Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, доктор медицинских наук Шевела, Екатерина Яковлевна

• Шевела, Екатерина Яковлевна
• доктор медицинских наук
• 2013

Оглавление диссертации доктор медицинских наук Шевела, Екатерина Яковлевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ: БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ)

1.1 Общая характеристика МСК

1.1.1 Идентификация МСК

1.1.2 Гетерогенность МСК in vitro

1.1.3 МСК in vivo

1.2 МСК и гемопоэз

1.3 Иммунорегуляторные свойства МСК

1.3.1 Иммуносупрессорная активность МСК

1.3.2 Иммуностимуляторная активность МСК

1.4 Регуляция функциональной активности МСК

1.5 Особенности МСК различного тканевого происхождения

1.6 Изменение свойств МСК при патологии

1.7 Клиническое использование МСК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика больных, включенных в исследование

2.2. Генерация и свойства МСК

2.2.1 Получение и культивирование мононуклеарных и ядросодержащих

клеток

2.2.2. Определение числа клоногенных предшественников МСК

2.2.3 Ростовые и морфометрические характеристики

2.2.4 Оценка фенотипа МСК

2.2.5 Оценка дифференцировочного потенциала МСК

2.2.6 Анализ иммуносупрессорной активности МСК

2.2.7 Гемопоэзстимулирующая активность

2.2.8 Оценка продукции цитокинов

2.3 Апробация ко-трансплантации ГСК и МСК у больных лимфомами

2.3.1 Оценка раннего восстановления лимфоцитов (PBJI)

2.3.2 Оценка субпопуляций Т-лимфоцитов методом проточной флуориметрии

2.4 Статистическая обработка полученных результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) взрослого организма: сравнительная характеристика МСК различного тканевого происхояедения

3.1.1 Клоногенность, пролиферативная активность и морфометрические особенности МСК

3.1.2 Фенотипическая характеристика и дифференцировочный потенциал МСК

3.1.3 Мультиплексный анализ биологически активных медиаторов, продуцируемых мезенхимальными стромальными клетками

3.1.4 Гемопоэзстимулирующая и иммуносупрессорная активность МСК

3.2 Характеристика МСК костного мозга при различных заболеваниях83

3.2.1 Клоногенность и пролиферативная активность МСК

3.2.2 Фенотипическая характеристика и дифференцировочный потенциал МСК

3.2.3 Биологически активные медиаторы, продуцируемые МСК

3.2.4 Оценка гемопоэзстимулирующей активности МСК

3.2.5 Исследование иммуносупрессорной активности МСК

3.3 Механизмы МСК-опосредованной иммуносупрессии

3.3.1 Активационные маркеры

3.3.2 Простагландин Е2 и индоламин-2,3-диоксигеназа

3.3.3 Интерлейкин 10

3.3.4 Оксид азота

3.3.5 HLA-G

3.4 Основной фактор роста фибробластов в коррекции нарушений МСК

3.5 Влияние МСК на иммунную реконституцию и клиническую эффективность при трансплантации ГСК у больных злокачественными лимфомами

3.5.1 Ретроспективный анализ ко-трансплантации МСК и ГСК у больных злокачественными лимфомами

3.5.2 Влияние МСК на длительность периода цитопении

3.5.3 Влияние МСК на раннее восстановление лимфоцитов

3.5.4 Влияние МСК на восстановление различных субпопуляций Т-лимфоцитов

3.5.5 Влияние МСК на реконституцию регуляторных Т-клеток

3.5.6 Осложнения после ауто-ТГСК и ко-трансплантации МСК и ГСК

3.5.7 Влияние МСК на общую выживаемость

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Список сокращений

МСК Мезенхимальные стромальные клетки

КМ-МСК, П-МСК, МСК, полученные из костного мозга, плаценты и жировой

Ж-МСК ткани соответственно

ИДО Индоламин-2,3-диоксигеназа

ИОД Индекс остеогенной дифференцировки

МНК Мононуклеарные клетки

CKJI Смешанная культура лимфоцитов

Ahth-CD3 Ahth-CD3 антитела

CD Кластер дифференцировки

EGF Эпидермальный фактор роста

ЕРО Эритропоэтин

FGF-basic (bFGF) Основной фактор роста фибробластов

G-CSF Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

GM-CSF Гранулоцитарно-макрофагальный

колониестимулирующий фактор

HLA-DR DR антигены главного комплекса гистосовместимости

sHLA-G 1/5 Растворимые изоформы HLA-G 1/5

IFN-a, IFN-y Интерфероны а и у

IGF Инсулиноподобный фактор роста

IL-2, IL-4 и др. Интерлейкин-2, интерлейкин-4 и др.

LPS Липополисахарид

PGE2 Простагландин Ег

Thlи Th2 Субпопуляции Т-хелперных клеток

TLR Toll-like рецептор

VEGF Сосудистый эндотелиальный фактор роста

АИЗ Аутоиммунные заболевания

ЦП Цирроз печени

ЛХ Лимфома Ходжкина

HXJI Неходжкинская лимфома

MM Множественная миелома

AA Апластическая анемия

ГСК Гемопоэтические стволовые клетки

ТГСК Трансплантация ГСК

РВЛ Раннее восстановление лимфоцитов

Treg Регуляторные Т-клетки

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фенотипические и функциональные свойства мезенхимальных стромальных клеток человека в норме и при иммунопатологических заболеваниях»

ВВЕДЕНИЕ

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермального происхождения [44]. Будучи широко представленными во всех тканях, содержащих строму с фибробластоподобными клетками [62], эти клетки активно участвуют в поддержании и обновлении элементов соединительной ткани [192]. Особое значение придается роли МСК в формировании гемопоэтических ниш, обеспечивающих функционирование стволовых гемопоэтических клеток в костном мозге, а также в создании микроокружения, необходимого для самоподдержания, пролиферации и дифференцировки тканеспецифических стволовых и прогениторных клеток, в том числе Т-клеточных предшественников в тимусе.

В последующих работах было показано, что в определенных условиях in vitro МСК могут дифференцироваться также в клетки тканей экто- и эндодермального происхождения [44, 170], и именно с этим свойством МСК первоначально связывали терапевтический потенциал этих клеток. Действительно, позитивный эффект трансплантации МСК в моделях травмы головного и спинного мозга в совокупности с данными о способности МСК дифференцироваться в нейрональные клетки свидетельствовал о значимости процессов дифференцировки в терапевтическом потенциале МСК. Использование МСК человека также приводило к значительному регрессу симптомов заболевания в моделях множественного склероза и бокового амиотрофического склероза, воспалительных заболеваний кишечника, инфаркта, инсульта, диабета и РТПХ [40, 222, 192, 213].

Однако быстрое развитие эффекта и выявление сравнительно небольшого количества дифференцировавшихся in vivo МСК заставило усомниться в том, что клинический эффект обусловлен в первую очередь трансдифференцировкой /клеточным замещением.

Наряду с выраженным дифференцировочным потенциалом, важным свойством МСК является паракринная функция, которая заключается в способности этих клеток влиять на функционирование целого ряда клеточных элементов. Паракринная функция может реализовываться через продукцию широкого спектра различных факторов МСК, контактные взаимодействия МСК с другими клетками, а также через привлечение (с помощью молекул адгезии и хемокинов) тканеспецифических предшественников и клеток иммунной системы.

Действительно, по данным литературы, спектр продуцируемых МСК факторов включает различные гемопоэтические и негемопоэтические ростовые факторы (в-СЗР, ОМ-С8Р, УЕОБ, ЮР-1, РвР-Ь), интерлейкины (ПТЧ-у, 1Ь-2,1Ь-6,1Ь-1р, ЮТ-а) и хемокины (1Ь-8, МСР-1, М1Р-1Ь). Наряду с этим, МСК являются достаточно активными продуцентами ТЫ/провоспалительных и ТЪ2/противовоспалительных цитокинов, что подразумевает возможность как негативного, так и позитивного влияния на клетки иммунной системы.

Важно отметить, что, несмотря на преимущественное проявление супрессорной активности, в определенных условиях МСК могут обладать иммуностимулирующим потенциалом. В пользу этого утверждения свидетельствует экспрессия на поверхности МСК антигенов МНС I класса, наличие внутриклеточного пула молекул МНС II класса, экспрессия различных молекул адгезии и ТТЛв, а также способность МСК фагоцитировать апоптотические клетки [218]. Поскольку МСК в ответ на эндотоксин усиливают свою секреторную активность, очевидно, что функциональный потенциал МСК может играть значительную роль в регуляции репаративных процессов не только в физиологических условиях, но и при различных повреждающих воздействиях в ответ на различные эндо-и экзогенные ТЪЛ-лиганды. Однако физиологическое значение и

функциональные последствия фагоцитарной активности МСК остаются в настоящее время неизученными.

Паракринные эффекты лежат в основе способности МСК оказывать иммуносупрессивный/противовоспалительный эффект; выполнять трофическую функцию; поддерживать, а при необходимости рекрутировать и активировать тканеспецифические предшественники и активировать ангиогенез. Важная роль супрессорной активности МСК продемонстрирована в моделях аутоиммунных заболеваний, трофический эффект показан в моделях нейропротекции или посттравматической репарации, проангиогенная активность - в моделях инфаркта миокарда, церебрального инсульта и ишемии нижних конечностей. Дополнительными аргументами, делающими МСК привлекательными для клинического использования, является низкая иммуногенность этих клеток, способность к миграции в очаг повреждения/воспаления и антиапоптотические свойства, что в совокупности с иммуносупрессорной и гемопоэзстимулирующей активностью позволяет рассматривать МСК как потенциально активные индукторы/регуляторы репаративных процессов [8, 97, 116, 187, 211].

Еще одним примером паракринной функции может быть гемопоэзподдерживающая активность МСК, которая заключается в способности этих клеток создавать микроокружение и стимулировать пролиферацию и дифференцировку ГСК. Гемопоэзстимулирующая активность in vivo была продемонстрирована в моделях приживления гемопоэтических стволовых клеток при трансплантации костного мозга после высокодозной химиотерапии [128, 20]. Действительно, в отдельных клинических испытаниях показана эффективность МСК при солидных опухолях [118]. В настоящее время обсуждается целесообразность использования МСК с целью ускорения восстановления кроветворения при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам гемобластозами после высоко дозной химиотерапии [128, 20].

Наличие одновременно с этим супрессорной активности МСК обусловило интерес к этим клеткам не только в плане повышения эффективности восстановления гемопоэза и иммунной реконституции после трансплантации ГСК, но и в плане профилактики РТПХ. С другой стороны, супрессорные свойства МСК могут неблагоприятным образом сказываться на иммунной реконституции, развитии инфекционных осложнений и выживаемости пациентов.

Несмотря на немногочисленность МСК в костном мозге (не более 0,01 - 0,001%), данная популяция клеток достаточно легко генерируется в культуре in vitro. Более того, впоследствии было показано, что источником МСК может быть не только костный мозг, но и жировая ткань, плацента, пуповинная кровь, эндометрий, пульпа молочных зубов и другие ткани [241, 92, 181, 11, 73, 32, 65, 184, 83]. Генерированные из разных тканей, МСК в целом отвечают Минимальным критериям, разработанным для стандартизации этих клеток. Тем не менее, имеются отдельные данные о фенотипических и функциональных особенностях МСК различного тканевого происхождения. Подобные наблюдения поднимают вопрос о необходимости сравнительной характеристики свойств МСК из различных тканей с целью обоснованного выбора оптимального источника МСК, что является непременным условием для успешного развития клеточных технологий.

В клинической практике, в соответствии с требования GCP, наиболее безопасным считается использование аутологичного клеточного материала, что позволяет избежать проблем гистосовместимости, этических и юридических вопросов. Однако использование аутологичных МСК пациентов при проведении клеточной терапии ставит вопрос о функциональной полноценности этих клеток при патологии. Исследования, посвященные возможностям генерации и анализу функциональной активности МСК при патологии, в частности, инфекционно-воспалительных

и онкологических заболеваниях, немногочисленны и противоречивы. Мнения различных исследователей варьируют от постулирования функциональной полноценности стромальных клеток [35, 124] или выявления нарушений отдельных их характеристик при сохранности других [212, 228, 133], до признания полной дефектности МСК [114, 166, 227]. Существуют также данные о нарушениях функционирования стромы лишь у небольшой части больных при отсутствии таковых у остальных [78, 103]. В целом анализ данные литературы не позволяет сделать однозначного заключения об особенностях функционирования МСК при той или иной патологии. Кроме того, отсутствие информации об особенностях/нарушениях функциональных свойств МСК при патологии тормозит разработку подходов направленной коррекции активности этих клеток, что приобретает особую значимость при использовании аутологичных МСК у пациентов с различными заболеваниями.

Вышесказанное определило цель настоящей работы: исследовать биологические и иммунорегуляторные свойства МСК различного тканевого происхождения, а также костномозговых МСК в норме и при иммунопатологических заболеваниях и изучить влияние МСК на эффективность восстановления гемоиммунопоэза при трансплантации гемопоэтических стволовых клеток у больных гемобластозами.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить количественное содержание, фенотип и дифференцировочный потенциал МСК различного тканевого происхождения (костный мозг, жировая ткань, плацента).

2. Изучить регуляторную (иммуносупрессорную, гемопоэз-стимулирующую, цитокин-секреторную) активность МСК, выделенных из костного мозга, жировой и плацентарной ткани.

3. Охарактеризовать количественное содержание, фенотип и дифференцировочный потенциал костномозговых МСК у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

4. Изучить иммуносупрессорную, гемопоэзстимулирующую и цитокин-секреторную костномозговых МСК у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

5. Исследовать возможные молекулярные механизмы, опосредующие иммуносупрессорную активность МСК костного мозга, в норме и у больных гемобластозами, аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени.

6. Изучить влияние фактора роста фибробластов (FGF) на диффернцировочный, иммуносупрессорный и цитокин-секреторный потенциал костномозговых МСК доноров в культуре in vitro и оценить возможность использования FGF для стимуляции роста и коррекции функциональной активности МСК при патологии.

7. Изучить влияние МСК на восстановление показателей кроветворения и иммунную реконституцию у больных гемобластозами при проведении аутологичной трансплантации стволовых кроветворных клеток.

8. Оценить особенности клинического течения пострансплантационного периода (частота развития инфекционных осложнений, показатели выживаемости, купирование ПХТ-индуцированной токсичности и т.д.) у больных гемобластозами с аутологичной трансплантацией стволовых кроветворных клеток в комбинации с введением МСК.

Научная новизна

Морфофункциональные исследования продемонстрировали, что выделенные из костного мозга, жировой и плацентарной ткани МСК соответствуют Минимальным критериям, продуцируют широкий спектр цитокинов с функциональным потенциалом для поддержания кроветворения,

иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов, проявляют дозозависимую иммуносупрессорную и гемопоэзстимулирующую активность, однако характеризуются рядом различий. В частности, МСК жировой ткани отличаются максимальным количеством клоногенных предшественников МСК и наиболее высоким базальным уровнем цитокин-секреторной активности, популяция плацентарных МСК - наибольшей пролиферативной активностью и выраженным супрессорным эффектом на пролиферацию Т-клеток в СКЛ, костномозговые МСК - максимально выраженным остеогенным потенциалом и иммуносупрессорной активностью в отношении a-CD3-активированных Т-клеток.

Исследование свойств МСК при патологии (гемобластозы, аутоиммунные заболевания, хронические вирусные гепатиты с исходом в цирроз печени) позволило получить новые данные о сопряженности патологии со снижением в костном мозге количества клоногенных предшественников МСК, наиболее выраженным у больных лимфомами и АИЗ, и значительной вариабельности данного показателя у больных ЦП и АА. При этом установлено, что вне зависимости от количества клоногенных предшественников, культуры МСК больных отличаются сниженной скоростью роста и количеством «дочерних» клеток, генерируемых одной КОЕ-Ф. Впервые продемонстрировано, что развитие иммунопатологических состояний ассоциировано со снижением иммуносупрессорной активности МСК, которая проявляется только при высоких количествах МСК, в то время как низкие дозы МСК не влияют (при ЦП), либо усиливают (у больных АИЗ и гемобластозами) пролиферативную активность Т-клеток. Характерно, что супрессорная активность МСК при большинстве исследуемых патологий не коррелирует с продукцией NO, HLA-G, IL-10, IDO, но в значительной степени опосредуется ПГЕ2, а у больных АА существенно блокируется при нейтрализации IDO.

Впервые установлено, что добавление основного фактора роста фибробластов (FGFb) в культуры МСК больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями приводит к снижению длительности

первичного культивирования МСК, увеличению выхода клеток и возрастанию числа клеток в 8Л32М фазе клеточного цикла. При этом возрастание пролиферативной активности МСК в присутствии БОБЬ сопровождается повышением супрессорного потенциала МСК доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями (АИЗ, ЦП), однако не приводит к усилению супрессорной активности МСК больных гемобластозами. Кроме того, использование БОБЬ в процессе культивирования МСК позволяет повысить исходно сниженный остеогенный дифференцировочный потенциал МСК больных ЦП, но не влияет на остеогенную дифференцировку МСК больных гемобластозами.

Впервые продемонстрировано, что использование низких доз МСК при трансплантации аутологичных ГСК у больных злокачественными лимфомами безопасно, сокращает сроки критической нейтро- и тромбоцитопении, повышает эффективность раннего восстановления лимфоцитов и реконституции СОА+ лимфоцитов (в том числе за счет наивных СО4+ Т-клеток) при отсутствии стимулирующего влияния на восстановление регуляторных Т-клеток. Трансплантация низких доз МСК ассоциируется с меньшей частотой развития тяжелых форм поражения слизистых и не приводит к увеличению частоты возникновения рецидивов/снижению выживаемости больных.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные свидетельствуют о том, что наряду с общностью биологических свойств, МСК различного тканевого происхождения характеризуются рядом тканеспецифических особенностей, в частности, различаются по количеству клоногенных предшественников, пролиферативному и остеогенному потенциалу, а также продукции цитокинов и проявлениям супрессорной активности.

Выявленное снижение количества клоногенных предшественников МСК, их пролиферативной и супрессорной активности, а также остеогеннош потенциала у больных воспалительными и онкогематологическими

заболеваниями свидетельствует о сопряженности иммунопатологических процессов с количественными и функциональными изменениями в популяции МСК. При этом ПГЕ2 является универсальным медиатором супрессорной активности высоких доз МСК независимо от патологии. Установленная зависимость между усилением пролиферации МСК (при обработке FGFb) и восстановлением супрессорного потенциала МСК при воспалительных заболеваниях и отсутствие подобной зависимости при гемобластозах свидетельствует о существовании различных типов функциональных нарушений МСК.

Практическая значимость работы заключается в том, что впервые показана возможность коррекции нарушений функциональной активности МСК при иммунопатологических заболеваниях фактором роста фибробластов и различная чувствительность МСК больных воспалительными и онкогематологическими заболеваниями к действию FGFb. Важным прикладным аспектом работы являются данные о безопасности, переносимости и клинической эффективности внутривенного введения относительно невысоких доз аутологичных МСК. Оценка показателей кроветворения и содержания различных субпопуляций Т-лимфоцитов свидетельствует, что трансплантированные МСК in vivo не обладают иммуносупрессорной активностью, повышают эффективность восстановления гемопоэза и иммунной реконститутции и оказывают благоприятный эффект на исходы трансплантации. Результаты исследований использованы для разработки новой медицинской технологии «Использование совместной трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобластозах и аутоиммунных заболеваниях» (ФС № 2008/014 от 30 января 2008 г). Основные положения, выносимые на защиту:

1. МСК различного тканевого происхождения имеют тканеспецифические различия по количеству клоногенных предшественников, пролиферативному и остеогенному потенциалу, а

также продукции цитокинов, участвующих в поддержании кроветворения, иммуномодуляции и стимуляции репаративных процессов.

2. Изменения свойств костномозговых МСК при гемобластозах, аутоиммунных заболеваниях и циррозе печени проявляются снижением количества клоногенных предшественников МСК, их пролиферативной и супрессорной активности, а также остеогенного потенциала в культуре in vitro.

3. Основной фактор роста фибробластов повышает in vitro пролиферативную активность МСК больных с иммунопатологическими заболеваниями и у пациентов с аутоиммунными заболеваниями и циррозом печени корригирует иммуносупрессорную активность и остеогенный потенциал МСК.

4. Использование низких доз МСК (в диапазоне от 0,01 до 1,1 х106 клеток/кг) является безопасным и повышает эффективность трансплантации аутологичных ГСК у больных гемобластозами за счет сокращения сроков цитопении, более эффективной реконституции Т-клеток и снижения частоты тяжелых инфекционных осложнений (мукозитов, энтеропатий).

Объем и структура диссертации

Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 180 страницах машинописного текста, включающего 28 таблиц и 24 рисунка. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 242 источника литературы, в том числе 229 иностранных.

Апробация работы Результаты доложены и обсуждены на Международном конгрессе по косметологии и эстетической медицине «Kosmetik International» (Москва, 2004); на Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая

клетка. Иммунитет» (Новосибирск, 2005); на Российско-американской конференции «Биотехнология и онкология» (С-Пб., 2005); на Всероссийских научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2005; Красноярск, 2006; Омск, 2007; Томск, 2008; Красноярск, 2010); на Международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005); на 10-ом конгрессе ESPRAS (European Societies of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery) (Вена, 2005); на Международной конференции "Basic science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, 2006); на Всероссийской и Международной конференции «Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении» (Москва, 2007); на 3-ей международной конференции «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2007); на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008); на II Съезде терапевтов Республики Казахстан (Алматы, 2009); на Всероссийской научной школе-конференции (Москва, 2010); на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» (Новосибирск, 2010); на Всероссийской научно-практической конференции «Поленовские чтения» (Санкт-Петербург, 2010); на 7-ой и 8-ой отчетных конференциях НИИКИ СО РАМН (Новосибирск, 2008, 2011); на 2-ой и 3-ей конференциях Международной ассоциации по нейрореконструкции (Пекин, 2009 и 2010); на 36-ой и 37-ой Annual Meeting of European Group for Blood and Marrow Transplantation (EBMT) (Флоренция, 2008; Париж, 2011).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 53 печатных работы, в том числе 17 статей в центральной печати, защищен 1 патент, зарегистрирована 1 новая медицинская технология.

ГЛАВА 1. МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТРОМАЛЬНЫЕ КЛЕТКИ: БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ИММУНОРЕГУЛЯТОРНЫЕ СВОЙСТВА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ (Обзор литературных данных)

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (МСК) относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки, имеющие мезенхимальное происхождение - адипоциты, остеоциты, хондроциты, а также в особых условиях in vitro - в клетки эктодермального и энтодермального фенотипа [170].

1.1 Общая характеристика МСК

Впервые предположение о присутствии в костном мозге стволовых клеток негемопоэтической природы было высказано Clonheim et al. Согласно данным этого автора, в костном мозге присутствуют фибробласты, синтезирующие коллагеновые волокна в процессе нормального заживления ран [174]. Однако честь открытия МСК принадлежит отечественному ученому А.Я.Фриденштейну, доказавшему, что костный мозг содержит клетки, способные дифференцироваться наравне с фибробластами в другие типы клеток мезенхимального направления [81, 79]. Авторы показали, что прилипающие клетки, присутствующие в цельном костном мозге, имели веретенообразную форму и образовывали скопления из 2-4 клеток, которые после 2-4 дней покоя начинали активно делиться. Подобные клетки могли давать начало колониям костно- или хрящеподобной ткани. Наблюдения А.Я.Фриденштейна активно дополнялись другими группами [48, 15, 17], в результате чего было доказано, что клетки, выделенные по его методу, являются мультипотентными и способными дифференцироваться в остеобласты, хондроциты, адипоциты, а также миобласты. В настоящее время для этих клеток принято название «мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки» (МСК) [44].

А.Я.Фриденштейн с соавт. были также первыми, кто продемонстрировал присутствие популяции колониеобразующих фибробластоподобных клеток, способных к мультипотентной дифференцировке, не только в костном мозге, но также в тимусе и других лимфоидных органах [80]. Однако еще в течение долгого времени костный мозг считался единственным источником МСК. Лишь спустя практически 30 лет, МСК были выделены и из других тканей взрослого организма, включая жировую и хрящевую ткани, пуповинную кровь, плаценту, сухожилия, периферическую кровь и др. [241, 92, 181, 11, 73, 32, 65, 184, 83]. Широкое распространение МСК в организме продемонстрировано в работе da Silva Meirelles L. С соавт., показавшими присутствие МСК во всех тканях, содержащих строму с фибробластоподобными клетками [62].

Последнее десятилетие ознаменовалось бурным ростом исследований, посвященным характеристике биологической активности МСК. С целью упорядочения обширного массива данных в 2006 году Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии (ISCT) были определены «минимальные» критерии, специфичные для МСК: 1) адгезия к пластику и фибробластоподобная морфология; 2) характерный, иммунофенотип (экспрессия CD73, CD90, CD105 и отсутствие экспрессии CD34, CD45, HLA-DR); 3) способность к дифференцировке в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлении [72].

Наиболее охарактеризованной популяцией являются МСК, полученные из аспиратов костного мозга в результате культивирования прилипающей фракции костномозговых мононуклеарных клеток. Морфологически культуры МСК представлены фибробластоподобными клетками [48, 79]. В то же время, помимо клеток с веретенообразной формой, в культурах МСК встречаются также уплощенные клетки [109], а также очень маленькие круглые клетки [55]. Кроме того, морфология МСК изменяется в зависимости от клеточной плотности. Однако значение подобной

вариабельности и сопряженность морфологических характеристик с функцией МСК на сегодняшний день не ясны.

Подавляющее большинство данных, характеризующих свойства МСК, получены в отношении in vitro генерированных клеток. Отличительной особенностью МСК, в сравнении, например, с ГСК, является высокая экспансия in vitro, позволяющая получать значительные количества МСК при культивировании в питательных средах, обогащенных 10-20% сыворотки. Однако пролиферативный потенциал МСК отличается выраженной вариабельностью. Так, одни культуры могут претерпевать до 40-50 клеточных удвоений без дифференцировки, в то время как другие прекращают репликацию уже на четвертом удвоении [223, 71, 169]. Такая вариабельность может быть обусловлена рядом причин, среди которых необходимо упомянуть процедуру забора костного мозга [37, 71, 169], низкую частоту МСК в аспирате костного мозга (иногда до 2-5 МСК на 106 МНК) [119], возраст и состояние донора костного мозга [71, 84]. Несмотря на высокий пролиферативный потенциал ex vivo, МСК не утрачивают в ходе культивирования нормальный кариотип и теломеразную активность [170]. Однако слишком долгое культивирование может нарушить функционирование клеток, что проявляется в появлении признаков старения [71] и апоптоза [56].

Исследования пролиферативной активности МСК показали, что большая часть клеток пребывает в G0/G1 фазах клеточного цикла, и лишь 10% МСК активно пролиферирует, находясь в S/G2/M фазах [56]. Считается, что большое количество клеток в G0/G1 фазах предполагает высокую способность МСК к дифференцировке [202]. Поиск «внешних» факторов, усиливающих пролиферативный потенциал МСК, показал, что такие факторы, как фактор роста, полученный из тромбоцитов (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), основной фактор роста фибробластов (bFGF), трансформирующий рост фактор (3 (TGF-[3), а также инсулино-

подобный фактор роста 1 (IGF-1) стимулируют пролиферацию КОЕ-Ф [19, 30,219, 123].

1.1.1 Идентификация МСК

Согласно Минимальным критериям, неотъемлемой частью идентификации и изучения функциональных особенностей МСК является определение их фенотипа. Антигенный профиль МСК не является уникальным и имеет общие черты с фенотипами клеток других типов, например, эндотелиальных, эпителиальных и мышечных клеток. Эта особенность является общей для стволовых и прогениторных клеток, присутствующих во взрослом организме. Отчасти это может быть обусловлено тем, что получаемые в условиях in vitro популяции стволовых клеток представляют собой смесь, содержащую некоторое количество коммитированных предшественников, приобретающих, в том числе, фенотипические признаки конечных типов клеток. Тем не менее, иммунофенотип МСК на данный момент достаточно хорошо охарактеризован. Так, четко определено, что на мембране МСК не должны экспрессироваться типичные гемопоэтические антигены - CD45, CD34 и CD14 [56, 170]. Список же экспрессируемых маркеров достаточно обширен и далек от подобной определенности. Ниже представлен результат систематизации разрозненных данных в виде перечня молекул, экспрессируемых на МСК с описанием их функций (таблица 1).

Таблица 1. Некоторые молекулы, экспрессируемые на МСК.

Антиген Функция Ссылка

CD29, CD49, CD51, CD61, CD 104 (различные цепи интегрина) Вовлечены в процессы адгезии и трансдукции сигналов. Содержат также рецептор к ламинину и фибриногену. [226]

CD44 (рецептор к гиалуронану) вовлечен в процессы адгезии к внеклеточному матриксу, миграции, активации Т-лимфоцитов [148]

CD54 (ICAM-1) участвует в образовании межклеточных контактов, является лигандом для интегринов лейкоцитов, экспрессируется также эндотелиоцитами, макрофагами, лейкоцитами [170]

СБ90 (ТЬу-1) вовлечен в процессы клеточно-клеточных (с эндотелиоцитами и фибробластами) и клеточно-матриксных взаимодействий, лиганд для СВ61, экспрессируется Т-лимфоцитами, нейронами [51]

СБ 102 (1САМ-2) вовлечен в процессы клеточно-клеточных взаимодействий, экспрессируется также иммунокомпетентными клетками, ингибирует адгезию, опосредованную СБ11а [170]

СБ 105 (эндоглин) гликопротеин, непосредственно связанный и регулирующий активность рецепторного комплекса к ТвР-р. Участвует в детерминации хондрогенной дифференцировки МСК. Экспрессируется также эндотелиоцитами, активированными макрофагами, фибробластами, лейомиоцитами [96, 22]

СБ 106 (УСАМ-1) вовлечен в процессы клеточно-клеточной адгезии. Экспрессируется также активированными цитокинами эндотелиоцитами, лейомиоцитами [170]

СБ\у1 19 (1РКу11) рецептор ИФНу, активирующий систему 1АК-БТАТ (Янус-киназы, передатчики сигнала и активаторы транскрипции), участвующую в регуляции пролиферации, дифференцировки и апоптоза [170]

СБ 120 (ТЫРЯ) рецепторы ФНОа, активируют транскрипционный фактор ОТ-кВ, регулирующий процессы апоптоза, определяют «участие» клетки в воспалительном ответе, регулируют процессы пролиферации [170]

СБ121а (1Ь-111) рецептор интерлейкина 1 [170]

СБ 123 (И-ЗКа) рецептор интерлейкина 3, вовлеченный через тирозинзависимую протеинкиназу в регуляцию пролиферации и дифференцировки [170]

СБ126 (1Ь-6Ы) рецептор интерлейкина 6, регулирующего процесс дифференцировки, в состав которого входит связывающий интерлейкин домен и трансдуктор -гликопротеин 130 [170]

СБ 127 (1Ь-7Яа) рецептор интерлейкина 7 [170]

СБ140 (РБОР-Я) рецепторы тромбоцитарного фактора роста [214]

8Т110-1 первый относительно специфичный маркер МСК, функция неизвестна [191]

88ЕА-4 маркер эмбриональных стволовых клеток, вовлеченный в регуляцию стабильности полипотентного статуса [85]

нейральный ганглиозид, экспрессируется клетками нервной ткани, вовлечен в процессы адгезии [140]

СЭ271 ИОРЯ - высоко экспрессируется на свежевыделенных, но не на культивируемых МСК [38]

В отличие от МСК человека, 10-20% МСК мышей С57В1/6 (но не ВАЬВ/с) несут на своей поверхности молекулу СЮ34 [164]. МСК человека

конститутивно экспрессируют низкие уровни молекул МНС I, но не МНС II класса [209, 70], хотя имеются и данные об экспрессии МНС II класса на некоторых популяциях МСК [172, 195]. В то же время обработка IFNy приводит к увеличению количества МСК, несущих на мембране МНС I и II класса [90, 122, 143]. Что касается ко-стимуляторных молекул, считается что CD80, CD86 и CD40L не экспрессируются и не индуцируются на МСК человека, хотя МСК мыши могут конститутивно экспрессировать CD80 [122, 195].

По мнению ряда авторов, наиболее специфичным МСК маркером может считаться NGFR/CD271 - низкоаффинный NGF рецептор, высоко экспрессируемый на МСК in vivo. Выделение популяции стромальных клеток, ко-экспрессирующих CD271 и D7-FIB (поверхностный антиген фибробластов с неизвестной функцией), позволяет получить популяцию мультипотентных МСК, способных к дифференцировке в различные клетки мезенхимальных тканей [39, 108].

Также на поверхности МСК экспрессируются такие белки, как десмин, нестин, виментин, кальпонин, а-гладкомышечный актин, задействованные в процессах пролиферации и миграции [10, 99, 214].

Как видно из таблицы 2, МСК продуцируют большое количество различных гемопоэтических и негемопоэтических ростовых факторов, интерлейкины и хемокины. В то время как продукция некоторых из них является конститутивной, другие продуцируются только при стимуляции [97]. Кроме того, МСК экпрессируют также рецепторы к цитокинам и ростовым факторам (таблица 2). В совокупности эти данные говорят в пользу того, что МСК в костном мозге участвуют в формировании и функционировании стромального микроокружения, которое оказывает индуктивные / регуляторные эффекты не только на МСК, но и на функционирование гемопоэтических предшественников и других немезенхимальных стромальных клеток, присутствующих в костном мозге

[52, 117, 139, 178]. В пользу такого предполагаемого динамического участия МСК в костномозговом микроокружении говорят также данные о продукции ими широкого спектра матриксных молекул, включая фибронектин, ламинин, коллаген и протеогликаны [54, 170, 174] и экспрессии ряда рецепторов, участвующих в адгезионных взаимодействиях с матриксом и другими клетками (таблица 2). Особенно важной является экспрессия CD44 [56, 170] - рецептора к различным лигандам, включая гиалуронан и остеопонтин, играющих центральную роль в организации матрикса в костном мозге и кости, соответственно [145, 229].

Таблица 2. Некоторые маркеры, экспрессируемые МСК

Тип маркера Описание

Специфические SH2, SH3, SH4, STRO-1, а-гладкомышечный

антигены актин, MAB 1740

Цитокины и факторы Интерлейкины: 1а, 6, 7, 8, 1 i, 12, 14, и 15, роста LIF, SCF, Flt-З лиганд, GM-CSF, G-CSF, M-CSF

Рецепторы цитокшюв IL-Tr^L-^ и факторов роста CSFR,

IFNyR, TNFIR, TNFIIR, TGFßlR, TGFßllR, bFGFR, PDGFR, EGFR Молекулы адгезии Интегрины: avß3, avß5

Цепи интегринов: al, a2, a3, a4, a5, av, ßl, ß3, ß4, ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, ALCAM-1, LFA-3, L-селектин, эндоглин, CD44 Экстрацеллюлярный Коллаген I, III, IV, V, и VI типов матрикс Фибронектин, ламинин, гиалуронан,

протеогликаны

Наряду с фенотипической характеристикой, МСК идентифицируют по способности дифференцироваться в клетки мезенхимальных тканей [135]. Многочисленные исследования in vitro, поддержанные экспериментами in vivo, показывают, что костномозговые МСК способны дифференцироваться в полностью специализированные клетки, функционально и морфологически соответствующие остеобластам [111, 123, 165], хондробластам [111, 196], адипоцитам [170], тендоцитам [234], миоцитам [77], нейронам [225], гепатоцитам [121] и формировать строму, поддерживающую гемопоэз [64].

1.1.2 Гетерогенность МСК in vitro

Популяции костномозговых МСК, полученные в результате экспансии in vitro, гетерогенны, что, по-видимому, является отражением сложного состава стромы костного мозга [151,], различий между донорами костного мозга [139, 151], а также используемых методов выделения и условий экспансии [198, 217]. Анализ свойств клонированных МСК показывает, что только часть клеток можно считать мультипотентными [151]. Кроме того, популяции МСК могут различаться по морфологии и пролиферативному потенциалу [109, 106]. С целью упорядочения понятия гетерогенности выделяют интра- и интерпопуляционную гетерогенность [167]. Интрапопуляционная гетерогенность подразумевает различия, существующие между различными образцами МСК, т.е. полученными от различных доноров (костного мозга или иной ткани) или различных линий мышей. Так, например, при исследовании остеогеного потенциала МСК, генерированных из 17 аспиратов костного мозга доноров, были выявлены различия ростовых характеристик, активности щелочной фосфатазы и индукции некоторых генов остеогенной дифференцировки между различными образцами костного мозга [169, 106]. Интерпопуляционная, или клональная, гетерогенность отражает наличие различий внутри конкретной культуры МСК [167]. Так, Colter с соавт. [55] показали, что в культурах МСК присутствует минорная субпопуляция мелких агранулярных клеток (RS-1-

клетки) с низкой способностью к образованию колоний и негативных по ядерному маркеру пролиферации Ki-67. Покоящиеся RS-1 -клетки не экпрессируют маркеры остеогенного или адипогенного направлений, Cbfa-1 и PPAR-2, соответственно [55, 170]. Очевидно, присутствие в культуре именно RS-1-клеток обеспечивает высокую пролиферативную активность МСК. С другой стороны, RS-1-клетки могут выходить из состояния покоя под действием стимулов, вырабатываемых МСК. По всей видимости, RS-1-клетки представляют ex vivo субпопуляцию некоммитированных самообновляющихся МСК.

Выраженная гетерогенность МСК и существование предшественников со свойствами некоммитированных мезенхимальных стволовых клеток так же было показано при изучении клональных культур костномозговых МСК [151]. Действительно, среди нескольких выделенных клонов один проявлял свойства стволовых клеток, а именно низкую частоту встречаемости (1%), FGF-2-ростовую зависимость [112], а также некоммитированное состояние, о чем говорила неспособность к дифференцировке в остеобласты, хондроциты и адипоциты. Вместе эти данные демонстрируют, что культуры костномозговых МСК содержат минорную субпопуляцию некоммитированных предшественников, проявляющих свойства стволовых клеток. Представляют ли эти клетки ex vivo вариант мезенхимальных стволовых клеток in vivo [48], остается непонятным.

Помимо некоммитированных мезенхимальных прешественников, в культурах костномозговых МСК также присутствует несколько типов коммитированных предшественников. Так, Muraglia А. С соавт. [151] получали различные неиммортализованные клоны мезенхимальных предшественников для изучения природы и степени коммитированности костномозговых МСК. При исследовании дифференцировочного потенциала выделяемых клонов было выявлено, что лишь 30% всех клонов являются мультипотентными, обладая трилинейным потенциалом

(остео/хондро/адипо). В то же время остальные клоны проявляли либо билинейный (остео/хондро), либо только остеогенный дифференцировочный потенциал [110]. Эти наблюдения были подтверждены и другими исследованиями с использованием трансформированных клеток [68, 69, 100]. Кроме того, авторам удалось выделить клон, обладающий свойствами мезенхимального предшественника с квадрилинейным потенциалом (клон ВМС9), который в соответствующих условиях был способен дифференцироваться в клетки с фенотипом и функциональными признаками остеобластов, хондроцитов, адипоцитов, а также стромы, поддерживающей гемопоэз [69]. В совокупности представленные данные демонстрируют гетерогенность культур костномозговых МСК, содержащих субпопуляции МСК разной степени коммитированности/стволовости.

Наличие гетерогенности популяций МСК приобретает особое значение, учитывая высокий терапевтический потенциал этих клеток. Действительно, использование МСК в терапии различных заболеваний диктует необходимость разработки как стандартизованных методов получения популяций МСАК с высокими регенеративными свойствами, так и методов адекватного контроля терапевтического потенциала МСК [203, 192]. Интересные данные в этом направлении опубликованы Janicki Р с соавт. в 2011 г. [106]. Авторы показали, что предиктором эффективного образования костной ткани in vivo может быть пролиферативная активность МСК. В частности, время удвоения популяции МСК менее 43,23 часов позволяет прогнозировать эктопическое остеообразование in vivo с высокой чувствительностью (81,8%) и специфичностью (100%). Обращает на себя внимание также выявленное авторами отсутствие корреляции между образованием депозитов кальция in vitro и образованием костной ткани in vivo, что «дисквалифицирует» стандартный метод in vitro характеристики остеогенного потенциала МСК. Аналогичные результаты о низкой специфичности определения ex vivo депозитов внеклеточного матрикса как

доказательства остеогенной дифференцировки МСК в функционально активные остеобласты уже сообщались ранее [125]. В совокупности эти данные поднимают вопрос о пригодности стандартного метода in vitro минерализации для характеристики остеогенного потенциала МСК in vivo, а в более широком аспекте свидетельствуют о необходимости стандартизации методов получения МСК с заданными свойствами.

1.1.3 МСК in vivo

Несмотря на большой интерес к МСК и несомненные достижения, сделанные за последнее время в области изучения биологии стволовых клеток, подавляющая часть данных основана на экспериментах in vitro. Напротив, чёткая локализация стволовых клеток в организме, а также схемы их функционирования in vivo до конца не изучены.

Тем не менее, в литературе существует гипотеза, разработанная Da Silva Meirelles с соавт., согласно которой МСК локализуются в организме как перициты [61]. При этом их функция заключается в стабилизации кровеносных сосудов и поддержании тканевого гомеостаза [62]. С разрушением сосудов в очаге повреждения ткани или поблизости от него происходит активация перицитов. Она сопровождается пролиферацией и секрецией биологических медиаторов, роль которых заключается в защите поврежденной ткани и стимуляции её регенерации. Секреторные продукты МСК в очаге повреждения угнетают иммунный надзор, а также подавляют Ти В-клеточно-опосредованное разрушение ткани в очаге. Эти меры служат для предупреждения ткани от потери «толерантности» и, следовательно, развития аутоиммунных процессов.

С определенной долей допущений на основе этой гипотезы можно объяснить развитие таких заболеваний, как рассеянный склероз и диабет 1 типа - как следствие дефекта в описанных иммунорегуляторных свойствах МСК.

Кроме того, нужно отметить, что секреторные продукты МСК оказывают выраженный трофический эффект [45] в очаге повреждения ткани, тем самым ограничивая его (антиапоптотическое действие), стимулируют ангио/васкулогенез, а также митотическую активность присутствующих в ткани клеток-предшественников.

Zannettino с соавт., используя маркеры, ассоциированные с мезенхимальными и периваскулярными стволовыми клетками (STRO-1, CD146 и 3G5), показали, что в жировой ткани человека также содержится популяция мультипотентных клеток, проявляющих периваскулярный фенотип [235]. Более того, обнаружена прямая зависимость между количеством стволовых клеток жировой ткани, полученных из хорошо и бедно выскуляризированных областей жировой ткани, и плотностью сосудов, что говорит о «физической» ассоциации МСК и кровеносных сосудов [43; 61]. Еще одним подтверждением гипотезы, в рамках которой прилипающие клетки жировой ткани со свойствами МСК рассматриваются как резидентные перициты, можно считать данные Traktuev, согласно которым клетки стромально-васкулярной фракции жировой ткани ко-экспрессируют мезенхимальные (CD 10, CD 13 and CD90), перицитарные (chondroitinsulphate proteoglycan, CD 140a и CD 140b) и гладкомышечные (a-actin, caldesmon и calponin) маркеры [207].

Таким образом, сущность гипотезы заключается в том, то периваскулярное пространство является универсальной нишей МСК, рассредоточенной по всем тканям организма. Следовательно, уменьшение плотности кровеносных сосудов в некоторых тканях по мере старения организма должно сопровождаться снижением количества МСК в этих тканях, что принципиально согласуется с данными литературы [198].

1.2 МСК и гемопоэз

Будучи впервые выделены из костного мозга, МСК играют важную роль в создании соответствующего микроокружения, необходимого для

созревания, дифференцировки и выживаемости кроветворных предшественников [150, 93]. Обеспечение этой функции МСК достигается посредством клеточно-клеточных взаимодействий и секреции цитокинов и ростовых факторов, таких как M-CSF, Flt-3L, SCF, IL-6, IL-7, IL-8, IL-11, IL-12, IL-14 и IL-15 [194]. Кроме того, при стимуляции IL-1а МСК могут продуцировать также IL-la, LIF, G-CSF, and GM-CSF [67]. МСК также вовлекаются в лимфопоэз [206]. Так, созревание B-клеток в костном мозге происходит при участии МСК, которые продуцируют SCF and IL-7 [144]. Кроме того, взаимодействуя с Т-клетками, МСК могут быть вовлечены в экстратимический Т-лимфопоэз [21].

Недавние исследования показали, что наряду с поддержкой гемопоэза, костный мозг играет важную роль в индукции эндогенных иммунных ответов. Имеются данные, позволяющие рассматривать костный мозг как уникальный лимфоидный орган, где происходит активация наивных Т-клеток и рекрутирование Т-клеток памяти [141]. Действительно, в работе Mazo с соавт. показано, что центральные CD8+ Т-клетки памяти рекрутируются преимущественно в костный мозг. При этом хоминг CD8+ Т-клетки памяти опосредуется хемокином CXCL12, мощными продуцентами которого являются МСК [141]. Таким образом, костномозговые МСК могут выступать в качестве участников эндогенных иммунных ответов.

1.3 Иммунорегуляторные свойства МСК

1.3.1 Иммуносупрессорная активность МСК

Известно, что МСК подавляют пролиферацию Т-клеток, стимулированных как аллогенными лимфоцитами и дендритными клетками, так и митогенами [70]. МСК-опосредованная супрессия реализуется как в результате межклеточных взаимодействий, так и при участии растворимых факторов. Так, например, Beyth с соавт. показали, что влияние МСК на пролиферацию Т-клеток имеет место только в случае наличия межклеточных контактов между МСК и МНК [28]. Напротив, Di Nicola М. С соавт. [70]

продемонстрировали супрессорные свойства супернатантов МСК, что предполагает действие растворимых медиаторов, секретируемых МСК.

Точный механизм МСК-опосредованной супрессии до сих пор неизвестен. Тем не менее, в настоящее время считается общепринятым, что 1) ведущая роль в супрессорных эффектах МСК принадлежит растворимым факторам и 2) для проявления супрессорных свойств МСК должны быть активированы/стимулированы. В ряде независимых исследований, с использованием нейтрализующих антител показано, что супрессорные эффекты МСК in vitro могут быть опосредованы TGF-pl, фактором роста гепатоцитов (HGF), простагландином Е2 [28, 9]. Известно также, что в присутствии IFNy МСК продуцируют индоламин-2,3-диоксигеназу (ИДО) -фермент, катализирующий конверсию триптофана в кинуренин, что приводит к выключению триптофана из метаболизма и, как результат, - к селективному подавлению пролиферации Т-клеток [143]. Ингибирующим эффектом на пролиферацию Т-клеток обладают также продукты дальнейшего метаболизма кинуренина [82].

Существуют также данные о вовлечении в реализацию супрессорных эффектов МСК контактно-опосредованных механизмов, в частности, взаимодействия B7-H1/PD-1 [122, 16].

Stagg с соавт. выдвинули гипотезу, согласно которой ex vivo генерированные МСК экспрессируют/продуцируют множество иммуносупрессорных факторов, использование которых в каждом конкретном случае определяется стимулом, влияющим на МСК (аллоантигены, мембрано-связанные протеины, митогены, цитокины и т.д.). Эта гипотеза нашла свое подтверждение в работе Rasmusson с соавт., что МСК используют различные механизмы для подавления пролиферации лимфоцитов, индуцированной аллоантигенами или митогенами (продуцируя в последнем случае простагландины) [176].

Le Blanc К. et al. (2004) и Glennie S. et al. (2005) показали, что подавление пролиферации CD4+ и CD8+ лимфоцитов в присутствии МСК сопровождается снижением экспрессии молекул активации - CD25 (рецептор интерлейкина 2), CD38 [127], а также HLA-DR [87]. В результате развивается функциональная анергия Т-лимфоцитов и остановка их пролиферации.

Считается также, что подавление пролиферации Т-клеток МСК может осуществляться опосредованно - через угнетение дифференцировки /созревания дендритных клеток (ДК) как из CD34+, так и из моноцитарных предшественников [28, 157]. Показано, что генерация ИЛ-4-ДК в присутствии МСК ассоциируется со значительным ослаблением антигенпрезентирующей способности ДК. Одним из факторов МСК-опосредованной супрессии в данном случае является ИЛ-6 [98].

МСК могут также существенно изменять фенотип и функциональную активность макрофагов [116].

В работах Glennie [87] и Zappia с соавт. [236] показано, что подавление пролиферации Т-клеток происходит за счёт остановки их клеточных делений в G0/G1 фазе клеточного цикла, в то время как апоптоз Т-клеток МСК не вызывают. Кроме того, Т-клетки лишь прекращают пролиферацию, в то время как экспрессия костимуляторных молекул сохраняется.

МСК способны воздействовать также на функции В-клеток, подавляя дифференцировку IgM, IgG и IgA-продуцирующих клеток [59]. Как и в случае с Т-клетками, происходила остановка клеточного цикла в G0/G1 фазе. Интересно также, что у В-клеток в присутствии МСК снижалась экспрессия CXCR4, CXCR5 и CCR7, равно как хемотаксис к CXCL12, CXCL13, лигандам к CXCR4 и CXCR5, что говорит о влиянии МСК на хемотаксические свойства В-клеток. При этом МСК не влияли ни на экпрессию на В-клетках костимуляторных молекул, ни на секрецию ими цитокинов.

В работе Aggarwal с соавт. показано, что МСК взаимодействуют также с IL-2-активированными НК-клетками, снижая продукцию ими ИФН-у

[9].

Долгое время считалось, что toll-like рецепторы (TLR) являются атрибутом исключительно клеток иммунной системы, позволяющим реагировать на различные потенциально опасные антигены вирусной, бактериальной или грибковой природы. Однако за последние годы появилось несколько работ, свидетельствующих об экспрессии на МСК функционально активных TLR [104, 152, 168, 205]. При этом взаимодействие лиганда (эндотоксина) с рецептором (TLR4) на МСК в целом потенцирует их секреторную активность, хотя различные типы МСК могут различаться между собой по уровню ЛПС-реактивности. Подобные данные указывают на значительную роль МСК в регуляции репаративных процессов не только в физиологических условиях, но и при различных повреждающих воздействиях, например в рамках иммунного ответа на бактериальные инфекции.

Обширный список молекул, имеющих отношение к МСК-опосредованной супрессии, и нередкое отсутствие однозначных данных по тем или иным кандидатным молекулам привели к появлению новой волны интереса к роли контактных взаимодействий в реализации функций МСК. В этой связи интересны новые данные о вовлечении молекул адгезии в супрессорные эффекты МСК. Так, в работе Ren с соавт. показано, что подавление пролиферативного ответа a-CD3-активированных Т-лимфоцитов ассоциируется с повышенной экспрессией молекул адгезии, ICAM-1 и VCAM-1, на МСК [179]. При этом выраженность супрессорных свойств прямо коррелировала с интенсивностью экспрессии этих молекул и в значительной степени нивелировалась при нейтрализации функции или выключении генов ICAM-1 и VCAM-1. Однако в работе Najar с соавт, где также было выявлено повышение экспрессии ICAM-1 (CD54) и LFA-1

(CD58) в культурах костномозговых МСК и Т-клеток, использование нейтрализующих антител против молекул адгезии не влияло на супрессорный потенциал МСК [153].

Иммуносупрессорная активность является характерной не только для МСК, полученных из различных тканей, но и для других типов стромальных клеток взрослого организма, например, фибробластов [95, 46]. Это послужило основанием для появления гипотезы об универсальности супрессорной активности как общего свойства всех стромальных клеток [95]. Действительно, подобно МСК, фибробласты кожи человека характеризуются выраженной способностью к подавлению пролиферативного ответа активированных Т-лимфоцитов. Но если первоначальные данные постулировали полную идентичность иммуносупрессии, реализуемой МСК и фибробластами [95], то в более поздних работах были показаны принципиальные различия в механизмах, лежащих в основе этой супрессии. Так, по данным Cappellesso-Fleury, супрессорный потенциал фибробластов реализуется без вовлечения ПГЕ2, IL-10 и IDO [46]. Наконец, Wada с соавт. в 2011 г подтвердили отсутствие экспрессии IDO и индукции iNOS в культурах фибробластов кожи человека и аллогенных МНК и продемонстрировали ключевую роль IFNa в супрессорных механизмах фибробластов [216]. Этими авторами был сделан вывод о том, что иммуносупрессорная активность фибробластов, как клеток стромы взрослого организма, реализуется с вовлечением альтернативных по отношению к костномозговым МСК механизмов супрессии.

Таким образом, МСК могут изменять существенно изменять активность клеток иммунной системы, приводя к проявлению в большей степени противовоспалительного или толерантного фенотипа. Подобные свойства МСК обосновывают возможность применения этих клеток при лечении иммунологически обусловленных заболеваний, в патогенез которых ведущее значение принадлежит различным иммунокомпетентным клеткам.

1.3.2 Иммуностимуляторная активность МСК

Известно, что, несмотря на наличие выраженной иммуносупрессивной активности, в определенных условиях мезенхимальные клетки способны усиливать пролиферативный ответ лимфоцитов на аллоантигены и стимуляцию гомеостатическими цитокинами (IL-15, IL-7, IL-2) [34]. Стимулирующий эффект связывают с использованием низких количеств МСК [129, 200], однако подобные сообщения единичны, и механизм данного явления нуждается в дальнейшем изучении.

Открытой областью исследований является возможное участие МСК в презентации антигена и запуске иммунного ответа. О том, что МСК могут обладать иммуностимулирующем потенциалом, свидетельствует ряд фактов: 1) экспрессия на поверхности МСК антигенов МНС I класса, 2) наличие внутриклеточного пула молекул МНС II класса, которые при стимуляции IFN-y начинают экспрессироваться на мембране МСК, 3) экспрессия различных молекул адгезии (CD 106 (VCAM), ICAM-1, CD 166 (ALCAM), LFA-3 (CD58) и др.), имеющих лиганды на поверхности иммунокомпетентных клеток, 4) экспрессия TLRs [205] и 5) появившиеся новые данные о способности МСК фагоцитировать апоптотические клетки [218]. Однако само по себе усиление экспрессии молекул I класса и экспрессия МНС II класса на IFN-y-обработанных МСК не предопределяет появление аллостимуляторной активности у МСК [161], что подразумевает существование сложного механизма, необходимого для реализации иммуностимуляторного потенциала МСК.

Способность МСК к фагоцитозу представляется вполне закономерной, если учесть широкую представленность МСК и периваскулярную локализацию этих клеток. Неясной остается последовательность постфагоцитарных событий. Если поглощение биологического материала мезенхимальными клетками приводит к запуску иммунного ответа, то МСК можно классифицировать как альтернативные антигенпрезентирующие

клетки. Действительно, имеются данные, свидетельствующие о подобной возможности и позволившие, по крайней мере, двум независимым группам ученых сформулировать представление о МСК как о новом типе антигенпрезентирующих клеток [49, 195]. Если же фагоцитоз, опосредуемый МСК, является иммунологически инертным событием, это свидетельствует о толерогенных свойствах МСК. В ближайшем будущем, несомненно, появятся новые данные по характеристике фагоцитарного процесса, условий проявления фагоцитарной активности, иммунологических последствий и регуляторных механизмах этой, нетипичной для МСК, функции, что приведет к осмыслению биологической роли способности МСК к фагоцитозу.

Наличие иммуностимуляторных свойств продемонстрировано не только для костномозговых МСК. Сравнительно недавно ТесЬпаи с соавт. было показано, что МСК жировой ткани, дифференцированные в хондрогенном направлении, проявляют одновременно иммуногенный и иммуносупрессорный фенотип. Так, в отличие от недифференцированных клеток, ТОБрЗ-индуцированные МСК уже с 7-го дня культивирования в индукционной среде экспрессировали НЬА-ОЯ, при этом возрастала также экспрессия НЬЛ-в и 1Ь-10 [204].

Подобный функциональный «дуализм» описан и для МСК, полученных из амниотического листка плаценты. В отличие от костного мозга, культуры плацентарных МСК содержат популяции как НЬА-ВЛ-позитивных, так и НЬА-011-негативных клеток, причем клетки обеих популяций не способны стимулировать пролиферативный ответ аллогенных Т-лимфоцитов. В то же время НЬА-ВЯ+ (но не НЬА-ОЯ-) МСК проявляют выраженный стимулирующий эффект в отношении а-СОЗ-стимулированных Т-клеток [137]. Авторы предполагают, что существование субпопуляций МСК с оппозитными свойствами может в какой-то степени объяснить противоречия, нередко встречающиеся при характеристике свойств МСК.

Квинтэссенцией подобных немногочисленных работ можно считать предположение о существовании как минимум двух типов МСК с оппозитными свойствами [221]. Основанием для подобного разделения послужили данные о различных последствиях активации разных toll-like рецепторов (TLRs) на МСК. Так, связывание TLR4 на МСК приводит к появлению популяции МСК, секретирующих преимущественно провоспалительные цитокины (IL-6, IL-8) и стимулирующих ответ активированных Т-клеток. В то же время, при активации TLR3 МСК преимущественно секретируют IL-4, рецепторный антагонист IL-ip, IDO и ПГЕ2, проявляя при этом выраженный супрессорный эффект в отношении активированных Т-лимфоцитов. Авторы обозначили популяцию МСК со стимулирующими свойствами как МСК1, а популяцию супрессорных МСК -МСК2. Дальнейшие исследования в этом направления позволят ответить на вопрос, действительно ли проявление оппозитных свойств является функцией разных типов МСК или отражает многообразие свойств этих клеток в рамках одной и той же популяции.

Сегодня же можно лишь констатировать, что МСК различного тканевого происхождения (костный мозг, жировая ткань) обладают потенциалом для участия в запуске и регуляции иммунного ответа.

1.4 Регуляция функциональной активности МСК

На сегодняшний день одним из важных свойств МСК считают способность этих клеток воспринимать и отвечать на сигналы конкретного микроокружения. В основе отвечаемости МСК лежит экспрессия этими клетками широкого спектра различных рецепторов, что позволило выделить следующие механизмы, регулирующие функционирование МСК: 1) регуляция, опосредованная факторами роста (рецепторы к HGF, PDGFb, FGFb, BMP, TNF и др.); 2) иммунная регуляция (рецепторы к интерлейкинам - IL-4, IL-10, IL-11, IL-13, IL-15, IL-17, IL-20, IL-21, а также TLRs); 3) гормональная регуляция (рецепторы к окситоцину, ангиотензину II,

серотонину, адипонектину, тромбину, эндотелину, лептину, тиреоидному и паратиреоидному гормонам); 4) регуляция, опосредованная нервной системой (адренергические рецепторы al и а2, дофаминовый рецептор D4).

Важная роль семейства факторов роста фибробластов (FGF) обусловлена их вовлеченностью в процессы заживления ран и ангиогенез. Среди прочих членов этого семейства, основной фактор роста фибробластов (FGF-2, или FGF-basic) усиливает пролиферацию МСК кроликов, собак и человека in vitro. При этом митогенный эффект наиболее ярко проявляется в культурах МСК с низкой плотностью и связан со снижением времени удвоения популяции. Поддерживая пролиферативный потенциал МСК, FGF-basic сохраняет на начальных этапах и способность МСК к три-линейной дифференцировке, однако при длительном пассировании МСК сохраняют лишь способность дифференцироваться в хондрогенном направлении [230]. Культивирование МСК в присутствии FGFb приводит к увеличению количества HLA-DR+ МСК. Однако, несмотря на повышение экспрессии HLA-DR, МСК остаются слабо иммуногенными in vitro и эффективно подавляют пролиферативный ответ Т-лимфоцитов в CKJI [203].

Снижение отвечаемости на ростовые факторы наблюдается при старении МСК и объясняется снижением экспрессии рецепторов к ростовым факторам [208].

В настоящее время считается, что эффекты МСК in vivo плейотропны, а проявления их находятся под влиянием микроокружения. Как упоминалось выше, МСК и секретируемые ими молекулы способны подавлять пролиферацию и активацию Т-лимфоцитов, индуцированную митогенами, recall антигенами и аллоантигенами [91, 209, 129, 70, 122, 138, 177]. Считается, что in vitro для реализации супрессорного потенциала МСК требуется активация, что, по-видимому, и происходит с ними in vivo [192]. В качестве активирующих стимулов могут выступать IFN-y, TNF-a, IL-la или IL-1|3, а также TGF-pi [192, 113].

Изменение активности МСК под влиянием определенных факторов микроокружения демонстрирует следующий пример. Известно, что дифференцировка не изменяет супрессорные свойства МСК. Однако, культивирование МСК крыс в среде, содержащей индукторы хондрогенной дифференцировки, приводит к появлению способности стимулировать пролиферацию, созревание и цитотоксическую активность дендритных клеток в отличие от недифференцированных и дифференцированных в остео-и адипогенном направлении МСК. При этом повышение иммуногенности МСК ассоциируется с увеличением экспрессии молекулы В 7 и частично отменяется в присутствии соответствующих нейтрализующих антител [50].

Отдельного внимания заслуживает 1КМу, играющий активную роль в иммуносупрессорных эффектах МСК. В присутствии №N7 МСК начинают продуцировать ПГЕ2 [9] и наблюдается усиление супрессорных свойств МСК [49]. Однако такое действие на МСК наблюдается лишь при больших дозах №N7 (100ед/мл). Наоборот, результатом воздействия низких доз (10ед/мл) №N7 является увеличение экспрессии молекул гистосовместимости I и II класса на МСК человека и мыши [49,195].

Иммунокомпетентные клетки также могут модулировать свойства МСК. Так, по данным ОгоЬ, СБ14+ моноциты периферической крови, продуцируя 1Ь-1Ь, активируют костномозговые МСК к продукции ТвБЬ (но не 1Ь-10), что ведет к подавлению экспрессии активационных маркеров и пролиферации аллогенных Т-лимфоцитов [91].

Многочисленными исследованиями показана также возможность усиления хоминга МСК. Известно, что МСК, как клетки с высоким уровнем экспрессии СХСЯ4 - рецептора к 8БР-1, обладают тропностью к зонам повреждения тканей, где наблюдается повышение концентрации 80Р-1 [29]. Соответственно, один из подходов повышения хомингового потенциала связан с трансдукцией СХСЯ4 с использованием ретровирусного вектора

[29]. Среди других способов усиления хоминга следует упомянуть обработку МСК ТОБа, №№>, копаксоном и КИМ [60, 134].

1.5 Особенности МСК различного тканевого происхождения

Широкое распространение МСК в организме [62] поднимает вопрос об идентичности МСК различного тканевого происхождения. В то же время до сих пор не ясно происхождение стволовых/стромальных клеток в различных тканях взрослого организма: имеют ли эти клетки костномозговое происхождение и мигрируют в ткани для обеспечения тканевого гомеостаза, или предсуществуют в тканях уже на стадии онтогенеза. Помимо фундаментального значения, поиск ответа на этот вопрос важен также с точки зрения расширяющегося клинического использования МСК. В этом аспекте, поиск альтернативных костному мозгу источников МСК является актуальной задачей. Однако, несмотря на активное изучение МСК различных тканей, анализ данных литературы не позволяет сделать однозначного заключения об особенностях функционирования МСК в той или иной ткани, что, в свою очередь, затрудняет выбор оптимального источника МСК для клинического использования с различными целями.

Но прежде чем говорить об особенностях МСК, полученных из различных тканей, необходимо упомянуть о различных условиях, позволяющих получить популяцию МСК из разных тканей. Известно, что генерация МСК из пуповинной крови отличается низкой эффективностью, не превышающей 20-30%. Поиск условий оптимизации культивирования МСК из пуповинной крови показал, что эффективность генерации многократно возрастает в присутствии 1Ь-3 и ОМ-СЗБ, но не БОБЬ, или ЕОБ, или РББВ, являющихся ростовыми для костномозговых МСК. Полученные в таких условиях МСК не отличались от костномозговых аналогов ни по фенотипу, ни по дифференцировочному потенциалу [74].

Одним из наиболее активно изучаемых тканевых источников МСК является жировая ткань. Первые сообщения о присутствии в жировой ткани

человека мультипотентных стромальных клеток появились в 2001 г. [241]. Жировая ткань представляет обильный и доступный источник МСК, которые могут быть получены менее инвазивным методом (при проведении процедуры липоаспирации) и в гораздо больших количествах по сравнению с костным мозгом. Показано, что МСК жировой ткани могут дифференцироваться в остеогенном, адипогенном, хондрогенном, миогенном, а также нейрональном направлении [240].

Сравнительная характеристика МСК костного мозга и жировой ткани, проведенная Bochev с соавт., показала отсутствие значимых различий по морфологии, фенотипу, а также колониеобразующей активности. Однако, имея сравнимую с костномозговыми МСК способность дифференцироваться в адипогенном направлении, МСК жировой ткани в то же время отличались сниженным остеогенным потенциалом. В то же время способность подавлять продукцию Ig B-лимфоцитами была более выраженной именно у жировых МСК [36]. Имея в целом схожий фенотип, МСК костного мозга и ировой ткани могут различаться по экспрессии некоторых маркеров адгезии (CD49d (Integrin а4), CD54 (ICAM-1), CD34 и CD 106 (VCAM-1), которые могут вовлекаться в процессы мобилизации, пролиферации и хоминга гемопоэтических стволовых клеток [66]. Еще одной особенностью Ж-МСК можно считать экспрессию эндотелиально-клеточных маркеров (CD31, CD 144 или VE-cadherin, VEGFR2, фактор von Willebrand) как на клетках стромально-васкулярной фракции, так и на пассированных МСК [146].

В исследовании Уоо авторы сравнили свойства МСК, выделенных их костного мозга, жировой ткани, пуповинной крови и Вартонова студня (основного компонента внеклеточного матрикса пуповины) и показали отсутствие значимых различий по иммуносупрессорной активности, профилю секретируемых цитокинов, экспрессии супрессорных молекул как интактными МСК, так и обработанными IFNg и/или TNFa [232]. Однако в последующих работах неоднократно было показано, что отсутствие

существенных различий в функционировании МСК не отменяет наличие нюансов в проявлении той или иной функции, истинное значение которых еще предстоит выяснить.

Известно, что МСК жировой ткани и костного мозга супрессируют пролиферацию активированных Т-клеток и секрецию провоспалительных цитокинов, и что эта супрессия в значительной степени опосредуется ПГЕ2 [155]. Блокирование синтеза ПГЕ2 индометацином приводит к восстановлению пролиферативного ответа Т-лимфоцитов, но не цитокин-секретирующей активности. Тем не менее, в присутствии индометацина наблюдается повышение экспрессии факторов транскрипции и генов провоспалительных/Thl цитокинов, однако это наблюдается лишь в культурах МСК жировой ткани (но не костномозговых) [231].

Сравнение фенотипических свойств МСК, выделенных из костного мозга и плаценты (амниона и хориона), показали сходный профиль позитивных (CD 105, CD44, CD90, CD 166, HLA-ABC) и негативных маркеров (CD45, АС 133 и HLA-DR). Однако проведение трансмиссионной электронной микроскопии продемонстрировало ультраструктурные различия изучаемых МСК, при этом плацентарные МСК проявляли черты смешанного, эпителиально-мезенхимального «ультраструктурного» фенотипа [162].

В последние годы одним из наиболее активно изучаемых источников МСК является Вартонов студень (Wharton's jelly) - основной компонент внеклеточного матрикса пуповины. Согласно данным Najar с соавт., МСК, полученные из этой ткани, наряду с МСК жировой ткани, отличаются от костномозговых аналогов более мощной иммуносупрессорной активностью в отношении пролиферации активированных различными стимулами Т-лимфоцитов [154], причем эта супрессия связана с секрецией фактора, ингибирующего лейкемию (LIF). Более того, МСК, полученные из Вартонова студня, наиболее эффективно генерируют регуляторные Т-клетки в большом диапазоне доз.

Профиль экспрессируемых ТЬЯб различается у МСК разных тканей. Так, сравнение МСК костного мозга, жировой ткани и Вартонова студня показало, что в условиях воспалительного микроокружения на всех трех типах МСК возрастает экспрессия ТЬЯЗ, в то время как экспрессия ТЬЯ4 увеличивалась только на костномозговых МСК. Однако, в отличие от МСК костного мозга, иммуносупрессивный потенциал МСК, выделенных из Вартонова студня, не изменялся ни при воспалении, ни при связывании ТЬЯб [175].

Согласно данным Апга1опе с соавт, МСК Вартонова студня отличаются экспрессией некоторых маркеров эмбриональных стволовых клеток - №по§ и Ос13/4А, повышенным пролиферативным потенциалом и способностью к дифференцировке в клетки мезо-, эндо- и эктодермальных тканей [13]. Кроме того, эти МСК отличаются повышенной экспрессией генов, связанных с ангиогенезом и ростовым потенциалом (включая ЕСР и БЮ), в то время как костномозговые МСК - экспрессией генов, ассоциированных с остеогенезом (ЯШХ2, ЭЬХ5 и ЫРЯЗ) [102].

Сравнительный анализ линий МСК, генерированных из костного мозга и периферической крови [57], показал, что МСК обоих источников имели фенотип БНЗ+С045-СБ68-СО133 -НЬ А-БК- клеток. В то же время костномозговые МСК отличались повышенной экспрессией СО 105, СБ 10 и С0117, а также щелочной фосфатазы, глютатион 8-трансферазы Р и соШт-1. Культуры МСК периферической крови отличались высоким содержанием СБ34+/СОЮ5+ (1оиЫе-позитивных клеток. Эти результаты свидетельствуют о более выраженной мультипотентности костномозговых МСК, тогда как МСК, выделенные из циркуляции, в большей степени имели черты гемопоэтических клеток.

Использование МСК в клинических целях предполагает сохранение этими клетками своих свойств в организме. Однако факторы конкретного микроокружения, например, при повреждении тканей или в условиях

воспаления, могут существенно влиять на функционирование МСК. При этом МСК, полученные из различных тканевых источников, могут по-разному реагировать на эти факторы. Например, в присутствии и Т№а супрессорный потенциал МСК, выделенных из Вартонова студеня, становится значительно более выраженным по сравнению с костномозговыми МСК [173]. Эта супрессорная активность наиболее выражена в СКЛ (в случае с МСК костного мозга - в митогенстимулированных культурах) и ассоциируется с ранней экспрессией негативной ко-стимуляторной молекулы, СТЬА4, на активированных лимфоцитах, чего не происходит в со-культурах МНК и МСК костного мозга.

1.6 Изменение свойств МСК при патологии

Являются ли МСК при различной патологии «аномальными», нефункциональными - до сих пор не вполне ясно. Хотя имеется, по крайне мере, одна работа, посвященная анализу свойств МСК у больных ревматоидным артритом (РА), авторы которой предполагают, что развитие РА ассоциируется с преждевременным старением МСК [114]. При РА наблюдается усиление пролиферативной активности лимфоцитов и аккумуляция лимфоидных агрегатов в синовии (третичные лимфоидные органы). Логично предположить, что подобные проявления заболевания, по крайне мере, в какой-то степени, обусловлены снижением иммуносупрессорных свойств МСК у больных РА.

По данным ВосЬеу с соавт., у больных АИЗ МСК костного мозга характеризуются сохранной анти-пролиферативной активностью и подавляют а-СБЗ стимулированный ответ аутологичных и аллогенных МНК на 90% [35]. Подобные данные о сохранности фенотипа, пролиферативного и дифференцировочного потенциала, а также иммуносупрессорных свойств МСК у больных системным склерозом описаны также в работе Ьа^Ьего с соавт [124]. Тем не менее в литературе имеются и противоположные данные. Так, по данным КаБ^пак! с соавт, МСК больных с ревматоидным артритом,

в отличие от МСК доноров, отличались сниженным клоногенным и пролиферативным потенциалом, что было сопряжено с потерей длины теломер [114]. Проведенный транскриптомный анализ выявил также снижение экспрессии генов, связанных с процессами адгезии и продвижением по клеточному циклу.

Миелодиспластический синдром (МДС) характеризуется дизрегуляцией гемопоэтических стволовых клеток и иммунными нарушениями. При этом МСК пациентов с МДС отличаются сниженной гемопэзподдерживающей активностью, а также выраженным снижением дифференцировочного потенциала (в адипогенном и нейрогенном направлении) [212]. В отношении иммуносупрессорных свойств МСК при этом заболевании данные противоречивы: имеются сообщения как о сохранной [238], так и о сниженной способности подавлять активацию и пролиферативный ответ Т-клеток [95]. В последнем случае авторы делают вывод о причастности выявленных изменений иммуномодулирующих свойств МСК к развитию нарушений в функционировании ГСК и иммунной системы.

Имеются данные о функциональной неполноценности МСК у больных идиопатической тромбоцитопенией [166].

Согласно данным Х18Ьап с соавт, МСК больных хроническим миелолейкозом имеют сохранную морфологию, фенотип и кариотип, но характеризуются нарушенной иммуносупрессорной активностью [228].

По данным 1л с соавт., у больных множественной миеломой (ММ) значительно снижена иммуносупрессорная активность и остеогенный дифференцировочный потенциал МСК [133]. При этом экспрессия мРНК ТОБ-р1,1Ь-6,1Ь-3, ТЫБ-а и ИАККЪ была значительно повышена у больных ММ.

Анализ исследований, посвященных изучению биологической активности ММСК у больных АА, не позволяет получить завершенное

представление о функционировании этой популяции, как в силу немногочисленности существующих данных, так и вследствие их противоречивости. При этом мнения авторов могут варьировать от постулирования полноценности функций стромальных клеток [159, 120, 237], выявления нарушений одних характеристик ММСК при сохранности других [103, 237], до признания дефектности ММСК [18, 101, 227]. Существует также мнение о наличии дефекта стромы лишь у определенной (небольшой) части больных при отсутствии такового у остальных [78, 103]. В работе Герасимовой Л.П. с соавт. делается заключение о том, что у части больных АА предшественники МСК находятся в активированном состоянии, что проявляется увеличением их концентрации (числа КОЕ-Ф) и размера образуемых ими колоний [1].

По данным Mazzanti, МСК больных множественным склерозом не отличаются от МСК здоровых доноров по пролиферативной активности, фенотипу (включая экспрессию TLRs), дифференцировочному потенциалу in vitro, иммуносупрессорным свойствам. Единственным показателем, по которому были выявлены различия, была продукция IP-10 [142].

По крайней мере, двумя группами исследователей показано, что при остеопорозе активность МСК существенно изменена, что проявляется в нарушении пролиферативного и дифференцировочного (остеогенного) потенциала, при этом изменение остеогенного потенциала МСК играет роль в развитии заболевания [63, 182].

1.7 Клиническое использование МСК

Благодаря иммуномодулирующим свойствам и

гемопоэзподдерживающей способности, МСК в настоящее время рассматриваются в качестве перспективного «средства» в терапии многих заболеваний. Терапевтический потенциал МСК многократно возрастает благодаря способности этих клеток мигрировать в места повреждения/воспаления и участвовать в процессах репарации/регенерации

поврежденных тканей. Действительно, в экспериментальных работах показано, что при любом способе введения - в поврежденный орган, в венозную или артериальную кровь - МСК мигрируют в область тканевого повреждения [136, 2, 3, 107]. Эта миграция осуществляется по градиенту концентрации: в месте повреждения/ воспаления повышается секреция хемокинов 8БР-1, фракталкина, МСР-1 и М1Р-1, что приводит к направленной миграции МСК с высоким уровнем экспрессии СХСЯ4 (рецептора к 8БР-1) и СХЗСШ (рецептора к фракталкину) в поврежденную ткань [76, 189, 220].

В клеточной терапии с использованием МСК различают несколько направлений: поддержка кроветворения и ускорение приживления трансплантата; снижение аллореактивности при трансплантации и уменьшение аутоиммунных конфликтов; репарация и замещение поврежденных тканей.

На сегодняшний день имеются данные об использовании МСК в 1-П фазах клинических испытаний, главной целью которых является оценка безопасности и переносимости инфузий МСК [20, 131, 26, 86]. Необходимо подчеркнуть, что введение МСК является безопасным, о чем свидетельствует отсутствие зарегистрированных побочных эффектов. МСК успешно используются для улучшения приживления ГСК при трансплантациях НЬА-гаплоидентичных, истощенных по Т-клеткам аллографтов [20], а также при трансплантациях клеток пуповинной крови [26], также для лечения тяжелых и рефрактерных форм острой РТПХ [131]. Перспективным является использование МСК в терапии сердечно-сосудистых заболеваний, в частности, хронической сердечной недостаточности [75, 5, 8].

Достойную альтернативу костномозговым МСК представляют МСК, полученные из жировой ткани. Подобно костномозговым аналогам, МСК жировой ткани показали свою эффективность в экспериментальных моделях инсульта, повреждения спинного мозга, сахарного диабета, коллаген-

индуцированных артритах, почечной недостаточности и легочно-сердечных заболеваниях. Так, у животных с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом (модель множественного склероза) МСК мигрируют в ЦНС и, продуцируя FGFb, BDGF и PDGF, индуцируют нейрорегенацию, что приводит к значительному снижению тяжести заболевания [58]. В работе Stocks с соавт. показано, что внутривенно введенные меченые МСК жировой ткани мигрируют в поврежденные ткани в мышиной модели ишемии [197]. В мышиной модели болезни Альцгеймера (трансгенные мыши Tg2576) системно или локально введенные МСК жировой ткани человека обнаруживаются в поврежденных областях гиппокампа. При этом большинство трансплантированных МСК имеют нейрональный, а некоторые их них - глиальный фенотип [199].

Появились первые результаты клинического использования МСК, выделенных из жировой ткани, при проведении косметических и реконструктивных процедур [180, 233, 53], в терапии периферических сосудистых заболеваний [156], артритов [88], инфаркте миокарда [40] и церебральной ишемии [222]. МСК жировой ткани показали свою эффективность в лечении резистентных к обычной терапии перианальных фистул у пациентов с болезнью Крона [86].

Получение клинического эффекта предполагает использование достаточных количеств МСК, что, в свою очередь, подразумевает культивирование МСК in vitro в течение довольно длительного периода. С целью стандартизации процедуры выделения и экспансии МСК, Европейская группа трансплантации крови и костного мозга (ЕВМТ) разработала общий протокол экспансии МСК [130]. Этот протокол постулирует использование предварительно скринированной FCS (10%), и подавляющее большинство клинических данных по эффективности МСК получены именно при использовании МСК, генерированных в присутствии FCS.

Однако использование ex vivo генерированных МСК для клинических целей сопряжено с потенциальным риском проявления иммуногенности этих клеток и образования эктопических очагов. Кроме того, длительное культивирование in vitro может изменять биологические свойства клеток, приводя к накоплению генетических нарушений [26]. В частности, работами Rubio и Rosland показано, что в результате длительной экспансии ex vivo МСК могут подвергаться трансформации [186, 183]. При этом трансформированные МСК проявляют повышенный пролиферативный потенциал, измененную морфологию и иммунофенотип, а также цитогенетические нарушения. При введении иммунодефицитным мышам такие клетки индуцируют образование опухолей. В то же время, трансформированные МСК не экспрессировали CD90 [183], что свидетельствует о возможном мезенхимально-эпителиальном переходе [185]. В недавней работе французских ученых показано, что в процессе экспансии МСК могут появляться хромосомные повреждения (например, анеуплоидия), однако такие МСК не несут каких-либо признаков трансформации (с-шус, р53, р21). Авторы делают вывод о том, что анеуплоидия, эпизодически встречающаяся в процессе экспансии МСК, является отражением старения клеток, но не злокачественной трансформации [203]. Эти данные послужили обоснованием для возобновления временно приостановленных клинических испытаний МСК во Франции. В этом же номере Blood было опубликовано письмо группы авторов (Almici С. et al) в ответ на статью Tarte с соавт. Согласно представленным авторами письма данным, несмотря на исходно нормальный кариотип 7 образцов костномозговых МСК доноров, в 2 препаратах МСК на первом пассаже наблюдались делеции, которые спонтанно элиминировались при дальнейшем пассировани (до 5-го пассажа). Авторы делают вывод о преходящем характере нестабильности хромосом, связанной с процессом экспансии in vitro.

Особенностью последнего десятилетия можно считать быстрое «продвижение» исследований МСК от работ in vitro к испытаниям на экспериментальных моделях и, наконец, к рандомизированным клиническим испытаниям. Несмотря на трудности идентификации МСК, на сегодняшний день достигнут определенный консенсус в отношении методологии культивирования и характеристики МСК. Понимание механизмов действия МСК также эволюционировало от первоначально господствовавшего положения о трансдифференцировке этих клеток до предположения об эффектах МСК на эндогенные прогениторные клетки и обеспечении/создании противовоспалительного микроокружения. Клиническое использование МСК сегодня охватывает широкий круг заболеваний, причем не прекращается выявление новых источников МСК. Тем не менее, остаются задачи, требующие пристального внимания и скорейшего решения, среди которых следует упомянуть настоятельную потребность в адекватных преклинических моделях, информативных клинических испытаниях, получении клеток в соответствии с GMP, а также объективный анализ отдаленных исходов клинических испытаний [213].

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Шевела, Екатерина Яковлевна

ВЫВОДЫ

1. МСК костного мозга (КМ-МСК), жировой (Ж-МСК) и плацентарной (П-МСК) ткани обладают схожей морфологией, иммунофенотипом и способны к билинейной дифференцировке, однако различаются по количеству клоногенных прекурсорсоров и пролиферативному потенциалу. Так, по сравнению с костным мозгом ядросодержащие клетки жировой ткани содержат большее количество КОЕ-Ф, а популяция П-МСК отличается большим содержанием относительно мелких клеток (<20 мкм), большим выходом клеток из одного клоногенного прекурсора и наименьшим временем удвоения клеточной популяции.

2. МСК различного тканевого происхождения обладают сходной гемопоэзпод держивающей активностью, в равной степени стимулируя образование КОЕ-Э и КОЭ-ГМ в культурах костно-мозговых клеток, но различаются по выраженности супрессорной активности, о чем свидетельствует более высокая ингибирующая активность П-МСК (по сравнению с КМ-МСК и Ж-МСК) в смешанной культуре лимфоцитов.

3. МСК различного тканевого происхождения обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения (через продукцию G-CSF, GM-CSF, ЕРО), иммуномодуляции (через продукцию IFN-y, IL-2, IL-6, IL-lb, TNF-a и хемокинов - IL-8, МСР-1, М1Р-1Ь) и стимуляции репаративных процессов (через продукцию VEGF, FGF-basic, IGF-1, IL-6, ММР-9, TIMP-1). При этом Ж-МСК отличаются наиболее выраженной спонтанной продукцией провоспалительных (IL-lb, TNF-a), иммунорегуляторных (IFN-y, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-lb) и гемопоэзстимулирующих (G-CSF, GM-CSF) медиаторов, но отличаются более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции.

4. Костномозговые мононуклеарные клетки при патологии отличаются сниженным содержанием клоногенных прекурсоров МСК, наиболее выраженным у больных лимфомами и АИЗ, и в меньшей степени - у больных ЦП и ММ. При этом выявленная внутригрупповая гетерогенность больных ЦП и АА по количеству КОЕ-Ф является новым признаком патогенетической разнородности данных заболеваний.

5. Увеличение времени генерации КМ-МСК in vitro, независимо от исходного количества клоногенных предшественников, а также снижение количества «дочерних» клеток, генерируемых одной КОЕ-Ф, свидетельствует о нарушении пролиферативного потенциала МСК у больных ЦП, АИЗ и гемобластозами.

6. В отличие от МСК здоровых доноров, МСК при патологии способны ингибировать пролиферативный ответ активированных Т-лимфоцитов только при высоких количествах МСК, тогда как низкие дозы МСК не влияют (при ЦП), либо усиливают (у больных АИЗ и гемобластозами) пролиферативную активность Т-клеток, что свидетельствует о значительном снижении иммуносупрессорных свойств и появлении иммуностимуляторной активности МСК при ряде патологий.

7. Супрессорная активность МСК при большинстве исследуемых патологий не коррелирует с продукцией NO, HLA-G, IL-10 или экспрессией IDO, однако в значительной степени (на 42%) снижается при обработке МСК индометацином, а у больных АА существенно блокируется при нейтрализации активности IDO, что свидетельствует об универсальной и значительной роли ПГЕ2 в реализации супрессорного потенциала МСК при различных патологиях и сохранности IDO-опосредованного механизма супрессорной активности МСК при АА.

8. Добавление основного фактора роста фибробластов (FGFb) на этапе генерации МСК у больных гемобластозами и воспалительными заболеваниями сопровождается сокращением сроков культивирования, увеличением выхода клеток, а также возрастанием числа МСК в S/G2M фазе клеточного цикла, что свидетельствует о способности FGFb корригировать исходно сниженную пролиферативную активность МСК при патологии.

9. Усиление пролиферативной активности МСК в присутствии FGFb сопровождается повышением супрессорного и остеогенного потенциала МСК доноров и больных хроническими воспалительными заболеваниями (АИЗ, ЦП), однако не влияет на супрессорную и дифференцировочную активность МСК больных гемобластозами, что свидетельствует о различной чувствительности МСК к действию FGFb при разных патологиях.

10. Наличие сопряженности между усилением пролиферации МСК (при обработке FGFb) и восстановлением супрессорного и остеогенного потенциала при воспалительных заболеваниях и отсутствие подобной зависимости при гемобластозах свидетельствует о существовании двух типов функциональных нарушений МСК - зависимом и не зависимом от их пролиферативной активности.

11. Использование низких доз МСК (в диапазоне от 0,01 до 1,1 х106 клеток/кг) при совместной трансплантации с аутологичными ГСК у больных гемобластозами позволяет сократить сроки критической нейтро- и тромбоцитопении, приводит к более эффективному раннему восстановлению лимфоцитов, более активной реконституции CD4+ лимфоцитов за счет наивных CD4+ Т-клеток и не оказывает стимулирующего влияния на генерацию регуляторных Т-клеток.

12. Совместное использование МСК и ГСК является безопасным, поскольку не приводит к увеличению частоты возникновения рецидивов и/или ухудшению показателей выживаемости больных геобластозами, и при этом позволяет повысить клиническую эффективность трансплантации аутологичных ГСК за счет снижения частоты развития тяжелых инфекционных осложнений (мукозитов, энтеропатий) и более эффективного купирования ПХТ-индуцированной токсической нефропатии.

Список литературы диссертационного исследования доктор медицинских наук Шевела, Екатерина Яковлевна, 2013 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Герасимова Л.П., Дризе Н.И., Лубкова О.Н., и др. Нарушение стромального микроокружения у больных с различными заболеваниями системы крови // Гематол. и трансфузиол. - 2008. - Т. 53, п. 5. - С. 59-62.

2. Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева X. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю., Семернин Е. Н., Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. Терапия экспериментального инфаркта миокарда у крыс с помощью трансплантации сингенных мезенхимных стволовых клеток // Цитология. - 2004. - Т. 46, п. 12. - С. 1043-1054.

3. Кругляков П. В., Соколова И. Б., Аминева X. К., Некрасова Н. Н., Вийде С. В., Чередниченко Н. Н., Зарицкий А. Ю., Семернин Е. Н., Кислякова Т. В., Полынцев Д. Г. Влияние сроков трансплантации мезенхимных стволовых клеток на репарацию сердечной мышцы крыс после инфаркта // Цитология. -2005. - Т. 47, п. 5. - С. 400-411.

4. Останин A.A., Петровский Я.Л., Шевела Е.Я., Курганова Е.В., Дробинская А.Н., Добрякова О.Б., Лисукова Е.В., Черных Е.Р. Новый подход к оценке остеогенного потенциала мезенхимальных

стромальных клеток // Клеточные технологии в биологии и медицине.-2008.-№4.-С. 219-226.

5. Рахмат-Заде Т.М., Скридлевская Е.А., Самойленко JI.E., Бугрий М.Е., Коноплянников А.Г., Колесникова А.И., Трипольская JI.B., Веселова Т.Н., Синицин В.Е., Сергиенко В.Б., Акчурин Р.С. Изучение влияния интрамиокардиальной имплантации стволовых клеток на перфузию и сократительную функцию миокарда у больных ишемической болезнью сердца с постинфарктным кардиосклерозом и хронической сердечной недостаточностью // Вестник рентгенологии и радиологии. - 2006. - №5. - Стр. 9-14.

6. Румянцев А.Г., Масчан А. А. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток у детей // М.: МИА. - 2003.

7. Терминология, используемая в практике клеточных технологий. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2006. - Т. 4, № 6.-С. 6-8.

8. Цыб А.Ф., Коноплянников А.Г., Каплан М.А., Поповкина О.Е., Лепехина Л.А., Кальсина С.Ш., Семенкова И.В., Агаева Е.В., Даниленко А.А. Использование системной трансплантации кардиомиобластов, полученных из мезенхимальных стволовых клеток аутологичного костного мозга, при комплексной терапии больных с хронической сердечной недостаточностью // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2009. - Т. 4, № 1. - Стр. 7884.

9. Aggarwal S., Pittenger M.F. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses // Blood. - 2005. - Vol. 105. - P. 18151822.

10. Aleksandrova M.A., Sukhikh G.T., Chailakhyan R.K., et al. Comparative analysis of differentiation and behavior of human neural and mesenchymal stem cells in vitro and in vivo // Bull Exp Biol Med. - 2006. - Vol. 141. -P. 152-160.

11. Alsalameh S., Amin R., Gemba Т., Lotz M. Identification of mesenchymal progenitor cells in normal and osteoarthritic human articular cartilage // Arthritis Rheum. - 2004. - Vol. 5. - P. 1522-1532.

12. Angelopoulou M., Novelli E., Grove J.E., et al. Co-transplantation of human mesenchymal stem cells enhances human myelopoiesis and megakaryocytopoiesis in NOD/SCID mice // Exp Hematol. - 2003. - Vol. 31, №5.. p. 413-420.

13. Anzalone R, Lo Iacono M, Corrao S, et al. New emerging potentials for human Wharton's jelly mesenchymal stem cells: immunological features and hepatocyte-like differentiative capacity // Stem Cells Dev. - 2010. - V. 19,N4.-P. 423-438.

14. Appelbaum F. The current status of hematopoietic cell transplantation // Annu Rev Med. - 2003. - Vol. 54. - P. 491.

15. Ashton B.A., Allen T.D., Howlett C.R., et al. Formation of bone and cartilage by marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo // Clin

Orthop Relat Res. - 1980. - Vol. 151. - P. 294-307.

16. Augello A., Tasso R., Negrini S.M., Amateis A., Indiveri F., Cancedda R., Pennesi G. Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death 1 pathway // Eur J Immunol. - 2005. - Vol. 35. - P. 1482-1490.

17. Bab I., Ashton B.A., Gazit D., et al. Kinetics and differentiation of marrow stromal cells in diffusion chambers in vivo // J Cell Sci. - 1986. - Vol. 84. -P. 139-151.

18. Bacigalupo A., Valle M., Podesta M., et al. T-cell suppression mediated by mesenchymal stem cells is deficient in patients with severe aplastic anemia // Exp Hematol. - 2005. - Vol. 33, n. 7. - P. 819-827.

19. Baddoo D., Hill K„ Wilkinson R., Gaupp D., Hughes C., Kopen G.C., Phinney D.G. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from bone-marrow by negative selection // J Cell Biochem. - 2003. - Vol. 89. -P. 1235-1249.

20. Ball L.M., Bernardo M.E., Roelofs H, et al. Co-transplantation of ex vivo-expanded mesenchymal stem cells accelerates lymphocytes recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation // Blood. - 2007. - V.l 10. - P. 2764-2767.

21. Barda-Saad M., Rozenszajn L.A., Globerson A., Zhang A.S., Zipori D. Selective adhesion ofimmature thymocytes to bone marrowstromal cells: relevance toTcell lymphopoiesis // Exp Hematol. - 1996. - Vol. 24. - P. 386-391.

22. Barry F.P., Boynton R.E., Haynesworth S., et al. The monoclonal antibody SH-2, raised against human mesenchymal stem cells, recognizes an epitope on endoglin (CD 105) // Biochem. Biophys. Res. Com. // 1999. - Vol. 265, № l.-P. 134-139.

23. Battiwalla M., Hematti P. Mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation // Cytotherapy. - 2009. - Vol. 11, n 5.- P. 503-515.

24. Beer A.E., Sio J.O. Placenta as an immunological barrier // Biol Reprod. -1982.-Vol. 26.-P. 15-27.

25. Bernardo M.E., Ball L.M., Cometa A.M., Roelofs H., Zecca M., Avanzini M.A., Bertaina A., Vinti L., Lankester A., Maccario R., Ringden O., Le Blanc K., Egeler R.M., Fibbe W.E., Locatelli F. Co-infusion of ex vivo expanded, parental mesenchymal stromal cells prevents life-threatening acute GvHD, but does not reduce the risk of graft failure in pediatric patients undergoing allogeneic umbilical cord blood transplantation // Bone Marrow Transplant. - 2011. - V. 46. - P. 200-207.

26. Bernardo M.E., Cometa A.M., Pagliara D., Vinti L., Rossi F., CristantielJi R., Palumbo G., Locatelli F. Ex vivo expansion of mesenchymal stromal cells // Best Pract Res Clin Haematol. - 2011. - V. 24, N 1. - P. 73-81.

27. Beyer M., Schultze J.L. Regulatory T cells in cancer // Blood. - 2006. -Vol. 108, n. 3. - P. 804-811.

28. Beyth S., Borovsky Z., Mevorach D., et al. Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness

// Blood. - 2005. - Vol. 105. - P. 2214-2219.

29. Bhakta S., Hong P., Koc O. The surface adhesion molecule CXCR4 stimulates mesenchymal stem cell migration to stromal cell-derived factor-1 in vitro but does not decrease apoptosis under serum deprivation // Cardiovasc Revasc Med. - 2006. - Vol. 7. - P. 19-24.

30. Bianchi G., Banfi A., Mastrogiacomo M., Notaro R., Luzzatto L., Cancedda R., Quarto R. Ex vivo enrichment of mesenchymal stem cell progenitors by fibroblast growth factor 2 // Exp Cell Res. - 2003. - Vol. 287. - P. 98-105.

31. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., et al. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications // Stem Cells. - 2001. -Vol. 19.-P. 180-192.

32. Bieback K., Kern S., Kliiter H. et al. Critical parameters for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord blood // Stem cells. - 2004. -Vol. 22.-P. 625-634.

33. Blazsek I., Delmas Marsalet B., Legras S., et al. Large-scale recovery and characterization of stromal cell associated primitive haemopoietic progenitor cells from filter retained human bone marrow // Bone Marrow Transplant. - 1999. - Vol. 23. - P. 647-657.

34. Bocelli-Tyndall C, Bracci L, Schaeren S, Feder-Mengus C, Barbero A, et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells and chondrocytes promote and/or suppress the in vitro proliferation of lymphocytes stimulated by interleukins 2, 7 and 15 // Ann Rheum Dis. - 2009. - Vol. 68. -P. 1352-1359.

35. Bocelli-Tyndall C, Bracci L, Spagnoli G, et al. Bone marrow mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) from healthy donors and auto-immune disease patients reduce the proliferation of autologous- and allogeneic-stimulated lymphocytes in vitro // Rheumatology (Oxford). - 2007. - V. 46, N 3. - P. 403-408.

36. Bochev I., Elmadjian G., Kyurkchiev D., et al. Mesenchymal stem cells from human bone marrow or adipose tissue differently modulate mitogen-stimulated B-cell immunoglobulin production in vitro // Cell Biol Int. -2008. - V. 32, N 4. - P. 384-393.

37. Bruder S.P., Jaiswal N., Haynesworth S.E. Growth kinetics, selfrenewal, and the osteogenic potential of purified human mesenchymal stem cells during extensive subcultivation and following cryopreservation // J Cell Biochem. - 1997. - Vol. 64. - P.278-294.

38. Buhring H.J., Battula V.L., Trml S., Schewe B., Kanz L., Vogel W. Novel markers for the prospective isolation of human MSC // Annu N Y Acad Sci. -2007.-Vol. 1106.-P. 262-271.

39. Buhring H.J., Treml S., Cerabona F., de Zwart P., Kanz L., Sobiesiak M. Phenotypic characterization of distinct human bone-marrow-derived MSC Subsets // Annu N Y Acad Sci. - 2009. - Vol. 1176. - P. 124-134.

40. Cai L., Johnstone B.H., Cook T.G., Tan J., Fishbein M.C., Chen P.S., March K.L. Human adipose tissue-derived stem cells induce angiogenesis and nerve sprouting following myocardial infarction, in conjunction with

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50,

51.

52,

53,

54,

potent preservation of cardiac function // Stem Cells. - 2009. - Vol. 27. -P. 230-237.

Campioni D., Lanza F., Moretti S. et al. Functional and immunophenotypic characteristics of isolated CD105(+) and fibroblast(+) stromal cells from AML: implications for their plasticity along endothelial lineage // Cytotherapy. - 2003. - Vol. 5, N 1. - P. 66—79.

Campioni D., Moretti S., Ferrari L. et al. Immunophenotypic heterogeneity of bone marrow-derived mesenchymal stromal cells from patients with hematologic disorders: correlation with bone marrow microenvironment // Haematologica. - 2006. - Vol. 91, № 3. - P. 364—368. Caplan A.I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine // J Cell Physiol. - 2007. - Vol. 213. - P. 341-347. Caplan A.I. The mesengenic process // Clin Plast Surg. - 1994. - Vol. 21. -P. 429-435.

Caplan A.I., Dennis J.E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators // J Cell Biochem. - 2006. - Vol. 98. - P. 1076-1084.

Cappellesso-Fleury S., Puissant-Lubrano B., Apoil P.A., et al. Human fibroblasts share immunosuppressive properties with bone marrow mesenchymal stem cells // J Clin Immunol. - 2010. - V. 30, N 4. - P. 607619.

Carlo-Stella C., Tabilio A., Regazzi E. et al. Effect of chemotherapy for acute myelogenous leukemia on hematopoietic and fibroblast marrow progenitors // Bone Marrow Transplant. - 1997. - Vol. 20. - P. 465—471. Castro-Malaspina H., Gay R.E., Resnick G., et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny // Blood. - 1980. - Vol. 56, № 2. - P. 289-301. Chan J.L., Tang K.C., Patel A.P., Bonilla L.M., Pierobon N., Ponzio N.M., Rameshwar P. Antigen-presenting property of mesenchymal stem cells occurs during a narrow window at low levels of interferon-gamma // Blood. -2006.-Vol. 107.-P. 4817^4824.

Chen X., McClurg A., Zhou G. Q. et al. Chondrogenic differentiation alters the immunosuppressive property of bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and the effect is partially due to the upregulated expression of B7 molecules // Stem Cells. - 2007. - V. 25. - P. 364-370. Chen X.D., Qian H.Y., Neff L., et al. Thy-1 antigen expression by cells in the osteoblast lineage // J Bone Miner Res. - 1999. - Vol. 14. - P. 362-375. Cheng L., Qasba P., Vanguri P., Thiede M.A. Human mesenchymal stem cells support megakaryocyte and pro-platelet formation from CD34(+) hematopoietic progenitor cells // J Cell Physiol. - 2000. - Vol. 184. - P. 5869.

Cherubino M., Marra K.G. Adipose-derived stem cells for soft tissue reconstruction // Regen Med. - 2009. - Vol. 4. - P. 109-117. Chichester C.O., Fernandez M., Minguell JJ. Extracellular matrix gene expression by human bone marrow stroma and by marrow fibroblast // Cell Adhes Commun. - 1993. - Vol. 1. - P. 93-99.

55. Colter D.C., Sekiya I., Prockop D.J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2001. - Vol. 98. - P. 78417845.

56. Conget P. A., Minguell J.J. Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells // J Cell Physiol. - 1999. - Vol. 181.-P. 67-73.

57. Conrad C., Zeindl-Eberhart E., Moosmann S., Nelson P.J., Bruns C.J., Huss R. Alkaline phosphatase, glutathione-S-transferase-P, and cofilin-1 distinguish multipotent mesenchymal stromal cell lines derived from the bone marrow versus peripheral blood // Stem Cells Dev. - 2008. - Vol. 17, n.l.-P. 23-27.

58. Constantin G., Marconi S., Rossi B., Angiari S., Calderan L., Anghileri E., Gini B., Bach S.D., Martinello M., Bifari F., Galie M., Turano E., Budui S., Sbarbati A., Krampera M., Bonetti B. Adipose-derived mesenchymal stem cells ameliorate chronic experimental autoimmune encephalomyelitis // Stem Cells. - 2009. - Vol. 27. - P. 2624-2635.

59. Corcione A., Benvenuto F., Ferretti E., et al. Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions // Blood. - 2006. - Vol. 107. - P. 367-372.

60. Croitoru-Lamoury J., Lamoury F.M., Zaunders J.J. et al. Human mesenchymal stem cells constitutively express chemokines and chemokine receptors that can be upregulated by cytokines, IFN-beta, and Copaxone // J Interferon Cytokine Res. - 2007. - Vol. 27. - P. 53-64.

61. Da Silva Meirelles L., Caplan A.I., Nardi N.B. In search of in vitro identity of mesenchymal stem cells // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 22872299.

62. Da Silva Meirelles L., Chagastelles P.C., Nardy N.B. Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues // Journal of Cell Science. - 2006. - Vol. 119. - P. 2204-2213.

63. Dalle Carbonare L., Valenti M.T., Zanatta M., Donatelli L., Lo Cascio V. Circulating mesenchymal stem cells with abnormal osteogenic differentiation in patients with osteoporosis // Arthritis Rheum. - 2009. -Vol. 60.-P. 3356-3365.

64. Dazzi F., Ramasamy R., Glennie S, Jones S.P., Roberts I. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis // Blood Reviews. - 2006. - Vol. 20. - P. 161-171.

65. de Mos M., Koevoet W.J., Jahr H., Verstegen M.M., Heijboer M.P., Kops N., van Leeuwen J.P., Weinans H., Verhaar J.A., van Osch G.J. Intrinsic differentiation potential of adolescent human tendon tissue: an in-vitro cell differentiation study // BMC Musculoskelet Disord. - 2007. - Vol. 8. - P. 16.

66. De Ugarte D.A., Morizono K., Elbarbary A. Comparison of multi-lineage cells from human adipose tissue and bone marrow // Cells Tissues Organs. -2003.-Vol. 174, №3.-P. 101-109.

67,

68.

69,

70,

71,

72,

73,

74,

75

76

77,

78

79,

80,

Deans R.J., Moseley A.B. Mesenchymal stem cells: biology and potential clinical uses // Exp Hematol. - 2000. - Vol. 28. - P. 875-884. Dennis J.E., Caplan A.I. Analysis of the developmental potential of conditionally immortal marrow-derived mesenchymal progenitor cells isolated from the H-2Kb-tsA58 transgenic mouse. // Connect Tissue Res. -1996.-Vol. 35.-P. 93-99.

Dennis J.E., Merriam A., Awadallah A., et al. A quadripotential mesenchymal progenitor cell isolated from the marrow of an adult mouse // J Bone Miner Res. - 1999. - Vol. 14. - P. 700-709.

Di Nicola M., Carlo-Stella C., Magni M., Milanesi M., Longoni P.D., Matteucci P., Grisanti S., GianniA.M. Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli // Blood. - 2002. - Vol. 99. - P. 3838-3843. Digirolamo C.M., Stokes D., Colter D., et al. Propagation and senescence of human marrow stromal cells in culture: A simple colony-formaing assay identifies samples with the greatest potential to propagate and differentiate // Br J Haematol. - 1999. - Vol. 107. - P. 275-281.

Dominici M., Le Blanc K., Mueller I., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement // Cytotherapy. - 2006. - Vol. 8, № 4. -P. 315-317.

Erices A., Conget P., Minguell J.J. Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood // Br J Haematol. - 2000. - Vol. 109. - P. 235-242. Fan X., Liu T., Liu Y., Ma X., Cui Z. Optimization of primary culture condition for mesenchymal stem cells derived from umbilical cord blood with factorial design // Biotechnol Prog. - 2009. - Vol. 25, n.2. - P. 499507.

Fazel S., Tang G.H., Angoulvant D., Cimini M., Weisel R.D., Li R.-K., Yau T.M. Current status of cellular therapy for ischemic heart disease // Ann Thorac Surg. - 2005. - Vol. 79, n. 6. - P. 2238-2247. Feng J., He A., Dheen S., Tay S. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired site in the brain after hypoglossal nerve injury // Stem Cells. -2004. - Vol. 22. - P. 415-427.

Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M., et al. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors // Science. - 1998. - Vol. 279. -P. 1528-1530.

Fouillard L., Bensidhoum M., Bories D., et al. Engraftment of allogeneic mesenchymal stem cells in the bone marrow of a patient with severe idiopathic aplastic anemia improves stroma // Leukemia. - 2003. - Vol. 17. _P. 474-476.

Friedenstein A.J., Gorskaja J.F., Kulagina N.N. Fibroblast precursors in normal and irradiated mouse hematopoietic organs // Exp Hematol. - 1976. -Vol. 4, №5.-P. 267-274.

Friedenstein A.J., Lalykina K.S. Thymus cells are inducible to osteogenesis

81.

82,

83

84

85

86

87

88

89

90

91

92

93

94,

// Eur J Immunol. - 1972. - Vol. 6. - P. 602-606.

Friedenstein AJ, Chailakhjan RK, Lalykina KS: The development of fibroblast colonies in monolayer cultures of guinea-pig BM and spleen cells // Cell Tissue Kinet. - 1970. - Vol. 3. - P. 393^103.

Frumento G., Rotondo R., Tonetti M., et al. Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase // J Exp Med. - 2002. - Vol. 196. -P. 459-468.

Fukuchi Y., Nakajima H., Sugiyama D. Human Placenta-Derived Cells Have Mesenchymal Stem/Progenitor Cell Potential // Stem Cells. - 2004. -Vol. 22.-P. 649-658.

Galotto M., Berisso G., Delfino L., et al. Stromal damage as consequence of high-dose chemo/radiotherapy in bone marrow transplant recipients // Exp Hematol. - 1999. - Vol. 27. - P. 1460-1466.

Gang E.J., Bosnakovski D., Figueiredo C.A., et al. SSEA-4 identifies mesenchymal stem cells from bone marrow // Blood. - 2007. - Vol. 109, № 4.-P. 1743-1751.

Garcia-Olmo D., Garcia-Arranz M., Herreros D, et al. A phase I clinical trial of the treatment of Crohn's fistula by adipose mesenchymal stem cell transplantation // Dis Colon Rectum. - 2005 - V. 48. - P. 1416-1423. Glennie S., Soeiro I., Dyson D.J., et al. Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells // Blood. - 2005. -Vol. 105.-P. 2821-2827.

Gonzalez M.A., Gonzalez-Rey E., Rico L., Buscher D., Delgado M. Treatment of experimental arthritis by inducing immune tolerance with human adipose-derived mesenchymal stem cells // Arthritis Rheum. - 2009. -Vol. 60.-P. 1006-1019.

Gordan L.N., Sugrue M.W., Lynch J.W., et al. Correlation of early lymphocyte recovery and progression-free survival after autologous stem-cell transplant in patients with Hodgkin's and non-Hodgkin's lymphoma // Bone Marrow Transplant. - 2003. - Vol. 31. - P. 1009-1013. Gotherstrom C., Ringden O., Tammik C., Zetterberg E., Westgren M., Le Blanc K. Immunologic properties of human fetal mesenchymal stem cells // Am J Obstet Gynecol. - 2004. - Vol. 190. - P. 239-245. Groh M.E., Maitra B., Szekely E., K09 O.N. Human mesenchymal stem cells require monocyte-mediated activation to suppress alloreactive T cells // Exp Hematol. - 2005. - V. 33, Issue 8. - P. 928-934. Gronthos S., Franklin D.M., Leddy H.A., Robey P.G., Storms R.W., Gimble J.M. Surface protein characterization of human adipose tissue-derived stromal cells // J Cell Physiol. - 2001. - Vol. 189. - P. 54-63. Gupta P., Blazar B.R., Gupta K., Verfaillie C.M. Human CD34(+) bone marrow cells regulate stromal production of IL-6 and G-CSF and increase the colony-stimulating activity of stroma // Blood. - 1998. - Vol. 91, N 10. -P. 3724—3733

Han Q, Sun Z, Liu L, et al. Impairment in immuno-modulatory function of

Flk 1 (+)CD31 (-)CD34(-) MSCs from MDS-RA patients // Leuk Res. -2007. - V. 31, N 11.-P. 1469-1478.

95. Haniffa M.A., Wang X.N., Holtick U., et al. Adult human fibroblasts are potent immunoregulatory cells and functionally equivalent to mesenchymal stem cells // J Immunol. - 2007. - V. 179, N 3. - P. 1595-1604.

96. Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I. Cell surface antigens on human marrow-derived mesenchymal cells are detected by monoclonal antibodies // Bone. - 1992. - Vol. 13. - P. 69-80.

97. Haynesworth S.E., Baber M.A., Caplan A.I. Cytokine expression by human marrow-derived mesenchymal progenitor cells in vitro: Effects of dexamethasone and IL-1 alpha // J Cell Physiol. - 1996. - Vol. 166. - P. 585-592.

98. Hegde S., Pahne J., Smola-Hess S., et al. Novel immunosuppressive properties of interleukin-6 in dendritic cells: inhibition of NF-kappaB binding activity and CCR7 expression // The Faseb Journal. - 2004. - Vol. 18.-P. 1439-1441.

99. Hegner B., Weber M., Dragun D., et al. Differential regulation of smooth muscle markers in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells // J Hypertens. -2005. - Vol. 23. - P. 1191-1202.

100. Hicok K.C., Thomas T., Gori F., et al. Development and characterization of conditionally immortalized osteoblast precursor cell lines from human bone marrow stroma // J Bone Miner Res. - 1998. - Vol. 13. - P. 205-217.

101. Hirata J., Umemura T., Kaneko S., et al. Difference of bone marrow adipocyte colony-forming capacity between aplastic anemia and iron deficiency anemia // Leukemia Res. - 1988. - Vol. 12, n. 2. - P. 179-183.

102. Hsieh JY, Fu YS, Chang SJ, et al. Functional module analysis reveals differential osteogenic and sternness potentials in human mesenchymal stem cells from bone marrow and Wharton's jelly of umbilical cord // Stem Cells Dev.-2010.-V. 19, N 12.-P. 1895-1910.

103. Huang Y.L., Huang S.L., Huang K., Cai Y. Biological characteristics of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and their relationship with immunosuppressive therapy in children with aplastic anemia // Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. - 2008. - Vol. 10, n. 1. - P. 9-13.

104. Hwa Cho H., Bae Y.C., Jung J.S. Role of toll-like receptors on human adipose-derived stromal cells // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - P. 27442752.

105. Itoi M., Tsukamoto N., Yoshida H., Amagai T. Mesenchymal cells are required for functional development of thymic epithelial cells // Int Immunol. - 2007. - Vol. 19. - P. 953-964.

106. Janicki P., Boeuf S., Steck E., Egermann M., Kasten P., Richter W. Prediction of in vitro bone forming potency of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells // Eur Cells Materials. - 2011. - Vol. 21. - P. 488507.

107. Ji J., He B., Dheen S., Tay S. Interactions of chemokines and chemokine receptors mediate the migration of mesenchymal stem cells to the impaired

site in the brain after hypoglossal nerve injury // Stem Cells. - 2004. - Vol. 22.-P. 415-427.

108. Jones E.A., English A., Kinsey S.E., Straszynski L., Emery P., Ponchel F., McGonagle D. Optimization of a flow cytometry-based protocol for detection and phenotypic characterization of multipotent mesenchymal stromal cells from human BM // Cytometry B Clin Cytom. - 2006. - Vol. 70.-P. 391-399.

109. Jones E., McGonagle D. Human bone marrow mesenchymal stem cells in vivo // Rheumatology. - 2008. - Vol. 47. - P. 126-131.

110. Joyner C.J., Bennett A., Triffitt J.T. Identification and enrichment of human osteoprogenitor cells by using differentiation stage-specific monoclonal antibodies. // Bone. - 1997. - Vol. 21, № 1. - P. 1-6.

111. Kadiyala S., Young R.G., Thiede M.A., Bruder S.P. Culture expanded canine mesenchymal stem cells possess osteochondrogenic potential in vivo and in vitro // Cell Transplant. - 1997. - Vol. 6. - P. 125-134.

112. Kagawachi N., Kazuhiro T., Nicodemou-Lena E., et al. De novo adipogenesis in mice at site of injection of basement membrane and basic fibroblasts growth factor // Proc Natl Acad Sci USA. - 1998. - Vol. 95. - P. 1062-1066.

113. Karlsson H., Samarasinghe S., Ball L.M., Sundberg B., Lankester A.C., et al. Mesenchymal stem cells exert differential effects on alloantigen- and virus-specific T-cell responses // Blood. - 2008. - Vol. 112. - P. 532-541.

114. Kastrinaki MC, Sidiropoulos P, Roche S, et al. Functional, molecular and proteomic characterisation of bone marrow mesenchymal stem cells in rheumatoid arthritis // Ann Rheum Dis. - 2008. - V. 67, N 6. - P. 741-749.

115. Kern S., Eichler H., Stoeve J., Kluter H., Bieback K. Comparative Analysis of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, or Adipose Tissue // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - P. 1294-1301.

116. Kim J., Hematti P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages // Exp Hematol. - 2009. - Vol. 37.-P. 1445-1453.

117. Klein G. The extracellular matrix of the hematopoietic microenvironment // Experientia. - 1995. - Vol. 51. - P. 914-926.

118. Koc O.N., Gerson S.L., Cooper B.W. et al. Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of autologous-blood stem cells and culture expanded marrow mesenchymal stem cells in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy // J Clin Oncol. - 2000. - Vol. 18. - P. 307-316.

119. Koc O.N., Peters C., Aubourg P., et al. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells remain host-derived despite successful hematopoietic engrafitment after allogeneic transplantation in patients with lysosomal and peroxisomal storage diseases // Exp Hematol. - 1999. - Vol. 27. - P. 16751681.

120. Kojima S., Matsuyama T., Kodera Y. Plasma levels and production of soluble stem cell factor by marrow stromal cells in patients with aplastic

anemia // Br. J. Haematol. - 1997. - Vol. 99, n. 2. - P. 440-446.

121. Korbling M., Katz R.L., Khanna A., Ruifrok A.C., Rondon G., Albitar M., et al. Hepatocytes and epithelial cells of donor origin in recipients of peripheral-blood stem cells // N Engl J Med. - 2002. - Vol. 346. - P. 738 -746.

122. Krampera M., Glennie S., Dyson J., Scott D., Laylor R., Simpson E., Dazzi F. Bone marrow mesenchymal stem cells inhibit the response of naive and memory antigen-specific T cells to their cognate peptide // Blood. - 2003. -Vol. 101.-P. 3722-3729.

123. Kuznetsov S.A., Friedenstein A.J., Robey P.G. Factors required for bone marrow fibroblast colony formation in vitro // Br J Haematol. - 1997. -Vol. 97.-P. 561-570.

124. Larghero J, Farge D, Braccini A, et al. Phenotypical and functional characteristics of in vitro expanded bone marrow mesenchymal stem cells from patients with systemic sclerosis // Ann Rheum Dis. - 2008. - V. 67, N 4. -P.443-449.

125. Larsen K.H., Frederiksen C.M., Burns J.S., Abdallah B.M., Kassem M. Identifying a molecular phenotype for bone marrow stromal cells with in vivo bone-forming capacity // J Bone Miner Res. - 2010. - Vol. 25. - P. 796-808.

126. Lazarus H.M., Haynesworth S.E., Gerson S.L. et al. Ex vivo expansion and subsequent infusion of human bone marrow derived stromal progenitor cells (mesenchymal progenitor cells): implications for therapeutic use // Bone Marrow Transplant. - 1995. - Vol. 16. - P. 557-564.

127. Le Blanc K., Rasmusson I., Sundberg B., et al. Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells // Lancet. - 2004. - Vol. 363. - P. 1439-1441.

128. Le Blanc K., Samuelsson H., Gustafsson B. et al. Transplantation of mesenchymal stem cells to enhance engraftment of hematopoietic stem cells // Leukemia. - 2007. - Vol. 21, n. 8. - P. 1733-1738.

129. Le Blanc K., Tammik L., Sundberg B., Haynesworth S.E., Ringden O. Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex // Scand J Immunol. - 2003. - Vol. 57. - P. 11-20.

130. Le Blank K., Fibbe W. A new cell therapy registry coordinated by the European Group for Blood and Marrow Transplantation EBMT) // Bone Marrow Transplant. - 2008. - V. 41. - P. 319-321.

131. Le Blank K., Frassoni F., Ball L., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of steroid-resistant, severe, acute graft-versus-host disease: a phase II study // Lancet. - 2008. - V. 371. - P. 1579-1586.

132. Lee K.D., Kuo T.K., Whang-Peng J., Chung Y.F., Lin C.T., Chou S.H., et al. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells // Hepatology. - 2004. - Vol. 40. - P. 1275 - 1284.

133. Li B., Fu J., Chen P., Zhuang W. Impairment in Immunomodulatory Function of Mesenchymal Stem Cells from Multiple Myeloma Patients //

Archives of Medical Research . - 2010. - V. 41, Issue 8. - P. 623-633.

134. Li Y, Yu X, Lin S et al. Insulin-like growth factor 1 enhances the migratory capacity of mesenchymal stem cells // Biochem Biophys Res Commun. -2007. - Vol. 356. - P. 780-784.

135. Lindner U., Kramer J., Rohwedel J., Schlenke P. Mesenchymal Stem or Stromal Cells: Toward a Better Understanding of Their Biology? // Transfus Med Hemother. - 2010. - Vol. 37. - P. 75-83.

136. Lu D., Li Y., Wang L., Chen J., Mahmood A., Chopp M. 2001. Intraarterial administration of marrow stromal cells in a rat model of traumatic brain injury // J Neurotrauma. - 2001. - Vol. 18. - P. 813-819.

137. Magatti M., De Munari S., Vertua E., Gibelli L., Wengler G.S., Parolini O. Human amnion mesenchyme harbors cells with allogeneic T-cell suppression and stimulation capabilities // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26, n. l.-P. 182-192.

138. Majumdar M.K., Keane-Moore M., Buyaner D., Hardy W.B., Moorman M.A., et al. Characterization and functionality of cell surface molecules on human mesenchymal stem cells // J Biomed Sci. - 2003. - Vol. 10. - P. 228-241.

139. Majumdar M.K., Thiede M.A., Mosca J.D., et al. Phenotypic and functional comparison of cultures of marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) and stromal cells // J Cell Physiol. - 1998. - Vol. 176. - P. 57-66.

140. Martinez C., Hofmann T.J., Marino R., et al. Human bone marrow mesenchymal stromal cells express the neural ganglioside GD2: a novel surface marker for the identification of MSCs // Blood. - 2007. - Vol. 109. -P. 4245-4248.

141. Mazo I.B., Honczarenko M., Leung H., Cavanagh L.L., Bonasio R., Weninger W., Engelke K., Xia L., McEver R.P., Koni P.A., Silberstein L.E., von Andrian U.H. Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells // Immunity. - 2005. - Vol. 22.-P. 259-270.

142. Mazzanti B., Aldinucci A., Biagioli T., Barilaro A., Urbani S., Dal Pozzo S., Amato M.P., Siracusa G., Crescioli C., Manuelli C., Bosi A., Saccardi R., Massacesi L., Ballerini C. Differences in mesenchymal stem cell cytokine profiles between MS patients and healthy donors: Implication for assessment of disease activity and treatment // J Neuroimmunol. - 2008. -V. 199, Issues 1-2.-P. 142-150.

143. Meisel R., Zibert A., Laryea M., Gobel U., Daubener W., Dilloo D. Human bone marrow stromal cells inhibit allogeneic T-cell responses by indoleamine 2,3-dioxygenasemediated tryptophan degradation // Blood. -2004.-Vol. 103.-P. 4619-4621.

144. Milne C.D., Fleming H.E., Zhang Y., Paige C.J. Mechanisms of selection mediated by interleukin-7, the preBCR, and hemokinin-1 during B-cell development // Immunol Rev. - 2004. - Vol. 197. - P. 75-88.

145. Minguell J.J. Is hyaluronic acid the "organizer" of the extracellular matrix in marrow stroma? // Exp Hematol. - 1993. - Vol. 21. - P. 7-8.

146. Mitchell J.B., Mcintosh K., Zvonic S., Garrett S., Floyd Z.E., Kloster A., Halvorsen Y.D., Storms R.W., Goh B., Kilroy G., Wu X., Gimble J.M. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers // Stem Cells. - 2006. -Vol. 24.-P. 376-385.

147. Mitra D.K., Singh H.P., Singh M., et al. Reconstitution of naive T cells and type 1 function after autologous peripheral stem cell transplantation: impact on the relapse of original cancer // Transplantation. - 2002. - Vol. 73, № 8. -P. 1336-1339.

148. Miyake K., Medina K.L., Hayashi S., et al. Monoclonal antibodies to Pgp-1/CD44 block lympho-hemopoiesis in long-term bone marrow cultures // J Exp Med. - 1990. - Vol. 171, № 2. - P. 477-488.

149. Mueller L.P., Luetzkendorf J., Mueller T. et al. Presence of mesenchymal stem cells in human bone marrow after exposure to chemotherapy: evidence of resistance to apoptosis induction // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24.-P. 2753—2765.

150. Muguruma Y., Yahata T., Miyatake H. et al. Reconstitution of the functional human hematopoietic microenvironment derived from human mesenchymal stem cells in the murine bone marrow compartment // Blood. - 2006. - Vol. 107. - P. 1878—1887.

151. Muraglia A., Cancedda R., Quarto R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. // J Cell Sei. - 2000. - Vol. 113. - P. 1161-1166.

152. Nagai Y., Garrett K.P., Ohta S., et al. Toll-like receptors on hematopoietic progenitor cells stimulate innate immune system replenishment // Immunity. - 2006. - Vol. 24. - P. 801-812.

153. Najar M., Raicevic G., Boufker H.I., Stamatopoulos, De Bruyn C., Meuleman N., Bron D., Toungouz M., Lagneaux L. Modulated expression of adhesion molecules and galectin-1: Role during mesenchymal stromal cell immunoregulatory functions // Exp Hematol. - 2010. - V. 38, Issue 10. -P. 922-932.

154. Najar M., Raicevic G., Boufker H.I., et al. Adipose-tissue-derived and Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells suppress lymphocyte responses by secreting leukemia inhibitory factor // Tissue Eng Part A. — 2010. - V.16, N. 11.-P. 3537-3546.

155. Najar M., Raicevic G., Boufker H.I., et al. Mesenchymal stromal cells use PGE2 to modulate activation and proliferation of lymphocyte subsets: Combined comparison of adipose tissue, Wharton's Jelly and bone marrow sources // Cell Immunol. - 2010. - V. 264, N 2. - P. 171-179.

156. Nakagami H., Maeda K., Morishita R., Iguchi S., Nishikawa T., Takami Y., Kikuchi Y., Saito Y., Tamai K., Ogihara T., Kaneda Y. Novel autologous cell therapy in ischemic limb disease through growth factor secretion by cultured adipose tissue-derived stromal cells // Arterioscler Thromb Vase Biol. - 2005. - Vol. 25. - P. 2542-2547.

157. Nauta A.J., Kruisselbrink A.B., Lurvink E., et al. Mesenchymal stem cells

inhibit generation and function of both CD34+-derived and monocyte-derived dendritic cells // The Journal of Immunology. - 2006. - Vol. 177. -P. 2080-2087.

158. Ning H., Yang F., Jiang M., et al. The correlation between co-transplantation of mesenchymal stem cells and higher recurrence rate in hematologic malignancy patients: outcome of a pilot clinical study // Leukemia. - 2008. - Vol. 22. - P. 593-599.

159. Nishimura J., Ware R.E., Burnette A., et al. The Hematopoietic defect in PNH is not due to defective stroma but is due to defective progenitor cells // Blood Cells, Molecules, and Diseases. - 2002. - Vol. 29, n. 2. - P. 159167.

160. O'Flaherty E., Sparrow R., Szer J. Bone marrow stromal function from patients after bone marrow transplantation // Bone Marrow Transplant. -1995.-Vol. 15.-P. 207-212.

161. Oh W., Kim D.S., Yang Y.S., Lee J.K. Immunological properties of umbilical cord blood-derived mesenchymal stromal cells // Cell Immunol. -2008.-Vol. 251, n. 2.-P. 116-123.

162. Pasquinelli G., Tazzari P., Ricci F., Vaselli C., Buzzi M., Conte R., Orrico C., Foroni L., Stella A., Alviano F., Bagnara G.P., Lucarelli E. Ultrastructural characteristics of human mesenchymal stromal (stem) cells derived from bone marrow and term placenta // Ultrastruct Pathol. - 2007. -Vol. 31,n.l.-P. 23-31.

163. Peggs K.S., Verfuerth S., Pizzey A., et al. Reconstitution of T-cell repertoire after autologous stem cell transplantation: Influence of CD34 selection and cytomegalovirus infection // Biol Blood Marrow Transplant. -2003. - Vol. 9, № 3. - P. 198-205.

164. Peister A., Mellad J.A., Larson B.L., Hall B.M., Gibson L.F., Prockop DJ. Adult stem cells from bonemarrow (MSCs) isolated from different strains of inbredmice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential // Blood. - 2004. - Vol. 103. - P. 1662-1668.

165. Pereira R.F., Halford K.W., O'Hara M.D., et al. Cultured adherent cells from marrow can serve as long-lasting precursor cells for bone, cartilage, and lung in irradiated mice // Proc Natl Acad Sci USA. - 1995. - Vol. 92. -P. 4857-4861.

166. Perez-Simon J.A., Tabera S., Sarasquete M.E., Diez-Campelo M., Canchado J., et al. Mesenchymal stem cells are functionally abnormal in patients with immune thrombocytopenic purpura // Cytotherapy. - 2009. -Vol. 11.-P. 698-705.

167. Pevsner-Fischer M., Levin S., Zipori D. The Origins of Mesenchymal Stromal Cell Heterogeneity // Stem Cell Rev and Rep. - 2011. -Vol. 7. - P. 560-568.

168. Pevsner-Fischer M., Morad V., Cohen-Sfady M., et al. Toll-like receptors and their ligands control mesenchymal stem cell functions // Blood. - 2007. -Vol. 109.-P. 1422-1432.

169. Phinney D. G., Kopen G., Righter W., Webster S., Tremain N., Prockop D.

J. Donor variation in the growth properties and osteogenic potential of human marrow stromal cells // J Cell Biochem. - 1999. - Vol. 75. - P. 424436.

170. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells // Science. - 1999. - Vol. 284. - P. 143-147.

171. Porrata L.F., Litzow M.R., Inwards D.J., et al. Infused peripheral blood autograft absolute lymphocyte count correlates with day 15 absolute lymphocyte count and clinical outcome after autologous peripheral hematopoietic stem cell transplantation in non-Hodgkin's lymphoma // Bone Marrow Transplant. - 2004. - Vol. 33. - P. 291-298.

172. Potian J.A., Aviv H., Ponzio N.M., Harrison J.S., Rameshwar P. Veto-like activity of mesenchymal stem cells: functional discrimination between cellular responses to alloantigens and recall antigens // J Immunol. - 2003. -Vol. 171.-P. 3426-3434.

173. Prasanna SJ, Gopalakrishnan D, Shankar SR, et al. Pro-inflammatory cytokines, IFNgamma and TNFalpha, influence immune properties of human bone marrow and Wharton jelly mesenchymal stem cells differentially // PLoS One. - 2010. - V. 5, N 2/ - e9016.

174. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues // Science. - 1997. - Vol. 276, № 5309. - P.71-74.

175. Raicevic G., Najar M., Stamatopoulos B., De Bruyn C., Meuleman N., Bron D., Toungouz M., Lagneaux L. The source of human mesenchymal stromal cells influences their TLR profile as well as their functional properties // Cell Immunol. - 2011. - Vol. 270, n. 2. - P. 207-216.

176. Rasmusson I., Ringden O., Sundberg B., Le Blanc K. Mesenchymal stem cells inhibit lymphocyte proliferation by mitogens and alloantigens by different mechanisms // Exp Cell Res. - 2005. - Vol. 305. - P. 33-41.

177. Rasmusson I., Ringden O., Sundberg B., Le Blanc K. Mesenchymal stem cells inhibit the formation of cytotoxic T lymphocytes, but not activated cytotoxic T lymphocytes or natural killer cells // Transplantation. - 2003. -Vol. 76.-P. 1208-1213.

178. Reese J.S., Koc O.N., Gerson S.L. Human mesenchymal stem cells provide stromal support for efficient CD34+ transduction // J Hematother Stem Cell Res. - 1999. - Vol. 8. - P. 515-523.

179. Ren G, Zhao X, Zhang L, et al. Inflammatory cytokine-induced intercellular adhesion molecule-1 and vascular cell adhesion molecule-1 in mesenchymal stem cells are critical for immunosuppression // J Immunol. — 2010. - V. 184, N 5. - P. 2321-2328.

180. Rigotti G., Marchi A., Galie M., Baroni G., Benati D., Krampera M., Pasini A., Sbarbati A. Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant: a healing process mediated by adipose-derived adult stem cells // Plast Reconstr Surg. - 2007. - Vol. 119. - P. 1409-1422.

181. Rodriguez A.M., Elabd C., Amri E.Z., Ailhaud G., Dani C. The human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Biochemie. - 2005. -

Vol. l.-P. 125-128.

182. Rodriguez J.P., Garat S., Gajardo H., Pino A.M., Seitz G. Abnormal osteogenesis in osteoporotic patients is reflected by altered mesenchymal stem cell dynamics // J Cell Biochem. - 1999. - Vol. 75. - P. 414^123.

183. Rosland G.V., Svendsen A., Torsvik A, et al. // Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation // Cancer Res. - 2009. - V. 69, N 13. -P.5331-5339.

184. Roufosse C.A., Direkze N.C., Otto W.R., Wright N.A. Circulating mesenchymal stem cells // Int J Biochem Cell Biol. - 2004. - Vol. 36. - P. 585-597.

185. Rubio D., Garcia S., De la Cueva T., et al. Human mesenchymal stem cell transformation is associated with a mesenchymal-epithelial transition // Exp Cell Res. - 2008. - V. 314, N 4. - P. 691-698.

186. Rubio D., Garcia-Castro J., Martin M.C., et al. Spontaneous human adult cell transformation // Cancer Res. - 2005. - V. 65. - P. 3035-3039.

187. Ruiz C., Pérez E., García-Martínez O., et al. Expression of cytokines IL-4, IL-12, IL-15, IL-18, and IFN-y and modulation by different growth factors in cultured human osteoblast-like cells // J Bone Miner Metab. - 2007. -Vol. 25, №5.-P. 286-292.

188. Sekiya I., Larson B., Smith J.R., et al. Expansion of human adult stem cells from bone marrow stroma: conditions that maximize the yields of early progenitors and evaluate their quality // Stem Cells. - 2002. - Vol. 20. - P. 530-541.

189. Shichinohe H., Kuroda S., Yano S., Hida K., Iwasaki Y. Role of SDF-1/CXCR4 system in survival and migration of bone marrow stromal cells after transplantation into mice cerebral infarct // Brain Res. - 2007. - Vol. 1183.-P. 138-147.

190. Siena S., Dregni M., Brando B. et al. Circulation of CD34+ haemopoietic stem cells in the peripheral blood of high-dose cyclophosphamide-treated patients: enhancment by intravenous recombinant human granulocyte-macrophage colonystimulating factor // Blood. - 1989. - Vol. 74, n, 6. - P. 1905—1914.

191. Simmons P.J., Torok-Storb B. Identification of stromal cell precursors in human bone marrow by a novel monoclonal antibody, Stro-1 // Blood. -1991.-Vol. 78.-P. 55-62.

192. Singer N.G., Caplan A.I. Mesenchymal Stem Cells: Mechanisms of Inflammation // Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. - 2011. - Vol. 6. - P. 457478.

193. Sionov R.V., Yagel S., Har N.R., Gallily R. Trophoblasts protect the inner cell mass from macrophage destruction // Biol Reprod. - 1993. - Vol. 49. -P. 588-595.

194. Stagg J., Galipeau J. Immune Plasticity of Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells // In: Bone Marrow-Derived Progenitors, Eds. Kauser K. and Zeiher A.-M. - Springer, 2007. - P. 45-67.

195. Stagg J., Pommey S., Eliopoulos N., Galipeau J. Interferon-gamma-stimulated marrow stromal cells: a new type of nonhematopoietic antigen-presenting cell // Blood. - 2006. - Vol. 107. - P. 2570-2577.

196. Steck E., Bertram H., Abel R., et al. Induction of invertebral disc-like cells from adult mesenchymal stem cells // Stem Cells. - 2005. - Vol. 23. - P. 403-411.

197. Stocks B.T., Bailey A.M., Peirce S.M. Tracking injected adipose-derived stem cells in vivo using a novel murine model of muscle ischemia // IF ATS. - 2009. - Abstracts.

198. Stolzing A., Jones E., McGonagle D., et al. Age-related changes in human bone marrow-derived mesenchymal stem cells: Consequences for cell therapies // Mech Ageing Dev. - 2008. - Vol. 129, № 3. - P. 163-173.

199. Suh Y.-H., Chang K.-A., Kim S. Study for development of cell therapy for Alzheimer's disease using adipose-derived stem cells // IF ATS. - 2009. — Abstracts.

200. Sun B., Zhang X., Wang G., Kong Q., Mu L, Wang J., Zhang S, Liu Y, Li R., Liu L., Tian Y., An Y., Li H. Regulation of suppressing and activating effects of mesenchymal stem cells on the encephalitogenic potential of MBP68-86-specific lymphocytes // J Neuroimmunol. - 2010 - V. 226, Issues 1-2.-P. 116-125.

201. Suniara R.K., Jenkinson E.J., Owen J.J.T. An essential role for thymic mesenchyme in early T cell development // J Exp Med. - 2000. - Vol. 191, n. 6.-P. 1051-1056.

202. Tamir A., Petrocelli T., Stetler K., et al. Stem cell factor inhibits erythroid differentiation by modulating the activity of Gl-cyclin-dependent kinase complexes: A role for p27 in erythroid differentiation coupled G1 arrest // Cell Growth Differ. - 2000. - Vol. 11. - P. 269-277.

203. Tarte K., Gaillard J., Lataillade J.-J., Fouillard L., Becker M., Mossafa H., Tchirkov A., Rouard H., Henry C., Splingard M., Dulong J., Monnier D., Gourmelon P., GorinN.-C., Sensebe L. Clinical-grade production of human mesenchymal stromal cells: occurrence of aneuploidy without transformation//Blood.-2010.-V. 115, N8.-P. 1549-1553.

204. Technau A., Froelich K., Hagen R., Kleinsasser N. Adipose tissue-derived stem cells show both immunogenic and immunosuppressive properties after chondrogenic differentiation // Cytotherapy. - 2011. - Vol. 13, n. 3. - P. 310-317.

205. Tomchuck S. L., Zwezdaryk K. J., Coffelt S. B. Toll-like receptors on human mesenchymal stem cells drive their migration and immunomodulating responses // Stem Cells. - 2008. - Vol. 26. - P. 99-107.

206. Torlakovic E., Tenstad E., Funderud S., Rian E. CD10+ stromal cells form B-lymphocyte maturation niches in the human bone marrow // J Pathol. — 2005. - Vol. 205. - P. 311-317.

207. Traktuev D.O., Merfeld-Clauss S., Li J., Kolonin M., Arap W., Pasqualini R., Johnstone B.H., March K.L. A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers,

reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks // Circ Res. - 2008. - Vol. 102. - P. 77-85.

208. Tran KT, Rusu SD, Satish L, Wells A. Aging-related attenuation of EGF receptor signaling is mediated in part by increased protein tyrosine phosphatase activity // Exp Cell Res. - 2003. - V. 289. - P. 359-367.

209. Tse W.T., Pendleton J.D., Beyer W.M., Egalka M.C., Guinan E.C. Suppression of allogeneic T-cell proliferation by human marrow stromal cells: implications in transplantation // Transplantation. - 2003. - Vol. 75. -P. 389-397.

210. Tzankov A., Meier C., Hirschmann P. et al. Correlation of high numbers of intratumoral FOXP3+ regulatoiy T cells with improved survival in germinal center-like diffuse large B-cell lymphoma, follicular lymphoma and classical Hodgkin's lymphoma // Haematologica. - 2008. - Vol. 32, n. 2.-P. 193-200.

211. van Poll D., Parekkadan B., Borel Rinkes I.H.M., et al. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Protection and Repair of Injured Vital Organs // Cellular and Molecular Bioengineering. - 2008. - Vol. 1, № 1. - P. 42-50

212. Varga G., Kiss J., Varkonyi J., et al. Inappropriate Notch activity and limited mesenchymal stem cell plasticity in the bone marrow of patients with myelodysplasia syndromes // Pathol Oncol Res. - 2007. - Vol. 13, № 4.-P. 311-319.

213. Viswanathan S. and Keating A. Mesenchymal Stromal Cells: Latest Advances // Tissue Engineering in Regenerative Medicine. - Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Part 1. - 2011. - P. 53-74.

214. Vogel W., Grunebach F., Messam C.A., et al. Heterogeneity among human bone marrow-derived mesenchymal stem cells and neural progenitor cells // Haematologica. - 2003. - Vol. 88. - P. 126-133.

215. Wada N, Menicanin D, Shi S, et al. Immunomodulatory properties of human periodontal ligament stem cells // J Cell Physiol. - 2009. - V. 219, N3.-P. 667-676.

216. Wada N., Bartold P.M., Gronthos S. Human foreskin fibroblasts exert immunomodulatory properties by a different mechanism to bone marrow stromal/stem cells // Stem Cells Dev. - 2011. - V. 20, N 4. - P. 647-659.

217. Wagner W., Roderburg C., Wein G., et al. Molecular and Secretory Profiles of Human Mesenchymal Stromal Cells and Their Abilities to Maintain Primitive Hematopoietic Progenitors // Stem Cells. - 2007. - Vol. 25. - P. 2638-2647.

218. Wan Tso G.H., Wai Law H.K., Tu W., et al. Phagocytosis of apoptotic cells modulates mesenchymal stem cells osteogenic differentiation to enhance IL-17 and RANKL expression on CD41 T cells // Stem Cells. - 2010. -Vol. 28.-P. 939-954.

219. Wang Q.R., Yan Z.J., Wolf N.S. Dissecting the hematopoietic microenvironment VI. The effects of several growth factors on the growth of murine bone marrow CFU-F // Exp Hematol. - 1990. - Vol. 18. - P. 341-347.

220,

221,

222,

223,

224,

225,

226

227,

228,

229,

230,

231,

232.

233.

Wang Y., Deng Y., Zhou G. SDF-lalpha/CXCR4-mediated migration of systemically transplanted bone marrow stromal cells towards ischemic brain lesion in a rat model // Brain Res. - 2008. - Vol. 1195. - P. 104-112. Waterman R.S., Tomchuck S.L., Henkle S.L., Betancourt A.M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: polarization into a proinflammatory MSC1 or an immunosuppressive MSC2 phenotype // PloS ONE. - 2010. - Vol. 5, n. 4: el0088. - doi:10.1371.

Wei X., Du Z., Zhao L., Feng D., Wei G., He Y., Tan J., Lee W.H., Hampel H., Dodel R., Johnstone B.H., March K.L., Farlow M.R., Du Y. IF ATS collection: The conditioned media of adipose stromal cells protect against hypoxia-ischemia-induced brain damage in neonatal rats // Stem Cells. -2009. - Vol. 27. - P. 478-488.

Welter J.F., Solchaga L.A., Penick K.J. Simplification of aggregate culture of human mesenchymal stem cells as a chondrogenic screening assay // Biotechniques. - 2007. - Vol. 42. - P. 732-737.

Williams K., Hakim F.T., Gress R.E. T cell immune reconstitution following lymphodepletion // Semin Immunol. - 2007.- Vol. 19, № 5.- P. 318-330.

Woodbury D, Schwarz EJ, Prockop DJ, Black IB. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons // J Neurosci Res. -2000. - Vol. 61. - P. 364 - 370.

Wu X., Miyake K., Medina K.L., et al. Recognition of murine integrin beta 1 by a rat anti-stromal cell monoclonal antibody // Hybridoma. - 1994. -Vol. 13, №5.-P. 409-416.

Wu Y., Yu J., Zhang L., et al. Hematopoiesis support of mesenchymal stem cells in children with aplastic anemia // Zhongguo Dang Dai Er Ke Za Zhi. - 2008. - Vol. 10, n. 4. - P. 455-459.

Xishan Z, Guangyu A, Yuguang S, et al. The research on the immunomodulatory defect of mesenchymal stem cell from Chronic Myeloid Leukemia patients // J Exp Clin Cancer Res. - 2011. - 47. Yamazaki M., Nakajima F., Ogasawara A., et al. Spatial and temporal distribution of CD44 and osteopontin in fracture callus // J Bone Joint Surg Br. - 1999. - Vol. 81. - P. 508-515.

Yanada S, Ochi M, Kojima K, Sharman P, Yasunaga Y, Hiyama E. Possibility of selection of chondrogenic progenitor cells by telomere length in FGF-2-expanded mesenchymal stromal cells // Cell Prolif. - 2006. - V. 39.-P. 575-584.

Yanez R, Oviedo A, Aldea M, et al. Prostaglandin E2 plays a key role in the immunosuppressive properties of adipose and bone marrow tissue-derived mesenchymal stromal cells // Exp Cell Res 2010 Nov 15; 316(19) :3109-23

Yoo KH, Jang IK, Lee MW, et al. Comparison of immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from adult human tissues // Cell Immunol. - 2009. - V. 259, N 2. - P. 150-156. Yoshimura K., Sato K., Aoi N., Kurita M., Inoue K., Suga H., Eto H., Kato

H., Hirohi Т., Harii К. Cell-assisted lipotransfer for facial lipoatrophy: efficacy of clinical use of adipose-derived stem cells // Dermatol Surg. -2008. - Vol. 34. - P. 1178-1185.

234. Young R.G., Butler D.L., Weber W., et al. Use of mesenchymal stem cells in a collagen matrix for Achilles tendon repair // J Ortho Res. - 1998. -Vol. 16.-P. 406-413.

235. Zannettino A.C., Paton S., Arthur A., Khor F., Itescu S., Gimble J.M., Gronthos S. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo // J Cell Physiol. -2008. - Vol. 214. - P. 413-421.

236. Zappia E., Casazza S., Pedemonte E., et al. Mesenchymal stem cells ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis inducing T-cell anergy//Blood.-2005.-Vol. 106.-P. 1755-1761.

237. Zhang Y.Z., Da W.M. In vitro biological characteristics of mesenchymal stem cells from patients with myelodysplastic syndrome and their support to Hematopoiesis // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. - 2005. - Vol. 13, n. 5.-P. 839-842.

238. Zhang YZ, DA WM, Huang WR, et al. [Bone marrow mesenchymal stem cells derived from patients with myelodysplastic syndrome possess immunosuppressive activity] // Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. -2007. - V. 15, N 2. - P. 302-305.

239. Zhao Z, Tang X, You Y, et al. Assessment of bone marrow mesenchymal stem cell biological characteristics and support hemotopoiesis function in patients with chronic myeloid leukemia // Leuk Res. - 2006. - V. 30, N 8. -P. 993-1003.

240. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P, De Ugarte D.A., Huang J.I., Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells // Mol Biol Cell. - 2002. - Vol. 13. -P. 4279-4295.

241. Zuk P.A., Zhu M., Mizuno H., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: Implications for cell-based therapies // Tissue Eng. - 2001. - Vol. 7. -P. 211-228.

242. Новая медицинская технология «Использование совместной трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобластозах и аутоиммунных заболеваниях» (ФС№2008/014 от 30 января 2008 г.).