Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, доктор биологических наук Белжеларская, Светлана Николаевна

• Белжеларская, Светлана Николаевна
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Белжеларская, Светлана Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ. 8

ВВЕДЕНИЕ.10

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.14

1.1. Введение.

1.2. Вирусные векторы для переноса и экспрессии генов в клетках эукариот.15

1.3. Бакуловирусы.17

1.3.1. Биология бакуловирусов.17

1.3.2. Молекулярная биология бакуловирусов.18

1.4. Бакуловирусные системы экспрессии (БЭС) рекомбинантных белков в клетках эукариот.19

1.4.1. Системы экспрессирующих векторов на основе бакуловирусов.19

1.4.2. Получение функционально активных рекомбинантных белков с использованием бакуловирусной системы экспрессии в клетках насекомых.22

1.4.3. Получение вирусоподобных частиц и вакцин в клетках насекомых с использованием бакуловирусной системы экспрессии.26

1.4.4. Бакуловирусы - средство введения и экспрессии гетерологичных генов у млекопитающих.28

1.4.5. Клеточные линии млекопитающих, чувствительные к бакуловирусной трансдукции.30

1.4.6. Эффективность бакуловирусной трансдукции.

1.4.7. Механизм взаимодействия бакуловируса с клетками млекопитающих.31

1.4.8. Доставка и экспрессия гетерологичных генов в клетки млекопитающих in vivo.32

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Системы клонирования и экспрессии целевых генов и анализ биологических функций синтезированных рекомбинантных белков»

Оптимизация и дальнейшее совершенствование различных используемых, а также разработка новых систем доставки и экспрессии рекомбинантных генов, в зависимости от типа клеток-мишеней и спектра задач, представляет собой важную функциональную научную задачу и имеет практическое значение в области биомедицины. Конструирование векторных ДНК для введения целевых последовательностей в геномы микроорганизмов, дрожжей, растений, насекомых, млекопитающих находит практическое применение для решении широкого спектра задач. На сегодняшний день используются различные методы для введения чужеродных генов в клетки про- и эукариот при помощи физико-химических способов доставки (электропорации, бомбардировки микрочастицами золота или вольфрама и т.д.) или при помощи различных вариантов биологической доставки (липидных коньюгатов — липосом, рекомбинантных вирусов и т.д). Введение рекомбинантных гибридных молекул ДНК в прокариотические и эукариотические клетки с помощью векторов имеет массу преимуществ и вышло на первый план при решении этой задачи. Разработка на их основе различных систем экспрессии, обеспечивающих эффективную продукцию белков in vitro и in vivo, постоянно совершенствуется, расширяется круг задач, при решении которых они применяются.

Кишечная палочка Е. coli - наиболее генетически, биохимически и физиологически изученный микроорганизм, поэтому основные работы по гетерологичной экспрессии выполняются на этих клетках. Однако Е. coli относится к условно-патогенным для человека микроорганизмом, что может создавать определенные трудности при получении на ее основе, например, фармацевтических препаратов. Сегодня Е. coli часто используют в качестве «промежуточной» системы клонирования при конструировании гибридных молекул ДНК для других типов клеток. Так, в новых бакуловирусных системах для получения рекомбинантного вируса используются клетки Е coli на промежуточной стадии для поддержания и размножения вирусной ДНК в виде кольцевой формы, с последующей репликацией бакуловируса в клетках насекомых.

Бактерия Bacillus subtilis по степени популярности и изученности следует за Е .coli: на ее основе также конструируют штаммы-продуценты, секретирующие чужеродные белки из клеток. В subtilis безопасна для человека и животных и успешно освоена микробиологической промышленностью.

Из низших эукариот хорошо изучены дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Первый штамм-продуцент поверхностного антигена вируса гепатита В был создан именно на S. cerevisiae. Дрожжи представляют собой один из важнейших промышленных микроорганизмов, поэтому интенсивная разработка исследований по созданию векторной дрожжевой системы продолжает быть актуальной и в настоящее время.

Системы клеток бактерий и дрожжей имеют свои особенности при использовании в генетической инженерии и при создании векторов для клонирования и экспрессии генов, для секвенирования ДНК и в качестве модельных систем для изучения генетических процессов, которые применяются в фундаментальной и прикладной биомедицине. Получены штаммы бактерий и дрожжей для клонирования и экспрессии генов с высокой эффективностью синтезирующие гетерологичные белки человека и животных. Каждая из систем клонирования и экспрессии имеет свои недостатки и преимущества. Системы клонирования и экспрессии генов в клетках бактерий и дрожжей не позволяют экспрессировать несплайсированные гены. Кроме того, в них невозможен сложный посттрансляционный процессинг полипептидов, происходящий в клетках млекопитающих. Все большую актуальность приобретает проблема экспрессии мультимерных белков эукариот, которые требуют для проявления своей биологической активности специфических посттрансляционных модификаций и сборки из различных субъединиц. В этих случаях используют экспрессирующие системы на основе клеток высших эукариот, которые обеспечивают синтез белков, структурно и функционально близких к своим природным аналогам. В последние два десятилетия предложено большое число векторов, в качестве которых выступают различные вирусы для введения чужеродных генов в клетки-мишени. С помощью вирусов - естественных переносчиков чужеродной ДНК в клетки млекопитающих - удается обеспечить эффективное проникновение генетического материала в клетки-мишени, достичь высокого уровня трансфекции клеток in vitro и in vivo и высокого уровня экспрессии внесеннных генов. Однако существование врожденного иммунитета у человека к большинству таких векторов может ограничить их применение.

Одним из подходов к преодолению этой проблемы является создание рекомбинантных вирусов, не патогенных для человека, в качестве векторов для переноса генов. Например, у человека отсутствует врожденная гуморальная и клеточная иммунная память по отношению к бакуловирусам. Поэтому бакуловирусная система экспрессии на основе клеток насекомых отряда Spodoptera, которая обеспечивает сверхпродукцию рекомбинантных белков в эукариотических клетках, популярна в настоящее время. Бакуловирусная система (БЭС) позволяет экспрессировать несплайсированные гены, а особенности структуры капсидной оболочки бакуловирусов позволяют упаковывать в нее очень большие гены. Рост интереса к этим системам экспрессии связан также с возможностью использования бакуловирусных векторов для доставки и экспрессии гетерологичных генов в клетках млекопитающих. Экспрессионная система на основе бкуловирусов, позволяющая синтезировать полноценные эукариотические белки в различных клетках млекопитающих in vitro, ex vivo и in vivo, рассматривается в качестве перспективной альтернативы векторам на основе вирусов человека. Оптимизация такой системы, в зависимости от типа клеток-мишеней, является актуальной задачей современных исследований в области биомедицины. Целью данной работы является сравнение различных векторных систем, клонирование и.экспрессия целевых рекомбинантных генов в клетках про- и эукариот и их применение для решения научных и прикладных задач. Оптимизация системы доставки и экспрессии генов в клетках насекомых и млекопитающих на основе бакуловирусных векторов: В ходе работы был поставлен ряд задач:

1. С использованием бактериальных систем клонирования и экспрессии: а) Получить библиотеки бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномных РНК вируса штриховатой мозаики ячменя (ВШМЯ) и вируса картофеля (ХВК), для изучения структуры вирусных геномов. б) Разработать тест-систему для функциональной селекции библиотек мутантных рибозимов в клетках Bacillus subtilis с целью изучения механизмов функционирования синтезированных рибозимов in vivo.

2. С использованием систем экспрессии в клетках листьев табака, ооцитов: Создать генетические конструкции для доставки и экспрессии гена серотонинового рецептора мозга мыши 5НТ1с в клетках листьев табака, ооцитах ксенопуса и клетках насекомых для изучения роли серотониновой системы в реакции различных типов клеток на стрессорные сигналы.

3. С использованием дрожжевой системы экспрессии:

Создать набор векторных конструкций, содержащих делеционные варианты промотора кислой фосфатазы РН05, для экспрессии и секреции генов в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

4. С использованием бакуловирусной системы экспрессии на основе клеток насекомых и млекопитающих:

1) Создать набор мультипромоторных векторов экспрессии для клеток насекомых, содержащих промоторы поздних генов вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), которые обеспечивают одновременную экспрессию нескольких генов в одной инфицированной клетке насекомого.

2) Сконструировать трансфер-векторы на основе бакуловирусов, содержащие регуляторные элементы, используемые ферментативными системами клеток млекопитающих, для экспрессии клонированных целевых генов в культуре клеток млекопитающих.

3) Получить рекомбинантные вирусы и линии клеток насекомых, синтезирующие иммунологически активные а- и (3-субъединицы хориогонадотропина (ХГ) и CD4 рецептора.

4) Получить рекомбинантную функционально-активную стероид-21-гидроксилазу человека и мутантный вариант этого фермента с высоким уровнем экспрессии в клетках насекомых Sf9 и Hi5 на основе бакуловирусов и провести функциональный анализ мутантного фермента in vitro.

5) Получить структурные белки и вирусоподобные частицы вируса гепатита С (ВГС ) в клетках насекомых и млекопитающих с помощью бакуловирусной системы экспрессии и исследовать их функциональные характеристики.

6) Исследовать морфогенез вируса гепатита С: изучить влияние гликозилирования обо л очечных белков ВГС на их экспрессию и процессинг и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых .

7) Исследовать влияние новых синтетических ингибиторов гликозилирования белков на процессинг структурных белков и формирование вирусоподобных частиц ВГС в клетках насекомых и млекопитающих.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. ВВЕДЕНИЕ

Векторы для переноса чужеродных ДНК в клетки млекопитающих и эукариотические системы экспрессии, основанные на их использовании и обеспечивающие эффективную продукцию биологически активных белков in vitro и in vivo, постоянно совершенствуются. Известны разные методы введения чужеродных генов в клетки эукариот, при помощи физико-химических способов доставки ( электропорации, бомбардировки микрочастицами золота или вольфрама и т.д.), при помощи различных вариантов биологической доставки (липидных коньюгатов -липосом, рекомбинантных вирусов и т.д). В течение последних двух десятилетий предложено большое число вариантов векторов на основе различных вирусов как средства доставки чужеродных генов в клетки-мишени. С помощью вирусов -естественных переносчиков чужеродной ДНК в клетки млекопитающих - удается обеспечить проникновение генетического материала в клетки-мишени и достичь высокого уровня трансфекции клеток in vitro и in vivo и экспрессии внесеннных генов.

Экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов позволяют синтезировать полноценные эукариотические белки в культивируемых клетках насекомых с таким выходом, уровень которого не достигнут ни в одной другой эукариотической системе гетерологичной экспрессии генов. Способность бакуловируса передавать генетическую информацию клеткам млекопитающих послужила предпосылкой для использования бакуловирусных векторов и в качестве экспрессирующих векторов для клеток млекопитающих. Так как бакуловирус, передавая эту информацию клеткам млекопитающих, сам не реплицируется, то векторы на его основе удобны и безопасны для разработки эффективных систем переноса и экспрессии чужеродных генов in vitro и in vivo. Более того, высокая емкость бакуловирусных векторов и биологическая безопасность вируса определяют интерес к этой системе и ее совершенствованию. Экспрессионная система на основе бакуловирусов, позволяющая получать эффективную продукцию полноценных эукариотических белков в широком спектре клеток млекопитающих in vitro, ex vivo и in vivo, может рассматриваться как перспективная альтернатива векторам на основе вирусов человека. В настоящем обзоре рассмотрены особенности бакуловирусов и систем экспрессии на их основе.

1.2. ВИРУСНЫЕ ВЕКТОРЫ ДЛЯ ПЕРЕНОСА И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В

КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ.

Векторы на базе вирусов млекопитающих, которые обеспечивают эффективное проникновение в клетки-мишени, позволяют использовать вирусы в качестве естественных векторов чужеродной ДНК для клеток эукариот. При выборе оптимальной системы, важны такие критерии, как простота применения, сильные и регулируемые во времени промоторы, как скорость получения значительных количеств активных эукариотических белков и т.д. Первостепенное значение имеет выбор вектора для получения белка. В зависимости от специфики решаемой проблемы, предпочтение отдается тому или иному вектору.

К сожалению, все известные in vitro и in vivo векторные системы доставки репортерных генов далеки от совершенства, хотя проблемы доставки экзогенных ДНК in vitro, в основном, решены. Системы же переноса чужеродных генов в клетки-мишени млекопитающих in vivo продолжают совершенствоваться. Например, такие характеристики векторных систем как стабильность их интеграции, регулируемая экспрессия, безопасность использования все еще нуждаются в доработке. В идеале, важно достичь не только устойчивости введенного гена, но и эффективной экспрессии в течение длительного времени.

При решении задач, связанных с совершенствованием систем эффективного переноса и экспрессии трансгенов в клетках эукариот in vitro и in vivo, в основном, используют различные векторы на основе вирусов человека. Примененяются векторы на основе ретровирусов, аденовирусов, аденоассоциированных вирусов, вируса герпеса, лентивирусов, бакуловирусов. Каждая система на их основе имеет свои преимущества и недостатки. Сравнение свойств вирусных векторов, наиболее часто используемых для доставки чужеродной генетической информации в клетки эукариот, позволяет оценивать их в качестве перспектив для использования в биологической медицине. По сравнению с другими типами вирусных векторов, векторы на основе ретровирусов обладают уникальной способностью эффективно переносить чужеродные гены и стабильно их интегрировать в геном делящихся соматических клеток. Недостатки ретровирусных систем переноса и экспрессии генов -невозможность доставки генов в геном неделящихся клеток, низкие вирусные титры и небольшие размеры внедренного трансгена. При конструировании векторных конструкций на основе аденовирусов используют дефектные по репликации аденовирусы. Способность аденовируса инфицировать практически любые клетки как in vitro, так и in vivo, позволяет применять аденовирусные векторы для адресной доставки генетического материала и вводить в их состав тканеспецифические промоторы. Недостатком системы на основе аденовируса является его неспособность интегрироваться в геном клетки-хозяина. Кроме того, рекомбинантный аденовирус может рекомбинировать с природными аденовирусами. Уникальной особенностью адено-ассоциированного вируса является способность к стабильной направленной интеграции в один из районов 19 хромосомы человека. Интегрируясь в геном, вирус пребывает в латентном состоянии. Специфичность такой интеграции определяется наличием в его геноме гена Rep. Однако этот вирус имеет низкую упаковывающую способность и относительно низкую инфекционность. Крупный ДНК содержащий герпес вирус (HSV) при трансформации клеток формирует в ядрах эписомные структуры. Большая емкость (более 30 т.п.о.), высокие вирусные титры, высокая эффективность инфекции и широкий спектр клеток-хозяев определяют преимущества векторных конструкций на основе вируса герпеса. При этом, упаковка вирусных частиц происходит с низкой эффективностью, а репликационно-дефектные мутанты вируса цитотоксичны. Векторные конструкции на основе бакуловирусов образуют рекомбинантные бакуловирусы в клетках насекомых (природных хозяевах бакуловирусов) с высоким титром.

Экспрессионная система на основе бакуловирусных векторов, по сравнению с другими типами вирусных векторов, представляется наиболее удобной, поскольку ее преимущества очевидны. Среди них то, что размеры внедренных трансгенов могут достигать до 100 т.п.н., уровень их экспрессии и синтеза рекомбинантных белков высок. Вектор может одновременно экспрессировать несколько генов, включая несплайсированные. В клетках млекопитающих вирус не реплицируется, и это позволяет использовать его в качестве вектора для доставки репортерных генов в клетки млекопитающих как in vitro, так и in vivo. С его помощью можно осуществлять прямое адрессное клонирование при временной и стабильной трансдукции клеток млекопитающих. Можно трансдуцировать первичные клетки разного типа, при широком спектре клеточной специфичности. Бакуловирус может инфицировать неделящиеся клетки, нецитотоксичен, не эндемичен для человека.

Врожденный иммунитет человека к большинству вирусов человека ограничивает применение векторов на их основе. Путь к преодолению этой проблемы - создание рекомбинантных вирусов не человеческого происхождения в качестве векторов для переноса генов. Врожденной гуморальной и клеточной иммунной памяти у человека по отношению к бакуловирусам нет, поскольку они инфекционны только для насекомых, но и обладают способностью передавать генетическую информацию клеткам млекопитающих.

К недостаткам этой системы можно отнести то, что посттрансляционные модификации белков в клетках насекомых в отдельных случаях неадекватны и то, что чувствительность бакуловируса к действию системы комплемента при доставке чужеродных генов в клетки и ткани млекопитающих in vivo достаточно велика. Тем не менее, на сегодняшний день, бакуловирусная векторная система успешно применяется для доставки генетической информации в клетки эукариот in vitro и ее использование для доставки генов in vivo продолжает расширяться. Векторы на основе бакуловирусов находят все большее применение в фундаментальной и прикладной биологии, в биомедицине, для разработок, направленных на создание методов диагностики, вакцинации и генотерапии.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Белжеларская, Светлана Николаевна

Выводы:

1. С использованием разработанных систем клонирования и экспрессии в клетках бактерий впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК ВШМЯ и предложена схема организации функционально фрагментированного генома фитовируса ВШМЯ; впервые предложена бактериальная тест-система, для функционального скрининга библиотек мутантных рибозимов.

2. Впервые сконструирована серия векторных плазмид, содержащих делеционные варианты регуляторных областей гена РН05, для экспрессии и секреции гетерологичных белков в культуре клеток Saccharomyces cerevisiae, которые могут быть использованы в качестве промышленных продуцентов рекомбинантных белков млекопитающих.

3. Впервые разработаны и предложены условия синтеза серотонинового рецептора 5НТ1с мозга мыши в клетках растений, в ооцитах Xenopus laevis и в клетках насекомых для изучения его функциональной активности. Показано, что рецептор серотонина в виде гибрида с GFP. в клеточном ответе на серотонин в ооцитах Xenopus laevis, связывается с гормоном и, при участии GTP-связывающего белка, активирует фосфолипазу С, инициируя поток кальция в клетке.

4. Впервые в инфицированных рекомбинантными бакуловирусами клетках насекомых синтезированы стероид-21-гидроксилаза (CYP21А2) человека и ее мутантный вариант (C169R), обнаруженный у больной с классической формой адреногенитального синдрома, с уровнем экспрессии, значительно превышающим показатели, достигнутые в системах экспрессии на основе клеток млекопитающих и дрожжей. Впервые проведены исследования влияния мутаций стероид-21-гидроксилазы на ее свойства, которые могут иметь важное значение для прогнозирования тяжести заболевания классической формой адреногенитального синдрома при молекулярно-генетической диагностике у новорожденных

5. Впервые предложены новые дву- и трех-промоторные векторы экспрессии для эукариот на основе бакуловирусов, для синтеза мультимерных белков со специфическими пост-трансляционными модификациями и корректной сборкой из различных субьединиц.в клетках насекомых.

6. Впервые сконструированы новые модифицированные бакуловирусные векторы в форме трансфер-векторов рРаз1ВасМатОРР и рРаз1ВасМатЬис, с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса (СМЛ') для направленной доставки и экспрессии эукариотических генов в культивируемых клетках млекопитающих. Разработаны условия эффективной трансдукции и экспрессии структурных генов ВГС в клетках Нек293 и Ний-7, с помощью рекомбинантных бакуловирусов.

7. Получены линии клеток насекомых 81^9 - эффективные продуценты структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С, структурно и иммунологи чески подобных вприонам вируса, использованных в качестве модели при изучении морфогенеза ВГС.

8. Для изучении морфогенеза ВГС исследовано влияние М-гликозилировапия гликопротеина Е1 вируса гепатита С на экспрессию и процессинг белков оболочки вируса, на образование комплекса Е1Е2 ВГС, влияющего на формирование часшц, морфологически подобных вприонам ВГС, с использованием вирусоподобных частиц ВГС, синтезируемых в клетках насекомых.

9. С целью разработки новых антивирусных соединений, влияющих на формирование вириона вируса гепатит а С, синтезированы ингибиторы а-глюкозидазы, производные иминосахара дезоксиноиримицина (БШ) Ы-пентил -Г)Ш и М-бепзил -БШ, способные нарушать процесс внутриклеточного М-гликозилирования оболочечных гликопротеинов вируса, влияя на сворачивание гликопротеинов и, соответственно, сборку вирусных частиц.

Работа получила финансовую поддержку Государственной научно-технической программы России «Новейшие методы биоинженерии» (№6-19), Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники гражданского назначения» 1999-2000 г.г. и 20012002 г.г. и Российского фонда фундаментальных исследований 05-04-49477а (2005-2007г.г.) , 07-04-12136 офи ( 2007-2008 г.г.) и 08-04-00281а (2008-2010 г.г.).

Список публикаций по теме диссертации.

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Dolja, V., Lunuia, N., Leiser, R., Stanarius, Т., Beljelarskaya, S., Kozlov, Y. and Atabekov,

1. (1983) A comparative study on the in vitro translation products of individual RNAs from two, three-, and four- component strains of Barley stripe mosaic virus. Virology 127, 1-44.

2. Белжеларская C.H., Морозов С.Ю., Доля B.B., Козлов Ю.В., Атабеков Г.И. (1984), Клонирование ДНК копий индивидуальных РНК ВШМЯ. Доклады АНСССР, 275,186-188.

3. Рупасов В., Адышев Д., Морозов С., Белжеларская С., Манкин А., Доля В., Аграновский А., Атабеков Г. и Козлов Ю. (1984) Структура 3'-концевого участка РНК вируса штриховатой мозаики ячменя . Молекулярная биология 18, 140-145

4. Kozlov, Yu., Rupasov, V., Adyshev. D., Beljelarskaya, S., Agranovsky, A., Mankin, A., Morozov, S. and Dolya, V. (1984) Nucleotide sequence of the З'-terminal structure in BSMV genome. Nucleic Acids Research, 12, 4001-4009.

5. Adyshev, D., Beljelarskaya, S. Kozlov, Yu. (1987) Pecularities of structural organization of BSMV genome. Ac. of Sci. of the Kyrghyz Rep. News, 4: 52-55.

6. Краев А., Морозов С., Лукашева Л., Розанов М., Чернов В.,' Симонова М., Голова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1988) Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля. Доклады АНСССР. 300, 711-716.

7. Циоменко А.Б., Лупашин В.В., Морзунов С.П., Карпычев И.В., Белжеларская С.Н., Рубцов П.М., Скрябин К.Г. (1990) Природа N-концевой сигнальной последовательности определяет характер внутриклеточного распределения и эффективность экспорта гормона роста человека у дрожжей Sacccharomyces cerevisiae. Молекулярная биология 24, 11261133.

8. Белжеларская С.Н., Орловский И В.и Никитенко С.В. (1996). Использование бактериальной селекционной системы на основе Bacillus Subtilis для отбора мутантных рибозимов, эффективно функционирующих in vivo .Доклады АНСССР. 347, 113-116.

9. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П., Филенко О.М., Бучацкий Л.П. и Рубцов П.М. (1996) Экспрессия кДНК хорионического гонадотропного гормона человека в культуре клеток насекомых. Молекулярная биология 30(3), 518-523.

10. Сутугина Л.П., Белжеларская С.Н., Филенко О.М., Труш Ф.М., Бучацкий Л.П. и Скрябин К.Г. (1996) Метод роллерного культивирования культуры клеток насекомых SF9, инфицированных гибридными бакуловирусами. Молекулярная биология 30, 410-415.

11. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П., Толкачева Т.В., Рубцов П.М.и Скрябин К.Г. (1996) Экспрессия гена CD-4 рецептора ВИЧ-1 в клетк5ах насекомых с использованием бакуловирусной системы. Молекулярная биология 30, 524-528.

12. Белжеларская С.Н. (2002) Бакуловирусная система экспрессии в клетках насекомых, Обзор, Молекулярная биология 36(3), 371-385.

13. Белжеларская С.Н. и Саттон Ф. (2003) Роль серотониновой системы в реакции различных типов клегок на стрессорные сигналы. Молекулярная биология 37(3), 452-457.

14. Белжеларская С.Н. и Саттон Ф. (2004) Экспрессия кДНК гена серотонинового рецептора мыши (5НТ1с) в культуре клеток насекомых. Молекулярная биология 38(3). 477482.

15. Королева Н.Н., Грищук Ю.В., Кочеткова С.В., Прасолов B.C. Рубцов П.М. и Белжеларская С.Н. (2006) Оптимизация бакуловирусной системы доставки генов в клетки насекомых и млекопитающих. Молекулярная биология, 40(6), 1074-1081

16. Yu.Grischuk. P. Rubtsov, F. Riepe, J. Grotzinger, S. Beljelarskaya, V. Prassolov, N. Kalintchenko, T. Semitcheva, V. Peterkova, A. Tiulpakov, W. G. Sippell and N.Krone (2006). Four novel missense mutations in the CYP21 gene in Russian patients with classical form of congenital adrenal hyperplasia (САН): identification, functional characterization and structural modeling. J Clin Endocrin & Metab (JCEM), 91(1-12), 4976-4980

17. Грищук Ю.В., Рубцов П.М. и Белжеларская С.Н.(2007) Экспрессия и функциональный анализ стероид 21 -гндроксилазы человека и ее мутаитного варианта в клетках насекомых. Молекулярная биология, 41(1), 77-78

18. С.Н. Белжеларская, Н.Н. Королева, В.В. Попенко, В.Л. Друца, О.В.Орлова, П.М. Рубцов, С.Н. Кочетков.(2010) Характеристика структурных белков и вирусоподобных частиц вируса гепатита С, синтезированных в клетках насекомых с помощью бакуловирусной системы экспрессии. Молекулярная биология 44(1). 107-119

19. Королева Н.Н., Спирин П.В. Тимохова А.В., Рубцов П.М., Кочетков С.Н., Прасолов B.C., Белжеларская С.Н. (2010) Бакуловирусныс векторы для эффективной доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих, Молекулярная биология, 44(3), 1-13

20. Lyupina YV, Dmitrieva SB, Tiinokhova AY, Beljelarskaya SN, Zatsepina OG, Evgen'ev M.B. Mikhailov VS. (2010) An important role of the heat shock response in infected cells for replication of baculoviruses. Virology, Aug 12,

21. Белжеларская С.Н. (2010). Бакуловирусные системы экспрессии рекомбинантных белков в клетках насекомых и млекопитающих. Обзор., Молекулярная биология,45(1), 142-159.

Избранные тезисы конференций:

22. Beljelarskaya, S., Morozov, S., Dolja, V., Kozlov, Yu. and Atabekov. I. (1982) Cloning of DNA-copies of RNA genome BSMV. Thesises on Sixth USSR-FRANCE Symposium "Proteins and Nuclear Acids Structure and Function", Tskhaltubo, p.21

23. Kozlov, Yu., Rupasov, V., Adyshev, D., and Beljelarskaya, S. (1984) Pecularities of structural organization of BSMV genome. Thesis on 16-th FEBS conference, Moscow, p.22.9

24. Beljelarskaya, S., Krajev, A., Mironova,M. and Skryabin, K. (1983) Cloning of ADE2 gene of Saccharomyces cerevisiae. Report on The International Conference" Metabolic and genetic regulation in yeast", Jena, GDR.

25. Краев А., Морозов С., Лукашева JI., Розанов М., Чернов В., Сшмонова М., Голова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1987) Первичная структура генома Х-вируса картофеля. Молекулярная генетика .3, 32

26. Рубцов П.М., Морозов И.А., Свердлова П.С., Дебабов Д. Г. и Белжеларская С.Н. (1994) Создание трансфер-векторов для экспрессии мультимерных генов в эукариотической системе экспрессии Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология. А, 17-18.

27. Белжеларская С.Н., Свежинский Е.А., Сутугина Л.П., Трум В.М., Рубцов П.М., Скрябин К.Г.(1994) Экспрессия гонадотропных гормонов в клетках эукариот. Молекулярная Генетика, Микробиология и Вирусология. 4, 16-17.

28. Белжеларская С.Н., Рубцов П.М., Сутугина Л.П., Рахимова Л.Х., Батырева Е.Р. и Скрябин К.Г.(1996) Создание эффективных систем клонирования и экспрессии эукариотических генов в клетках насекомых с использованием бакуловирусных векторов. Тезисы стендовой сессии Международной конференции, посвященной памяти акад. А.А.Баева. 109.

29. Beljelarskaya S., Holt С., Sutton F. (1999) Conservation of signal transduction pathways in plant and animal cells. Thesises on The 4th International Engelhardt Conference on Molecular Biology, Moscow, 7.

30. S. N. Beljelarskaya, Yu.V. Grischuk, N.N Koroleva, S.N. Kochetkov and P.M. Rubtsov. (2004) Efficient gene transfer into insect and mammalian cells by baculovirus vectors for production of functional human steroid-21-hydroxilase and hepatitis С virus proteins in insect and mammalian cells. Thesises: 7th Interntional Engelhardt Conference on Molecular Biology, Susdal.

31. Y.V.Grischuk, D.S. Ivanov, V.S. Prassolov, S.N. Beljelarskaya and P.M.Rubtsov. (2005) Two novel disease-causing mutations in the CYP21 gene in Russian patients with 21hydroxylase deficiency: affect on functional enzyme activity. 30th FEBS Congress-9th IUBMB Conference, Budapest. A4-023P.

Заключение

Цикл работ, представленный в настоящей диссертации, посвящен разработке систем клонирования и экспрессии генов в клетках про - и эукариот и анализу биологических функций целевых белков с использованием этих систем, начиная с бактериальных клеток и завершая, активно используемой в настоящее время, бакуловирусной системой экспрессии в клетках насекомых и млекопитающих.

Конструирование векторных ДНК и введение целевых последовательностей в геномы микроорганизмов, дрожжей, растений, насекомых, млекопитающих, в зависимости от спектра поставленных задач; разработка и оптимизация систем экспрессии генов позволили синтезировать белки разного типа, пригодные для структурных и функциональных исследований.

При выполнении представленной работы, с использованием клеток Е. coli, впервые получена библиотека бактериальных клонов, содержащих ДНК-копии геномной РНК ВШМЯ, которая может быть использована в производстве диагностических препаратов, необходимых для селекции сортов злаков, устойчивых к этому вирусу. Предложена схема организации функционально фрагментированного генома фитовируса. Использованная нами система двумерного электрофореза дает оптимальное разрешение для олигонуклеотидов длиной свыше 10 остатков, что давало возможность анализировать значительную часть последовательностей исследуемых молекул РНК ВШМЯ. Так как олигонуклеотиды статистически распределены по всей длине исследуемой молекулы РНК, то можно допустить, что они достаточно достоверно представляют всю последовательность этой РНК. Сравнительный анализ олигонуклеотидных карт геномных РНК ВШМЯ показал, что ВШМЯ имеет ряд особенностей в устройстве генома, отличающих его от всех известных фитовирусов. Подтверждено, что необычным свойством ВШМЯ является вариабельность структуры его генома, при этом, разные штаммы ВШМЯ различаются в числе компонентов вирионной РНК. Проведенное олигонуклеотидное картирование показало, что, несмотря на различие в числе компонентов генома исследуемых штаммов ВШМЯ, они имеют высокую степень гомологии, т.е. являются близкородственными. При этом, очень близкие штаммы вируса, неотличимые серологически, имеют различия в структуре генома.

С использованием систем клонирования в клетках бацилл, определен эффект ингибирующей концентрации макролидного антибиотика тилозина на рост бактериальных клеток штамма Bacillus subtilis, индуцирующего экспрессию РНК-мишени (модифицированный ген егшС) и мутантного рибозима, расщепляющего эту мишень.

В результате разработана селекционная бактериальная система на основе В. subtilis функциональной селекции рибозимов, в которой выживание бактерий зависит от эффективности функционирования мутантного рибозима. Такая система может быть полезна при рассмотрении проблем конструирования, функционирования и селекции синтетических эндорибонуклеаз (рибозимов) способных в конечном итоге привести к созданию мощных агентов против вирусных инфекций.

С точки зрения разработки векторов, каждая система доставки генов к клеточным мишеням in vitro и in vivo имеет свои преимущества и недостатки. При выборе системы, обеспечивающей высокий уровень биологической активности продукта, важны такие критерии, как легкость применения, использование сильных и регулируемых во времени промоторов, скорость получения значительных количеств активных эукариотических белков и т.д. Первостепенное значение имеет выбор вектора для получения белка в зависимости от специфики решаемой проблемы.

При клонировании и экспрессии генов в клетках бактерий невозможен сложный посттрансляционный процессинг полипептидов, происходящий в клетках эукариот. В этой связи, дрожжевые системы экспрессии стали играть важную роль в получении гетерологичных белков для научных, промышленных и медицинских целей. В представленной работе предложены векторные конструкции, несущие регуляторные области дрожжевого гена РН05, для экспрессии и секреции гетерологичных белков в клетках Saccharomyces cerevisiae. С этой целью, впервые сконструирована серия векторных плазмид, содержащих делеционные варианты промотора кислой фосфатазы РН05 S. cerevisiae и создан набор дрожжевых векторов, содержащих регулируемый промотор гена кислой фосфатазы и нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальные пептиды секретируемых белков. Созданная дрожжевая система экспрессии использована для получения штаммов дрожжей, синтезирующих поверхностный антиген вируса гепатита В человека, для изучения влияния гомологичных и гетерологичных лидерных пептидов на эффективность экспорта гормона роста человека из S. cerevisiae.

Интерес к фитогормонсвязывающим белкам растений обусловлен в первую очередь их возможной рецепторной функцией, их ролью в молекулярных механизмах рецепции и передачи гормонального сигнала. К настоящему времени накоплены данные по сопоставлению гормональных систем регуляции и гормонсвязывающих белков растений и животных. Для сравнения систем передачи внеклеточных сигналов на сигнальные преобразования в растительных и животных клетках в данной работе использован мембранный серотониновый рецептор 5НТ1с мозга мыши, связывающий гормон из

141 внеклеточного пространства. Исследована серотониновая система в реакции клеток растений и ооцитов Хепорт laevis на стрессорный сигнал, активированный взаимодействием серотонинового рецептора с серотонином, и связанного с ним ионного потока Са2а. Для этого, впервые разработаны, и предложены условия синтеза серотонинового рецептора 5НТ1с мозга мыши в клетках листьев табака, в ооцитах Хепорт 1аем18 и в клетках насекомых для изучения его функциональной активности. Показано, что рецептор серотонина в виде гибрида с ОБР в клеточном ответе на серотонин в ооцитах Хепорш laevis, связывается с гормоном и, при участии ОТР-связывающего белка, активирует фосфолипазу С, инициируя поток кальция в клетке. Ионный поток Са2а в клетке активирует С1" - каналы и поток СГ из клетки, который легко регистрируется. Изучение участия рецептора серотонина в регуляции передачи сигнала в различных клетках может быть полезным при исследовании клеточной системы преобразования внешнего стимулирования во внутриклеточные сигналы.

В заключительной части диссертации представлены результаты исследований, посвященных разработке и оптимизации бакуловирусной системы экспрессии генов в клетках насекомых и млекопитающих. Экспрессирующие векторы на основе бакуловирусов позволяют синтезировать полноценные эукариотические белки в культивируемых клетках насекомых с таким выходом, уровень которого не достигнут ни в одной другой' эукариотической системе гетерологичной экспрессии генов. На сегодняшний день, экспрессионная система на основе бакуловирусов привлекает внимание исследователей, благодаря ее очевидным преимуществам. Большие размеры внедренного трансгена - до 100 т.п.о., высокий уровень экспрессии рекомбинантных белков, возможность одновременной экспрессия нескольких генов и экспрессии несплайсированных генов, возможность прямого адресного клонирования, временная и стабильная трансдукция клеток млекопитающих, трансдукция первичных клеток разного типа, широкий спектр клеточной специфичности. Бакуловирус инфицирует неделящиеся клетки, нецитотоксичен, не эндемичен для человека. Таким образом, векторы на основе бакуловирусов широко используются для получения гетерологичных белков в культурах клеток насекомых и млекопитающих.

Для экспрессии сложных белков, белков из нескольких субъединиц и многобелковых комплексов в клетках насекомых используют один из способов получения мультимерных белков, который заключается в совместной котрансфекции культуры клеток насекомых двумя и более типами рекомбинантных ДНК, содержащих гены субъединиц. В таких экспериментах не всегда удается получить зрелый активный продукт. В этой связи, созданы и создаются в настоящее время специальные экспрессирующие кассеты,

142 содержащие три, четыре и более промоторов поздних вирусных генов, позволяющие получать мультимерные белки. В представленной работе предложены новые дву- и трехпромоторные векторы экспрессии на основе бакуловирусов для одновременной экспрессии нескольких генов в одной инфицированной клетке насекомого, полученных с использованием субклонированных нами фрагментов геномной ДНК вируса ядерного полиэдроза (ВЯП), содержащих гены поздних вирусных белков PIO, Р35 и Р39 с их промоторными последовательностями. Новые векторы экспрессии могут быть использованы для синтеза мультимерных белков, функционально близких природному аналогу.

Рекомбинантные бакуловирусы, содержащие промоторы, активные в клетках млекопитающих, широко используются в настоящее время для доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих in vitro и in vivo. На сегодняшний день показано, что бакуловирус эффективно трансдуцирует различные типы клеток, при этом, список клеточных линий млекопитающих, чувствительных к бакуловирусной трансдукции, постоянно расширяется и, в зависимости от типа клеток, эффективность трансдукции колеблется от 10 до 90%. Нами сконструированы новые модифицированные бакуловирусные векторы в форме трансфер-векторов pFastBacMaml-3GFP и pFastBacMamLuc, с экспрессирующими кассетами под контролем промотора цитомегаловируса (CMV) для направленной доставки и экспрессии эукариотических генов в культивируемых клетках млекопитающих. Векторы использованы для эффективной трансдукция клеток Hek293, COS-7 и Huh7 рекомбинантными бакуловирусами и экспрессии структурных генов вируса гепатита С. Разработаны условия эффективной трансдукция клеток млекопитающих Нек293 и Huh-7 рекомбинантными бакуловирусами, несущими последовательности структурных генов ВГС, что приводило к экспрессии клонированных генов полипротеина ВГС и их правильному процессингу с образованием продуктов генов структурных белков вируса.

С использованием бакуловирусной системы экспрессии гетерологичных генов нами были получены клетки насекомых и млекопитающих, продуцирующие разные типы сложных белков. Это - мембранные белки рецептор CD4 человека и серотониновый рецептор 5НТ1с мыши, микросомный гем-содержащий белок стероид-21-гидроксилаза и его мутантный вариант, гликопротеидный двухсубъединичный гормон хориогонадотропин человека, структурные белки С, El и Е2 вируса гепатита С.

Экспрессия трех структурных белков ВГС в клетках насекомых сопровождается образованием вирусоподобных частиц и может служить основой модельной системы морфогенеза ВГС. Эта система использована нами для изучения влияния

143 гликозилирования структурных белков ВГС на их димеризацию и сборку и для исследования действия новых синтетических ингибиторов а - глюкозидаз на процесс сборки вирусных частиц.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Белжеларская, Светлана Николаевна, 2011 год

1. Ayres M.D., Howard S.C. Kuzio J, Lopez-Ferber M., Possee R.D.I994. The complete DNA sequence of Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus. Virology. 202, 586-605.

2. Rohrmann G.F. Martignoni M.E., Beaudreau G.S. 1982. J. Gen. Virol. 62, 137-142.

3. Miller L.K. 1986. Biotechnology advances in invertebrate pathology and cell culture. Orlando FI: Acad. Press.

4. Miller L.K., Lingg А.Т., Bulla L.A. 1983. Bacterial, Viral and Fungal Insecticides. Science. 219, 715-721.

5. Van der Beek C. P., Saaijer Riep J. D., Vlak J.M. 1980. On the origin of the polyhedral protein of Autographa califomica nuclear polyhedrosis virus. Isolation, characterization, and translation of viral messenger RNA. J. Virol. 100,326 -333.

6. Volkman L.E., Zaal K.J.M. 1990. Autographa califomica M nuclear polyhedrosis virus: Microtubules and replication. Virology. 175, 292 302.

7. Rohrmann G.F. 2008. Baculovirus Molecular Biology. NCBI. Bethesda. US. Book.

8. Kool M., Ahrens C.S., Vlak J.M., Rohrmann G.M. 1995. Replication of baculovirus DNA. J. Gen. Virol. 76, 2103 2118.

9. Mikhailov and Rohrmann G.F. 2002. The baculovirus replication factor LEF-1 is a DNA primase. Journal of Virology. 76, 2287-2297

10. Miller L.K. 1988. Baculovirus as gene expression vectors. Annv Rev. Microbiol. 42, 177-199.

11. Miller D.W., Safer P. and Miller L.K. 1986. An insect baculovirus host vector for highlevel expression of foreign genes. In Genetic Engineering. 8 (J.K.Setlow and A.Hollaender, eds.). Plenum. New York. 277-298.

12. Summers M.D., Smith G.E. 1987. A manual of method for baculovirus vectors and insect cell culture procedures. Bulletin No. J555. Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, Publishers College Station, Texas. 10-39

13. Matsuura Y., Possee R., Bishop D. 1987. Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233 1250.

14. Luckow V.A., Summers M.D. 1988. Trends in the development of baculovirus expression vectors. Biotechnology. 6, 47 55.

15. Smith G.E., Summers M.D., Fraser M.J. 1983. Production of human beta-interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell Biol. 3, 2156 -2165.

16. Pennock GD, Shoemaker C, Miller LK. 1984. Strong and regulated expression of Escherichia coli beta-galactosidase in insect cells with a baculovirus vector. Mol Cell Biol. 4, 399 -406.

17. Smith G.E., Summers M.D.: US4745051 (1988).

18. Smith G.E., Summers M.D.: US4879236 (1989).

19. Kitts PA, Ayres MD, Possee RD. 1990. Linearization of baculovirus DNA enhances the recovery of recombinant virus expression vectors. Nucleic Acids Res. 18, 5667 5672.

20. Kitts PA, Possee RD. 1993. A method for producing recombinant baculovirus expresson. vectors at high frequency. Biotechniques. 14, 810 817.

21. Possee RD., King L.A. : WOOl 12829 (2001).

22. Possee RD., Hitchman RH, Richards KS, et al. 2008. Generation of baculovirus vectors for the high throughput production of proteins in insect cells. Biotechnol. Bioeng. 101(6), 1115-1122.

23. Berger 1, Richmond T.J. W020055085456 (2005)

24. Fitzgerald D.J., Berger P., Schaffitzel C., Yamada K., Richmond T.J., Berger I. 2006. Protein complex expression by using multigene baculovirus vectors. Nat. Methods. 3, 1021 1032.

25. Lee, S.C., Leusch, M.S., Luckow, V.A., Olins, P.O. : US5348886 (1994).

26. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Version D. ed: Invitrogen Life Technologies, 2004.

27. Wells D.E., Compans R.W. 1990. Expression and characterization of a functional human immunodeficiency virus envelope glycoprotein in insect cells. Virology. 176, 575 — 584.

28. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П., Толкачева Т.В., Рубцов П.М.и Скрябин К.Г. 1996. Экспрессия гена CD4 -рецептора ВИЧ -1 в клетках насекомых с использованием бакуловирусной недели. Молекуляр. биология. 30, 524 — 528.

29. Белжеларская С.Н., Сутугина Л.П. Филенко О.М., Бучацкий Л.П. и Рубцов П.М. 1996. Экспрессия кДНК хорионического гонадотропного гормона человека в культуре клеток насекомых. Молекуляр. биология. 30, 518 523.

30. Lowe P.N., Page M.J et al. 1991. Characterization of recombinant human Kirsten-ras (4B) p21 produced at high levels in Escherichia coli and insect baculovirus expression systems. J. Biol. Chem. 226, 1672- 1678.

31. Ramer S.E., Winkler D.G., Carrera A., Roberts T.M. and Walsh Ch.T., 1991. Purification and initial characterization of the lymphoid-cell protein-tyrosine kinase p56 lek from a baculovirus expression system. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 6254 — 6258.

32. Kloc, M., Reddy, В., Crawford, S., and Etkin, L. D. 1991.The use of baculoviruses as expression vectors. J. Biol. Chem. 226, 8206 8212.

33. Tsao Т., Hseih J.C., M E Durkin, С Y Wu, S Chakravarti, L J Dong. M Lewis, and A E Chung. 1990. Characterization of the basement membrane glycoprotein entactin synthesized in a baculovirus expression system. J. Biol. Chem. 265, 5188-5191.

34. Белжеларская C.H., Саттон Ф. 2004. Экспрессия кДНК гена серотонинового рецептора мыши (5НТ1С) в культуре клеток насекомых . Молекуляр. биология. 38, 477-482.

35. Грищук Ю.В., Рубцов П.М., Белжеларская С.Н 2007. Экспрессия и функциональный анализ стероид 21 -гидроксилазы человека и ее мутантного варианта в клетках насекомых. Молекуляр. биология. 41, 77 78.

36. Hasemann G.A., Capra J.D. 1990. . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 3842 3846.

37. Ermst W., GrabheiT R., Wegner D., Borth N., Grassauer A., Katinger H. 1998. Baculovirus surface display: construction and screening of a eukaryotic epitope library. Nucleic Acids Res. 26, 1717 1723.

38. Weyer U., Possee R.D. 1991. A baculovirus dual expression vector derived from the Autographa californica nuclear polyhedrosis virus polyhedrin and plO promoters: coexpression of two influenza virus genes in insect cells J. Gen. Virol. 72, 2967 2974.

39. Pajot Augy E., Bozon V., Remy JJ., Couture L. and Salesse R. 1999. Critical relationship between glycosylation of recombinant lutropin receptor ectodomain and its secretion from baculovirus-infected insect cells. Eur. J. Biochem. 260, 635 -648.

40. Jarvis D.L. 1993. Book. Annals New York Academy of Sciences. 240 246.

41. Harrison R.L., Jarvis D.L. 2006. Protein N-glycosylation in the baculovirus-insect cell expression system and efforts to engineer insect cells to produce "mammalianized" recombinant glycoproteins. Adv. Virus. Res. 68, 159- 191.

42. Harrison R.L., Jarvis D.L. 2007. Transforming lepidopteran insect cells for improved protein processing. Methods Mol Biol. 388, 341 -356.

43. Shi X., Jarvis D.L. 2007. Protein N-glucosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr. Drug. Targets. 8, 1116 1125.

44. Jarvis D.L., 2009. United States Patent Application 20090288178

45. Jarvis D.L., BeekN.V., Fraser M. Patent:-US20070067855, 2007.

46. Hollister J.R., Jarvis D.L. 2001. Engineering lepidopteran insect cells for sialoglycoprotein production by genetic transformation with mammalian pi,4 -galactosyltransferase and alpha 2,6 sialyltransferase genes. Glycobiology. 11, 1—9.

47. Hollister J.R., Grabenhorst E., Nimtz M., Conradt H., Jarvis D.L. 2002. Engineering the piotein N-glycosylation pathway in insect cells for production of biantennary, complex N-glycans. Biochemistry. 41, 15093 15104.

48. Van Patten S.M., Hughes H., Huff M.R.et al. 2007. Effect of mannose chain length on targeting of glucocerebrosidase for enzyme replacement therapy of Gaucher disease. Glycobiology 17, 467-478.

49. Aumiller J.J, Hollister J.R., Jarvis D.L. 2003. A transgenic lepidopteran insect cell line engineered to produce CMP-sialic acid and sialoglycoproteins. Glycobilogy. 13. 497 -507.

50. Seo N.S., Hollister J.R., Jarvis D.L. 2001. Mammalian glycosyltransferase expression allows sialoglycoprotein production by baculovirus-infected insect cells. Prot Exp. Purif. 22, 234-241.

51. Pajot Augy E., Bozon V., Remy J-J., Couture L., Salesse R. 1999. Critical relationship between glycosylation of recombinant lutropin receptor ectodomain and its secretion from baculovirus — infected insect cells. Eur. J Biochem. 260, 635 - 648.

52. Fath-Goodin A., Kroemer J., Martin S., Reeves K., Webb B.A. 2006. Polydnavirus genes that enhance the baculovirus expression vector system. Advances in virus research. 68, 75 90.

53. Kulakovsky P.C., Shuler M. L., Wood H.A. 1998. N glycosylation of a baculovirus-expressed recombinant glycoprotein in three insect cell lines. In Vitro Cell Dev Biol. — Anim. 34, 101 - 108.

54. Shi, Xianzong Jarvis, Donald L. 2007. Protein N-glycosylation in the baculovirus-insect cell system. Curr. Drug. Targets. 8, 1116 1125.

55. TokoyamaN. et al. 2000. Co-expression of human chaperonas Hsp70 and Hsdj or Hsp40 cofactor increase solubility of overexpressed target proteins in insect cells. Biochim Biophys. Acta. 1493, 119 124.

56. Bruns J.B., Carattino M.D., S. Sheng, Maarou A.B. 2007. Epitelial Na+ channels are fully activated by furin- and piostatin dependent release of an inhibitory peptide from the y - subunit. J. of Biol. Chem. 282, 6153-6160.

57. Hughey R. P., Bruns J. B., Kinlough C. L., Harkleroad K. L., long Q., Carattino M. D., Johnson J. P., Stockand J. D., Kleyman T. R. 2004. Epithelial Sodium Channels Are Activated by Furin-dependent Proteolysis. J. of Biol. Chem. 279(18). 18111 18114.

58. Posthaus H, Dubois C.M., Laprise M.H., Grondin F., Suter M.M., Muller E. 1998. Proprotein cleavage of E-cadherin by furin in baculovirus over-expression system: potential role of other convertase in mammalian cells. FEBS Lett. 438. 306 310.

59. Lee D-F, Chen C-C. Hsu T-A and Juang J-L. 2000. A baculovirus superinfection system: Efficient vehicle for gene transfer into Drosophila S2 cells. J. Virol. 74, 11873 11880.

60. Ailor E., Betenbbaugh M.J. 1998. O ver expression of a cytosolic chapetone to improve solubility and secietion of a lecombinant IgG protein in insect cells. Biotechnol. Bioeng. 58, 196-203.

61. Laurent S., Vautheiot J-F., Madelaine M-F., Le Call C. and Rasschaert D., 1994, Recombinant Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Capsid Protein Expresse4d in Baculovirus Self-Assembles into Virus Particles and Induces Protection. J.Virol. 68, 6794-6798.

62. Malim M.H., Tiley L.S., McCarn D.F. Rusche J.R., Hauber J. and Bryan. 1990. HIV-1 structural gene expression requires binding of the rev /raws-activator to its RNA target sequence. Cell. 60, 675-683.

63. Angelo C., Smith G.E., Summers M.D., Krug R.M. 1987. Coexpression of three or more recombinant polymerases influences in insect cells. Virology. 67, 361-365.

64. Conner M., Zarley C., Hu B., Parsons S., Drabinski D., Greiner S., Smith R, Jiang B. 1996. Virus-like particles as a rotavirus subunit vaccine. J. Infect Dis. 174, 88-92.

65. Hu Y.C., Bentley W.E., Edwards G.H., Vakharia V.N. 1999. Chimeric infectious bursal disease virus-lije particles expressed in insect cells and purified by immobilized metal affinity chromatography. Biotechnol. Bioeng. 63, 721-729.

66. Hu Y.C., Hsu T.A., Huang J.H., Ho M.S., Ho Y.S. 2003. Formation of enterovirus-like particle aggregates by recombinant baculoviruses co-expressing PI and 3CD in insect cells. Biotechnol. Lett. 25, 919-925.

67. Mortola E., Roy P. 2004. Efficient assembly and release of SARS coronavirus-like particles by a heterologous expression system. FEBS Lett. 576, 174-178.

68. Adler S., Reay P., Roy P. 1998. Induction of T cell response by bluetongue virus corelike particles expressing a T cell epitope of the Ml protein of influenza A virus. Med. Microbiol. Immunol. 187, 91-96.

69. Luo L., Kang C.Y. 1990. Expression of gag precursor protein and secretion of virus-like gag particles of HIV-2 from recombinant baculovirus-infected insect cells. Virology. 179, 874-880.

70. Xi S.Z., Bants L.M. 1992. Site-directed mutagenesis of virtually any plasmid by eliminating a unique site. J. Gen. Virol. 72, 2991-2998.

71. Newcomb W.W., Homa F.L., Thomson D.R. Trus B.L., Cheng N., Steven A. Spencer

72. J.V. and Brown J.C. 1999. Assembly of the herpes simplex virus procapsid from purified154components and identification of small complexes containing the major capsid and scaffolding proteins J. Virol. 73, 4239 4250.

73. Touze A., Bousarghin L., Ster C„ Combita A.-L., Roingeard P., Coursaget P. 2001. Gene transfer using human polyomavirus BK virus-like particles expressed in insect cells. J. of Gen. Virology. 82, 3005-3009.

74. Notka F., Stahl-Hennig C., Dittmer U., Wolf H., Wagner F. 1999. Contraction and characterization of recombinant VLPs and Semliki-Forest virus live vectors for comparative evaluation in the SHIV monkey model. Biol Chem. 380, 341-352.

75. Casal J.I. 1999. Use of parvo virus-like particles for vaccination and induction of multiple immune responses. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, 141-150.

76. Crawford S.E., Estes M.K., Ciailet M., Barone C., O'Neal C.M., Cohen J., Conner M.E. 1999. Heterotypic protection and induction of a broad heterotypic neutralization response by rotavirus-like particles. J. Virol. 73. 4813-4822.

77. Xiang J., Wunschmann S., George S.L., Klinzman D., Schmidt W.N., LaBrecque D.R., Stapleton J.T. 2002. Recombinant hepatitis С virus-like particles, expressed by baculovirus: utility in cell-binding and antibody detection assays. J Med Virol. 68, 53743.

78. Zhao W., Liao G.Y., Jiang Y.T., Jiang S.D. 2003. No requirement of HCV 5'NCR for HCV like particles ssembly in insect cells. J. Gastroenterol. 10, 2226-2231.

79. Bartosch В., Dubuisson J. & Cosset F.L. 2003. infectious hepatitis С virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. J. Exp Med. 197, 633642.

80. Kang C.Y., Luo L., Wainberg M.A., Li Y. 1999. Development of HIV/AIDS vaccine using chimeric gag-env virus-like particles. Biol. Chem. 380, 341-352.

81. Gronowski A.M. D. M. Hilbert, K. C. F. Sheehan, G. Garotta. 1999. Baculovirus stimulates antiviral effects in mammalian cells. J. Virol. 73, 9944-9951.

82. Schiller JT, Lowy DR. 2010. Vaccines to Prevent Infections by Oncoviruses. Annu Rev Microbiol. 64, 23-41.

83. Hofmann C., Sandig V., Jennings G„ Rudolph M., Schlag P., Strauss M. 1995. Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vcctors. Proc Natl Acad Sci USA. 92, 10099-10103.

84. Boyce F.M. Bucher N.L.R. 1996. Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells. . Proc Natl Acad Sci USA. 93, 2348-2352.

85. Huser A., Hofmann C. 2003. Baculovirus vector: novel mammalian cell gene-delivery vehicles and their application. American Journal of PharmacoGenomics. 3, 53-63.

86. Matsuura Y. Shoji I., Yap C.-C., Tani H., Ishii K. and Miyamura T. 1997. Gene transfer into mammalian cells by baculovirus vector and its applications. Virus. 47, 247-256.

87. Condreay J.P., Witherspoon S.M., Clay W.C., Kost T.A. 1999. Transient and stable gene expression in mammalian cells, transducted with a recombinant baculovirus vector. . Proc Natl Acad Sci USA. 96, 127-132

88. Shoji I., Aizaki H., Tani H., Ishii K., Chiba T., Saito I., Miyamura T., Matsuura Y. 1997. Efficient gene transfer into various mammalian cells, including non-hepatic cells, by baculovirus vectors. ,/. of Gen. Virology. 78, 2657-2664.

89. Kost T., Condreay J.P. 1999. Recombinant baculoviruses as expression vectors for insect and mammalian cells. Current Opinion in Biotechnology. 10, 428-433.

90. Hu Y.-C. 2005. Baculovirus as a high efficient expression vector in insect and mammalian cells. Acta Pharmacologica Sinica. 26, 405-416.

91. Beljelarskaya S.N. 2002. A baculovirus expression system for insect cells. Mol. Biol. 36, 281-92.

92. Fipaldini C., Bellei B., La Monica N., 1999. Expression of hepatitis C virus cDNA in human hepatoma cell line mediated by a hybrid baculovirus-HCV vector. Virology. 255, 302-11.

93. Sandig V. Hofmann C., Steinert S., Jennings G., Schlag P., Strauss M. 1996. Gene transfer into hepatocytes and human liver tissue by baculovirus vectors. Hum Gene Ther. 7, 1937-45.

94. Tani H., Limn C.K., Yap C.C., Onishi M., Nozaki M., Nishimune Y., Okahashi N., Kitagawa Y., Watanabe R., Mochizuki R., Moriishi K., Matsuura Y. 2003. In vitro and in vivo gene delivery by recombinant baculoviruses. J. Virol. 77, 9799-808.

95. Song U.S., Shin S.-H., Kim S.-Ki., Choi G.-S., Kim W.-C., Lee M.-H., Kim S.-J., Kim I.-H., Choi M.-S., Hong Y.-J. Lee K.-H. 2003. Effective transduction of osteogenic sarcoma cells by a baculovirus vector. J. Gen. Virol. 84, 697-703.

96. Palombo F. Monciotti A. Recchia A. Cortese R.„ Ciliberto G., and La Monica N. 1998. Site-specific integration in mammalian cells mediated by a new hybrid baculoviras-adeno-associated virus vector. J. Virol. 72, 5025-5034.

97. Chuang CK, Sung LY, Hwang SM, Lo WH, Chen HC, Hu YC. 2007. Baculovirus as a new gene delivery vector for stem cell engineering and bone tissue engineering. Gene Ther. 14, 1417-24.

98. Chen H.-C., Chang Y.-H., Chuang C.-K., Lin C.-Y., Sung L.- Y., Wang Y.- H„ Hu Y.-C 2009. The repair of osteochondral defects using baculovirus mediated gene transfer with de-differentiated chondrocytes in bioreactor culture. Biomaterials. 30, 674-681.

99. Королева H.H., Спирин П.В., Тимохова A.B., Рубцов П.М., Кочетков С.Н., Прасолов B.C., Белжеларская С.Н. 2010. Бакуловирусные векторы для эффективной доставки и экспрессии генов в клетках млекопитающих. Мол. Биол. 44, 541-550.

100. Yap С.-С., Ish.ii К., Aoki Y., Aizaki Н., Tani Н., Shimizu Н., Ueno Y., Miyamura Т., Matsuura Y. 1997. A hybrid baculovirus -T7 RNA polymerase system for recovery of an infectious virus from cDNA. Virol. 231, 192-200.

101. Barsoum J., Brown R., McKee M., Boyce F.M. 1997. Efficient transduction of mammalian cells by a recombinant baculovirus having the vesicular stomatitis G glycoprotein. Hum. Gene Ther. 8, 2011-18.

102. Tami C., Farber M., Palma E.L. and Taboga O. 2000. Presentation of antigenic sites from foot and- mouth disease virus on the surface of baculovirus and in the membrane of infected cells. Arch. Virol. 145, 1815-28.

103. Ojala K., Mottershead D.G., Suokko A. and Oker -Blom C. 2001. Specific binding of baculoviruses displaying gp64 fusion proteins to mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. 284, 777-784.

104. Sarkis J. 2000. A comparative analysis of DEA as a discrete alternative multiple criteria decision tool. Eur. J. Oper. Res. 123, 543-557.

105. Duisit G, Saleun S., Douthe S., Barsoum J., Chadeuf G., Moullier P. 1999. Baculovirus vector requires electroplastic interactions including heparin sulfate foe efficient gene transfer in mammalian cells. J Gene Med. 1, 93-102.

106. Tani H., Nishijima M, Ushijima H., Miamura T. and Matsuura Y. 2001. Characterization of cell-surface determinants important for baculovirus infection. Virol. 279, 343-53.

107. Cheshenko N., Krougliak N. , Eisensmith R.C. and Krougliak Y.A. 2001. A novel system for the production of fully deleated adenovirus vectors that does not require helper adenovirus. Gene Ther. 8, 846-854.

108. Merrinew R. V. . Clay W.C., Condreay J.P., Witherspoon S.M., W.S. Dallas and Kost T.A. 2001. Chromosomal Integration of Transducted Recombinant Baculovirus DNA in mammalian cells. J. Virol. 75, 903-909.

109. Sandig V., Hofmann C., Steinert S., ennings G., Schlag P., Strauss M. 1996. Gene transfer into hepatcytes and human liver tissue by baculovirus vectors. Hum. Gene Ther. 7, 1937-45.

110. Hofmann C., Strauss M. 1998. Baculovirus-mediated gene transfer in the presence of human serum or bood facilitated by inhibition of the complement system. Gene Ther. 5, 531-36.

111. Hofmann C., Huser A, Lehnert W, Strauss M. 1999. Protection of baculovirus-vectors against complement-mediated inactivation by recombinant soluble complement ieceptor type 1. Biol. Chem. 380, 393-95.

112. Kaikkonen M.U, Maatta A.I., Yla-Herttuala S. and Airemie K. 2010. Screening of Complement Inhibitors: Shielded Baculoviruses increase the safety and efficacy of gene deliverycomplement shielded baculoviruses. Mol Ther. 18, 987-9.

113. Kircheis R., Wightman L., Schreiber A., Robitza B., Rossler V., Kursa M. and Wagner E.,. 2001. Polyethylenimine\DNA complexes shielded by transferring target gene expression to tumors after systemic application. Gene Ther. 8, 28-40.

114. Huser A. Rudolph M. and Hofmann Ch. 2001. Incorporation of decayaccelerating factor into the baculovirus envelope generates complement-resistant gene transfer vectors. Nat. Biotechnol 19, 451-455.

115. Brodbeck W.G., Liu D., Sperry J., Mold C. Medof M.E. 1996. Localization of classical and alternative pathway regulatory activity within decay-accelerating factor. J. Immunol. 156, 2528-33.

116. Ory D.S., Neugeboren B. A. and Mulligan R. C. 1996. A stable human-derived packaging cell line for production og high titer retroviius\vesicular stomatitis virus G pseudotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 11400-06.

117. Airenne K.J., Hiltunen M. O., Turunen M.P., Turunen A-M., Laitinen O.H., Kulomaa M.S., Yla- Herttuala S 2000. Baculovirus-mediated periadventitial gene transfer to rabbit carotid artery. Gene Ther. 7, 1499-1504.

118. Liu Catherine Y.Y., Wang Ch.H., Wang J.Ch. and Chao Yu.Ch. 2007. Stimulation of baculovirus transcriptome expression in mammalian cells by baculoviral transcriptional activators. Journal of General Virology. 88, 2176-2184.

119. Jarvis D.L., Weinkauf C., Guarino L.A. 1996. Immediate-early baculovirus vectors for foreign gene expression in transformed or infected insect cells. Protein Expr. Purif. 8. 191-203.

120. Maniatis T., Fritsch E.F., Sainbrook J. Molecular cloning. A Laboratory Manual. ColdSpring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1982.

121. Smith G.E., Summers M.D., Fraser M.J. 1983. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165.

122. Mutsura Y., Possee R., Bishop D. 1987. Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233-1250.

123. Summers M. D., Smith G.E. 1987. A manual for baculovirus vectors and insect ccll culture procedures. Bulletin no. 1555. Texas Agricultural Experiment Station and Texas A & M University, College Station, Texas. 10-39.

124. Mutsura Y., Possee R, Bishop D. 1987. Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233-1250.

125. Molecular Biological Methods for Bacillus. 1990. Edited by Colin R. Harwood and Simon M. Cutting. 0 471 92393 1. John Wiley & Sons Ltd., Chichester. England

126. Ito H., Fukada Y., Murata K., Kimura A. 1983. J. Bacteriol. 153, 163-168.

127. Maurel C., Rezer J., Schoeder J.I., Chrispeels M.J. 1993. The vacuolar membrane protein y-type creates water specific channels in Xenopus oocytes. EMBO J. 12, 22412247.

128. Corey D.P. 1983. Patch Clamp: Current Excitement in Membrane Physiology. Neuroscience Commentaries. 1, 99-110.

129. Casper St. J., Holt A. 1996. Expression of the green fluorescent protein-encoding gene from tobacco mosaic virus-based vector. Gene. 173, 69-73.

130. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System, Instruction Manual. St. Louis, MO: Life Technologies Inc., Monsanto Corp. Res., 2003.

131. Bac-to-Bac Baculovirus Expression System. Version D. ed: Invitrogen Life Technologies, 2004.

132. Laemmli U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 227. 680-685.

133. Sambrook J., Fritsch E. and Maniatis T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor. NY: Cold Spring Harbor Laboratory).

134. Hanahan D. 1985. DNA Cloning . Clover D.M., Ed. Oxford; Washington: IRL Press, 1. 109-135.

135. Gruenwald S., Heitz J. Baculovirus Expression Vector System: Procedures & Methods Manual. PharMingen. 5-62.

136. Methods in Enzymology. 1990.Guide to Protein Purification. Ed. Deuscher M.P. San Diego. Califrnia: Acad. Press. 182.

137. Sanger F., Coulson A.R., 1975. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol., 94, 441.

138. Kafatos F.C., Jones C.W., Efstratiadis A. 1979. Nucleic Acids Res. 7. 1541-1552.

139. Short protocols in molecular biology. 1992. Edited by Ausubel F.M. et al. 3rd ed. Published by John Willey& Sons, Inc. USA.

140. Cruz P.E., Maranga L., Carrondo M.J. 2002. Integrated process optimization: lessons from retrovirus and virus-like particle production. J. Biotechnol. 99, 199-214.

141. Baumert T.F., Ito S., Wong D.T., Liang T.J. 1998. Hepatitis C virus structural proteins assemble into virus-like particles in insect cells. J. Virol,. 72, 3827-3836.

142. King L.A., Possee R.D. 1992. The Baculovirus Expression System: a Laboratory Guide. London: Chapman, Hall. 229.

143. Друца И.Л., Кабердин В.Р., Королева О.Н., Шилов И.О. 1991. Эффективный метод направленного введения мутации в плазмиды и клонирование однотяжевых фрагментов ДНК. Биоорг. химия. 17, 1487-1493.

144. Dolja V.V., Sokolova N.A., Tjulkina L.G., Atabekov J.G. 1979. A study of the barley stripe mosaic virus (BSMV) genome. II. Translation of individual RNA species of two BSMV strains in a homologous cell-free system. Mol Gen. Genet., 175, 93-97.

145. Jackson A.O., Brakke M.K. 1973. Multicomponent properties of barley stripe mosaic virus ribonucleic acid. Virology, 55. 483-494.

146. Lane L.C. 1974. The components of barley stripe mosaic and related viruses. Virology 58, 323-333.

147. Афанасьев Б.Н., Рупасов E.B., Федченко В.И. Доля В.В., Атабеков И.Г., "Чернов Б.К., Козлов Ю.В., Баев А.А. 1986. Первичная структура РНК 3 вируса штриховатой мозаики ячменя и образование РНК 26 и РНК 4. Докл. АН СССР. 290, 724-727.

148. Gustafson G.D., Milner J.J., McFarland J.E., Pedersen K., Larkins B.A., Jackson A.O. 1982. Investigation of the complexity of barley stripe mosaic virus RNAs with recombinant DNA clones. Virology, 120, 183-193.

149. Taliansky M.E., Boykov S.V., Kavsan V.M., Atabekov J.G. 1979. A study of the barley stripe mosaic virus (BSMV) genome. I. Determination of sequence homology between BSMV RNA species. Mol. Gen. Genet. 775, 89-92.

150. Gustafson G.D., Larkins B.A., Jackson A.O. 1981. Comparative analysis of polypeptides synthesized in vivo and in vitro by two strains of barley stripe mosaic virus Virology. Ill, 579-587.

151. McFarland J.E., Brakke M.K., Jackson A.O. 1983. Complexity of the Argentina mild strain of barley stripe mosaic virus. Virology. 130, 397-402.

152. Hsu Y.N., Brakke M.K. 1985. Cell-free translation of soil-borne wheat mosaic virus RNAs. Virology. 143, 272-279.

153. Bisaro D.M., Siegel A. 1982. Subgenomic components of tobacco rattle virus in infected tissue. Virology. 118,411-418.

154. Ahlquist P., Dasgupta R., Kaesberg P. 1981. Near identity of 3' RNA secondary structure in bromoviruses and cucumber mosaic virus. Cell. 23, 183-189.

155. Ohno Т., Takamatsu N., Meshi Т., Okada Y., Nishigushi M., Kiho Y. 1983. Single amino acid substitution in 30K protein of TMV defective in vims transport function. Virology, 131, 255-258.

156. Davies J.W., Hull R. 1982. Genome Expression of plant positive-strand RNA viruses. -J. Gen. Virol. 61, 1-14.

157. Kramer F.R., Lizardi P.M., 1989. Nature. 339, 401-402

158. Albano M., Breitting R., Dubnau D., 1989, J. Bacteriol. 171, 5386-5404.

159. Морозов С.Ю., Захарьев B.M., Чернов Б.К. и др. 1983. ДАН. 271, 211-215.

160. Морозов С.Ю., Лукашева Л.И. Чернов Б.К. и др. 1987. Молек. генет., № 3, 32-38.

161. Kramer F.R., Mills D.R. 1981. Secondary structure formation during RNA synthesis. Nucleic Acids Res. 9, 5109-5124.

162. David Dubnau. 1985. Induction of ermC requires translation of the leader peptide. The EMBO Journal. 4, 533-537.

163. Narayan C.S., Dubnau D. 1985. Evidence of the translational attenuation model: ribosome-binding studies and structural analysis with an in vitro run-off transcript of ermC. Nucleic Acids Res. 13, 7307-7326.

164. Villafane R., Bechhofer D.H., Narayan C.S., Dubnau D. 1987. Replication control genes of plasmid pE194. J. of Bacteriology. 169, 4822-4829.

165. Chu B.C.F., Kramer F.R., Orgel L.E. 1986. Synthesis of an amplifiable reporter RNA for bioassays. Nucleic Acids Res. 14, 5591-5603.

166. Meyhack В. Bajwa W., Rudolph H. et al. 1983.- EMBO J. 1, 675-680.

167. Hagenauer-Tsapis R., Hinnen A. 1984. Mol. Cell. Biol. 4, 2668-2675.

168. Hinnen A. 1983. In: Gene Expression in Yeast Proc. Of Alko Symposium, Helsinki, 1983\Eds. M. Korhala, E. Varsanen. - Foundation for Biotech. Industr. Ferment. Research., 157-163.

169. Эльдаров M.A., Морзунов С.П. И.В. Карпычев, К.Г. Скрябин, О.В.Василенко и др., 1987. Синтез поверхностных антигенов вирусов в дрожжах. Биотехнология. 3, 319-324.

170. К.Г. Скрябин, А.Б. Циоменко, С.П. Морзунов, И.В.Карпычев, В.В.Лупашин, М.А. Эльдаров, П.М.Рубцов, И.С.Кулаев, А.А.Баев.1987. Синтез и секреция гормона роста человека у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Биотехнология, 3, 312-318.

171. Романов Г.А. 1989. Гормонсвязывающие белки растений и проблема рецепции фитогормонов, обзор. Физиология растений. 36.

172. MacRobbie Е.А.С. 1997. Signaling in guard cells and regulation of ion channel activity. J. Exp. Bot. 48, 515-528.

173. Dohlman H.G., Caron M.G., Lefkowitz R.J. 1987. A family of receptors coupled to guanine nucleotide regulatory proteins. Biochemistry. 26, 2657-2664.

174. Majerus P.W., Connoly T.M., Descmyn H., Ross T.S., et al. 1986. The metabolism of phosphoinositidile-derived messenger molecules. Science. 234, 1519-1526.

175. Lurin C., Geelen D., Barbier-Brygoo H., Guern J., Maurel C. 1996. Cloning and functional expression of a plant voltage-dependent chloride channel. Plant Cell. 8, 701711.

176. Leush M.S., Lee S.C., Olins P.O. 1994. A novel host vector system for direct selection of recombinant baculoviruses (bacmids) in E. coli. Gene. V.160. P. 191-194.

177. Mutsura Y., Possce R., Bishop D. 1987. Baculovirus expression vectors: the requirements for high level expression of proteins, including glycoproteins. J. Gen. Virol. 68, 1233-1250.

178. Shi Y.P., Hasnain S.E., Sacci J.B., et al. 1999. Immunogenicity and in vitro protective efficacy of a recombinant multistage Plasmodium falciparum candidate vaccine. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 1615-1620.

179. Takahashi R.IL, et al. 1999. Analysis of human lymphotropic T-cell virus type II-like particle production by recombinant baculovirus-infected insect cells. Virology. 256, 371378.

180. Lajic S, Nikoshkov A, Hoist M, Wedell A.1999. Effects of missence mutations and deletions on membrane anchoring and enzyme function of human steroid 21-hydroxylase. Biochem Biophys Res Commun. 257, 384-390.

181. Nelson DR, Strobel HW. 1988.On the membrane topology of vertebrate cytochrome P450 proteins. J Biol Chem. 263, 6038-6050.

182. Sakaguchi M, Tomiyoshi R, Kuroiwa T, Mihara K. Omura T.1992.Functions of signal anchor sequences are determined by the balance between the hydrophobic segment and the N-terminal charge. Proc Natl Acad Sci USA. 89, 16-19.

183. Asseffa A, Smith SJ, Nagata K, Gillette J, Gelboin HV, Gonzalez FJ. 1989. Novel exogenous heme-dependent expression of mammalian cytochrome P450 using baculovirus. Arch Biochem Biophys. 274, 481-490.

184. Lee C, Kadwell S, Kost T, Serabjut-Singh CJ. 1995. Recombinant baculovirus strategy for coexpression of functional human cytochrome P450 and' P450 reductase. Meth Enzymol. 272. 86-95.

185. Paine MJI, Gilham D, Roberts GCK, Wolf R. 1996. Functional high level expression of cytochrome P450 CYP2D6 using baculoviral expression systems. Arch Biochem Biophys. 328, 143-150.

186. Chen L, Buters JTM, Hardwick JP, Tamura Sh, Penman BW, Gonzalez FJ, Crespi ChL.1997. Coexpression of cytochrome P4502A6 and NADPH-cytochrome P450 oxidoreductase in the baculovirus system. Drug Methab Dispos. 25, 399-405.

187. Tusie-Luna M-T, Traktman P, White PC. 1990. Determination of functional effects of mutations in the steroid 21-hydroxylase gene (CYP21) using recombinant vaccinia virus. J Biol Chem. 265, 20916-20922.

188. Mokhonov V.V., Novikov D.Y., Samokhvalov E.I., Shatalov A.G., Selivanov N.A., Prilipov A.G. L'vov D.K. 2002. Genome analysis of Hepatitis С virus strain 274933RU isolated in Russian Federation. Vopr. Virusol. 47, 9-12.

189. Baumert T.F., Ito S., Wong D.T., Liang T.J. 1998. Hepatitis С virus structural proteins assemble into virus-like particles in insect cells. J. Virol. 72, 3827-3836.

190. Reed ICE., Rice C.M. 2000. Overview of hepatitis С virus genome structure, polyprotein.processing, and protein properties. Curr. Top. Microbiol Immunol. 242, 55— 84.

191. Иванов A.B., Кузякин A.O, Кочетков C.H. 2005. Молекулярная биология вируса гепатита С. Успехи биохимии. 45, 37-86.

192. Hoofnagle J.H. 2002. Course and outcome of hepatitis C. Hepatology. 35, 21—29.

193. Dubuisson J. and Rice C.M. 1996. Hepatitis С virus glycoprotein folding: disulfide bond formation and association with calnexin. J. Virology. 70, 778-786.

194. Choo Q.L., Kuo G., Weiner A. J., Overby L.R., Bradley D.W., Houghton M. 1989. Isolation of a cDNA clone derived from blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244, 359-362.

195. Yagi Shintaro, Mori Kenichi, Shiotf Kunio. 2006. Implications of the HCV subeenome discovery for viral pathogenesis, persistence and proliferation. Future Virology. 1, 425-433(9).

196. Eike Steinmann, Christiane Brohm, Stephanie Kallis, Ralf Bartenschlager and Thomas Pietschmann. 2008. Efficient r/ww-Encapsidation of Hepatitis C Virus RNAs into Infectious Virus-Like Particles. Journal of Virology. 82, 7034-7046.

197. Daniel M. Jones and John McLauchlan 2010 Hepatitis C Virus: Assembly and Release of Virus Particles./. Biol. Chem. 285, 22733-22739.

198. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.S., ZhuN., Lai M.M. 1996. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C virus core piotein. Virology. 218, 43-51.

199. Choi S.H., Kim S.Y., Park K.J., Kim Y.J., Hwang S.B. 2004. Hepatitis C virus Core protein is efficiently released into the culture medium in insect cells. J Biochem. Mol. Biol. 37, 735-740.

200. Liu Q., Tackney C., Bhat R.A., Prince A.M., Zhang P. 1997. Regulated processing of the hepatitis C virus core protein is linked to subcellular localization. J. Virol. 71, 657662.

201. Matsumoto M., Hwang S.B., Jeng K.S., Zhu N., Lai M.M. 1996. Homotypic interaction and multimerization of hepatitis C viius core protein. Virology. 218, 43-51.

202. Goffard A., Callens N., Bartosch B., Wychowski C., Cosset F.L., Montpellier C., Dubuisson J. 2005. Role of N-linked giycans in the functions of hepatitis C virus envelope glycoproteins. J. Virol. 19, 8400-8409.

203. A. Fournillier, C. Wychowski, D. Boucreux, T. F. Baumert, J.-C. Meunier, D. Jacobs,

204. S. Muguet, E. Depla, and G. Inchauspe. 2001. Induction of Hepatitis C Virus El165

205. Envelope Protein-Specific Immune Response Can Be Enhanced by Mutation of N~ Glycosylation Sites . Journal of Virology, 75(24). 12088-12097.

206. Tiffany Slater-Handshy, Deborah A. Droll, Xiaofeng Fan, Adrian M. Di Bisceglie, and Thomas J. Chambers. 2004. HCV E2 glycoprotein: mutagenesis of N-lnked glycosylation sites and its effects on E2 expression and processing. Virology, 319, 36-48.

207. Hanna, S. L., Pierson, T. C., Sanchez, M. D., Ahmed. A. A., Murtadha, M. M. Doms, R. W. 2005. N-Linked Glycosylation of West Nile Virus Envelope Proteins Influences Particle Assembly and Infectivity. J. Virol., 79, 13262-13274.

208. Brown, R. J. P., Juttla, V. S., Tarr, A. W., Finnis, R., Irving, W. L., Hemsley, S., Flower, D. R., Borrow, P., Ball, J. K. 2005. Evolutionary dynamics of hepatitis C virus envelope genes during chronic infection. J. Gen. Virol., 86, 1931-1942.

209. A Karpas, G W Fleet, R A Dwek, S Petursson, S K Namgoong, N G Ramsden, G S Jacob, and T W Rademacher. 1988, Aminosugar derivatives as potential anti-human immunodeficiency virus agents. PNAS. 85 (23), 9229-9233.

210. Durantel, D., Branza-Nichita, N., Carrouee-Durantel, S., Butters, T. D., Dwek, R. A. Zitzmann, N. 2001. Study of the Mechanism of Antiviral Action of Iminosugar Derivatives against Bovine Viral Diarrhea Virus. J. Virol., 75. 8987-8998.

211. Wu. S.-F., Lee, C.-J., Liao, C.-L., Dwek, R. A. Zitzmann, N. Lin. Y.-L. 2002. Antiviral Effects of an Iminosugar Derivative on Flavivirus Infections. ./. Virol.76, 3596-3604.

212. Краев А., Морозов С., Лукашева Л., Розанов М., Чернов В., Симонова М., Г олова Ю., Белжеларская С., Позмогова Г., Скрябин К. и Атабеков Г. (1988) Первичная структура и организация генома Х-вируса картофеля. Доклады АНСССР. 300, 711-716.