Разработка технологии суспензионного культивирования клеток CHO для получения рекомбинантного интерферона-бета-1а тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Лобанова, Наталия Валентиновна

• Лобанова, Наталия Валентиновна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лобанова, Наталия Валентиновна

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Интерферон-бета - строение, свойства и применение

1.2. Этапы создания продуцентов рекомбинантных белков

1.3. Получение биофармацевтических препаратов с помощью культур клеток млекопитающих

1.4. Методы оптимизации процессов культивирования клеток СНО

1.5. Режимы и аппаратурное оформление процессов культивирования

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Технология получения рекомбинантного ИФН-Р- 1а

2.2.2. Создание клонов-продуцентов ИФН-Р-1а

2.2.3. Выбор клонов, обладающих максимальной продуктивностью

2.2.4. Изучение стабильности клонов-продуцентов ИФН-Р-1а

2.2.5. Подбор питательной среды, оптимальной для культивирования клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-Р- 1а

2.2.6. Подбор параметров культивирования

2.2.7. Оптимизация состава питательной среды для увеличения продуктивности клона-продуцента

2.2.8. Оптимизация состава среды для улучшения состава гликозилированных форм ИФН-Р-1а

2.2.9. Анализ ростовых характеристик, продуктивности и гликозилирования при культивировании биореакторах

2.2.10. Технологическая схема процесса и материальный баланс

2.2.11. Экономическая эффективность процесса

3. ОСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ

ВЫВОДОВ

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CHAPS - 3-[(3-холамидопропил) диметиламмония]-1-пропансульфонат CMV, hCMV, mCMV - цитомегаловирус, человека, мыши DHFR - дигидрофолатредуктаза EF-1 а - фактор элонгации -1 а

IFNAR - трансмембранный рецептор интерферона-альфа IRF - интерферон-регулирующий фактор SDS - додецилсульфат натрия АК - аминокислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография ГЛФ - готовая лекарственная форма ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК, кДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, кодирующая

ДТТ - дитиотреитол

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН-Р - интерферон-бета

КЖ - культуральная жидкость

мкАТ - моноклональные антитела

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК, дцРНК, мРНК - рибонуклеиновая кислота, двухцепочечная, матричная

PC - рассеянный склероз

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ЦНС - центральная нервная система

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии суспензионного культивирования клеток CHO для получения рекомбинантного интерферона-бета-1а»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Получение белков медицинского назначения, произведенных по рекомбинантной технологии, является одной из наиболее перспективных и динамически развивающихся отраслей науки в современном мире. На настоящий момент на мировом рынке реализуется несколько сотен препаратов, полученных на основе рекомбинантных белков, еще около тысячи находится на стадии регистрации и начала производства после проведенных клинических исследований. Данные препараты успешно применяются для лечения онкологических, сердечно-сосудистых, аутоиммунных и других тяжелых заболеваний человека, и объем их продаж занимает одно из ведущих мест в мире. Значительную часть производимых рекомбинантных препаратов представляют гликозилированные белки (цитокины, гормоны, антитела, факторы коагуляции и др.), получение которых осуществимо только в клетках млекопитающих (17, 145, 190).

Одним из широко используемых белков, получаемых по рекомбинантной технологии, является интерферон-бета (ИФН-ß). Данный биотехнологический препарат входит в список жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств, кроме оригинального препарата производится множество биоаналогов. ИФН-ß является эффективным средством борьбы с рассеянным склерозом (PC) - хроническим аутоиммунным заболеванием ЦНС, характеризующимся обширными повреждениями головного мозга. Эффективность ИФН-ß подтверждена в ходе многоцентровых клинических испытаний (54).

Коммерчески доступные рекомбинантные препараты ИФН-ß бывают двух типов: интерферон-бета-16 (ИФН-ß-16) - получаемый в бактериальных экспрессионных системах (Escherichia coli) и, являющийся негликозилированным (100) и интерферон-бета-1а (ИФН-ß-1а) -гликозилированный белок, продуцируемый эукариотическими клетками (СНО, яичники китайского хомячка) (130). По данным Антонетти и соавт.

(18), оба препарата обладают сходными свойствами, однако биологическая активность ИФН-Р-1а выше, что обусловлено его гликозилированием.

Для производства гликозилированных рекомбинантных белков в мире наиболее часто используют культуру клеток яичников китайского хомячка (СНО). К положительным особенностям клеток СНО можно отнести высокую скорость пролиферации, простоту культивирования и изученность, которые упрощают процесс контроля качества и регистрацию лекарственных препаратов (190). Суспензионное культивирование клеток СНО является современным способом организации процесса, оно позволяет достичь высоких клеточных плотностей и, соответственно, продуктивностей, а также не требует использования продуктов животного происхождения (17, 145, 190). По литературным данным, существующие продуценты рекомбинантного ИФН-Р-1а основаны на адгезионных линиях клеток СНО (153, 155, 156), однако, их применение в производстве не согласуется с требованиями регуляторных органов, предъявляемых к качеству лекарств.

Одним из ответственных моментов разработки технологии является выбор оптимальной системы экпрессии целевого рекомбинантного белка. Довольно часто при производстве рекомбинантных белков используется экспрессия под контролем конститутивных промоторов, как наиболее простой и изученный способ. Однако, для ИФН-Р, характеризующегося токсическим действием на клетки, данный вариант не является оптимальным.

ИФН-Р - сложный для производства белок, что, по мнению Ранкель и соавт. (155), обусловлено его высокой гидрофобностью и склонностью к агрегации. Несколькими коллективами авторов (153, 156) показано, что при гиперэкспрессии ИФН-Р в клетках млекопитающих он теряет нативную конформацию и образует агрегаты, преципитирующие на органеллах клеток. Вследствие этого необходим особый подход к разработке технологии культивирования, минимизирующий токсические эффекты, производимые ИФН-(3 на клетки. Для достижения этой цели оптимальным, на наш взгляд, является использование индуцируемого промотора гена ИФН-Р (136). Важным моментом в разработке технологии получения гидрофобных

рекомбинантных белков является подбор ряда параметров культивирования: температурного режима, различных добавок, влияющих на продукцию белка, моделирующих посттрансляционные модификации и повышающих его стабильность (83, 170).

Стоит отметить, что в настоящее время на российских биотехнологических производствах назревает необходимость разработки и внедрения новых процессов, основанных на современных технологиях культивирования. В данной работе описано несколько подходов к организации производства рекомбинантного ИФН-(3, включающих подбор оптимальных физико-химических параметров, состава питательной среды, стратегии введения подпиток и добавок, а также типа используемого биореактора для масштабирования процесса.

На данный момент на российском рынке, в основном, представлены препараты ИФН-(3, производимые зарубежными компаниями. В рамках стратегии развития фармацевтической промышленности на период до 2020 г. поставлена задача снижения импортозависимости российского рынка лекарственных средств. Поэтому разработка технологии производства отечественного препарата ИФН-[3 для лечения аутоиммунных заболеваний людей и животных является актуальной задачей для медицины и ветеринарии.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось создание клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-(3-1а на основе клеток СНО, разработка технологии их суспензионного культивирования и её апробация в рамках общей технологии производства препарата ИФН-(3-1а.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Создание клонов-продуцентов ИФН-Р-1а на основе клеток яичников китайского хомячка СНО.

2. Отбор полученных клонов-продуцентов по ростовым характеристикам и продуктивности.

3. Разработка лабораторной технологии культивирования клона-продуцента рекомбинантного ИФН-(3-1а.

4. Оптимизация параметров и режимов культивирования, состава питательной среды для повышения продуктивности и качества целевого белка.

5. Разработка опытно-промышленной технологии культивирования клеток-продуцентов ИФН-(3-1а в биореакторах различного типа.

6. Выделение целевого продукта из культуральной жидкости, определение его физико-химических свойств и противовирусной активности.

7. Проведение доклинических и клинических испытаний полученного препарата ИФН-|3-1а.

8. Разработка нормативной документации на производство субстанции рекомбинантного ИФН-(3-1а и препарата на её основе.

Научная новизна. Впервые создан продуцент рекомбинантного ИФН-(3-1а на основе системы индуцируемой экспрессии и клеток яичников китайского хомяка СНО, не имеющий аналогов на российских биотехнологических производствах. Впервые в России разработана и успешно апробирована технология получения рекомбинантного ИФН-(3-1а, основанная на суспензионном культивировании клеток СНО без использования белков животного происхождения.

Доказана эффективность введения в среду 10 мМ галактозы и 2 мМ уридина, являющихся субстратами реакций гликозилирования, с целью повышения содержания целевой гликозилированной формы рекомбинантного ИФН-|3-1а в культуральной жидкости клеток СНО.

Впервые проведено сравнительное исследование процессов культивирования продуцента рекомбинантного ИФН-|3-1а в биореакторах различного типа - стеклянном с механическим перемешивающим элементом и волновом на основе одноразовых мешков, по результатам которого показаны преимущества последнего для сохранения ростовых характеристик, продуктивности клона и гликозилирования ИФН-(3-1а при масштабировании.

Практическая значимость. Полученные в работе результаты использованы в организации производства отечественного лекарственного препарата ИФН-(3-1а на площадке ООО «Фармапарк». Данные, полученные в

ходе проведенных исследований, включены в опытно-промышленный регламент по производству рекомбинантного ИФН-(3-1а. Разработана нормативная документация на производство субстанции (фармакопейная статья предприятия, инструкция по применению). Препарат ИФН-(3-1а, созданный с использованием разработанной технологии, успешно прошёл доклинические исследования, а также первую фазу клинических исследований. Результаты проведенной работы могут быть применены к процессам оптимизации биотехнологических процессов производства других генно-инженерных лекарственных препаратов.

Личный вклад соискателя состоит в получении, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подведении итогов работы, подготовке публикаций. Клоны-продуценты рекомбинантного ИФН-|3-1а созданы в ходе совместных исследований автора с группой учёных Биотехнологического исследовательского института (Монреаль, Канада). Автором обоснована возможность использования куматной экспрессионной системы для получения клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-(3-1а человека, проведена работа по характеризации полученных клонов. Автором создан клеточный банк лучшего клона, проведена его паспортизация. Автором выполнены эксперименты по подбору параметров культивирования, подпиток и добавок, влияющих на секрецию и гликозилирование нарабатываемого белка, а также по масштабированию процесса. Эксперименты по очистке рекомбинантного ИФН-(3-1а и разработка аналитических методов проводились совместно с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк».

Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на VI международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011), научной конференции по биоорганической химии и биотехнологии «X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова» (Москва, 2011), международной конференции «Биология -наука XXI века» (Москва, 2012), XV европейском конгрессе по биотехнологии (Стамбул, 2012), II международной научно-практической

конференции «Биотехнология - перспективы развития» (Уфа, 2012), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика».

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК.

Объем и структура и диссертации. Диссертационная работа изложена на 167 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 201 источник, из них 189 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 18 таблиц, 35 рисунков, 10 страниц приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Рекомбинантная технология на основе суспензионных клеток СНО и индуцируемой экспрессионной системы обеспечивает получение стабильных клонов-продуцентов рекомбинантного ИФН-(3-1а за счет минимизации негативного влияния данного белка на клетки.

2. Максимальная продуктивность клеточной линии достигается при применении двухфазного температурного режима культивирования, использовании химически определенной бессывороточной питательной среды Power CHO-2CD и концентрации индуктора (кумата натрия) 1,5 мг/л.

3. Профиль изоформ рекомбинантного ИФН-(3-1а может быть приведен в соответствие с требованиями Европейской Фармакопеи путем внесения в питательную среду галактозы и уридина в концентрации 10 и 2 мМ, соответственно.

4. Основные характеристики разработанной технологии суспензионного культивирования клеток СНО (продуктивность, гликозилирование и активность рекомбинантного ИФН-Р-1а) остаются стабильными при масштабировании процесса в волновом биореакторе на основе одноразовых мешков объемом 10 л.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Интерферон-бета - строение, свойства и применение

В ответ на проникновение патогенного организма клетки нашей иммунной системы, в частности, лейкоциты, начинают секретировать разнообразные цитокины. Цитокины характеризуются широким спектром действий, заключающихся в активации адаптативного и врожденного иммунитета и прямом воздействии на инфицированные клетки. Интерфероны (ИФН) являются природными цитокинами, которые вырабатываются клетками большинства позвоночных в ответ на проникновение вирусов, препятствуя их репликации и пролиферации (27, 94). Пестка и соавт. показали (147), что важнейшими функциями данных цитокинов является иммуномодулирующая и антипролиферативная.

Первичным сигналом к началу выработки клетками ИФН является двухцепочечная РНК (дцРНК). В норме здоровые клетки организма не содержат дцРНК, а ее появление может быть обусловлено репликацией вирусных частиц (27, 94). Точный механизм активации процессов биосинтеза ИФН в ответ на вирусную инфекцию до конца не выяснен. Однако, несколькими группами авторов (84, 148) описаны факторы, регулирующие транскрипцию генаИФН-(3.

1КТ-1 и 1КТ-2 относятся к факторам транскрипции в семействе интерферон-регулирующих факторов (ПИ7), играющих важную роль в регуляции экспрессии гена ИФН-(3. ШР-1 индуцирует транскрипцию гена ИФН-Р в инфицированных вирусом клетках, тогда как 111Р-2 способен связываться с той же последовательностью ДНК и репрессировать транскрипцию. Оба фактора связываются с молекулой 1КР-Е - ДНК-связывающим фактором вирус-индуцируемого региона промотора гена ИФН-Р (84, 148).

Строение и свойства ИФН~р. Согласно последним исследованиям (19, 120), существует три главных семейства интерферонов (I-III), названных в соответствии с типом рецептора, с которым происходит их непосредственное взаимодействие. Тип I включает семейство ИФН-а (13 субтипов), а также IFN-(3, -8, -£, -к, -т и -ю, из них у человека обнаружены ИФН-а, -(3, -s, -к и -со (120, 147). К типу II относится IFN-y, связывающийся с определенным типом рецептора (120). Недавно установлено существование семейства интерферонов III типа - IFN-X: IFN-X.1, -XI и -A3, также известные как интерлейкин-29, -28А и -28В, соответственно (112, 121). Леви и соавт. (121) показали, что все перечисленные типы ИФН обладают сходными свойствами и являются критическими компонентами системы врожденного иммунитета.

IFNARl IFNAR2 ннтерфероново-рецепторньш комплекс

Рис. 1. Модель взаимодействия молекулы ИФН-р и компонентов интерферонового рецептора I типа (158)

Интерферон-бета (ИФН-Р), как и все представители семейства I типа интерферонов, связывается с трансмембранным рецептором интерферона-альфа (IFNAR), который экспрессируется на поверхности большинства клеток организма (27, 146) (рис. 1). Рецептор представляет собой гетеродимер, формирующийся из двух трансмебранных субъединиц -интерферонового рецептора I (IFNARl) и II типа (IFNAR2), состоящего из

550 и 487 аминокислотных остатков, соответственно. Внеклеточные домены обоих рецепторов содержат несколько повторов, сходных по строению с фибронектином III (19). В работе Рассель-Харде и соавт. (158) описана сборка двух субъединиц рецептора в присутствии ИФН-ß в функциональный рецепторный комплекс (рис. 1), который индуцирует дальнейший каскад внутриклеточных событий.

После сборки интерферон-рецепторного комплекса внутриклеточные домены IFNAR1 и IFNAR2 связываются с двумя тирозин-киназами, JAK1 и TYK2, которые трансфосфорилируются, а затем фосфорилируют рецепторы. Фосфорилированные рецепторы IFNAR1 и IFNAR2 далее связываются с белками STAT1 и STAT2 (преобразователи сигнала и активаторы транскрипции 1 и 2). Белки STAT подвергаются димеризации, а затем мигрируют в ядро, где активируют транскрипцию нескольких генов, включая ген комплекса гистосовместимости I класса, 2',5'-олигоаденилатсинтазы (159), бета-2-микроглобулина, неоптерина и ген устойчивости к миксовирусам (Мх) (19, 171). Данные белки определяются в плазме людей после парентерального введения ИФН-ß, и по повышению их концентрации косвенно судят о биологических эффектах препарата. Репрессирование вышеописанной передачи сигнала по пути JAK/STAT осуществляется тирозин-фосфатазой SHP-1 (133).

Интересно отметить, что хотя молекулы ИФН-а и ИФН-ß имеют один и тот же мембранный рецептор, но запускают разные каскады внутриклеточных событий. В работе Рассель-Харде и соавт. (158) показано, что связывание ИФН-ß с рецепторами IFNAR1 и IFNAR2 является более прочным, нежели у ИФН-а. Таким образом, стабильность комплекса ИФН-рецептор обусловливает природу дальнейшего проведения сигнала, что и объясняет разные эффекты от связывания молекул ИФН-а и ИФН-ß с одним и тем же рецептором.

ИФН-ß - полипептид, состоящий из 166 аминокислотных остатков. По вторичной структуре ИФН-ß является глобулярным белком, имеющем в

составе 5 а-спиралей (20) и одну внутримолекулярную дисульфидную связь между остатками цистеинов 31 и 141 (рис. 2). Кроме того, в положении 17 полипептидной цепи белка содержится свободный остаток цистеина, который, по мнению нескольких групп авторов (102, 103), играет важную роль в образовании агрегатов путём создания внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей.

Ранкель и соавт. (156) установлено, что полипептидная цепь ИФН-(3 содержит несколько гидрофобных мотивов, которые участвуют в связывании с рецепторами ШЫАШ и 1РЫА112. Именно этим фактом объясняется крайне высокая гидрофобность ИФН-{3, склонность к агрегации и низкая растворимость (около 50 мкг/мл в водном растворе при нейтральном рН) (122). В организме ИФН-|3 экспрессируется в низкой концентрации (порядка десятков пг в 1 мл крови), кроме того, нативная конформация данного белка хорошо стабилизируется альбумином плазмы (47), поэтому гидрофобная природа ИФН-Р практически не вызывает потери его активности.

Рис. 2. Вторичная структура молекулы ИФН-0

ИФН-ß человека является гликопротеином с молекулярной массой около 22,5 кДа, имеющим 1 сайт N-связанного гликозилирования по 80 остатку аспарагина (52). Среди коммерческих рекомбинантных препаратов данного белка различают два типа: негликозилированный - ИФН-ß-16, продуцируемый клетками Е. coli (52) и гликозилированный - ИФН-ß-1а, нарабатываемый в клетках яичников китайского хомяка СНО (100).

Описано существование нескольких гликозилированных форм белка, отличающихся степенью разветвления гликанов и количеством концевых остатков сиаловых кислот (46, 56). Определена структура гликанов ИФН-ß-1а, имеющих различное происхождение. Например, в работе Конрадта и соавторов (46) показано, что гликаны рекомбинантного ИФН-ß-1а, полученного в клетках СНО, обладают низкой гетерогенностью: 95% всех форм составляет комплекс из двух ветвей, содержащих два терминальных остатка сиаловых кислот и один остаток фукозы (рис. 3).

а-(2,6)

or а-(2,3) К 1,4) ß-(1,2)

or а-(2,-3)

Pentasaccharide core

ES3 ( ) о <3

< )

Fucose Asparagine /V-acetylglucosamine Mannose Galactose Sialic acid

Рис. 3. Структура двухантенных гликанов, синтезируемых клетками

СНО

Таким образом, углеводную составляющую молекулы ИФН-ß можно представить брутто формулой - NeuAc2Gal2Man3GlcNAc4Fucl (46). Стоит отметить, что гликаны ИФН-ß-1а, получаемого в клетках СНО, имеют схожее строение с нативным белком человека (100) и мыши (42).

Многими исследователями (110, 128, 141) установлено значительное влияние гликозилирования на стабильность, растворимость, период полувыведения ИФН-ß из организма, а также на связывание с рецептором. Цивас и соавторы предположили (42), что гликозилирование ИФН-ß-1а является важным для связывания белка с рецептором. Также существуют данные об участии углеводной составляющей белка в поддержании его растворимости и стабильности (155, 156). Данный факт подтверждается тем, что гликозилированный вариант ИФН-ß-1а имеет в 10 раз более высокую противовирусную активность по сравнению с негликозилированным вариантом, кроме того была доказана склонность дегликозилированной формы рекомбинантного ИФН-ß-1а к агрегатообразованию (46, 155, 184).

Как было сказано выше, ИФН-ß представляет собой сильногидрофобный белок. В связи с этим агрегация ИФН-ß является следствием экранирования гидрофобных участков белка от гидрофильной фазы (водного раствора) (155). Хотя гликозилирование уменьшает степень агрегации ИФН-ß, однако при гиперэкспрессии белка в условиях культивирования клеток СНО, этот процесс неизбежно происходит (153).

Существуют многочисленные данные, что агрегаты, образуемые рекомбинантным ИФН-ß при введении в организм, могут вызывать тяжелые иммунологические реакции, сопровождающиеся образованием связывающих и нейтрализующих антител (179, 180). Поскольку мономерная неагрегированная форма ИФН-ß обладает большей активностью, а также не вызывает иммуногенных реакций в организме животных и человека, чрезвычайно важной является минимизация степени агрегирования белка. Этого можно достичь, применяя различные подходы как на стадии

конструирования штамма-продуцента, так и при разработке технологии культивирования клеток.

ИФН-Р как средство против рассеянного склероза. Несколько препаратов на основе интерферонов I типа в настоящее время одобрено для лечения различных заболеваний. Так, препараты на основе рекомбинантного ИФН-Р успешно применяются для лечения рассеянного склероза (55). Рассеянный склероз (РС) - хроническое аутоиммунное заболевание ЦНС, характеризующееся обширными повреждениями белого вещества. Хотя точная причина заболевания до сих пор не выяснена, однако установлено, что наследственные факторы, а также неблагоприятные условия окружающей среды могут приводить к активации различных клеток иммунной системы (например, аутореактивных популяций Т- и В-лимфоцитов) белковыми антигенами, структурно схожими с миелином ЦНС. Эти популяции аутоиммунных клеток проникают через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), приводя к демиелинизации воспалительного характера, утрате олигодендроцитов и повреждению аксонов (54), что соответствует клиническим симптомам обострения заболевания и последующей инвалидизации (рис. 4).

При более подробном рассмотрении, активированные аутоиммунные клетки, такие как Т-хелперы (ТЫ и ТЫ 7) и В-клетки, связываются с эндотелиальными клетками ЦНС, затем мигрируют в головной мозг, где прямо или опосредованно атакуют слои миелина, олигодендроциты и аксоны, что приводит к повреждениям, характерным для РС.

Точное понимание каскада воспалительных процессов, связанных с РС, привело к появлению к новой стратегии лечения, препятствующей раннему образованию поврежденных участков ЦНС. Независимыми группами исследователей (45, 73, 93, 154, 175) было показано, что ИФН-Р является эффективным иммуномодулирущим препаратом для лечения возвратно-ремиттирующего РС. Введение ИФН-Р на ранней стадии заболевания

снижает скорость развития обострения и остроту процесса (45, 73, 93, 175), а также замедляет инвалидизацию (154).

Без применения бета интерферона

Иммунные клетки пересекают ГЭБ Свод черепа

Гамма-интерферон активирует иммунные клетки

Кровеносный сосуд

Активированные иммунные клетки (макрофаги)

При лечении бета-интерфероном

Бета-интерферон препятствует проникновению иммунных клеток через ГЭБ

Уменьшается воспаление, меньше повреждение нервной клетки

Неактивированная^ иммунная клетка

Присутствие бета-интерферона уменьшает производство гамма-интерферона и снижает активность иммунных клеток К

Рис. 4. Механизм действия ИФН-0 при рассеянном склерозе

В настоящий момент три препарата ИФН-(3 одобрены для предотвращения клинических проявлений возвратно-ремиттирующего РС: внутримышечно ИФН-бета-1а, подкожно - ИФН-бета-1а и ИФН-бета-1б (21, 25, 151). В течение последних 15 лет использование данных препаратов являлось эффективным при введении сразу же после постановки диагноза

или после первого клинического проявления у пациентов с МРТ-признаками PC (139).

Как было описано ранее, сейчас в мире применяются два коммерческих препарата ИФН-(3 - ИФН-0-16 и ИФН-р-1а (52, 100, 130). Рекомбинантный ИФН-Р-1а имеет аминокислотную последовательность, полностью совпадающую с эндогенным белком, вырабатываемым клетками человеческого организма и гликозилирование по 80 остатку аспарагина (100, 155). Негликозилированный ИФН-Р-16 содержит одну аминокислотную замену (остаток цистеина-17 заменен на серин), которая была введена с целью улучшения биологической активности и снижения агрегации (130). Хотя оба продукта имеют весьма схожие биологические эффекты, активность негликозилированного продукта значительно ниже (92).

Оба варианта препаратов на основе ИФН-Р снижают частоту обострений при PC (61), но препараты ИФН-Р-16 должны вводится в гораздо большем количестве, чем ИФН-Р-1а, для достижения такой же эффективности. Так, 22 мкг ИФН-Р-1а или же 250 мкг ИФН-Р-16 вводят подкожно 3 раза в неделю, при этом концентрация белка Мх, вырабатываемого лейкоцитами периферической крови, оказывается одинаковой (24). Короткий период полураспада молекул ИФН-Р в циркулирующей крови обусловливает частое введение препарата, при этом часто происходит образование нейтрализующих антител, что снижает эффективность проводимого лечения (129). Поэтому при лечении возвратно-ремиттирующего PC препаратами ИФН-Р-1а проводится клиническое мониторирование биологических эффектов по измерению Мх-ответа (143).

Важно отметить, что оба препарата ИФН-Р обладают сходными иммуномодулирующими свойствами, однако противовирусная активность ИФН-Р-1а выше, что может быть обусловлено гликозилированием (18). Хотя клинические эффекты при разных способах введения препарата (внутримышечный или подкожный) сходны, существует зависимость «доза-эффект» при лечении PC: более высокие дозы ИФН-бета дают более

благоприятные эффекты (например, скорость развития рецидива и разрушение склеротических бляшек по данным МРТ) (73, 131). Гликозилирование также способствует уменьшению агрегации белка и иммуногенности препарата (131).

Суммируя вышесказанное, следует отметить, что события, происходящие в иммунной системе под действием ИФН-Р при PC, изучены не до конца. Однако предполагается, что при этом происходит снижение активации Т-клеток, индукция выработки цитокинов, обладающих противовоспалительным действием, предотвращение адгезии и перехода Т-клеток через ГЭБ, а также индукция образования Т-регуляторных клеток. Использование препаратов ИФН-Р в среднем на 30% уменьшает частоту обострений при ремиттирующем и замедляет развитие инвалидизации при вторично-прогрессирующем течении рассеянного склероза. Однако препараты ИФН-Р имеют высокую стоимость. В связи с эффективностью применяемых препаратов на основе рекомбинантного ИФН-бета важной задачей является разработка технологии получения отечественного ИФН-бета, что будет иметь положительный экономический и социальный эффект.

1.2. Этапы создания продуцентов рекомбинантных белков

Процесс создания стабильной клеточной линии, продуцирующей целевой рекомбинантный белок, обычно включает следующие этапы: сборку экспрессионного вектора, его введение в клетки-реципиенты (трансфекция), отбор клонов по наличию селективного маркера и продуктивности, анализ стабильности экспрессии (рис. 5).

Выбор клеточной системы для продукции рекомбинантных белков зависит от многих факторов - генетических и ростовых свойств продуцента, уровня синтеза и правильности посттрансляционного процессинга целевого белка, его потенциальной токсичности для клеток. Клетки млекопитающих обладают несомненным преимуществом перед другими клеточными

системами экспрессии рекомбинантных белков, поскольку нужным образом обеспечивают синтез и широкий спектр посттрансляционных модификаций рекомбинантного белка, включая правильное 14- и О-гликозилирование, точное удаление лидерной последовательности в ходе секреции (17, 60, 190).

участок инидоідо реп лип»»«

(ЕЛОІ)

1. Трангфекция клеток СНО DHFR

сигнал пояи-адеиилирования

маркер устойчивости к антибиотику »ля селекіфм » Е со» (например, Amp")

«торой селективный

маркер (например, Neoft)

промотор

рмомбинвктныи геи

0HFR

2. Селекция

3. Отбор II размножение

резистентных р екомоннантны х к лонов

4 Амплификация

метотрексат

5. Отбор наиболее продуктивного клона(клонов)

Рис. 5. Схема создания клона-продуцента рекомбинантного белка

Среди различных клеточных линий клетки яичников китайского хомяка - СНО - наиболее широко используются для стабильной экспрессии с целью промышленной продукции белков, имеющих фармацевтическое значение (95, 190). В работе Кауфмана и соавт. (105) показана их важная

особенность - способность поддерживать амплификацию рекомбинантных плазмид, содержащих селективные маркерные гены дигидрофолатредуктазы (ЭИРЯ) и глутаминсинтетазы.

Создание клеточной линии-продуцента для стабильной экспрессии -трудоемкий процесс, поскольку требует отбора клеточных клонов с высоким уровнем экспрессии рекомбинантного гена из большого числа колоний, выросших после первичной трансфекции. Эти первичные клоны обладают широким разбросом уровня экспрессии и числом копий целевого гена. Например, в разных клеточных клонах СНО число копий трансгена может различаться в 100 раз в зависимости от места интеграции трансгена в хромосому хозяина (57, 119), а встраивание трансгена вблизи центромеры может стать причиной хромосомных перестроек (181).

После введения генно-инженерной конструкции, содержащей трансген, в клетки млекопитающих необходимо отобрать рекомбинантные клоны, содержащие данную конструкцию. Для этой цели в питательную среду добавляют какое-либо вещество - селективный агент (антибиотик, пробиотик, цитотоксичекий агент), в присутствие которого клетки дикого типа, не получившие рекомбинантной плазмиды, не выживают. Клетки с трансгеном успешно выживают и размножаются, так как содержат селективный маркер, интегрированный в клетку в составе экспрессионной плазмиды (95, 190). Для отбора штаммов-продуцентов экономически важных рекомбинантных белков часто проводят селекцию в присутствии какого-либо антибиотика (С418, гигромицин, пуромицин и т.д.). Гены устойчивости к антибиотикам, входящие в состав экспрессионной плазмиды, кодируют ферменты, нейтрализующие антибиотики путем их химической модификации - фосфорилирования, ацетилирования и др. (135).

Выбор регуляторных элементов не менее ответственный этап создания штамма-продуцента. Основным элементом является промотор, который содержит участок узнавания РНК-полимеразы, без которого невозможна инициация транскрипции. За экспрессию абсолютного большинства генов

человека и других млекопитающих отвечает РНК-полимераза II. Для таких генов показано наличие в промоторе коротких элементов, называемых элементами ТАТА, СААТ и вС (166).

Для производства рекомбинантных белков используются как вирусные промоторы, так и промоторы генов млекопитающих, кодирующих белки "домашнего хозяйства", транскрипционные факторы, структурные белки и т.д. На основе ограниченного числа эффективных промоторов, используемых для производства рекомбинантных белков, построены коммерческие экспрессионные векторы, например, рсОЫА и рО-пео (СМУ человека), рЕР/тус/суШ и рСОР1-МС82-ЕР1 (ЕР-1а человека).

Для внедрения ключевого гена в клетки продуцентов с целью стабильной экспрессии рекомбинантного белка экспрессионные векторы должны содержать следующие элементы: промоторно-энхансерный участок вирусного гена, геномную или матричную последовательность гена, поли-А хвост, маркер бактериальной репликации, бактериальный и эукариотический гены устойчивости к антибиотикам (рис. 6).

энхансер

MAR

Рис. 6. Стандартная схема экспрессионного вектора

MAR - участок связывания с ядерным матриксом, DHFR, neo -эукариотические селективные маркеры, Ampr - бактериальный селективный

маркер

В качестве промотора в настоящее время обычно используется промотор предранних генов цитомегаловируса человека (ЬСМУ), обладающий достаточно высокой эффективностью (29, 36). Кроме него, в публикациях отмечен также аналогичный промотор цитомегаловируса мыши (тСМУ), который предпочтителен для клеток СНО в связи с более близким происхождением мыши и хомяка (34). Одним из недостатков вирусных промоторов является их чужеродный по отношению к эукариотическим клеткам характер, вследствие чего они сильно подвержены выключению из-за эпигенетических факторов. Предлагается два решения этой проблемы: модификация нуклеотидных последовательностей промоторов или использование эукариотических промоторов, например, промоторов генов актина, фактора элонгации ЕР-1а или убиквитина (108, 157).

Отдельным направлением является разработка индуцируемых промоторов, которые применимы для экспрессии токсичных белков, в частности, ИФН-(3. В ряде работ показано (2, 153, 155), что конститутивная экспрессия ИФН-(3 клетками СНО значительно снижает ростовые характеристики культуры. Это связано с физико-химическими характеристиками данного белка, в частности, с высокой гидрофобностью и низкой растворимостью. После экспрессии в больших количествах он образует агрегаты в цитоплазме, которые налипают на мембрану и органеллы клеток. Через 2-4 дня культивирования при таких условиях снижается скорость пролиферации и секреции белка, а через 7-10 дней клетки гибнут.

В настоящее время разработаны системы контроля экспрессии с помощью гормонов (промотор ММТУ), антибиотиков (тетрациклиновый оперон), тяжелых металлов и т. д. (76, 90, 162). Однако все эти индукторы достаточно токсичны, и системы на их основе в производстве не используются. Существуют также генетические системы, в которых экспрессия индуцируется нетоксичными веществами, например, 4-изопропилбензойной кислотой или биотином.

Экспрессионная система, регулируемая 4-изопропилбензойной кислотой и ее солями (куматами), представляет особый интерес. Она была разработана в Биотехнологическом исследовательском институте (Biotechnology Research Institute, BRI), и в настоящее время успешно используется для создания продуцентов рекомбинантных белков. Индуктором транскрипции в ней выступает 4-изопропилбензойная кислота или ее соли (куматы) (136).

Куматная система (рис. 7) имеет три модификации, в которых кумат выполняет функцию активатора, репрессора или обратного активатора. Для создания клонов-продуцентов ИФН-(3 оптимально использование системы с куматом в роли активатора (cumate-ON). Она состоит из двух плазмид:

- плазмида, содержащая структурный ген под контролем куматного активатора;

- плазмида, кодирующая куматный активатор под контролем конститутивного промотора.

ВЫК/1 (без кумата) ВК/1 (с куматом)

гсТА гсТА

т

бхСиО TATA. repórter exCuO TATA, reporter

CR5 CR5

Рис. 7. Схема действия куматиой системы при регуляции транскрипции

При культивировании клеток без добавления кумата в среду происходит только экспрессия со второй плазмиды, в результате в клетках нарабатывается искусственный транскрипционный активатор гсТА. Активатор не связывается с ДНК, без него экспрессия с первой плазмиды не происходит, поскольку она содержит только минимальный промотор без энхансера. После добавления в среду кумат проникает в клетки и образует

комплекс с активатором гсТА, в результате чего тот связывается с промотором и вызывает инициацию транскрипции с минимального промотора (рис. 7).

Всего от момента добавления кумата в среду до достижения оптимальной скорости секреции белка в клетках СНО проходит около 4 дней. Скорость выключения экспрессии при удалении кумата из среды составляет около 6 дней. Куматная система обеспечивает хорошее соотношение уровней экспрессии во включенном и выключенном состояниях, составляющее примерно 30:1. Этот показатель существенно лучше единственной альтернативной системы с близкой продуктивностью, основанной на тетрациклиновом операторе (136).

В заключение следует отметить, что для индуцируемых экспрессионных систем цикл культивирования проводится в два этапа: на первом этапе производится наращивание клеточной массы, затем добавляется индуктор, после чего начинается собственно цикл продукции рекомбинантного белка, который секретируется клетками в КЖ. Из-за разных задач условия культивирования на этих двух этапах подбираются независимо, и могут существенно различаться. В частности, наработка токсичного белка, такого как ИФН-|3, требует периодической замены среды на этапе продукции, в то же время на этапе наращивания клеточной массы этого не нужно проводить.

1.3. Получение биофармацевтических препаратов с помощью культур клеток млекопитающих

Препараты на основе рекомбинантных белков успешно применяются для лечения многих тяжелых заболеваний человека (13-15). Существенную часть производимых рекомбинантных препаратов представляют гликозилированные белки, нарабатываемые в клетках млекопитающих (17). Эукариотические продуценты обладают рядом преимуществ перед другими

клеточными системами экспрессии, поскольку нужным образом обеспечивают синтез и широкий спектр посттрансляционных модификаций рекомбинантного белка, точное удаление лидерной последовательности в ходе секреции, а также правильный фолдинг (32, 50, 60, 62, 95, 145, 155, 164, 190). Кроме того, эукариотические клетки обладают способностью секретировать нативные белки в КЖ, что облегчает процедуру дальнейшей очистки (17,145,190). Преимуществом использования клеток млекопитающих также является более высокая активность синтезируемых ими белков, по сравнению с белками, нарабатываемыми в бактериях, дрожжах и растениях (32, 50, 62,155).

Клетки СНО - основная культура для производства рекомбинантных белков. Для производства фармацевтических препаратов использовались разные клеточные линии: COS (клетки почек африканской зеленой мартышки), ВНК (клетки почек новорожденного сирийского хомяка), НЕК293 (клетки почек эмбриона человека), NS0 (клетки миеломы мыши), Рег.Сб (клетки человеческой ретины) и другие (40, 189, 192). Однако наиболее часто в качестве продуцентов белков медицинского назначения используются клетки яичников китайского хомяка - СНО (81, 150).

По мнению Дюрошер и соавторов (60), к положительным особенностям клеток СНО можно отнести высокую скорость пролиферации, простоту культивирования и способность к росту при очень высокой клеточной плотности, что является незаменимым для промышленного производства. Другое полезное свойство клеток СНО, объясняющее их предпочтительное использование для продукции разнообразных медицинских биопрепаратов -это их соответствие принципам биологической безопасности, поскольку подавляющее большинство патогенных вирусов человека, включая вирусы иммунодефицита, полиомиелита, гриппа и герпеса, не способно в них размножаться (60, 187).

На данный момент клетки СНО хорошо охарактеризованы, что значительно упрощает регистрацию рекомбинантных лекарственных

препаратов. Несмотря на некоторые недостатки (отличный от человеческого профиль гликозилирования, наличие эндогенных вирусов), данная клеточная линия стала основной в мировой биотехнологии. В настоящее время около 70% рекомбинантных фармацевтических биопрепаратов производится именно на основе клеток СНО (табл. 1).

Таблица 1. Наиболее важные фармацевтические биопрепараты, __производимые в клетках СНО__

Фармацев- Действующее Терапия Производитель Год

тический вещество внедре-

препарат ния в производство

1 2 3 4 5

Perjeta мкАТ к метастатичес- Genetech 2012

субдомену 2 рецептора HER2 кий рак груди (США) / Roche (Швейцария)

Eylea fusion-белок из фрагментов возрастная макулярная Regeneran Pharmaceuticals 2011

рецепторов 1 и2 VEGF человека и дегенерация (США)

Fc-фрагментов иммуноглобулина

G1 человека

Adcetris коньюгат мкАТ к анапластичес- Seattle Genetics 2011

антигену CD30 с монометил- кая крупноклеточная лимфо- (CULIA)/Takeda (Япония)

ауристатином Е ма Ходжкина

Nulojix fusion-белок из острое Bristol-Myers 2011

фрагмента отторжение Squibb (США)

антигена-4 при пересадке

цитотоксического почки

Т-лимфоцита и Fc-фрагментов иммуноглобулина

G1 человека

Yervoy мкАТ к антигену 4, ассоциированному с цито-токсическими Т-лимфоцитами меланома Bristol-Myers Squibb 2011

1 2 3 4 5

Benlysta мкАТ к фактору системная Human Genome 2011

активации В- красная Sciences (США)

лимфоцитов волчанка / GlaxoSmith-Kline (Великобритания)

Prolia мкАТ к активатору рецептора лиганда ядерного фактора каппа В остеопороз в менопаузе Amgen (США) 2010

Actemra мкАТ к рецептору интерлейкина-6 человека ревматоидный артрит Amgen 2010

Arzerra мкАТ к антигену CD20 хроническая лимфолейке-мия GlaxoSmith-Kline 2009

Recothrom димер тромбина кровотечения ZymoGenetics, 2008

человека при хирургических вмешательствах Inc. (США)

Vectibix мкАТ к рецептору фактора роста эпидермиса метастазирую- щий рак прямой кишки Amgen 2006

Myozyme а-глюкозидаза болезнь Помпа Genzyme (США) 2006

Aldura- ларонидаза мукополисаха- Genzyme 2006

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Лобанова, Наталия Валентиновна

ВЫВОДОВ

1. Препарат, созданный на основе субстанции рекомбинантного ИФН-Р-1а человека, получаемой по разработанной технологии, является первым отечественным препаратом данного белка, используемым для лечения рассеянного склероза. Полученный препарат рекомбинантного ИФН-(3-1а не уступает по качеству оригинальному препарату, обладая при этом гораздо меньшей стоимостью, и рекомендуется для широкого применения в медицинской и ветеринарной практике.

2. Разработанная технология суспензионного культивирования отвечает всем современным требованиям качества, предъявляемым к медицинским препаратам на основе рекомбинантных белков. Данная технология рекомендуется к внедрению в серийное производство биофармацевтических препаратов вместо технологий, основанных на адгезионном культивировании, как способствующая сокращению объема работ и трудозатрат.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лобанова, Наталия Валентиновна, 2013 год

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Волова Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова // Новосибирск: Изд-во СО РАН.- 1999.-247 с.

2. Ершов Ф.И. Продукция рекомбинантного белка интерферона-бета человека в культуре клеток птиц / Ф.И. Ершов, A.JI. Гинцбург, М.В. Мезенцева, Б.С. Народицкий, М.М. Шмаров, Д.Ю. Логунов, Л.В. Верховская, Е.А. Черентаева // Мол. генетика, микробиол. вирусол. -2008. -№3.- С. 37-40.

3. Лобанова Н.В. Оптимизация процесса культивирования клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный интерферон-бета / Н.В. Лобанова, И.Н.Трусова, Е.Г. Благо датских и др. // Биотехнология. - 2011. - №6. - С. 5562.

4. Лобанова Н.В. Оптимизация условий культивирования эукариотических продуцентов рекомбинантного интерферона-бета / Н.В. Лобанова, И.Н. Трусова, Е.Г. Благодатских и др. // X чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова: Мат. науч. конф. по биоорганической химии и биотехнологии. - М.: ИБХ РАН. - 2011. - С. 41.

5. Лобанова Н.В. Оптимизация технологии культивирования эукариотического продуцента рекомбинантного интерферона-бета-1 а в одноразовом биореакторе / Н.В. Лобанова, A.A. Нурбаков, И.Н. Трусова и др. // Биология - наука XXI века: Мат. междунар. конф. - М.: Макс-Пресс. -2012.-С. 495-497.

6. Лобанова Н.В. Оптимизация условий культивирования клеток СНО как ключевой этап создания технологии производства рекомбинантных белков медицинского назначения / Н.В. Лобанова, A.A. Нурбаков, P.P. Шукуров и др. // Биотехнология - перспективы развития: Мат. II междунар. науч.-практ. конф. - Уфа: БГПУ. - 2012. - С. 24-26.

7. Лобанова Н.В. Сравнение эффективности технологий культивирования клеток СНО, продуцентов рекомбинантного интерферона-бета-1 а, в биореакторах различного типа / Н.В. Лобанова, A.A. Нурбаков, Л.В. Ермолина и др. // Ветеринарная медицина. - 2012. - № 3-4. - С. 26-30.

8. Лобанова Н.В. Оптимизация процессов культивирования эукариотических клеток-продуцентов на основе линии СНО при производстве биофармацевтических препаратов / Н.В. Лобанова, А.А. Нурбаков, Е.Н. Сауткина и др. // Биотехнология. - 2013. - №1. - С. 825.

9. Лобанова Н.В. Оптимизация профиля гликозилирования рекомбинантного интерферона-бета-1 а при культивировании клеток СНО в биореакторе волнового типа / Н.В. Лобанова, А.А. Нурбаков, В.И. Аксенова и др. // Биотехнология. - 2013. - №2. - С. 55-66.

10. Серегин Ю.А. Особенности разработки и оптимизации эукариотических клонов-продуцентов рекомбинантного интерферона-бета / Ю.А. Серегин, Е.Г. Благодатских, Н.В. Лобанова и др. // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Мат. VI междунар. конгр. - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии». - 2011. - С. 95-96.

11. Серегин Ю.А. Влияние ингибирования ферментов, модифицирующих хроматин, на уровень экспрессии генов под контролем вирусных промоторов в клетках млекопитающих / Ю.А. Серегин, Н.В. Лобанова, О.И. Копылова и др. // Современная медицина: анализ и перспективы развития: Мат. IV междунар. науч.-практ. конф. - М.: Спутник-плюс. - 2012. - С. 32-37.

12. Чупыркина А.А. Разработка технологии очистки интерферона бета-1а из культуральной жидкости клеток СНО / А.А. Чупыркина, Н.А. Шамонов, Н.В. Лобанова и др. // Биология - наука XXI века: Мат. междунар. конф. -М.: Макс-Пресс. - 2012. - С. 1032-1033.

13. Aggarwal, S. What's fueling the biotech engine-2007 / S. Aggarwal // Nat. Biotechnol.-2008.-Vol. 26.-N. 11.-P. 1227-1233.

14. Aggarwal, S. What's fueling the biotech engine-2009-2010 / S. Aggarwal // Nat. Biotechnol. - 2010. - Vol. 28. - P. 1165-1171.

15. Aggarwal, S. What's fueling the biotech engine-2011-2012 / S. Aggarwal // Nat. Biotechnol.-2010.-Vol. 28.-N. 12.-P. 1191-1197.

16. Altamirano, C. Specific nutrient supplementation of defined serum-free medium for the improvement of CHO cells growth and t-PA production /

C. Altamirano, A. Illanes, R. Canessa et al. // Electronic J. Biotechnol. - 2006. -Vol. 9.-N. l.-P. 61-67.

17. Andersen, D.C. Recombinant protein expression for therapeutic applications / D.C. Andersen, L. Krummen // Curr. Opin. Biotechnol. - 2002. - Vol. 13. -P. 117-123.

18. Antonetti, F. A comparison of the biologic activity of two recombinant IFN-ß preparations used in the treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis / F. Antonetti, O. Finocchiaro, M. Mascia et al. // J. Interferon Cytokine Res. -2002. - Vol. 22. - P. 1181-1184.

19. Arduini, R.M. Characterization of a soluble ternary complex formed between human interferon-ß-1 a and its receptor chains / R.M. Arduini, K.L. Strauch, L.A. Runkel et al. // Prot. Sei. - 1999. - Vol. 8. - P. 1867-1877.

20. Armstrong, J.A. Cytopathic effect inhibition assay for interferon: microculture plate assay / J.A. Armstrong // Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 78. -Part A.-P. 381-387.

21. Avonex®. Prescribing information // Cambridge, MA: Biogen Idee Inc. -2006.

22. Backliwal, G. Valproic acid: a viable alternative to sodium butyrate for enhancing protein expression in mammalian cell cultures / G. Backliwal, M. Hildinger, I. Kuettel et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2008. - Vol. 101. - N. 1. -P. 182-189.

23. Barnes, L.M. Stability of protein production from recombinant mammalian cells / L.M. Barnes, C.M. Bentley, A.J. Dickson // Biotechnol. Bioeng. - 1990-Vol. 81.-N. 6.-P. 631-639.

24. Bertolotto, A. Evaluation of bioavailability of three types of IFNb in multiple sclerosis patients by a new quantitative-competitive-PCR method for MxA quantification / A. Bertolotto, F. Gilli, A. Sala et al. // J. Immunol. Methods. -2001.-Vol. 256.-P. 141-152.

25. Betaseron®. Prescribing information // Montville, NJ: Bayer HealthCare Pharmaceuticals. - 2007.

26. Birch, J. Suspension culture of mammalian cells / J. Birch, R. Arathoon // Bioprocess Technol. - 1990. - Vol. 10. - P. 251-270.

27. Biron, C. Role of early cytokines, including alpha and beta interferons (IFN-a/b), in innate and adaptive immune responses to viral infections / C. Biron // Seminars in Immunology. - 1998. - Vol. 10. - P. 383-390.

28. Bollati-Fogolin, M. Temperature reduction in cultures of hGM-CSF-expressing CHO cells: effect on productivity and product quality / M. Bollati-Fogolin, G. Forno, M. Nimtz et al. // Biotechnol. Prog. - 2005. - Vol. 21. - P. 1721.

29. Boshart, M. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus / M. Boshart, F. Weber, G. Jahn et al. // Cell. - 1985. - Vol. 41. - N. 2. - P. 521-530.

30. Bumelis, V.A. Investigation of thermal stability of recombinant human interferon-gamma / A. Bumeliene, G. Gedminiene, V. Smirnovas et al. // Biologija. -2002.-Vol. 2. - P. 37—41.

31. Butler, M. Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals / M .Butler // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2005.-Vol. 68-P. 283-291.

32. Byrne, B. Sialic acids: carbohydrate moieties that influence the biological and physical properties of biopharmaceutical proteins and living cells / B. Byrne, G.G. Donohoe, R. O'Kennedy // Drug Discov. Today. - 2007. - Vol. 12. - N. 7/8. -P. 319-326.

33. Candido, E.P. Sodium butyrate inhibits histone deacetylation in cultured cells / E.P. Candido, R. Reeves, J.R. Davie // Cell. - 1978. - Vol. 14. - P. 105113.

34. Cardin, R.D. Murine cytomegalovirus IE2, an activator of gene expression, is dispensable for growth and latency in mice / R.D. Cardin, G.B. Abenes, C.A. Stoddart et al. //Virology. - 1995. - Vol. 209. -N. 1. - P. 236-241.

35. Carcagno, C. Method for the massive culture of cells producing recombinant human erythropoietin / C. Carcagno, M. Criscuolo, C. Melo et al. // US Patent. - 2000. - WP 200027997.

36. Chatellard, P. The IE2 promoter/enhancer region from mouse CMV provides high levels of therapeutic protein expression in mammalian cells / P. Chatellard, R. Pankiewicz, E. Meier et al. // Biotechnol. Bioeng - 2007. - Vol. 96.-N. l.-P. 106-117.

37. Chen, Z. Temperature shift as a process optimization step for the production of pro-urokinase by a recombinant Chinese hamster ovary cell line in high-density perfusion culture / Z. Chen // J. Biosci. Bioeng. - 2004. - Vol. 97. - P. 239-243.

38. Chopin, V. Sodium butyrate induces p53-independent, Fas-mediated apoptosis in MCF-7 human breast cancer cells / V. Chopin, R.A. Toillon, N. Jouy et al. // J. Pharmacol. - 2002. - Vol. 135. - P. 79-86.

39. Christie, A. The adaptation of BHK cells to a non-ammoniagenic glutamate-based culture medium / A. Christie, M. Butler // Biotechnol. Bioeng. - 1999. -Vol. 64.-N. 3.-P. 298-309.

40. Chu, L. Industrial choices for protein production by large-scale cell culture / L. Chu, D.K. Robinson // Curr. Opin. Biotechnol. - 2001. - Vol. 12. - P. 180-187.

41. Chun, B.-H. Enhanced production of recombinant b-domain deleted factor VIII from Chinese hamster ovary cells by propionic and butyric acids / B.-H. Chun // Biotech. Lett. - 2003. - Vol. 25. - P. 315-319.

42. Civas, A. Purification and carbohydrate structure of natural murine interferon-beta / A. Civas, B. Fournet, C. Coulombel et al. // Eur. J. Biochem. -1988.-Vol. 173.-P. 311-316.

43. Clackson, T. Regulated gene expression systems / T. Clackson // Gene Ther. -2000.-Vol. 7.-P. 120-125.

44. Clincke, M.F. Effect of surfactant pluronic F-68 on CHO cell growth, metabolism, production, and glycosylation of human recombinant IFN-y in mild operating conditions / M.F. Clincke, E. Guedon, F.T. Yen et al. // Biotechnol. Prog.-2011.-Vol. 27.-N. l.-P. 181-190.

45. Comi, G. Effect of early interferon treatment on conversion to definite multiple sclerosis: a randomised study / G. Comi, M. Filippi, F. Barkhof et al. // Lancet. - 2001. - Vol. 357. - P. 1576-1582.

46. Conradt, H.S. Structure of the carbohydrate moiety of human interferonbeta secreted by a recombinant Chinese hamster ovary cell line /H.S. Conradt, H. Egge, J. Peter-Katalinic et al. // J. Biol. Chem. - 1987. - Vol. 262. - P. 1460014605.

47. Cook, A.W. Serum protein masking of the thermal sensitivity of the antiviral activity of purified human beta-interferon: implications for clinical studies / A.W. Cook, F. Nidzgorski, P. Came et al. // J. Biol. Response Mod. - 1986. -Vol. 6.-P. 499-503.

48. Crowell, C.K. Amino acid and manganese supplementation modulates the glycosylation state of erythropoietin in a CHO culture system / C.K. Crowell, G.E. Grampp, G.N. Rogers et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2007. - Vol. 96. - P. 538-549.

49. De Jesus, M. Manufacturing recombinant proteins in kg-ton quantities using animal cells in bioreactors / M. De Jesus, F.M. Wurm // Eur. J. Pharmaceutics and Biopharmaceutics. - 2011. -Vol. 78.-P. 184-188.

50. Delorme, E. Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin / E. Delorme, T. Lorenzini, J. Giffin et al. // Biochemistry. - 1992. -Vol. 31.-P. 9871-9876.

51. Derouazi, M. Serum-free large-scale transient transfection of CHO cells // M. Derouazi, P. Girard et al., F.van Tilborgh // Biotechnol. Bioeng. - 2004. - Vol. 87.-N. 4.-P. 537-545.

52. Derynck, R. Isolation and structure of a human fibroblast interferon gene / R. Derynck, J. Content, E. DeClercq et al. // Nature. - 1980. - Vol. 285. - P. 542547.

53. Devasahayam, M. Factors affecting the expression of recombinant glycoproteins / M. Devasahayam // Indian J. Med. Res. - 2007. - Vol. 126. -P. 22-27.

54. Dhib-Jalbut, S. Pathogenesis of myelin/oligodendrocyte damage in multiple sclerosis / S. Dhib-Jalbut // Neurology. - 2007. - Vol. 68. - P. 13-21.

55. Dhib-Jalbut, S. Interferon-(3 mechanisms of action in multiple sclerosis / S. Dhib-Jalbut and S. Marks // Neurology. - 2010. - Vol. 74. - P. 17-24.

56. Dissing-Olesen, L. The function of the human interferon-beta-la glycan determined in vivo / M. Thaysen-Andersen, M. Meldgaard, P. Hojrup et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2008. - Vol. 326 - N. 1. - P. 338-347.

57. Dobie, K.W. Variegated transgene expression in mouse mammary gland is determined by a transgene integration locus / K.W. Dobie, M. Lee, J.A. Fantes et al. // PNAS. - 1996. - Vol. 93. - P. 6659- 6664.

58. Dorai, H. Early prediction of instability of Chinese hamster ovary cell lines expressing recombinant antibodies and antibody-fusion proteins / H. Dorai, S. Corisdeo, D. Ellis et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2012- Vol. 109. - N. 4. -P. 1016-1030.

59. Dunster, C. The effect of oxidative stress on the production of the recombinant protein, interferon gamma, produced by Chinese hamster ovary cells in stirred batch culture / C. Dunster, K. Cheeseman, S. Maddix // Appl. Microbiol and Biotechnol. - 1997. - Vol. 48. - N. 2. - P. 198-203.

60. Durocher, Y. Expression systems for therapeutic glycoprotein production / Y. Durocher and M. Butler // Curr. Opin. Biotechnol. - 2009. - Vol. 20. -P. 700-707.

61. Duquette, P. Interferon beta-lb is effective in relapsing-remitting multiple-sclerosis - clinical-results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial / P. Duquette, M. Girard, L. Despault et al. // Neurology. - 1993. -Vol. 43.-P. 655-661.

62. Egrie, J.C. The role of carbohydrate on the biological activity of erythropoietin / J.C. Egrie, J.R. Grant, D.K. Gillies et al. // Glycoconjugate J. -1993.-Vol. 10.-P. 263.

63. Eibl, R. Bag bioreactor based on wave-induced motion: characteristics and applications / R. Eibl, S.Werner, D. Eibl // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. -2010.-Vol. 115.-P. 55-87.

64. Elliott, S. Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering / S. Elliott, T. Lorenzini, S. Asher et al. // Nat. Biotechnol. -2003. -Vol. 21. -P. 414-421.

65. Fike, R. Nutrient supplementation strategies for biopharmaceutical production, Part 1: Feeding for optimal recombinant protein production / R. Fike // BioProcess Int. - 2009. - Vol. 7. - N. 10. - P. 44-51.

66. Fike, R. Nutrient supplementation strategies for biopharmaceutical production, Part 2: Feeding for optimal recombinant protein production / R. Fike // BioProcess Int. - 2009. - Vol. 7. - N. 11. - P. 46-52.

67. Fiore, M. Dimethyl sulfoxide restores contact inhibition-induced growth arrest and inhibits cell density dependent apoptosis in hamster cells / M. Fiore and F. Degrassi // Exp. Cell Res. - 1999. - Vol. 251. - N. 1. - P. 102-110.

68. Franco, R. Influence of osmolality and pH increase to achieve a reduction of monoclonal antibodies aggregates in a production process / R. Franco, G. Daniela, M. Fabrizio et al. // Cytotechnology. - 1999. - Vol. 29. - P. 11-25.

69. Furukawa K. Effect of culture temperature on a recombinant CHO cell line producing a C-terminal a'-amidating enzyme / K. Furukawa and K. Ohsuye // Cytotechnology. - 1998. - Vol. 26. - P. 153-164.

70. Glacken, M.W. Reduction of waste product excretion via nutrient control: Possible strategies for maximizing product and cell yields on serum in cultures of mammalian cells / M.W. Glacken, R.J. Fleischaker, A.J. Sinskey // Biotechnol. Bioeng.- 1986.-Vol. 28.-N. 9.-P. 1376-1389.

71. Glassy, M.C. Serum-free media in hybridoma culture and monoclonal antibody production / M.C. Glassy, Tharakan J.P., Chau P.C. // Biotechnol. Bioeng. - 1998 - Vol. 32. - P. 1015-1028.

72. Goldman, M.H. Monitoring recombinant human interferon-gamma N-glycosylation during perfused fluidized-bed and stirred-tank batch culture of CHO

cells / M.H. Goldman, D.C. James, M. Rendall et al. // Biotechnol. Bioeng. - 1998. - Vol. 60. - P. 596-607.

73. Goodin, D.S. Disease modifying therapies in multiple sclerosis: report of the therapeutics and technology assessment subcommittee of the American Academy of Neurology and the MS council for clinical practice guidelines / D.S. Goodin, E.M. Frohman, G.P. Garmany et al. // Neurology. - 2002. - Vol. 58. - P. 169-178.

74. Gorfien, S.F. Recombinant protein production by CHO cells cultured in a chemically defined medium / S.F. Gorfien // Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects. - 1998. - Vol. 9. - P. 247-252.

75. Gorfien, S.F. Optimized nutrient additives for fed-batch cultures / S.F. Gorfien, W. Paul, D. Judd // BioPharm International. - 2003. - P. 34-40.

76. Gossen, M. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters / M. Gossen and H. Bujard // PNAS. - 1992. -Vol. 89.-P. 5547-5551.

77. Gramer, M.J. Glycosidase activities in Chinese hamster ovary cell lysate and cell culture supernatant / M.J. Gramer and C.F. Goochee // Biotechnol. Prog. -1993.-Vol. 9.-P. 366-373.

78. Gu, M.B. Analysis of foreign protein overproduction in recombinant CHO cells. Effect of growth kinetics and cell cycle traverse / M.B. Gu, P. Todd, D.S. Kompala // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1994. - Vol. 2. - N. 721. - P. 194-207.

79. Gu, X. Improvement of interferon-y sialylation in Chinese hamster ovary cell culture by feeding of N-Acetylmannosamine / X. Gu and D.C. Wang // Biotechnol. Bioeng. - 1998. - Vol. 58. - N. 6. - P. 642-648.

80. Gurtovenko, A. Modulating the structure and properties of cell membranes: the molecular mechanism of action of dimethyl sulfoxide / A. Gurtovenko and J. Anwar // J. Phys. Chem. - 2007. - Vol. 111. - P. 10453-10460.

81. Hacker, D.L. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells: where do we go from here? / D.L. Hacker, M. De Jesus, F.M. Wurm // Biotechnol. Adv. - 2009. - Vol. 27. - N. 6. - P. 1023-1027.

82. Haldankar, R. Serum-free suspension large-scale transfection of CHO cells in wave bioreactors / R. Haldankar // Molecular Biotechnology. - 2006. - Vol. 34. -N. 2.-P. 191-199.

83. Han, Y.K. Enhanced interferon- p production by CHO cells through elevated osmolality and reduced culture temperature / Y.K. Han, T.Y. Koo, G.M. Lee // Biotechnol. Prog. - 2009. - Vol. 25. - N. 5. - P. 1440-1447.

84. Harada, H. The role of interferon regulatory factors in the interferon system and cell growth control / H. Harada, T. Taniguchi, N. Tanaka // Biochimie. - 1998. -Vol. 80.-P. 641-650.

85. Hassell, T. Growth inhibition in animal cell culture: the effect of lactate and ammonia / T. Hassell, S. Gleave, M. Butler // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1991. -Vol. 30.-P. 29-41.

86. Hassig, C.A. Nuclear histone acetylases and deacetylases and transcriptional regulation: HATs off to HDACs / C.A. Hassig and S.L. Schreiber // Curr. Opin. Chem. Biol. - 1997. - Vol. 1. - N. 3. - P. 300-308.

87. Helenius, A. Intracellular functions of N-linked glycans / A. Helenius and M. Aebi // Science. - 2001. - Vol. 291. - P. 2364-2369.

88. Hendrick, V. Increased productivity of recombinant tissular plasminogen activator (t-PA) by butyrate and shift of temperature: a cell cycle phases analysis / V. Hendrick, P. Winnepenninckx, C. Abdelkafi et al. // Cytotechnology. - 2001. -Vol. 36.-N. 1-3.-P. 71-83.

89. Hossler, P. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture / P. Hossler, S.F. Khattak, Z.J. Li // Glycobiology. - 2009. - Vol. 19. -N. 9. - P. 936-949.

90. Hynes, N.E. Hormone-responsive expression of an endogenous proviral gene of mouse mammary tumor virus after molecular cloning and gene transfer into cultured cells / N.E. Hynes, N. Kennedy, U. Rahmsdorf et al.// PNAS. - 1981. -Vol. 78.-P. 2038-2042.

91. Hu, X. Pilot production of u-PA with porous microcarrier cell culture / X. Hu, C. Xiao, Z. Huang et al. // Cytotechnology. - 2000. - Vol. 33. - P. 13-19.

92. Jacobs, L.D. Intramuscular interferon beta-la for disease progression in relapsing multiple sclerosis. The Multiple Sclerosis Collaborative Research Group (MSCRG) / L.D. Jacobs, D.L. Cookfair, R.A. Rudick et al. // Ann. Neurol. - 1996. -Vol. 39. -N. 3. - P. 285-294.

93. Jacobs, L.D. Intramuscular interferon beta-la therapy initiated during a first demyelinating demyelinating event in multiple sclerosis. CHAMPS Study Group/ L.D. Jacobs, R.W. Beck, J.H. Simon et al. // N. Engl. J. Med. - 2000. - Vol. 343. -P. 898-904.

94. Janeway, C.A. The immune system in health and disease / C.A. Janeway, P. Travers, M. Walport et al. // Immunobiology, 4th ed. - New York: Elsevier Science/Garland Publishing. - 1999. - P. 385-386.

95. Jayapal, K.P. Recombinant protein therapeutics from CHO cells - 20 years and counting / K.P. Jayapal, K.F. Wlaschin, W.S. Hu // SBE Special Section. -2007. - P. 40^17.

96. Jayme, D.W. Media formulation options and manufacturing process controls to safeguard against introduction of animal origin contaminants in animal cell / D.W. Jayme and S.R. Smith // Cytotechnology. - 2000. - Vol. 33. - P. 27-36.

97. Jeon, M. Correlation between enhancing effect of sodium butyrate on specific productivity and mRNA transcription level in recombinant Chinese hamster ovary cells producing antibody / M. Jeon and G.M. Lee // J. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - Vol. 17. - P. 1036-1040.

98. Jiang, Z. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in CHO cells by improving gene accessibility / Z. Jiang and S. Sharfstein // Biotechnol. Bioeng. -2008. - V. 100. - P. 189-194.

99. Jones, W. Uptake, recycling, and antioxidant actions of alpha-lipoic acid in endothelial cells / W. Jones, X. Li, Z.C. Qu et al. // Free Radic. Biol. Med. - 2002. -V. 33-N. l.-P. 83-93.

100. Kagawa, Y. Comparative study of the asparagine-linked sugar chains of natural human interferon-beta 1 and recombinant human interferon-beta 1

produced by three different mammalian cells / Y. Kagawa, S. Takasaki, J. Utsumi et al. // J. Biol. Chem. - 1988. - Vol. 263. - P. 17508-17515.

101. Kaneko, Y. Changes in the quality of antibodies produced by Chinese hamster ovary cells during the death phase of cell culture / Y. Kaneko, R. Sato, H. Aoyagi // J. Biosci. Bioeng. - 2010. - Vol. 3. - P. 281-287.

102. Karpusas, M. The crystal structure of human interferon-beta at 2.2-Ä resolution / M. Karpusas, M. Nolte, C.B. Benton et al. // PNAS. - 1997. - Vol. 94. -P. 11813-11818.

103. Karpusas, M. The structure of human interferon-beta: implications for activity / M. Karpusas, A.Whitty, L. Runkel et al. // Cell. Mol. Life Sei. - 1998. -Vol. 54.-P. 1203-1216.

104. Kasama, K. Pharmacokinetics and biologic activities of human native and asialointerferon-beta / K. Kasama, J. Utsumi, E. Matsuo-Ogawa et al. // J. Interferon Cytokine Res. - 1995. - Vol. 15. - P. 407^15.

105. Kaufman, R.J. Selection and amplification of heterologous genes in mammamlian cells / R.J. Kaufman // Methods Enzymol. - 1990. - Vol. 185. -P. 537-566.

106. Kawasaki, N. The significance of glycosylation analysis in development of biopharmaceuticals / N. Kawasaki, S. Itoh, N. Hashii et al. // Biol. Pharm. Bull. -2009. - Vol. 32. - N. 5. - P. 796-800.

107. Keen, M.J. Development of a serum-free culture medium for the large scale production of recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell line / M.J. Keen and N.T. Rapson // Cytotechnology. - 1995. - Vol. 17.-P. 153-163.

108. Kim, S.Y. The human elongation factor 1 alpha (EF-1 alpha) first intron highly enhances expression of foreign genes from the murine cytomegalovirus promoter / S.Y. Kim, J.H. Lee, H.S. Shin et al. // J. Biotechnol. - 2002. - Vol. 93. -N. 2.-P. 183-187.

109. Kim, D.Y. Effects of supplementation of various medium components on Chinese hamster ovary cell cultures producing recombinant antibody / D.Y. Kim, J.C. Lee, H.N. Chang et al. // Cytotechnology. - 2005. - Vol. 47. - P. 37-49.

110. Kodama, S. Role of sugar chains in the in-vitro activity of recombinant human interleukin-5 / S. Kodama, M. Tsujimoto, N. Tsuruoka N et al. // Eur. J. Biochem. - 1993. - Vol. 211. - P. 903-908.

111. Kong, D. Long-term stable production of monocyte-colony inhibition factor (M-CIF) from CHO microcarrier perfusion cultures / D. Kong, R. Gentz, J. Zhang // Cytotechnology. - 1998. - Vol. 26. - P. 131-138.

112. Kotenko, S.V. IFN-A.S mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex / S.V. Kotenko, G. Gallagher, V.V. Baurin et al. // Nat. Immunol. - 2003. - Vol 4. - P. 69-77.

113. Kou, T.-C. Detailed understanding of enhanced specific productivity in Chinese hamster ovary cells at low culture temperature / T.-C. Kou, L. Fan, Y. Zhou et al. // Cytotechnology. - 2009. - Vol. 59. - P. 81-91.

114. Krieg, A.M. Direct immunologic activities of CpG DNA and implications for gene therapy / A.M. Krieg // J. Gene. Med. - 1999. - Vol. l.-P. 56-63.

115. Kumar, N. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture. A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CHO cell lines / N. Kumar, P. Gammell, M. Clynes // NICB Special Issue Cytotechnology. -2007.-Vol. 53. -P. 33-16.

116. Kunas, K.T. Damage mechanisms of suspended animal cells in agitated bioreactors with and bithout bubble entrainment / K.T. Kunas // Biotechnol. Bioeng. - 1990. - Vol. 36. - P. 476—183.

117. Kunkel J.P. Comparisons of the glycosylation of a monoclonal antibody produced under nominally identical cell culture conditions in two different bioreactors / J.P. Kunkel, D.C.H. Jan, M. Butler et al. // Biotechnol. Prog. - 2000. -Vol. 16.-P. 462^170.

118. Kuwae, S. Development of a fed-batch culture process for enhanced production of recombinant human antithrombin by Chinese Hamster Ovary cells, Ohda N., Tamashima H., Miki H., Kobayashi K. // J. Biosci. Bioeng. - 2005. -Vol. 100.-N. 5.-P. 502-510.

119. Lambert, J.R. Steroid-selective initiation of chromatin remodeling and transcriptional of the mouse mammary tumor virus promoter is controlled by the site of promoter integration / J.R. Lambert and S.K. Nordeen // J. Biol. Chem. -1998. - Vol. 273. - P. 32708-32714.

120. Leonidas, C. Platanias mechanisms of type I and type II interferonmediated signaling / C. Leonidas // Nat. Rew. Immunol. - 2005. - Vol. 5 - P. 375386.

121. Levy, D.E. Induction and function of type I and III interferon in response to viral infection / D.E. Levy, I.J. Marie, J.E. Durbin // Curr. Opin. Virol. — 2011.— Vol. l.-N. 6.-P. 476-486.

122. Lin, L. Interferon-P-lb (Betaseron®): A model for hydrophobic therapeutic proteins / L. Lin, M. Kunitani, M. Hora // Pharm. Biotechnol. - 2002. -Vol. 9.-P. 275-301.

123. Ling, W.L. Improvement of monoclonal antibody production in hybridoma cells by dimethyl sulfoxide / W.L. Ling, L. Deng, J. Lepore et al. // Biotechnol. Prog.-2003.-Vol. 19.-N. l.-P. 158-162.

124. Liu, C.H. Enhanced expression of various genes in recombinant Chinese hamster ovary cells in presence of dimethylsulfoxide / C.H. Liu, I.M. Chu, S.M. Hwang // Biotechnol. Lett. - 2001. - Vol. 23. - P. 1641-1655.

125. Liu, C. Development of a shaking bioreactor system for animal cell cultures / C. Liu and L. Hong // Biochem. Eng. J. - 2001. - Vol. 7. - N. 2. -P. 112-121.

126. Liu, C.H. Promotion of recombinant macrophage colony stimulating factor production by dimethylsulfoxide addition in Chinese hamster ovary cells / C.H. Liu and L.H. Chen // J. Biosci. Bioeng. - 2007. - Vol. 103. - N. 1. - P. 4549.

127. Lobanova, N. Optimization of CHO cell culture medium for production of recombinant human erythropoietin and interferon beta-la / N. Lobanova, I. Savinova, I. Trusova et al. // 15th European congress on biotechnology. -Elsevier B.V.: Oxford. - 2012. - P. 72.

128. Logsdon, N.J. The IL-10R2 binding hot spot on IL-22 is located on the N-terminal helix and is dependent on N-linked glycosylation / N.J. Logsdon,

B.C. Jones, J.C. Allman et al. // J. Mol. Biol. - 2004. - Vol. 342. - P. 503-514.

129. Malucchi, S. Neutralizing antibodies reduce the efficacy of beta-IFN during treatment of multiple sclerosis / S. Malucchi, A. Sala, F. Gilli et al. // Neurology. - 2004. - Vol. 62. - N. 11. - P. 2031-2037.

130. Mark, D.F. Site-specific mutagenesis of the human fibroblast interferon gene / D.F. Mark, S.D. Lu, A.A. Creasey et al. // PNAS. - 1984. - Vol. 81. -P. 5662-5666.

131. Markowitz, C.E. Interferon-beta: mechanism of action and dosing issues /

C.E. Markowitz // Neurology. - 2007. - Vol. 68. - Suppl. 4. - P. 8-11.

132. Mendonca, R.Z. Metabolic active-high density Vero cell cultures on microcarriers following apoptosis prevention by galactose/glutamine feeding / R.Z. Mendoca, S.J. Arrozio, M.M. Antoniazzi et al. // J. Biotechnol. - 2002. -Vol. 97.-N. l.-P. 13-22.

133. Min, W. Inteferon induction of TAP 1: the phosphatase SHP-1 regulates crossover between the IFN-a/b and the IFN-g signal-transduction pathways / W. Min, J.S. Pober, D.R. Johnson // Circul. Res. - 1998. - Vol. 83. - P. 815-823.

134. Moore A. Effects of temperature shift on cell cycle, apoptosis and nucleotide pools in CHO cell batch cultures / A. Moore, J. Mercer, G. Dutina et al. // Cytotechnology. - 1997. - Vol. 23. - P. 47-54.

135. Mortensen R. Selection of transfected mammalian cells / R. Mortensen, J.D. Chesnut, J.P. Hoeffler et al. // Curr. Protoc. Mol. Biol. - 2003. - Chapter 9. -Unit. 9.5.

136. Mullick, A. The cumate gene-switch: a system for regulated expression in mammalian cells / A. Mullick, Y. Xu, R. Warren et al. // BMC Biotechnol. - 2006. -Vol. 6.-P. 43.

137. Nam, J.H. The effects of culture conditions on the glycosylation of secreted human placental alkaline phosphatase produced in Chinese hamster ovary

cells / J.H. Nam, F. Zhang, M. Ermonval et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2008. -Vol. 100.-N. 6.-P. 1178-1192.

138. Nam, J.H. The effects of microcarrier culture on recombinant CHO cells under biphasic hypothermic culture conditions / J.H. Nam, M. Ermonval, S.T. Sharfstein // Cytotechnology. - 2009. - Vol. 59. - P. 81-91.

139. National Clinical Advisory Board of the National Multiple Sclerosis Society. MS Desease Management Consensus Statement. - 2007.

140. Oh, H.K. Effect of N-acetylcystein on butyrate-treated Chinese hamster ovary cells to improve the production of recombinant human interferon-ß-1 a / H.K. Oh, M.K. So, J. Yang J. et al. // Biotechnol. Prog. - 2005. - Vol. 21. - P. 1154-1164.

141. Oh-eda, M. O-linked sugar chain of human granulocyte colony-stimulating factor protects it against polymerization and denaturation allowing it to retain its biological activity / M. Oh-eda, M. Hasegawa, K. Hattori et al. // J. Biol. Chem. -1990. - Vol. 265. - P. 11432-11435.

142. Ozturk, S.S. Effect of medium osmolality on hybridoma growth, metabolism, and antibody production / S.S. Ozturk and B.O. Palsson // Biotechnol. Bioeng. - 1991. - Vol. 37. - P. 989-993.

143. Pachner, A.R. Measurement of MxA mRNA or protein as a biomarker of IFNbeta bioactivity: detection of antibody-mediated decreased bioactivity (ADB) / A.R. Pachner, A. Bertolotto, F. Deisenhammer // Neurology. - 2003. - Vol. 61. -N. 9. - P. 24-26.

144. Palermo, D.P. Production of analytical quantities of recombinant proteins in Chinese hamster ovary cells using sodium butyrate to elevate gene expression / D.P. Palermo, M.E. DeGraaf, K.R. Marotti et al. // J. Biotechnol. - 1991. -Vol. 19.-P. 35-48.

145. Pavlou, A.K. Recombinant protein therapeutics - success rates, market trends and values to 2010 / A.K. Pavlou and J.M. Reichert // Nat. Biotechnol. -2004. - Vol. 22 - P. 1513-1519.

146. Pestka, S. The human interferon-alpha species and hybrid proteins / S. Pestka // Semin. Oncol. - 1997. - Vol. 3. - Suppl. 9. - P. 4-17.

147. Pestka, S. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors / S. Pestka, C.D. Krause, M.R.Walter // Immunol. Rev. - 2004. - Vol. 202. - P. 832.

148. Pitha, P.M. Role of the interferon regulatory factors (IRFs) in virusmediated signaling and regulation of cell growth / P.M. Pitha, W.C. Au, W. Lowther et al. // Biochimie. - 1998. - Vol. 80. - P. 651- 658.

149. Potapenko, I.O. Glycan gene expression signatures in normal and malignant breast tissue; possible role in diagnosis and progression / I.O. Potapenko, V.D. Haakensena, T. Ludersc et al. // Mol. Oncol. - 2010. -Vol. 4.-N. 2.-P. 98-118.

150. Puck, T.T. Development of the Chinese hamster ovary (CHO) cell / T.T. Puck // Molecular Cell Genetics. - New York: John Wiley & Sons. - 1985. -P. 37-64.

151. Rebif®. Prescribing information // Rockland, MA: EMD Serono. - 2008.

152. Restelli, V. The effect of dissolved oxygen on the production and the glycosylation profile of recombinant human erythropoietin produced from CHO cells / V. Restelli, M.-D. Wang, N. Huzel et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2006. -Vol. 94. - N. 3. - P. 481-494.

153. Rodriguez, J. Enhanced production of monomeric interferon-p by CHO cells through the control of culture conditions / J. Rodriguez, M. Spearman, N. Huzel et al. // Biotechnol. Prog. - 2005. - Vol. 21. - P. 22-30.

154. Rudick, R.A. Impact of disease-modifying therapies on brain and spinal cord atrophy in multiple sclerosis / R.A. Rudick // J. Neuroimaging. - 2004. -Vol. 14. - Suppl 3.-P. 54-64.

155. Runkel, L. Structural and functional differences between glycosylated and non-glycosylated forms of human interferon-beta (IFN-beta) / L. Runkel, W. Meier, R.B. Pepinsky et al. // Pharm. Res. - 1998. - Vol. 15. - P. 641-649.

156. Runkel, L. Systematic mutational mapping of sites on human interferon-beta-la that are important for receptor binding and functional activity / L. Runkel,

C. deDios, M. Karpusas et al. // Biochemistry. - 2000. - Vol. 39. - N. 10. -P. 2538-2551.

157. Running Deer J. High-level expression of proteins in mammalian cells using transcription regulatory sequences from the Chinese hamster EF-1 alpha gene / J. Running Deer and D.S. Allison // Biotechnol. Prog. - 2004. - Vol. 20. - N. 3.-P. 880-889.

158. Russell-Harde, D. Formation of a uniquely stable type I interferon receptor complex by interferon-b is dependent upon particular interactions between interferon-b and its receptor and independent of tyrosine phosphorylation /

D. Russell-Harde, T.C. Wagner, H.D. Perez et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1999. - Vol. 255. - P. 539-544.

159. Rutherford, M.N. Interferon-induced binding of nuclear factors to promoter elements of the 2-5A synthetase gene / M.N. Rutherford, G.E. Hannigan, B.R. Williams // EMBO J. - 1988. - Vol. 7. - P. 751-759.

160. Ryu, J.S. Osmoprotective effect of glycine betaine on foreign protein production in hyperosmotic recombinant Chinese hamster ovary cell cultures differs among cell lines / J.S.Ryu, T.K. Kim, J.Y. Chung et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2000. - Vol. 70. - N. 2. - P. 167-175.

161. Sautkina, E. Preclinical investigation of a new interferon beta-la biosimilar / E. Sautkina, Y. Seregin, N. Lobanova et al. // 15th European congress on biotechnology. - Elsevier B.V.: Oxford. - 2012. - P. 202.

162. Searle, P.F. Building a metal-responsive promoter with synthetic regulatory elements / P.F. Searle, G.W. Stuart, R.D. Palmiter // Mol. Cell Biol. -1985.-Vol. 5.-P. 1480- 1489.

163. Senger, R.S. Effect of shear stress on intrinsic CHO culture state and glycosylation of recombinant tissue-type plasminogen activator protein / R.S. Senger and M.N. Karim // Biotechnol. Prog. - 2003. - Vol. 19. - N. 4. -P.1199-1209.

164. Sevastsyanovich, Y. Recombinant protein production: a comparative view on host physiology / Y. Sevastsyanovich, A. Sara, J. Cole // New Biotechnol. -V. 2009. - Vol. 25. - P. 175-180.

165. Sharma, V.K. Temperature- and pH-induced multiple partially unfolded states of recombinant human interferon-alpha2a: possible implications in protein stability / V.K. Sharma and D.S. Kalonia // Pharm. Res. - 2003. - Vol. 20. - N. 11. -P. 1721-1729.

166. Shenk, T. Transcriptional control regions: nucleotide sequence requirements for initiation by RNA polymerase II and III / T. Shenk // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1981. - Vol. 93. - P. 25^6.

167. Sinacore, M.S. CHO DUKX cell lineages preadapted to growth in serumfree suspension culture enable rapid development of cell culture processes for the manufacture of recombinant proteins / M.S. Sinacore, T.S. Charlebois, S. Harrison et al. // Oakes Biotechnol. Bioeng. - 1996. - Vol. 52. - P. 518-528.

168. Sinclair, A.M. Glycoengineering: The effect of glycosylation on the properties of therapeutic proteins / A.M. Sinclair and S. Elliott // J. Pharm. Sci. -2005. - Vol. 94. - P. 1626-1635.

169. Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation / V. Singh // Cytotechnology. - 1999. - Vol. 30. - P. 149-158.

170. Spearman, M. Effect of culture conditions on glycosylation of recombinant (3-Interferon in CHO cells / M. Spearman, J. Rodriguez, N. Huzel et al. // Cell Technology for Cell Products [ed. R. Smith]. - Dordrecht: Springer. - 2007. -P. 71-85.

171. Staeheli, P. Transcriptional activation of the mouse Mx gene by type-I interferon / P. Staeheli, P. Danielson, O. Haller et al. // Mol. Cell. Biol. - 1986. -Vol. 6. - P. 4770^774.

172. Sun, X. Effects of lactate on growth, metabolism and EPO expression of recombinant CHO cells / X. Sun and Y. Zhang // Chin. J. Chem. Eng. - 2002. -Vol. 53.-P. 1034-39.

173. Sunley, K. CHO cells adapted to hypothermic growth produce high yields of recombinant p-interferon / K. Sunley, T. Tharmalingam, M. Butler // Biotechnol. Prog. - 2008. - Vol. 24. - P. 898-906.

174. Tharmalingam, T. High yields of monomeric recombinant b-interferon from macroporous microcarrier cultures under hypothermic conditions / T. Tharmalingam, K. Sunley, M. Butler // Biotechnol. Prog. - 2008. - Vol. 24. -P. 832-838.

175. The IFN-J3 multiple sclerosis study group and the university of British Columbia MS/MRI analysis group. Interferon beta-lb in the treatment of multiple sclerosis: final outcome of the randomized controlled trial // Neurology. - 1995. -Vol. 45.-P. 1277-1285.

176. Trummer, E. Process parameter shifting: part I. Effect of DOT, pH, and temperature on the performance of Epo-Fc expressing CHO cells cultivated in controlled batch bioreactors / E. Trummer, K. Fauland, S. Seidinger et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2006. - Vol. 94. - P. 1033-1044.

177. Trummer, E. Process parameter shifting: part II. Biphasic cultivation - a tool for enhancing the volumetric productivity of batch processes using Epo-Fc expressing CHO cells / E. Trummer, K. Fauland, S. Seidinger et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2006. - Vol. 94. - P. 1045-1052.

178. Unger, D.R. Computational and experimental investigation of flow and fluid mixing in the roller bottle bioreactor / D.R. Unger, F.J. Muzzio, J.G. Aunins et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2000. - Vol. 70. - P. 117-130.

179. Van Beers, M.C. On the role of aggregates in the immunogenicity of recombinant human interferon-beta in patients with multiple sclerosis / M.C. Van Beers, W. Jiskoot, H. Schellekens // J. Interferon Cytokine Res. - 2010. - Vol. 30. -P. 767-775.

180. Van Beers, M.C. Aggregated recombinant human interferon-beta induces antibodies but no memory in immune-tolerant transgenic mice / M.C. Van Beers, M. Sauerborn, F. Gilli et al. // Pharm. Res. - 2010. - Vol. 27. - P. 1812-1824.

181. Wahl, G.M. Effect of chromosomal position on amplification of transfected genes in animal genes / G.M. Wahl, B.R. de Saint Vincent, M.L. De Rose // Nature. - 1984. - Vol. 307. - P. 516-520.

182. Wang, W. Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics / W. Wang // Int. J. Pharmaceutics. - 2005. - Vol. 289. - P. 1-30.

183. Warren, C.E. Glycosylation / C.E. Warren // Curr. Opin. Biotechnol. -1993. - Vol. 4. - N. 5. - P. 596-602.

184. Watanabe, Y. Properties of non-glycosylated human interferon-beta from MG63 cells / Y. Watanabe and Y. Kawade // J. Gen. Virol. - 1983. - Vol. 64. -P.1391-1395.

185. Weidle, U.H. Inhibition of histone deacetylases: a new strategy to target epigenetic modifications for anticancer treatment / U.H. Weidle and A. Grossmann // Anticancer Res. - 2000. - Vol. 20. - N. 3A. - P. 1471-1485.

186. Whitford, W.G. Fed-batch mammalian cell culture in bioproduction / W.G. Whitford // BioProcess Intl. - 2006. - Vol. 4. - N. 4. - P. 30^14.

187. Wiebe, M.E. A multifaceted approach to assure that recombinant tPA is free of adventitious virus / M.E. Wiebe // Advances in animal cell biology and technology. - London: Butterworth-Heinemann. - 1989. - P. 68-71.

188. Wlaschin, K.F. Engineering cell metabolism for high-density cell culture via manipulation of sugar transport / K.F. Wlaschin and W.S. Hu // J. Biotechnol. -2007.-Vol. 131.-N. 2.-P. 168-176.

189. Wurm, F. Large-scale transient expression in mammalian cells for recombinant protein production / F. Wurm and A. Bernard // Curr. Opin. Biotechnol.- 1999.-Vol. 10.-P. 156-159.

190. Wurm, F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells / F.M. Wurm // Nature Biotechnol. - 2004. - Vol. 22 - P. 1393-

191. Xie, L. Integrated approaches to the design of media and feeding strategies for fed-batch cultures of animal cells / L. Xie and D.I. Wang // Trends Biotechnol. - 1997.-Vol. 15.-N. 3.-P. 109-113.

192. Xie, L. Protein production by large-scale mammalian cell culture II L. Xie, W. Zhou, D. Robinson // Gene transfer and expression in mammalian cells [ed. S.C. Makrides]. - Asterdam: Elsevier Science. - 2003. - P. 605-623.

193. Yang, M. Effect of ammonia on the glycosylation of human recombinant erythropoietin in culture / M. Yang and M. Butler // Biotechnol. Prog. - 2000. -Vol. 16.-P. 751-759.

194. Yang, Y. DNA methylation contributes to loss in productivity of monoclonal antibody-producing CHO cell lines / Y. Yang, A. Mariati, J. Chusainow et al. // J. Biotechnol. - 2010. - Vol. 147. - N. 3-4 - P. 180-185.

195. Yi, X. Effects of osmotic pressure on recombinant BHK cell growth and von willebrand factor (vWF) expression / X. Yi, S. Xiangming, Z. Yuanxing // Process Biochem. - 2004. - Vol. 39. - P. 1817-1823.

196. Yoon S.K., Choi S.L., Song J.Y., Lee G.M. Effect of culture pH on erythropoietin production by Chinese hamster ovary cells grown in suspension at 32.5 and 37.0 degrees C // Biotechnol. Bioeng. - 2005. - V. 5. - N. 89. - P. 345356.

197. Yoon, S.K. Effect of culture temperature on folliclestimulating hormone production by Chinese hamster ovary cells in a perfusion bioreactor / S.K. Yoon, Y.-H. Ahn, M.H. Jeong // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - Vol. 76. - P. 8389.

198. Yoon, S.K. Application of sodium propionate to the suspension culture of Chinese hamster ovary cells for enhanced production of follicle-stimulating hormone / S.K. Yoon and Y.-H. Ahn // Biotechnology and Bioprocess Engineering.-2007.-Vol. 12.-N. 5.-P. 497-501.

199. Yoshida, H. Chemical chaperones reduce aggregate formation and cell death caused by the truncated Machado-Joseph disease gene product with an

expanded polyglutamine stretch / H. Yoshida, T. Yoshizawa, F. Shibasaki et al. // Neurobiol. Dis. - 2002. - Vol. 10. - N. 2. - P. 88-99.

200. Zang, M. Production of recombinant proteins in Chinese hamster ovary cells using a protein-free cell culture medium / M. Zang, H. Trautmann, C. Gandor et al. // Biotechnology. - 1995. - Vol. 13. - P. 389-392

201. Zhang, Y. Approaches to optimizing animal cell culture process: substrate metabolism regulation and protein expression improvement / Y. Zhang // Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. - 2009. - Vol. 113. - P. 177-215.