Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Семихин, Александр Сергеевич

• Семихин, Александр Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Семихин, Александр Сергеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Технология аффинных доменов и ее применение для получения химерных бежов.

1.2. Аффинные домены.

1.2.1. Целлюлозосвязывающие домены.

1.2.2. Коллаген-связывающие домены.

1.2.2.2. Коллаген-связывающие домены из фактора фон Виллебранда быка и человека (vWFB, vWFH, и vWFH2).

1.2.2.3. Коллаген-связывающий домен из остеонектина человека (CollBD).

1.2.2.4. Декстран-связывающий домен из декстрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides.

1.3. Биологически активные белки.

1.3.1. Эпидермальный фактор роста человека (EGF).

1.3.2. Фактор роста фибробластов человека (FGF).

1.3.3. Интерферон бета человека (IFN-fi').

1.3.3.1. Интерферон бета и его функции.

1.3.3.2. Производство интерферона бета.

1.3.4. Костные морфогенетические белки человека (BMP).

1.3.4.1. Методы получения BMP.

1.3.4.2. Общая характеристика BMP.

1.3.4.3. Механизм действия BMP.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.4. Материалы и реактивы.

2.4.1. Плазмидные векторы и олигонуклеотиды.

2.4.2. Бактериальные штаммы и линии клеток.

2.4.3. Лабораторные животные.

2.4.4. Питательные среды.

2.4.5. Ферменты.

2.4.6. Сорбенты.

2.4.7. Буферные растворы.

2.4.8. Другие реактивы.

2.4.9. Оборудование.

2.5. Основные методики.

2.5.1. Полимеразная цепная реакция.

2.5.2. Химико-ферментативный синтез.

2.5.3. Гидролиз ДНК специфическими эндонуклеазами.

2.5.4. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.5.5. Препаративное разделение фрагментов ДНК и их элюция из геля.

2.5.6. Лигирование фрагментов ДНК.

2.5.7. Выделение и очистка аналитического количества. плазмидной ДНК.

2.5.8. Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.5.9. Выделение хромосомной ДНК Staphylococcus aureus и.

Leuconostoc mesenteroides.

2.5.10. Определение нуклеотидных последовательностей. плазмидных ДНК.

2.5.11. Подготовка компетентных клеток Е. coli для трансформации плазмидной ДНК электропорацией.

2.5.12. Трансформация клеток Е. coli.

2.5.13. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН.

2.5.14. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков.

2.5.15. Определение растворимости белков.

2.5.16. Выделение и очистка рекомбинантных белков на целлюлозе,. с помощью целлюлозосвязывающего домена.

2.5.17. Выделение и очистка рекомбинантных белков на сефадексе,. с помощью декстран-связывающего домена.

2.5.18. Выделение и очистка белков, содержащих. коллаген-связывающие домены.

2.5.19. Измерение биологической активности интерферона бета.

2.5.20. Измерение активности щелочной фосфатазы.

2.5.21. Получение телец включения Е. coli, содержащих ВМР2.

2.5.22. Очисткарекомбинатного BMP2 и получение биологически. активной формы.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание бактериальных штаммов-продуцентов аффинных доменов.

3.1.1. Создание бактериального штамма-продуцента коллаген-связывающего домена (SAu).

3.1.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка SAu.

3.1.1.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка SAu в клетках Е. coli штаммов М15 и DH5a.

3.1.2. Создание бактериальных штаммов-продуцентов белков vWFB, vWFHi и vWFH2.

3.1.2.1. Клонирование нуклеотидных последовательностей генов белков vWFB, vWFH], vWFH2.

3.1.2.2. Экспрессия рекомбинантных генов белков vWFHb vWFH2, vWFB в клетках Е. coli Ml5.

3.1.3. Создание бактериального штамма-продуцента белка CollBD.

3.1.3.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка CollBD.

3.1.3.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка CollBD в клетках

Е. coli Ml 5.

3.1.4. Создание бактериального штамма-продуцента декстран-связывающего домена (DBD).

3.1.4.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка DBD.

3.1.4.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка DBD в клетках

Е. coli Ml5.

3.2. Изучение аффинных свойств полученных доменов.

3.3. Создание бактериальных штаммов-продуцентов биологически активных бежов.

3.3.1. Создание бактериального штамма-продуцента белка EGF.

3.3.1.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка EGF.

3.3.1.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка EGF в клетках

Е. coli Ml5.

3.3.2. Создание бактериального штамма-продуцента белка FGF.

3.3.2.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка FGF.

3.3.2.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка FGF в клетках

Е. coli М15.

3.3.3. Создание бактериального штамма-продуцента белка 1FN-J3.

3.3.3.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена. белка IFN-р.

3.3.3.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка IFN-p. в клетках Е. coli Ml 5.

3.3.4. Создание бактериального штамма-продуцента белка В MP2.

3.3.4.1. Клонирование нуклеотидной последовательности гена белка ВМР2.

3.3.4.2. Экспрессия рекомбинантного гена белка ВМР2 в клетках

Е. coli Ml5.

3.4. Создание бактериальных штаммов-продуцентов химерных бежов, несущих в своем составе аффинные домены и биологически активные белки.

3.4.1. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка v WFHi-sp-EGF.

3.4.1.1. Клонирование гена химерного белка vWFHi-sp-EGF.

3.4.1.2. Экспрессия гена химерного белка vWFHrsp-EGF в клетках

Е. coli Ml5.

3.4.2. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка vWFHrsp-FGF.

3.4.2.1. Клонирование гена химерного белка vWFHrsp-FGF.

3.4.2.2. Экспрессия гена химерного белка vWFHrsp-FGF в клетках

Е. coliM 15.

3.4.3. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка CollBD-sp-EGF.

3.4.3.1. Клонирование гена химерного белка CollBD-sp-EGF.

3.4.3.2. Экспрессия гена химерного белка CollBD-sp-EGF в клетках

Е. coli Ml5.

3.4.4. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка CollBD-sp-FGF.

3.4.4.1. Клонирование гена химерного белка CollBD-sp-FGF.

3.4.4.2. Экспрессия гена химерного белка CollBD-sp-FGF в клетках

Е. coliM 15.

3.4.5. Получение спейсерной последовательности и конструкции p-sp-DBD.

3.4.6. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка DBD-sp-EGF.

3.4.6.1. Клонирование гена химерного белка DBD-sp-EGF.

3.4.6.2. Экспрессия гена химерного белка DBD-sp-EGF в клетках

Е. coliMIS.

3.4.7. Создание бактериального штамма-продуцента химерного. белка DBD-sp-FGF.

3.4.7.1. Клонирование гена химерного белка DBD-sp-FGF.

3.4.7.2. Экспрессия гена химерного белка DBD-sp-FGF в клетках

Е. coli М15.

3.4.8. Создание бактериального штамма-продуцента химерного. белка DBD-sp-IFNp.

3.4.8.1. Клонирование гена химерного белка DBD-sp-IFNp.

3.4.8.2. Экспрессия гена химерного белка DBD-sp-IFNp в клетках

Е. coli Ml5.

3.4.9. Создание бактериального штамма-продуцента химерного белка CollBD-sp-BMP2.

3.4.9.1. Клонирование гена химерного белка CollBD-sp-BMP2.

3.4.9.2. Экспрессия гена химерного белка CollBD-sp-BMP2 в клетках

Е. coli М15.

3.4.9.3. Подбор и оптимизация условий, способствующих восстановлению биологически активной формы ВМР-2.

3.5. Оптимизация условий культивирования бактериальных клеток, содержащих гены химерных белков.

3.5.1. Подбор условий культивирования штаммов-продуцентов рекомбинантных белкоа в колбах.

3.5.2. Наработка биомассы в ферментере New Brunswick BioFlo 415.

3.6. Исследование биологических свойств химерного белка CollBD

FGF на модели культивирования эукариотических клеток in vitro на поверхности плашек, покрытых коллагеном.

3.7. Исследование биологических свойств химерного белка DBD-sp-EGF на модели культивирования эукариотических клеток in vitro в объеме питательной среды.

3.8. Исследование биологической активности химерного белка DBD-sp-IFNb in vitro, на модели инфекции вирусом энцефаломиокардита мышей.

3.9. Исследование биологической активности химерного белка

COLLBD-sp-BMP2 in vitro, на культуре эукариотических клеток.

ЗЛО. Исследование биологической активности химерного белка CollBD-sp-BMP2 in vivo, на модели костного дефекта в болынеберцовой кости крыс.

3.11. Исследование биологической активности химерного белка CollBD-sp-BMP2 in vivo, на модели костного дефекта в черепе крыс.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение компонентов иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов»

Актуальность проблемы. Перспективным направлением развития современной медицинской науки является разработка новых технологий получения иммунобиологических препаратов на основе микробиологического синтеза. Такие технологии позволяют сократить срок разработки нового препарата и значительно снизить его стоимость. Безусловно, синтез гетерологичных белков в клетках бактерий связан с рядом трудностей, основные из них это низкий уровень продукции чужеродного белка, нестабильность и сложность его очистки. Решение этих проблем является важной биотехнологической задачей и одним из подходов, применяемых для повышения уровня продукции целевого белка, его стабилизации и возможности быстрой и эффективной очистки, является технология аффинных доменов. Основной принцип данной технологии заключается в получении двухдоменных белков, содержащих в своем составе целевой белок, обладающий биологической активностью и различные аффинные домены, способные влиять на уровень продукции, растворимость и стабильность целевого белка. Кроме того технология аффинных доменов позволяет решить другую важную задачу — упростить систему очистки целевого белка и таким образом снизить его стоимость.

Одна из наиболее важных областей применения технологии аффинных доменов - получение иммунобиологических препаратов нового поколения. Благодаря широкому разнообразию встречающихся в природе аффинных доменов и соответствующих матриц можно создавать препараты, в которых оба компонента (рекомбинантный белок и аффинная матрица) будут иметь важное биологическое значение. Химерный белок (фактор роста, вакцинный компонент, иммуномодулятор и т.д.) будет проявлять специфическую биологическую активность, а носитель, на котором он иммобилизован, может стимулировать иммунный ответ, защищать белок от действия ферментов и биологических жидкостей организма, обеспечивать пролонгированное действие иммобилизованного белка и т.д.

Большой интерес представляет создание рекомбинантных факторов роста, способствующих росту и заживлению тканей. В настоящее время в различных странах, в т.ч. и в России, широко применяются раневые покрытия, содержащие рекомбинантный эпидермальный фактор роста человека. Такие покрытия показали свою эффективность в клинике: благодаря их использованию повреждения кожи заживают путем первичного натяжения без образования рубцов и скорость полного восстановления ткани сокращается в 2-3 раза.

Также рекомбинантные ростовые факторы могут применяться для улучшения существующих и разработки новых систем культивирования эукариотических клеток. Для этих целей используются эпидермальный ростовой фактор и фактор роста фибробластов, т.к. известна их способность стимулировать рост клеток эукариот in vitro.

Препараты рекомбинантного интерферона бета в настоящее время применяются в медицине для лечения широкого спектра патологий - это, прежде всего, различные вирусные инфекции, аутоиммунные заболевания и злокачественные опухоли. Однако, несмотря на очевидную эффективность препаратов на основе интерферона-(3, существующие технологии получения этого белка не способны в полной мере удовлетворить растущие потребности медицины.

Для производства рекомбинантного интерферона-p сегодня используются различные системы экспрессии, и каждая из них обладает своими недостатками и преимуществами. Получение интерферона с помощью клеток млекопитающих позволяет получить белок идентичный натуральному, но накопление, выделение и очистка такого белка являются сложным и дорогостоящим процессом. Более того, интерферон является токсичным для клеток-продуцентов, что дополнительно снижает

12 эффективность данной технологии и повышает стоимость конечного продукта. В свою очередь рекомбинантный интерферон-p, синтезированный в бактериальных клетках может быть загрязнен различными токсичными белками и пирогенами, и также токсичен для клеток-продуцентов.

Ежегодно в России регистрируется около 20 млн. различных травм, 15% которых связаны с переломами костей. Одним из наиболее эффективных методов лечения является заполнение дефектов кости различными биокомпозитами, ускоряющими рост костной ткани. В ряде случаев необходимо использование металлоконструкций для обеспечения фиксации кости в месте перелома. Для улучшения приживаемости таких имплантатов их также покрывают композиционными покрытиями. Однако не все материалы достаточно биосовеместимы и актуальной проблемой трансплантологии сейчас является создание новых поколений биодеградируемых и биосовместимых покрытий и матриксов, в которые введены биологически активные соединения, обеспечивающие благоприятную среду для восстановления поврежденных тканей.

Новое поколение композиционных препаратов кроме широко используемых материалов - коллагена и гидроксиапатита содержит биологически активные белки - факторы роста. Одним из основных таких белков является костный морфогенетический белок 2 (Bone morphogenetic protein 2 - ВМР-2). Функции ВМР-2 в организме чрезвычайно разнообразны, но основная его задача во взрослом организме — поддержание и восстановление костной ткани. Введение в состав композиционных препаратов рекомбинантного ВМР-2 способно сократить время заживления переломов в 2-3 раза, а при обработке металлических имплантатов биосовместимыми покрытиями, содержащими ВМР-2, снизить вероятность отторжения имплантатов в 3-5 раз.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось разработка подходов для получения, очистки и иммобилизации биологически активных

13 белков на основе микробиологического синтеза и технологии аффинных доменов.

Часть работы, связанная с получением рекомбинантного белка ВМР-2 и композиционных препаратов на его основе, выполнялась в рамках государственного контракта № 02.522.12.2007 от 30 апреля 2008 года, по теме: «Разработка опытно-промышленных технологий получения гидроксиапатит/коллагеновых композиционных препаратов/покрытий имплантируемых материалов».

В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Клонирование в клетках Е. coli нуклеотидных последовательностей, кодирующих гены аффинных доменов: коллаген-связывающий домен из адгезина микроорганизма Staphylococcus aureus (SAu), коллаген-связывающие декапептиды из фактора фон Виллебранда быка (vWFB) и человека (vWFHl и vWFH2), коллаген-связывающий домен из остеонектина человека (CollBD), декстран-связывающий домен (DBD) из декстрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides и гены биологически активных белков — цитокинов из организма человека: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов (FGF), интерферон бета (IFN-p) и костный морфогенетический белок человека 2 (ВМР-2). Выбор оптимальных аффинных доменов для создания химерных конструкций с биологически активными белками.

2. Создание штаммов Е. coli — продуцентов химерных рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-p и CollBD-BMP-2.

3. Оптимизация условий культивирования штаммов-продуцентов химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-P и CollBD-BMP-2.

4. Отработка методов очистки и иммобилизации химерных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-p и CollBD-BMP-2 на соответствующих сорбентах - желатин-сефарозе для белков, несущих в своем составе коллаген-связывающий домен и Сефадексе для белков, содержащих декстран-связывающий домен.

5. Разработка методики оценки биологической активности препаратов химерных белков DBD-EGF и CollBD-FGF при культивировании эукариотических клеток in vitro.

6. Изучение биологической активности препарата белка DBD-IFN-p иммобилизованного на Сефадексе in vitro.

7. Изучение биологической активности препарата белка CollBD-BMP-2 in vitro.

8. Разработка методик изучения и оценки биологической активности препаратов, содержащих рекомбинантный белок CollBD-BMP-2 in vivo. Научная новизна. В результате выполнения работы впервые были получены бактериальные штаммы-продуценты химерных белков, содержащих эпидермальный фактор роста человека, соединенный с декстран-связывающим доменом, фактор роста фибробластов человека, соединенный с коллаген-связывающим доменом, интерферон бета человека соединенный с декстран-связывающим доменом и костный морфогенетический белок 2 соединенный с коллаген-связывающим доменом.

Были достигнуты высокие уровни продукции химерных белков и созданы высокоэффективные системы выделения, очистки и иммобилизации их на соответствующих сорбентах, основанные на способности выбранных аффинных доменов специфически связываться с соответсвующим сорбентом. Степень чистоты полученных таким образом белковых препаратов составила более 95%.

Впервые была разработана методика культивирования эукариотических клеток в объеме питательной среды на поверхности Сефадексов, покрытых препаратом рекомбинантного белка DBD-EGF.

Была разработана методика повышения эффективности культивирования эукариотических клеток на поверхности, покрытой коллагеном и обработанной препаратом рекомбинантного белка CollBD-FGF.

Путем микробиологического синтеза была получена биологически активная форма рекомбинантного интерферона-p, по своей противовирусной активности не уступающая доступным коммерческим аналогам.

Впервые в России были созданы препараты, содержащие рекомбинантный белок CollBD-BMP-2 и показана эффективность данных препаратов в опытах на лабораторных животных.

Практическое значение работы. Результаты работы представляют не только научный, но и чрезвычайный практический интерес. Полученные в нашей работе аффинные домены могут быть использованы для создания химерных белков, несущих в своем составе различный биологически активный компонент: цитокины из организма человека, биологическиценные и экономически-значимые белки из различных макро- и микроорганизмов, бактериальные и вирусные антигены, токсины и т.д. При этом аффинной матрицей, для полученных нами доменов, являются хорошо изученные и разрешенные к медицинскому применению вещества — коллаген и декстран. Также необходимо отметить, что использование коллагенсвязывающего домена открывает широкие перспективы для создания пролонгированных форм лекарственных препаратов. Благодаря аффинному взаимодействию можно получить препарат белка иммобилизованного на коллагене (или его гидролизованной форме - желатине) или коллагенсодержащем носителе. Такой препарат может иметь инъекционную форму и при введении будет постепенно гидролизоваться протеазами организма, высвобождая новые порции химерного белка. Благодаря возможности

16 изменения физических свойств коллагена (желатина), т.е. его химической или радиационной сшивки, можно регулировать скорость деградации носителя в организме и создавать препараты, действующие от нескольких недель до нескольких месяцев. Кроме того малые размеры коллаген-связывающего домена (~ 2 кДа) практически не влияют на биологические свойства присоединяемого белка и не вызывают иммунной реакции в организме человека.

Несомненную практическую значимость представляют также полученные в работе биологически активные белки. Так химерный белок, содержащий в своем составе коллаген-связывающий домен и фактор роста фибробластов, может быть использован для интенсификации процесса культивирования клеток эукариот на поверхности, покрытой коллагеном. Благодаря аффинному взаимодействию химерный белок будет прочно закреплен на носителе и не потребует дополнительной стадии очистки, а благодаря способности FGF стимулировать рост клеток можно повысить эффективность культивирования (а, следовательно, и накопления биологически ценных продуктов, синтезируемых клетками) в 1,5-2 раза. Полученный нами белок, содержащий декстран-свзязывающий домен и эпидермальный фактор роста, также может быть использован для улучшения существующих систем культивирования клеток эукариот, но не на поверхности пластика, а в объеме питательной среды. Используя способность декстран-связывающего домена избирательно и прочно взаимодействовать с Сефадексом (химически модифицированным декстраном) такой химерный белок можно иммобилизовать на поверхности сфер Сефадекса. После этого, добавив эти сферы в питательную среду, можно значительно увеличить площадь культивирования и, следовательно, получить большее количество клеток с того же объема питательной среды.

Несомненную практическую значимость представляет полученный нами химерный белок, содержащий декстран-связывающий домен и

17 интеферон-p. Потребность в интерфероне-p в России и в мире в настоящее время велика и разработка новых простых и дешевых систем его получения является чрезвычайно актуальной биотехнологической задачей. Полученный нами рекомбинантный белок в опытах in vitro продемонстрировал способность защищать клетки от модельной вирусной инфекции не хуже существующих коммерческих аналогов. Благодаря аффинному домену выделение и очистку интерферона-Р можно проводить на недорогих сорбентах практически безинструментально и в одну стадию получить препарат с чистотой целевого белка более 95%.

Полученный химерный белок, состоящий из коллаген-связывающего домена и костного морфогенетического белка 2, позволит создавать препараты для ускорения регенерации костной ткани, не уступающие по своим характеристикам существующим мировым аналогам. ВМР-2 является основным фактором, влияющим на скорость восстановления костной ткани и введение его в препараты для регенерации переломов и повреждений кости, а также в композиционные покрытия для имплантируемых материалов, позволяет в 2-3 раза повысить скорость восстановления костной ткани и снизить вероятность отторжения имплантатов. Особое значение данной части работы придает тот факт, что в настоящее время не существует отечественных коммерческих препаратов, содержащих рекомбинантный ВМР-2, в то время как в США и странах Западной Европы препараты на его основе уже прошли клинические испытания и применяются в медицинской практике. При этом такого рода препараты являются очень дорогостоящими. Рекомбинантный белок ВМР-2, полученный в работе, может быть использован для разработки отечественных препаратов ВМР-2 и решения важнейшей задачи импортозамещения.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на II Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, 6-8, октября, 2009), где работа

18 была удостоена I премии, также результаты работы были отмечены медалью конкурса работ молодых ученых, проводимого в рамках пятого международного конгресса Биотехнология 2009: состояние и перспективы развития (Москва, 16-20, марта, 2009). Кроме этого результаты работы были представлены на 4 международных и всероссийских конференциях: Первый международный форум по нанотехнологиям, Москва, 3-5 декабря 2008, международная конференция «Нанотехнологии в онкологии», Москва, 6 декабря 2008, Всероссийское совещание «Биоматериалы в медицине», Всероссийская научно-практическая конференция «Применение искусственных кальций-фосфатных биоматериалов в травматологии и ортопедии», Москва, 11-12 февраля 2010.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 в журналах, рекомендованных ВАК, 4 работы в сборниках тезисов всероссийских и международных конференций. На разработки, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, поданы 3 заявки на патент РФ.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Семихин, Александр Сергеевич

Выводы.

1. Сконструированы экспрессионные плазмиды, содержащие рекомбинантные гены коллаген-связывающего домена адгезина микроорганизма Staphylococcus aureus (SAu), коллаген-связывающих декапептидов из фактора Виллебранда человека (vWFHb vWFH2) и быка (vWFB), коллаген-связывающего домена из остеонектина человека (CollBD), декстран-связывающего домена из дестрансахаразы микроорганизма Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides (DBD), эпидермального фактора роста человека (EGF), фактора роста фибробластов человека (FGF), интерферона бета человека (IFN-3) и костного морфогенетического белка 2 человека (ВМР-2).

2. Получены штаммы Е. coli - продуценты химерных рекомбинантных белков DBD-EGF, ColBD-FGF, DBD-IFN-p и CollBD-BMP-2, имеющих в своем составе декстран-связывающий или коллаген-связывающий аффинные домены. Продукция целевых белков составляет от 5 до 30 % от тотального белка клетки.

3. Произведена оптимизация условий культивирования и экспрессии рекомбинантных белков в клетках Е. coli. При этом достигнуто увеличение уровня выхода рекомбинантных белков в 1,5-2 раза.

4. На основе технологии аффинных доменов отработаны методы очистки и иммобилизации на соответствующих сорбентах рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF, DBD-IFN-(3 и CollBD-BMP-2.

5. Показана биологическая активность препаратов рекомбинантных белков DBD-EGF, CollBD-FGF на эукариотических клетках in vitro. Белки DBD-EGF и CollBD-FGF вызывают ускорение роста культур клеток и могут быть использованы для модернизации имеющихся и разработки новых методик культивирования эукариотических клеток.

6. Биологическая активность полученных препаратов иммобилизованного на сорбенте рекомбинантного белка DBD-IFN-(3 при тестировании на

156 эукариотических клетках in vitro превышает активность исследованных коммерческих препаратов рекомбинантного интерферона бета человека.

7. Биологическая активность полученного препарата рекомбинантного белка CollBD-BMP-2 при тестировании на эукариотических клетках in vitro, сравнима с активностью коммерческого препарата ВМР-2.

8. Разработаны методики исследования скорости регенерации и оценки прочности врастания в костную ткань модельных металлических имплантатов, обработанных покрытием с рекомбинантным белком CollBD-BMP-2, на экспериментальных животных.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Семихин, Александр Сергеевич, 2010 год

1. Nygren, Р.А. Engineering proteins to facilitate bioprocessing / P.A. Nygren, S. Stahl, M. ЦЫёп // Trends Biotechnol. 1994. - Vol. 12. P. 184-188.

2. Scheich, C. An automated method for high-throughput protein purification applied to a comparison of His-tag and GST-tag affinity chromatography / C. Scheich, V. Sievert, K. Bussow // BMC Biotechnol. 2003. - Vol. 3. P. 12.

3. Smith, J.C. Chemical synthesis and cloning of a poly(arginine)-coding gene fragment designed to aid polypeptide purification / J.C. Smith et al. // Gene. -1984. Vol. 32. P. 321-327.

4. Hochuli, E. New metal chelate adsorbent selective for proteins and peptides containing neighbouring histidine residues / E. Hochuli, H. Dobeli, A. Schacher // J. Chromatogr.-1987. Vol.411. P. 177-184.

5. Blanar, M.A. Interaction cloning: identification of a helix-loop-helix zipper protein that interacts with c-Fos / M. A. Blanar, W. J. Rutter // Science. — 1992. -Vol. 256. P. 1014-1018.

6. Schmidt, T. G. M. Molecular interaction between the Strep-tag affinity peptide and its cognate target, streptavidin / T. G. M. Schmidt, et al. // J. Mol. Biol. -1996.-Vol. 255. P. 753-766.

7. Keefe, A. D. One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-affinity streptavidin-binding peptide, the SBP-Tag / A. D. Keefe, et al. // Protein Expr. Purif. 2001. - Vol. 23. P. 440-446.

8. Evan, G. 1. Isolation of monoclonal antibodies specific for human c-myc proto-oncogene product / G. I. Evan, et al. // Mol. Cell. Biol. 1985. - Vol. 5. P. 36103616.

9. Karpeisky, M. Y. Formation and properties of S-protein complex with S-peptidecontaining fusion protein / Karpeisky M. Y. et al. // FEBS Lett. 1994. -Vol. 339. P. 209-212.

10. McCormick, M., Purification and S-Tag detection of CBD fusion proteins / M. McCormick, J. Berg // Innovations. 1997. - Vol. 7. P. 12-15.

11. Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation / J. Porath, et al. // Nature. 1975. - Vol. 258. P. 598-599.

12. Zheng, C.-F. A new expression vector for high level protein production, one step purification and direct isotopic labeling of calmodulin-binding peptide fusion proteins / C.-F. Zheng, et al. // Gene. 1997. Vol. 186. P. 55-60.

13. Stofko-Hahn, R. E. A single step purification for recombinant proteins / R. E. Stofko-Hahn, D. W. Carr, J. D. Scott // FEBS Lett. 1992. - vol. 302. P. 274-278.

14. Tomme, P. Characterization and affinity applications of cellulose-binding domains / P.Tomme, et al. // J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1998. - Vol. 715. P. 283-296.

15. Xu, Z. Heavy metal removal by novel CBD-EC20 sorbents immobilized on cellulose / Z. Xu, et al. // Biomacromolccules. 2002. - Vol. 3. P. 462^465.

16. Watanabe, T. The role of the C-terminal domain and type III domains of chitinase Al from Bacillus circulans WL-12 in chitin degradation / T. Watanabe, et al. // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. P. 4465-4472.

17. Morisaki, H. Analysis of a dextran-binding domain of the dextranase of Streptococcus mutans / H. Morisaki, et al. // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - Vol. 35. P. 223-227.

18. Kaseda, K. A novel approach for purification of recombinant proteins using the dextran-binding domain / K. Kaseda. et al. // FEBS Lett. -2001. Vol. 3. P. 141144.

19. Рабинович, M. Jl. Прогресс в изучении целлюлолитических ферментов и механизм биодеградации высокоупорядоченных форм целлюлозы / М. Л. Рабинович, М. С. Мельник // Успехи биол. химии. 2000. С. 205—266.

20. Rabinovich, M. L. Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials by Microorganisms / M. L. Rabinovich // Pushchino: Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms. 1984. P. 31-48.

21. Рабинович, M. Л. Кинетические аспекты действия карбогидраз (лизоцим и целлюлолитические ферменты): дис. . канд. хим. наук. — М., 1977. С. 16.

22. Levy, I. Cellulose-binding domains: biotechnological applications / I. Levy, O. Shoseyov//Biotechnol. Adv. 2002. - Vol. 20. P. 191-213.

23. Гурвич, A. E. / Биохимия. 1957. - T.22, вып. 6. - С. 1028-1034.

24. Гурвич, А. Е., Кузовлева О. Б., Туманова А. Е. / А. Е. Гурвич, О. Б. Кузовлева, А. Е. Туманова // Биохимия. — 1961. — Т.26, вып.5. — С.934-942.

25. Гурвич, А. Е., Кузовлева О. Б., Орлов Г. Е. / А. Е. Гурвич, О. Б. Кузовлева, Г. Е. Орлов / Лаб. дело. 1967, №12. - С. 732-734.

26. Лунин, В. Г., Карягина-Жулина А. С., Лящук А. М. и др. / Патент РФ № 2270249 от 20 февраля 2006 г.

27. Лунин, В. Г., Карягина-Жулина А. С., Тихонова Т. В. и др. // Патент РФ №2278160 от 20 июня 2006 г.

28. Лящук, А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Биотехнология. — 2006, №5. С.23-32.

29. Лящук, А. М. Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. иммунобиол. 2006, № 4. - С.65-68.

30. Rabinovich, M. L. Materials of Soviet-Finland Seminar on Bioconversion of Plant Raw Materials by Microorganisms / M. L. Rabinovich // Pushchino: Institute of Biochemistry and Physiology of Microorganisms. 1984. P. 31-48.

31. Рабинович, M. JI. Кинетические аспекты действия карбогидраз (лизоцим и целлюлолитические ферменты): дис. . канд. хим. наук. -М., 1977. С. 16.

32. Levy, I. Cellulose-binding domains: biotechnological applications / I. Levy, O. Shoseyov // Biotechnol. Adv. 2002. - Vol. 20. P. 191-213.

33. Гурвич, A. E. / Биохимия. 1957. - T.22, вып. 6. - C.l028-1034.

34. Гурвич, A. E., Кузовлева О. Б., Туманова А. Е. / А. Е. Гурвич, О. Б. Кузовлева, А. Е. Туманова // Биохимия. 1961. - Т.26, вып.5. - С.934-942.

35. Гурвич, А. Е., Кузовлева О. Б., Орлов Г. Е. / А. Е. Гурвич, О. Б. Кузовлева, Г. Е. Орлов / Лаб. дело. 1967, №12. - С. 732-734.

36. Лунин, В. Г., Карягина-Жулина А. С., Лящук А. М. и др. / Патент РФ № 2270249 от 20 февраля 2006 г.

37. Лунин, В. Г., Карягина-Жулина А. С., Тихонова Т. В. и др. // Патент РФ №2278160 от 20 июня 2006 г.

38. Ляшук, А. М., Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Биотехнология. 2006, №5. — С.23-32.

39. Ляшук, А. М. Лунин В. Г., Карягина А. С. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. иммунобиол. 2006, № 4. — С.65-68.

40. Ogston, A. "On Abscesses". Classics in Infectious Diseases. / A. Ogston // Rev. Infect. Dis. 1984. - Vol. 6. P. 122-28.

41. Holderbaum, D. A. L. Collagen Binding to Staphylococcus aureus / D. A. L. Holderbaum, G. S. Hall // Microbiology. 1986. - Vol. 54. P. 359-364.

42. Cruz M., et al. // The Journal of biological chemistry. 1995. Vol. 270. P. 10822-10827.

43. Hohenester, E. Structural basis of sequence-specific collagen recognition by SPARC / E. Hohenester, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. - Vol. 105. P. 18273-18277.

44. Suwannarangsee, S. Search for a dextransucrase minimal motif involved in dextran binding / S. Suwannarangsee, et al. // FEBS Letters. 2007. - Vol. 581. P. 4675-4680.

45. Monchois, V. Glucansucrases: mechanism of action and structure-function relationships / V. Monchois, R-M. Willemot, P. Monsan // FEMS Microbiology Reviews.-1999.-Vol. 23. P. 131-151.

46. Monsan P. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria. / P. Monsan, et al. // Int. Dairy J. 2001. - V. 11. P. 675-685.

47. Kobayashi, M. Dextransu-crase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F: characterization of the enzyme bound to Sephadex gel / M. Kobayashi, K. Mihara, K. Matsuda // Agric. Biol. Chem. 1986. - Vol. 50. P. 551-557.

48. Paul, F. Production and purification of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides, NRRL В 512 (F) / F. Paul, et al. // Ann. NY Acad. Sci. 1984. -Vol. 434. P. 267-270.

49. Giffard, P.M. Definition of a fundamental repeating unit in streptococcal glucosyltransferase glucanbinding regions and related sequences / P.M. Giffard, N.A. Jacques // J. Dent. Res. 1994. Vol. 73. P. 1133-1141.

50. Miller, A.W. Milligram to gram scale purification and characterization of dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F / A.W. Miller, S.H. Eklund, J.F.Robyt // Carbohyd. Res. 1986. - Vol. 147. P. 119-133.

51. McCabe, M.M. Specific method for the purification of Streptococcus mutans dextransucrase / M.M. McCabe, E.E. Smith // Infect. Immun. 1977. - Vol.16. P. 760-765.

52. Anderson, G. W. Recombinant V antigen protects against pneumonic and bubonic plague caused by F1-capsule-positive and -negative strains of Yersinia pestis / G. W. Anderson, et al. // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. P. 4580-4585.

53. Broekhuijsen, M. P. Fusion proteins with multiple copies of the major antigenic determinant of foot-and-mouth disease virus protect both the natural hostand laboratory animals / M. P. Broekhuijsen, et al. // J. Gen.Virol. 1987. - Vol. 68. P. 3137-3143.

54. Clayton, M. A. Protective vaccination with a recombinant fragment of Clostridium botulinum neuro-toxin serotype A expressed from a synthetic gene in Escherichia coli. / M. A. Clayton, et al. // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63. P. 2738-2742.

55. Лящук, A. M. Получение и характеристика рекомбинантного белка TUL4, потенциального компонента генно-инженерной субъединичной противотуляремийной вакцины: дис. . канд. биол. наук. М., 2005. — 104 с.

56. Savage, С. R. Jr. Epidermal Growth Factor and a New Derivative. Rapid isolation procedures and biological and chemical charactrerization / C. R. Savage, S. Jr. Cohen // The journal of biological chemistry. 1972. - Vol. 247. P. 76097611.

57. Savage, C. R. Jr. The Primary Structure of Epidermal Growth Factor / C. R. Jr. Savage, T. Inagami, S. Cohen // The journal of biological chemistry. — 1972. — Vol. 23. P. 7612-7621.

58. Goodlad, R. A. Gastrointestinal epithelial cell proliferation / R. A. Goodlad // Dig Dis.-1989.-Vol. 7. P. 169-177.

59. Allen, G. Production of epidermal growth factor in Escherichia coli from a synthetic gene / G Allen, C. A. Paynter, M. D. Winther // J. Cell. Sci. Suppl. -1985. Vol. 3. P.29-38.

60. Tsang, M. W. The use of recombinant human epidermal growth factor (rhEGF) in a gentleman with drug-induced Steven Johnson syndrome / M. W. Tsang, K. Y. Tsang , W. K. Wong // Dermatol. Online J. 2004. Vol. 10. P. 25.

61. Florkiewicz, R. Z. Human basic fibroblast growth factor gene encodes four polypeptides: three initiate translation from non-AUG codons / R. Z.

62. Florkiewicz, A. Sommer // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 39783981.

63. Karpusas, M. The structure of human interferon-beta: implications for activity / M. Karpusas, et al. // Cell. Mol. Life Sci. 1998. - Vol. 54. P. 1203-1216.

64. Kaynor, C. Direct evidence that IFN-beta functions as a tumor-suppressor protein / C. Kaynor, et al. // J. Interferon Cytokine Res. 2002. - Vol. 22. P. 1089-1098.

65. Murata, M. A comparison of the antitumor effects of interferon-alpha and beta on human hepatocellular carcinoma cell lines / M. Murata et al. // Cytokine. -2006. — Vol. 33. P.121-128.

66. Wilderman, M. J. Intrapulmonary IFN-beta gene therapy using an adenoviral vector is highly effective in a murine orthotopic model of bronchogenic adenocarcinoma of the lung / M. J. Wilderman, et al. // Cancer Res. — 2005. -Vol. 65. P. 8379-8387.

67. Ройт, А. Иммунология / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл // М.: Мир. 2000.

68. Попов В.Ф. Лекарственные формы интерферонов / В.Ф. Попов, О. В. Попов // М.: Триада-Х. 2002. - С. 230.

69. Urist, М. R. Bone: formation by autoinduction / M. R. Urist // Science. 1965. Vol. 150. P. 893-899.

70. Reddi, A. H. Bone morphogenetic proteins: from basic science to clinical applications / A. H. Reddi // J. Bone Joint. Surg. Am. 2001. Vol. 83-A. P. 1-6.

71. Wozney, J. M. Overview of bone morphogenetic proteins / J. M. Wozney // Spine 2002. - Vol. 27. P. 2-8.

72. Koh, J. T. Combinatorial gene therapy with BMP2/7 enhances cranial bone regeneration / J. T. Koh, et al. // J. Dent. Res. 2008. Vol. 87. P. 845-849.

73. Paralkar, V. M. Cloning and characterization of a novel member of the transforming growth factor-beta/bone morphogenetic protein family / V. M. Paralkar, et al. //J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. P. 13760-13767.

74. Reddi, A.H. Morphogenesis and tissue engineering of bone and cartilage: inductive signals, stem cells, and biomimetic biomaterials / A. H. Reddi // Tissue Eng. 2000. - Vol. 6. P. 351-359.

75. Reddi, A.H. Interplay between bone morphogenetic proteins and cognate binding proteins in bone and cartilage development: noggin, chordin and DAN / A. H. Reddi // Arthritis Res. 2001. - Vol. 3. P. 1-5.

76. Granjeiro, J. M. Bone morphogenetic proteins: from structure to clinical use / J. M. Granjeiro // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 2005. P. 1463 - 1473.

77. Weber. A silent H-bond can be mutationally activated for high-affinity interaction of BMP-2 and activin type IIB receptor / Weber, et al. / BMC Structural Biology. 2007. - Vol. 7. P. 6.

78. Wang, E.A. Bone morphogenetic proteins (BMPs): therapeutic potential in healing bony defects / E. A. Wang // Trends Biotechnol. 1993. - Vol. 11. P. 379383.

79. Reddi, A.H. Role of morphogenetic proteins in skeletal tissue engineering and regeneration / A. H. Reddi // Nat. Biotechnol. 1998. - Vol.16. P. 247-252.

80. Reddi, A.H. Initiation of fracture repair by bone morphogenetic proteins/ A. H. Reddi // Clin. Orthop. Relat. Res. 1998. - Vol. 355. P. 66-72.

81. Rountree, R.B. BMP receptor signaling is required for postnatal maintenance of articular cartilage / R. B. Rountree, et al. // PLoS Biol. 2004. - Vol. 11. P. 355.

82. Jeppsson, C. A combination of bisphosphonate and BMP additives in impacted bone allografts / C. Jeppsson, et al. // Acta Orthop. Scand. 2003. - Vol. 74. P. 483-489.

83. Tsumaki, N. Bone morphogenetic protein signals are required for cartilage formation and differently regulate joint development during skeletogenesis / N. Tsumak, et al. // J. Bone Miner. Res. -2002. Vol. 17. P. 898-906.

84. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

85. Han, B. Quantitative and sensitive in vitro assay for osteoinductive activity of demineralized bone matrix / B. Han, B. Tang, M. E. Nimni // Journal of Orthopaedic Research. -2003. Vol. 21. P. 648-654.

86. Katagiri, T. Bone morphogenetic protein-2 converts the differentiation pathway of C2C12 myoblasts into the osteoblast lineage / T. Katagiri // J. Cell Biol. 1994. Vol. 127. P. 1755-1766.

87. Kim, I. S. Synergistic action of static stretching and BMP-2 stimulation in the osteoblast differentiation of C2C12 myoblasts / I. S. Kim, et al. // J. Biomech. — 2009. Vol. 8. P. 6.

88. Long, S., et al. Protein expression and purification. 2006 - V. 46, P. 374378.

89. Fiers, W. Cloning and expression of human interferon-beta: from be to ac / W. Fiers, et al. // Verh. K. Acad. Geneeskd. Belg. 2009. V. 71. P. 43-50.

90. Demain, A.L. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms / A. L. Demain, P. Vaishnav // Research Institute for Scientists Emeriti, Drew University, Madison, NJ 07940, USA.

91. Williams, J.A. Plasmid DNA vaccine vector design: impact on efficacy, safety and upstream production / J.A. Williams, A. E. Carnes, C. P. Hodgson // Nature Technology Corporation, Lincoln, NE 68521, USA.

92. Pltickthun, A. Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systems / A. Pltickthun // Biotechnology. 1991. - Vol. 9. P. 545551.

93. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli / F. Baneyx // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - Vol. 10. P. 411-21.

94. Cabrita, L.D., Bottomley S.P. Protein expression and refolding-a practical guide to getting the most out of inclusion bodies / L.D. Cabrita, S.P. Bottomley // Biotechnol. Annu. Rev. 2004. - Vol. 10. P. 31-50.

95. Long, J.Y. Refolding of recombinant proteins in vitro / J.Y. Long, H.X. Wang // Sheng Li Ke Xue Jin Zhan. 1998. - Vol. 29. P. 103-108.

96. Middelberg, A.P. Preparative protein refolding / A. P. Middelberg // Trends Biotechnol. 2002. - Vol. 20. P. 437-443.

97. Грачева M.A. Разработка компонентной базы на основе рекомбинантных а- и в-субъединиц рицина для создания тест-систем, антидотов и вакцин против отравлений рицином: дис. . канд. биол. наук. М., 2008 г. 152 с.

98. Ishikawa, Т. Production of a Biologically Active Epidermal Growth Factor Fusion Protein with High Collagen Affinity / T. Ishikawa, H. Terai, T. Kitajima // J. Biochem. -2001. Vol. 129. P. 627-633.

99. Andrades J. A. A recombinant human TGF-bl fusion protein with collagen-binding domain promotes migration, growth, and differentiation of bone marrow mesenchymal cells / J. A. Andrades, et al. // Experimental Cell Research. 1999. -Vol. 250. P. 485-498.

100. Andrades, J. A. Production of a recombinant human basic fibroblast growth factor with a collagen binding domain / J. A. Andrades, et al. // Protoplasma. — 2001.-Vol. 218. P. 95-103.

101. Karsten, H., Joanne, С. // The QIAexpressionist. Qiagen GmbH, Qiagen Inc. -1992.

102. Zhou, H. Enhanced bioactivity of bone morphogenetic protein-2 with low dose of 2-N, 6-O-sulfated chitosan in vitro and in vivo / H. Zhou, et al. // Biomaterials. 2009. - Vol. 30. P. 1715-1724.