., Toborek M. Nicotine upregulates nerve growth factor expression and prevents apoptosis of cultured spinal cord neuron // Neurosci. 2003. Vol. 47, N3.- P.349-55

85. Gottschalk W., Pozzo-Miller L.D., Figurov A., Lu B. (1998). Presynaptic modulation of synaptic transmission and plasticity by BDNF in developing hippocampuss // J. Neuroscience. 1998. Vol. 18, N17.- P.6830-6839.

86. Grant С A, Ponnazhagan S, Wang XS, Srivastava A, Li T. Evaluation of recombinant adeno-associated virus as a gene transfer vector for the retina. Curr Eye Res 1997; 16(9).- P. 949-956.

87. Hagg T. Neurotrophins prevent death and differentially affect tyrosine hydroxylase of adult rat nigrostriatal neurons in vivo // Exper. Neurol. 1998. Vol. 149, N 1.-P. 183-192

88. Hoff A., Hammerle H., Schlosshaucr B. Organotypic culture system of chicken retina // Brain Res. Brain Res. Protoc. 1999. V. 4(3).- P. 237-248.

89. Hutchins J.B. Acetylcholine as a neurotransmitter in the vertebrate retina // Exp. Eye Res: 1987. V. 45.- P. 1- 38.

90. Jakeman L.B. Wei P., Guan Z. et al. Brain-derived neurotrophic factor stimulates hindlimb stepping and sprouting of cholinergic fibers after spinal cord injury // Ep.Neurol. 1998. Vol. 154, N 1.-P. 170-184.

91. Jaworowski A., Fang Z., Khong T.F., Augusteyn R.C. Protein synthesis and secretion by cultured pigment epithelia // Biochim. Biophys. Acta. 1995. Aug 17. V.1245(l).-P. 121-129.

92. Jensen A.M., Walker C., Westerfield M. Mosaic eyes: a zebrafish gene required in pigmented epithelium for apical localization of retinal cell division and lamination //Development. 2001. V.128.- P. 95-105.

93. ЮЗ.Капеко Y., Matsumoto G., Hanyu Y. The occurrence of apoptosis during retinal regeneration in adult newts // Dev. Brain Res. 1999. V.l 17.- P. 225-228.

94. Kaneko Y., Saito T. Appearance and maturation of voltage-dependent conductances in solitary spiking cells during retinal regeneration in the adult newt // J. Сотр. Physiol. 1992,- P. 411-425.

95. Kano Т., Abe Т., Tomita H., Sakata Т., Ishiguro S., Tamai M. Protective effect against ischemia and light damage of iris pigment epithelial cells transfected with the BDNF gene // Invest-Ophthalmol-Vis-Sci. 2002 Dec; 43(12).- P. 374453.

96. Kettenmann H., Ransom B.R. Neuroglia. 1995.- P.767.

97. Kim H.G., Wang Т., Olafsson P. Neurotrophin-3 potentiates neuronal activity and inhibitis gamma-aminobutyratergic synaptic transmission in cortical neurons // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. Vol.91, N.25.- P.12341-12345.

98. Kligman D., Hilt D.C. The S 100 protein family // TIBS. 1988. V.13.- P. 437-443.

99. Kntisel В., Beck K.D., Winslow J.W., Rosenthal A., Burton L.E., Widmer H.R.,

100. Ко ML, Hu DN, Ritch R, Sharma SC, Chen CF. Patterns of retinal ganglion cell survival after brain-derived neurotrophic factor administration in hypertensive eyes of rats. Neurosci Lett 2001; 305(2).- P139-142.

101. Ко ML, Hu DN, Ritch R, Sharma SC. The combined effect of brain-derived neurotrophic factor and a free radical scavenger in experimental glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 2000; 41(10).- P. 2967-2971.

102. Koda M., Murakami M., Ino H. Brain-derived neurotrophic factor suppresses delayed apoptosis of oligodendrocytes after spinal cord injury in rats // J. Neurotrauma. 2002. Vol.19. N6.- P.777-785.

103. Korhonen L., Riikonen R., Nawa H., Lindholm D. Brain derived neurotrophic factor is increased in cerebrospinal fluid of children suffering from asphyxia // Neurosci Lett. 1998. Vol.240, N 3.- P. 151-154

104. Korsching, S. The neurotrophic factor concept: a reexamination, (feature article) // J. Neuroscience. 1993. Vol. 13, N7.- P. 2739-2748.

105. Kosaka J., Watanabe K., Eguchi G. Transdifferentiation of chicken retinal pigmented epithelial cells in serum-free culture // Exp. Eye Res. 1992. V. 55.- P. 261-267.

106. Kosaka M., Kodama R., Eguchi G. In vitro culture system for iris-pigmented epithelial cells for molecular analysis of transdifferentiation // Exp. Cell Res. 1998. V. 245. № 2.- P. 245-251.

107. Kugler P. Improvement of the method of Karnovsky and Roots for the histochemical.

108. L 'Esperance F. Ophthalmic lazers. Photocoagulation, photoradiation and surgery.St.Louis.Mosby.1983.- P. 606.

109. Lai YK, Rakoczy P, Constable I, Rolling F. Adeno-associated virus-mediated gene transfer into human retinal pigment epithelium cells. Aust N Z J Ophthalmol 1998; 26(Suppl 1).- P 77-79.

110. Layer P.G., Weikert Т., Alber R. Cholinesterases regulate growth of chick nerve cells in vitro by means of a non-enzymatic mechanism // Cell Tissue Res. 1993. V.273.- P. 219-226.

111. Levin L. Apoptosis signaling in neurons // World Glaucoma Congress-International Glaucoma Review 2005- Vol. 7.- P. 22.

112. Lewis G.P., Erickson P.A., Guerin C.J. et al. Changes in the expression of specific Muller cell proteins during long term retinal detachment // Exp. Eye Res. 1989. V. 49(1).- P. 93-111

113. Lin W., Szaro B.G. Neurofilaments help to maintain normal morphologies and support elongation of neurites in Xenopus laevis cultured embryonic spinal cordneurons // J. Neurosci. 1995. V. 15.- P. 8331 8344

114. Lindholm D., Castren E., Berzaghi M. et al. Activity-dependent and hormonal regulation of neurotrophin messenger RNA lrvrls in the brain implications for neuronal plasticity // J. Neurobiol. 1994. Vol.25, N11.- P.1362-1372.

115. Lindsay "R.M. Role of neurotrophins and trk receptors in the development and maintenance of sensory neurons: an overview // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1996/Vol. 351, N 1338.- P.365-373.

116. Lodovichi C., Berardi N., Pizzorusso T et al. Effects of neurotrophins on cortical plasticity: Same or different? // J.Neurosci. 2000. Vol.20, N6.- P.2155-2165.

117. Lu P., Blesch A., Tuszynski M.H. Neurotrophism without neurotropism: BDNF promotes survival but not growth of lesioned corticospinal neurons // J. Сотр. Neurol. 2001, Vol. 436. N2,- P.456-470

118. Mack A.F., Fernald R.D. Thin slices of teleost retina continue to grow in culture // J. Neurosci. Methods. 1991. V.36.- P.195-202.

119. Mamounas L. A., Altar C. A., Blue M. E., Kaplan D.R., Tessarollo L. Lyons W.E. BDNF promotes the regenerative sprouting, but not survival, of injured serotonergic axons in the adult rat brain // Neurosci. 2000. Vol.20, N 2.- P.771-782.

120. Matsuzaki H., Namikawa К., Kiyama H., Mori N., Sato K. Brain-derived neurotrophic factor rescues neuronal death induced by methamphetamine // Biol Psychiatry. 2004. Vol.55, N.I.- P.52-60.

121. McAllister A.K., Katz L.C., Lo D.C. Neurotrophins and synaptic plasticity. Annual Review ofNeuroscience. 1999. Vol.22.- P.295-318.

122. McAllister A.K., Katz L.C., Lo D.C. Opposing roles for endogenous BDNF and NT-3 in regulating cotical dendritic growth //Neuron. 1997. Vol.18.- P.767-778.

123. McKinnon SJ, Lehman DM, Tahzib NG, Ransom NL, Reitsamer HA, Liston P et al. Baculoviral IAP repeat-containing-4 protects optic nerve axons in a rat glaucoma model. Mol Ther 2002; 5 (6).- P. 780-787

124. Merlio J.P., Ernfors P., Jaber M., Persson H. Molecular cloning of rat trkC and distribution of cells expressing messenger RNAs for members of the trk family in the rat central nervous system //Neuroscience. 1992. Vol.51, N 3.- P.513-532.

125. Minichiello L., Casagranda F., Tatche R.S., et al. Point mutation in trkB causes loss of Nt4-dependent neurons without major effects on diverse BDNF responses //Neuron. 1998. Vol.21, N2.- P. 335-345.

126. Minichiello L., Klein R. TrkB and TrkC neurotrophin receptors cooperate in promoting survival of hippocampal and cerebellar granule neurons // Genes Dev. 1996. Vol.10, N22.- P.2849-2858.

127. Mitashov V.I. Arsanto J.P., Markitantova Y.V., Thouveny Y. Remodelling processes during neural retina regeneration in adult urodeles: An immunohistochemical survey // Internal J. Dev. Biol. 1995. V. 39.- P. 993-1003.

128. Mitashov V.I. Arsanto J.P., Markitantova Y.V., Thouveny Y. Remodelling processes during neural retina regeneration in adult urodeles: An immunohistochemical survey // Internat. J. Dev. Biol. 1995. V. 39.- P. 993-1003.

129. Mitashov V.I. Arsanto J.P., Markitantova Y.V., Thouveny Y. Remodelling processes during neural retina regeneration in adult urodeles: An immunohistochemical survey // Internat. J. Dev. Biol. 1995. V. 39.- P. 993-1003.

130. Moroi S.E., Hao Y., Inoue-Matsuhisa E., et al. Cell signaling in bovine ciliaryepithelial organ culture. // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2000. V.16(l).- P. 65-74.

131. Moroi S.E., Hao Y., Inoue-Matsuhisa E., et al. Cell signaling in bovine ciliary epithelial organ culture. // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2000. V.16(l).- P. 65-74.

132. Moroi S.E., Hao Y., Inoue-Matsuhisa E., et al. Cell signaling in bovine ciliary epithelial organ culture. // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2000. V.16(l).- P. 65-74.

133. Murer M.G., Yan Q., Raisman-Vozari R. Brain-derived neurotrophic factor in the control brain, and in Alzheimer's disease and Parkinson's disease // Prog. Neurobiol. 2001. Vol. 63, N 1.- P.71-124

134. Nishizono H., Murata Y., Tanaka M. et al. Evidence that Mueller cells can phagocytize egg-lectin coated silicone particles // Tissue and Cell. 1993. V. 25(2).-P. 305-310

135. Nishizono H., Murata Y., Tanaka M. et al. Evidence that Mueller cells can phagocytize egg-lectin coated silicone particles // Tissue and Cell. 1993. V. 25(2).- P. 305-310

136. Nishizono H., Murata Y., Tanaka M. et al. Evidence that Mueller cells can phagocytize egg-lectin coated silicone particles // Tissue and Cell. 1993. V. 25(2).- P. 305-310

137. Osborn M., Weber K. Intermediate filaments: cell type specific markers in differentiation and pathology // Cell. 1982. V. 31.- P. 303-306.

138. Osborn M., Weber K. Intermediate filaments: cell type specific markers in differentiation and pathology // Cell. 1982. V. 31.- P. 303-306.

139. Osborn M., Weber K. Intermediate filaments: cell type specific markers in differentiation and pathology // Cell. 1982. V. 31.- P. 303-306.

140. Osborne N., Wood J., Chidlow G., et al. Ganglion cell death in glaucoma: what we really know? // Br. J. Ophthalmol.- 1999.- Vol. 83.-No. 8.- P. 980-986.

141. Pease ME, McKinnon SJ, Quigley HA, Kerrigan-Baumrind LA, Zack DJ. Obstructed axonal transport of BDNF and its receptor TrkB in experimental glaucoma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Mar;41(3).- P. 764-74.

142. Persechini A., Moncrief N.D., Kretsinger R.H. The EF-hand family of calcium-modulated proteins. // TINS. 1989. V. 12. № 11.- P.462-467.

143. Persechini A., Moncrief N.D., Kretsinger R.H. The EF-hand family of calcium-modulated proteins. // TINS. 1989. V. 12. № 11.- P.462-467.

144. Persechini A., Moncrief N.D., Kretsinger R.H. The EF-hand family of calcium-modulated proteins. //TINS. 1989. V. 12. № 11.- P.462-467.

145. Pinzon-Duarte G., Kohler K., Arango-Gonzales В., Guenther E. Cell differentiation, synaptogenesis, and influence of the retinal pigment epithelium in a rat neonatal organotypic retina culture // Visual Res. 2000. V. 40. № 25.- P. 3455-3465.

146. Pinzon-Duarte G., Kohler K., Arango-Gonzales В., Guenther E. Cell differentiation, synaptogenesis, and influence of the retinal pigment epithelium in a rat neonatal organotypic retina culture // Visual Res. 2000. V. 40. № 25.- P.3455-3465.

147. Pinzon-Duarte G., Kohler K., Arango-Gonzales В., Guenther E. Cell differentiation, synaptogenesis, and influence of the retinal pigment epithelium in a rat neonatal organotypic retina culture // Visual Res. 2000. V. 40. № 25.- P. 3455-3465.

148. Rait J. The prevention of ganglion cell suicide in primary open angle glaucoma // Asian J. Ophthalmol. 1998. Vol. 1, N2.- P.3-8.

149. Rakic P. Principles of neural cell migration // Experientia. 1990. Vol.46, N 9.- P. 882-891.

150. Rattner A., Smallwood P.M., Williams J., et al. A photoreceptor-specific cadherin is essential for the structural integrity of the outer segment and photoreceptor survival //Neuron. 2001. V. 32. № 5.- P. 775-786.

151. Rattner A., Smallwood P.M., Williams J., et al. A photoreceptor-specific cadherin is essential for the structural integrity of the outer segment and photoreceptor survival // Neuron. 2001. V. 32. № 5.- P. 775-786.

152. Rattner A., Smallwood P.M., Williams J., et al. A photoreceptor-specific cadherin is essential for the structural integrity of the outer segment and photoreceptor survival //Neuron. 2001. V. 32. № 5.- P. 775-786.

153. Raymond S.M., Jackson I,J. The retinal pigmented epithelium is required for development and maintenance of the mouse neural retina // Curr. Biol. 1995. V.5(ll).- P.1286-1295.

154. Raymond S.M., Jackson I.J. The retinal pigmented epithelium is required for development and maintenance of the mouse neural retina // Curr. Biol. 1995. V.5(ll).-P.1286-1295.

155. Raymond S.M., Jackson I.J. The retinal pigmented epithelium is required for development and maintenance of the mouse neural retina // Curr. Biol. 1995. V.5(ll).-P.1286-1295.

156. Redburn D.A., Rowe-Rendleman Ch. Developmental neurotransmitters: signals for shaping neuronal circuitry // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996. 37. № 8.- P. 1479-1482.

157. Redburn D.A., Rowe-Rendleman Ch. Developmental neurotransmitters: signals for shaping neuronal circuitry // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996. 37. № 8.- P. 1479-1482.

158. Redburn D.A., Rowe-Rendleman Ch. Developmental neurotransmitters: signals for shaping neuronal circuitry // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1996. 37. № 8.- P. 1479-1482.

159. Reichardt L. F., Farinas, I. Neurotrophic factors and their receptors: roles in neuronal development and function // Molecular and Cellular approaches to Neural Development. 1997.- P. 220-263

160. Rickman D.W. Parvalbumin immunoreactivity is enhanced by brain-derived neurotrophic factor in organotypic cultures of rat retina. // J/ Neurobiol. 1999. V.41(3).- P. 376-384.

161. Rickman D.W. Parvalbumin immunoreactivity is enhanced by brain-derived neurotrophic factor in organotypic cultures of rat retina. // J/ Neurobiol. 1999. V.41(3).- P. 376-384.

162. Rickman D.W. Paralbumin immunoreactivity is enhanced by brain-derived neurotrophic factor in organotypic cultures of rat retina. // J/ Neurobiol. 1999. V.41(3).-P. 376-384.

163. Robitzki A. et al. Antisense 5'-DNA butyrylcholiesterase increases retinal apoptosis // J. Methods. 1991. V.36.- P. 195-202.

164. Robitzki A. et al. Antisense 5'-DNA butyrylcholiesterase increases retinal apoptosis // J. Methods. 1991. V.36.- P. 195-202.

165. Robitzki A., Mack A., Hoppe U., et al. Regulation of cholinesterase gene expression affects neuronal differentiation as revealed by transfection studies on reaggregating embryonic chicken retinal cells // Eur. J. Neurosci. 1997b.V. 9.- P. 2394-2405.

166. Robitzki A., Mack A., Hoppe U., et al. Regulation of cholinesterase gene expression affects neuronal differentiation as revealed by transfection studies on reaggregating embryonic chicken retinal cells // Eur. J. Neurosci. 1997b.V. 9.- P. 2394-2405.

167. Robitzki A., Mack A., Hoppe U., et al. Regulation of cholinesterase gene expression affects neuronal differentiation as revealed by transfection studies onreaggregating embryonic chicken retinal cells // Eur. J. Neurosci. 1997b.V. 9.- P. 2394-2405.

168. Sala R., Viegi A., Rossi F.M., Pizzorusso Т., Bonanno G., Raiteri M., Maffei L. Nerve growth factor and brain-derived neurotrophic factor increase neurotransmitter release in the rat visual cortex // Europ. J. Neurosci. 1998. Vol. 10.- P.2185-2191

169. Schuettauf F., Volwerk C., Naskar R. Adeno-associated viruses containing bFGF or BDNF are neuroprotective against excitotoxicity // Current Eye Res 2004-Vol. 29.- P. 379-386.

170. Seiler M., Aramant R. et al.Characteristic of embryonic retina transplanted to rat and rabbit retina // Neuro-Ophthalm. 1991. Vol. 11.- P.263-273.

171. Shpak A., Gavrilova N., Lanevskaya N. Brain-Derived Neurotrophic Factor in Patients with Primary Open-Angle Glaucoma // World Ophthalmology Congress Hong Kong, 28 June-2 July 2008. P. 19.

172. Silver J., Edwards M.A., Lewitt P. Immunocytochemical demonstration of early appearing astroglial structures that form boundaries and pathways along axon tracts in the fetal brain // J. Сотр. Neurol. 1993. Vol.328, N3.- P.415-436.

173. Small D.L., Murray C.L., Mealing G.A. Brain-derived neurotrophic factor increases activity of NR2B-containing N-methyl-D-aspartate receptors in excised patches from hippocampal neurons //Neurosci. Lett. 1998. Vol. 252, N3. P.211-214.

174. Takano M, Horie H, Iijima Y, Dezawa M, Sawada H, Ishikawa Y. Brain-derived neurotrophic factor enhances neurite regeneration from retinal ganglion cells in aged human retina in vitro. Exp Eye Res 2002; 74(2).- P. 319-323.

175. Tanaka Т., Saito H., Matsuki N. Inhibition of GABAA synaptic responses by brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in rat hippocampus // J Neurosci. 1997. Vol.17.-P.2959-2966.

176. Taylor S., Srinivasan В., Wordinger R. Glutamate stimulates neurotrophin expression in cultured Muller cells // Brain Res. and Molecular Brain Res-2005.-Vol. 111.-P. 189-197.

177. Tokumine J., Kakinohana O., Cizkova D., Smith D.W., Marsala M. Changes in spinal GDNF, BDNF, and NT-3 expression after transient spinal cord ischemia in the rat // J. of Neurosci. Res. 2003. Vol. 74, N 4.- P. 552-561

178. Tuszynski M. H., Gage F.H. Bridging grafts and transient nerve growth factor infusions promote long-term central nervous system neuronal rescue and partial functional recovery//Proc. Natl. Acad. Sci. 1995. Vol.92, N10.- P. 4621-4625.

179. Vicario-Abejon C., Collin C., McKay R. D., Segal M. Neurotrophins induce formation of functional excitatory and inhibitory synapses between cultured hippocampal neurons // J. Neuroscience. 1998. Vol.18, N 18,- P.7256-7271.

180. Viktorov I.V., Aleksandrova O.P., Alekseeva N.Y. Roller organ cultures of the retina from postnatal rats.// Bull Exp Biol Med. 2006.Vol.142, N4.- P.486-489.

181. Wirth M.J., Brun A., Grabert J., Patz S. Wahle P. Accelerated dendritic development of rat cortical pyramidal cells and interneurons after biolistic transfection with BDNF andNT4/5 // Development. 2003.Vol.130.- P. 5827-5838.

182. Wu H., Black I.B., Dreyfus C.F. Differential regulation of neurotrophin expression in basal forebrain astrocytes // Soc. Neurosci. 1996. Vol.22.- P. 548.

183. Zhao L.R., Risedal A., Wojcik A. et al. Enriched environment influences brain-derived neurotropic factor levels in rat forebrain after focal stroke // Neurosci. Lett. 2001. Vol. 305, N 3.- P. 169-172

184. Kay M.C. Ischemic optic neuropathy. Neurol.// Clin. 1991. Feb. 9(1).-P. 115-129.

185. Aiello A.L., Sadum A.A., Feldon S.E. Spontaneous improvement of progressive anterior ischemic optic neuropathy: report of two cases ( letter) // Arch. Ophthalmol. 1992. Vol. 110. N.9.- P. 119-1199.

186. Silverman M.S., Hughes S.E.// Progr.Clin.Biol.Res. 1989. -Vol.314. - P.687-704.

187. Das Т., del Cerro M., Jalali S.,Rao V.S. et al., The transplantation of human fetal neuroretinal cells in advanced retinitis pigmentosa patients: results of a long-term safety study// Exp. Neurol.-1999.-V. 157.- P.58-68.

188. Radtke N.D., Aramant R.B.,Seiler M., Petry H.M. Preliminary report: indications of improved visual function after retinal sheet transplantation in retinitis pigmentosa patients // Am.J.Ophthalmol. -1999.V.128.- P.384-387.

189. Algvere P.V. Berlin L., Gouras P., Sheng Y. Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularisation// Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. -1994. V.232.- P.707-716.

190. Algvere P.V. Berlin L., Gouras P.et al. Transplantation of RPE in age- related macular degeneration: observations in disciform in lesions and dry RPE athrophy // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. -1997. V.235.- P.149-158.

191. Weisz J.M., Humayun M.S., de Juan Jr., del Cerro M.et al., Allogenic fetal pigment epithelial celltransplant in a patient with geographic atrophy // Retina. -1999.-V.19.- P. 540-545.

192. Sheedio H.J., Li L.X., Turner J.E. Photoreceptor cell rescue in the Res rat by RPE transplantation: a therapeutic approach in a model of inherited retinal dystrophy // Prog.Clin.Bio.Res.-1989.V.314.- P.645-658.

193. Whiteley S.J., Utchfield T.M.,Coffey PJ.et al. Imrovement of the papillary light reflex of Royal College of Surgeons rats following RPI cell grafts //Exp. Neural. -1996.-V. 140.-P. 100-141.

194. Yamamoto S., Du J., Gouras P. Et al. Retinal pigment epithelial transplants and retinal function in RCS rats // IOVS.- 1993.-V.34.- P.3068-3075.

195. Takahashi M., Palmer T. D. , Takahashi J. et al. Widespread integration and survival of adult-derived neural progenitor cells in the developing optic retina// Mol. Cell Neurosci. 1998.V. 12.- P.340-348.

196. Nishida A., Takahashi M. , Tanihara H. et al. Incorporation and differentiation of hippocampus-derived neural stem cells transplanted in injured adult rat retina //IOVS.2000.V.41.- P.4268-4274.

197. Young M. J., Ray J., Whiteley S. J. et al. Integration of transplanted neural progenitor cells into the retina of the dystrophic rat// IOVS. 1999. V. 40.- P.3846.

198. Young M. J., Ray J., Whiteley S. J. et al. Neuronal differentiation and morphological integration of hippocampal progenitor cells transplanted to the retina of immature and mature distrophic rats// Mol. Cell Neurosci.2000.V.16.-P. 197-2 05.

199. Murimoto H., Murimoto K., Whiteley S.J. et al. Transplantation of human neural progenitor cells to the vitreous cavity of the Royal College of Surgeons ratII Cell Transpl.2001.V. 10.- P.223-233.

200. Hara A., Niwa M., Kunisada Т., Yoshimura N. et al. Embryonic stem cells are capable of generating of neuronal network in the adult mouse retina// Brain Res.2004.V.999.- P.216-221.

201. Kurimoto Y., Shibuki H., Kaneko Y. et al. Transplantation of adult rat hippocampus-derived neural stem cells into retina injured by transient ischemia// Neurosci. Lett.2001.V.306.- P.57-60.

202. Ahmad I. Stem Cells: New Opportunities to treat EyeDiseases// IOVS. 2 001.V.42.- P. 274 3-2748 .

203. Dong X., Pulido J. S., Qu T. et al. Differentiation J of human neural stemcells into retinal cells.// Neuroreport.-2003.-V. 14.- P. 143-146.

204. Schraermeyer U., Thumann G., Luther T. et al. Subretinally transplanted embryonic stem cells rescue photoreceptors cells from degeneration in the RCS rats// Cell Transplant.2001 .V. 10.- P.673-680.

205. WarfVinge K., Kamme C, Englund U. et al. Retinal integration of grafts of brain-derived precursor cell lines implanted subretinally into adult normal rats// Exp. Neurology.2001 .V. 169.- P. 1 -12.

206. Wojciechowski А. В., Englund U., Lundberg C. et al. Long-term survival and glial differentiation of the brain-derived precursor cell line RN33B after subretinal transplantation to adult normal rats// Stem Cells.2002.V.20.- P. 163-173.

207. Wojciechowski А. В., Englund U., Lundberg C. et al. Survival and long migration of brain-derived precursors cells transplanted to adult rat retina// Stem Cells.2004.V.22.- P.27-38.

208. Kicic A., Shen W-J., Wilson A. S. et al. Differentiation of marrow stromal cells into photoreceptors in the rat eye// J. Neurosci. 2003. Abstracts. V.23.- P.7742.

209. Tomita M., Adashi Y., Yamada H. et al. Bone marrow-derived stem cells can differentiate into retinal cells in injured rat retina// Stem Cells.2002.V.20.- P. 279283.

210. Sagdullaev B.T., Amarant R.B., Seiler M.J., Woch G., McCall M. Retinal transplantation-induced recovery of retinotectal visual function in a rodent model of retinitis pigmentosa // IOVS.2003.V.44.- P. 1686-1695.

211. Sauve Y., Girman S.V., Wang S., Keegan D.Y., Lund R.D. Preservation of visual responsiveness in thesuperior colliculus of RCS rats after retinal pigmented epitheliumcell transplantation // Neurosci.2002.V. 114,- P.389-401.

212. Woch G., Aramant R.B., Seiler M.J., Sagdullaev B.T., McCall A. Retinal transplants restore visually evoked responses in rats with photoreceptor degeneration// IOVS.2001.V.42.- P. 1669-1676.

213. Jiang L.G., Hamasaki D. Corneal electroretinographic function rescued by normal retinal pigment epithelial grafts in retinal degenerative Royal College of Surgeonsrats// IOVS.1994.V.35.- P.4300-4309.

214. Lund R.D., Kwan A.S., Keegan D.J., Sauve Y. et al. Cell transplantation as a treatment for retinal disease. Elsevier Science.2001.- P.416-449.

215. Prasky G.T., Lu В., Douglas R.M., Lund R.D. Loss ofvision resulting from retinal degeneration is limited by retinal transplantation// Soc. Neurosci. Abstr. 2002.-V.158.-P.12.

216. La Vail M.M., Yasumura D., Matthes M.t. et al. protection of mouse photoreceptors by survival factors in retinal degeneration// IOVS. 1998.V.39. -P.592-602.

217. Lambiase A., Aloe L. Nerve growth factor delays retinal degeneration in C3H mice// Graefes Arch.Clin.Exp.Ophthalmol.l996.V.234 (suppl 1).- P.S96-S100.

218. Cayouette M., Behn D., Sendther M. et al. Intraocular gene transfer of ciliary neurotrophic factor prevents death and increases responsiveness of rod photoreceptors in the retinal degeneration slow mouse// J. Neurosci. 1998. V. 18.- P.9282-9293.

219. Beatty S. et al. Macular Pigment and risk for age-related macular degeneration in subjects from a Northern population // Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. -2001.-Vol.42.- P.439-446.

220. Thornton J., Edwards R., Mitchell P. et al. Smoking and age-related macular degeneration: a review of association // Eye.- 2005.-Vol.19.- P. 935-944.

221. Clemons Т.Е., Milton R.C., Klein R et al. Risk factors for the incidence of advanced age-related macular degeneration in the Age- Related Eye Disease Study. // Ophthalmology. 2005.- Vol.112. - P. 533-539.