Исследование экспрессии гранзима В в CD4?-лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга

Дроков, Михаил Юрьевич

Исследование экспрессии гранзима В в CD4?-лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.21, кандидат наук Дроков, Михаил Юрьевич

Дроков, Михаил Юрьевич
кандидат наук
2014

Специальность ВАК РФ14.01.21

Количество страниц 125

Дроков, Михаил Юрьевич. Исследование экспрессии гранзима В в CD4?-лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга: дис. кандидат наук: 14.01.21 - Гематология и переливание крови. Москва. 2014. 125 с.

Оглавление диссертации кандидат наук Дроков, Михаил Юрьевич

Список используемых сокращений...............................................................................6

Введение...........................................................................................................................8

Актуальность темы..........................................................................................................8

Цель исследования...........................................................................................................9

Задачи исследования.......................................................................................................9

Научная новизна............................................................................................................10

Практическая значимость работы................................................................................10

Основные положения, выносимые на защиту............................................................10

Глава 1: Обзор литературы...........................................................................................12

1. Реконституция Т-клеточного звена как ключевой фактор у пациентов с гемобластозами после трансплантации аллогенного костного мозга......................12

1.2 История вопроса......................................................................................................12

1.3 Иммунофенотипические характеристики Т клеточного звена иммунной системы...........................................................................................................................13

1.4 Реконституция Т клеточного звена иммунной системы.....................................16

1.5 Реконституция CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов...........................................20

1.6 Реконституция CD4+ субпопуляции Т-лимфоцитов...........................................22

1.7 Реконституция Т-регуляторных клеток.................................................................23

1.8 Реконституция НК-клеток......................................................................................24

1.9 Реконституция Т-клеточного звена при трансплантации от родственного донора..............................................................................................................................25

1.10 Реконституция Т-клеточного звена при трансплантации от неродственного донора..............................................................................................................................26

1.11 Реконституция Т-клеточного звена при трансплантации костного мозга после Т-клеточной деплеции...................................................................................................27

1.12 Реконституция Т-клеточного звена при трансплантации пуповинной крови. 28

1.13 Толерантность при трансплантации аллогенного костного мозга и стволовых

клеток крови...................................................................................................................29

1.14 Реакция трансплантат против хозяина................................................................32

1.15 Реакция трансплантат против лейкоза................................................................33

1.16 Реконституция Т-клеточного звена и влияния трансфузии лимфоцитов донора на нее..................................................................................................................33

1.17 Влияние кондиционирования и иммуносупрессивных агентов на реконституцию Т-клеточного звена............................................................................34

1.18 Подходы к ускорению Т-клеточной реконституции.........................................36

1.19 Гранзим В...............................................................................................................38

Глава 2. Материалы и методы......................................................................................41

2.1. Клиническая характеристика больных.................................................................41

2.2. Схемы предтрансплантационного кондиционирования, используемые у больных, включенных в исследование........................................................................42

2.3 Схемы профилактики острой реакции трансплантат против хозяина (препараты, дозы, дни введения).................................................................................43

2.4. Объем исследования и временной регламент......................................................44

2.5 Проточная цитометрия............................................................................................46

2.5.1 Пробоподготовка при определении уровня экспрессии внутриклеточного гранзима В и FoxP3 в различных субпопуляциях лимфоцитов................................47

2.5.2 Определение доли и экспрессии внутриклеточного гранзима В в различных субпопуляциях лимфоцитов.........................................................................................49

2.5.3 Пробоподготовка при определении различных субпопуляций Т лимфоцитов с использованием метода «лизис без отмывки».........................................................51

2.6 Статистический анализ данных..............................................................................53

Глава 3. Результаты исследования и обсуждение......................................................55

3.1 Клинические результаты.........................................................................................55

3.2 Особенности оценки экспрессии гранзима В и его доли в популяции СЭ4+ лимфоцитов, а также субпопуляции Т-регуляторных СВ4+СБ25Ь'811 клеток..........60

3.3 Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в СБ4+ и С04+С025Н1ёЬ клетках периферической крови у больных до проведения трансплантации костного мозга и в контрольной группе здоровых доноров.........62

3.4 Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в СЭ4+ и С04+СВ25Ь'8Ь субпопуляциях лимфоцитов периферической крови у больных в зависимости от диагноза до проведения трансплантации костного мозга..............65

3.5 Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в С04+ и С04+С025ЫёЬ клетках в популяциях периферической крови при реконституции донорской иммунной системы у больных с различными нозологиями после трансплантации аллогенного костного мозга...........................68

3.6 Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в С04+ и СВ4+СВ25ь'ёЬ клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга от родственного и неродственного донора..............................................................................................................................72

3.7 Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в СЭ4+ и СБ4+СВ25Ь1ёЬ клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга с кондиционированием в миелоаблативном режиме и режиме пониженной интенсивности..........................76

3.8 Изменение характеристики интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в СБ4+ и СВ4+СВ25Ь'§Ь клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга с использованием циклофосфамида в качестве индуктора толерантности..............................................................................80

3.9 Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в С04+ и С04+СВ25Ь1ёЬ клетках периферической крови у больных, у которых диагностирована острой реакции трансплантат против хозяина.............................81

3.10 Характеристика интенсивности экспрессии гранзима В и его доли в СЭ4+ и СВ4+СВ25ь'ё|1 клетках периферической крови у больных после трансплантации аллогенного костного мозга с цитомегаловирусной инфекцией и без нее............87

3.11 Результаты исследования субпопуляций Т лимфоцитов у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга и введении мезенхимальных стромальных клеток в качестве профилактики острой реакции трансплантат

против хозяина...............................................................................................................89

3.12 Коэффициент соотношения СБ4\С08 клеток у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга до введения мезенхимальных стромальных клеток и в контрольной группе здоровых доноров............................93

Глава 4. Заключение......................................................................................................95

Выводы:..........................................................................................................................98

Список литературы........................................................................................................99

Приложение..................................................................................................................113

Список используемых сокращений

FSC - прямое рассеяние света

KIR - иммуноглобулиноподобный рецептор киллер-клетки

RIC - режим кондиционирования пониженной интенсивности

SSC - боковое рассеяние света

Теш - Центральные клетки памяти

Tern - Эффекторные клетки памяти

Thl - Т хелперы первого типа

Th2 - Т хелперы второго типа

Алло-ТКМ - трансплантация аллогенного костного мозга

АТГ - антитимоцитарный глобулин

ДК - дендритные клетки

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ - интерлейкин

ИСТ - иммуносупрессивная терапия

КМ - костный мозг

ЛПЗ - лимфопролиферативное заболевание МАК - миелоаблативное кондиционирование МкАТ - моноклональные антитела

МСК - мультипотентные мезенхимные стромальные клетки

НК - натуральные киллеры

OJI - острый лейкоз

OJIJT - острый лимфобластный лейкоз

OMJI - острый миелобластный лейкоз

оРТПХ - острая реакция трансплантат против хозяина

ПК - периферическая кровь

РНК - рибонуклеиновая кислота

РТПХ - реакция трансплантат против хозяина

СБ - кластер дифференцировки ТКР - Т-клеточный рецептор Трег - Т-регуляторные клетки ХТ - химиотерапия ЦФ - циклофосфамид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование экспрессии гранзима В в CD4?-лимфоцитах и Т-регуляторных клетках у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга»

Введение Актуальность темы

Трансплантация аллогенного костного мозга в настоящее время является единственным методом, позволяющим добиться биологического излечения у больных гемобластозами. Это достигается как с помощью миело- и немиелоаблативного воздействия на кроветворную ткань, так и с помощью иммунологических механизмов, прежде всего реакции трансплантат против лейкоза.

Реконституция именно Т-клеточного звена иммунной системы определяет развитие иммунологической толерантности, реакции трансплантат против хозяина и реакции трансплантат против лейкоза. После идентификации маркеров Т-лимфоцитов были выполнены многочисленные исследования по оценке химеризма в отдельных популяциях Т- и В- клеток у реципиентов аллогенного костного мозга. Так по данным Venen и соавт. [104] среди В- клеток раньше всего происходит реконституция популяции В 1а- клеток. В нашей клинике было установлено, что восстановление лимфопоэза происходит постепенно и характеризуется длительной персистенцией клеток, принадлежащих реципиенту [119]. Так, в популяции Т-клеток на ранних сроках после трансплантации костного мозга (ТКМ) в большинстве случаев выявлен смешанный химеризм на +30 день после ТКМ. Лишь у 53% - CD3+ клетки были только донорского генотипа. Также Желновой и соавт. было показано, что быстрая реконституция лимфоцитов, принадлежащих донорскому генотипу, увеличивает вероятность развития острой РТ11Х [119]. В случае же проведения трансплантации костного мозга от гаплоидентичного донора, по данным Luznik и соавт. именно динамика восстановления CD3+ клеток, а также их принадлежность к генотипу донора или реципиента, определяет частоту развития хронической РТПХ [51]. Реконституция же НК-клеток напрямую коррелирует с частотой развития острой РТПХ. В популяции Т-регуляторных клеток, являющихся ключевыми в индукции

поддержания толерантности и в сдерживании РТПХ по данным Noriega (устный доклад на 36th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation), лишь y 85% больных определяется полный донорский химеризм, и в среднем - к +38 дню после ТКМ. Учитывая важность не только проявлений РТПХ, но и процесса ее регуляции. В качестве объекта исследования был выбран гранзим В - фермент, с помощью которого Т-регуляторные клетки осуществляют контроль за клетками-эффекторами иммунного ответа.

Публикуемые в литературе сведения позволяют говорить о Т-клеточном звене, как о ведущем в иммунной системе у пациентов с гемобластозами после трансплантации костного мозга

Цель исследования

Изучить интенсивность экспрессии гранзима В и долю гранзим В-положительных CD4+ лимфоцитов и Т-регуляторных (CD4+CD25high) клеток у больных после трансплантации аллогенного костного мозга.

Задачи исследования

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить частоту развития оРТПХ у больных различными вариантами гемобластозов в зависимости от диагноза, фазы заболевания, режима кондиционирования, вида трансплантата (источник, донор)

2. Определить относительное количество CD4+ лимфоцитов и Т-регуляторных клеток (CD4+CD25high), экспрессирующих гранзим В, в периферической крови доноров и пациентов с гемобластозами до алло-ТКМ, в контрольные сроки после алло-ТКМ и в день развития оРТПХ

3. Определить интенсивность экспрессии внутриклеточного гранзима В в популяции CD4+ и Т-регуляторных клеток (CD4+CD25hlßh) в

периферической крови доноров и пациентов с гемобластозами до алло-ТКМ, в контрольные сроки после алло-ТКМ и в день развития оРТПХ

4. Проанализировать влияние вида трансплантата (источник, донор), схемы иммуносупрессивной терапии, а также других факторов до и после алло-ТКМ на уровень экспрессии гранзима В в субпопуляции Т-регуляторных клеток (СВ4+С025Ы8Ь).

5. Изучить влияние экспрессии гранзима В в популяции СБ4+ и Т-регуляторных клеток (СБ4+С025Ь'811) на частоту развития острой реакции трансплантат против хозяина

Научная новизна

Впервые проведено исследование уровня гранзима В в популяциях СЭ4+ и лимфоцитов ПК у больных гемобластозами и у здоровых доноров. Выполнено исследование по определению динамики субпопуляций Т лимфоцитов после введения МСК с целью профилактики оРТПХ.

Практическая значимость работы

В результате данного исследования у больных после трансплантации аллогенного костного мозга была выявлена потенциальная значимость гранзима В как фактора прогноза развития оРТПХ. Эти данные будут учтены в разработке протоколов превентивной терапии оРТПХ.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У здоровых доноров и пациентов в полной ремиссии острого лейкоза процент гранзим В-положительных СВ4+СБ25Ь'8Ь клеток выше, чем у пациентов находящихся вне ремиссии до алло-ТКМ.

2. Интенсивность иммуносупрессивной терапии после алло-ТКМ влияет на количество гранзим В-положительных С04+С025Ы8Ь клеток на +30 день

и гранзим В-положительных СБ4+ клеток на +30 и +90 день после алло-ТКМ: чем интенсивнее ИСТ, тем ниже содержание гранзима В.

3. На всех контрольных сроках при отсутствии оРТПХ количество экспрессирующих гранзим В клеток в популяции С04+СВ25Ы^ существенно выше их количества у больных в день развития оРТПХ и у тех, у кого впоследствии разовьется оРТПХ, что дает основания рассматривать исследуемый показатель и как маркер, и как предиктор оРТПХ.

4. Количество гранзима В в популяции CD4+CD25h,8h в день констатации оРТПХ ниже, чем на любых контрольных сроках у пациентов без оРТПХ.

Глава 1: Обзор литературы

1. Реконституция Т-клеточного звена как ключевой фактор у пациентов с гемобластозами после трансплантации аллогенного костного мозга.

1.2 История вопроса

До 1960 года сам тимус был органом с неизвестной функцией, а его связь с иммунитетом и лимфоцитами была не установлена. В 1960 году Жак Миллер, работая в больнице в Лондоне, как и многие в то время был заинтересован тем фактом, что некоторые вирусы, в том числе MoMuLV, могут вызывать лейкозы и лимфомы, при введении в новорожденных мышей. Как субстрат, исследователи рассматривали клетки, происходящие из тимуса, поэтому в исследование входили группы мышей, которым тимус был удален хирургически. Во время опытов практически все мыши с удаленным тимусом умерли от генерализованной инфекции. Опыты, повторенные на курицах Cooper с соавт., подтвердили роль тимуса как центрального звена иммунитета [17].

В 1980 году произошли дальнейшие шаги в понимании Т-клеточного иммунитета - Edwin et. al. [22] были определены специфические маркеры Т-лимфоцитов CD4, CD8 и CD3.

По мере дальнейших исследований было выяснено, что развитие иммунного ответа требует высокоорганизованной клеточной миграции по всему организму. В процесс ответа оказались вовлечены Т- и B-клетки, а также такие органы как тимус, костный мозг, представляющие первичные лимфоидные органы, селезенка, лимфатические узлы и бляшки Пейера, представляющие вторичные лимфоидные органы. Во время афферентной фазы иммунного ответа лимфатические узлы выполняют функции «главного места встреч», где происходят высоко динамичные процессы клеточного движения, позволяющие формировать ответ Т-

и В-клеткам, столкнувшимся с антигенпрезентирующими клетками, которые мигрировали с периферии. В эфферентной фазе иммунного ответа, активированные Т-клетки оставляют лимфатические узлы и мигрируют в периферические ткани. Миграция Т-клеток через эндотелий сосудов в лимфатические узлы при афферентной фазе иммунного ответа и в периферических тканях при эфферентной фазе регулируется селектинами, интегринами, и хемокинами. Кроме того, ретиноевая кислота, метаболит витамина А, способствует заселению Т-клеток в кишечник, в то время витамин D способствует хоумингу Т клеток в кожу.

Описанные выше механизмы уже с участием Т- клеток донорского и хозяйского генотипа и обуславливают основные механизмы развития как реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), так и реакции трансплантат против лейкоза (РТПЛ). Так что многие попытки поиска центрального регулирующего звена РТПХ и РТПЛ именно среди Т лимфоцитов вполне обоснованы.

Один из важных компонентов Т-клеточной системы открытый в 1998 году -Гранзим В - представляет собой сериновую протеазу, содержащуюся в гранулах Т-лимфоцитов и НК-клеток. Основная ее задача заключается в запуске процесса апоптоза в клетках-мишенях.

В некоторых работах было показано что высокий уровень гранзима В в Т-клетках связан с большей вовлеченностью органов и тканей в РТПХ. Так по данным Hodge et. al. [31] высокий уровень гранзима В наблюдается в них при РТПХ с поражением легких.

В это же время благодаря исследованиям Sheng et. al. [88] на мышиных моделях стало понятно, что гранзим В участвует не только в эффекторном звене с участием Т-лимфоцитов, но также и в регуляторном, через которое и обусловлено модулирование как РТПХ, так и реакции трансплантат против лейкоза.

1.3 Иммунофенотипические характеристики Т клеточного звена иммунной системы.

Т-клеточное звено иммунной системы в настоящее время представляет объект динамично развивающейся области исследования. Среди методов, используемых для характеристики гетерогенной популяции лимфоцитов, используют многоцветную проточную цитометрию, которая по данным литературы и таких баз данных как РиЬМес! в настоящее время преобладает как метод оценки данной популяции клеток. Кроме того, сложность структуры СОЗ+ популяции Т-лимфоцитов , как в функциональном, так и в фенотипическом плане - делает многоцветную проточную цитометрию, начиная с 1980 года, необходимым и эффективным инструментом для исследователей. В настоящее время Т-клетки могут быть разделены на три основные группы в зависимости от их функциональных и фенотипических характеристик. Цитотоксические Т-клетки, Т-хелперы (ТЬ), Т-регуляторные клетки (Трег). Именно различия в экспрессии маркеров кластеров дифференцировки на поверхности клеточной мембраны, а также различия в секреции цитокинов позволяют разделить эти популяции. Например, СБ8+ цитотоксические Т-клетки уничтожают инфицированные клетки-мишени с помощью перфорин-гранзимного механизма. Тогда как СЭ4+ - Т-хелперы (т. е. ТЫ, ТЪ2, ТЬ9, ТЫ7, и ТБН клетки) обладают маленькой цитотоксической активностью и в основном секретируют цитокины, которые действуют на другие клетки, такие как В-клетки, макрофаги, эозинофилы, нейтрофилы с целью элиминации патогена. Что касается Т-регуляторных клеток, их функция заключается в подавлении Т-клеточного ответа с помощью нескольких механизмов. Т-регуляторные клетки играют важную роль в поддержании иммунного гомеостаза [105], также их роль выявлена при многих аутоиммунных заболеваниях [105]. Например при 1РЕХ синдроме, когда утрачивается функция Т- регуляторных клеток, возникают аутоиммунные поражения как кожных покровов, так и эндокринных желез [105]. Для определения Т-регуляторных клеток проточная цитометрия не заменима.

Выделяют два основных класса CD4+ Т-регуляторных клеток (Трег): «натуральные» Трег (пТрег), которые иммунофенотипически характеризуются экспрессией CD25 на поверхности и внутриклеточной экспрессией FoxP3. Вторая субпопуляция - это индуцированные Т-регуляторные клетки (iTper), в которых CD25 и FoxP3 появляются вследствие цитокиновой активации, а не в процессе созревания [105]. Эта субпопуляция Т-регуляторных клеток берет свое начало из тимуса, родоначальником ее выступают CD4+ клетки [105]. Они дифференцируются в CD25+/FoxP3+ под действием адекватной антигенной стимуляции и цитокинов, таких как TGF-(3, ИЛ -10, и ИЛ-2 [105]. Также для данной популяции характерна так называемая пластичность - т.е. способность клеток к трансдифференцировке в Thl и Thl7 клетки. Что касается иммунофенотипического маркера окончательно идентифицирующего и определяющего Т-регуляторные клетки, то им является FoxP3. Однако в литературе, в частности Hansen et. al. [28] приводятся данные о небольших популяциях FoxP3 негативных Т-регуляторных клеток. Выявление FoxP3 в качестве маркера для Трег позволило выявить дополнительные маркеры, в том числе CD127, экспрессия которого на поверхности обратно пропорциональна внутриклеточной экспрессии FoxP3 [44]

Помимо основных популяций использование антител к таким антигенам как CCR7, CD62L и/или CD69 могут дать важную информацию о потенциале клеток к заселению ниш и об их локализации в организме [76]. В настоящее время появляется также много работ о Т клетках памяти. Центральные клетки памяти (Тст) и эффекторные клетки памяти (Теш) первоначально были выявлены на основании наличия или отсутствия непосредственно эффекторных функций, а также экспрессии рецепторов, которые позволяют клеткам мигрировать во вторичные лимфоидные органы, такие как лимфатические узлы и другие [81]. Так Тст постоянно экспрессируют на своей поверхности CCR7 и CD62L - рецепторы, которые необходимы для прохождения клеток через вены с высоким эндотелием,

которые располагаются в лимфатических узлах. Эффекторные Т клетки памяти не экспрессируют ССК7, являются гетерогенными по экспрессии С062Ь, а также имеют в своей цитоплазме большое количество перфорина, что и обеспечивает им более высокую цитотоксическую активность и функцию близкую к той, которую выполняют С08+ клетки.

1.4 Реконституция Т клеточного звена иммунной системы.

У всех пациентов с гемобластозами после трансплантации костного мозга или гемопоэтических клеток крови развивается глубокий иммунодефицит в том числе и клеточный, это происходит как вследствие кондиционирования, наличия донорских Т лимфоцитов, инфузированных вместе с костномозговой или лейковзвесью, и неспособных выполнять свою функцию полноценно, а также использования иммуносупрессивных препаратов, направленных на предотвращение развития РТПХ.

Восстановление компетентной иммунной системы после трансфузии клеточной взвеси является неотъемлемой частью успешной трансплантации аллогенного костного мозга. Без восстановления Т клеточного звена иммунной системы, реципиент подвержен высокому риску развития оппортунистических инфекций (вирусов, бактерий, грибов и простейших), рецидиву опухоли. В основном компетенция иммунной системы опосредуется через Т-лимфоциты, В-лимфоциты и натуральные киллеры (НК). Несмотря на это разнообразие, именно антиген-специфичные Т-лимфоциты играют центральную роль в человеческом клеточном иммунитете, а именно в контроле ДНК- и РНК-вирусных инфекций, содействуют выработке специфических антител к бактериальным патогенам (в сочетании с В-клетками), контроле грибковых инфекций [29] Таким образом, именно развитие нормально функционирующих антиген-специфичных Т-лимфоцитов является необходимостью для реконституции компетентной иммунной системы у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга. Успешное приживление гемопоэтических общих лимфоидных

предшественников, ведет к развитию Т-и B-лимфоцитов и НК-клеток. Общие лимфоидные предшественники мигрируют в тимус где проходят нормальный для Т-лимфоцитов онтогенез, но только в случае нормально функционирующего тимуса.

Экспериментальные данные показали, что начальное восстановление Т-клеток после трансплантации происходит главным образом за счет экспансии зрелых Т-клеток донора, тимусзависимое восстановление происходит позднее. Включение тотального облучения тела в режим кондиционирования и развитие РТПХ, по данным Taub [98] нарушает процесс восстановления функции тимуса после трансплантации, а, учитывая тот факт, что функция тимуса с возрастом снижается, вышеперечисленные факты оказывают свое влияние преимущественно на реконституцию у взрослых пациентов, нежели детей. В тимусе общие лимфоидные предшественники проходят последовательную череду делений и дифференцировку под контролем как цитокинов, так и молекул, располагающихся на поверхности клеток стромы. Центральную роль в этом процессе играют молекулы Notch-1, а также цитокины, такие как ИЛ-7 и ИЛ-2 [8]. На этих ранних предшественниках выявляется высокая экспрессия рецепторов к ИЛ-7, однако такие маркеры как CD3, CD4 и CD8 не определяются.

Первоначально, CD3 выявляется только в цитоплазме, а появление на поверхности клетки совпадает по времени с выявлением перестроенного Т-клеточного рецептора (ТКР), как TKP-aß, так и ТКР-у8. TKP-aß тимоциты первоначально начинают экспрессировать CD3 и ТКР, но не CD4 и CD8. Далее происходит экспансия Т-лимфоцитов со специфичностью к определенным пептидам, которые презентируются на главном комплексе гистосовместимости стромальных клеток тимуса. Происходит как положительная селекция, так и негативная селекция - т.е. центральная делеция аутореактивного клона. Во время негативной селекции клетки уже несут на своей поверхности CD4 и CD8 маркеры. Что касается отдельных популяций, то тимусзависимый путь Т-клеточного

восстановления является более важным для восстановления CD4+ клеток, чем для CD8+. [2]

Таким образом, в случае наличия прижившегося общего лимфоидного предшественника и адекватно функционирующего тимуса, клетки с фенотипом CD3+/CD4- и CD3+/CD8- могут быть найдены в периферической крови примерно спустя 3 месяца после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток крови, на этих сроках данные клетки уже могут подвергаться экспансии после адекватной стимуляции их TCR. Эти данные также совпадают со многими клиническими данными, в том числе и Thomas и соавт. [2], которые говорят о периоде до +100 дня, как о периоде, в котором пациент максимально подвержен инфекционным осложнениям как бактериальной, так и вирусной природы. Стоит отметить, что восстановление врожденного иммунитета - НК-клеток и интерферон (ИНФ)-продуцирующих клеток происходит в течение первого месяца после трансплантации. По данным Storek и соавт. [97] к факторам, которые могут препятствовать восстановлению Т клеточного звена относятся использование пуповинной крови, использование трансплантата от неродственного донора, трансплантаты, содержащие низкое число CD34+ и/или Т-клеток, пожилой возраст реципиента или донора, возникновение острой и/или хронической РТПХ, высокие дозы глюкокортикоидных гормонов. Все эти факторы могут привести к снижению массы тимуса, а также функциональному дефекту клеток стромы тимуса, а именно способности этих клеток продуцировать цитокины особенно ИЛ-7 и Kit-лиганд, то есть цитокины, которые необходимы для пролиферации и дифференцировки тимоцитов. Что касается пациентов после интенсивной химиотерапии, то по данным Mackall и соавт. [53] функция тимуса зависит от возраста, а, учитывая важность тимус-зависимого пути прежде всего для CD4+ лимфоцитов, число CD4+ Т-лимфоцитов у молодых пациентов после полихимиотерапии, больше чем у пожилых пациентов. Таким образом, исходя из множества фактов, было показано, что самой иммунокомпрометированной

группой являются пожилые пациенты после трансплантации аллогенного костного мозга, в программу кондиционирования у которых была включена как высокодозная химиотерапия, так и тотальное облучение тела, у которых имело место РТПХ. Такие пациенты имеют недостаточную функцию тимуса, чтобы обеспечить адекватную реконституцию Т клеточного звена и разнообразие репертуара Т клеточного рецептора. За исключением тех случаев, когда в качестве трансплантата используется трансплантат после Т клеточной деплеции, т.к. в норме как в лейко- так и костномозговой взвеси содержатся антиген-специфичные Т-лимфоциты, наивные Т-лимфоциты, и общие лимфоидные предшественники.

Основываясь на исследованиях МаскаИ и соавт. [54] на животных, можно утверждать, что как антиген-специфичные, так и наивные Т-лимфоциты могут подвергаться выраженной экспансии под действием ИЛ-7. Таким образом, имеется шунтирующий путь реконституции, когда при недостаточной функции тимуса удается достичь нормальных параметров Т клеточного звена за счет экспансии донорских лимфоцитов. Несмотря на это, учитывая отсутствие тимус-зависимого пути, репертуар ТКР чрезвычайно сужен. Таким образом восстановление Т клеточного звена происходит как через тимус-независимые механизмы - экспансию зрелой Т-клеточной популяции трансплантата, так и тимус-зависимые механизмы - со всеми этапами созревания.

Время до восстановления варьируется для различных компонентов и функций Т клеточного звена и зависит от многих факторов. Так у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга от НЬА-идентичного сиблинга, пролиферативный ответ на фитогемагглютинин достигал нормальных значений только через 4-6 месяцев, количество СБ4+ клеток в периферической крови начинает достигать нормального диапазона спустя 7-9 месяцев [66] Реконституция Т клеточного звена происходит позже у пациентов, в качестве трансплантата у которых использовался костный мозг или стволовые клетки

крови после Т клеточной деплеции [2]. Также в некоторых работах показано, что восстановление CD4+ клеток происходит быстрее, в тех случаях, когда для трансплантации использовались мобилизованные гемопоэтические клетки, а не костный мозг[2]

Несмотря на все вышеперечисленные данные как инфузированные Т клетки, так и общие лимфоидные предшественники не обладают способностью к самоподдержанию, что приводит к формированию пробелов в репертуаре ТКР. Это все делает невозможным ответ на некоторые патогены, особенно ярко это было показано в работе Patel и соавт. [71], в которой у больных с тяжелым комбинированным иммунодефицитом после трансплантации аллогенного костного мозга количество эписом с ТКР в Т клетках спустя 14 лет после трансплантации соответствовало уровню 80-летних здоровых доноров. В течение первых Зх месяцев после трансплантации костного мозга происходит селективная пролиферация Т-клеток по тимус-независимому пути причем происходит изменение репертуара Т клеточного рецептора, а именно, спектр перестройки ограничен и неустойчив. Причиной этого, вероятнее всего, служит массивное поступление антигенов из кишечника в кровоток в процессе кондиционирования, именно поэтому ограничение особенно выраженно у пациентов с РТПХ.

Что касается НК-клеток, то они являются наиболее ранними из CD3-лимфоидных клеток, наблюдаемых после трансплантации костного мозга. Их уровень достигает нормы в течение первых 3-х месяцев [74]. НК-клетки экспрессируют ингибирующие и активирующие KIR-рецепторы и CD94: NKG2 лектиноподобные рецепторы [27] Эта экспрессия предопределена генетически, и у здоровых доноров преобладает экспрессия KIR, в то время как после трансплантации аллогенного костного мозга у больных начинают экспрессироваться CD94. Затем происходит нормализация в экспрессии и KIR-рецепторы начинают преобладать. Это происходит в течение 1-3 лет после трансплантации, в данном случае эти клетки повторяют естественный онтогенез.

1.5 Реконституция CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов.

Первыми Т-клетками, из CD3+ положительных, которые появляются после трансплантации костного мозга как при использовании трансплантата с Т-клеточной деплецией, так и без нее являются преимущественно CD8+ клетки, и они остаются доминирующей популяцией более чем в течение года. Также по данным Schroff и соавт. [85] CD8+ популяция появляется крайне рано и является особенно выраженной у пациентов с вирусными инфекциями, особенно цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВ). Кроме того, популяция CD8+ клеток у пациентов после трансплантации костного мозга, может иметь аберрантный фенотип, который редко можно встретить у здоровых доноров, это также ведет к ослаблению функции Т-клеточного звена иммунной системы.

Субпопуляция CD8+ клеток, а именно тех, которые экспрессируют CD57 по данным Wursch и соавт. [111] составляет до 75% всех CD8+ клеток особенно у ЦМВ-позитивных реципиентов в период реактивации вируса. У здоровых доноров уровень CD8+CD57+ Т-клеток составляет порядка 7%. Что касается функциональных особенностей, то CD8+CD57+ клетки подавляют Т-клеточную функцию нормальных Т-лимфоцитов и в тестах не отвечают на стимуляцию митогеном, однако по данным Autran [5] и Sadat-Sowti [80] способны опосредовать цитотоксичность.

Анализ ТКР CD8+CD57+ субпопуляции показал ограниченный репертуар. Тем не менее, по данным Morley и соавт. [62] CD8+CD57+ Т-клетки и у нормальных доноров могут иметь олигоклональный репертуар, что может представлять собой нормальный ответ на какой-либо антиген. У ЦМВ-положительных реципиентов CD8+CD57+ Т-клетки преимущественно представлены ЦМВ-специфическими клетками, что было доказано путем клонирования и измерения продукции ИФН-а и ФНО в ответ на ЦМВ. По данным некоторых исследователей, в том числе Rowbottom [78] у пациентов после трансплантации аллогенного костного мозга с высоким процентом CD8+CD57+,

данная популяция отвечала экспансией в ответ на аутологичные ЦМВ-инфицированные фибробласты, однако процент ЦМВ-специфичных клеток был крайне мал, по сравнению с кровью пациентов с небольшой популяцией CD8+CD57 + Т-клеток. По всей вероятности, экспансия происходит в ответ на ЦМВ, но не понятно относится ли это к противовирусному ответу, либо к ЦМВ-опосредованной иммуносупрессии. Интересно, что Dolstra и соавт. [20] обнаружили более низкую частоту рецидивов у реципиентов костного мозга после Т-клеточной деплеции, с высоким уровнем CD8+CD57+ Т-клеток после трансплантации, что указывает на дополнительную роль этой субпопуляции в реакции трансплантат против лейкоза. Исследования Soiffer [76] у реципиентов костного мозга после Т-клеточной деплеции также подтвердили роль ЦМВ в экспансии CD3+CD57+ Т-клеток. Так количество CD3+CD57+ Т-клеток было нормальным на +100 день у пациентов, которые были ЦМВ- положительны во время трансплантации, причем уровень этой субпопуляции быстро вырос и остался на уровне выше нормального во всем посттрансплантационном периоде. У ЦМВ-негативных пациентов уровень CD3+CD57+ клеток рос постепенно и нормализовался к 6 месяцу после трансплантации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дроков, Михаил Юрьевич, 2014 год

Список литературы

1. Adrain C, Duriez PJ, Brumatti G, Delivani P, Martin SJ.] The cytotoxic lymphocyte protease, granzyme B, targets the cytoskeleton and perturbs microtubule polymerization dynamics.J Biol Chem. 2006 Mar 24;281(12):8118-25.

2. Appelbaum Frederick R., Stephen J. Forman, Robert S. Negrin, Karl G. Blume "Thomas' Hematopoietic Cell Transplantation: Stem Cell Transplantation",2004

3. Asselin-Labat ML, David M, Biola-Vidamment A, Lecoeuche D, Zennaro MC, Bertoglio J, Pallardy M.GILZ, a new target for the transcription factor Fox03, protects T lymphocytes from interleukin-2 withdrawal-induced apoptosis. Blood. 2004 Jul l;104(l):215-23

4. Atkinson K. Reconstitution of the haemopoietic and immune systems after marrow transplantation. Bone Marrow Transplant 1990; 5: 209-26.)

5. Autran B, Leblond V, Sadat-Sowti B, et al. A soluble factor released by CD8+CD57+ lymphocytes from bone marrow transplanted patients inhibits cellmediated cytolysis. Blood 1991;77:2237-2241

6. Aversa F, Tabilio A, Velardi A et al. Treatment of high-risk acute leukemia with T-cell-depleted stem cells from related donors with one fully mismatched HLA haplotype. N Engl J Med 1998; 339: 1186-93

7. Bahceci E, Epperson D, Douek DC et al. Early reconstitution of the T-cell repertoire after nonmyeloablative peripheral blood stem cell transplantation is from post-thymic T-cell expansion and is unaffected by graft-versus-host disease or mixed chimaerism. Br J Haematol 2003; 122: 934-43.

8. Balciunaite G, Ceredig R, Fehling HJ, Zuniga-Pfliicker JC, Rolink AG The role of Notch and IL-7 signaling in early thymocyte proliferation and differentiation.Eur J Immunol. 2005 Apr;35(4): 1292-300.

9. Barry M, Heibein JA, Pinkoski MJ, Lee SF, Moyer RW, Green DR, Bleackley RC.Granzyme B short-circuits the need for caspase 8 activity during granule-mediated cytotoxic T-lymphocyte killing by directly cleaving Bid.Mol Cell Biol. 2000 Jun;20(l l):3781-94.

10.Belkaid Y. Regulatory T cells and infection: a dangerous necessity. Nat Rev Immunol. 2007 Nov;7(ll):875-88.

11.Blanco P, Pitard V, Viallard JF, Taupin JL, Pellegrin JL, Moreau JF.Increase in activated CD8+ T lymphocytes expressing perforin and granzyme B correlates with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus.Arthritis Rheum. 2005 Jan;52(l):201-ll

12.Brunkow, M.E., et al. 2001. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nat. Genet. 27:68-73

13.Cancrini C., Ferrua F. Role of reduced intensity conditioning in T-cell and B-cell immune reconstitution after HLA-identical bone marrow transplantation in ADA-SCID, Haematologica. 2010 0ct;95(10): 1778-82

14.Chinnaiyan AM, Hanna WL, Orth K, Duan H, Poirier GG, Froelich CJ, Dixit VM.Cytotoxic T-cell-derived granzyme B activates the apoptotic protease ICE-LAPS. Curr Biol. 1996 Jul l;6(7):897-9.

15.Clarke SL, Betts GJ, Plant A, Wright KL, El-Shanawany TM, Harrop R, Torkington J, Rees BI, Williams GT, Gallimore AM, Godkin AJ. CD4+CD25+FOXP3+ regulatory T cells suppress anti-tumor immune responses in patients with colorectal cancer. PLoS One. 2006 Dec 27;l:el29

16.Cohen G, Carter SL, Weinberg KI et al. Antigenspecific T-lymphocyte function after cord blood transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: 133542.

17.Cooper MD, Raymond DA, Peterson RD, South MA, Good RA The functions of the thymus system and the bursa system in the chicken.

18.Cutler C, Giri S, Jeyapalan S, Paniagua D, Viswanathan A, Antin JH.Acute and chronic graft-versus-host disease after allogeneic peripheral-blood stem-cell and bone marrow transplantation: a meta-analysis.J Clin Oncol. 2001 Aug 15;19(16):3685-91

19.Deeg HJ, Storb R. Graft-versus-host disease: pathophysiological and clinical aspects. Annu Rev Med 1984; 35: 11-24.

20.Dolstra H, Preijers F, Van de Wiel-van Kemenade E, et al. Expansion of CD8+CD57+ T cells after allogeneic BMT is related with a low incidence of relapse and with cytomegalovirus infection. Br J Haematol 1995;90:300-307

21.Domingues HS, Mues M, Lassmann H, Wekerle H, Krishnamoorthy G.Functional and pathogenic differences of Thl and Thl7 cells in experimental autoimmune encephalomyelitis. PLoS One. 2010 Nov 29;5(ll):el5531.

22.Edwin W. Ades,Robert K. Zwerner, Ronald T. Acton, And Charles M. Balch Isolation and partial characterization of the human homologue of Thy-1 J Exp Med. 1980 February 1; 151(2): 400-406

23.E1-Serafi I, Abedi-Valugerdi M, Potacova Z, Afsharian P, Mattsson J, Moshfegh A, Hassan M. Cyclophosphamide alters the gene expression profile in patients treated with high doses prior to stem cell transplantation. PLoS One. 2014 Jan 22;9(1): e86619

24.Foot AB, Potter MN, Donaldson C, Cornish JM, Wallington TB, Oakhill A, Pamphilon DH Immune reconstitution after BMT in children. Bone Marrow Transplant. 1993 Jan;l 1(1):7-13

25.Garfn MI, Chu CC, Golshayan D, Cernuda-Morollon E, Wait R, Lechler RI.Galectin-1: a key effector of regulation mediated by CD4+CD25+ T cells. Blood. 2007 Mar l;109(5):2058-65.

26.Gaspar H.B., Aiuti A., Porta F., Candotti F., Hershfield M.S., Notarangelo L.D. . How I treat ADA deficiency. Blood. 2009; 114(17):3524—32.

27.Gunturi A, Berg RE, Forman J. The role of CD94/NKG2 in innate and adaptive immunity. Immunol Res. 2004; 30(l):29-34.

28.Hansen,W., K. Loser, A.M.Westendorf, D. Bruder, S. Pfoertner, C. Siewert, J. Huehn, S. Beissert, and J. Buer. 2006. G protein-coupled receptor 83 overexpression in naive CD4+CD25- T cells leads to the induction of Foxp3+ regulatory T cells in vivo. J Immunol 177:209-215

29.HebarTH, Bollinger_C7Fisch P, Sarfati J, Meisner C, Baur M, Loeffler J, Monod M, Latgé JP, Einsele H.]. Analysis of T-cell responses to Aspergillus fumigatus antigens in healthy individuals and patients with hematologic malignancies. Blood. 2002 Dec 15;100(13):4521-8

30.Heibein JA, Barry M, Motyka B, Bleackley RC. Granzyme B-induced loss of mitochondrial inner membrane potential (Delta Psi m) and cytochrome c release are caspase independent. J Immunol 1999; 163: 4683-4693

31.Hodge S, G Hodge, J Ahern, C-L Liew,P Hopkins, D C Chambers, P N Reynolds, and M Holmes Increased levels of T cell granzyme b in bronchiolitis obliterans syndrome are not suppressed adequately by current immunosuppressive regimens Clin Exp Immunol. Nov 2009; 158(2): 230-236

32.Huang CT, Workman CJ, Flies D, Pan X, Marson AL, Zhou G, Hipkiss EL, Ravi S, Kowalski J, Levitsky HI, Powell JD, Pardoll DM, Drake CG, Vignali DA Role of LAG-3 in regulatory T cells.Immunity. 2004 0ct;21(4):503-13

33.Jakubowski AA, Small TN, Young JW et al. T cell depleted stem-cell transplantation for adults with hematologic malignancies: sustained engraftment of HLA-matched related donor grafts without the use of antithymocyte globulin. Blood 2007; 110:4552-9

34.Jenkins MK, Schwartz RH, Pardoll DM. Effects of cyclosporine A on T cell development and clonal deletion. Science 1988; 241: 1655-8

35.Jiménez M, Martínez C, Ercilla G et al. Reducedintensity conditioning regimen preserves thymic function in the early period after hematopoietic stem cell transplantation. Exp Hematol 2005; 33:1240-8

36.Joachim H. How I treat refractory acute GVHD Blood. May 15, 2007; 109(10): 4119-4126.

37.Kapoor N, Chan R, Weinberg KI, Burotto F, Parkman R. Defective anticarbohydrate antibody responses to naturally occurring bacteria following bone marrow transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 1999; 4: 46-50

38.Kastan M.B., Schlaffer E., Russo J.E., Colvin O.M., Civin C.I, Hilton J. Direct demonstration of elevated aldehyde dehydrogenase in human hematopoietic progenitor cells Blood. 1990 May 15,75(10): 1947-50

39.Klingemann H. Relevance and potential of natural killer cells in stem cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2000;6:90-99

40.Kook H, Goldman F, Padley D, et al. Reconstruction of the immune system after unrelated or partially matched T-cell-depleted bone marrow transplantation in children: immunophenotypic analysis and factors affecting the speed of recovery. Blood 1996;88:1089-1097.

41.Lamb LS, Abhyankar SA, Hazlett L, et al. Expression of CD 134 (0X-40) on T cells during the first 100 days following allogeneic bone marrow transplantation as a marker for lymphocyte activation and therapy-resistant graft-versus-host disease. Cytometry 1999;38:238-243

42.LeMaoult J, Caumartin J, Daouya M, Favier B, Le Rond S, Gonzalez A, Carosella ED.Immune regulation by pretenders: cell-to-cell transfers of HLA-G make effector T cells act as regulatory cells. Blood. 2007 Mar l;109(5):2040-8.]

43.Linch DC, Knott LJ, Thomas RM et al. T cell regeneration after allogeneic and autologous bone marrow transplantation. Br J Haematol 1983; 53:451-8

44.Liu W, Putnam AL, Xu-Yu Z, Szot GL, Lee MR, Zhu S, Gottlieb PA, Kapranov P, Gingeras TR, Fazekas de St Groth B, Clayberger C, Soper DM, Ziegler SF, Bluestone JA.CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 2006 Jul 10;203(7): 1701-11.

45.Ljungman P CMV infections after hematopoietic stem cell transplantation Bone Marrow Transplantation (2008) 42, S70-S72; doi:10.1038/bmt.2008.120

46.Ljungman P, Wilczek H, Gahrton G et al. Longterm acyclovir prophylaxis in bone marrow transplant recipients and lymphocyte proliferation responses to herpes virus antigens in vitro. Bone Marrow Transplant 1986; 1: 185-92.

47.Lobe CG, Finlay BB, Paranchych W, Paetkau VH, Bleackley RC. Novel serine proteased encoded by two cytotoxic T lymphocyte-specific genes. Science 1986; 232: 858-861

48.Loeb CR, Harris JL, Craik CS.] Granzyme B proteolyzes receptors important to proliferation and survival, tipping the balance toward apoptosis. J Biol Chem. 2006 Sep 22;281(38):28326-35.

49.Luznik L, Javier Bolanos-Meade, Marianna Zahurak, Allen R. Chen, B. Douglas Smith, Robert Brodsky, Carol Ann Huff, Ivan Borrello, William Matsui, Jonathan D. Powell, Yvette Kasamon, Steven N. Goodman, Allan Hess, Hyam I. Levitsky, Richard F. Ambinder, Richard J. Jones and Ephraim J. Fuchs High-dose cyclophosphamide as single-agent, short-course prophylaxis of graft-versus-host disease

50.Luznik L., Engstrom L.W, Iannone R, Fuchs E.J. Posttransplantation Cyclophosphamide Facilitates Engraftment of Major Histocompatibility Complex-Identical Allogeneic Marrow in Mice Conditioned With Low-Dose Total Body Irradiation , Biol Blood Marrow Transplant. 2002;8(3): 131-8.

51.Luznik L., O'Donnell P.V., Symons H.J., Chen A.R., Leffell M.S., Zahurak M. et. Al. HLA-Haploidentical Bone Marrow Transplantation for Hematologic Malignancies Using Nonmyeloablative Conditioning and High-Dose, Posttransplantation Cyclophosphamide. Biol Blood Marrow Transplant. 2008 Jun;14(6):641-50.

52.Luznik L., O'Donnell P.V., Symons H.J., Chen A.R., Leffell M.S., Zahurak M. et. Al. HLA-Haploidentical Bone Marrow Transplantation for Hematologic Malignancies Using Nonmyeloablative Conditioning and High-Dose, Posttransplantation Cyclophosphamide. Biol Blood Marrow Transplant. 2008 Jun;14(6):641-50

53.Mackall CL, Fleisher TA, Brown MR et al. Age,thymopoiesis, and CD4+ T-lymphocyte regeneration after intensive chemotherapy. N Eng J Med 1995; 332: 143-9

54.Mackall CL, Fry TJ, Bare C et al. IL-7 increases both thymic-dependent and thymic-independent Tcell regeneration after bone marrow transplantation. Blood 2001;97: 1491-7

55.Mackay CR. Dual personality of memory T cells. Nature. 1999 Oct 14;401(6754):659-60.

56.Maeda T., Eto M., Nishimura Y., Nomoto K., Kong Y.-Y. & Nomoto K. Direct evidence for clonal destruction of allo-reactive T cells in the mice treated with cyclophosphamide after allo-priming Immunology. 1993 Jan;78(l): 113-21.

57.Masson D, Tschopp J. A family of serine esterases in lytic granules of cytolytic T lymphocytes. Cell 1987; 49: 679-685

58.Matsuoka K, Kim HT, McDonough S, et al. Altered regulatory T cell homeostasis in patients with CD4+ lymphopenia following allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Clin Invest 2010;120(5):1479-1493

59.Maziarz R.T., Slater S., Blood and Marrow Transplant Handbook, Oregon, 2011, page 39,

60.Megan KL MacLeod, John W Kappler, and Philippa Marrack Memory CD4 T cells: generation, reactivation and re-assignment Immunology. May 2010; 130(1): 10-15.

61.Mohty M.Mechanisms of action of antithymocyte globulin: T-cell depletion and beyond.Leukemia. 2007 Jul;21(7): 1387-94.

62.Morley JK, Batliwalla FM, Hingorani R, et al. Oligoclonal CD8+ T cells are preferentially expanded in the CD57+ subset. J Immunol 1995;154:6182-6190

63.Morris ES., Kelli P. A. MacDonald, and Geoffrey R. Hill «Stem cell mobilization with G-CSF analogs: a rational approach to separate GVHD and GVL?»

64.Motyka B, Korbutt G, Pinkoski MJ, Heibein J A, Caputo A, Hobman M, Barry M, Shostak I, Sawchuk T, Holmes CF, Gauldie J, Bleackley RC.Mannose 6-

phosphate/insulin-like growth factor II receptor is a death receptor for granzyme B during cytotoxic T cell-induced apoptosis. Cell. 2000 Oct 27;103(3):491-500

65.Nakajima H, Park HL, Henkart PA. Synergistic roles of granzymes A and B in mediating target cell death by rat basophilic leukemia mast cell tumors also expressing cytolysin/perforin. J Exp Med 1995; 181: 1037-1046

66.Niehues T, Rocha V, Filipovich AH, Chan KW, Porcher R, Michel G, Ortega JJ, Wernet P, Gôbel U, Gluckman E, Locatelli F.Factors affecting lymphocyte subset reconstitution after either related or unrelated cord blood transplantation in children - a Eurocord analysis. Br J Haematol. 2001 Jul; 114(1 ):42-8.

67.Noel DR, Witherspoon RP, Storb R et al. Does graft-versus-host disease influence the tempo of immunologic recovery after allogeneic human marrow transplantation? An observation on 56 long-term survivors. Blood 1978; 51: 1087105

68.0ttinger HD, Beelen DW, Scheulen B, Schaefer UW, Gross-Wilde H. Improved immune reconstitution after allotransplantation of peripheral blood stem cells instead of bone marrow. Blood 1996; 88:2775-9

69.0zdemir E, St John LS, Gillespie G et al. Cytomegalovirus reactivation following allogeneic stem cell transplantation is associated with the presence of dysfunctional antigen-specifi c CD8+ T cells. Blood 2002; 100: 3690-7

70.Parkman R, Cohen G, Carter SL et al. Successful immune reconstitution decreases leukemic relapse and improves survival in recipients of unrelated cord blood transplantation. Biol Blood Marrow Transplant 2006; 12: 919-27

71.Patel DD, Gooding ME, Parrott RE et al. Thymic function after hematopoietic stem-cell transplantation for the treatment of severe combined immunodeficiency. N Engl J Med 2000; 342: 1325-32.

72.Pérez-Martínez A, González-Vicent M, Valentín J, Aleo E, Lassaletta A, Sevilla J, Vicario JL, Ramírez M, Diaz MA. Early evaluation of immune reconstitution following allogeneic CD3/CD19-depleted grafts from alternative donors in childhood acute leukemia. Bone Marrow Transplant. 2012 Nov;47(l 1): 1419-27

73.Petersen S L, L P Ryder, P Bjork, H O Madsen, C Heilmann, N Jacobsen, H Sengel0v and L L Vindel0v A comparison of T-, B- and NK-cell reconstitution following conventional or nonmyeloablative conditioning and transplantation with bone marrow or peripheral blood stem cells from human leucocyte antigen identical sibling donors Bone Marrow Transplantation (2003) 32, 65-72.

74.Reisner Y, Kapoor N, Kirkpatrick D et al. Transplantation for severe combined immunodeficiency with HLA-A, B, D, DR incompatible parental marrow cells fractionated by soybean agglutinin and sheep red blood cells. Blood 1983; 61: 341-8

75.Rissoan MC, Duhen T, Bridon JM, Bendriss-Vermare N, Peronne C, de Saint Vis B, Briere F, Bates EE. Subtractive hybridization reveals the expression of immunoglobulin-like transcript 7, Eph-Bl, granzyme B, and 3 novel transcripts in human plasmacytoid dendritic cells. Blood. 2002 Nov l;100(9):3295-303.

76.Robert J. Soiffer MD Stem Cell Transplantation for Hematologic Malignancies, 2008

77.Robertson MJ, Ritz J. Biology and clinical relevance of human natural killer cells. Blood 1990;76:2421-2438.

78.Rowbottom A, Garland R, Lepper M, et al. Functional analysis of the CD8+CD57+ cell population in normal healthy individuals and matched unrelated T-cell-depleted bone marrow transplant recipients. Br J Haematol 2000; 110:315321

79.Ruggeri L, Capanni M, Urbani E et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplants. Science 2002; 295: 2097100.

80.Sadat-Sowti B, Debre P, Mollet L, et al. An inhibitor of cytotoxic functions produced by CD8+CD57+ T-lymphocytes from patients suffering from AIDS and immunosuppressed bone marrow recipients. Eur J Immunol 1994;24:2882-2888.

81.Sallusto F, Lenig D, Förster R, Lipp M, Lanzavecchia A. Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions.Nature. 1999 Oct 14;401(6754):708-12. 82.Sato,K., Yamashita,N., Yamashita,N., Baba,M., and Matsuyama,T. (2003). Regulatory dendritic cells protect mice from murine acute graft-versus-host disease and leukemia relapse. Immunity. 18, 367-379. 83.Savino W, Postel-Vinay MC, Smaniotto S, et al. The thymus gland: a target organ

for growth hormone. Scand J Immunol 2002;55:442^52. 84.Schmitz N, Eapen M, Horowitz MM et al. Longterm outcome of patients given transplants of mobilized blood or bone marrow: a report from the International Bone Marrow Transplant Registry and the European Group for Blood and Marrow Transplantation. Blood 2006; 108: 4288-90 85.Schroff RW, Gale RP, Fahey JL. Regeneration of T cell subpopulations after bone marrow transplantation: cytomegalovirus infection and lymphoid subset imbalance. J Immunol 1982;129:1926-1930 86.Sehn LH, Alyea EP, Weller E, Canning C, Lee S, Ritz J, Antin JH, Soiffer RJ.Comparative outcomes of T-cell-depleted and non-T-cell-depleted allogeneic bone marrow transplantation for chronic myelogenous leukemia: impact of donor lymphocyte infusion. J Clin Oncol. 1999 Feb;17(2):561-8 87.Sharma V, Delgado M, Ganea D.;Activation-Induced T Helper Cell Death Contributes to Thl/Th2 Polarization following Murine Schistosoma japonicum Infection Gratama JW, Verdonck LF, Van Der Linden JA et al. Cellular immunity to vaccinations and herpesvirus infections after bone marrow transplantation.Transplantation 1986; 41: 719-24. 88.Sheng F. Cai, Xuefang Cao, Anjum Hassan, Todd A. Fehniger, Timothy J. Ley Granzyme B is not required for regulatory T cell-mediated suppression of graft-versus-host disease? Blood. 2010 March 4; 115(9): 1669-1677

89.Shenoy S, Mohanakumar T, Todd G, et al. Immune reconstitution following allogeneic peripheral blood stem cell transplants. Bone Marrow Transplant 1999;23:335-346

90. Shi L, Kraut RP, Aebersold R, Greenberg AH. A natural killer cell granule protein that induces DNA fragmentation and apoptosis. J Exp Med 1992; 175: 553-566.

91.Shimoda M, Saraya T, Tsujimoto N, Kurai D, Takizawa H, Goto H.Fatal Disseminated Cryptococcosis Resembling Miliary Tuberculosis in a Patient with HIV Infection. Intern Med. 2014;53(15): 1641-4

92.Sinha ML, Fry TJ, Fowler DH, Miller G, Mackall CL. Interleukin 7 worsens graft-versus-host disease. Blood. 2002 Oct 1; 100(7):2642-9

93.Small TN, Avigan D, Dupont B, et al. Immune reconstitution following T-cell depleted bone marrow transplantation: effect of age and post-transplant graft rejection prophylaxis. Biol Blood Marrow Transplant 1997;3:65-75

94.Small TN, Papadopoulos EB, Boulad F, et al. Comparison of immune reconstitution after unrelated and related T-cell-depleted bone marrow transplantation: effect of patient age and donor leukocyte infusions.Blood 1999;93:467-480

95.Sojka DK, Hughson A, Fowell DJ.CTLA-4 is required by CD4+CD25+ Treg to control CD4+ T-cell lymphopenia-induced proliferation.Eur J Immunol. 2009 Jun;39(6): 1544-51.

96.Storek J, Dawson MA, Storer B et al. Immune reconstitution after allogeneic marrow transplantation compared with blood stem cell transplantation. Blood 2001; 97: 3380-9

97.Storek J, Joseph A, Dawson MA et al. Factors influencing T-lymphopoiesis after allogeneic hematopoietic cell transplantation. Transplantation 2002; 73: 1154-8.

98.Taub DD, Longo DL Insights into thymic aging and regeneration. Immunol Rev. 2005 Jun;205:72-93.

99.Thomas HE, Trapani JA, Kay TW. The role of perforin and granzymes in diabetes. Cell Death Differ. 2010 Apr;17(4):577-85

Ill

100.Tian ZG, Woody MA, Sun R, et al. Recombinant human growth hormone promotes hematopoietic reconstitution after syngeneic bone marrow transplantation in mice. Stem Cells 1998;16:193-199

101.Todd W. Kelley and Olga Efimova Induction of Granzyme B expression in human regulatory T cells requires TCR and CD28 triggering but not IL-2 and is suppressed by inhibitors of the PI3K-mTOR pathway.

102.Trapani JA, Browne KA, Dawson M, Smyth MJ.] Immunopurification of functional Asp-ase (natural killer cell granzyme B) using a monoclonal antibody. Biochem Biophys Res Commun. 1993 Sep 15;195(2):910-20

103.Tutschka PJ, Copelan EA, Klein JP. Bone marrow transplantation for leukemia following a new busulfan and cyclophosphamide regimen. Blood. 1987 Nov;70(5): 1382-8.

104.Veneri Dino, Massimo Franchini, Donata de Sabata, Silvia Ledro, Antonio Vella, Riccardo Ortolani, Giovanni Pizzolo, and Fabio Benedetti Blood Transfiis. Oct 2008; 6(4): 220-224

105.Vignali DA, Collison LW, Workman CJ.How regulatory T cells work. Nat Rev Immunol. 2008 Jul;8(7):523-32. doi: 10.1038/nri2343

106.Volpi I, Perruccio K, Tosti A et al. Postgrafting administration of granulocyte colony-stimulating factor impairs functional immune recovery in recipients of human leukocyte antigen haplotypemismatched hematopoietic transplants. Blood 2001; 97: 2514-21

107. Weinberg K, Blazar BR, Wagner JE et al. Factors affecting thymic function after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Blood 2001; 97:1458-66.),

108.Welte K, Kiobanu N, Moore MAS et al. Defective interleukin-2 production in patients after bone marrow transplantation and in vitro restoration of defective T-lymphocyte proliferation by highly purified interleukin 2. Blood 1984; 64: 380-5.),

109.Witherspoon RP, Storb R, Ochs HD et al. Recovery of antibody production in human allogeneic marrow graft recipients: infl uence of time posttransplantation,

the presence or absence of chronic graft-versus-host disease, and antithymocyte globulin treatment. Blood 1981; 58: 360-8

110.Wu CJ, Chillemi A, Alyea EP, Orsini E, Neuberg D, Soiffer RJ, Ritz J. Reconstitution of T-cell receptor repertoire diversity following T-cell depleted allogeneic bone marrow transplantation is related to hematopoietic chimerism. Blood. 2000 Jan ;95(l):352-9

111.Wursch AM, Gratama JW, Middeldorp JM, et al. The effect of cytomegalovirus infection on T lymphocytes after allogeneic bone marrow transplantation. Clin Exp Immunol 1985;62:278-287.

112.Xhaard A, Moins-Teisserenc H, Busson M, Robin M, Ribaud P, Dhedin N, Abbes S, Carmagnat M, Kheav VD, Maki G, Peffault de Latour R, Toubert A, Socié G. Reconstitution of regulatory T-cell subsets after allogeneic hematopoietic SCT.Bone Marrow Transplant. 2014 Aug;49(8): 1089-92

113.Xiao-jun Huang Current status of haploidentical stem cell transplantation for leukemia J Hematol Oncol. 2008; 1: 27. Published online 2008 December 31. doi: 10.1186/1756-8722-1-27

114. Xinyu Xu, Xiaoyun Wen, Ying Chi, Lei He, Sha Zhou, Xuefeng Wang, Jiaqing Zhao, Feng Liu, and Chuan Su Granzyme B, a new player in activation-induced cell death, is down-regulated by vasoactive intestinal peptide in Th2 but not Thl effectors. J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):97-110.

115.Yang K, Fan ZP, Liu QF, Zhang Y Effect of donor CD4+CD25+ regulatory T cells on hematopoietic and immune reconstitution, GVHD and disease-free survival after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2008 Apr;28(4):537-41

116. Yang X, Stennicke HR, Wang B, Green DR, Jànicke RU, Srinivasan A, Seth P, Salvesen GS, Froelich CJ Granzyme B mimics apical caspases. Description of a unified pathway for trans-activation of executioner caspase-3 and -7.J Biol Chem. 1998 Dec 18;273(51):34278-83

117.Zeiser R, Nguyen VH, Beilhack A et al. Inhibition of CD4+CD25+ regulatory T-cell function by calcineurin-dependent interleukin-2 production. Blood 2006; 108: 390-9

118.E.H. Паровичникова, И.В. Гальцева, И.А. Воробьев Характеристика Т-клеточного звена иммунной системы у больных острыми лейкозами // Терапевтический архив : Научно-практический журнал. - 2006. - Том78, N7. -С. 18-25 :

119.Желнова Е. И., Демидова И.А., Гальцева И. В., Любимова JI. С., Мисюрин А. В., Савченко В.Г. Количественный анализ гемопоэтического химеризма у больных после аллогенной трансплантации стволовых клеток крови методом иммуномагнитной селекции и ПЦР-амплификации гипервариабельных участков ДНК научное издание Молекулярная медицина. - 2009. - N3. - С. 3237

Приложение

Приложение 1. Схемы предтрансплантационного кондиционирования (препараты, дозы, дни введения)

-Кондиционирование Препараты--------- Доза "Дни введения

«Бусульфан+циклофо сфан» Бусульфан 4мг/кг/сут с-7 по -4 дни

циклофосфан 60 мг/кг с-3 по -2 дни

«Тиотепа+флюдараби н+кармустин» Флюдарабин 25 мг/м2/сут с-6 по -4 дни

Тиотепа 10 мг/кг/сут с-5 по -4 дни

Карму стин 400 мг/м2 -6 день

БЬАМЗА (модифицированная) флюдарабин 30 мг/м2/сут с -10 по -7 день и с -4 по -3 день

идарубицин 10 мг/м2/сут с -10 по -8 день

цитозар 2 г/м2/сут с -10 по -7 день

бусульфан 4 мг/кг/сут с -4 по -3 день

«Флюдарабин+бусуль фан» Флюдарабин 30 мг/м2/сут с-10 по -5 дни

бусульфан 4 мг/кг/сут с-6 по -5 дни

«Циклофосфан+треос ульфан» Циклофосфан 60 мг/кг/сут -3 и -2 день

треосульфан 12 г/м2 С -6 по -4

«Флюдарабин+мелфа лан» Флюдарабин 25 мг/м2/сут с-6 по -2 дни

мелфалан 70 мг/м2 с-3 по -2 дни

Приложение 2.Схемы профилактики острой реакции трансплантат против хозяина (препараты, дозы, дни введения)

Схемы Препараты Доза Дни введения

«ЦСА+МТХ» Циклоспорин А 3 мг/кг/сут С-1 дня до 180 дня

Метотрексат 15 мг/м2 в +1 день

10 мг/м2 в +3,6,11 день

«АТГ+ЦСА+ММФ» Антитимоцитарный глобулин 10 мг/кг/сут с-4 по -1 день