Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 δ2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Смирнов, Сергей Васильевич

• Смирнов, Сергей Васильевич
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Смирнов, Сергей Васильевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи работы

Научная новизна и практическая значимость работы

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Оптимизация экспрессии гетерологичных генов в клетках Escherichia coli.

1.1 Основные компоненты экспрессионных векторов. Проблема стабилизация дозы рекомбинантного гена.

1.2 Регуляция транскрипции.

1.2.1. Промоторы.

1.2.1.1. lac-промотор и его производные.

1.2.1.2. рЕТ-векторы.

1.2.1.3. Другие индуцируемые промоторы.

1.2.2. Строго регулируемые экспрессионные системы.

1.2.3. Терминаторы транскрипции.

1.3 Регуляция трансляции.

1.3.1. Инициация трансляции мРНК.

1.3.2. Энхансеры трансляции мРНК.

1.3.3. Стабильность мРНК.

1.3.4. Элонгация трансляции.

1.3.5. Точность трансляции.

1.3.6. Терминация трансляции.

2. Структурно-функциональные аспекты гетерологичной экспрессии белков в клетках

Escherichia coli.

2.1. Цитоплазматическая продукция рекомбинантных белков.

2.1.1. Формирование дисульфидных связей в цитоплазме Е. coli.

2.1.2 Процессинг N-концевого метионинового остатка.

2.2. Молекулярные шапероны.

2.3. Секреция рекомбинантных белков.

2.3.1 Периплазматическая продукция рекомбинантных белков.

2.3.2 Экстраклеточная секреция рекомбинантных белков.

2.5. "Слитые" белки.

2.6. Деградация белков.

2.7. Рефолдинг белков-продкутов гетерологичного синтеза.

2.7.1. Выделение, очистка и солюбилизация телец включения.

2.7.2. Ренатурация белка

МА ТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы, плазмиды и среды.

Эксперименты с ДНК.

Конструирование рекомбинантного гена Ы1-482.

Конструирование синтетического гена gdnf.

Выделение и очистка белков.

Приготовление препарата телец включения ЫЬ-452.

Ренатурация и очистка ЫЬ-452.

Ренатурация и очистка ЫЬ-4.

Определение биологической активности Ы^452.

РЕЗУЛЬ ТА ТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Получение штаммов Escherichia coli - продуцентов делеционной формы интерлейкина-4 человека - hIL4-52.

1.1 Конструирование рекомбинантного гена hil-452 и его экспрессия в составе плазмиды pUCTIL-4d2.

1.2 Экспрессия гена Ы1-452 в составе рекомбинантных плазмид рВТ1Ь-4(12 и рЕТ1Ь-4с12.

2. Ренатурация и очистка рекомбинантного 111Ь-452.

3. Определение биологической активности препарата рекомбинантного ЫЬ-452.

4. Получение штаммов Escherichia coli— продуцентов нейротрофина глиального происхождения.

4.1 Конструирование синтетического гена нейротрофина глиального происхождения человека - gdnf

4.2 Экспрессия синтетического гена gdnf в составе рекомбинантной плазмиды pBT-GDNF.

4.3 Экспрессия синтетического гена gdnf в составе рекомбинантных плазмид pBT-lacI-GDNF, placl-GDNF и placIQ-GDNF.

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эффективная экспрессия в клетках Escherichia coli рекомбинантных генов цитокинов человека: делеционного варианта интерлейкина-4 (hil-4 δ2) и нейротрофина глиального происхождения (gdnf)»

Актуальность проблемы

Цитокины - это родовое название специализированных растворимых белков и пептидов, которые, действуя как гуморальные иммуномодуляторы на отдельные клетки или ткани, принимают участие в регуляции таких важных биологических процессов как гемопоэз, иммунный ответ, тканеспецифическая клеточная пролиферация, апоптоз. В настоящее время во многих научно-исследовательских центрах мира проводятся интенсивные работы по изучению возможности использования цитокинов для диагностики и лечения различного рода патологий иммунной системы [Егорова и др., 1998; Martino et al., 2000], вирусных инфекций [Tovey et al., 1999; Carreno et. al., 2000; Тимченко и др., 2001], а также в комплексной терапии широкого спектра онкологических заболеваний [Tagawa 2000; Bukowski 2001]. Объектами подобных исследований являются, в частности, делеционная форма интерлейкина-4 человека - hIL-482 [Arinobu et al, 1999; Glare et al., 2001; Sea et al., 2001] и нейротрофин глиального происхождения человека GDNF [Lapchak et al, 1997; Espejo et al., 2001; Zurn et al., 2001].

Изучение экспрессии гена интерлейкина-4 человека (hil-4) показало, что в Т-лимфоцитах периферической крови человека и тимоцитах вместе с мРНК hil-4 экспрессируется и ее делеционный вариант, у которого в процессе специфического (альтернативного) сплайсинга происходит элиминация участка нуклеотидной последовательности, соответствующей экзону 2, а участки, соответствующие экзонам 1, 3 и 4, образуют непрерывную рамку считывания для природной делеционной изоформы интерлейкина-4 - hIL-452 [Sorg et al., 1993]. Эксперименты in vitro с рекомбинантным hIL-452 показали, что этот белок является природным антагонистом hIL-4. В частности, ML4-52 ингибирует как костимулирующее действие hIL-4 на активированные Т-лимфоциты периферической крови человека, так и активацию hIL-4 синтеза IgE и экспрессию CD23 в В-лимфоцитах [Atamas et al., 1996; Arinobu et al., 1999]. В моноцитах hlL-482, напротив, блокирует ингибирующее действие hIL-4 на LPS-индуцируемый синтез циклооксигеназы-2 и последующую секрецию простагландина Е2 [Arinobu et al., 1999]. Результаты исследований позволяют говорить о значительном терапевтическом потенциале hIL-482 как природного антагониста интерлейкина-4.

Другой представитель семейства цитокинов - GDNF-(Glial Cell Derived Neurotrophic Factor), был впервые очищен и исследован в 1993 году. Оказалось, что данный белок способствует выживанию эмбриональных допаминергических нейронов среднего мозга, дегенерирующих при болезни Паркинсона. [Lin et al., 1993], и является ростовым фактором для спинномозговых моторных нейронов [Henderson et al., 1994]. Было показано, что GDNF способствует регенерации сенсорных аксонов при травмах позвоночника [Ramer et al., 2000], участвует в процессах сперматогенеза [Meng et al 2000] и морфогенеза почек [Pichel et al., 1996]. GDNF обладает большим терапевтическим потенциалом и может быть использован для лечения многих нейропатологий, включая болезнь Паркинсона, боковой амиотрофический склероз и др. [Lin et al., 1993; Hunot et al., 1996; Bohn 1999; Ozawa et al., 2000].

Одной из основных проблем, возникающих при разработке лекарственных препаратов или диагностических систем на основе цитокинов и подобных им белков, является невозможность выделения этих биомолекул из их природных источников в количествах, достаточных для организации масштабного фармакологического производства. В этой связи, чрезвычайно актуальной становится задача разработки способов получения биологически-активных рекомбинантных аналогов природных белков, в частности, путем оптимизации гетерологичной экспрессии соответствующих генов в бактериальных клетках Escherichia coli.

Цели и задачи работы

Целью представляемой работы было создание на основе клеток E.coli высокоэффективных штаммов-продуцентов рекомбинантных hIL-482 и GDNF. В процессе работы решались следующие задачи:

1. Конструирование синтетических генов, соответствующих процессированным формам белков hIL-452 и GDNF, с оптимизированными для трансляции в клетках Е. coli нуклеотидными последовательностями.

2. Конструирование плазмидных векторов, обеспечивающих эффективную экспрессию в клетках E.coli рекомбинантных генов hil-482 и gdnf.

3. Разработка лабораторной процедуры ренатурации рекомбинантного hIL-482.

4. Исследование биологической активности препарата рекомбинантного hIL-482.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые в клетках Escherichia coli осуществлена высокоэффективная экспрессия генов hil-452 и gdnf, а также - сконструированы штаммы-продуценты соответствующих рекомбинантных цитокинов. Для достижения максимальной продукции целевых белков учитывался целый ряд факторов, влияющих на эффективность процессов транскрипции и трансляции гетерологичных генов в Е. coli. В частности, проведен комплексный анализ первичной и потенциальной вторичной структур нативной мРНК gdnf, на основании которого разработана схема конструирования трансляционных модулей, состоящих из искусственного участка связывания рибосом (RBS) и синтетического рекомбинантного гена gdnf с оптимизированным для трансляции в Е. coli кодоновым составом. При выборе основных параметров экспрессионных векторов (копийность и стабильность репликона, «сила» и «строгость» регуляции промотора, эффективность RBS) были учтены как токсичное действие обоих гетерологичных белков на бактериальные клетки, так и влияние относительной скорости клеточного биосинтеза целевых белков на процесс формирования структуры образуемых ими телец включения.

Исходя из особенностей формирования третичной структуры делеционной формы интерлейкина-4, разработана лабораторная методика его ренатурации и очистки из нерастворимой клеточной фракции «телец включения». Исследована биологическая активность рекомбинантного hIL-452. Показано, что ренатурированный in vitro hIL-4<52 ингибирует костимулирующее действие hIL-4 на активированные тимоциты человека и установлено, что данный эффект усиливается в присутствии циклоспорина А. Данные по биологической активности ренатурированного hIL-452 согласуются с результатами, полученными в аналогичных экспериментах с белком, продуцируемым в растворимой форме в клетках РгсМарайШНБ [А1атаз е1 а!., 1996].

Штамм-продуцент ЫЬ-482 и препарат белка переданы в Институт инженерной иммунологии, а также в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН для дальнейших структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4.

Штамм-продуцент рекомбинантного вБЫР передан в лабораторию НПЦ «Фосфосорб», для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Среди многочисленных доступных на сегодняшний день про- и эукариотических систем экспрессии рекомбинантных белков кишечная палочка Escherichia coli (Е. coli) остается одним из наиболее востребованных биологических объектов в фармацевтической биотехнологии. Высокая плотность культуры продуцирующих клеток и их быстрый рост на относительно недорогих субстратах позволяют во многих случаях добиться существенного снижения себестоимости конечного продукта, даже с учетом необходимости соблюдения строгих стандартов качества, предъявляемых к фармакологическим препаратам [Swartz 2001]. Как правило, почти любая работа по гетерологичному синтезу белка начинается с попытки экспрессировать соответствующий рекомбинантный ген в клетках Е. coli. Альтернативные системы экспрессии используются, только если для биологической активности белка необходима сложная посттрансляционная модификация или при наличии непреодолимых проблем связанных с его фолдингом или ренатурацией [Makrides, 1996; Машко, 1998; Jonasson et al 2002]. Кроме «технологического» аспекта, при выборе бактериальной системы экспрессии решающую роль играет детальное знание молекулярной биологии Е. coli и развитая генная инженерия этого микроорганизма.

Процесс ко-трансляционного формирования структуры эукариотического белка в бактериальной клетке обладает одной характерной особенностью. При сравнительно малом уровне продукции гетерологичного полипептида (0,01-0,1% от суммарного клеточного белка) соответствующий белок, как правило, растворим, при повышении уровня экспрессии обнаруживаются как растворимые, так и нерастворимые формы белка, а при дальнейшем возрастании уровня экспрессии до 5-10% или выше от суммарного клеточного белка - практически весь синтезируемый рекомбинантный белок обнаруживается в виде нерастворимых «телец включения» (inclusion body) [Стронгин 1990]. Критические значения внутриклеточной концентрации и скорости биосинтеза, равно как «технологические» и «экономические» параметры процессов ренатурации и очистки специфичны для каждого конкретного белка. Поэтому в одних случаях выгодно добиваться максимального выхода его растворимой формы (стратегия «максимального качества»), а в других - полностью переводить целевой белок в нерастворимую фракцию «телец включения» (стратегия «максимального количества»). Очевидно, что для успешной реализации каждой из этих стратегий необходимо: во-первых, уметь регулировать скорость биосинтеза рекомбинантного полипептида, а во-вторых - влиять на процессы котрансляционного формирования третичной структуры белка, посттрансляционного процессинга (в частности - протеолиза) и межкомпартментного транспорта (секреция целевого белка в периплазму или культуральную среду). Кроме того, если гетерологичный белок продуцируется в форме нерастворимых «телец включения», то для получения его растворимой функционально-активной формы необходимы стадии ренатурации и очистки.

Исходя из того, что основной целью представляемой работы была эффективная продукция цитокинов человека в клетках Е. coli, данный Обзор литературы посвящен анализу современных подходов к решению задачи оптимизации гетерологичной продукции белков в клетках Е. coli, которая, как было указано выше, имеет два четко выраженных аспекта. Первый - это комплекс задач по обеспечению эффективной экспрессии гетерологичного гена, то есть, создание экспрессионной системы с оптимальными, в рамках выбранной стратегии, скоростями транскрипции целевой кДНК и трансляции соответствующей мРНК. Второй - структурно-функциональный аспект, включает в себя задачи эффективного и целенаправленного использования бактериальных систем фолдинга и секреции белков, регуляции клеточных редокс-потенциала и профиля протеолитической активности, разработки общих подходов к проблеме ренатурации белка in vitro.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Смирнов, Сергей Васильевич

ВЫВОДЫ

1. Получены синтетические гены делеционной формы интерлейкина-4 человека (hil-482) и нейротрофина глиального происхождения (gdnj) с оптимизированным для трансляции в клетках Е. coli кодоновым составом.

2. Осуществлено конструирование экспрессионных векторов, способных обеспечить высокоэффективную и строго регулируемую экспрессию генов hil-4S2 и gdnf, на основе которых созданы штаммы-продуценты делеционной формы интерлейкина-4 человека (hIL-4<S) и нейротрофина глиального происхождения (GDNF).

3. Разработана лабораторная методика ренатурации и очистки из телец включения рекомбинантного hIL-4^2.

4. Исследована биологическая активность делеционной формы интерлейкина-4. Показано, что in рекомбинантный hIL-4<52 ингибирует костимулирующее действие hIL-4 на активированные тимоциты человека. Установлено, что данный эффект усиливается в присутствии циклоспорина А.

5. Штамм-продуцент hIL-452 и препарат белка переданы в Институт инженерной иммунологии, для структурно-функциональных исследований рекомбинантного делеционного варианта интерлейкина-4. Препарат белка hIL-452 передан в Институт Цитологии Новосибирского отделения РАМН, для изучения роли этого цитокина в тканеспецифической регуляции иммунных реакций и на разных этапах онтогенетического развития. Штамм-продуцент рекомбинантного GDNF передан в лабораторию НПЦ «Фосфосорб», для дальнейших исследований по изучению возможности создания на его основе эффективных лекарственных биопрепаратов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Смирнов, Сергей Васильевич, 2003 год

1. Adams, J. М. (1968) On the release of the formyl group from nascent protein. J. Mol. Biol. 33: 571-589.

2. Adhya, S. and Gottesman, M. (1982) Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity. Cell 29: 939-944.

3. Allen, S.P., Polazzi, J.O., Gierse, J.K., Easton, A.M. (1992) Two novel heat shock genes encoding proteins produced in response to heterologous protein expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:6936-6941.

4. Arenas, E., Trupp, M., Akerud, P. & Ibanez, C.F. (1995) GDNF prevents degeneration and promotes the phenotype of brain noradrenergic neurons in vivo. Neuron 15:1465-1471.

5. Atamas, S.P., Choy, J., Yurovsky, V.V., White, B. (1996) An alternative splice variant of human IL-4, IL-452, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation. J. Immunol. 156:435-441.

6. Balakrishnan, R., Bolten, В., Backman, K.C. (1994) A gene cassette for adapting Escherichia coli strains as hosts for a//-Int-mediated rearrangement and PL expression vectors. Gene 138: 101-104.

7. Balbas, P., Bolivar, F. (1990) Design and construction of expression plasmid vectors in Escherichia coli. Methods Enzymol. 185: 14-37.

8. Banchereau J., Bidaud, C., Fluckiger, A., Galibert, L., Garrone, P., Malisan, F. & Pandrau, D. (1993) Effects of interleukin 4 on human В cell growth and differentiattion. Res. Immunol. 144:625-631.

9. Baneyx, F. (1999) Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10: 411-421.

10. Bardwell, J. C. A. (1994) Building bridges: disulfide bond formation in the cell. Mol. Microbiol. 14: 199-205.

11. Bechhofer, D. (1993) 59 mRNA stabilizers, p. 31-52. In J. G. Belasco and G. Brawerman (ed.), Control of messenger RNA stability. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

12. Belasco, J. G., G. Nilsson, A. von Gabain, and S. N. Cohen. (1986) The stability of£. coli gene transcripts is dependent on determinants localized to specific mRNA segments. Cell 46:245-251.

13. Ben-Bassat, A., Bauer, K., Chang, S.-Y., Myambo, K., Boosman, A., Chang, S. (1987) Processing of the initiation methionine from proteins: properties of the Escherichia coli methionine aminopeptidase and its gene structure. J. Bacteriol. 169: 751-757.

14. Bessette, P-H., Aslund, F., Beckwith, J., Georgiou, G. (1999) Efficient folding of proteins with multiple disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 96:13703-13708.

15. Bjornsson, A., S. Mottagui-Tabar, and L. A. Isaksson. (1996) Structure of the C-terminal end of the nascent peptide influences translation termination. EMBOJ. 15: 1696-1704.

16. Blackwell, J. R. and Horgan, R. (1991) A novel strategy for production of a highly expressed recombinant protein in an active form. FEBS Lett. 295: 10— 12.

17. Blight, M. A., Chervaux, C., and Holland, I. B. (1994) Protein secretion pathways in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. 5: 468—474.

18. Bogosian, G., Violand, B. N., Dorward-King, E. J., Workman, W. E., Jung, P. E., and Kane, J. F. (1989) Biosynthesis and incorporation into protein of norleucine by Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264: 531-535.

19. Bohn, M. (1999) A commentary on glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF). From a glial secreted molecule to gene therapy. Biochem Pharmacol. 57(2): 135-142.

20. Bowden, G. A., and Georgiou, G. 1988. The effect of sugars on b-lactamase aggregation in Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 4: 97-101.

21. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method of for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the priciple of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

22. Brinkmann, U., Mattes, R. E., and Buckel P. (1989) High-level expression of recombinant genes in Escherichia coli is dependent on the availability of the dnaY gene product. Gene 85: 109-114.

23. Brosius, J., Erfle, M., Storella, J. Spacing of the -10 and -35 regions in the tac promoter. (1985) Effect on its in vivo activity. J Biol Chem. 260(6):3539-3544.

24. Brosius, J., Ullrich A., Raker, M.A., Gray, A., Dull, T.J.,Gutell, R.G., Noller, H.F. (1981) Construction and fine mapping of recombinant plasmids containing the rrnB ribosomal RNA operon of E.coli. Plasmid 6: 112-118.

25. Brown, W.C. and Campbell, J.L. (1993) A new cloning vector and the expression strategy for genes encoding proteins toxic to Escherichia coli. Gene. 127: 99-103.

26. Bukau, B., Horwich, A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 92: 351-366.

27. Bukowski TP, Sedberry S, Richardson B. Straten. (2001) Is human chorionic gonadotropin useful for identifying and treating nonpalpable testis? J Urol. 165(l):221-226.

28. Butler, J.S., Springer, M., Grunberg-Manago, M. (1987) AUU-to-AUG mutation in the initiator codon of the translation initiator factor IF3 abolishes translational autocontrol of its own gene (infC) in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 4022-4025.

29. Carpousis, A.J., Vanzo, N.F., Raynal, L.C. (1999) mRNA degradation: a tail of poly(A) and multiprotein machines. Trends Genet. 15: 24-28.

30. Chang, J.Y. and Swartz, J.R. (1993) Single-step solubilization and folding of IGF-I aggregates from Escherichia coli. In: Protein Folding in vivo and in vitro. Cleland J.I., Ed. ACS Symposium Series 526. Washington. D.C. p. 178189.

31. Chao, Y.-P., Chiang, C.-J., Lo T.-E., Fu, H. 2000. Overproduction of D-hydantoinase and carbamoylase in a soluble form in Escherichia coli. Appl. Microbiol Biotechnol. 54: 348-353.

32. Cheah, K. C., Harrison, S., King, R., Crocker, L., Wells, J. R. E. and Robins, A. (1994) Secretion of eukaryotic growth hormones in Escherichia coli is influenced by the sequence of the mature proteins. Gene 138: 9-15.

33. Chen, C.-Y. A., Beatty, J. T., Cohen, S. N., and Belasco, J. G. (1988) An intercistronic stem-loop structure functions as an mRNA decay terminator necessary but insufficient for puf mRNA stability. Cell 52: 609-619.

34. Chen, G.-F. T., and Inouye, M. (1994). Role of the AGA/AGG codons, the rarest codons in global gene expression in Escherichia coli. Genes Dev. 8: 2641-2652.

35. Chen, G.-F. T., and Inouye, M. 1990. Suppression of the negative effect of minor arginine codons on gene expression: preferential usage of minor codons within the first 25 codons of the Escherichia coli genes. Nucleic Acids Res. 18: 1465-1473.

36. Chen, H.-Y., Pomeroy-Cloney, L., Bjerknes, M., Tam, J., Jay, E. (1994) The influence of adenine-rich motifs in the 3' portion of the ribosome binding site on human IFN-y gene expression in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 240: 2027.

37. Chen, L.-H., S. A. Emory, A. L. Bricker, P. Bouvet, and J. G. Belasco. (1991) Structure and function of a bacterial mRNA stabilizer: Analysis of the 59 untranslated region of ompA mRNA. J. Bacteriol. 173: 4578-4586.

38. Chen, W., Kallio, T., Bailey, J.E. (1995) Process characterization of a novel cross-regulation system for cloned protein production in Escherichia coli. Boitechnol. Prog. 11: 397-402.

39. Chopin, M-C., Chopin, A., Ronault, A., Galleron, M. (1989) Insertion and amplification of foreign genes in the Lactococcus lactis subsp. lactis chromosome. Appl.Environ. Microbiol. 55:1769-1774.

40. Clark, E. (1999) Protein refolding for industrial processes. Current Opinion in Biotechnology 12:202-207.

41. Cleland, J. I., (1993) Impact of protein folding on biotechnology. In: Protein Folding in vivo and in vitro. Cleland J.I., Ed. ACS Symposium Series 526. Washington. D.C. p. 1-18.

42. Coburb, G.A., Mackie, G.A. 1999. Degradation of mRNA in Escherichia coli: an old problem with some new twists. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 62: 55-108.

43. Coyle, J.E., Jaeger, J., Gross, M., Robinson, C.V., Radford, S.E. (1997) Structural and mechanistic consequences of polypeptide binding by GroEL. Fold. Des. 2: 93-104.

44. Crawford, R., Finbloom, D„ Ohara, J., Paul W. & Meltzer, M. (1987) B cell stimulatory factor-1 (interleukin-4) activates macrophages for increased tumoricidal activity and expression of 1 a antigens. J. Immunol. 139:135-141.

45. Dalboge, H., Dahl, H.-H. M., Pedersen, J., Hansen, J. W., Christensen, T. (1987) A novel enzymatic method for production of authentic hGH from an Escherichia coli produced hGH-precursor. Bio/Technology 5: 161-164.

46. Derman, A. I., Prinz, W. A., Belin, D., and Beckwith, J. (1993). Mutations that allow disulfide bond formation in the cytoplasm of Escherichia coli. Science 262: 1744-1747.

47. Dix, D.B., and Thompson, R.C. (1989). Codon choice and gene expression: synonymous codons diffe in translation accuracy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6888-6893.

48. Donovan, W. P., and S. R. Kushner. (1986) Polynucleotide phosphorylase and ribonuclease II are required for cell viability and mRNA turnover in Escherichia coli K-12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 120-124.

49. Duvoisin, R. M., D. Belin, and H. M. Krisch. (1986) A plasmid expression vector that permits stabilization of both mRNAs and proteins encoded by the cloned genes. Gene 45: 193-201.

50. Emory, S. A., P. Bouvet, and J. G. Belasco. (1992) A 59-terminal stem-loop structure can stabilize mRNA in Escherichia coli. Genes Dev. 6: 135-148.

51. Estrem, S.T., Gaal, T., Ross, W., Gourse, R. L. (1998) Identification of an UP element consensus sequence for bacterial promoters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95: 9761-9766.

52. Etchegaray, J.P., Inouye, M. (1999) Translational enhancement by an element downstream of the initation codon in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 274: 10079-10085.

53. Fahnestock, S. R., Irwin, S. L., (1997)Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 47(l):23-32.

54. Figge, J., Wright, C., Collins, C. J., Roberts, T. M., and Livingston, D. M. (1988) Stringent regulation of stably integrated chloramphenicol acetyl transferase genes by E. coli lac repressor in monkey cells. Cell 52:713-718.

55. Fischer, B., Sumner, I., Goodenough, P., (1993) Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukariotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies. Biotechnol. Bioeng. 41: 3-13.

56. Forrer, P. and Jaussi, R. (1998) High-level expression of soluble heterologous proteins in the cytoplasm of Escherichia coli by fusion to the bacteriophage lambda head protein D. Gene 224: 45-52.

57. Frankel, S., Sohn R., Leinwand, L., (1991) The use of sarcosyl in generating soluble protein after bacterial expression. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 1192-1196.

58. Friehs K, Reardon KF. (1993) Parameters influencing the productivity of recombinant E. coli cultivations. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 48:53-58.

59. Garcia, G. M., P. K. Mar, D. A. Mullin, J. R. Walker, and N. E. Prather. (1986) The E. coli dnaY gene encodes an arginine transfer RNA. Cell 45: 453-459.

60. Georgiou, G. (1996) in Protein engineering: Principles and Practice (Cleland, J. L. and Craik, C. S., eds.), pp. 101-127, Wiley-Liss, New York.

61. Georgiou, G., Valax, P. (1999) Isolation inclusion bodies from bacteria. Methods. Enzymol. 309:48-58.

62. Giladi, H., Koby, S., Gottesman, M.E., Oppenheim, A.B. (1992) Supercoiling, integration host factor, and a dualpromoter system, participate in the control of the bacteriophage X pL promoter. J. Mol. Biol. 224: 937-948.

63. Glare, E.M,. Divjak, M., Rolland, J.M., Walters, E.H. (1999) Asthmatic airway biopsy specimens are more likely to express the IL-4 alternative splice variant IL-4delta2. J Allergy Clin Immunol 104(5):978-982.

64. Glascock, C.B., Weickert, M.J. (1998) Using chromosomal lacIQX to control expression of genes on high-copy number plasmids in Escherichia coli. Gene 223: 221-231.

65. Goff, S. A. and Goldberg, A., L. (1985) Production of abnormal proteins in E. coli stimulates transcription of Ion and other heat shock genes. Cell 41:587595.

66. Gold, L. and Stormo, G.D. (1990) High-level translation initiation. Methods Enzymol. 185: 89-93.

67. Goldman, E., Rosenberg, A. H., Zubay, G., and Studier, F. W. (1995) Consecutive low-usage leucine codons block translation only when near the 5'-end of a message in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 245: 467-473.

68. Gottesman, S. (1999) Regulation of proteolysis: developmental switches. Current Opinion in Microbiology 2:142-147.

69. Grossman, T.H., Kawasaki, E.S., Punreddy, S.R., Osbune, M.S. (1998) Spontaneous cAMP-dependent derepression of gene expression in stationary phase plays a role in recombinant expression instability. Gene 209: 95-103.

70. Gutman, G. A. and Hatfield, G. W. (1989) Nonrandom utilization of codon pairs in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3699-3703.

71. Hall, M.N., Gabay, J., Debarbouille, M., Schwartz, M. (1982) A role for mRNA secondary structure in the control of translation initiation. Nature (London) 295:616-618.

72. Hancock, R.E.W. (1983) Alternations in outer membrane permeability. Annu.Rev.Microbiol. 38: 237-247.

73. Hayashi, M.N., Hayashi, M. (1985) Cloned DNA sequences that determine mRNA stability of bacteriophage <f)X174 in vivo are functional. Nucleic Acids Res. 13: 5937-5848.

74. Henderson, C.E., Philips, H.S., Pollock, R.A., Davies A.M., Armanini, M., Simmons, L., Moffet, B„ Vandlen, R.A. & Simmons, L. (1994) GDNF: a potent survival factor for motoneurons present in peripheral nerve and muscle. Science 266:1062-1067.

75. Higgins, C. F„ H. C. Causton, G. S. C. Dance, and E. A. Mudd. (1993) The role of the 39 end in mRNA stability and decay, p. 13-30. In J. G. Belascoand G. Brawerman (ed.), Control of messenger RNA stability. Academic Press, Inc., San Diego, Calif.

76. Hirota, Y., Suzuki, H., Nishimura, Y., Yasuda, S. 1977. On the process of cellular division in Escherichia coli: a mutant of E.coli lacking a murein-lipoprotein. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74: 1417-1422.

77. Hottenrott, S., Schumann, T., Pluckthun, A., Fischer, G., Rahfeld, J.-U. (1997) The Escherichia coli SlyD is a metal ion-regulated peptidyl-prolyl cis/trans isomerase. J. Biol. Chem. 272: 15697-15701.

78. Howard, M., Farrar, J., Hilfike,r M., Johnson, B., Takatsu, K., Hamaoka, T., Paul W. E. (1982) Identification of a T cell derived B cell growth factor distinct from interleukin-2. J. Exp. Med. 155:914-923.

79. Hsiung, H. M., Cantrell, A., Luirink, J., Oudega, B., Veros, A. J., and Becker, G. W. (1989) Use of bacteriocin release protein in E. coli for excretion of human growth hormone into the culture medium. Bio/Technology 7: 267-271.

80. Hsiung, H. M., Mayne, N. G., and Becker, G. W. (1986) High-level expression, efficient secretion and folding of human growth hormone in Escherichia coli. Bio/Technology 4: 991-995.

81. Huh, K. R., Cho, E. H., Lee, S. O., Na, D. S. (1996) High level expression of human lipocortin (annexin) 1 in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 18: 163168.

82. Hwang, C., Sinskey, A. J., Lodish, H. F. (1992) Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. Science 257: 1496-1502.

83. Illera, V., Perdandones, C., Stünz, L., Mower, D. & Ashman. (1993) Apoptosis in splenic B lymphocytes:regulation by protein kinase C and IL-4. J. Immunol. 151:3521-3526.

84. Jaenicke, R., Rudolf, R. (1989) Folding protein, pp.191-223. In: T. E/ Creighton (ed.), Protein structure, a practical approach. Oxford University Press, Oxford, UK.

85. Jonasson, P., Liljeqvist, S., Nygren, P-A., Stahl, S. (2002) Genetic design for facilitated production and recovery of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem. 35:91-105.

86. Kapust, R.B. and Waugh, D.S. (1999) Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sei. 8: 1668-1674.

87. Kavanaugh, J. S., Rogers, P. H., Arnone, A. (1992) High-resolution X-ray study of deoxy recombinant human hemoglobins synthesized from b-glo-bins having mutated amino termini. Biochemistry 31: 8640-8647.

88. Kenealy, W. R., Gray, J. E., Ivanoff, L. A., Tribe, D. E., Reed, D. L., Korant, B. D. and Petteway, S. R., Jr. (1987) Solubility of proteins overexpressed in Escherichia coli. Dev. Ind. Microbiol. 28: 45-52.

89. Kern, I., and Ceglowski, P. (1995) Secretion of streptokinase fusion proteins from Escherichia coli cells through the hemolysin transporter. Gene 163: 53-57.

90. Kimmenade, A., Bond, M. W., Schumacher, J. H., Laquoi, C., Kastelein, R. A. (1988) Expression, renaturation and purification of recombinant human interleukine 4 from Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 173:109-114.

91. Kitai, K., Kudo T., Nakamura, S., Masegi, T., Ichikawa, Y., and Horikoshi, K. 1988. Extracellular production of human immunoglobulin G Fe region (hlgG-Fc) by Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28: 52-56.

92. Kleerebezem, M. and Tommassen, J. (1993) Expression of the pspA gene stimulates efficient protein export in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 7: 947-956.

93. Laemmli, V.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685.

94. Lanzer, M., Bujard, H. (1988) Promoters largely determine the efficiency of repressor action. Proc. Natl. Acad. Sei. 85: 8973-8977.

95. Lapchak, P.A., Gash, D. M., Jiao, S., Miller, P. J., Hilt, D. (1997) Glial cell line-derived neurotrophic factor: a novel therapeutic approach to treat motor dysfunction in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 144(1 ):29-34.

96. Lee, Y., Oelkuct, M., Gentz, R. Method for pyrifying chemokines from inclusion bodies. US patent 1999 591 12327.

97. Liew, O.W., Choo A.B-H., Too, H.P. (1997) Parameters influencing the expression of mature glial-cell-line-derived neurotrophic factor in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem. 25:223-233.

98. Lin, L-F.H., Doherty, D.H., Lile, J.D., Bektesh, S & Collins, F. (1993) GDNF: a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons. Science 260:1130.

99. Makrides, S.C. (1996) Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Reviews. 60:512-538.

100. Minas, W., and Bailey, J. E. (1995) Co-overexpression ofprlF increases cell viability and enzyme yields in recombinant Escherichia coli expressing Bacillus stearothermophilus a-amylase. Biotechnol. Prog. 11: 403-411.

101. Minsky, A., Summers, R. G., and Knowles, J. R. (1986) Secretion of beta-lactamase into the periplasm of Escherichia coli: evidence for a district release step associated with a conformational change. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 83:4180-4184.

102. Miroux, B., Walker, J. (1996) Over-production of protein in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J.Mol.Biol. 260: 289-298.

103. Mitchell, L., Davis, L. & Lipsky, P. (1989) Promotion of human T lymphocyte proliferation by IL-4. J. Immunol. 142:1548-1557.

104. Muller, J., Oehler, S., Muller-Hill, B. (1996) Repression of lac promoter as a function of distance, phase and quality of an auxiliary lac operator. J. Mol. Biol. 257:21-29.

105. O'Connor, C.D. and Timmis, K.N., (1987) Highly repressible expression system for cloning genes that specify potentially toxic proteins. J. Bacteriol. 169: 4457-4462.

106. Olins, P. O., Rangwala, S. H. (1990) Vector for enhanced translation of foreign genes in Escherichia col\. Methods Enzymol. 185: 115-119.

107. Olins, P. O., Rangwala, S. H. (1989) A novel sequence element derived from bacteriophage T7 mRNA acts as an enhancer of translation of the lacZ gene in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264: 16973-16976.

108. Olsen, M.K., Rockenbach, S.K., Curry, K.A., Tomich, C.-S.C. (1989) Enhancement of heterologous polypeptide expression by alterations in the ribosome-binding site sequence. J. Biotechnol. 9: 179-190.

109. Olson, P., Zhang, Y., Olsen, D., Owens, A., Cohen, P., Nguyen, K., Ye, J-J., Bass, S., Mascarenhas, D.(1998) High-level expression of eukaryotic polypeptides from bacterial chromosomes. Protein. Expr. Purif. 14:160-166.

110. Omer, C. A., Diehl, R. E., Krai, A. M. (1995) Bacterial expression and purification of human protein prenyltransferases using epitope-tagged, translationally coupled systems. Methods Enzymol 250: 3-12.

111. Ozawa, K., Fan, D.S., Shen, Y., Muramatsu, S., Fujimoto, K., Ikeguchi, K., Ogawa, M., Urabe, M.,Kume, A., Nakano, I. (2000) Gene therapy of Parkinson's disease using adeno-associated virus (AAV) vectors. J. Neural. Transm. Suppl. 58:181 -191.

112. Pe'rez-Pe'rez, J., G. Ma'rquez, J.-L. Barbero, and J. Gutie'rrez. (1994) Increasing the efficiency of protein export in Escherichia coft. Bio/Technology 12: 178-180.

113. Peredelchuk, M. Y., Bennett, G. N. (1997) A method for construction of E. coli strains with multiple DNA insertions in the chromosome. Gene 187:231238.

114. Phadtare, S., Alsina, J., Inouye, M. (1999) Cold-shock response and cold-shock proteins. Curr. Opin. Microbiol. 2: 175-180.

115. Poole, E. S., Brown, C. M., and Tate, W. P. (1995) The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli. EMBOJ. 14: 151-158.

116. Proba, K., Ge L. M., Pluckthun, A. (1995) Functional antibody single-chain fragments from the cytoplasm of Escherichia coli: influence of thioredoxin reductase (TrxB). Gene 159: 203-207.

117. Pryor, K.D. and Leiting, B. 1997. High level expression of soluble proteins in Escherichia coli using a His6-tag and maltose-binding protein double-affinity fusion system. Protein Expr. Purif10: 309-319.

118. Przybycien, T.M., Dunn, J.P., Valax, P., Georgiou, G. (1994)Secondary structure characterization of p-lactamase inclusion bodies. Protein Eng. 7:131-137.

119. Pugsley, A. P. and Schwartz, M. (1985) Export and secretion of proteins by bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 32: 3-38.

120. Ramer, M.S., Priestly, J.V. & McMahon, S. B. (2000) Functional regeneration of sensory axons into the adult spinal cord. Nature 403:312-316.

121. Richardson, J.P. and Greenblatt, J. (1996) Control of RNA chain elongation and termination, p. 822-848. In F.C. Neidhardt, R. Curtiss III, J.L. Ingraham, E.C.C. Lin K.B.Low, B. Magasanik, W.S. Reznikoff, M. Riley M. Schaechter and H.E. Umbarger.

122. Ringquist, S., Shinedling, S., Barrick, D., Green L., Binkley, J., Stormo, G.D., Gold, L. (1992) Translation initiation in Escherichia coli: sequence within the ribosome-binding site. Mol.Microbiol. 6: 1219-1229.

123. Rudiger, S., Germeroth, L., Schneider-Mergener, J., Bukau, B. (1997) Substrate specificity of the DnaK chaperone determined by screening cellulose-bound peptide libraries. EMBO J. 16: 1501-1507.

124. Russell, D., R., Bennett, G. N. (1982) Construction and analysis of in vivo activity of E. coli promoter hybrids and promoter mutants that alter the -35 to -10 spacing. Gene 20(2):231-243.

125. Sachdev, D. and Chirgwin, J.M. (1998) Order of fusions between bacterial and mammalian proteins can determine solubility in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 933-937.

126. Sagava, H., Ohshima, A., Kato I. (1996) A tightly regulated expression system in Escherichia coli with SP6 RNA polymerase. Gene 168: 37-41.

127. Sambrook, J., Fritsch E., Maniatis T.// Molecular cloning. A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor, 1989.

128. Sandman, K., Grayling, R. A., Reeve, J. N. (1995). Improved N-terminal processing of recombinant proteins synthesized in Escherichia coli. Bio/Technology 13: 504-506.

129. Sanger, F.,Nicklen, S., Coulson, A. R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl Acad. Sci. USA 74:5463-5467.

130. Schatz, G. and Dobberstein, B. (1996) Common principles of protein translocation across membranes. Science 271: 1519-1526.

131. Schauder, B., McCarthy, J. E. G. (1989) The role of bases upstream of the Shine-Dalgarno region and in the coding sequence in the control of geneexpression in Escherichia coli: translation and stability of mRNAs in vivo. Gene 78: 279-283.

132. Schein, C. H. (1991) Optimizing protein folding to the native state in bacteria. Curr. Opin. Biotechnol. 2:746.

133. Schein, C. H. (1993) Solubility and secretability. Curr. Opin. Biotechnol. 4: 456—461.

134. Schumperli, D., McKenney, K., Sobieski, D.A., Rosenberg, M. (1982) Translation coupling an intercistronic boundary of the Escherichia coli galactose operon. Cell 30: 865-871.

135. Scolnik, E., R. Tompkins, T. Caskey, and M. Nirenberg. (1968) Release factors differing in specificity for terminator codons. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 61:768-774.

136. Sharp, P. M., and Bulmer, M. (1988) Selective differences among translation termination codons. Gene 63:141-145.

137. Shine, J., and L. Dalgarno (1974) The 3'-terminal sequence of Escherichia coli 16S ribosomal RNA: complementarity to nonsense triplets and ribosome binding sites. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 71: 1342-1346.

138. Siegele, D.A. and Hu, J.C. (1997) Gene expression from plasmids containing the araBAD promoter at subsaturating inducer concentrations represents mixed populations. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 94: 8168-8172.

139. Skerra, A. (1993) Bacterial expression of immunoglobulin fragments. Curr. Opin. Immunol. 5: 256-262.

140. Snyder, W. B. and Silhavy, T. J. (1992) Enhanced export of b-galactosidase fusion proteins in prlF mutants is Lon dependent. J. Bacteriol. 174:5661-5668.

141. Sorg, R.V., Enczmann, J., Sorg, U.R., Schneider E.M, Wernet, P. (1993) Identification of an alternatively spliced transcript of human interleukin-4 lacking the sequence encoded by exon 2. Exp. Hematol. 21:560-563.

142. Sprengart, M. L., Fuchs, E., Porter, A. G. (1996) The downstream box: an efficient and independent translation initiation signal in Escherichia coli. EMBOJ. 15: 665-674.

143. Stanssens P., Remaut E., Fiers W. (1985) Alterations upstream from the Shine-Dalgarno region and their effect on bacteral gene expression. Gene 36: 211-223.

144. Sugimoto, S., Yokoo, Y., Hatakeyama, N., Yotsuj, A., Teshiba, S., and Hagino, H. (1991) Higher culture pH is preferable for inclusion body formation of recombinant salmon growth hormone in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 13: 385-388.

145. Summers, D. (1998) Timing, self-control and a sense of direction are the secrets of multicopy plasmid stability. Mol. Microbiol. 29:1137-1145.

146. Swartz, R. (2001) Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr. Opin. Biotechnol 12:195-201.

147. Tagawa A, Kashima R, Kaneda K, Nakayama M, Ono S, Shimizu N. (2000) Polymyositis successfully treated with surgical resection of colon cancer. Eur Neurol. 44(4):251-252.

148. Tate, W. P., and C. M. Brown. (1992) Translational termination: "stop" for protein synthesis or "pause" for regulation of gene expression. Biochemistry 31: 2443-2450.

149. Tessier, L.-H., Sondermeyer, P., Faure T., Dreyer, D., Benavente, A., Villeval, D., Courtney, M., Lecocq, J.-P. (1984) The influence of mRNA primary and seconary structure on human IFN-y gene expression in E.coli. Nucleic Acids Res. 12: 7663-7675.

150. Thomas, C.D., Modha, J., Razzaq, T.M., Cullis, P.M., Rivett, A.J. (1993) Controlled high-level expression of the Ion gene of Escherichia coli allows overproduction of Lon protease. Gene 136: 237-242.

151. Thomas, J.G., Ayling, A., Baneyx, F. (1997) Molecular chaperones, folding catalysis and the recovery of active recombinant proteins from E.coli: to fold or to refold. Appl. Biochem. Biotechnol. 66: 197-238.

152. Tocatlidis, K., Dhurjati, P., Millet, J., Beguin, P., Aubert, J.-P. (1991) High activity of inclusion bodies formed in Escherichia coli overproducing Clostridium thermocellum endoglucanase D. FEBSLett. 282:205-209.

153. Tolentino, G.J., Meng, S.-Y., Bennet, G.N., San, K.-Y. (1992) A pH-regulated promoter for the expression of recombinant proteins in Escherichia coli. Biotechnol. Letters. 14: 157-162.

154. Tsung, K., Inouye, S., Inouye, M. (1989) Factors affecting the efficiency of protein synthesis in Escherichia coli. Production of a polypeptige of more than 6000 amino acid residues. J. Biol. Chem. 264: 4428-4433.

155. TzarevaN. V., Makhno V. I., Boni I. V. (1994) Ribosome-messenger recognition in the absence of the Shine-Dalgarno interactions. FEBS Lett. 337: 189-194.

156. Varshavsky, A. (1996) The N-end rule: Functions, mysteries, uses. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 93: 12142-12149.

157. Vasina, J. A., Peterson, M. S., Baneyx, F. (1998) Scale-up and optimization of the low-temperature inducible cspA promoter system. Biotechnol. Prog. 14:714-721.

158. Voskuil, M.I. and Chambliss, G.N. (1998) The -16 region of Bacillus subtilis and other gram-positive bacterial promoters. Nucl. Acids Res. 26: 3584-3590.

159. Warne, S.R., Thomas, C.M., Nugent, M.E., Tacon, W.C.A. (1986) Use of modified Escherichia coli trpR gene to obtain tight regulation of high-copy number expression vectors. Gene 46: 103-112.

160. Wier, U., Sparks, J. (1987) Purification and renaturation of recombinant human interleukine-2. Biochem. J. 245:85-91.

161. Wilhelm, O. G., Jaskunas, S. R., Vlahos, C. J., Bang, N. U. (1990) Functional properties of the recombinant kringle-2 domain of tissueplasminogen activator produced in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265:14606-14611.

162. Wilkinson, D. L. and Harrison, R. G. (1991) Predicting the solubility of recombinant proteins in Escherichia coli. Bio/Technology 9: 443-448.

163. Williams, S. G., Cranenburgh, R. M., Weiss, A-M. E., Wrighton, C. J., Sheratt, D. J., Hanak, J. J. (1998) Repressor tiyration: a novel system for selection and stable maintenance of recombinant plasmids. Nucleic Acids Res. 26:2120-2124.

164. Wong, H. C., and S. Chang. March (1990) 39-Expression enhancing fragments and method. U.S. patent 4,910,141.

165. Yabuta, M., Onai-Miura, S., Ohsuye, K. (1995) Thermo-inducible expression of a recombinant fusion protein by Escherichia coli lac repressor mutants. J. Biotechnol. 39: 67-73.

166. Yamamoto, T., and F. Imamoto. (1975) Differential stability of trp messenger RNA synthesized originating at the trp promoter and pL promoter of lambda trp phage. J. Mol. Biol. 92: 289-309.

167. Yasueda, H., Nagase, K., Hosoda, A., Akiyama, Y., Yamada, K. (1990) High-level direct expression of semi-synthetic human interleukine-6 in Escherichia coli. And production of N-terminus Met-free product. Bio/Technol. 8:1036-1040.

168. Yasukawa, T., Kaneiishii, C., Maekawa, T., Fujimoto ,J., Yamamoto, T. And Ishii, S. (1995) Increase of solubility of foreign proteins in Escherichia coli by coproduction of the bacterial thioredoxin. J. Biol. Chem. 270: 2532825331.

169. Zav'yalov, V.P., Denesyuk, A. I., White, B., Yurovsky, V. V.,Atamas, S. P., Korpela, T. (1997) Immunol. Lett. 58:149-152.

170. Zhang, S., G. Zubay, and E. Goldman. (1991) Low usage codons in Escherichia coli, yeast, fruit fly and primates. Gene 105: 61-72.

171. Zhang, Y., Olsen, D.R., Nguyen, K.B., Olson, P.S., Rhodes, E.T., Mascarenhas, D. (1998) Expression of eukaryotic proteins in soluble form in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 12: 159-165.

172. Zum, A.D., Widmer, H.R., Aebischer, P. (2001) Sustained delivery of GDNF: towards a treatment for Parkinson's disease. Brain Res. Rev. 36:222229.

173. Альтман И.Б., Птицын JI.P., Смирнов C.B., Калужский B.E., Машко C.B. (1997) Создание штамма-продуцента рекомбинантного у-интерферона быка, пригодного для эффективного биотехнологического производства. Биотехнология №11-12, С. 3-13.

174. Дебабов В. Г., Жданова Н. И. И др. Штаммы Е. coli ВНИИГенетика VL 334(pYN7) и ВНИИГенетика VL. 334(pYN6) продуценты L -треонина и способ их получения: Заявка № 4191345/13 СССР. 1979.

175. Егорова В.Н., Смирнов М.Н. (1999) Новые возможности иммунотерапии с использованием Ронколейкина в рекомбинантного интерлейкина-2 человека. Terra Medica, 2:15.

176. Кулагина M. А., Скапцова Н. В., Батчикова Н. В., Куркин А. Н., Ажаев А. В. (1990) Н-фосфатный метод в синтезе структурного гена интерлейкина-4 человека. Биоорганическая химия 16(5):625-629.

177. Машко C.B., 1998. Оптимизация экспрессии чужеродных генов в клетках E.coli. Биотехнология 6:3-23.

178. Птицын Л.Р., Альтман И.Б. (1995) Рекомбинантные штаммы Escherichia coli, обеспечивающие высокий уровень экспрессии интерлейкина-3 и интерлейкина-4 человека. Новые медицинские технологии 59(1):83-85.

179. Птицын Л.Р., Смирнов C.B., Альтман И.Б., Самсонова H.H., Ходякова A.B., Василенко Р.Н. (1999) Продукция рекомбинантного hIL-452 -природной изоформы интерлейкина-4 человека, в клетках Escherichia coli. Биоорганическая химия 25(8):623-628.

180. Стронгин А. Я. (1990) Молекулярно-биологические основы структурно-функциональных особенностей белков — продуктов гетер олотичного микробного синтеза.// Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. Москва, Наука, с. 240.