Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, доктор биологических наук Гилева, Ирина Павловна

• Гилева, Ирина Павловна
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Гилева, Ирина Павловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость результатов исследования

Апробация работы

Структура и объем диссертации

Положения, выносимые на защиту ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ - ИММУНОМ0ДУЛЯТОРЫ»

1 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ Escherichia coli

2 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ В КЛЕТКАХ НАСЕКОМЫХ

3 ВЫДЕЛЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ИЗ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ И НАСЕКОМЫХ

4 РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ-И ФАРМАЦЕВТИКА

4.1 ИНТЕРФЕРОНЫ АЛЬФА

4.2 ФАКТОРЫ РОСТА КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА

4.3 ВИРУСНЫЕ БЕЛКИ КАК ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ СРЕДСТВА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки»

Актуальность проблемы. Гормоны и цитокины обеспечивают согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем человека в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия. Недостаток гормонов и цитокинов является причиной многих заболеваний человека (например, диабет при недостатке инсулина или нарушение гемопоэза при недостатке гемопоэтических факторов), коррекция которых возможна соответствующими препаратами экзогенного происхождения. Антивирусная, иммуномодулирующая и антипролиферативная активность цитокинов - интерферонов, фактора некроза опухолей (TNF), факторов кроветворения - делает перспективными их использование в качестве лекарственных средств. Выделение биологически активных веществ (БAB)1 белковой природы из природных источников (донорского материала или тканей животных) малоэффективно из-за низких концентраций- целевых продуктов или невозможно из-за иммунологической несовместимости. С другой стороны, гиперпродукция цитокинов' лежит в* основе патогенеза* многих тяжелых заболеваний' человека (в случае гиперпродукции TNF -ревматоидного артрита, менингита, септического шока, кахексии и др.).

Фундаментальные достижения молекулярной биологии, молекулярной генетики и энзимологии легли в основу возникновения^ в 70-х гг. прошлого века генетической инженерии или технологии создания рекомбинантных молекул. Суть этой технологии состоит в соединении in vitro фрагментов ДНК из различных источников и последующем введении «искусственной» ДНК в живую клетку, где она способна реплицироваться, а кодируемая ею информация - экспрессироваться. Наиболее наглядным примером успеха такой методологии является создание новых эффективных лекарственных средств на основе БАВ белковой природы - рекомбинантных гормонов и цитокинов.

К моменту начала работ по теме диссертации было показано, что экспрессия в клетках Escherichia coli генов цитокинов — интерферона а-2 (Nagata et al., 1980; Goeddel D.V. et. al., 1981) или GM-CSF (Burgess A.W. et. al., 1987) позволяет выделить из бактериальных клеток биологически активные рекомбинантные белки. Сотрудниками ГНЦ ВБ «Вектор» (р.п. Кольцове, Новосибирская область) и Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина (г. Москва) методом прямого химического синтеза был получен и клонирован в бактериальной плазмиде (pLelFlac) синтетический ген ifii а-2 человека (Колосов М.Н. и др., 1984). Необходимым продолжением этих работ является разработка стратегии создания высокопродуктивных штаммов Е. coli, обеспечивающих синтез таких важнейших для медицины БАВ, какими являются интерферон и GM-CSF.

В работах ряда исследователей (Щелкунов С.Н., 1995; Alcami А., 2003; Lukas A., McFadden G., 2004) высказаны предположения о возможности использования* вирусных иммуномодуляторных белков для антицитокиновой терапии. Получение таких белков в биологически активной, форме возможно в ряде случаев* только в эукариотических клетках. Удобной системой для решения этой задачи является бакуловирусная система экспрессии.

Настоящая диссертационная работа посвящена конструированию штаммов-продуцентов интерферона а-2Ь и GM-CSF человека на основе бактерии Е. coli, а также рекомбинантных бакуловирусов, содержащих в своем геноме* гены ортопоксвирусных TNF-антагонистов, и изучению свойств рекомбинантных белков, выделенных из бактериальных клеток и инфицированных клеток насекомых.

Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования является получение бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных цитокинов - интерферона а-2Ь человека (hIFNa-2b), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (hGM-CSF) и эукариотических продуцентов TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян (VARV-CrmB, CPXV-CrmB, MPXV-CrmB), а также изучение физико-химических и биологических свойств этих рекомбинантных белков.

Для выполнения* поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

-сконструировать рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых генов в бактериальных клеткаxE.coli;

-изолировать из. вирусных геномов гены TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян и получить рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие гены вирусных TNF-связывающих белков в клетках насекомых;

-выделить из клеток штаммов-продуцентов- и изучить, физико-химические и биологические свойства полученных рекомбинантных белков (hIFNa-2b, hGM-CSF, VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB);

-оценить терапевтический потенциал рекомбинантных белков hGM-CSF и VARV-CrmB.

Научная новизна и практическая значимость результатов исследования. Впервые получены рекомбинантные бакуловирусы BTRi67 и BTRz96, детерминирующие в клетках насекомых линии Sf21 синтез TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы обезьян (белков VARV- и MPXV-CrmB), и впервые проведено сравнительное изучение свойств белков VARV-CrmB; CPXV-CrmB и MPXV-CrmB in vitro. Впервые оценен TNF-нейтрализующий потенциал белка VARV-CrmB относительно некоторых TNF-антагонистов (клеточных TNF— рецепторов, поликлональных антител, TNF-нейтрализующего моноклонального антитела МАК 195, коммерческого препарата Ремикейд) на клетках мышиных фибробластов линии L929. Впервые показана TNF-нейтрализующая активность белка VARV-CrmB in vivo: увеличение количества выживших животных в экспериментальной модели эндотоксического шока и снижение MuTNF-индуцированной подвижности дендритных клеток кожи мышей линии Balb/c. Впервые показана нейтрализация-белком VARV-CrmB эффектов MuTNF на модели костномозгового гемопоэза мышей Balb/c.

Сконструированы, оригинальные рекомбинантные ДНК, обеспечивающие эффективный3 синтез в клетках E.coli продуктов экспрессии, синтетических генов ifnoL-To и gm-csf человека. Получен и депонирован во Всесоюзной- коллекции промышленных микроорганизмов высокоэффективный штамм E.coli SG20050/pIF16 (В-5809) - продуцент рекомбинантного интерферона а-2Ь человека с выходом целевого

7 о продукта j-4 х 10' МЕ/мл/10 кл. На основе этого штамма в ГНЦ ВБ «Вектор» разработана, технология получения субстанции-интерферона а-2Ь и его лекарственных форм. Получен, и депонирован, во Всесоюзной коллекции* промышленных микроорганизмов штамм- E.coli SG20050/p280GM (В-6613) — первый' отечественный продуцент рекомбинантного GM-CSF человека, обеспечивающий выход целевого продукта- в< количестве 20-50 мг/л клеточной суспензии. Показано, что продукт экспрессии синтетического гена, gm-csf в клетках E.coli видоспецифически стимулирует гранулоцитарно-макрофагальную дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток и дендритных клеток. Получен штамм-продуцент и препарат рекомбинантного MuTNF, что позволило использовать этот рекомбинантный белок в экспериментальных моделях при изучении терапевтического потенциала поксвирусных TNF-антагонистов.

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях:

Международный симпозиум «Регуляция трансляции», Рига (1989); Ш-я Всесоюзная конференция «Макромолекулы и клетки», Москва, Россия (1989); 2nd International conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", St. Petersburg, Russia (1992); XI Poxvirus and Iridivirus Meeting, Toledo, Spain (1996); 2nd Russian Principal Investigator Conference, Holland (2001); Международная школа - конференция «Цитокины. Воспаление. Иммунитет», Санкт-Петербург, Россия (2002); 1st International Congress BIOTECHNOLOGY- state of the art&prospects of development, Moscow, Russia (2002); Workshops "Review of Cooperative Biodefense Research Projects, Serpukhov, Russia (2002), St. Petersburg, Russia (2003); International conference "Chemical and biological problems of proteomics", Novosibirsk, Russia (2004); CBR annual review conference, St. Petersburg, Russia (2004); 12th International Congress of Immunology, Montreal, Canada, (2004); XVth International Poxviral- and Iridoviral Symposia, Oxford, UK (2004); Всероссийский научный симпозиум с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск, Россия, (2005); 30th FEBS Congress - 9th IUBMB> Conference, Budapest, Hungary (2006); Научно-практическая* конференция «Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики», XapKiß, Укра'ши, (2006); 17th International Poxvirus and Iridovirus Conference, Grainau, Germany, (2008); XIV International congress of virology, Istanbul, Turkey (2008); Всеросийская научно-практическая конференция «Современные представления об иммунокоррекции», Пенза, Россия, (2008); 18-я Международная конференция «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, Россия (2009); Всероссийская научная конференция «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск, Россия (2010).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список работ, опубликованных по теме диссертации, и библиографический список. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста и включает 126 рисунков и 50 таблиц. Библиографический список содержит 643 источника.

Положения, выносимые на защиту:

1. Экспрессия генов в составе искусственных полицистронных оперонов с сопряженной трансляцией позволила создать бактериальные суперпродуценты рекомбинантных белков:

-интерферона а-2Ь человека с продуктивностью около 60% от суммарного клеточного белка;

-гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека с продуктивностью 15% от суммарного клеточного белка;

-фактора некроза опухолей мыши с продуктивностью 15-20% от суммарного клеточного белка.

2. Гены сгтВ вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян в-составе генома рекомбинантных бакуловирусов детерминируют синтез в клетках насекомых белков, ингибирующих цитотоксическое действие TNF на клетках мышиных фибробластов дозозависимым образом.

3. Видоспецифические отличия в аминокислотных последовательностях белков VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB обуславливают различия их физико-химических и биологических свойств.

4. Белок VARV-CrmB обладает TNF-нейтрализующей активностью in vivo.

Работа выполнялась в ФБУН ГНЦ ВБ Вектор в рамках научных тем организации, по гранту Международного научно-технического центра #1685 «Разработка нового терапевтического препарата на основе ортопоксвирусного белка, связывающего фактор некроза опухолей человека», по грантам РФФИ 06-04-48074а и 10-04-00387а, в рамках

Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России», госконтракт № 100430/—3052/266.

Конструирование рекомбинантных плазмид для экспрессии природных и синтетических генов в клетках Е. coli выполнено автором лично и в соавторстве с В.В. Кравченко, Т.С. Бондарь (НИКТИ БАВ, г. Бердск) и В.Н. Добрыниным, С.А. Филипповым, В.Г. Коробко (ГУН Институт биоорганической химии им. MiM. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, г. Москва). Физико-химический анализ рекомбинантных белков hIFNa-2b и hGM-CSF выполнен автором лично и в соавторстве с ЗА. Акименко, С.И. Ястребовым, В.И. Офицеровым (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Изучение свойств штаммов-продуцентов E.coli SG20050/pIF16 и E.coli SG20050/p280GM проведено в соавторстве с И.А. Андреевой (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») и HiB. Наумовой (ЗАО «Вектор-Медика», р.п. Кольцово). Выделение рекомбинантных белков hIFNa-2b, hGM-CSF и MuTNF проведено в соавторстве с JI.P. Лебедевым, В.П. Романовым, Н.М. Пустошиловой (ФБУН ГНЦ- ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово); А.Н. Закабуниным и Ю.Н. Козловой (ГУН ИХБФМ СО РАН; г. Новосибирск). Изучение биологических свойств рекомбинантного hGM-CSF проведено в соавторстве с С.К. Халдояниди, И.А. Орловской, Л.Б. Топорковой, Л.В. Сахно, C.B. Сенниковым (ГУН НИИКИ СО РАМН, г. Новосибирск). Изучение CrmB-белков ортопоксвирусов выполнено автором под общим руководством С.Н. Щелкунова. Конструирование рекомбинантных. бакуловирусов BTRi67, BTRz96 и BTRgr90 проведено И.А. Рязанкиным, З.А. Максютовым, A.B. Тотмениным при участии автора. Компьютерный анализ аминокислотных последовательностей CrmB-белков проведен A.B. Тотмениным и Д.В. Антонецом (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово). Выделение CrmB-белков проведено Л.Р. Лебедевым (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово). Изучение физико-химических и иммунологических свойств CrmB-белков проведено автором лично и в соавторстве с И.А. Рязанкиным, Н.М. Пустошиловой и

Г.Н. Афиногеновой (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово). Изучение TNF-нейтрализующих эффектов CrmB-белков на клетках линии L929 и на модели ЛПС-индуцированного септического шока проведено автором лично, Т.С. Непомнящих под руководством автора и совместно с Г.В. Кочневой и A.A. Гражданцевой (ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», р.п. Кольцово). Изучение TNF-нейтрализующих эффектов белка VARV-CrmB в экспериментальных моделях костномозгового колониеобразования и ингибирования миграции клеток Лангерганса выполнено совместно с Л.Б. Топорковой, И.А. Орловской, Е.А. Вязовой (ГУН НИИКИ СО РАМН, г. Новосибирск). Автор также приносит благодарность настоящим и бывшим сотрудникам ФБУН ГНЦ ВБ «ВЕКТОР», внесшим свой вклад в проведение настоящего исследования -В.А. Лихошваю, В.В. Шамину, О.И. Серпинскому, Е.И. Рябчиковой, Е.М. Майковой, И.В. Виноградову, В.А. Агеенко и сотрудникам отдела Геномных исследований и разработки методов ДНК-диагностики поксвирусов. Особую благодарность автор выражает к.х.н. В.В. Кравченко - инициатору изучения механизмов экспрессии генов в составе полицистронных оперонов и Е.А. Каргиновой за радость совместной работы, д.б.н., профессору С.К. Василенко, отношение которого к жизни и науке являются примером.

По теме диссертации опубликовано 20 печатных работ (16 статей в научных журналах и сборниках научных трудов). Часть результатов-защищена патентами (4 Патента РФ). Патент РФ № 2241754 включен в список 100 лучших патентов России за 1997-2007 гг.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

РЕКОМБИНАНТНЫЕ БЕЛКИ - ИММУНОМОДУЛЯТОРЫ»

Несколько типов клеток используется в настоящее время для получения рекомбинантных белков: прокариотические (Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus species) (Stellwag E.J., Brenchley J. E., 1986; Hannig G., Makrides S.C., 1998) и дрожжевые (Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae) (Marugg J.D. et al., 1995; Herrmann G.F. et al., 1995), насекомых (калифорнийская совка, тутовый шелкопряд) (Kost Т.А, 2005) и теплокровных. Бесклеточные экспрессионные системы предоставляют возможность синтеза рекомбинантных белков in vitro (лизат ретикулоцитов, зародышей пшеницы, лизат клеток Escherichia coli , ооциты Xenopus levis) (Spirin A.S. et al., 1988; Spirin A.S., 2004). Трансгенные растения и животные и (Щелкунов С.Н., 2004; Houdebine L.M., 2002) представляют собой живые биореакторы.

Не существует идеальных экспрессионных систем (типов клеток) для получения рекомбинантных белков,- каждая имеет свои преимущества и недостатки. В таблице 1 (Sodoyer R., 2004) представлен анализ преимуществ и недостатков различных экспрессионных систем.

Возможность достижения поставленной цели во многом определяется правильностью выбора экспрессионной системы, однако следует отметить, что исторически первой и наиболее распространенной до настоящего времени экспрессионной системой являются клетки E.coli. К 2003г 80% белков с известными третичными структурами, представленные в базе данных PDB, получены экспрессией в E.coli (Baneyx F., 1999). Вторая по значимости система - экспрессия в клетках насекомых генов целевых белков, интегрированных в геном бакуловирусов.

Обе эти экспрессионные системы использовались для выполнения настоящего исследования.

Таблица 1

Сравнительный анализ преимуществ и недостатков различных экспрессионных систем

Экспрессионная система* Достоинства Недостатки Экономичность Стадия разработки

Прокариоты

Escherichia coli -всесторонне хорошо изученный биологический объект; -большое разнообразие коммерчески доступных экспрессионных векторов; высокая скорость роста* *(30 мин) и высокий выход (до 50500 мг/л целевого продукта; -образование «телец включения» в ряде случаев упрощает схему очистки целевого продукта; -отсутствие контаминации целевых продуктов вирусами или прионами. -внутриклеточная экспрессия в грамотрицательных бактериях (хотя известны системы с периплазматической экспрессией целевых продуктов); -присутствие метионина как N-концевой аминокислоты в рекомбинантных белках; -контаминация бактериальными эндотоксинами, что требует специальных способов очистки и контроля целевых продуктов; -отсутствие пострансляционных модификаций (гликозилирования, алкилирования и т.д.); -необходимость ренатурации in vitro целевого продукта. -относительная дешевизна компонентов питательных сред; -возможность крупномасштабного культивирования; высокая скорость роста* *(30 мин) и высокий выход (до 50-500 мг/л) целевого продукта. Промышленный уровень.

Bacillus subtilis -секреция рекомбинантных белков; -пониженный уровень аетивности протеаз в клетках. • R&D.

Саи1оЬас(ег сгехсеМт -экспонирование рекомбинантных белков на поверхности клетки-хозяина; -простой метод выделения рекомбинантных белков. -отсутствие пострансляционных модификаций.

ЬасЮсоссш 1асйн -секреция рекомбинантных белков, позволяющая применять современные технологии очистки целевых продуктов. Лабораторные разработки.

Эукариоты

Клетки теплокровных -экспрессия целевого продукта в нативной форме; -возможность экспрессии и секреции сложных пострансляционно- модифицированных белков; -коммерчески доступные экспрессионные векторы. -возможная контаминация вирусами; -использование линий трансформированных клеток проблематично по соображениям онкологической безопасности. -низкая скорость роста** (24 час) и продолжительное время ферментации; -низкий выход целевого продукта (0.1-10 мг/л); -дорогостоящие компоненты культуральных сред и необходимость специального оборудования для культивирования. Промышленный уровень.

Клетки насекомых (Lepidotera, Bombax morí) -возможность крупномасштабного суспензионного культивирования; -протеолиз и К-, 0- гликозилирование, ацилирование, карбоксиметилирование, фосфорилирование целевых продуктов; -коммерчески доступные экспрессионные векторы и линии клеток насекомых; -возможность экспрессии токсических продуктов; -секреция целевых продуктов в нативной форме; -отсутствие патогенности у бакуловирусов для человека(уровень биобезопасности ВЫ). -проблема стабильности клеточных линий; -бакуловирусная инфекция приводит к контаминации целевого продукта иммуногенными белками клеток-хозяев; -различия систем гликозилирования клеток насекомых и теплокровных; -невозможность правильного процессинга из белков-предшественников (т.е.пептидных гормонов, нейропептидов, ростовых факторов, матриксных металлопротеаз). -дорогостоящие компоненты культуральных сред; -низкая скорость роста** (18-24 час); -высокий выход целевых продуктов (10-500 мг/л). Промышленный уровень.

Клетки растений -секреция и правильный процессинг целевых продуктов; -коммерчески доступные экспрессивные векторы; -уровень биобезопастности ВЫ. -различия систем гликозилирования растительных и животных клеток. -низкая себестоимость рекомбинантных белков; -нелимитированная возможность масштабирования производства рекомбинантных белков. Лабораторные разработки.

Дрожжевые клетки (Saccharomyces -всесторонне хорошо изученный -система гликозилирования дрожжей не идентична -простота и экономичность (относительная дешевизна сегеч'тае, ПсЫа равШт) биологический объект; -посттрансляционная модификация целевого продукта; -отсутствие контаминации целевого продукта эндотоксинами и низкая контаминация белками и ДНК дрожжевых клеток; -секреция целевого продукта в культуральную среду. гликозилированию в клетках теплокровных; -гипергликозилирование может отрицательно сказываться на биологической активности целевого продукта; -протеолиз целевого продукта. компонентов питательных сред) крупномасштабного культивирования; -высокая скорость роста**(90 мин) и высокий выход целевых продуктов (10-1000 мг/л). Промышленный уровень.

Простейшие {ЬеНтпата Шгеп1о1ае) -правильный процессинг целевых продуктов. -генетически плохо изученный объект. -относительная дешевизна компонентов питательных сред.

Трансгенные животные -правильный процессинг целевых продуктов; -низкая себестоимость. -недостаточно изученные механизмы регуляции; -риск заражения вирусами и прионами; -коэкспрессия животных белков. -высокий выход целевых продуктов (5-50 г/л); -относительно долгое время проходит от момента создания экспрессионной конструкции до достижения промышленного уровня продукции (18-33 месяца); Лабораторные разработки.

Бесклеточные системы

СЕСР/СРСР) -позволяет производить токсические вещества и использовать для синтеза неприродные аминокислоты. выход целевых продуктов до 100

Экстракт Е.соН -позволяет -отсутствие поспрансляционных мг. производить модификаций. токсические вещества и использовать для синтеза неприродные аминокислоты;

-введение меток в белки.

Экспрессионная система * - тип клеток, в которых синтезируется целевой продукт; скорость роста** - время удвоения числа клеток.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Гилева, Ирина Павловна

выводы

1. Предложен способ эффективной экспрессии генов в составе искусственного полицистронного оперона, в котором последовательность SD дистального гена перекрывается с терминирующим кодоном проксимального.

2. Получены рекомбинантные плазмиды (pIF6/8, p381IFN, p381/2IFN, p280IFN, p280/2IFN, pIF16), обеспечивающие в клетках E.coli SG20050 конститутивный синтез интерферона a-2b человека, составляющий 1060% от суммарного клеточного белка. Штамм-продуцент рекомбинантного интерферона а-2Ь человека E.coli SG20050/pl¥\6 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер В-5809).

3. Получены рекомбинантная плазмида p280GM, содержащая синтетический ген гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, и штамм E.coli SG20050/2&0GM — продуцент соответствующего цитокина с уровнем синтеза целевого продукта около 15% от суммарного белка клетки. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер В-6613).

4. Показано, что продукт экспрессии синтетического гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека в клетках E.coli видоспецифически стимулирует дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток.

5. Получены и депонированы в музее Культур клеток микроорганизмов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» рекомбинантные бакуловирусы BTRi67, BTRz96 и BTRgr90, детерминирующие синтез растворимых TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы обезьян и оспы коров (коллекционные номера VB-01, VB-03 и VB-02).

6. Показано, что видоспецифические аминокислотные замены в TNF-связывающих белках вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян выражаются в различных физико-химических и биологических свойствах этих белков:

-степень ингибирования связывания hTNF с собственными поликлональными антителами уменьшается в ряду VARV-CrmB->CPXV-CrmB->MPXV-CrmB;

-различается эффективность ингибирования цитотоксического действия человеческого, мышиного, кроличьего TNF и LT-a человека на клетки мышиных фибробластов линии L929;

-только белок VARV-CrmB оказывает выраженный лечебный эффект на проявления ЛПС-индуцированного эндотоксического шока у мышей линии Ва1Ь/с, достоверно увеличивая процент выживших животных.

7. Показано, что белок VARV-CrmB, синтезирующийся в клетках насекомых, обладает олигомерной структурой и гликозилирован.

8. Рекомбинантный белок VARV-CrmB нейтрализует in vitro:

-цитототоксическое действие hTNF на культуре клеток мышиных фибробластов линии L929 с эффективностью на 2-3 порядка превышающей аналогичные эффекты растворимых клеточных TNF-рецепторов 1-го и 11-го типов и соизмеримой с активностью TNF-нейтрализующего моноклонального антитела МАК195;

-MuTNF-опосредованые эффекты в экспериментальной модели костномозгового колониеобразования мышей Ва1Ь/с, увеличивая количество эритроидных и уменьшая количество гранулоцитарно-макрофагальных колоний до базального уровня.

9. Рекомбинантный белок VARV-CrmB in vivo нейтрализует MuTNF-индуцируемую миграцию клеток из кожного лоскута мышей линии Ва1Ь/с.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах:

1. Гилева И.П., Мизенко Г.А., Серпинский О.И., Аммосов А.Д., Кравченко В.В. Усиление экспрессии клонированных генов в результате использования системы искусственного полицистронного оперона // Доклады АН СССР. 1986. Т. 288. № 3. С. 734-737.

2. Кравченко В.В., Гилева И.П., Шамин В.В., Лихошвай В.А., Куличков В.А., Добрынин В.Н., Филиппов С.А., Чувпило С.А., Коробко В.Г. Конструирование и свойства искусственных полицистронов на основе укороченных генов триптофанового оперона E.coli и белка оболочки фага М13 // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. № 9. С. 1176-1185.

3. Кравченко В.В., Гилева И.П., Шамин В.В., Лихошвай В.А., Куличков В.А., Добрынин В.Н., Филиппов С.А., Чувпило С.А., Коробко В.Г. Дупликация синтетического гена лейкоцитарного интерферона человека и его экспрессия в составе полицистронной мРНК с сопряженной системой трансляции // Биоорган, химия. 1987. Т. 13. №9. С. 1186-1193.

4. Акименко З.А., Зыков С.А., Шапров В.В., Офицеров В.И., Гилева И.П., Кравченко В.В. Химически синтезированный ген обеспечивает в Е. coli синтез полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека альфа-2 // Доклады АН СССР. 1991. Т. 319. С. 1248-1251.

5. Гилева И.П., Бондарь Т.С., Блинова H.H., Халдояниди С.К., Кравченко В.В., Ястребов С.И., Офицеров В.И., Коробко В.Г. Экспрессия синтетического гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора в Е. coli // Доклады АН СССР. 1994. Т. 336. С. 254-256.

6. Гилева И.П., Рязанкин И.А., Максютов З.А., Тотменин A.B., Агеенко В.А., Нестеров А.Е., Щелкунов С.Н. Сравнительное изучение свойств ортопоксвирусных растворимых рецепторов фактора некроза опухолей // Доклады РАН. 2003. Т. 390. № 5. С. 1-5.

7. Гилева И.П., Рязанкин И.А., Непомнящих Т.С., Тотменин A.B., Максютов З.А., Лебедев Л.Р., Афиногенова Г.Н., Пустошилова Н.М., Щелкунов С.Н. Экспрессия генов TNF-связывающих белков ортопоксвирусов в клетках насекомых и изучение свойств рекомбинантных белков // Молек. биол. 2005. Т. 39. С. 245-254.

8. Гилева И.П., Малкова Е.М., Непомнящих Т.С., Виноградов И.В., Лебедев Л.Р., Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Рябчикова Е.И., Щелкунов С.Н. Изучение действия TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы на развитие ЛПС-индуцированного эндотоксического шока // Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5. С. 44-48.

9. Gileva I.P., Nepomnyashchikh Т.С., Antonez D.V., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grazhdantseva A.A., Shchelkunov S.N. Properties of the recombinant TNF-binding proteins from variola, monkeypox and cowpox viruses are different H Biochemica et Biophysica Acta. 2006. V. 1764. P. 1710-1718.

Ю.Сахно Л.В., Леплина О.Ю., Тихонова M.A., Распай Ж.М., Гилева И.П., Никонов С.Д., Жданов O.A., Останин A.A., Черных Е.Р. Характеристика дендритных клеток, генерируемых в присутствии интерферона-a, у больных туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2007. № 3. С. 42-46.

П.Топоркова Л.Б., Орловская И.А., Сенников C.B., Сахно Л.В., Козлова Ю.Н., Лебедев Л.Р., Гилева И.П. Изучение in vitro биологических свойств рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора // Иммунология. 2009. № 4. С. 203-205.

12.Гилева И.П., Непомнящих Т.С., Рязанкин И.А., Щелкунов С.Н. Рекомбинантный TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы как потенциальный TNF-антагонист нового поколения // Биохимия. 2009. Т. 74. С. 1664-1671.

13. Топоркова Л.Б., Петухова A.A., Гилева И.П., Орловская И.А. Рекомбинантный белок вируса натуральной оспы нейтрализует эффекты фактора некроза опухолей на модели костномозгового гемопоэза мышей Balb/c // Мед. Иммунология. 2010. Т. 12. № 4-5. С. 275-280.

14. Цырендоржиев Д.Д., Сенников C.B., Вязовая Е.А., Гилева И.П., Щелкунов С.Н., Рязанкин И.А., Лебедев Л.Р., Топоркова Л.Б., КурилинВ.В., Петухова A.A., Орловская И.А. Влияние рекомбинантного TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы на миграционную и окислительно-восстановительную функции лейкоцитов крови мышей при эпикутанной аппликации фактора некроза опухолей // Бюллетень СО РАМН. 2011. Т. 31. № 3. С. 73-79.

Работы, опубликованные в сборниках научных трудов:

1. Гилева И.П., Кравченко В1В:, Шамин В.В. Роль структуры матричных РНК в регуляции биосинтеза: белка у прокариот. // Генетическая инженерия, молекулярная биология, селекция промышленных микроорганизмов: Обзорн. информ. М.: ВНИИСЭНТИ. 1990. Вып. Г. С. 1-22.

2. Романов В.П., Андреева И.С., Гилева И.П;, Порываев ВЩ., Пучкова Л.И., Закабунин А.И. Разработка методов повышения стабильности продуцента и способа выделения рекомбинантного альфа-2-интерферона человека // Сборник науч. тр. сотрудников НИКТИ БАВ. Посвящается 25-летию института. Бердск. 1996. С. 55-63.

Патенты:

1. Гилева И.П., Бондарь Т.С., Коробко В.Г., Кравченко В.В., Сандахчиев Л.С. Рекомбинантная плазмидная ДНК p280GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, и штамм

E.coli SG20050/p280GM — продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. Патент РФ 2091488, опубликован 27.09.1997, бюлл. № 27.

2. Кравченко В.В., Гилева И.П. Сандахчиев JI.C., Петренко В.А., Коробко В.Г., Добрынин В.Н. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIF16, кодирующая полипептид со свойствами интерферона альфа-2 человека, и штамм E.coli SG20050/pIF16 — продуцент полипептида со свойствами интерферона альфа-2 человека. Патент РФ № 2054041, опубликован 10.02.1996, бюлл. №4.

3. Пикалова М.И., Наумова Н.В., Доманова З.М., Хайбулина И.И., Гилева И.П., Колокольцов A.A. Способ промышленного получения рекомбинантного GM-CSF человека. Патент РФ 2144083, опубликован 10.01.2000, бюлл. № 1.

4. Гилева И.П., Щелкунов С.Н., Рязанкин И.А., Максютов З.А., Тотьменин A.B., Нестеров А.Е., Агеенко В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFastBac-G2R, содержащая фрагмент генома вируса натуральной оспы, кодирующий белок-аналог рецептора ФНО, и штамм бакуловируса BTRi67, продуцирующий растворимый рецептор ФНО вируса натуральной оспы. Патент РФ № 2241754, опубликован 10.12.2004, бюлл. №34.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Широкий спектр биологических активностей цитокинов позволяет использовать их для коррекции иммунопатологий человека. Однако единственным возможным способом получения цитокинов для терапевтических нужд является экспрессия генов соотвествующих цитокинов в составе рекомбинантных плазмид. Способ экспрессии генов в составе искусственных полицистронных оперонов, представленный в настоящем исследовании, использован для конструирования бактериальных штаммов-продуцентов рекомбинантных цитокинов - интерферона а-2Ь и ОМ-С8Б человека, обладающих антивирусными и иммуномодуляторными свойствами.

Продукт экспрессии искусственного гена интерферона а-2Ь человека в бактериальных клетках Е.соИ обладает физико-химическими и биологическими свойствами природного аналога. На основе созданного штамма-продуцента Е.соИ 5020050/рПЧб в ГНЦ ВБ «Вектор» разработана эффективная отечественная технология получения субстанции интерферона альфа-2Ь человека и готовых лекарственных форм на его основе. В 2000 году эта работа удостоилась Премии Правительства Российской Федерации в области науки и техники. В настоящее время ЗАО «Вектор-Медика» выпускается несколько видов лекарственных форм, представленных ниже.

Реаферон-ЕС

Регистрационное удостоверение Р № 000642/01. Реаферон-ЕС - человеческий рекомбинантный интерферон альфа-2Ь - белок, синтезированный бактериальным штаммом кишечной палочки, в генетический аппарат которой встроены два гена человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2Ь. Реаферон-ЕС идентичен человеческому лейкоцитарному интерферону альфа-2Ь. Представляет собой порошок или пористую массу белого цвета. В качестве криопротектора содержит человеческий донорский альбумин в конечной концентрации 5 мг/мл, проверенный на отсутствие НВв антигена и антител к вирусу СПИД.

Реаферон-ЕС Липинт

ЮВДЙ

С^ ЗАО -«СЖГО^-МГ^,^. ^^

РЕАШЕРОН ЕС ЛШ1ИМЇ

ЛИ ПОСОМА Л і. м ы и

ЛИ ПГ|>4>рЛ*Ъ1ПМО •ІІМІїИІ'ЇНп»« 1««мм

ИНТЕРФЕРОН АЛЬФА

Регистрационное удостоверение Р № 000821/01-2001. Реаферон-ЕС Липинт — интерферон альфа, заключенный в липосомы, лиофильно высушенный. Пористая масса белого цвета, содержащая интерферон альфа-2 человеческий рекомбинантный в количестве 0.5 млн МЕ, в качестве антиоксидантов - витамины Е (10 мг) и С (1.5 мг). ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА: Обладает противовирусным и иммуномодулирующим свойствами, обусловленными наличием в препарате интерферона альфа-2. ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ: Применяется в комплексной терапии у больных острым гепатитом В, хроническим гепатитом В в активной и неактивной репликативных формах, а также хроническим гепатитом В, осложненным гломерулонефритом. Для лечения больных атопическими заболеваниями, аллергическим риноконъюнктивитом, бронхиальной астмой при проведении специфической иммунотерапии. Применяется для профилактики и лечения гриппа и ОРЗ у взрослых.

Инфагель

Инфагель - мазь интерферона альфа-2 рекомбинантного на гидрогелевой основе -лекарственное средство для наружного применения, представляющее сорбированный на геле гидроокиси алюминия интерферон альфа-2 рекомбинантный, полученный из генетически модифицированного штамма-продуцента. Входящий в состав мази поливиниловый спирт обеспечивает необходимую консистенцию и способствует пленкообразованию при высыхании на коже. Мазь - густая, гелеобразная, однородная масса белого или сероватого цвета, стерильна, при хранении может частично расслаиваться (перед употреблением перемешать).

Лайфферон

СУХОЙ «10Ч>ИЛИЗЛТ

Новый современный препарат интерферона альфа-2Ь - преемник Реаферона. Более высокая степень очистки, технологически недоступная на предыдущем этапе развития, позволяет отнести Лайфферон к следующему поколению препаратов.

Конструирование штамма Е.соИ 8С20050/р2&(ЮМ - продуцента рекомбинантного ОМ-С8Р открывает перспективу получения субстанции рекомбинантого вМ-С^Р человека и лекарственных форм на его основе -отечественных аналогов дорогостоящих импортных препаратов для нужд отечественного здравоохранения.

Проведенное в настоящей работе изучение свойств нового класса ТМ7-антагонистов - поксвирусных ТМР-связывающих белков пока еще далеко до завершения, но полученные на этом этапе экспериментальные данные свидетельствуют о перспективности продолжения фундаментальных исследований, направленных на изучение взаимодействия вирусных иммуномодуляторных белков с иммунной системой теплокровных. Несомненный терапевтический потенциал белка УАЕ.У-СгшВ позволяет рассматривать его как базовый элемент для разработки нового поколения иммунокорректирующих терапевтических средств.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Гилева, Ирина Павловна, 2011 год

1. Аратюнян АА., Северин Е.С., Варшавский Я.М. // Биохимия. 1975. Т. 40. С. 878-884.

2. Афиногенова Г.Н., Гладченко Т.Н., Веревкина К.Н., Пустошилова Н.М. Метод определения примесей белков E.coli в препаратах рекомбинантных цитокинов» Сб. научных трудов сотрудников НИКТИ БАВ ГНЦВБ «Вектор», г. Бердск. 1999 г. С. 68-75.

3. Барштейн Ю.А., Персидский Ю.В., Грутман М.И. Взаимосвязь структурной перестройки эндотелия микрососудов печени с изменениями в клетках Купфера и гепатоцитах при развитии грамотрицательной инфекции // Арх. патол. 1990. Вып. 12. С. 33-38.

4. Белжерарская С.Н. Бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых // Молекулярная биология. 2002. Т. 36. № 3. С. 371-385.

5. Бессмельцева Е.В., Зайцев Б.Н., Гилева И.П., Рябчикова Е.И. Изучение морфологии клеток E.coli продуцентов рекомбинантных белков с помощью электронной и атомно-силовой микроскопии // Поверхность.2003. Т. 7. С. 39-42.

6. Вовк А.Д. Пегилированные интерфероны новое слово в лечении вирусного гепатита С // Здоров'я Укра!'ни. 2003. № 19. С. 28.

7. Воронцова А.Л., Кудрявец Ю.И. Интерферон как важный элемент оптимизации лечения онкологических больных // Онкология. 2000. Т. 2. № 1-2. С. 16-20.

8. Вязовая Е.А., Орловская- И.А., Козлов В.А. Влияние эпикутанных (накожных) аппликаций мелкодисперсных минеральных композиций на морфо-функциональные показатели иммунной системы // Иммунология. 2007. Т. 28. С. 338 342.

9. Денисова Л. Я., Батурина И. И., Закабунин А. И. и др. Определение примесей липополисахаридов в препаратах белков // Журн. микробиол. 1999. №5. С. 109-112.

10. Ершов Ф.И., Киселёв О.И. Интерфероны и их индукторы (от молекул до лекарств). М: ГЭОТАР-Медиа, 2005 г.

11. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск: Сибирское университетское издательство, 2003. 480 С.

12. Игонин A.A., Кукес В.Г., Пальцев М.А. Сепсис: молекулярные механизмы системного воспаления в качестве модели для изучения перспективных терапевтических мишений // Молекулярная Медицина.2004. Т. 2. С. 3-12.

13. Калинин Ю.Е., Тимофеев И.В., Перминова Т.П. и др. Модельная система для изучения стабильности эукариотических генов и экспрессированных белков в открытом космосе // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2000. Т. 34. № 2. С. 61-66.

14. Калинин Ю.Е., Тимофеев И.В., Перминова Т.П. и др. Подходы к изучению структурно-функциональной белковых молекул в условиях международной космической станции // Авиакосмическая и экологическая медицина. 2000. Т. 34. № 5. С. 65-71.

15. Колосов М.Н., Коробко В.Г., Добрынин В.Н. и др. Способ получения полипептида с активностью интерферона микробиологическим синтезом // Бюл. изобр. 1984. № 18.

16. Корепанова C.B., Ерошкин A.M., Иванисенко В.А. и др. Получение фактора некроза опухолей человека (ФНО) с повышенной стабильностью к протеазам // Молекулярная биология. 1994. Т. 28. С. 143-149.

17. Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Нгуен Куанг Винь и др. Плазмидные векторы с полусинтетическим геном ß-галактозидазы // Биоорг. химия. 1983. Т. 9. №9. Р. 1132-1134.

18. Лебедев Л.Р., Зернов Ю.П., Андреева И.С., Пустошилова Н.М. Разработка технологии получения фактора некроза опухолей и его исследования//Биотехнология. 1995. Т. 12. Р. 19-24.

19. Кравченко В.В., Шамин В.В., Гилева И.П. и др. Механизм регуляции трансляции полицистронных мРНК. Роль взаимного расположения цистронов // ДАН СССР. 1987. Т. 295. С. 745-748.

20. Кравченко В.В., Ямщиков В.Ф., Плетнев A.A. Плазмидныей вектор для контролируемой терпературой экспрессии генов // Биоорг. химия. 1985. Т. 11.С. 523-533.

21. Кравченко В.В., Шамин В.В., Гилева И.П. и др. Эффективность трансляции дистального гена в полицистронах зависит от взаимного расположения регуляторных сигналов на матрице // Биоорг. химия. 1988. Т. 14. № Ю. С. 1372-13834.

22. Кравченко В.В., Гилева И.П., Добрынин В.Н. и др. Положение инициирующего кодона AUG относительно 5'-конца мРНК влияет на эффективность трансляции в кдетках E.coli // Биоорг. химия. 1988. Т. 14. №. С. 1387-1391.

23. Кравченко В.В., Шамин В.В., Гилева И.П. и др. Влияние альтернативных вторичных структур на эффективность трансляции полицистронных мРНК // Доклады АН СССР. 1998. Т. 301. С. 480-483.

24. Кэтти Д. Антитела. Методы (книга 1). М.: Мир, 1991. С. 106.

25. Лебедев Л.Р., Гилева И.П., Карпенко Л.И., Ерошкин A.M. Конструирование искусственного иммуногена для кандидатной вакцины к вирусу ВИЧ-1 // Мол. Ген. Микроб. Вирус. 2000. Т. 3. С. 3640.

26. Лебедев Л.Р., Зернов Ю.П., Андреева И.С., Пустошилова Н.М. Разработка технологии получения фактора некроза опухолей и его исследования//Биотехнология. 1995. Т. 12. Р. 19-24.

27. Лебедев Л.Р., Рязанкин И.А., Сизов A.A. и др. Способ очистки антагонистов фактора некроза опухолей и исследование их некоторых свойств //Биотехнология. 2001. Т. 6. С. 14-18.

28. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы. М.: Товарищество научных изданий КМК, 1998.

29. Машко C.B., Ляпидус А.Л., Лебедева Н.И. и др. Достижение высокоэффективной экспрессии клонированных генов путем конструирования «гибридного оперона» // ДАН СССР. 1984. Т. 21. С. 1487-1490.

30. Машко C.B., Ляпидус А.Л., Трухан М.Э. и др. Исследование эффективности трансляционного сопряжения в гибридных оперонах // Молекулярная биология. 1987. Т. 21. С. 1310-1321.

31. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М: Мир, 1976. С. 561-563.

32. Непомнящих Т.С., Лебедев Л.Р., Рязанкин И.А. и др Сравнительное изучение рекомбинантных интерферон-у-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы обезьян // Молекулярная биология. 2005. Т. 39. С. 1055-1062.

33. Непомнящих Т.С. Изучение свойств< гамма-интерферон- и TNF-связывающих белков ортопоксвирусов. Автореферат диссертации к. б. н. Новосибирск, 2006.

34. Непомнящих Т.С., Антонец Д.В., Гилева И.П., и др. Изучение структурно-функциональных свойств ортопоксвирусных белков, связывающих фактор некроза опухолей // Молекулярная биология. 2010. Т. 44. С. 1054-1063.

35. Никитин И.Г. Пегилированные интерфероны-альфа: новые возможности в лечении хронического гепатита С // Сучасш шфекцп. 2003. № 1.С. 120-128.

36. Николенко Г.Н., Кравченко М.М., Сваровская Е.С. и др. Регуляция трансляции дистального (lacZ) гена полицистронной мРНК. Роль потока рибосом // Биоорганическая химия. 1997. Т. 23. Р. 200-204.

37. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. М.: Наука, 2000. 528 С.

38. Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. М.: Наука, 2004. С. 13 -519.

39. Пермяков Н.К., Яковлев М.Ю., Галанкин В.Н. Эндотоксин и система полиморфноядерного лейкоцита // Арх. патол. 1989. Вып. 5. С. 3-11.

40. Рязанкина О.И., Туманова О.Ю., Колосова И.В. и др. Структурно-функциональная организация генома вируса оспы коров GRI-90 I. Выделение клонов фрагментов ДНК полного генома вируса оспы коров //Молекулярная биология. 2000. Т. 34. С. 160-166.

41. Серпинский О.И., Каргинова Е.А., Микрюков Н.Н. и др. Конструирование и свойства вектора для клонирования промоторсодержащих фрагментов ДНК. Клонирование промоторов E.coli и бактериофага Т7 // Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. С. 840847.

42. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРФЕРОНА-АЛЬФА-2 ИЗ НЕРАСТВОРИМЫХ ТЕЛ ВКЛЮЧЕНИЯ. Патент РФ 2123010. Опублик. 10.12.1998. Бюлл. изобр. №16.

43. Способ получения человеческого лейкоцитарного интерферона альфа-2 рекомбинантными бактериями Pseudomonas species: авторское свидетельство СССР 1712416.

44. Старокадомский П.Л. Белковый сплайсинг (теория) // Молекулярная биология. 2007. Т. 41. № 2. С. 314-330.

45. Шмелев В.А., Бунина З.Ф., Кудрявцева Т.Ю. // Мол. ген. микробиол. вирусол. 1995. №. 1. С. 9-14.

46. Черствой Е.Д., Сятковский В. А., Григорьев Д.Г. Синдром диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови при эдотоксиновом шоке //Арх. патол. 1990. Вып. 9. С. 51-56.

47. Щелкунов С.Н. Иммуномодуляторные белки ортопоксвирусов // Молекулярная биология. 2003. Т. 37. С. 41-53.

48. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия. Ч. 1. Новосибирск: Изд-во Новосибирского ун-та., 2004. 304 с.