Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Гавриков, Алексей Валерьевич

• Гавриков, Алексей Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гавриков, Алексей Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Оптимизация экспрессии гетерологичных белков в Escherichia coli

1.2. Создание штаммов-продуцентов интерферона альфа-2Ь на основе Escherichia coli и их ферментационное культивирование.

1.3. Выделение и очистка интерферона альфа-2Ь.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Генноинженерные методики.

2.2.2. Ферментационное культивирование в 2-х л ферментере.

2.2.3. Ферментационное культивирование в 30-и л ферментере.

2.2.4. Получение телец включения.

2.2.5. Получение грубого экстракта интерферона.

2.2.6. Очистка интерферона на катионите SP-Toyopearl.

2.2.7. Очистка интерферона с использованием ОФ-ВЭЖХ.

2.2.8. Аналитические методы.

2.2.8.1. Измерение концентрации белка.

2.2.8.2. Постановка белкового SDS электрофореза.

2.2.8.3. ВЭЖХ.

2.2.8.4. Метод молекулярной гибридизации на остаточную ДНК штамма-хозяина и вектора.

2.2.8.5. Метод ИФА на остаточные белки штамма-продуцента.

2.2.8.6. Метод биологического тестирования активности интерферона.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследования влияния различных факторов на уровень экспрессии альфа-F интерферона под контролем регуляторных элементов Т7-экспрессионной системы.

3.1.1. Создание вариантов гена человеческого альфа-F интерферона с различными заменами редко встречающихся кодонов и их клонирование в векторную плазмиду рЕТ22(Ь+).

3.1.2. Влияние тандема терминаторов транскрипции в 3'-нетранслируемой области гена.

3.2. Создание и ферментационное культивирование штаммапродуцента альфа-2Ь интерферона.

3.2.1. Создание штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2Ь.

3.2.2. Подбор условий культивирования на лабораторном 2-х л ферментере Multigen.

3.2.3. Масштабирование ферментационного процесса на промышленном 30-и л ферментере Marubishi.

3.3. Создание технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2Ь.

3.3.1. Получение грубого экстракта нативного мономера интерферона.

3.3.2. Хроматография на катионите SP-Toyopearl 550-С.

3.3.3. Хроматография на полу препаративном ОФ-ВЭЖХ, ODS.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека для создания на их основе препаратов ветеринарного назначения»

Актуальность проблемы. С развитием молекулярной биологии и ряда ее методических приложений (генно-инженерных методик и методов жидкостной хроматографии) повышаются требования качества к продуктам, получаемым в данной области. Одним из основных примеров подобных тенденций является повышение чистоты фармакологических субстанций, полученных с использованием технологий «рекомбинантных ДНК». Более конкретно это относится к белку, лекарственные препараты которого существуют уже более 20-и лет, - человеческому рекомбинантному интерферону альфа-2Ь.

Наиболее выгодным экономически является использование штаммов-продуцентов, в которых экспрессия целевого белка увеличена до количеств, измеряемых в процентах от суммарного клеточного белка (в этих случаях гетерологичный белок «складируется» в клетке в виде нерастворимых конгломератов - телец включения).

Создание подобных штаммов-продуцентов возможно только при соблюдении ряда условий, один из которых - стабильность мРНК при экспрессии целевого гена. Основным фактором стабильности мРНК и эффективности ее трансляции, является кодоновая композиция гетерологичного рекомбинантного гена. При наличии редко встречающихся аминокислотных кодонов, в гене, клонированном на мультикопийный экспрессионный вектор, подобная генетическая конструкция будет нежизнеспособна, или же, синтез целевого белка будет крайне низким. Другим фактором нестабильности мРНК гетерологичного гена может являться интерференция процесса транскрипции гена (особенно, если его экспрессия находится под контролем сильного бактериального или фагового промотора) с процессом репликации плазмидного вектора, что возможно даже при наличии теминатора транскрипции в нетранслируемой З'-концевой области целевого гена.

Одновременно с развитием генно-инженерных технологий, повысились требования к чистоте конечной субстанции. Появились такие анализы на чистоту получаемого интерферона, как анализ ВЭЖХ, тесты на остаточную ДНК и на остаточные белки штамма-хозяина и вектора. Тест на пирогенность постепенно вытесняется тестом на бактериальные эндотоксины (JlAJI-тест). Усложнение аналитического контроля привело к принципиальным изменениям технологий производства субстанции интерферона, т.к. применение старых технологических путей являлось не достаточным для получения высокоочищенного белка, или же, экономически невыгодным.

При суперэкспрессии гетерологичных белков в клетках Е. coli (в таких количествах, что экспрессируемый белок начинает образовывать тельца включения), бактериальные клетки находятся в состоянии стресса. Во многих случаях бактериальная культура практически не растет после индуцирования синтеза целевого белка. Кроме того, в данных условиях стресса, синтезируемые в тельцах включения белки могут иметь всевозможные модификации, начиная с неотщепленного N-концевого метионина, и заканчивая ацетилированием или окислением некоторых аминокислотных остатков белка. Подобные модификации могут не удаляться различными видами гидрофобной и ионообменной жидкостной хроматографий (не говоря уже про аффинную и гель-фильтрационную), так как при модификации изменение их конформации не происходит, а изменение массы и заряда ничтожно мало по сравнению с нативной молекулой белка. Но при правильном подборе условий их можно детектировать ОФ-ВЭЖХ, а, следовательно, при их большом количестве относительно нативного белка, конечная субстанция не проходит анализ ВЭЖХ.

Было замечено, что количество и характер подобных примесей напрямую зависит от условий ферментационного культивирования штамма-продуцента интерферона, а не только от подбора условий технологии выделения.

Таким образом, процесс получения высокоочищенной субстанции рекомбинантного белка представляет собой комплексную задачу, изменения одного из этапов которой, значительно влияет на остальные этапы.

Цели и задачи работы.

Целями работы являлись:

1) увеличение эффективности биосинтеза рекомбинантного интерферона бактериальными продуцентами (на примере лейкоцитарного интерферона a-F человека);

2) исследование влияния условий ферментации рекомбинантных штаммов Е. coli на образование модифицированных примесей целевого белка (на примере штамма-продуцента интерферона а-2Ъ человека);

3) исследование возможности создания технологии выделения и очистки интерферона a-2b биомассы штамма-продуцента с оптимальным соотношением «цена-качество».

В ходе работы были решены следующие задачи:

• Созданы и клонированы варианты гена человеческого a-F интерферона с различными заменами редко встречающихся эукариотических кодонов.

• Создан штамм-суперпродуцент человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

• Разработаны несколько вариантов регламента ферментации штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

• Созданы несколько вариантов технологии выделения и очистки человеческого рекомбинантного интерферона a-2b.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе работы было подробно рассмотрено влияние редко встречающихся в E.coli аминокислотных кодонов на экспрессию гетерологичного гена, представленного на мультикопийном векторе, под контролем регуляторных элементов на основе Т7 РНК-полимеразы.

Был разработан ферментационный протокол культивирования штамма-продуцента интерферона альфа-2Ь, в котором индукция синтеза интерферона осуществляется лактозой, вместо ИПТГ. Подобный подход значительно снижает себестоимость процесса ферментации. А так же позволяет получать больше количества продукта.

Было показано, что за счет оптимизации ферментационного процесса культивирования можно получать полупродукт более высокого качества, что позволяет упростить дальнейший процесс очистки интерферона, уменьшив количество хроматографических стадий, т.е. понизить себестоимость продукта.

Разработанные технологии позволили наладить рентабельное производство субстанции интерферона альфа-2Ь на базе предприятия ЗАО «Мосагроген», Москва. Получаемая субстанция интерферона альфа-2Ь используется для приготовления ветеринарных лекарственных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®».

Публикации. По теме диссертации опубликовано четыре печатные работы в отечественных журналах и одно тезисное сообщение в материалах научных конференций.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Материалов и методов, Результатов и обсуждения, Выводов и Списка литературы. Работа изложена на 102 страницах, включая 12 рисунков и 18 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 128 источников, в том числе J2 на русском языке.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Гавриков, Алексей Валерьевич

ВЫВОДЫ

1. Получен новый бактериальный штамм-продуцент рекомбинантного интерферона a-F человека с уровнем накопления целевого белка более 25 % от суммарных клеточных полипептидов. Этот уровень был достигнут благодаря модификации гена интерферона a-F включением в его состав часто встречающихся в E.coli синонимических аминокислотных кодонов и обеспечением транскрипции РНК полимеразой фага Т7 целевого гена, входящего в состав экспрессионной кассеты с тандемом терминаторов транскрипции в З'-нетранслируемой области.

2. Создан также новый промышленный продуцент рекомбинантного интерферона a-2b человека с продуктивностью, составляющей более 30% от суммарных клеточных полипептидов.

3. Разработаны варианты протокола промышленной ферментации бактериального штамма-продуцента человеческого рекомбинантного интерферона a-2b, позволяющие упростить дальнейшую очистку интерферона и уменьшить ее себестоимость.

4. Разработаны варианты технологии выделения и очистки интерферона а-2Ь, с общим выходом 50 - 60 %, позволяющие получать субстанцию интерферона ветеринарного и фармакопийного качества. Препаративный уровень соответствует получению порядка 150 тыс ветеринарных терапевтических доз и 3 млн. медицинских терапевтических доз.

5. Созданные в работе новые штаммы-продуценты рекомбинантных интерферонов человека и промышленных способов их выделения и очистки с 2004 г. успешно используются в ЗАО «Мосагроген» для промышленного получения субстанций этих белков и создания на их основе эффективных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®» ветеринарного назначения.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Скороходова А.Ю., Зименкое Д.В., Гавриков А.В., Киверо А.Д., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Машко С.В. «Оптимизация экспрессии генов в бактериальных клетках в биотехнологических исследованиях XXI века» // В сб.:МИФИ, Москва, январь 2002, 125-139.

2. Машко С.В., Скороходова А.Ю., Зименкое Д.В., Мичурина Т.А.У Гавриков А.В., Беневоленский М.С., Киверо АД., Каташкина Ж.И., Дорошенко В.Г., Бирюкова И.В., Дебабов В.Г. «Использование метаболической регуляции для оптимизации экспрессии генов в бактериальных клетках - новое направление биотехнологии XXI-века.» // Биотехнология №4 (2002), 3-14.

3. Гавриков А.В., Зименкое Д.В., Машко С.В. «Введение тандема терминаторов транскрипции повышает эффективность накопления рекомбинантных белков в клетках Escherichia coli при использовании системы экспрессии на основе РНК-полимеразы фага Т7» // Биотехнология №2 (2005), 18-25.

4. Зименкое Д.В., Гавриков А.В., Машко С.В. «Замена редко встречающихся в Escherichia coli эукариотических аминокислотных кодонов на синонимические прокариотические увеличивает эффективность накопления рекомбинантных интерферона-aF и интерлейкина-ip человека» // Биотехнология №3 (2006), 17-32.

5. Гавриков А.В., Рязанов И.А., Калужский В.Е., Машко С.В. «Зависимость процедуры выделения и очистки рекомбинантного интерферона-а2Ь человека от условий его накопления в клетках штамма-продуцента в ходе регулируемого культивирования» // Биотехнология (2006) - в печати.

4. Заключение.

Получение лекарственных препаратов на основе человеческих рекомбинантных белков представляет собой комплексную проблему. Получение высокоэффективного бактериального штамма-продуцента, безусловно, первый и основной шаг на этом пути. При этом, с одной стороны, возникают чисто технические вопросы клонирования гетерологичного гена в соответствующую экспрессионную бактериальную систему, а с другой стороны, необходимо понимание фундаментальных основ процессов транскрибции и трансляции для оптимизации экспрессии гетерологичного белка. В нашем случае - влияние редко встречающихся в Е. coli кодонов и процесса терминации транскрибции экспрессии гетерологичного гена под контролем высокоэффективных экспрессионных элементов бактериофага Т7.

Частое явление, когда исследователи, создав высоко эффективный штамм-продуцент, не уделяют достаточного внимания его дальнейшему ферментационному культивированию. Для штаммов-продуцентов гетерологичных белков, экспрессия которых находится под контролем экспрессионных элементов бактериофага Т7 (чаще всего используют векторные плазмиды серии рЕТ и штамм-хозяин BL21(DE3)) и для лабораторного и для промышленного культивирования, в качестве индуктора синтеза целевого белка используют IPTG.

Как мы показали, использование вместо IPTG лактозы во-первых более экономически выгодно на стадии ферментационного культивирования, во-вторых увеличивает выход бактериальной биомассы в 1,5 - 2 раза (а, следовательно, и выход целевого белка), а в третьих, влияет на формирование телец включения интерферона в процессе синтеза. Основное отличие телец включения, полученных при индукции бактериальной культуры лактозой, от телец включения, полученных индукцией классическим индуктором IPTG, состоит в том, что первые содержат меньше примесей модифицированного интерферона. Благодаря этому в поцессе дальнейшей очистки белка выше его выход на этапе ренатурации и для получения ветеринарной субстанции интерферона достаточно одной стадии хроматографической очистки на катионите SP-Toyopearl, а не две. Т.е. при индукции лактозой выше выход нативного интерферона в ходе последующих процедур выделения и очистки, что дополнительно понижает его себестоимость.

Для получения субстанции интерферона фармакологической чистоты необходима дальнейшая очистка ветеринарной субстанции от примесей модифицированного интерферона, не удаляемых методами жидкостной хроматографии низкого давления. Один из возможных вариантов - доочистка методом препаративной ВЭЖХ, что и было продеманстрировано. Другой возможный вариант - продолжение исследований характеристик ферментационного культивирования, с целью разработки такого ферментационного протокола, при котором в процессе формирования телец включения не будут образовываться модифицированные варианты интерферона.

В Европейской и Британской фармакопеях чистота по анализу ВЭЖХ конечной субстанции интерферона должна составлять не менее 95 % [121]. Субстанция подобной чистоты получалась примерно в 1 цикле выделения интерферона из 7, без применения этапа препаративного ВЭЖХ. Как говорилось выше, содержание «переднего» пика зависит от характеристик ферментационного процесса, не определенных на данный момент. Возможна дальнейшая работа в этом направлении.

Технология выделения и очистки рекомбинантного человеческого интерферона альфа-2Ь с использованием одной хроматографической стадии -очистки на катионите SP-Toyopearl, успешно применяется последние два года в ЗАО «Мосагроген», Москва, для получения ветеринарной субстанции интерферона и создания на ее основе ветеринарных препаратов «Миксоферон®» и «Кинорон®».

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гавриков, Алексей Валерьевич, 2006 год

1. Sowers, G., Jarsch, M. //Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996 - V.46 - P. 1 - 9.

2. Овчинников Ю.А., Свердлов Е.Д., Царев С.А. и др. II Авторское свидетельство СССР № 1328963.-(1987).

3. Davison J. // Gene. 1984. - V. 28. - P. 1-15.

4. Zurita M, Bolivar F., SoberonX. II Gene. 1984. - V. 28. - P. 119-122.

5. Summer D.K., SherratD.J. II Cell. 1984. - V. 36. - P. 1097-1103.

6. Lee N. Cozzitorto J. et al. II Nucl. Acids. Res. 1984. - V. 12. - P. 6797-6812.

7. Mashko S. V., Mochulsky A. V., Kotenko S. V. et al. И Gene. 1991. - V. 97. - P. 259-266.

8. Deuschle U., Kammerer W., Gentz R., Bujard H. IIEMBO J. 1986. - V. 5. - P. 2987-2994.

9. Kammerer W., Deuschle U., Gentz R., Bujard H. II EMBO J. 1986. - V. 5. - P. 2995-3000.

10. Машко C.B., Горовиц P.Л., Трухан М.Э. и др. II Докл. АН СССР. 1986. - Т. 291.-С. 1510-1513.

11. Remaut Е., Stanssens P., Fiers W. II Gene. 1981. - V. 15. - P. 81 -93.

12. Poindexter К., Gayle III, R.B. II Gene. 1991. - V. 97. - P. 125-130.

13. RussellD.R., Bennett G.N. //Gene. 1982. -V. 20. - P. 231-243.

14. Brosius J., Erfle M., Storella J. II J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 35393541.

15. Nishi Т., Itoh S. II Gene. 1986. - V. 44. - P. 29-36.

16. PetrenkoL.A., Gileval.P., Kravchenko V.V. //Gene.- 1989.-V. 78.-P. 85-91.

17. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J. J., Dubendorff J.W. II Meth. Enzymol. -1990.-V. 185.-P. 60-89.

18. Joho K.E., Gross L.B., McGraw N.J. et all I J. Mol. Biol. 1990. - V. 215. - P. 31-39.

19. Raskin C.A. II "Characterization of the promoter specificity determinants of bacteriophage T3 and T7 RNA polymerases". (Ph.D. Thesis, under the guidance of

20. W.T. McAllister), Dept. Microbiol. & Immunol. Morse Inst, of Molecular Genetics, State University of New York, Health Science Center at Brooklyn, (1991).

21. Maksimova T.G., Mustayev A.A., Zaychikov E.F. et al. II Eur. J. Biochem. 1991. -V. 195.-P. 841-847.

22. Soma R., Chung Y.J., Rose J.P., Wang B.-C. II Nature. 1993. - V. 364. - P. 593-599.

23. Chamberlin M., Ring J. II J. Biol. Chem. 1973. - V. 248. - P. 2235-2244.

24. Golomb M, Chamberlin M. II J. Biol. Chem. 1974. V. 249. - P. 2858-2863.25. lost I., Guillerez J., Dreyfus M. // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 619-622.

25. Tabor S., Richardson C.C. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1985. - V. 82. - P. 1074-1078.

26. Jeng S.-T., Gardner J.F., Gumport R.I. 11 J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - P. 3823-3830.

27. Giordano T.J., Deuschle U., BujardH., McAllister W.T. II Gene. 1989. - V. 84. -P. 209-219.

28. Tanhauser S.M., Jewell D.A., Tu C.K. et al. I I Gene. 1992. - V. 117. - P. 113117.

29. Studier F. W., Moffat B.A. II J. Mol. Biol. 1986. - V. 189. - P. 113-130.

30. Перельман A.H., Мочульская H.A., Миронов А.С., Машко C.B.I I Биотехнология. 1995. -№ 1-2. - С. 11-18.

31. StudierF.W. II J. Mol. Biol. 1991. -V. 219. -P. 37-44.

32. Moffatt B.A., Studier F. W. // Cell. 1987. - V. 49. - P. 221-227.

33. Ильичев А.А., Меламед H.B., Закабунин А.И. и др. II Докл. АН СССР. 1988. -Т. 303.-С. 496-498.

34. DubendorffJ. W., Studier F. W. И J. Mol. Biol. 1991. - V. 219. - P. 45-59.

35. Lebedeva M.I., Rogozhkina E. V., Tsyba N.A., Mashko S. V. II Gene. 1994. - V. 142.-P. 61-66.

36. Uhlenbeck O.C., Bailer J., Doty P. //Nature. 1970. -V. 225. - P. 508-510.

37. Shine J., Dalgarno L. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1974. - V. 71. - P. 13421346.

38. Olins, P.O., Devine, C.S., Rangwala, S.H., Kavka, K.S. H Gene. 1988. - V. 73. -P. 227-235.

39. Olins, P.O., Rangwala, S.H. II J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 1697316976.

40. McCarthy, J.E.G., Sebald, W., Gross, G„ Lammers, R. И Gene. 1986. - V. 41. -P. 201-206.

41. Boni, I. V., Isaeva, D.M., Musychenko, M.L., Tzareva, N.V. II Nucl. Acids Res. -1991.-V. 19.-P. 155-162.

42. Petersen, G.B., Stockwell, P.A., Hill, D.F. IIEMBO J. 1988. - V. 1. - P. 39573962.

43. Faxen, M, Plumbridge, J., Isaksson, L.A. II Nucl. Acids Res. 1991. - V. 19. -P. 5247-5251.

44. Sprengart, M.L., Fatscher, H.P., Fuchs, E. II Nucl. Acids Res. 1990. - V. 18. -P. 1719-1723.

45. Iserentant D., Fiers W. II Gene. 1980. - V. 3. - P. 1-12.

46. Stanssens P., RemautE., Fiers W. // Gene. 1985. - V. 36. - P. 211-223.49. de Smit M.H., van Duin. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 7668-7672.

47. Backman K., Ptashne M. 11 Cell. 1978. - V. 13. - P. 65-71.

48. Roberts Т., Kacick R., Ptashne M. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. -P. 760-764.

49. Guarente L., Roberts T.M., Ptashne M. II Science. 1980. - V. 209. - P. 14281430.

50. Spanjaard R.A., van Dijk M.C.M., Turion A.J., van Duin J. II Gene. 1989. - V. 80.-P. 345-351.

51. Andersson S.G.E., Kurland C.G. II Microbiol. Rev. 1990. - V. 54. - P. 198-210.

52. Chen G.-F.T., Inouye M. II Nucl. Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 1465-1473.

53. Fahnestock S.R., Irwin S.L. II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. - V. 47. - P. 23-32.

54. Yarchuk O., Guillerez J., Jacques N., Dreyfus M. II J. Mol. Biol. 1992. -V. 226. -P. 581-596.

55. Holm I. II Nucl. Acid. Res. 1986. - V. 14. - P. 3075-3078.

56. Robinson M., Lilley R., Little S. et al. II Nucleic Acids Res. 1984. - V. 12. - P. 6663-6671.

57. Sorensen M.A., Kurland C.G., Pedersen S. II J. Mol. Biol. 1989. - V. 207. - P. 365-377.

58. Belasco J.G., Higgins C.F. II Gene. 1988. - V. 72. - P. 15-23.

59. Collins J.J., Roberts G.P., Brill W.J. II J. Bacteriol. 1986. - V. 168. - P. 173178.

60. Melin L., Rutberg L., von Gabain A. II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 21102115.

61. Mudd E.A., Prentki P., Belin Д, Krisch H.M. II EMBO J. 1988. - V. 7. - P. 3601-3607.

62. Koraimann G., Hogenauer G. II Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - P. 12831298.

63. Cannistraro V.J., Subbarao M.N., Kennell D. II J. Mol. Biol. 1989. - V. 192. -P. 257-274.

64. Deutscher M.P. II Cell. 1985. - V. 40. - P. 731-732.

65. Chen C.-Y.A., BeattyJ.T., Cohen S.N., Belasko J.G. И Cell. 1988. - V. 52. - P. 609-619.

66. Newbury S.F., SmithN.H., Higgins C.F. //Cell.- 1987.-V. 51.-P. 1131-1143.

67. Melefors O., von Gabain A. //Cell. 1988. -V. 52. - P. 893-901. IX.Lundberg U., Nilsson G., von Gabain A. II Gene. - 1988. - V. 72. - P. 141-149.

68. Emory S.A., Belasco J.G. H J. Bacteriol. 1990.-V. 172.-P. 4472-4481.

69. Cannistraro V.J., Kennel D. II J. Bacteriol. 1985. - V. 161. - P. 820-822.

70. Lundberg U., von Gabain A., Melefors О. II EMBO J. 1990. - V. 9. - P. 27312741.

71. Wong H.C., Chang S. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - P. 32333237.

72. Chanda P., Ono M., Kuwano M., Kung H. II J. Bacteriol. 1985. - V. 161. - P. 446-449.

73. Claverie-Martin F., Diaz-Torres M.R., Yancey S.D., Kushner S.R. II J. Bacteriol. 1989.-V. 171.-P. 5479-5486.

74. VarshavskyA. //Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 1996.-V. 93.-P. 12142-12149.

75. Blanquet S., Hirel P.-H., Schmitter J.-M. et al. II Abstr. Soviet-French Symp. "Physico-chemical foundation of life", Bordo, France, 1988.

76. Cheng Y.-S.E., Kwoh D.Y., Kwoh T.J. et al. // Gene. 1981. - V. 14. - P. 121130.

77. KaneJ.F., HartleyD.L. //TibTech.- 1988. V. 6.-P. 95-101.

78. Chen S.-H. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - P. 4627-4631.

79. Кетре Т., Kent B.H., Chow F. et al. I I Gene. 1985. - V. 39. - P. 239-245.

80. Swebilius В., Gold L. II Gene. 1991. - V. 106. - P. 1-6.

81. Стронгин А.Я., Борухов С.И., Богуш В.Г. и др. II Биотехнология. 1987. - Т. З.-С. 325-331.

82. Lundell D., Greenberg R., Alroy Y. et al II J. Ind. Microbiol. 1990. - V. 5. - P. 215-228.

83. Kimmenade A., Dang W. I I J. Biotechnol. 1989. - V. 11. - P. 11-24.

84. Belev M., Zhou Y, Wang S. et al. II J. Chromatogr. 1994. - V. 679. - P. 67-83.

85. Fraser Т.Н., Bruce B.J. 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - Y. 75. - P. 59365940.

86. Van der WerfS., Dreano M., Bruneau P. et al. И Gene. 1983. - V. 23. - P. 8593.

87. Sakamoto K., Ishimaru S., Kobayashi T. et al. II J. Bacteriol. 2004. - V. 186. -P. 5899-5905.

88. Kim, D.Y., Bochar, D.A., Stauffacher, C.V., Rodwell, V.W. II Protein Expr. Purif. 1999.-V. 17.-P. 435-442.

89. Hua, Z, Wang, H., Chen, D. et al. И Mol. Biol. Int. 1994. - V. 32. - P. 537-543.

90. Died, G., Bottarelli, L., Ballabeni, A., Ottonello, S. II Protein Expr. Purif. 2000. -V. 18.-P. 346-354.

91. Jiang, L., Yang, Y., Chatterjee, S. et al. II Biosci. Biotechnol. Biochem. 1999. -V. 63.-P. 2097-2101.

92. Calderone, T.L., Stevens, R.D., Oas, T.G. II J. Mol. Biol. 1996. - V. 262. - P. 407-412.

93. Spanjaard, R.A., Chen, K., Walker, J.R., van Duin, J. II Nucleic Acids Res. -1990.-V. 18.-P, 5031-5036.

94. Zahn К. II J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 2926-2933.

95. Brinkmann U., Mattes R.E., Buckel P. II Gene. 1989. - V. 85. - P. 109-114.

96. HirschfeldE, Riesenberg DII Appl Microbiol Biotechnol. 1992 - V. 36(4) -P. 487-492.

97. Ivanov I, MarkovaN, Bachvarov D, Alexciev K, SaraffovaA, Maximova V, Tsaneva I, Markov G. II Int J Biochem. 1989 - V.21(9) - P. 983-985.

98. Laplace F, Hartmann M, Klessen C, Tonew M, Malke H. IIJ Basic Microbiol. -1988 V.28(l-2)-P. 55-61.

99. Petrenko LA, Gileva IP, Kravchenko VV. //Bioorg Khim. 1987 - V. 13(11) -P. 1561-1569.

100. Srivastava P, Bhattacharaya P, Pandey G, Mukherjee KJ. II Protein Expr Purif. -2005 -V. 41(2)-P. 313-322.

101. IvanovIG, SaraffovaA, Alexandrova R, AbouHaidar MG. IIFEMS Microbiol Lett.- 1993-V. 108(2)-P. 231-236.

102. Waine GJ, Wines BD, Wang L, McMullen GL. //Biochem Int. 1992 - V.28(2) -P. 255-263.

103. Кравченко B.B., Гшева И.П., Сандахчиев JI. С. и др. II Патент Российской Федерации № 2054041 (1996).

104. Пикалова М.И., Доманова З.М., Хайбуллина И.И. u dp. II Патент Российской Федерации № 2118366 (1998).

105. Черепанов П.А., Михайлова Т.Г., Черепанов П.П. и др. //Патент Российской Федерации № 2165455 (2001).

106. Riesenberg D., Menzel К., Schulz V., Schulmann К., Veith G., Zuber G., Knorre W.A. II Appl Microbiol Biotechnol. 1990 - V. 34 - P. 77-82.

107. Bodo G., Maurer-Fogy I., Falkner E., et al. И United State Patent № 5,196,323 -(1993).

108. Hauptmann R., Falkner E., Bodo G., et al. И United State Patent № 5,710,027 -(1998).

109. Бажутипа H.B., Гурьев В.П., Гурьева Т.Л., и др. II Патент Российской Федерации № 2123010 (1998).

110. Beldarrain A., Cruz Y, Cruz О., Navarro М., Gil М. II Biotechnol. Appl. Biochem. 2001-V.33.-P. 173-182.

111. Bab и K.R., Swaminathan S., Marten S., KhannaN., Rinas U. II Appl Microbiol Biotechnol. 2000 - V. 53 - P. 655-660.

112. Guo L.A. II Se Pu Abstract - 2001 - V. 19(4) - P. 301-303.

113. Cho J.M., Park Y. W., Park S.J., et al. //Europe Patent № 0 553 494 (1993).

114. Swaminathan S., Khanna N. II Protein Expr. Purif. 1999 - V. 15(2) - P. 236242.

115. Di Marco S., Fendrich G., Meyhack В., Grutter M.G. II J.Biotechnol. 1996 -V. 50(1)-P. 63-73.

116. Yan Y, WangX., Wu A., Sun Y H Chin J Biotechnol. Abstract - 1996 - V. 12(1)-P. 25-29.

117. Anon. Monograph 1100. Concentrated interferon alpha 2 solution. II European Pharmacopoeia 3rd edition 1998 - Strasburg, France.

118. Фармакопейная статья предприятия 42-0241118201. ДГУ ПП «Вектор-Фарм» - 2001 - Интерферон альфа-2Ь человеческий рекомбинантный (субстанция).

119. Фармакопейная статья предприятия 42-0543549504. ООО «Фармапарк» -2004 - Интерферон альфа-2Ь человеческий рекомбинантный.

120. Hershenson S., Shaked Z., Thomson J. // United State Patent № 4,961,969 -(1990).

121. Hershenson S., Shaked Z. 11 United State Patent № 4,894,330 (1990).

122. McAllister, W.T., Morris, C., Rosenberg, A.H., et al.// J. Mol. Biol. 1981 - V. 153-P. 527-544.

123. Morehead, H., et al //Biochemistry 1984 - V. 23 - P. 2500 - 2507.

124. Колосов, M.H., и dp J Авторское свидетельство СССР № 1092176 1984 -Бюл. Изобр. № 18.