Влияние мезенхимальных стромальных клеток на иммунную реконституцию в посттрансплантационном периоде у больных лимфомами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат медицинских наук Баторов, Егор Васильевич

• Баторов, Егор Васильевич
• кандидат медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Баторов, Егор Васильевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. РЕКОНСТИТУЦИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ

ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 ИСТОЧНИКИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ АУТОЛОГИЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

1.2. МЕХАНИЗМЫ ВОССТАНОВЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ЦИТОПЕНИИ

1.2.1. Гомеостатическая пролиферация Т-лимфоцитов в условиях цитопении

1.2.2. Роль тимуса в иммунной реконституции после ТГСК

1.3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В ТЕРАПИИ ГЕМОБЛАСТОЗОВ

1.3.1. Общая характеристика мезенхимальных стромальных клеток

1.3.2. Влияние МСК на гемопоэз

1.3.3. Влияние МСК на генерацию и функции Т-лимфоцитов

1.3.4. МСК при гемобластозах

1.4. РЕГУЛЯТОРНЫЕ Т-КЛЕТКИ ПРИ ГЕМОБЛАСТОЗАХ

1.4.1. Регуляторные Т-клетки после ТГСК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 ВЛИЯНИЕ МСК НА РАННЕЕ ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ АУТОЛОГИЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

3.2. ОСОБЕННОСТИ РАННЕГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ЛИМФОМАМИ ПОСЛЕ АТГСК И ВЛИЯНИЕ КО-ТРАНСПЛАНТАЦИИ МСК НА РЕКОНСТИТУЦИЮ Т-КЛЕТОК

3.3. ВЛИЯНИЕ МСК БОЛЬНЫХ НА IL-2-СТИМУЛИРОВАННУЮ ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЛИМФОЦИТОВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO И ДИНАМИКУ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КЛЕТОК С ФЕНОТИПОМ НЕДАВНИХ МИГРАНТОВ ИЗ ТИМУСА

3.3.1. Влияние различных доз МСК на IL-2-стимулированную пролиферацию лимфоцитов in vitro

3.4.2. Влияние МСК на относительное количество CD31+ наивных Т-клеток у больных злокачественными лимфомами в посттрансплантационном периоде

3.4. РЕГУЛЯТОРНЫЕ Т-КЛЕТКИ У БОЛЬНЫХ ЛИМФОМАМИ ПОСЛЕ АУТОЛОГИЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

3.5. ВЛИЯНИЕ МСК НА КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЭФФЕКТИВНОСТИ АТГСК У БОЛЬНЫХ ЛИМФОМАМИ

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Литература

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ аланиновая аминотрансфераза

АсАТ аспарагиновая аминотрансфераза

АТГСК аутологичная трансплантация гемопоэтических

стволовых клеток

ВДХТ высокодозная химиотерапия

Г-КСФ гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ГСК гемопоэтические стволовые клетки

ДК дендритные клетки

ДКБКЛ диффузная крупноклеточная В-клеточная лимфома

ЗЛ злокачественные лимфомы

ИВ индекс влияния

ИДО индоламин-2,3-диоксигеназа

КМ костный мозг

ЛХ лимфома Ходжкина

ММ множественная миелома

МСК мезенхимальные стромальные клетки

МНК мононуклеарные клетки

НХЛ неходжкинские лимфомы

ПК периферическая кровь

РВЛ раннее восстановление лимфоцитов

РТПЛ реакция «трансплантат-против-лейкоза»

РТПХ реакция «трансплантат-против-хозяина»

СКЛ смешанная культура лимфоцитов

ТГСК трансплантация гемопоэтических стволовых клеток

Трег регуляторные Т-клетки

ЦМВ цитомегаловирусный

Анти-СБЗ анти-СБЗ антитела

ССЬ хемокины подсемейства СС

CD кластер дифференцировки

FLIPI международный прогностический индекс для

фолликулярной лимфомы HGF фактор роста гепатоцитов

ICAM-1 молекула межклеточной адгезии 1 типа

ICOS индуцибельный костимуляторный рецептор

ICOS-L лиганд индуцибельного костимуляторного рецептора

IFN-y интерферон у

IGF инсулиноподобный фактор роста

IL-2, IL-4 и др. интерлейкин-2, интерлейкин-4 и др. PGE2 простагландин Е2

TGF-P трансформирующий фактор роста f3

TLR То11-подобный рецептор

TREC Т cell receptor excision circles, кольцевые ДНК,

состоящие из фрагментов генов Т-клеточного рецептора

VCAM-1 молекула адгезии сосудистого эндотелия 1 типа

VEGF фактор роста эндотелия сосудов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние мезенхимальных стромальных клеток на иммунную реконституцию в посттрансплантационном периоде у больных лимфомами»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Гемобластозы занимают особое место в структуре онкологической заболеваемости: составляя около 5 % от всех случаев развития злокачественных опухолей в целом, в возрастной группе до 30 лет их доля — 32,9% (loe место) [1]. Злокачественные лимфомы (3JI) — неходжкинские лимфомы (HXJT), лимфома Ходжкина (JIX), множественная миелома (ММ), — гетерогенная группа периферических Т- и В-клеточных лимфоидных опухолей, обеспечивают основную динамику роста заболеваемости гемобластозами, которая опережает общую онкологическую заболеваемость в неблагоприятных районах в 4,5 раза [3]. Особенностью HXJI и XJI является агрессивное течение у лиц молодого трудоспособного возраста [5, 6]. ММ на сегодняшний день остается инкурабельным заболеванием. Несмотря на улучшение результатов терапии, увеличение агрессивных форм обусловливает увеличение смертности, в частности, от HXJI, на 2-4% в год, что требует поиска новых и совершенствования существующих методов терапии [2].

Аутологичная трансплантация гемопоэтических стволовых клеток (АТГСК) после высокодознои химиотерапии (ВДХТ) является эффективным и относительно безопасным (по сравнению с аллогенной ТГСК) методом лечения ряда гематологических, онкологических и аутоиммунных заболеваний. В мире ежегодно выполняется более 30000 аутологичных ТГСК [18, 177], около 80% приходится на долю 3JI [24], для большинства из которых при диагностике рецидива и первично-рефрактерного течения при отсутствии противопоказаний ВДХТ с АТГСК является терапией выбора [138], позволяющей значительно увеличить частоту ремиссий и показатели выживаемости [2].

Тем не менее, рецидив заболевания после аутологичной ТГСК возникает приблизительно у половины больных HXJI и JIX [57, 195], а при ММ практически неизбежен, и является причиной смерти в 73 % случаев [177].

Рецидив в 20-40% случаев возникает в течение первых 2 лет [57, 181], при этом медиана выживаемости, например, для лимфомы Ходжкина после раннего рецидивирования не превышает, по данным разных авторов, 1-2 лет [2, 57]. В связи с этим продолжается поиск и разработка методов как оптимизации аутологичной ТГСК, так и прогноза течения посттрансплантационного периода.

Усиление токсичности на фоне интенсификации ВДХТ существенно ограничивает уровень фармакологического цитостатического воздействия на эффективность ТГСК. С другой стороны, интенсивное изучение процессов, происходящих в иммунной системе, позволило выявить новые возможности влияния на исход данного метода лечения, как препаратами таргетной терапии (моноклональные антитела, ингибиторы ферментов), так и средствами клеточной иммунотерапии. Понимание механизмов иммунной реконституции после ТГСК, в частности, важность раннего восстановления определенных субпопуляций лимфоцитов, может привести, например, к пересмотру подходов к мобилизации и сепарации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) [187].

Среди прочих методов клеточной терапии при ТГСК использование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) в последнее время привлекает все большее внимание. Это в первую очередь обусловлено способностью МСК продуцировать гемопоэз-стимулирующие цитокины, дифференцироваться в клетки кроветворного микроокружения и соответственно поддерживать гемопоэз [16, 148]. Проведение химио/радиотерапии у больных гемобластозами и солидными опухолями приводит к выраженным нарушениям гемопоэз-поддерживающей функции стромальных клеток костного мозга. Поэтому одновременное введение МСК при ТГСК после ВДХТ может способствовать улучшению приживления ГСК и сокращения сроков критической цитопении [27, 175, 234]. Кос с соавт. продемонстрировали, что ко-трансплантация аутологичных МСК больным с метастатическими формами рака молочной железы позволила улучшить

исходы ТГСК и добиться быстрого восстановления числа нейтрофилов и тромбоцитов [124]. Позднее Ball с соавт. показали, что ко-трансплантация донорских МСК позволяет добиться быстрого восстановления гемопоэза и снижает риск отторжения трансплантата у пациентов с аллогенной трансплантацией гаплоидентичных ГСК [25]. Целесообразность ведения МСК также обсуждается при трансплантации ГСК пуповинной крови, когда ограниченное количество ГСК может быть причиной задержки восстановления гемопоэза [27].

Вторым аспектом, привлекающим внимание к МСК, является наличие у этих клеток выраженных иммуносупрессивных свойств [86, 128, 233], в том числе за счет индукции генерации регуляторных Т-клеток (Трег) [67, 190], что, с одной стороны, определяет перспективы применения МСК для профилактики и подавления трансплантационных реакций [27, 216, 229], а с другой - вызывает опасения, что ко-трансплантация МСК может негативно сказываться на раннем восстановлении лимфоцитов, во многом определяющих исходы ТГСК.

При этом значение самих Трег при гемобластозах остается недостаточно исследованным и понятным. С одной стороны, возрастание Трег в периферической крови и опухолевом микроокружении при лимфомах и лейкозах и выявленная способность этих клеток подавлять реакции клеточного иммунитета свидетельствует о негативной роли регуляторных Т-клеток в противоопухолевом ответе [107, 158, 224]. Подтверждением тому являются данные, демонстрирующие, что элиминация Трег в экспериментальной модели лимфомы приводит к регрессии опухоли [105]. С другой стороны, количество Трег в зоне опухолевого роста при JIX и HXJI прямо коррелирует с показателями выживаемости, и их содержание в стадии ремиссии выше, чем на фоне прогрессии [44, 232]. Эти факты свидетельствует о том, что локализованные в опухоли Трег могут, по-видимому, оказывать и позитивный эффект, подавляя пролиферацию малигнизированных клонов лимфоцитов.

Восстановление Т-лимфоцитов после АТГСК происходит за счет тимопоэза и гомеостатической пролиферации. Ранние исследования показали, что МСК ингибируют пролиферацию наивных Т-клеток и Т-клеток памяти на поликлональные стимулы и антигены [69, 127]. Также было продемонстрировано, что МСК ингибируют пролиферацию лимфоцитов, стимулированных IL-2, IL-7 и IL-15, т.е. отражающую гомеостатическую пролиферацию Т-клеток, инициируемую не через Т-клеточный рецептор [34]. Следует, однако, отметить, что ингибирующий эффект МСК in vitro не всегда подтверждается in vivo [207]. Данные о влиянии МСК на гомеостатическую пролиферацию лимфоцитов in vivo в принципе отсутствуют. Кроме того, до сих пор не исследовано влияние МСК на эффективность тимопоэза. Поэтому вопрос о том, будут ли МСК обладать иммуносупрессивным эффектом на восстановление лимфоцитов у больных с ТГСК, остается открытым.

С целью прогнозирования агрессивности течения, эффективности терапии больных лимфомами отдельными авторами предлагается использовать определение различных морфологических или иммунологических параметров, или цитогенетических нарушений в малигнизированных клетках [4, 106]. Для прогноза развития рецидивов и характера течения агрессивных HXJI предложено использовать Международный прогностический индекс (International Prognostic Index, IPI). Общим недостатком этих методов является низкая прогностическая ценность, что во многом обусловлено проводимой высокодозной XT (в том числе в комбинации с АТГСК), которая неизбежно оказывает влияние на общеклинические и лабораторные характеристики опухоли. В последнее время было выявлено большое прогностическое значение скорости иммунной реконституции после АТГСК, выражающееся в сроках восстановления лимфоцитов и их отдельных субпопуляций, а также факторов, влияющих на этот процесс, в частности абсолютного содержания лимфоцитов в продукте афереза [20, 108, 188]. Возможное влияние ко-

трансплантации аутологичных МСК требует пристального внимания в связи с возможными негативными и позитивными эффектами на исход ТГСК.

Все вышеизложенное определило цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования

Изучить влияние ко-трансплантации аутологичных мезенхимальных стромальных клеток на восстановление различных популяций Т-лимфоцитов, а также клинико-лабораторные показатели эффективности аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать раннее восстановление лимфоцитов, в том числе с учетом количества трансплантируемых ГСК и лимфоцитов в составе продукта сепарации у больных 3JI в группах со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК.

2. Изучить эффективность ранней реконституции наивных Т-клеток и Т-клеток памяти в субпопуляциях CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в группах пациентов со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК.

3. Исследовать влияние МСК больных на IL-2-стимулированную пролиферацию лимфоцитов в культуре in vitro и динамику восстановления клеток с фенотипом недавних мигрантов из тимуса (CD4+CD45RA+CD31+) в посттрансплантационном периоде ex vivo.

4. Изучить динамику восстановления регуляторных Т-клеток в группах больных 3J1 со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК и взаимосвязь между количеством Трег и исходами АТГСК.

5. Оценить клинико-лабораторные показатели, характеризующие эффективность АТГСК, в сопоставимых группах больных 3JI со стандартной АТГСК и ко-трансплантацией МСК.

Научная новизна

В результате выполнения работы впервые показано, что частота пациентов с ранним восстановлением лимфоцитов в группе больных 3JI с ко-трансплантацией МСК достоверно выше, чем в группе пациентов со стандартной АТГСК. При этом стимулирующий эффект МСК наиболее ярко проявлялся при низком содержании CD34+ ГСК или лимфоцитов в продукте сепарации. Установлено, что ко-трансплантация МСК повышает эффективность иммунной реконституции как за счет Т-клеток памяти, так и наивных Т-клеток, особенно популяции CD4+ Т-лимфоцитов, а также приводит к более быстрому восстановлению клеток с фенотипом недавних мигрантов из тимуса (CD4+CD45RA+CD31+). Выявлен стимулирующий эффект МСК больных 3JI на IL-2-индуцированную пролиферацию лимфоцитов in vitro, при этом эффект МСК обратно коррелирует с исходной реактивностью МНК к IL-2. Впервые продемонстрировано, что реконституция Трег после АТГСК проявляется быстрым (в течение месяца) восстановлением относительного содержания CD4+FOXP3+ и CD4+CD25hl Трег, ДО исходно повышенного уровня и постепенным снижением до нормативных значений к исходу 12 мес. При этом ко-трансплантация МСК не оказывает значимого эффекта на содержание Трег в динамике 12 мес. периода после АТГСК. Получены новые данные о взаимосвязи между повышенным содержанием Трег периферической крови в раннем посттрансплантационном периоде и неблагоприятным исходом АТГСК (развитие раннего рецидива/прогрессии заболевания). Выявлено, что наряду с повышением эффективности раннего восстановления лимфоцитов и иммунной реконституции ко-трансплантация МСК приводит к сокращению продолжительности нейтро- и тромбоцитопении, снижению в 1,75 раза частоты развития тяжелых инфекционных осложнений и не сопровождается эскалацией ПХТ-индуцированной нефро- и гепатотоксичности и ухудшением показателей 5-летней выживаемости.

Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая значимость работы заключается в расширении представлений об иммунорегуляторной активности МСК, в частности, способности этих клеток стимулировать раннее восстановление лимфоцитов и реконституцию Т-клеток у больных ЗЛ после проведения АТГСК за счет улучшения инграфтинга ГСК и усиления периферической экспансии лимфоцитов. Способность МСК поддерживать периферическую экспансию Т-клеток в условиях индуцированной лимфопении подтверждается данными о более эффективном восстановлении пула Т-клеток памяти и наивных Т-лимфоцитов на этапе выхода из лейкопении и стимулирующем эффекте МСК на пролиферацию лимфоцитов в условиях, моделирующих гомеостатическую пролиферацию (при стимуляции лимфоцитов р1Ь-2). С другой стороны, данные о более быстром (к 6 мес. после АТГСК) восстановлении наивных Т-лимфоцитов с фенотипом недавних мигрантов из тимуса на фоне введения МСК не исключает позитивного влияния МСК на тимопоэз. Полученные данные о динамике восстановления Трег после стандартной АТГСК и ко-трансплантации МСК раскрывают закономерности реконституции ТреГ и свидетельствуют об отсутствии стимулирующего влияния МСК больных ЗЛ на количественную экспансию Трег. В свою очередь выявленная взаимосвязь между повышенным количеством СБ4+РОХРЗ+ и СВ4+СБ25Ь1 Трег и развитием рецидива/прогрессии основного заболевания указывает на негативное влияние этих клеток на противоопухолевый иммунный ответ в посттрансплантационном периоде.

Практическая значимость работы заключается в выявлении позитивного влияния МСК на сокращение сроков критической цитопении и ускорение иммунной реконституции при отсутствии стимулирующего эффекта на реконституцию Трег. Эти факты в совокупности с данными о снижении частоты развития тяжелых инфекционных осложнений при отсутствии негативного эффекта МСК на выраженность ПХТ-индуцированной нефро- и гепатотокчности и показатели выживаемости обосновывают безопасность и целесообразность ко-трансплантации МСК для

улучшения инграфтинга ГСК и иммунной реконституции у больных лимфомами. Другим прикладным аспектом является разработка нового метода прогнозирования раннего рецидива у больных ЗЛ на основе оценки Трег на момент выхода из лимфопении.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ко-трансплантация аутологичных МСК у больных ЗЛ с АТГСК является эффективным способом, повышающим частоту раннего восстановления лимфоцитов с наибольшей выраженностью эффекта у пациентов с низким количеством СБ34+ГСК или лимфоцитов в продукте афереза.

2. Ко-трансплантация аутологичных МСК у больных ЗЛ является безопасным методом повышения эффективности иммунной реконституции и приживления ГСК и не приводит к развитию негативных иммунотропных (количественной экспансии Трег) и клинических эффектов (возрастанию частоты инфекционных осложнений, эскалации ПХТ-индуцированной гепато/нефротокисичности и ухудшению показателей выживаемости).

3. Повышенное содержание Трег периферической крови больных ЗЛ на момент выхода из лимфопении является диагностически значимым маркером, позволяющим с высокой вероятностью прогнозировать развитие раннего рецидива заболевания.

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 134 страницах машинописного текста, включающего 18 таблиц и 19 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 251 литературный источник, в том числе 241 иностранный. Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийской научно-практической конференции «Дни иммунологии в Сибири» (Иркутск, 2012), Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010), 9ом ежегодном заседании Ассоциации по иммунотерапии рака - Association for Cancer Immunotherapy (CIMT) 9th Annual Meeting (Mainz, 2011), Зей Международной конференции по регуляторным Т клеткам и субпопуляциям Т-хелперов и их клиническому применению при болезнях человека - The 3rd International Conference on Regulatory T Cells and Helper T Cell Subsets and Clinical Application in Human Diseases (Shanghai, 2012), а также 8ой отчетной конференции ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН (Новосибирск, 2011). Апробация диссертации состоялась 29 ноября 2012 г. на семинаре клинического отдела ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных работ.

Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии отдела клинической иммунологии ФГБУ «НИИ клинической иммунологии» СО РАМН (руководитель лаборатории член-корреспондент РАМН, д.м.н., профессор, Е.Р. Черных).

ГЛАВА 1. РЕКОНСТИТУЦИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 ИСТОЧНИКИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ЛИМФОЦИТОВ ПОСЛЕ АУТОЛОГИЧНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

Восстановление лимфоцитов после высокодозной химиотерапии (ВД ХТ) и последующей аутологичной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (АТГСК) может идти из 4 источников: CD34+ гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и лимфоцитов, сохранившихся в организме после ВД ХТ, и ГСК и лимфоцитов, реинфузируемых в составе продукта сепарации.

Как правило, после курсов химиотерапии, используемых в режимах кондиционирования перед АТГСК, самостоятельное восстановление кроветворения невозможно. Тем не менее, данные, полученные при проведении аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ТГСК), показывают, что Т-клетки способны переживать миелоаблативные режимы химиотерапии [41, 201]. Например, Roux с соавт., используя ПЦР, в течение первого года после аллогенной трансплантации костного мозга (КМ) с деплецией Т-клеток в трансплантате выявляли лимфоциты доноров и реципиентов [201]. В любом случае, вклад незначительного количества клеток, перенесших курс ВДХТ, направленный в том числе и на их полноценную эрадикацию, не может играть большой роли.

На заре использования АТГСК в лечении гемобластозов считалось, что клиническая эффективность процедуры реализуется только за счет предшествующей миелоаблативной ВДХТ, направленной на эрадикацию опухолевых клеток. CD34+ ГСК, полученные из КМ и периферической крови (ПК), используются для восстановления кроветворения после миелоаблативных режимов кондиционирования. При этом рецидив

заболевания после АТГСК является причиной смерти в 73 % случаев [177]. Большое число рецидивов после аутологичной ТГСК связывали с опухолевыми клетками, как контаминирующими продукт афереза с последующей реинфузей, так и сохранившимися после ВДХТ («минимальная остаточная болезнь»), при отсутствии эффекта «трансплантат-против-опухоли», характерной для аллогенной ТГСК.

Сепарация и реинфузия достаточного количества CD34+ ГСК имеет основное значение для наиболее быстрого и полноценного восстановления всех ростков кроветворения и выхода из панцитопении после АТГСК, процедура афереза направлена именно на накопление этих клеток. Разработаны оригинальные методики и эффективные препараты, направленные на увеличение содержания ГСК в ПК [65, 115, 122]. Тем не менее, у 10-30% больных не удается получить достаточного для проведения трансплантации количества клеток [155, 222]. Пациенты, получающие низкие дозы С034+-клеток (<1-2 х 106/кг), находятся в группе риска по неприживлению трансплантата [66, 120, 211]. Более быстрое восстановление кроветворения наблюдается при трансплантации от 2,5 до 5 х 106 CD34+-клеток/кг [29, 65, 66, 120, 237]. Дальнейшее увеличение количества ГСК, по мнению некоторых авторов, не приводит к значимому сокращению периода цитопении [179, 212]. Общепринятые рекомендуемые в настоящее время дозы составляют 3-5 х 106 С034+-клеток/кг. При трансплантации такого количества ГСК минимальное время восстановления нейтрофилов до 500 клеток/мл составляет 7 дней от начала цитопении и 12 дней для достижения 50000 тромбоцитов/мл [179]. По данным других наблюдений, увеличение дозы ГСК при аутологичной ТГСК все-таки приводит к увеличению показателей выживаемости [33, 35], при аллогенной ТГСК подобных сообщений больше [136, 182, 199].

В настоящее время клиническое значение контаминации продукта афереза опухолевыми клетками и селекции CD34+ ГСК остается спорным. В нескольких исследованиях сообщалось о лучшей выживаемости при

использовании очищенных (путем позитивной селекции ГСК или негативной селекции лимфоцитов) аутотрансплантатов [32, 210], однако в ряде других не было выявлено каких-либо различий [33, 99, 205, 218]. Например, по результатам 2 мультицентровых рандомизированных исследований сообщалось об отсутствии достоверных различий в общей и безрецидивной выживаемости после аутологичной трансплантации выделенных методом иммуномагнитной селекции ГСК и неочищенного продукта афереза у 190 пациентов с множественной миеломой [218] и 229 больных фолликулярной неходжкинской лимфомой [205]. На основании этих данных значительный вклад реинфузируемых опухолевых клеток в развитие рецидива после АТГСК у многих авторов вызывает сомнение.

При этом в ряде исследований было показано, что использование обогащенного С034+-клетками трансплантата приводит к увеличению риска инфекционных осложнений в посттрансплантационном периоде [55, 81, 89, 159, 165], в основном вирусных инфекций, таких как цитомегаловирусный (ЦМВ) ретинит, аденовирусный геморрагический цистит, герпетический пневмонит и тяжелый криптоспоридиоз, развитие которых свойственно пациентам с Т-клеточными иммунодефицитами [89, 159, 165]. В исследовании Holmberg с соавт. показано значимое увеличение летальности от различных проявлений ЦМВ-инфекции среди ЦМВ-серопозитивных пациентов, 31 из которых была проведены аутологичные трансплантации продуктами афереза, обогащенными СБ34+-клетками, по сравнению с 237 больными, получившими обычную АТГСК [111]. Crippa с соавт. выявлено достоверное увеличение частоты вирусных инфекций не-ЦМВ генеза (в основном, локальная и диссеминированная инфекция, вызванная вирусом Varicella zoster) и бактериальных инфекций при сравнении 32 пациентов, получавших для трансплантации обогащенный С034+-клетками продукт афереза, и 273 больных с обычной АТГСК [55].

В большинстве перечисленных наблюдений авторами прослеживается связь между частотой развития инфекционных осложнений и медленным

восстановлением пула лимфоцитов после реинфузии С034+-обогащенного трансплантата. В ряде исследований также показано относительно низкое содержание отдельных субпопуляций Т-клеток, в первую очередь CD4+ Т-хелперов [36].

Впервые важность своевременного восстановления абсолютного числа лимфоцитов, как суррогатного маркера иммунной реконституции, и его связь с увеличением показателей выживаемости была отмечена при аллогенной ТГСК [178, 189]. В дальнейшем появилось большое число публикаций, подтверждающих справедливость этого наблюдения и для аутологичной ТГСК [77, 94, 119, 171, 186, 188]. Porrata с соавт. в серии наблюдений, взяв за точку разделения абсолютное содержание лимфоцитов >500 клеток/мл ПК на 15ый день после АТГСК, показали значимое увеличение показателей общей выживаемости и выживаемости до прогрессии заболевания в группе пациентов с повышенным содержанием лимфоцитов периферической крови при JIX, HXJ1, ММ, остром миелоидном лейкозе, раке молочной железы и первичном системном амилоидозе [188]. Этой и другими группами исследователей продемонстрирована связь между абсолютным количеством лимфоцитов в продукте сепарации и сроками выхода из лимфопении, а также показателями выживаемости при ММ и JIX [108, 184, 185]. Помимо лимфоцитоза в целом, установлена прогностическая значимость повышенного содержания отдельных субпопуляций — CD8+ Т-клеток, NK-клеток, CD4+Т-клеток [20, 117, 184, 204]. Сходных результатов — быстрого выхода из лимфопении после АТГСК — можно добиться путем реинфузии (адоптивного переноса) предварительно сепарированных лимфоцитов [61, 196]. Таким образом была клинически доказана роль периферической экспансии реинфузируемых лимфоцитов в процессе иммунной реконституции.

Porrata с соавт. и Hiwase с соавт. в дальнейшем указали на значимость таких факторов для быстрого восстановления лимфоцитоза после АТГСК (и дальнейшего улучшения показателей выживаемости), как количество сеансов

афереза (>4), используемые сепараторы клеток крови, время от последней химиотерапии более 55 дней [108, 188]. По результатам нескольких публикаций также предлагается использовать IL-2 в мобилизационных режимах [213, 225]. Перечисленные условия направлены на увеличение количества реинфузируемых лимфоцитов. В настоящее время некоторые авторы предлагают пересмотреть сами подходы к сепарации клеток крови для накопления достаточного количества Т-клеток [188].

1.2. МЕХАНИЗМЫ ВОССТАНОВЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ В

УСЛОВИЯХ ЦИТОПЕНИИ

В течение жизни количество и субпопуляционный состав лимфоцитов ПК в отсутствие какой-либо патологии поддерживается на относительно постоянном уровне [79, 90]. После внешних воздействий, ведущих к деплеции лимфоцитов, таких как вирусные инфекции или химиотерапия, как правило, происходит восполнение их пула до достижения нормальных значений. Разные субпопуляции лимфоцитов занимают разные «ниши», определяющиеся общностью и различием факторов, необходимых для их выживания и экспансии. Например, количество Т-клеток не возрастает в условиях В-клеточной лимфопении и наоборот [79, 121, 160, 226]. При этом субпопуляции Т-лимфоцитов - CD4+ и СБ8+-клетки — занимают одну нишу и в процессе восстановления конкурируют между собой [73, 79]. При снижении численности Т-клеток любой из этих субпопуляций происходит компенсаторное увеличение числа клеток оппозитной субпопуляции - до восстановления общей численности а|3-Т-клеток [149, 194]. Эти феномены объединяются понятием «слепой гомеостаз» [53, 153]. В рамках «слепого гомеостаза» выявляется определенная ассиметрия: С08+-клетки проявляют более высокую способность к конкуренции, чем СБ4+-клетки; при дефекте экспрессии молекулы CD4 дефицит С04+-клеток компенсируется пролиферацией CD8+-клеток, но не наоборот [23]. При этом именно CD4+-

клетки наиболее подвержены цитотоксическому действию химиотерапии, реализующемся путем индукции апоптоза (независимо от механизма действия препаратов) [9, 142, 143, 215].

Источниками реконституции Т-клеток после лимфодеплеции являются тимопоэз, в результате которого генерируются новые наивные Т-клетки, и экспансия сохранившихся или реинфузируемых зрелых Т-клеток -гомеостатическая пролиферация [145]. Относительный вклад каждого из этих путей зависит от возраста, функционального состояния тимуса, доступности гомеостатических цитокинов, антигенной стимуляции и продолжительности периода лимфопении (а также развития РТПХ - при аллогенной ТГСК).

У взрослых восстановление С04+-клеток после ТСКК происходит в течение 1-2-х лет и больше и в основном за счет CD4+CD45RO+ клеток памяти [103, 130, 144]. СБ8+-клетки восстанавливаются относительно быстро в течение 6 месяцев за счет CD8 CD28"- и CD8 CD57 -субпопуляций [84, 126]. Показано, что восстановление этих субпопуляций происходит тимус-независимым путем [22, 126, 145].

1.2.1. Гомеостатическая пролиферация Т-лимфоцитов в условиях цитопении

Гомеостатической пролиферацией называется экспансия зрелых лимфоцитов в условиях лимфопении различного генеза для компенсаторного устранения их количественного дефицита, она не сопровождается экспрессией маркеров активации и последующей дифференцировкой в эффекторные клетки [37]. Этот процесс является независимым от тимопоэза (численность лимфоцитов на периферии не влияет на скорость поступления наивных Т-клеток из тимуса), однако в эксперименте наблюдалось его усиление у тимэктомированных мышей по сравнению с теми, у которых имелся сохранный тимус [144]. Экспансия предсуществующих на периферии или реинфузируемых лимфоцитов ограничивает разнообразие представленных в организме Т-клеточных рецепторов, что может привести

как к снижению ответа на чужеродные антигены, так и к развитию аутоиммунных заболеваний.

В процессе гомеостатической пролиферации принимают участие как наивные Т-клетки, так и Т-клетки памяти.

Для запуска и нормального течения гомеостатической пролиферации наивных Т-клеток требуется взаимодействие с молекулами МНС класса II (для CD4+ клеток) или МНС класса I (для CD8+ клеток) (и, по некоторым данным, не требуется ко-стимуляции через CD28 и CD154 [192]), а также присутствие IL-7. Таким образом, пролиферация цитотоксических Т-лимфоцитов возможна в любом месте организма при контакте с любыми антигенпрезентирующими клетками, а Т-лимфоцитов-хелперов — только в тимусзависимых зонах вторичных лимфоидных органов при участии дендритных клеток [59].

Также необходимо присутствие IL-7, усиливающего экспансию Т-клеток и экспрессию в них антиапоптотических факторов. Интенсивность и сама возможность гомеостатической пролиферации зависит от концентрации этого цитокина. При этом для поддержания гомеостатической пролиферации требуется более высокое содержание IL-7, чем для обеспечения выживаемости Т-клеток. Источником IL-7 являются стромальные и дендритные клетки вторичных лимфоидных органов, а также эпителиальные и стромальные клетки тимуса [10, 82]. Выработка IL-7 усиливается в ответ на развитие лимфопении с некоторой задержкой [169], также сама потеря Т-клеток способствует увеличению его доступности, затем снижение уровня цитокина идет параллельно с восстановлением числа наивных Т-клеток [28, 82].

По некоторым данным, С08+-клетки более чувствительны к действию IL-7 и раньше вступают в процесс гомеостатической пролиферации, чем СБ4+-клетки [79]. В ряде работ также описана возможность запуска и поддержания гомеостатической пролиферации CD8+ (но не CD4+) Т-клеток под влиянием IL-2 in vitro и in vivo, что может быть связано с экспрессией на

СБ8+ клетках (3-цепи общего рецептора для 1Ь-2 и 1Ь-15 (СО 122), практически отсутствующего на СБ4+лимфоцитах [51, 112, 214].

Гомеостатическая пролиферация наивных Т-клеток сопровождается приобретением ими фенотипа Т-клеток памяти [50, 116, 174], при этом они не проходят стадию активированных клеток (не происходит временной экспрессии на их поверхности маркеров активации СТ>69 и СБ25 [50, 91, 163] и формирования эффекторных клеток [52]). При этом по функции Т-клетки после гомеостатической пролиферации также больше похожи на Т-клетки памяти, чем на эффекторные Т-лимфоциты (для С08+-клеток - по выраженности цитолитической функции, секреции ПТЧГу) [116, 174]. При продолжающемся дефиците Т-клеток приобретенный фенотип клеток памяти сохраняется стабильно [191]. Приобретая фенотип и свойства клеток памяти, Т-лимфоциты, вовлекаемые в гомеостатические процессы, попадают под действие факторов, определяющих гомеостаз Т-клеток памяти [100].

Гомеостатическая пролиферация Т-клеток памяти, в отличие от экспансии наивных Т-клеток, развивается независимо от наличия МНС [163]. Основным фактором, обуславливающим размножение клеток, служит один из цитокинов с общей у-цепью [92]. Для С04+-клеток памяти в процессе гомеостатической пролиферации необходим 1Ь-7 [193], для СБ8+-клеток памяти - 1Ь-15 [37]. По данным литературы, экспансия СБ8+-клеток памяти может увеличиваться также в ответ на любой другой из цитокинов с общей у-цепью: 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-7 [37], в экспериментальных моделях также показана значимость некоторых хемокинов, в частности, ССЬ2.

1.2.2. Роль тимуса в иммунной реконституции после ТГСК

Тимус является центральным органом иммунной системы, в нем происходит созревание и селекция Т-лимфоцитов. Созревание по тимусзависимому пути обеспечивает разнообразие репертуара Т-клеток, необходимого для иммунного ответа на большое число антигенов. Несмотря на физиологическую инволюцию (ежегодная убыль массы 1-3%, в

зависимости от возраста), наивные Т-клетки генерируются в тимусе в течение всей жизни [217].

Для оценки роли тимуса в формировании пула циркулирующих Т-лимфоцитов в настоящее время широко используются 2 метода. Это, во-первых, определение с помощью ПЦР содержащихся в цитоплазме недавно образованных в тимусе Т-клеток кольцевых ДНК, состоящих из фрагментов генов Т-клеточного рецептора (Т cell receptor excision circles, TREC). Эта кольцевая молекула ДНК не реплицируется в процессе митоза и при каждом делении переходит лишь к одной из клеток, «растворяясь» таким образом среди дочерних лимфоцитов [72, 137]. Обнаружение недавних мигрантов из тимуса, ещё не пролиферировавших на периферии, также возможно методом проточной цитометрии - путем определения экспрессии молекулы CD31 на поверхности CD4+CD45RA+ наивных Т-клеток [101, 125]. Молекула CD31 (тромбоцитарная/эндотелиальная молекула адгезии 1, platelet/endothelial cell adhesion molecule 1, PECAM-1) также экспрессируется на эндотелиальных клетках, тромбоцитах, гранулоцитах, моноцитах, NK-клетках, тимоцитах, участвует в трансэндотелиальной адгезии и миграции. CD31+ наивные Т-клетки по сравнению с центральными CD31" наивными Т-клетками, образовавшимися на периферии, характеризуются высоким содержанием TREC, большей длиной теломер и повышенной теломеразной активностью [125].

В целом, определение TREC предпочтительнее, хотя оценка CD31+ наивных Т-клеток в настоящее время также широко распространена. В некоторых работах показано, что с увеличением возраста количество TREC в Т-клетках снижается быстрее, чем экспрессия CD31. Это может объясняться либо усиленной внутритимической экспансией наивных Т-клеток, либо способностью к некоторой IL-7-опосредованной пролиферативной активности CD31+лимфоцитов на периферии, т.к. при стимуляции через Т-клеточный рецептор с последующим интенсивным делением наивные Т-клетки CD31 не экспрессируют. Тем не менее, считается, что для оценки

сохранности или восстановления функции тимуса, в том числе после ВДХТ и ТГСК, достаточно определения CD31+наивных Т-клеток [125].

Несмотря на возрастную и индуцированную различными повреждениями (в том числе химиотераипей) инволюцию, тимус сохраняет способность к регенерации, хоть и снижающуюся с возрастом, и вносит свой вклад в количественное и - особенно - качественное восстановление пула периферических Т-клеток.

По данным публикаций, минимально детектируемые уровни TREC в наивных Т-клетках ПК больных гемобластозами начинают регистрироваться примерно через 100 дней после аллогенной ТГСК, с постепенным увеличением к 6 месяцам и 1 году [46, 104, 202]. Brown с соавт. сообщили о выявлении взаимосвязи между количеством TREC (>2000 копий/млн ДНК) к концу первого года и увеличением общей выживаемости [38].

Увеличение числа наивных и содержащих TREC Т-клеток до нормативных значений сопоставимых здоровых лиц после ТГСК продолжается до 2-5 лет и более. Storek с соавт., проанализировав содержание TREC в лимфоцитах у 72 пациентов через 20 и более лет после аллогенной ТГСК, выявили сниженное по сравнению со здоровыми донорами количество наивных Т-клеток - недавних мигрантов из тимуса в группе больных старше 18 лет (независимо от развития РТПХ) [219]. В исследовании Castermans с соавт. показано, что динамика восстановления TREC и CD4 CD45RA клеток пациентов после аллогенной ТГСК в возрасте до 50 лет и в промежутке между 50 и 60 гг. достоверно не отличалась, но была существенно снижена в возрастной группе >60 лет [46].

Известно, что на восстановление тимопоэза после повреждающих воздействий положительно влияет поступление достаточного количества клеток-предшественников из КМ. В эксперименте усиление тимопоэза (выражавшееся в увеличении содержания TREC) после аллогенной ТГСК достигалось инфузиями лимфоидных предшественников [246]. Также установлено, что ГСК старых мышей обладают сниженными потенциалом к

самоподдержанию и способностью дифференцироваться в лимфоидные предшественники [248]. Вносят свой вклад также возрастные изменения микроокружения КМ [71], однако наибольшее значение имеет инволюция тимуса. Существенное влияние на интенсивность тимопоэза оказывает также возрастной или индуцируемый повреждениями дисбаланс цитокинов. Для нормального тимопоэза необходимы IL-7, IL-15, IL-12, фактор роста кератиноцитов, гормон роста, инсулиноподобный фактор роста-1 (последние три также оказывают позитивное влияние на стромальные клетки тимуса) [40, 49, 63, 110].

1.3. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК В ТЕРАПИИ ГЕМОБЛАСТОЗОВ

1.3.1. Общая характеристика мезенхимальных стромальных

клеток

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермального происхождения, а также в особых условиях in vitro - в клетки эктодермального и энтодермального фенотипа [7, 43]. МСК широко представлены в организме, могут быть выделены из КМ, жировой ткани, хряща, пуповинной крови, плаценты, сухожилий, периферической крови и др. [14, 31, 64, 76, 83, 200, 251]. Показано присутствие МСК во всех тканях, содержащих строму с фибробластоподобными клетками [58]. В настоящее время лучше охарактеризованы и наиболее широко используются МСК, получаемые при культивировании мононуклеарных клеток аспирата КМ и липоаспирата [133, 251].

Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии были определены «минимальные» критерии, специфичные для МСК: 1) адгезия к пластику и фибробластоподобная

морфология, 2) характерный иммунофенотип (экспрессия CD73, CD90, CD 105 и отсутствие экспрессии CD34, CD45, HLA-DR) и 3) способность дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлении [70]. Также МСК продуцируют различные цитокины, факторы роста и хемокины: IL-la, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14, IL-15, LIF, SCF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF [102], а также матриксные молекулы, такие как фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны [48, 183].

In vitro и in vivo продемонстрировано, что костномозговые МСК способны дифференцироваться в специализированные клетки, функционально и морфологически соответствующие остеобластам, хондробластам, адипоцитам, тендоцитам, миоцитам, нейронам, гепатоцитам и формировать строму, поддерживающую гемопоэз [203, 231].

МСК в организме оказывают противовоспалительное, иммуномодуляторное, трофическое действия, направленные на защиту и регенерацию тканей после повреждающих воздействий. МСК способны изменять активность клеток иммунной системы, обладая противовоспалительным и иммуносуперссивным эффектом [231].

1.3.2. Влияние МСК на гемопоэз

В эмбриогенезе человека МСК, первоначально циркулирующие в ПК, начинают мигрировать в печень и КМ на 9ой неделе беременности с целью включения в процесс кроветворения [42]. Вскоре после этого происходит перемещение гемопоэза из первичных очагов в эти органы [47, 154]. На МСК и эмбриональных предшественниках ГСК выявлены общие паттерны экспрессии интегрина 01, что подразумевает общие механизмы хоминга, способствующие совместной локализации этих клеток в фетальной печени и КМ в первом триместре беременности [60]. Friedenstein с соавт. в эксперименте на мышах обнаружили, что трансплантация стромы аллогенного КМ под капсулу почки приводила к формированию очагов

кроветворения, при этом мигрирующие гемопоэтические предшественники принадлежали реципиентам [80].

В костном мозге взрослого организма процесс кроветворения протекает в нишах, располагающихся вблизи эндоста трубчатых костей. МСК и родственные им клетки (остеобласты и фибробласты) являются важнейшими компонентами ниш кроветворения [239]. Помимо вклада в структурную организацию ниши, МСК активно участвуют в регуляции гемопоэза, секретируя ряд медиаторов, образующих паракринную сигнальную сеть [240]. Всё перечисленное создает предпосылки для применения МСК в гематологии.

Одновременное ведение ГСК и МСК приводит к ускорению восстановления гемопоэза после лучевой терапии или курса ВДХТ в экспериментах на мышах и у человека [124, 133, 173]. В исследованиях показано ускорение выхода из нейтро- и тромбоцитопении при введении МСК по сравнению с контрольной группой больных после аллогенной ТГСК [131, 133], также подтверждено снижение риска неприживления трансплантата [25, 133]. В публикации 1за1кта с соавт. ко-трансплантация МСК (в среднем, 0,6 х 106 клеток/кг) при аутологичной трансплантации низких доз ГСК (< 2,5 х 106/кг) 7 детям с лимфопролиферативными заболеваниями приводила к ускорению выхода из цитопении по сравнению с контрольной группой [93].

1.3.3. Влияние МСК на генерацию и функции Т-лимфоцитов

Иммуносупрессорная активность является характерной не только для МСК, полученных из различных тканей, но и для других типов стромальных клеток взрослого организма, например, фибробластов. Известно, что МСК подавляют пролиферацию Т-клеток (как наивных, так и клеток памяти), стимулированных аллогенными лимфоцитами, антиген-презентирующими

клетками и митогенами. МСК-опосредованная супрессия реализуется через межклеточные контакты и посредством растворимых факторов.

В ряде исследований показано, что супрессорные эффекты МСК могут быть опосредованы TGF-f31, фактором роста гепатоцитов (HGF), простагландином Е2, IL-10, а также — в присутствии IFNy — продукцией индоламин-2,3-диоксигеназы (ИДО) [231]. Существуют также данные о вовлечении в реализацию супрессорных эффектов МСК контактно-опосредованных механизмов, в частности, взаимодействия B7-H1/PD-1 и молекул адгезии [21]. Ren с соавт. показали, что подавление пролиферативного ответа aHTH-CD3-активированных Т-лимфоцитов ассоциировалась с повышенной экспрессией молекул адгезии (ICAM-1 и VCAM-1) на МСК, выраженность супрессорных свойств прямо коррелировала с интенсивностью экспрессии этих молекул и снижалась при нейтрализации функции или нокауте генов ICAM-1 и VCAM-1 [197]. Однако в работе Najar с соавт., где также было выявлено повышение экспрессии ICAM-1 и LFA-1 в культурах костномозговых МСК и Т-клеток, использование нейтрализующих антител против молекул адгезии не влияло на супрессорный потенциал МСК [167].

Le Blanc с соавт. и Glennie с соавт. показали, что подавление пролиферации CD4+ и CD8+ лимфоцитов в присутствии МСК сопровождается снижением экспрессии молекул активации - CD25, CD38, а также HLA-DR [88, 134]. В результате развивается функциональная анергия Т-лимфоцитов и остановка их пролиферации. Подавление пролиферации Т-клеток происходит за счёт остановки их клеточных делений в G0/G1 фазе клеточного цикла, в то время как апоптоз Т-клеток МСК не вызывают [88, 247].

Также подавление пролиферации Т-клеток МСК может осуществляться опосредованно - через угнетение дифференцировки /созревания дендритных клеток (ДК) как из CD34+, так и из моноцитарных

предшественников [170]. МСК могут также существенно изменять фенотип и функциональную активность макрофагов [118].

МСК могут подавлять пролиферацию лимфоцитов и через генерацию различных субпопуляций регуляторных Т-клеток (ТреГ). Способность МСК индуцировать экспрессию FOXP3 и других маркеров Трег в лимфоцитах-хелперах с приобретением последними супрессорных свойств была неоднократно описана in vitro [67, 75, 168, 190] и в экспериментальных моделях [45, 93, 146]. На генерацию индуцированных Трег, вероятно, влияют прямой межклеточный контакт и продукция МСК простагландина Е2 и TGF-ß [75].

Супрессорный эффект МСК нашел применение в клинике. Трансфузии in vitro генерированных клеток, полученных от доноров ГСК или от третьих лиц, проходят многочисленные клинические испытания и в настоящее время используются для профилактики и лечения острой и хронической РТПХ (в том числе резистентной к терапии глюкокортикоидами) после аллогенной ТГСК. Сообщения, в целом, показывают хорошую эффективность и безопасность МСК [227, 229]. Проведенное Европейской группой по трансплантации костного мозга мультицентровое исследование по лечению стероид-резистентной РТПХ генерированными ex vivo МСК в средней дозе 1,4 х 106 клеток/кг (0,4 - 9 х 106 клеток/кг), полученных из разных источников (HLA-идентичные сиблинги, гаплоидентичные и неидентичные по HLA доноры, а также несколько доноров), показало лучшую выживаемость в группе ответивших на терапию МСК пациентов, а также независимость ответа от источника МСК [132].

Несмотря на супрессорное действие МСК на аллореактивные лимфоциты, выражающееся в профилактике, купировании или облегчении течения развившейся РТПХ, в большинстве публикаций не отмечают угнетающего влияния на РТПЛ [25, 26, 131]. Увеличение частоты развития рецидивов (и уменьшение частоты развития РТПХ) на фоне ко-инфузии

МСК при аллогенной ТГСК описано только в исследовании Ning с соавт. [172].

Супрессорный эффект МСК in vitro проявляется при высоких дозах МСК [134] и не всегда подтверждается in vivo [220]. В определенных условиях мезенхимальные клетки способны усиливать пролиферативный ответ лимфоцитов на аллоантигены и стимуляцию гомеостатическими цитокинами (IL-15, IL-7, IL-2) [34]. Стимулирующий эффект наблюдается при низком уроне базальной пролиферации лимфоцитов и при использовании низких количеств МСК [34, 134, 168].

По некоторым данным, МСК способны инициировать и регулировать иммунный ответ. Доказательством этого может являться экспрессия на поверхности МСК антигенов МНС II класса при стимуляции IFN-y, молекул адгезии (VCAM, ICAM-1, ALCAM, LFA-3 и др.), отвечающих за взаимодействие с иммунокомпетентными клетками, toll-подобных рецепторов (TLR) [228], а также способность МСК фагоцитировать апоптотические клетки. На основании наблюдений об активации TLR на МСК было высказано предположение о существовании двух типов этих клеток с оппозитными свойствами [235]. Связывание эндотоксина с TLR4 на МСК приводит к появлению популяции, секретирующей преимущественно провоспалительные цитокины (IL-6, IL-8) и стимулирующих ответ активированных Т-клеток, а при активации TLR3 МСК преимущественно секретируют IL-4, рецепторный антагонист IL-1J3, ИДО и PGE2, и проявляют супрессорный эффект в отношении активированных Т-лимфоцитов [236].

В настоящее время можно констатировать возможность как супрессорного, так и стимулирующего эффекта МСК на популяцию Т-лимфоцитов, однако факторы, влияющие на реализацию любой из этих функций, остаются малоисследованными.

1.3.4. МСК при гемобластозах

Информация о фенотипических и функциональных особенностях МСК при гемобластозах представлена относительно небольшим числом публикаций.

МСК, полученные из КМ больных злокачественными лимфомами (неходжкинские лимфомы и лимфома Ходжкина) и острым лимфобластным лейкозом, достоверно не отличались от клеток, полученных от сопоставимых по возрасту здоровых доноров по морфологии, фенотипу, кариотипу, ультраструктуре, динамике роста ex vivo, продуцируемым цитокинам и способности к дифференцировке [249]. Isaikina с соавт. не выявили различий между МСК 8 детей, перенесших лучевую терапию, и 9 здоровых доноров по гемопоэз-стимулирующей активности in vitro [97]. Также МСК больных острым лимфобластным лейкозом, HXJI и JTX способны подавлять пролиферацию лимфоцитов в смешанной культуре [250]. МСК, полученные из КМ больных острым миелоидным лейкозом, демонстрировали измененные морфологические и функциональные свойства, в том числе неспособность ингибирования экспансии лимфоцитов [249, 250].

По другим данным, МСК больных гемобластозами, хотя и способны подавлять пролиферацию активированных Т-клеток, отличаются менее выраженным иммуносупрессорным действием по сравнению с клетками здоровых доноров, при этом гемопоэз-стимулирующая активность клеток больных оставалась сохранной [8].

Medina с соавт. и Lwin с соавт. в серии наблюдений in vitro выявили протективное влияние МСК на клетки мантийноклеточной лимфомы и других HXJI за счет индукции антиапоптотических сигналов в малигнизированных лимфоцитах [140, 141, 152].

Сохраненная активность МСК больных лимфопролиферативными заболеваниями обосновывает возможность их применения в терапии злокачественных лимфом. При этом, несмотря на широкое применение МСК в терапии гемобластозов, оценка функциональной активности этих клеток в

опухолевом микроокружении остается одним из актуальных вопросов иммунологии.

1.4. РЕГУЛЯТОРНЫЕ Т-КЛЕТКИ ПРИ ГЕМОБЛАСТОЗАХ

Регуляторные Т-клетки (Трег) представлены гетерогенной популяцией лимфоцитов, способных подавлять иммунный ответ, играют важную роль в предотвращении аутоиммунных заболеваний, участвуют в формировании толерантности при трансплантации, в регуляции противоопухолевого и противоинфекционного иммунитета, и, в целом, способствуют поддержанию иммунного гомеостаза. Наиболее исследованными в настоящее время являются CD4+CD25hl Трег, внутриклеточно экспрессирующие транскрипционный фактор FOXP3, обеспечивающий реализацию программы супрессии. Иммунносупрессивное действие Трег осуществляется при прямом контакте с клеткой-мишенью. Активация Трег происходит через Т-клеточный рецептор, для функционирования необходимы IL-2 и TGF-(3. Содержание ТреГ в ПК у здоровых людей не превышает 5% пула СБ4+-клеток.

Увеличение содержания этих клеток при различных онкологических заболеваниях в зоне опухолевого роста и в ПК рассматривается в качестве одной из причин неэффективности иммунного ответа [30, 161, 243]. Отмечается, что их количество возрастает по мере увеличения объема солидной опухоли и сочетается с плохим прогнозом. В эксперименте на мышах истощение Трег ведет к эффективному отторжению перевиваемой опухоли [223].

Неоднозначная картина складывается при рассмотрении роли регуляторных клеток в патогенезе гемобластозов, субстратом которых являются зрелые лимфоидные клетки. В ряде публикаций отмечается увеличение количества Трег, эффективно подавляющих иммунный ответ, как в ПК, так и в пораженных органах [107, 150, 158, 224].

С одной стороны, возрастание Трег в ПК и опухолевом микроокружении при лимфомах и лейкозе и выявленная способность этих клеток подавлять реакции клеточного иммунитета свидетельствует о негативной роли Трег (идентичной таковой при солидных новообразованиях) в противоопухолевом ответе. Разными группами исследователей показано, что клетки, выделенные из малигнизированных лимфатических узлов при разных типах HXJ1 и хроническом лимфобластном лейкозе, индуцируют образование адоптивных Трег с выраженной супрессорной активностью из CD4+CD25~ лимфоцитов [11, 158]. Ai с соавт. описана способность опухолевых B-клеток при фолликулярной лимфоме индуцировать экспрессию FOXP3 в CD4+-лимфоцитах с приобретением последними регуляторных свойств при отсутствии дополнительной стимуляции через Т-клеточный рецептор. При этом конверсия в индуцибельные Трег происходила независимо от микроокружения, так как ей были подвержены Т-лимфоциты больных фолликулярной лимфомой и здоровых доноров [11]. Малигнизированные плазматические клетки, как полученные от больных, так и из клеточных линий ММ, также способны генерировать индуцибельные Трег через некий контакт-зависимый механизм (предположительно, при взаимодействии через ICOS/ICOS-L) [78]. Также есть данные, что с целью ухода из-под иммунного надзора атипичные клетки при лимфомах потенцируют увеличение количества Трег в своём микроокружении путем секреции хемокинов, например, CCL22 и CCL17, продуцируемых клетками Рид-Штернберга [13]. Heier с соавт. в экспериментальной модели лимфомы показали, что элиминация Трег приводит к регрессии опухоли [105].

Beyer et al., изучив показатели ПК 9 больных с моноклональными гаммапатиями неясного генеза и 67 - с ММ, выявили увеличение CD4+CD25highFOXP3+ Т-клеток при обеих патологиях, при ММ - в том числе и увеличение в зависимости от стадии. Не выявлено различий в концентрации Трег у впервые выявленных больных и больных после химиотерапии на фоне выраженного снижения абсолютного числа Т-клеток,

и при сравнении данных пациентов с прогрессией болезни и со стабильным течением либо находящихся в полной или частичной ремиссии [30]. Muthu Raja с соавт. при изучении показателей 207 пациентов ММ выявили повышенное содержание Трег при рецидиве заболевания, при наличии тяжелых осложнений (гиперкальциемия, снижение числа нормальных В-клеток) [164]. Также повышенное содержание Трег ассоциировалось с быстрой прогрессией заболевания при ММ и остром миелоидном лейкозе [87, 164].

Тем не менее, в 2 клинических исследованиях ex vivo культивированные или выделенные из ПК Трег были использованы для профилактики острой РТПХ после аллогенной трансплантации клеток пуповинной крови и гаплоидентичной ТГСК, при этом не было выявлено увеличения частоты рецидивов и инфекционных осложнений [39, 68]. Селективное ингибирование РТПХ при отсутствии влияния на РТПЛ (то есть на противоопухолевый иммунный ответ) было показано и в некоторых экспериментальных моделях [74, 230].

Параллельно с сообщениями о негативном влиянии Трег на противоопухолевый иммунный ответ при гемобластозах, в литературе представлены данные, связывающие повышенное содержание Трег с благоприятным течением некоторых вариантов ЗЛ и улучшением показателей выживаемости. При исследовании гистологического материала 97 пациентов с НХЛ Carreras et al. продемонстрировали, что число инфильтрирующих пораженные лимфатические узлы РОХРЗ+-клеток является независимым от индекса FLIPI показателем выживаемости при фолликулярной лимфоме. Количество этих клеток значимо снижается при прогрессии болезни и - особенно - в процессе трансформации в более агрессивную диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (ДКБКЛ). Сообщается, что пациенты с более высоким содержанием CD4+CD25hlghFOXP3+ клеток лучше отвечали на химиотерапию. Авторы полагают, что снижение числа Трег может способствовать прогрессии в связи

с уменьшением ингибирующих сигналов на опухолевые В-клетки [44]. В гистологических исследованиях Alvaro с соавт. и Greaves с соавт. при J1X (рассмотрены образцы 257 и 122 пациентов, соответственно), Lee с соавт. при фолликулярной лимфоме (59 пациентов) и Tzankov с соавт. при фолликулярной лимфоме, ДКБКЛ, J1X (926 пациентов) также показывают увеличение общей и безрецидивной выживаемости, коррелирующее с числом FOXP3+ клеток [15, 95, 135, 232].

Эти факты свидетельствует о том, что локализованные в опухоли Трег могут, по-видимому, оказывать и позитивный эффект, подавляя пролиферацию малигнизированных клонов лимфоцитов.

К сожалению, даже при одном заболевании при исследованиях содержания Трег и их связи с течением болезни у разных групп исследователей могут наблюдаться противоположные результаты. Например, представленные выше данные об улучшении выживаемости при повышенном содержании FOXP3+ клеток в биоптатах пациентов с JIX [15, 95, 232] не согласуются с выводами Kelley с соавт. и Schreck с соавт., указывающими на ухудшение показателей бессобытийной выживаемости при увеличении количества Трег [114, 206].

1.4.1. Регуляторные Т-клетки после ТГСК

Данные о реконституции Трег представлены в публикациях, посвященных восстановлению количества и функциональной активности этих клеток после аллогенной ТГСК и после аутологичной ТГСК при аутоиммунных заболеваниях.

В экспериментах на животных показана способность Трег к полному количественному восстановлению в условиях лимфопении [123, 162]. Большинство авторов также сходятся на том, что, в отличие от основного пула Т-лимфоцитов, на восстановление которого требуется около года и больше, процентное и абсолютное содержание Трег может достигать

относительно высоких значений в ближайшие месяцы после трансплантации [19, 62, 85, 147, 151, 156, 166, 198]. При этом основная роль в реконституции Трег принадлежит гомеостатической пролиферации. Matsuoka с соавт., используя маркеры пролиферации Ki-67 и недавних мигрантов из тимуса CD31, продемонстрировали высокий уровень периферической экспансии Трег после аллогенной ТГСК (постепенно снижающийся) при постоянной очень низкой способности к их генерации de novo, в отличие обычных CD4-лимфоцитов, пул которых по мере восстановления функции тимуса начинает пополняться образованными в нем клетками [147]. Это подтверждается и результатами, полученными Atanackovic с соавт. при изучении количества TREC в CD4+CD25+FOXP3+-wieTKax больных ММ [19]. Kawano с соавт. выявляли повышенный уровень пролиферативной активности Трег даже через 3-5 лет после аллогеной ТГСК [113]. Показанное несколькими авторами увеличение частоты развития острой РТПХ на фоне сниженного содержания Трег в продукте сепарации также может служить дополнительны^ доказательством преимущественно периферического их происхождения после ТГСК [139, 176, 198, 244]. Также ранее Condomines с соавт. сообщали о 2-3-кратном увеличении количества супрессорных CD4+CD25hl-KneTOK на фоне снижения наивных Т-клеток и NK-клеток в ПК перед сепарацией и в продукте афереза для АТГСК у 14 больных ММ, связывая это с большей резистентностью Трег к высоким дозам циклофосфамида [54].

Повышенное количество Трег после 18 месяцев в посттрансплантационном периоде после аллогенной ТГСК коррелировало с вероятностью развития рецидива хронического миелолейкоза [166].

Опубликованы несколько исследований, посвященных реконституции Трег после АТГСК при аутоиммунных заболеваниях. Kleer с соавт. обнаружили быстрое восстановление числа С04+СБ25Ь1-клеток после АТГСК через 6-8 недель с дальнейшим ростом у 11 больных ювенильным ревматоидным артритом [62]. Продолжительное сохранение показателей Трег,

достигших уровня здоровых доноров после АТГСК,— от 2 до 7 лет — описано у 7 больных системной красной волчанкой [12].

Восстановление Трег после АТГСК описано для ММ, однако данные о связи с течением заболевания после трансплантации противоречивы. Для 5 пациентов, находящихся в ремиссии (полной или частичной) в течение от 9 до 19 месяцев показано постепенное снижение повышенного содержания Трег [30]. В другой публикации у 6 пациентов в ремиссии при исходно сниженном относительном количестве Трег через 6 месяцев наблюдалось их увеличение до значений здоровых доноров [85].

До конца не выяснено влияние самих Трег на процесс гомеостатической пролиферации эффекторных клеток, в некоторых экспериментальных моделях показано его угнетение. БЬеп с соавт. продемонстрировали, что Трег более эффективно подавляли гомеостатическую пролиферацию Т-клеток с низкоавидными Т-клеточными рецепторами [209]. \yinstead с соавт. показали, что СВ4+СБ25+РОХРЗ+-клетки ингибировали антиген-специфическую «спонтанную» экспансию Т-лимфоцитов, но не влияли гомеостатическую пролиферацию, индуцируемую цитокинами, в частности 1Ь-7 [241]. Эти же авторы в следующей работе отмечают, что отсутствие Трег в течение периода реконституции Т-лимфоцитов приводит к ограничению репертуара Т-клеточных рецепторов и снижению способности развивать полноценный иммунный ответ на чужеродные антигены [242]. Возможно, таким образом Трег предотвращают неконтролируемую экспансию быстро пролиферирующих клонов, чем способствуют будущему разнообразию Т-клеток.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Характеристика больных, включенных в исследование

Диссертационная работа основана на результатах клинико-иммунологического обследования 167 больных, в том числе 93 мужчин и 74 женщин в возрасте от 7 до 62 лет (медиана 35 лет), которым проводилась АТГСК в отделении гематологии и трансплантации костного мозга Клиники иммунопатологии ФГБУ «НИИ Клинической иммунологии» СО РАМН в период с октября 2003 по июнь 2012 гг. У 62 пациентов диагностировалась неходжкинская лимфома (HXJI), у 59 - лимфома Ходжкина (JTX) и у 46 больных - множественная миелома (ММ).

Мобилизацию ГСК у 155 больных проводили с использованием различных режимов ХТ (таблица 1) с последующим введением препаратов гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора (Г-КСФ) 5-10 мкг/кг/день.

Таблица 1.

Режимы химиотерапии, использованные при мобилизации ГСК

Режим химиотерапии Количество человек

Высокодозный циклофосфамид 125

DexaBEAM (дексаметазон, кармустин 60 мг/м2, этопозид 800-1000 мг/м2, цитозар 8001000 мг/м2, алкеран 20 мг/м2) 7

ESHAP (этопозид 160 мг/м2, метилпреднизолон 2,5 г/м2, цитарабин 2 г/м2, цисплатин 100 мг/м2) 7

ICE (карбоплатин 300 мг/м2, ифосфамид 5000 мг/м2, этопозид 300 мг/м2) 5

DCEP (этопозид 300 мг/м2, дексаметазон, циклофосфамид 3 г/м2, цисплатин 100 мг/м2) 3

DHAP (дексаметазон, цисплатин 100 мг/м2, цитозар 4 г/м2) 3

CAV (циклофосфан 1 г/м2, доксорубицин 45 мг/м2 и винкристин 2 мг) 2

Высокодозный этопозид 2

EDAP (этопозид 400 мг/м2, дексаметазон, цитарабин 1 г/м2, цисплатин 100 мг/м2) 1

Г-КСФ в режиме монотерапии (10 мкг/кг/день) применялся у 12 больных. Процедуру афереза начинали по достижении концентрации 1x104 CD34+ клеток/мл периферической крови и продолжали до получения > 2,0 х 106 CD34+ клеток/кг, используя сепараторы клеток крови AS ТЕС 204 (Fresenius) и Spectra LRS 07 (СОВЕ).

ГСК трансплантированы в средней дозе 5,31 ± 0,3 х 106 клеток/кг (1 -34 х 106 клеток/кг). Среднее количество содержащихся в продукте сепарации лимфоцитов составило 12,1 ± 0,9 х 109 клеток (1,83 - 50,9 х 109 клеток).

На момент проведения ВДХТ перед АТГСК у 41 больного зарегистрирована полная ремиссия заболевания, у 99 - частичная ремиссия и у 27 - резистентное течение или прогрессия.

Пациенты получали режимы кондиционирования: BEAM (кармустин

2 2 о

300 мг/м , алкеран 140 мг/м , этопозид и цитозар по 1000 мг/м ) (98 человек) и мелфалан 140-200 мг/м (69 человек).

У всех пациентов оценивали абсолютное количество лимфоцитов до мобилизации, в продукте сепарации и после АТГСК - на момент выхода из лимфопении (лимфоциты > 0,5 х 109/л). Забор крови и все иммунологические исследования проводились после получения письменного информированного согласия пациентов, подписываемого при поступлении на стационарное лечение.

В качестве контрольной группы всего было обследовано 219 сопоставимых с исследуемыми пациетами по полу и возрасту условно здоровых доноров.

2.2.1. Получение, культивирование и введение МСК

МСК для ко-трансплантации и для экспериментов in vitro выделяли из лейковзвеси костного мозга.

В условиях операционной специалист-гематолог выполнял трепанобиопсию крыла подвздошной кости или стернальную пункцию, во время которой в стерильный флакон с раствором гепарина (50 ЕД /мл

аспирата) забирал аспират костного мозга в объеме от 10 до 50 мл. Затем полученный аспират инкубировали при в течение 40 мин. После

гравитационного разделения, «верхнюю» фракцию, состоящую из клеток лейковзвеси в аутоплазме, центрифугировали (1500 об./мин, 10 мин). Осадок клеток лейковзвеси ресуспендировали в питательной среде а-МЕМ («БиолоТ», С-Пб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 20% FCS («БиолоТ», С-Пб, или HyClone, США), и подсчитывали общее количество выделенных клеток.

Для получения обогащенной популяции МСК клетки аспирата КМ

культивировали в пластиковых флаконах («Nunclon», Дания, площадью 25,

2 6 2 75 или 150 см ) с исходной плотностью 10 клеток/см в питательной среде а-

МЕМ («БиолоТ», С-Пб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 20% FCS («БиолоТ», С-Пб, или HyClone, США), при 37°С в С02-инкубаторе. Через 2448 ч. неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток продолжали культивировать до получения клеточного монослоя, занимающего 80-90%) площади культурального флакона. Обновление питательной среды проводили дважды в неделю. Отделение МСК от поверхности флакона при пассировании осуществляли с использованием 0,25%) раствора трипсина (Sigma-Aldrich, США) и 0,02% раствора ЭДТА (ICN, США) в течение 10 минут. Морфологию полученных клеток оценивали визуально с помощью фазово-контрастной микроскопии. В экспериментах и для ко-трансплантации использовали МСК после 1-3 пассажей.

Для ко-трансплантации МСК криоконсервировали в 10%-ном растворе человеческого альбумина («Микроген», Россия), содержащем 10% DMSO (Sigma-Aldrich, Германия). Размораживание клеток проводили непосредственно перед введением на водяной бане при 37°С. Далее клетки последовательно отмывали в питательной среде а-МЕМ («БиолоТ», С-Пб), дополненной 100 мкг/мл гентамицина и 20% FCS («БиолоТ», С-Пб, или HyClone* США), и в физиологическом растворе, ресуспендировали в 20 мл физиологического раствора и вводили внутривенно непосредственно после

трансплантации ГСК. Количество трансплантированных МСК варьировало от 0,01 до 1,38 х 106 клеток/кг веса больного (медиана 0,18 xlО6 клеток/кг).

2.2.2. Характеристика МСК

В серии наблюдений была проведена оценка соответствия генерируемых ex vivo клеток минимальным критериям Международного общества клеточной терапии (2006 г.) для МСК.

В ходе ex vivo экспансии МНК КМ были получены прилипающие к пластику активно делящиеся фибробластоподобные клетки, через 2-3 недели культивирования образующие монослой, занимающий 80-90% площади культурального флакона.

Фенотипический анализ клеток методом проточной цитометрии (п.2.3.2 главы «Материалы и методы исследования») после первого и следующих пассажей (после достижения конфлюэнтного роста исходной популяции фибробластоподобных клеток КМ) показал, что подавляющее большинство генерируемых клеток экспрессируют характерные для МСК поверхностные маркеры: CD73 (86,1 ± 5,6 %), CD90 (79,9 ± 4,9 %) и CD105 (89,2 ± 4,9 %).

Эксперименты по индукции остеогенной дифференцировки показали, что фибробластоподобные клетки КМ были способны дифференцироваться в клетки, гистохимически соответствующие остеобластам. 14-18-дневное культивирование МСК (популяции фибробластоподобных клеток после 1-2 пассажа) в индукционной среде, содержащей глицерол-2-фосфат, аскорбиновую кислоту и дексаметазон, приводило к образованию внеклеточных депозитов кальция. Эксперименты по индукции адипогенной дифференцировки показали, что фибробластоподобные клетки КМ были способны дифференцироваться в клетки с цитохимическими/ морфологическими свойствами адипоцитов. 14-дневное культивирование МСК в индукционной среде, содержащей изобутилметилксантин, дексаметазон и индометацин, приводило к появлению адипоцитоподобных

клеток, содержащих в цитоплазме липидные вакуоли, которые специфически окрашивались с помощью красителя масляного красного.

Наличие вышеперечисленных свойств у фибробластоподобных клеток, выделенных из КМ, подтверждает их принадлежность к классу мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток.

2.3. Методы лабораторных исследований

Для разных целей у больных 3JI в контрольных точках (непосредственно перед ВДХТ, на день выхода из лимфопении, через 6 и 12 мес. после АТГСК) и условно здоровых доноров из центрального венозного катетера или кубитальной вены забирали 10-20 мл крови в пробирку с гепарином (конечная концентрация гепарина 50 ЕД/мл) или в пробирки BD Vacutainer с Li-гепарином (Becton Dickinson, Нидерланды).

Для исследования использовались лейковзвесь и мононуклеарные клетки (МНК) периферической крови, которые выделяли стандартно путём центрифугирования цельной гепаринизированной венозной крови в градиенте плотности фиколла-верографина (р=1,078) в течение 20 мин при 3000 об/мин с последующей двукратной отмывкой в ЗФР и культуральной среде RPMI-1640 (Sigma, США), дополненной 0,3 мг/мл L-глутамина, 5мМ HEPES-буфера, 100 мкг/мл гентамицина и 10% сыворотки плодов коровы («БиоЛот», Санкт-Питербург).

Часть выделенных клеток криоконсервировали с использованием 10%-ного раствора DMSO (Sigma-Aldrich, Germany) в растворе человеческого альбумина 10%-ного («Микроген», Россия) с возможностью последующего хранения в течение года при температуре -80°С.

2.3.1 Определение количества лимфоцитов и диагностика раннего восстановления лимфоцитов (РВЛ)

В работе использованы результаты общего анализа крови с лейкоцитарной формулой (ПК и продукта афереза), рутинно проводимого больным ЗЛ в отделении гематологии и трансплантации костного мозга

Клиники иммунопатологии ФГБУ «НИИ Клинической иммунологии» СО РАМН.

РВЛ считалось наступившим, если выход из цитопении (лейкоциты > 1 х 109/л) наступал не позднее 15 дня после АТГСК, а количество лимфоцитов в периферической крови при этом составляло 500 и более клеток/мл. 2.3.2. Определение субпопуляций клеток методом проточной цитометрии

Приготовление образцов для определения относительного содержания субпопуляций клеток, экспрессирующих поверхностные CD-маркеры, проводили в соответствии с методикой Becton Dickinson с небольшими модификациями. МНК (50 мкл, 0,5 х 106 клеток/пробу) в растворе «А» (5% желатиноля, 0,1% азида натрия, 0,02% ЭДТА, 10% сыворотки доноров АВ (IV) группы в ЗФР) помещали в цитометрические пробирки. К суспензии клеток добавляли рекомендуемое количество моноклональных антител, меченных перидин-хлорофилл протеином (РегСР), фикоэритрином (РЕ) и флуоресцеина изотиоцианатом (FITC), инкубировали 30 мин при 4°С. Затем клетки отмывали от антител раствором «В» (0,1% азида натрия, 0,02% ЭДТА в ЗФР), ресуспендировали и заливали 0,5 мл лизирующего раствора (FACSLyse, Becton Dickinson, США), что обеспечивало фиксацию с полным разрушением остаточных эритроцитов.

Подготовленные таким образом пробы исследовали на лазерном проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CellQuest (Becton Dickinson, США). Процент позитивных клеток, экспрессирующих соответствующие CD-маркеры, рассчитывался среди как минимум 30 000 событий в лимфоцитарном гейте. При определении субпопуляции CD4+CD25hlgh учитывались клетки с наибольшей интенсивностью свечения CD25.

Для определения субпопуляции CD4+CD25hlgh Т-клеток использовали РЕ-меченные анти-С04 (ЗАО «Сорбент-сервис», г. Москва) и FITC-меченные анти- CD25 моноклональные антитела (Becton Dickinson, США).

Для определения субпопуляции CD4+FOXP3+ Т-клеток использовали FITC-меченные анти-СБ4 (ЗАО «Сорбент-сервис», г. Москва) и - после предварительной фиксации в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре в 1%-ном растворе парафармальдегида (Sigma- Aldrich, Германия) и пермеабилизации в течение 15 мин в темноте при комнатной температуре в 0,2%-ном растворе Tween-20 (Ferak, Германия) - РЕ-меченные анти-РОХРЗ моноклональные антитела (Becton Dickinson, США).

Для определения субпопуляций наивных Т-клеток и Т-клеток памяти использовали РЕ- и FITC-меченные анти-С04, анти-С08, aHTH-CD45RA и aHTH-CD45RO моноклональные антитела (Becton Dickinson, США).

Для определения субпопуляции CD4+CD45RA+CD31+ Т-клеток использовали РЕ-меченные анти-СОЗ 1 (eBioscience, США), РегСР-меченные анти-С04 (Becton Dickinson, США) и FITC-меченные affra-CD45RA моноклональные антитела (Becton Dickinson, США).

2.3.3. Оценка пролиферативной активности МНК периферической крови

МНК культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для

иммунологических исследований при температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% С02. Полная культуральная среда состояла из среды RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной сыворотки доноров АВ (IV) группы, 2мМ HEPES-буфера, 0,3 мг/мл глютамина (все реактивы фирмы Sigma) и гентамицином 100 мкг/мл (KRKA, Словения). Количество

МНК, вносимых в лунку, составляло 0,1 х 106 клеток в 0,15 мл культуральной среды.

Для стимуляции клеток использовали растворимые моноклональные анти-СОЗ антитела (ТОО «Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению в нуклеопротеидные фракции клеток 3Н-тимидина, вносимого за 18 ч. до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Подсчет радиоактивности материала производили в жидкостном сцинциляционном счетчике SL - 30

(Intertechnic, Франция). Параллельно оценивали спонтанную пролиферативную способность МНК. Результаты представляли в виде среднего значения (имп/мин) счетов двух идентичных культур.

2.3.4. Оценка влияния МСК на пролиферативную активность лимфоцитов

МНК здоровых доноров и больных ЗЛ культивировали в 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических исследований при

температуре 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% СОг- Полная культуральная среда состояла из среды RPMI-1640, дополненной 10% инактивированной сыворотки доноров АВ (IV) группы, 2мМ HEPES-буфера., 0,3 мг/мл глютамина (все реактивы фирмы Sigma) и гентамицином (100 мкг/мл) (KRKA, Словения). Количество МНК, вносимых в лунку, составляло

10^ клеток в 0,15 мл культуральной среды.

Для стимуляции клеток использовали экзогенный интерлейкин-2 (IL-2) в концентрации 100 ЕД/мл («Ронколейкин», ООО «Биотех»). Стимулированные таким образом лимфоциты культивировали в течение 72 часов с разными дозами (2 х 103; 104; 5 х 104; 105 клеток/лунку) предварительно генерированных ex vivo МСК КМ.

Интенсивность пролиферации оценивали через 72 ч по включению 3Н-тимидина, вносимого за 18 ч. до окончания культивирования в дозе 1 мкКю/лунку. Подсчет радиоактивности материала производили в жидкостном сцинциляционном счетчике SL - 30 (Intertechnic, Франция). Параллельно оценивали спонтанную пролиферативную способность МНК, а также IL-2-стимулированную пролиферативную активность в отсутствие МСК. Результаты представляли в виде среднего счета (имп/мин) из двух идентичных культур.

2.4. Статистическая обработка полученных результатов

Статистическая обработка данных производилась с использованием программных пакетов для статистической обработки Statistica 6.0 (StatSoft) и GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc.).

Таблицы и рисунки содержат информацию в виде среднего (М) и стандартной ошибки среднего (SE), медианы (Me), в отдельных случаях представлены диапазоны квартальных значений, а также минимальное и максимальное значения.

Для оценки значимости различий дискретных переменных между

2 2

группами больных использовали критерий % (Р^ ) и точный метод Фишера для малых выборок (Ртмф)-

Для оценки значимости различий независимых непрерывных переменных между группами больных использовали непараметрический U-критерий Вилкоксона-Манна-Уитни (Ри). Для оценки значимости различий зависимых выборок использовали критерий Вилкоксона для парных выборок.

Для оценки взаимосвязи количественных показателей с качественными альтернативно распределенными признаками, применяли коэффициент ранговой корреляции Спирмена.

Для оценки диагностической значимости определяемых показателей использовали ROC-анализ с расчетом площади под кривой. С целью оценки эффекта взаимодействия нескольких прогностических факторов применяли метод бинарной логистической регрессии с последующим представлением результатов в виде ROC-кривой.

Анализ выживаемости проведен по методу Каплана-Мейера, для оценки достоверности использован log-rank-критерий.

Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05.

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Баторов, Егор Васильевич

ВЫВОДЫ

1. Ко-трансплантация аутологичных МСК больным ЗЛ на фоне АТГСК повышает частоту раннего восстановления лимфоцитов. Эффект МСК наиболее выражен у пациентов с низким содержанием СЭ34+ ГСК или лимфоцитов в составе продукта афереза, что свидетельствует о стимулирующем влиянии МСК на различные факторы восстановления пула лимфоцитов, связанные с приживлением и периферической экспансией лимфоцитов, соответственно.

2. Пациенты с ко-трансплантацией МСК в раннем посттрансплантационном периоде отличаются более высоким абсолютным количеством СЭ451Ю+ Т-клеток памяти (в 2 раза) и СВ45ИА+ наивных Т-лимфоцитов (в 1,4 раза) и относительным содержанием наивных СЭ4+ Т-клеток (в 1,6 раза), что указывает на способность МСК усиливать восстановление обеих популяций Т-лимфоцитов с более выраженным эффектом в отношении наивных СБ4+ Т-клеток.

3. МСК больных ЗЛ усиливают 1Ь-2-индуцированную пролиферацию МНК в диапазоне соотношений МСК:МНК (1:2-1:50), при этом эффект МСК обратно коррелирует с исходным уровнем ответа МНК на 1Ь-2, что свидетельствует о способности МСК поддерживать экспансию лимфоцитов в условиях, моделирующих гомеостатическую пролиферацию, особенно при исходно низкой реактивности.

4. Больные ЗЛ с ко-трансплантацией МСК в отличие от пациентов со стандартной АТГСК характеризуются более быстрым восстановлением С04+С045КА+С031+ Т-клеток, относительное количество которых к 6-му месяцу достигает нормативного уровня, что свидетельствует о более эффективной реконституции наивных Т-лимфоцитов с фенотипом недавних мигрантов из тимуса на фоне введения МСК.

5. Как при стандартной АТГСК, так и при ко-трансплантации МСК относительное содержание СБ4+РОХРЗ+ и СВ4+СБ25Ь1 регуляторных

Т-клеток у больных ЗЛ восстанавливается до исходно повышенного уровня в течение месяца и постепенно снижается до нормативных значений к 12 месяцам. Сходная динамика восстановления Трег свидетельствует, что введение МСК не сопровождается количественной экспансией Трег.

6. Развитие раннего рецидива/прогрессии заболевания после АТГСК ассоциируется с более высоким содержанием СВ4чТОХРЗ+ и СБ4+СБ25Ы Трег. Уровень Трег на момент выхода из леикопении характеризуется высокой диагностической информативностью, что свидетельствует о взаимосвязи количества Трег с развитием рецидива и позволяет прогнозировать неблагоприятный исход АТГСК в течение 6 мес. при значениях СО4+Р0ХРЗ+ Трег более 9,1 % со специфичностью 77,4 % и чувствительностью 87,5 %.

7. Ко-трансплантация аутологичных МСК больным ЗЛ на фоне АТГСК приводит к сокращению продолжительности нейтро- и тромбоцитопении, снижению в 1,75 раза частоты тяжелых инфекционных осложнений и не сопровождается нарастанием ПХТ-индуцированной нефро- и гепатотоксичности и ухудшением показателей 5-летней выживаемости, что научно обосновывает возможность применения МСК с целью повышения эффективности инграфтинга ГСК и иммунной реконституции у больных злокачественными лимфомами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Баторов, Егор Васильевич, 2013 год

Литература

1. Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность) // Под ред. Чиссова В.И., Старинского В.В., Петровой Г.В.- Москва, 2011.- С. 4-6.

2. Клиническая онкогематология // Под ред. Волковой М.А.- Москва, 2007.- С.912-957.

3. Ковынев И.Б., Поспелова Т.И., Агеева Т.А. и др. Частота и структура неходжкинских злокачественных лимфом в Новосибирске, НСО и городах Сибирского Федерального Округа// Бюллетень СО РАМН.-2006.- ТА, № 122.- С. 175-181.

4. Мазуров В.И., Криволапов Ю.А. Классификация лимфом. Морфология, иммунофенотип, молекулярная генетика неходжкинских лимфом // Практическая онкология.- 2004.- Т.5, №3.- С. 169-175.

5. Новик A.A. Современная концепция классификации опухолей из лимфоидных тканей // Вестник хирургии им.И.И.Грекова.- 2001.- №4.-С. 101-107.

6. Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека / Под ред. C.B. Петрова и Н.Т. Райхлина. — Казань, 2000. — С. 149-172.

7. Терминология, используемая в практике клеточных технологий. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. - Т. 1, № 4 — С. 6-8.

8. Шевела Е.Я., Петровский Я.Л., Курганова Е.В. и др. Характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга у больных гемобластозами // Гематология и трансфузиология.- 2008.- Т. 53, № 2.-С. 32-38.

9. Шевела Е.Я., Сизикова С.А., Тихонова М.А. Характеристика нарушений функциональной активности Т-клеток у больных лимфомами при проведении программной полихимиотерапии. // Гематология и трансфузиология.- 2004.- №1. - С. 15-19.

10. Ярилин A.A. Цитокины в тимусе. Выработка и рецепция цитокинов // Цитокины и воспаление. - 2003. - Т. 2, №1. - С. 3-13.

11. Ai W.Z., Hou J.Z., Zeiser R., et al. Follicular lymphoma В cells induce the conversion of conventional CD4+ T cells to T regulatory cells // Int J Cancer. -2009.- Vol. 124, № 1.- P. 239-244.

12. Alexander Т., Thiel A., Rosen O., et al. Depletion of autoreactive immunologic memory followed by autologous hematopoietic stem cell transplantation in patients with refractory SLE induces long-term remission through de novo generation of a juvenile and tolerant immune system // Blood.- 2009.- Vol. 113.- P. 214-223.

13. Allavena P., Marchesi F., Mantovani A. The role of chemokines and their receptors in tumor progression and invasion: potential new targets of biological therapy // Current Cancer Therapy Reviews.- 2005.- Vol. 1, № 1.-P. 81-92.

14. Alsalameh S., Amin R., Gemba Т., Lötz M. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage // Arthritis Rheum. - 2004. - Vol. 5. - P. 1522-1532.

15. Alvaro Т., Lejeune M., Salvado M.T., et al. Outcome in Hodgkin's lymphoma can be predicted from the presence of accompanying cytotoxic and regulatory T cells // Clin Cancer Res.- 2005,- Vol. 11, № 4.- P. 1467-1473.

16. Angelopoulou M., Novelli E., Grove J.E., et al. Cotransplantation of human mesenchymal stem cells enhances human myelopoiesis and megakaryocytopoiesis in NOD/SCID mice // Exp Hematol.- 2003.- Vol.31.-P.413-420.

17. Appelbaum F.R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy // Nature.- 2001.- Vol.411.- P.385-389.

18. Appelbaum F.R. Hematopoietic-Cell Transplantation at 50 // N Engl J Med.-2007.- № 357.- P. 1472-1475

19. Atanackovic D., Cao Y., Luetkens Т., et al. CD4+CD25+FOXP3+ T regulatory cells reconstitute and accumulate in the bone marrow of patients

with multiple myeloma following allogeneic stem cell transplantation // Haematologica.- 2008.- Vol. 93, № 3.- P. 423-430.

20. Atta E.H., de Azevedo A.M., Maiolino A., et al. High CD8+ lymphocyte dose in autograft predicts early absolute lymphocyte count recovery after peripheral hematopoietic stem cell transplantation // Am. J. Hematol.- 2009.-Vol. 84, № 1.- P.21-28.

21. Augello A., Tasso R., Negrini S.M., et al. Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death 1 pathway// Eur J Immunol.- 2005.- Vol.35, №5.- P. 14821490.

22. Azuma M., Phillips J.H., Lanier L.L. CD28- T lymphocytes. Antigenic and functional properties// 1993.- J Immunol.- Vol.150.- P.l 147-1159.

23. Bachmann M.F., Oxenius A., Mak T.W., Zinkernagel R.M. T cell development in CD8-/- mice. Thymic positive selection is biased toward the helper phenotype// J Immunol.- 1995.- Vol. 155, № 8.- P.3727-3733.

24. Baldomero H. Global overview on HSCT 2006/07/08. WBMT, Hanoi 2011. http://www.wbmt.org/fileadmin/pdf/10 Hanoi-2011/B1-4-

Baldomero Plenary session Hanoi WBMT Workshop Nov2011.pdf

25. Ball L.M., Bernardo M.E., Roelofs H., et al. Cotransplantation of ex vivo expanded mesenchymal stem cells accelerates lymphocyte recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stem-cell transplantation// Blood.- 2007.- Vol.110.- P.2764-2767.

26. Baron F., Lechanteur C., Willems E., et al. Cotransplantation of mesenchymal stem cells might prevent death from graft-versus-host disease (GVHD) without abrogating graft-versus-tumor effects after HLA-mismatched allogeneic transplantation following nonmyeloablative conditioning // Biol Blood Marrow Transplant.- 2010.- Vol. 16, № 6.- P.838-847.

27. Battiwalla M., Hematti P. Mesenchymal Stem Cells in Hematopoietic Stem Cell Transplantation // Cytotherapy.- 2009.- Vol.11, № 5.- P.503-515.

28. Bell E.B., Sparshott S.M. The peripheral T-cell pool: regulation by non-

antigen induced,proliferation? // Semin. Immunol.- 1997.- Vol. 9.- P.339-346.

29. Bensinger W.I., Appelbaum F.A., Demirer T. Transplantation of allogeneic peripheral blood stem cells // Stem Cells.- 1995.- Vol.3, Suppl.3.- P.63-70.

30. Beyer M., Kochanek M., Giese T., et al. In vivo peripheral expansion of naive CD4+CD25high FoxP3+ regulatory T cells in patients with multiple myeloma // Blood.- 2006.- Vol.107, №.10.- P.3940-3949.

31. Bieback K., Kern S., Kliiter H. et al. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood // Stem cells. - 2004. -Vol. 22.-P. 625-634.

32. Bierman P.J., Sweetenham J.W., Loberiza F.R. et al. Syngeneic hematopoietic stem-cell transplantation for non-Hodgkin's lymphoma: a comparison with allogeneic and autologous transplantation-The Lymphoma Working Committee of the International Bone Marrow Transplant Registry and the European Group for Blood and Marrow Transplantation//J Clin Oncol.- 2003.- Vol. 21, № 20.- P.3744-3753.

33. Blystad A.K., Delabie J., Kvaloy S. et al. Infused CD34+cell dose, but not tumor cell content of peripheral blood progenitor cell grafts, predicts clinical outcome in patients with diffuse large B-cell lymphoma and follicular lymphoma grade 3 treated with high-dose therapy// Br J Haematol.- 2004.-Vol.125.- P.605-612.

34. Bocelli-Tyndall C., Bracci L., Schaeren S., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells and chondrocytes promote and/or suppress the in vitro proliferation of lymphocytes stimulated by interleukins 2, 7 and 15// Ann Rheum Dis.- 2009.- Vol.68.- P. 1352-1359.

35. Bolwell B.J., Pohlman B., Rybicki L., et al. Patients mobilizing large numbers of CD34+ cells ('super mobilizers') have improved survival in autologous stem cell transplantation for lymphoid malignancies // Bone Marrow Transplant.- 2007.- Vol.40 № 5.-P.437-441.

36. Bomberger C., Singh-Jairam M., Rodey G., et al. Lymphoid reconstitution

after autologous PBSC transplantation with FACS-sorted CD34+ hematopoietic progenitors// Blood.- 1998.- Vol.91.- P.2588-2600.

37. Boyman O., Letourneau S., Kreig C., Sprent J. Homeostatic proliferation and survival of naive and memory T cells // Eur. J. Immunol. - 2009. - Vol. 39, № 8.-P. 2088-2094.

38. Brown J.A., Stevenson K., Kim H.T., et al. Clearance of CMV viremia and survival after double umbilical cord blood transplantation in adults depends on reconstitution of thymopoiesis // Blood.- 2010.- Vol.115, № 20.- P.4111-4119.

39. Brunstein C.G., Miller J.S., Cao Q., et al. Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics // Blood.- 2011.- Vol.117, № 3.- P. 1061-1070.

40. Burgess W., Liu Q., Zhou J., et al. The immune-endocrine loop during aging: role of growth hormone and insulin-like growth factor-1 // Neuriommunomodulation. - 1999. - Vol. 6, № 1-2. - P. 56-58.

41. Butturini A., Seeger R.C.,Gale R.P. Recipient immune-competent T lymphocytes can survive intensive conditioning for bone marrow transplantation // Blood.- 1986.- Vol. 68, № 4,- P.954-95.

42. Campagnoli C., Roberts I.A., Kumar S., et al. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal blood, liver, and bone marrow. // Blood. - 2001. - Vol. 98. - P. 2396-2402.

43. Caplan A.I. The mesengenic process. // Clin Plast Surg. - 1994. - Vol. 21.- P. 429-435.

44. Carreras J., Lopez-Guillermo A., Fox B.C., et al. High numbers of tumor-infiltrating FOXP3-positive regulatory T cells are associated with improved overall survival in follicular lymphoma// Blood.- 2006.- Vol.108.- P.2957-2964.

45. Casiraghi F., Azzollini N., Cassis P., et al. Pretransplant infusion of mesenchymal stem cells prolongs the survival of a semiallogeneic heart transplant through the generation of regulatory T cells // J Immunol.- 2008.-

Vol.181, №6.- P.3933-3946.

46. Castermans E., Hannon M., Dutrieux J., et al. Thymic recovery after allogeneic hematopoietic cell transplantation with non-myeloablative conditioning is limited to patients younger than 60 years of age // Haematologica.- 2011.- Vol. 96, № 2.- 298-306.

47. Charbord P., Tavian M., Humeau L., Peault B. Early ontogeny of the human marrow from long bones: an immunohistochemical study of hematopoiesis and its microenvironment. // Blood. - 1996. - Vol. 87. - P. 4109-4119.

48. Chichester C.O., Fernandez M., Minguell J.J. Extracellular matrix gene expression by human bone marrow stroma and by marrow fibroblast. // Cell Adhes Commun. - 1993. - Vol. 1. - P. 93-99.

49. Chidgey A., Dudakov J., Seach N., Boyd R. Impact of niche aging on thymic regeneration and immune reconstitution // Semin. Immunol. - 2007. - Vol. 19, №5.-P. 331-340.

50. Cho. B.K., Rao V.P., Ge Q., Eisen H.N., Chen J. Homeostasis-stimulated proliferation drives naive T cells to differentiate directly into memory T cells // J.Exp.Med. - 2000. - Vol. 192, № 4. - P.549-556.

51. Cho J.H., Boyman O., Kim H.O., et al. An intense form of homeostatic proliferation of naive CD8+ cells driven by IL-2 // J Exp Med.- 2007.- Vol. 204, №8.- P. 1787-1801.

52. Clarke S.R., Rudensky A.Y. Survival and homeostatic proliferation of naive peripheral CD4+ T cells in the absence of self peptide: MHC complexes// J Immunol.- 2000.- Vol.165.- P.2458-2464.

53. Cole S. Blind T-cell homeostasis and HIV infection // Immunol Today.-1997.- Vol. 18, № 10.- P. 505-507.

54. Condomines M., Quittet P., Lu Z.Y., et al. Functional regulatory T cells are collected in stem cell autografts by mobilization with high-dose cyclophosphamide and granulocyte colony-stimulating factor// J Immunol.-2006.- Vol. 176.- P. 6631-6639.

55. Crippa F., Holmberg L., Carter R.A., et al. Infectious complications after

autologous CD34-selected peripheral blood stem cell transplantation // Biol Blood Marrow Transplant.- 2002.- Vol. 8., № 5.- P.281-289.

56. Crop M.J., Baan C.C., Korevaar S.S., et al. Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells induce explosive T-cell proliferation// Stem Cells Dev.- 2010.- Vol.19, № 12.- P.1843-1853.

57. Crump M. Management of Hodgkin lymphoma in relapse after autologous stem cell transplant// Hematology.- 2008.- P. 326-333.

58. da Silva Meirelles L., Chagastelles P.C., Nardy N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues. // Journal of Cell Science. - 2006. - Vol. 119. - P. 2204-2213.

59. Dai Z., Lakkis F.G. Cutting edge: Secondary lymphoid organs are essential for maintaining the CD4, but not CD8, naive T cell pool // J. Immunol. -2001.-Vol. 167, № 12.-P. 6711-6715.

60. Dazzi F., Ramasamy R., Glennie S., et al. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis. // Blood Reviews. - 2006. - Vol. 20. - P. 161-171.

61. de Gast G.C., Vyth-Dreese F.A., Nooijen W., et al. Reinfusion of autologous lymphocytes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induces rapid recovery of CD4+ and CD8+ T cells after high-dose chemotherapy for metastatic breast cancer// J Clin Oncol.- 2002.- Vol.20, № 1.- P. 58-64.

62. de Kleer I., Vastert B., Klein M., et al. Autologous stem cell transplantation for autoimmunity induces immunologic self-tolerance by reprogramming autoreactive T cells and restoring the CD4+CD25+ immune regulatory network // Blood.- 2006.- Vol. 107.- P.1696-1702.

63. De Mello-Coelho V., Savino W., Postel-Vinay M.V., Dardenne M. Role of prolactin and growth hormone on thymus physiology // Dev. Immunol. -1998.-Vol. 6, № 3-4.-P. 317-323.

64. de Mos M., Koevoet W.J., Jahr H., et al. Intrinsic differentiation potential of adolescent human tendon tissue: an in-vitro cell differentiation study // BMC Musculoskelet Disord. - 2007. - Vol. 8. - P. 16.

65. Demirer T., Buckner C.D., Bensinger W.I. Optimization of peripheral blood

stem cell mobilization//Stem Cells.- 1996.- Vol.14, № 1.- P. 106-116.

66. Dercksen M.W., Rodenhuis S., Dirkson M.K. et al. Subsets of CD34+ cells and rapid hematopoietic recovery after peripheral blood stem cell transplantation // J Clin Oncol.- 1995.- Vol.13.- P. 1922-1932.

67. Di Ianni M., Del Papa B., De Ioanni M., et al. Mesenchymal cells recruit and regulate T regulatory cells// Exp Hematol.- 2008.- Vol.36.- P.309-318.

68. Di Ianni M., Falzetti F., Carotti A., et al. Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation// Blood.- 2011.-Vol.117.- P.3921-3928.

69. Di Nicola M., Carlo-Stella C., Magni M., et al. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli// Blood.- 2002.- Vol.99.- P.3838-3843.

70. Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. // Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8, № 4. - P. 315317.

71. Donnini A., Re F., Orlando F., Proviciali M. Intrinsic and microenvironmental defects are involved in the age-related changes of Lin-c-kit+ hematopoietic progenitors cells // Rejuvenation Res. - 2007. - Vol. 10, № 4. - P. 459-472.

72. Douek D.C., McFarland R.D., Keiser P.H., et al. Changes ih thymic function with age and during the treatment of HIV infection // Nature. - 1998. - Vol. 396.-P. 690-695.

73. Dummer W., Ernst B., Le Roy E., Lee D.-S., Surh Ch.D. Autologous regulation of naive T cell homeostasis within the T cell compartment // J Immunol.- 2001. - Vol. 166. - P. 2460-2468.

74. Edinger M., Hoffmann P., Ermann J., et al. CD4(+)CD25(+) regulatory T cells preserve graft-versus-tumor activity while inhibiting graft-versus-host disease after bone marrow transplantation // Nat Med.- Vol. 9.- P. 1144-1150.

75. English K., Ryan J.M., Tobin L., et al. Cell contact, prostaglandin E(2) and

transforming growth factor beta 1 play non-redundant roles in human mesenchymal stem cell induction of CD4+CD25(High) forkhead box P3+ regulatory T cells // Clin Exp Immunol.- 2009.- Vol. 156, № 1.- P. 149-160.

76. Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood // Br J Haematol. - 2000. - Vol. 109. - P. 235-242.

77. Ferrandina G., Pierelli L., Perillo A., et al. Lymphocyte recovery in advanced ovarian cancer patients after high-dose chemotherapy and peripheral blood stem cell plus growth factor support: clinical implications// Clin Can Res.-2003.- Vol. 9.-P. 195-200.

78. Feyler S., Scott G.B., Parrish C., et al. Tumour cell generation of inducible regulatory T-cells in multiple myeloma is contact-dependent and antigen-presenting cell-independent // PLoS ONE.- 2012.- Vol.7, № 5.- e35981. doi: 10.1371/journal.pone.0035981

79. Freitas A.A., Rocha B. Population biology of lymphocytes: the flight for survival // Annu Rev Immunol.- 2000.- Vol.18.- P. 83-111.

80. Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs. // Exp Hematol. - 1976. -Vol. 4, №5.-P. 267-274.

81. Friedman J., Lazarus H.M., Koc O.N. Autologous CD34+-enriched peripheral blood progenitor cell (PBPC) transplantation is associated with higher morbidity in patients with lymphoma when compared to unmanipulated PBPC transplantation // Bone Marrow Transplantation.- 2000.- 26.- P.831-836.

82. Fry T.J., Connick E., Fallon J., Lederman M.M., Liewehr D.J., et al. A potential role for interleukin-7 in T-cell homeostasis // Blood. - 2001. - Vol. 97, № 10.-P. 2983-2990.

83. Fukuchi Y., Nakajima H., Sugiyama D. Human Placenta-Derived Cells Have Mesenchymal Stem/Progenitor Cell Potential // Stem Cells. - 2004. - Vol. 22. -P. 649-658.

84. Fukuda H., Nakamura H., Tominaga N., et al. Marked increase of

CD8+S6F1+ and CD8+57+ cells in patients with graft-versus-host desease after allogeneic bone marrow transplantation// 1994.- Bone Marrow Transpl.- Vol.13.- P. 181-185.

85. Ganeshan P., Gupta R., Hakim M., et al. Reconstitution of regulatory T cells after autologous transplantation in multiple myeloma // Int J Hematol.- 2011 Vol. 94.- P.578-579.

86. Ghannam S., Bouffi C., Djouad F., Jorgensen F., Noël D. Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications// Stem Cell Research & Therapy.- 2010.- Vol.1, №1:2.

87. Giannopoulos K., Kaminska W., Hus I., Dmoszynska A. The frequency of T regulatory cells modulates the survival of multiple myeloma patients: detailed characterisation of immune status in multiple myeloma// Br J Cancer.- 2012.-Vol.106, № 3.- P.546-552

88. Glennie S., Soeiro I., Dyson D.J., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells. // Blood. - 2005. - Vol. 105.-P. 2821-2827.

89. Goldberg S.L., Pecora A.L., Alter R.S., et al. Unusual viral infections (progressive multifocal leukoencephalopathy and cytomegalovirus disease) after high-dose chemotherapy with autologous blood stem cell rescue and peritransplantation rituximab// Blood.- 2002.- Vol.99.-P. 1486-1488.

90. Goldrath A.W., Bevan M.J. Selecting and maintaining a diverse T-cell repertoire // Nature.- 1999. - Vol.402, № 6159.- P. 255-262.

91. Goldrath A.W., Bogatzki L.Y., Bevan M.J., et al Naïve T cells transiently acguire a memory - like phenotype during homeostasis-driven proliferation// J.Exp.Med.- 2000. - Vol. 192.№ 4.- P 557 - 564.

92. Goldrath A.W., Luckey C.J., Park R., Benoist Ch., Mathis D. The molecular program induced in T cells undergoing homeostatic proliferation // PNAS. -2004. - Vol. 101 .N48. - P. 16885-16890.

93. Gonzalez M. A., Gonzalez-Rey E., Rico L., Buscher D., Delgado M. Adipose-derived mesenchymal stem cells alleviate experimental colitis by

inhibiting inflammatory and autoimmune responses // Gastroenterology.-2009.- Vol. 136,- P.978-989.

94. Gordan L.N., Surgrue M.W., Lynch J.W., et al. Correlation of early lymphocyte recovery and progression-free survival after autologous stem-cell transplant in patients with Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphoma// Bone Marrow Transplant.- 2003.- Vol.31.- P. 1009-1013.

95. Greaves P., Clear A., Coutinho R., et al. Expression of FOXP3, CD68, and CD20 at diagnosis in the mMicroenvironment of classical Hodgkin lymphoma is predictive of outcome // J Clin Oncol.- 2012,-http://jco.ascopubs.org/content/early/2012/10/03/JC0.2011.39.9881 .long

96. Isaikina Ya., Minakovskaya N., Aleinikova O. The influence of autologous marrow mesenchymal stem cell infusion on hematopoiesis reconstitution after hematopoietic stem cells autotransplantation in children with oncological and hematological diseases// Cellular Therapy and Transplantation.- 2008.- Vol. 1,№ 1.-P.35-42.

97. Isaikina Ya, Shman T. Influence of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of children with oncohematological diseases on proliferation and self-renewal of hematopoietic progenitor cells in vitro// Exp Oncol.-2008,- Vol. 30, № 3.- P.121-128.

98. Itoi M., Tsukamoto N., Yoshida H., Amagai T. Mesenchymal cells are required for functional development of thymic epithelial cells// Int Immunol.-2007.- Vol.19.-P.953-964.

99. Jacobsen E., Freedman A. B-cell purging in autologous stem-cell transplantation for non-Hodgkin lymphoma//Lancet Oncol.- 2004.- Vol. 5.-P.711-717.

100. Jameson S.C. Maintaining the norm: T-cell homeostasis // Immunology. -2002.-Vol.2.-P.547-556.

101. Junge S., Kloeckener-Gruissem B., Zufferey R., et al. Correlation between recent thymic emigrants and CD31+ (PECAM-1) CD4+ T cells in normal individuals during aging and in lymphopenic children // Eur J Immunol.-

2007.- Vol. 37, №11.- P.3270-3280.

102. Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I. Cytokine expression by human marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro: Effects of dexamethasone and IL-1 alpha. // J Cell Physiol. - 1996. - Vol. 166. - P. 585592.

103. Hakim F.T., Memon S.A., Cepeda R., et al. Age-dependent incidence, time course, and consequences of thymic renewal in adults // The J. of Clinical Investigation.- 2005.- Vol.115, № 4.- P.930-939.

104. Hazenberg M.D., Otto S.A., de Pauw E.S., et al. T-cell receptor excision circle and T-cell dynamics after allogeneic stem cell transplantation are related to clinical events// Blood.- 2002.- Vol.99.- P.3449-3453.

105. Heier I., Hofgaard P.O., Brandtzaeg P., Jahnsen F.L., Karlsson M. Depletion of CD4+ CD25+ regulatory T cells inhibits local tumour growth in a mouse model of B cell lymphoma// Clin Exp Immunol.- 2008.- Vol.152.- P.381-387.

106. Herbst H., Tippelmann G., Anagnostopoulos I. et al. Immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in Hodgkin's disease and Ki-1-positive anaplastic large cell lymphoma: issociation between phenotype and genotype // Leuk Res.- 1989.- Vol.13, № 2.- P.103-116.

107. Hilchey S.P., De A., Rimsza L.M., Bankert R.B., Bernstein S.H. Follicular lymphoma intratumoral CD4+CD25+GITR+ regulatory T cells potently suppress CD3/CD28-costimulated autologous and allogeneic CD8+CD25" and CD4+CD25"T cells// J Immunol.- 2007.- Vol.178.- P.4051-4061.

108. Hiwase D.K., Hiwase S., Bailey M., Bollard G., Schwarer A.P. Higher infused lymphocyte dose predicts higher lymphocyte recovery, which in turn, predicts superior overall survival following autologous hematopoietic stem cell transplantation for multiple myeloma // Biol Blood Marrow Transplant.-

2008.-Vol. 14, № 1.-P. 116-124.

109. Hogan WJ, Storb R. Therapeutic applications of non-myeloablative hematopoietic stem cell transplantation in malignant disease// Immunol Res.-

2003.-Vol.28.- P.l-11.

110. Holland A.M., van den Brink M.R. Rejuvenation of the aging T cell compartment // Curr. Opin. Immunol. - 2009. - Vol. 21, № 4. - P. 454-459.

111.Holmberg L., Boeckh M., Hooper H., et al. Increased incidence of cytomegalovirus disease after autologous CD34-selected peripheral blood stem cell transplantation// Blood.- 1999.- Vol.94.- P.4029^1035.

112. Kamimura D., Bevan M.J. Naive CD8+ T cells differentiate into protective memory-like cells after IL-2 anti IL-2 complex treatment in vivo // J Exp Med.- 2007.- Vol. 204, № 8.- P.1803-1812.

113. Kawano Y., Kim H.T., Matsuoka K., et al. Low telomerase activity in CD4+ regulatory T cells in patients with severe chronic GVHD after hematopoietic stem cell transplantation // Blood.- 2011.- Vol. 118, № 18.- P.5021-5030.

114. Kelley T.W., Pohlman B, Elson P., Hsi E.D. The ratio of FOXP3+ regulatory T cells to granzyme B+ cytotoxic T/NK cells predicts prognosis in classical Hodgkin lymphoma and is independent of bcl-2 and MAL expression// Am J Clin Pathol.- 2007.- Vol. 128, № 6.- P.958-965.

115.Kessans M.R., Gatesman M.L., Kockler D.R. Plerixafor: a peripheral blood stem cell mobilizer // Pharmacotherapy.- 2010,- Vol. 30, № 5.- P. 485-492.

116. Kieper W.C., Jameson S.C. Homeostatic expansion and phenotypic conversion of naive T cells in response to self-peptide/MHC ligands // Proc Natl Acad Sci U S A.- 1999,- Vol.96, № 23,- P. 13306-13311.

117. Kim D.G., Won D.I., Lee N.Y., et al. Non-CD34~ cells, especially CD8+ cytotoxic T cells and CD56+ natural killer cells, rather than CD34 cells, predict early engraftment and better transplantation outcomes in patients with hematologic malignancies after allogeneic peripheral stem cell transplantation // Biol Blood Marrow Transplant.- 2006.- Vol.12.- P.719-728.

118. Kim J., Hematti P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages // Exp Hematol. - 2009. - Vol. 37.-P. 1445-1453.

119. Kim H., Sohn H.J., Kim S.E., et al. Lymphocyte recovery as a positive

predictor of prolonged survival after autologous peripheral blood stem cell transplantation in T-cell non-Hodgkin's lymphoma// Bone Marrow Transplant.- 2004.- Vol.34.- P. 43-49.

120. Kiss J.E., Rybka W.B., Winkelsein A. et al. Relationship of CD34 cell dose to early and late hematopoiesis following autologous peripheral-blood stem-cell transplantation// Bone Marrow Transplant.- 1997.- Vol.19.- P.303-310.

121. Kitamura D., Roes J., Kiihn R., Rajewsky K. A B cell-deficient mouse by targeted disruption of the membrane exon of the immunoglobulin mu chain gene//Nature.- 1991.- Vol.350, № 6317,- P.423-426.

122. Kobbe G., Bruns I., Fenk R., Czibere A., Haas R. Pegfilgrastim for PBSC mobilization and autologous haematopoietic SCT // Bone Marrow Transplant.- 2009.- Vol. 43, № 9.- P. 669-677.

123. KomatsuN., Hori S. Full restoration of peripheral Foxp3+ regulatory T-cell pool by radioresistant host cells in scurfy bone marrow chimeras // Proc Natl Acad Sci USA.- Vol. 104.- P. 8959-8964.

124. Koc O.N., Gerson S.L., Cooper B.W., et al. Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous blood stem cells and culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving highdose chemotherapy// J Clin Oncol.- 2000.- Vol.18.- P.307-316.

125. Kohler S., Thiel A. Life after the thymus: CD31+ and CD31- human naive CD4+ T-cell subsets // Blood.- 2009.- Vol.113, № 4.- P.769-774.

126. Konno A., Okada K., Mizuno K., et al CD8aa memory effector T cells descend directly from clonally expanded CD8a+|3high TCRaf3 T cells in vivo// Blood.- 2002.- Vol.100, № 12.- P.4090-4097.

127. Krampera M., Glennie S., Dyson J., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide// Blood.- 2003.- Vol.101, № 9.- P.3722-3729.

128.Kuci S., Kuci Z., Kreyenberg H., et al. CD271 antigen defines a subset of multipotent stromal cells with immunosuppressive and lymphohematopoietic engraftment-promoting properties// Haematologica.-

2010- Vol.95, № 4.- P.651 - 659.

129. Lalu M.M., Mclntyre L., Pugliese C., et al. Safety of Cell Therapy with Mesenchymal Stromal Cells (SafeCell): A Systematic Review and Meta-Analysis of Clinical Trials // PLoS One.- 2012.- Vol. 7, № 10.- :e47559. doi: 10.1371/journal.pone.0047559.

130. Laurenti L., Piccirillo N., Sora F., et al. Immunological reconstitution after autologous peripheral blood stem cell transplantation in patiehts with chronic lymphocytic leukemia// Haematologica- 2004- Vol.89, № 1-P.120-122.

131. Lazarus H.M., Koc O.N., Devine S.M., et al. Cotransplantation of HLA-identical sibling Cclture-expanded mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients. // Biol Blood Marrow Transplant. - 2005. - Vol. 11. - P. 389-398.

132. Le Blanc K., Frassoni F., Ball L., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroidresistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study. // Lancet.- 2008.- Vol. 371.- P. 1579-1586.

133. Le Blanc K., Samuelsson H., Gustafsson., et al. Transplantation of mesenchymal stem cells to enhance engraftment of hematopoietic stem cells. // Leukemia. - 2007. - Vol. 21. - P. 1733-1738.

134. Le Blanc K., Tammik L., Sundberg B., Haynesworth S.E., Ringden O.. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex// Scand J Immunol.- 2003.- Vol.57.- P. 11-20.

135. Lee A.M., Clear A.J., Calaminici M., et al. Number of CD4+ cells and location of forkhead box protein P3-positive cells in diagnostic follicular lymphoma tissue microarrays correlates with outcome // J Clin Oncol.- 2006.-Vol.24, № 31.- P.5052-5059.

136. Lee S.H., Lee M.H., Lee J.H. et al. Infused CD34+cell dose predicts long-term survival in acute myelogenous leukemia patients who received allogeneic bone marrow transplantation from matched sibling donors in the

first complete remission//Biol Blood Marrow Transplant.- 2005.- Vol.11.-P.122-128.

137. Livak F. and Schatz D.G. T-cell receptor a locus V(D)J recombination byproducts are abundant in thymocytes and mature T cells // Mol. Cell. Biol. -1996.-Vol. 16.-N. 2.-P. 609-618.

138. Ljungman P., Urbano-Ispizua A., Cavazzana-Calvo M. et al. Allogeneic and autologous transplantation for hematological diseases, solid tumours and immune disorders: definitions and current practice in Europe// Bone Marrow Transplant.- 2006.- P. 439^49.

139. Lu S.-Y., Liu K.-Y., Liu D.-H., Xu L.-P., Huang X-J. High frequencies of CD62L+ naive regulatory T cells in allografts are associated with a low risk of acute graft-verses-host disease following unmanipulated allogeneic haematopoietic stem cell transplantation // Clin Exper Immunol.- 2011.-Vol.165.- P.264-277.

140. Lwin T., Hazlehurst L.A., Dessureault S., et al. Cell adhesion induces p27Kipl -associated cell-cycle arrest through down-regulation of the SCFSkp2 ubiquitin ligase pathway in mantle-cell and other non-Hodgkin B-cell lymphomas // Blood.- 2007.- Vol.110, № 5.- P. 1631-1638.

141. Lwin T., Crespo L.A., Wu A., et al. Lymphoma cell adhesion-induced expression of B cell-activating factor of the TNF family in bone marrow stromal cells protects non-Hodgkin's B lymphoma cells from apoptosis // Leukemia.-2009.- Vol. 23, № 1.- P.170-177.

142. Mackall C. T-cell immunodeficiency following cytotoxic antineoplastic therapy: a review// The Oncologist.- 1999.- Vol. 4.- P. 370-378.

143. Mackall C., Stein D., Fleisher T, et al. Prolonged CD4 depletion after sequential autologous peripheral blood progenitor cell infusion in children and young adults// Blood.- 2000.- Vol.96.- P.754-762.

144. Mackall C.L., Granger L., Sheard M.A., Cepeda R., Gress R.E. T cell regeneration after bone marrow transplantation: Differential CD45 isoform expression on thymic-derived versus thymic-independent progeny// 1993.-

Blood.- Vol.82.- P.2585-2594.

145. Mackall C.L, Hakim FT, Gress RE. Restoration of T-cell homeostasis after T-cell depletion // Immunology.- 1997.- Vol.9. - P.339-346.

146. Madec A.M., Mallone R., Afonso G., et al. Mesenchymal stem cells protect NOD mice from diabetes by inducing regulatory T cells// Diabetologia.-2009.- Vol.52, №7.- P. 1391-1399.

147. Magenau J.M., Qin X., Tawara I., et al. Frequency of CD4(+)CD25(hi)FOXP3(+) regulatory T cells has diagnostic and prognostic value as a biomarker for acute graft-versus-host-disease // Biol Blood Marrow Transplant.- 2010.- Vol.16, № 7.- P. 907-914.

148. Majumdar M.K., Thiede M.A., Haynesworth S.E., Bruder S.P., Gerson S.L. Human marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) express hematopoietic cytokines and support long-term hematopoiesis when differentiated toward stromal and osteogenic lineages. J Hematother Stem Cell Res. 2000; 9: 841-848.

149. Marrack P., Bender J., Hildeman D., et al. Homeostasis of alpha beta TCR+ T cells//Nat Immunol.- 2000.- Vol.1, № 2.- P. 107-111.

150. Marshall N.A., Christie L.E., Munro L.R., et al. Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma // Blood.- 2004.- Vol.103, № 5.- P.1755-1762.

151.Matsuoka K., Kim H. T., McDonough S., et al. Altered regulatory T cell homeostasis in patients with CD4+ lymphopenia following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation// J Clin Invest.- 2010.- Vol. 120.- P. 1479-1493.

152. Medina D.J., Goodell L., Glod J., et al. Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of B-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor kB pathways // Haematologica.- 2012.-Vol.97, №8.- P.1255-1263.

153. Mehr R., Perelson A.S. Blind T-cell homeostasis and the CD4/CD8 ratio in

the thymus and peripheral blood // J Acquir Immune Defic Syndr Hum Retroviral.- 1997.- Vol.14, № 5.- P. 387-398.

154. Mendes S.C., Robin C., Dzierzak E. Mesenchymal progenitor cells localize within hematopoietic sites throughout ontogeny. // Development. - 2005. -Vol. 132.-P. 1127-1136.

155.Micallef I.N., Apostolidis J., Rohatiner A.Z. et al. Factors which predict unsuccessful mobilisation of peripheral blood progenitor cells following G-CSF alone in patients with non-Hodgkin's lymphoma// Hematol J.- 2000.-Vol. 1, № 6.- P.367-373.

156. Mielke S., Rezvani K., Savani B.N., et al. Reconstitution of FOXP3+ regulatory T cells (Tregs) after CD25-depleted allotransplantation in elderly patients and association with acute graft-versus-host disease // Blood.- 2007.-Vol.110, № 5.- P.1689-1697.

157. Mitra D.K., Singh H.P., Singh M., et al. Reconstitution of naive T cells and type 1 function after autologous peripheral stem cell transplantation: impact on the relapse of original cancer // Transplantation.- 2002.- Vol. 73, № 8.- P. 1336-1339.

158. Mittal S., Marshall N.A., Duncan L., et al. Local and systemic induction of CD4+CD25+ regulatory T-cell population by non-Hodgkin lymphoma// Blood.- 2008.- Vol.111.- P.5359-5370.

159. Miyamoto T., Gondo H., Miyoshi Y. Early viral complications following CD34-selected autologous peripheral blood stem cell transplantation for non-Hodgkin's lymphoma// Br J Haematol.- 1998,- Vol.100.- P.348-350.

160. Mombaerts P., Clarke A.R., Rudnicki M.A., et al. Mutations in T-cell antigen receptor genes alpha and beta block thymocyte development at different stages// Nature.- 1992.- Vol.360, № 6401.- P.225-231.

161. Mougiakakos D., Choudhury A., Lladser A., Kiessling R., Johansson C.C. Regulatory T cells in cancer // Adv Cancer Res.- 2010.- Vol.107.- 57-117.

162. Moxham V.F., Karegli J., Phillips R.E., et al. Homeostatic proliferation of lymphocytes results in augmented memory-like function and accelerated

allograft rejection // J Immunol.- 2008.- Vol. 180, № 6.- P.3910-3918.

163. Murali-Krishna K., Altman J.D., Suresh M., Sourdive D.J.D., Zajac A.J., et al Counting antigen - specific CD 8 T cells: a réévaluation of bystander activation during viral infection // Immunity. - 1998. - Vol.8. - P.177-187.

164. Muthu Raja K.R., Rihova L., Zahradova L., et al. Increased T regulatory cells are associated with adverse clinical features and predict progression in multiple myeloma// PLoS ONE.- 2012.- Vol.7, № 10.- P. 1-11.

165. Nachbaur D., Kropshofer G., Feichtinger H., Allerberger F., Niederwieser D. Cryptosporidiosis after CD34-selected autologous peripheral blood stem cell transplantation// Bone Marrow Transplant.- 1997.- Vol.19.- P.1261-1263.

166. Nadal E., Garin M., Kaeda J. et al. Increased frequencies of CD4+CD25high Tregs correlate with disease relapse after allogeneic stem cell transplantation for chronic myeloid leukemia// Leukemia.- 2007.- Vol.21.- P. 472-479.

167. Najar M., Raicevic G., Boufker H.I., Stamatopoulos, De Bruyn C., Meuleman N., Bron D., Toungouz M., Lagneaux L. Modulated expression of adhesion molecules and galectin-1: Role during mesenchymal stromal cell immunoregulatory functions // Exp Hematol. - 2010. - V. 38, Issue 10. - P. 922-932.

168. Najar M., Rouas R., Raicevic G., et al. Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6 // Cytotherapy.- 2009.- Vol.11, № 5.- P.570-583.

169. Napolitano L.A. Approaches to immune reconstitution in HIV infection // International AIDS Society-USA. - 2003. - Vol. 11. - P. 160-163.

170. Nauta A.J., Kruisselbrink A.B., Lurvink E., et al. Mesenchymal stem cells inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells. // The Journal of Immunology. - 2006. - Vol. 177. - P. 20802087.

171.Nieto Y., Shpall E.J., McNiece I.K., et al. Prognostic analysis of early lymphocyte recovery in patients with advanced breast cancer receiving high-

dose chemotherapy with an autologous hematopoietic progenitor cell transplant// Clin Can Res.- 2004.- Vol. 10.- P. 5076-5086.

172. Ning H., Yang F., Jiang M., et al. The correlation between co-transplantation of mesenchymal stem cells and higher recurrence rate in hematologic malignancy patients: outcome of a pilot clinical study // Leukemia.- 2008.-Vol. 22.- P. 593-599.

173.Noort W.A., Kruisselbrink A.B., in't Anker P.S., et al. Mesenchymal stem cells promote engraftment of human umbilical cord blood-derived CD34 (+) cells in NOD/SCID mice. // Exp Hematol. - 2002. - Vol. 30. - P. 870-878.

174. Oehen S., Brduscha-Riem K. Naive cytotoxic T lymphocytes spontaneously acquire effector function in lymphocytopenic recipients: A pitfall for T cell memory studies? // Eur J Immunol. -1999.- Vol.29, №2.- P.608-614.

175. O'Flaherty E., Sparrow R., Szer J. Bone marrow stromal function from patients after bone marrow transplantation // Bone Marrow Transplant.-1995.- Vol.15.-P.207-212.

176. Pabst C., Schirutschke H., Ehninger G., et al. The graft content of donor T cells expressing TCR+ and CD4+foxp3+ predicts the risk of acute graft versus host disease after transplantation of allogeneic peripheral blood stem cells from unrelated donors // Clin Cancer Res.- 2007.- Vol.13.- P. 2916 -2922.

177. Pasquini M.C., Wang Z. Current use and outcome of hematopoietic stem cell transplantation: CIBMTR summary slides, 2011. Available at: http://www.cibmtr.org

178. Pavletic Z.S., Joshi S.S., Pirruccello S.J., et al. Lymphoid reconstitution after allogeneic stem cell transplantation for hematologic malignancies// Bone Marrow Transplant.- 1998.- Vol. 21.- P.33-41.

179. Pecora A. Impact of stem cell dose on hematopoietic recovery in autologous blood stem cell recipients//Bone Marrow Transplant.- 1999.- Vol. 23, Suppl. 2.- S7-S12.

180. Peggs K.S., Verfuerth S., Pizzey A., et al. Reconstitution of T-cell repertoire

after autologous stem cell transplantation: Influence of CD34 selection and cytomegalovirus infection // Biol. Blood Marrow Transplant.- 2003.- Vol. 9, № 3.- P. 198-205.

181. Peniket A.J., Ruiz de Elvira M.C., Taghipour G., et al. An EBMT registry matched study of allogeneic stem cell transplants for lymphoma: allogeneic transplantation is associated with a lower relapse rate but a higher procedure-related mortality rate than autologous transplantation// Bone Marrow Transplant.- 2003.- Vol. 31, № 8.- P.667-678.

182. Perez-Simon J.A., Diez-Campelo M., Martino R. et al. Impact of CD34+ cell dose on the outcome of patients undergoing reduced-intensity conditioning allogeneic peripheral blood stem cell transplantation//Blood.- 2003.-Vol. 102.- P.l 108-1113.

183. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. // Science. - 1999. - Vol. 284. - P. 143-147.

184. Porrata L.F., Gastineau D.A., Padley D., Bundy K., Markovic S.N. Re-infused autologous graft natural killer cells correlates with absolute lymphocyte count recovery after autologous stem cell transplantation// Leuk Lymphoma.- 2003.- Vol.44, №6,- P.997-1000.

185. Porrata L.F., Gertz M.A., Geyer S.M., et al. The dose of infused lymphocytes in the autograft directly correlates with clinical outcome after autologous peripheral blood hematopoietic stem cell transplantation in multiple myeloma // Leukemia.- 2004.- Vol.18.- P. 1085-1092.

186. Porrata L.F., Inwards D.J., Ansell S.M., et al. Early lymphocyte recovery predicts superior survival after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin lymphoma: a prospective study // Biol Blood Marrow Transplant.-2008.- Vol.14.- P.807-816.

187. Porrata L.F., Litzow M.R., Markovic S.N. Graft engineering for autologous stem cell transplantation// Gene Therapy and Molecular Biology.- 2005.-Vol.9.- P. 121—134.

188. Porrata L.F., Markovic S.N. Autograft mediated adoptive immunotherapy of

cancer in the context of autologous stem cell transplantation // World J Clin Oncol.- 2010.- Vol. 1, № 1.- P.29-34.

189. Powles R., Singhal S., Treleaven J., et al. Identification of patients who may benefit from prophylactic immunotherapy after bone marrow transplantation for acute myeloid leukemia on the basis of lymphocyte recovery early after transplantation// Blood.- 1998.- Vol. 91.- P.3481-3486.

190. Prevosto C., Zancolli M., Canevali P., Zocchi M.R., Poggi A. Generation of CD4+ or CD8+ regulatory T cells upon mesenchymal stem cell-lymphocyte interaction// Haematologica.- 2007.- Vol.92.- P.881-888.

191. Priatel J.J., Chui D., HiraokaN., et al. The ST3Gal-I sialyltransferase controls CD8+ T lymphocyte homeostasis by modulating O-glycan biosynthesis // Immunity.- 2000.- Vol.12, № 3.- P.273-283.

192. Prlic M., Blazar B.R., Khoruts A., Zell T., Jameson S.C. Homeostatic expansion occurs independently of costimulatory signals// J Immunol -2001.-Vol.167.-P. 5664-5668.

193. Purton J.F., Tan J.T., Rubinstein M.P., Kim D.M., Sprent J., Surh C.D. Antiviral CD4+ memory T cells are IL-15 dependent // J. Exp. Med. - 2007. -Vol. 204, №4.-P. 951-961.

194. Rahemtulla A., Fung-Leung W.P., Schilham M.W., et al. Normal development and function of CD8+ cells but markedly decreased helper cell activity in mice lacking CD4//Nature.- 1991.- Vol. 353, № 6340.- P.180-184.

195. Rapoport A.P., Meisenberg B., Sarkodee-Adoo C., et al. Autotransplantation for advanced lymphoma and Hodgkin's disease followed by post-transplant rituxan/GM-CSF or radiotherapy and consolidation chemotherapy// Bone Marrow Transplant.- 2002.- Vol. 29, № 4,- P.303-312.

196. Rapoport A.P., Stadtmauer E.A., Aqui N., et al. Rapid immune recovery and graft-versus-host-disease-like engraftment syndrome following adoptive transfer of costimulated autologous T cells// Clin Cancer Res.- 2009.- Vol. 15.- P. 4499-4507.

197. Ren G, Zhao X, Zhang L, et al. Inflammatory cytokine-induced intercellular

adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in mesenchymal stem cells are critical for immunosuppression // J Immunol. - 2010. - V. 184, №5. -P. 2321-2328.

198. Rezvani K., Mielke S., Ahmadzadeh M., et al. High donor FOXP3-positive regulatory T-cell (Treg) content is associated with a low risk of GVHD following HLA-matched allogeneic SCT// Blood.- 2006.- Vol. 108.- P.1291-1297.

199. Ringden O., Barrett A.J., Zhang M.J. et al. Decreased treatment failure in recipients of HLA-identical bone marrow or peripheral blood stem cell transplants with high CD34 cell doses//Br. J Haematol.- 2003.- Vol. 121.-P.874-885.

200. Roufosse C.A., Direkze N.C., Otto W.R., Wright N.A. Circulating mesenchymal stem cells // Int J Biochem Cell Biol. - 2004. - Vol. 36. - P. 585-597.

201.Roux E., Helg C., Chapuis B., Jeannet M., Roosnek E. T-cell repertoire complexity after allogeneic bone marrow transplantation// Hum Immun.-1996.- Vol. 48, № 1-2.- P.135-138.

202. Sairafl D., Mattsson J., Uhlin M., Uzunel M. Thymic function after allogeneic stem cell transplantation is dependent on graft source and predictive of long term survival // Clin Immunol.- 2012.- Vol.142, № 3.- P.343-350.

203. Salem H.K., Thiemermann C. Mesenchymal stromal cells: current understanding and clinical status. // Stem Cells. - 2010. - Vol. 28. - P.585-596.

204. Schmidmaier R., Oversohl N., Schnabel B., Straka C., Emmerich B. Helper T cells (CD3+/CD4+) within the autologous peripheral blood stem cell graft positively correlate with event free survival of multiple myeloma patients // Exp. Oncol.- 2008.- Vol.30, № 3.- P.240-243.

205. Schouten H.C., Qian W., Kvaloy S., et al. High-dose therapy improves progression-free survival and survival in relapsed follicular non-Hodgkin's lymphoma: results from the randomized European CUP trial// J Clin Oncol.-

2004.-Vol.21.- P.3918-3927.

206. Schreck S, Friebel D, Buettner M, et al. Prognostic impact of tumour-infiltrating Th2 and regulatory T cells in classical Hodgkin lymphoma // Hematol Oncol.- 2009.- Vol. 27, № 1.- P.31-39.

207. Schurgers E., Kelchtermans H., Mitera T., Geboes L., Matthys P. Discrepancy between the in vitro and in vivo effects of murine mesenchymal stem cells on T-cell proliferation and collagen-induced arthritis// Arthritis Research & Therapy.- 2010.- Vol. 12., № R31.- P.l-11.

208. Sergeevicheva V.V., Shevela E.Y., Sizikova S.A., et al. Autologous mesenchymal stromal cells of hemoblastosis patients efficiently support hematopoietic recovery after stem cell transplantation// Cellular Therapy and Transplantation.- 2010.- Vol. 1, № 4,- P.98-105.

209. Shen S., Ding Y., Tadokoro C.E., et al. Control of homeostatic pro- liferation by regulatory T cells // J Clin Invest.- 2005.- Vol.115.- P. 3517- 3526.

210. Shimoni A., Korbling M. Tumor cell contamination in re-infused stem cell autografts: does it have clinical significance?// Critical Rev Onc/Hematol.-2002.- Vol.41.-P.241-250.

211.Shpall E.J. The utilization of cytokines in stem cell mobilization strategies// Bone Marrow Transplant.- 1999.- Vol. 23, Suppl. 2.- S13-S19

212. Siena S., Schiavo R., Pedrazzoli P., Carlo-Stella C. Therapeutic relevance of CD34+ cell dose in blood cell transplantation// J Clin Oncol.- 2000.- Vol. 18.-P.1360-1377.

213. Sosman J.A., Stiff P., Moss S.M., et al. Pilot trial of interleukin-2 with granulocyte colony-stimulating factor for the mobilization of progenitor cells in advanced breast cancer patients undergoing high-dose chemotherapy: expansion of immune effectors within the stem-cell graft and post-stem-cell infusion// J Clin Oncol.- 2001.- Vol.19.- P.634-644.

214. Sprent J., Surh C.D. Normal T cell homeostasis: the conversion of naive cells into memory-phenotype cells // Nat Immunol.- 2011.- Vol.12, № 6.- P.478-484.

215. Stahnke K., Fulda S., Freisen C., et al. Activation of apoptosis pathways in peripheral blood lymphocytes by in vivo chemotherapy// Blood.- 2001.- Vol. 98.- P.3066-3073.

216. Stankevich Y., Golovacheva A., Babenko E., et al. Experience of clinical mesenchymal stem cells (MSCs) usage for prophylaxis and GVHD treatment in patients undergoing allo-HSCT// Cellular Therapy and Transplantation.- 2008.- Vol. 1, №. 2.- P. 17-21.

217. Steinmann G.G. Changes in the human thymus during aging // Curr. Topics Pathol. - 1986. - Vol. 75. - P. 43-88.

218. Stewart A.K., Vescio R., Schiller G., et al. Purging of autologous peripheral-blood stem cells using CD34 selection does not improve overall or progression-free survival after high-dose chemotherapy for multiple myeloma: results of a multicenter randomized controlled trial// J Clin Oncol.-2001.-Vol.19.-P.3771-3779.

219. Storek J., Joseph A., Espino G., et al. Immunity of patients surviving 20 to 30 years after allogeneic or syngeneic bone marrow transplantation // Blood.-2001.- Vol. 98, № 13.- P.3505-3512.

220. Sudres M., Norol F., Trenado A., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro but fail to prevent graft-versus-host disease in mice // J. Immunol.- 2006.- Vol. 176, № 12.- P. 7761-7767.

221. Suniara R.K., Jenkinson E.J., Owen J.J. An essential role for thymic mesenchyme in early T cell development// J. Exp. Med.- 2000.- Vol.191, № 6.- P.1051-1056.

222. Surgue M.W., Williams K., Pollock B.H., et al. Characterization and outcome of "hard to mobilize" lymphoma patients undergoing autologous stem cell transplantation// Leuk Lymphoma.- 2000.- Vol. 39, № 5-6,- P. 509-519.

223. Sutmuller R.P., van Duivenvoorde L.M., van Elsas A., et al. Synergism of cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and depletion of CD25+ regulatory T cells in antitumor therapy reveals alternative pathways for suppression of autoreactive cytotoxic T lymphocyte responses. // J. Exp.

Med.- 2001.- Vol. 194.- P. 823-832.

224. Szczepanski M.J., Szajnik M., Czystowska M., et al. Increased frequency and suppression by regulatory T cells in patients with acute myelogenous leukemia// Clin Cancer Res.- 2009.- Vol.15.- P.3325-3332.

225. Talebian L., Wu J.Y., Fischer D.A., et al. Novel mobilization strategies to enhance autologous immune effector cells in multiple myeloma// Front Biosci (Elite Ed).- 2011.- Vol.3.- P. 1500-1508.

226. Tanchot C., Lemonnier F.A., Perarnau B., Freitas A.A., Rocha B. Differential requirements for survival and proliferation of CD8 nai've or memory T cells// Science.- 1997.- Vol. 276.- P. 2057-2062.

227. Tolar J., Villeneuve P., Keating A. Mesenchymal stromal cells for graft-versus-host disease // Hum Gene Ther.- 2011.- Vol. 22, № 3.- P.257-262.

228. Tomchuck S. L., Zwezdaryk K. J., Coffelt S. B. Toll-like receptors on human mesenchymal stem cells drive their migration and immunomodulating responses // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 99-107.

229. Toubai T., Paczesny S., Shono Y., et al. Mesenchymal stem cells for treatment and prevention of graft-versus-host disease after allogeneic hematopoietic cell transplantation// Current Stem Cell Research & Therapy.-2009.- Vol.4.- P.252-259.

230. Trenado A., Charlotte F., Fisson S., et al. Recipient-type specific CD4+CD25+ regulatory T cells favor immune reconstitution and control graft-versus-host disease while maintaining graft-versus-leukemia // J Clin Invest.- 2003.- Vol.112, №. 11.- P. 1688-1696.

231.Tyndall A., Uccelli A. Multipotent mesenchymal stromal cells for autoimmune diseases: teaching new dogs old tricks. // Bone Marrow Transplant.- 2009.- Vol. 43.- P.821-828.

232. Tzankov A., Meier C., Hirschmann P., et al. Correlation of high numbers of intratumoral FOXP3+ regulatory T cells with improved survival in germinal center-like diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma and classical Hodgkin's lymphoma// Haematologica.- 2008.- Vol.93.- P.193-200.

233. Uccelli A., Pistoia V., Moretta L. Mesenchymal stem cells: a new strategy for immunosuppression?// Trends in immunology.- 2007.- Vol.28, № 5.- P.219-226.

234. Uhlman D.L., Verfaillie C., Jones R.B., Luikart S.D. BCNU treatment of marrow stromal monolayers reversibly alters haematopoiesis // Br J Haematol.- 1991.- Vol.78.- P.3304-3309.

235. Wan Tso G.H., Wai Law H.K., Tu W., et al. Phagocytosis of apoptotic cells modulates mesenchymal stem cells osteogenic differentiation to enhance IL-17 and RANKL expression on CD41 T cells // Stem Cells. - 2010. - Vol. 28. -P. 939-954.

236. Waterman R.S., Tomchuck S.L., Henkle S.L., Betancourt A.M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a proinflammatory MSC1 or an immunosuppressive MSC2 phenotype // PloS ONE.-2010.-Vol. 5, №4: el0088.- doi:10.1371.

237. Weaver C.H., Hazelton B., Birch R., et al. An analysis of engraftment kinetics as a function of the CD34 content of peripheral blood progenitor cell collections in 692 patients after the administration of myeloablative chemotherapy// Blood.- 1995.- Vol.86.- P.3961-3969.

238. Williams K., Hakim F.T., Gress R.E. T cell immune reconstitution following lymphodepletion // Semin. Immunol.- 2007.- Vol. 19, № 5.- P. 318-330.

239. Wilson A., Oser G.M., Jaworski M., et al. Dormant and self-renewing hematopoietic stem cells and their niches. // Ann N Y Acad Sci. - 2007. -Vol. 1106.-P. 64-75.

240. Wilson A., Trumpp A. Bone-marrow haematopoietic stem cell niches. // Nat Rev Immunol. - 2006. - Vol. 6. - P. 93-106.

241. Winstead C.J., Fraser J.M., Khoruts A.. Regulatory CD4+CD25+Foxp3+ T cells selectively inhibit the spontaneous form of lymphopenia-induced proliferation of naive T cells// J Immunol.- 2008.- Vol.180.- P.7305-7317.

242. Winstead C.J., Reilly C.S., Moon J.J., et al. CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells optimize diversity of the conventional T cell repertoire during

reconstitution from lymphopenia// J Immunol.- 2010.- Vol.184.- P.4749-4760.

243. Wolf A.M., Wolf D., Steurer M., et al. Increase of regulatory T cells in the peripheral blood of cancer patients // Clin Cancer Res.- 2003.- Vol.9, № 2.-P.606-612.

244. Wolf D., Wolf A.M., Fong D., et al. Regulatory T-cells in the graft and the risk of acute graft-versus-host disease after allogeneic stem cell transplantation // Transplantation.- 2007.- Vol. 83., № 8.- P. 1107-1113.

245. Yoon D.H., Sohn B.S., Jang G., et al. Higher infused CD34+ hematopoietic stem cell dose correlates with earlier lymphocyte recovery and better clinical outcome after autologous stem cell transplantation in non-Hodgkin's lymphoma// Transfusion.- 2009.- Vol.49, № 9.- P. 1890-1900.

246. Zakrzewski J.L., Kochman A.A., Lu S.X., et al. Adoptive transfer of T-cell precursors enhances T-cell reconstitution after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation //Nat Med.- 2006.- Vol.12, № 9.- P. 1039-1047.

247. Zappia E., Casazza S., Pedemonte E., et al. Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy.// Blood. -2005. -Vol. 106.-P. 1755-1761.

248. Zediak V.P., Maillard I., Bhandoola A. Multiple prethymic defects underlie age-related loss of progenitor competence // Blood. - 2007. - Vol. 110, №. 4- P. 1161-1167.

249. Zhao Z.G., Liang Y., Li K., et al. Phenotypic and functional comparison of mesenchymal stem cells derived from the bone marrow of normal adults and patients with hematologic malignant diseases // Stem Cells Dev.- 2007.-Vol.16, № 4.- P.637-648.

250. Zhi-Gang Z., Wei-Ming L., Zhi-Chao C., Yong Y., Ping Z. Immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells derived from bone marrow of patient with hematological malignant diseases // Leuk Lymphoma.- 2008.- Vol.49, №11.- P.2187-2195.

251. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P, et al. Human adipose tissue is a source of

si 34

multipotent stem cells // Mol Biol Cell. - 2002. - Vol. 13. - P. 4279-4295.