Дизайн рекомбинантных антител тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, доктор биологических наук Тикунова, Нина Викторовна

• Тикунова, Нина Викторовна
• доктор биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации доктор биологических наук Тикунова, Нина Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Иммуноглобулины.

1.1.1. Строение антител на примере молекулы IgG.

1.1.2. Строение вариабельных доменов иммуноглобулинов.

1.1.3. Организация генов, кодирующих иммуноглобулины.

1.2. Типы рекомбинантных антител.

1.2.1. Мини-антитела на основе гипервариабельных участков и VHдоменов.

1.2.2. Fab- и Fv-фрагменты.

1.2.3. Одноцепочечные антитела.

1.2.4. Производные одноцепочечных антител и Fab-фрагментов.

1.2.5. Продукция мини-антител в клетках E.coli.

1.2.6. Химерные антитела.

1.2.7. Гуманизированные антитела.

1.2.8. Рекомбинантные полноразмерные антитела человека.

1.2.9. Продукция рекомбинантных полноразмерных антител в эукариотических клетках.

1.3. Получение рекомбинантных антител методом фагового дисплея

1.3.1. Фаговый дисплей: история вопроса.

1.3.2. Строение и жизненный цикл нитчатого бактериофага.

1.3.3. Типы векторных систем на основе нитчатых бактериофагов.

1.3.4. Комбинаторные фаговые библиотеки пептидов.

1.3.5. Комбинаторные фаговые библиотеки антител.

1.3.6. Типы фаговых библиотек антител.

1.3.7. Комбинаторные фаговые библиотеки на основе Fab-фрагментов.

1.3.8. Комбинаторные фаговые библиотеки на основе одноцепочечных антител.

1.3.9. Конструирование наивных библиотек.

1.3.10.Конструирование синтетических библиотек.

1.3.11 .Конструирование иммунных библиотек.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Дизайн рекомбинантных антител»

Актуальность проблемы. Антитела относительно давно стали применять в терапии ряда заболеваний, в том числе и вирусных инфекций, благодаря исключительным свойствам этих природных биомолекул - высокой специфичности, наличию эффекторных функций, способности проникать в ткани и выводиться из организма с помощью естественных механизмов. Однако, применение поликлональных антител, выделенных из донорской крови, имеет ряд недостатков (Maynard and Georgiou, 2000), наиболее серьезным из которых является биологический риск, связанный с возможностью инфицирования неидентифицированными патогенами. Кроме того, сырьевая база для получения специфических поликлональных антител всегда ограничена, и стандартизовать эти препараты очень трудно из-за различающихся от партии к партии соотношений белок/специфические антитела. Серьезной проблемой является и то, что не все антигены можно использовать для иммунизации добровольцев, например, получить человеческие сыворотки против высокопатогенных инфекционных агентов или токсических агентов практически невозможно. Использование в терапии моноклональных антител (MICA) также имеет серьезные ограничения. Большинство имеющихся МКА производятся гибридомными клетками животных, и введение их в организм человека вызывает развитие нежелательной иммунной реакции, особенно при повторном введении. Кроме того, эффекторные функции МКА животных недостаточно активируются в организме человека, у них слишком короткий период полувыведения из организма. Получение высокоаффинных МКА человека, стабильно продуцируемых гибридомными клетками, к настоящему времени затруднено из-за отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы (Karpas et al., 2001; Traggiai et al., 2004). Спектр антител, получаемых с помощью гибридомных клеток человека, ограничен: так, получить антитела против патогенных и токсичных агентов, а также против собственных белков человека не представляется возможным (Laffly and Sodoyer, 2005). Наконец, не стоит забывать, что гибридомные клетки трансформированы, и, вследствие этого, препараты на их основе потенциально опасны как онкогены.

Новые перспективы в этой области открывают ДНК-технологии. Одним из направлений в получении МКА человека является создание трансгенных животных, у которых собственные гены, кодирующие иммуноглобулины, заменены на человеческие (Kellermann and Green, 2002; Laffly and Sodoyer, 2005). Однако, не все желаемые антитела можно получать таким образом из-за токсичности ряда антигенов для организма животного.

Еще одно активно развивающееся направление в разработке рекомбинантных антител основано на направленном дизайне генов кодирующих иммуноглобулины методами генетической инженерии. Так, к настоящему времени разработаны и используются в медицинской практике так называемые «химерные» антитела, состоящие из вариабельных доменов мышиных антител, обладающих целевыми свойствами, и константных доменов иммуноглобулинов человека. Создаются также и «гуманизированные» антитела, в которых только гипервариабельные участки человеческих антител заменены на мышиные.

Вместе с тем очевидно, что полностью человеческие рекомбинантные антитела (fully human antibodies) являются наиболее предпочтительными. Для их создания объединяют вариабельные домены антител человека, обладающих целевой активностью, с константными доменами иммуноглобулинов человека нужного изотипа. Такие антитела синтезируют в эукариотических клетках, которые обеспечивают правильную конформацию и гликозилирование молекулы иммуноглобулина.

Ключевой стадией в создании полноразмерных антител человека является получение вариабельных доменов, отвечающих за специфичность антитела, его аффинность и биологические свойства. Одним из способов их получения является отбор вариабельных доменов из комбинаторных фаговых библиотек мини-антител. Каждый бактериофаг в такой библиотеке экспонирует на своей поверхности только одно антитело уникальной специфичности (фаговое антитело). Репертуар антител в

12 таких библиотеках может достигать 10 различных мини-антител. В ходе процедуры аффинной селекции (biopanning) можно существенно обогатить исходную библиотеку бактериофагами, несущими на своей поверхности мини-антитела нужной специфичности, и затем из обогащенной популяции отобрать мини-антитела с нужными свойствами. Для получения рекомбинантных антител с заданными свойствами в настоящее время широко используют комбинаторные библиотеки одноцепочечных (scFv) антител и Fab-фрагментов, сконструированных на основе нитчатых бактериофагов E.coli.

Сами мини-антитела находят применение в терапии некоторых заболеваний. Обладая меньшими размерами, они легче проникают в ткани, преодолевают гематоэнцефалический барьер, вызывают меньший неспецифический иммунный ответ (Ewert et al., 2003). На их основе конструируют полифункциональные мини-антитела, иммунотоксины, средства адресной доставки лекарственных средств в организме больного.

В настоящее время мини-антитела и рекомбинантные полноразмерные антитела применяют в фундаментальных исследованиях, в биотехнологии, в терапии различных заболеваний, включая вирусные. Разработка противовирусных рекомбинантных антител ведется очень широко, однако лишь ограниченное количество работ, посвящено получению рекомбинантных антител против особо опасных для человека вирусных патогенов.

В число основных направлений деятельности ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» входят фундаментальные исследования вирусов, включая особо опасные, и разработка средств лечения заболеваний, вызываемых вирусными инфекциями. Именно поэтому целью настоящей работы являлась разработка и оптимизация методов получения рекомбинантных антител против вирусных патогенов и, прежде всего, против особо опасных вирусов человека.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- создать экспрессионную систему, обеспечивающую высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках E.coli, и на примере одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита исследовать особенности экспрессии целевых генов с использованием созданной конструкции, изучить иммунохимические свойства продуцируемых антител;

- отобрать из имеющейся синтетической фаговой библиотеки одноцепочечные антитела человека против вируса Эбола и против ортопоксвирусов, включая жизнеспособный вирус натуральной оспы (штаммы variola major и variola minor alastrim); исследовать иммунохимические и биологические свойства отобранных антител;

- сконструировать натуральную наивную библиотеку одноцепочечных антител человека и охарактеризовать ее, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела против различных антигенов, включая вирусные;

- сконструировать натуральную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе генетического материала периферических лимфоцитов доноров, вакцинированных вирусом осповакцины, отобрать из сконструированной библиотеки одноцепочечные антитела человека против различных ортопоксвирусов, исследовать их иммунохимические свойства;

- выявить одноцепочечные антитела человека, способные ингибировать инфекционность ортопоксвирусов, определить белки-мишени для этих антител;

- на основе одноцепочечных антител человека против вируса Эбола и ортопоксвирусов сконструировать полноразмерные антитела человека и исследовать их иммунохимические свойства.

Научная новизна результатов исследования.

Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека из периферических лимфоцитов доноров, иммунизированных вирусом осповакцины.

Впервые из сконструированной иммунной библиотеки и из имеющейся синтетической библиотеки отобраны одноцепочечные антитела человека против жизнеспособных ортопоксвирусов - вируса натуральной оспы, штаммы variola major и variola minor alastrim, вирусов осповакцины, оспы коров, эктромелии, а также против рекомбинантного белка ргАЗОЬ вируса натуральной оспы.

Впервые обнаружены рекомбинантные антитела человека, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы.

Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные нейтрализовать инфекционность вирусов осповакцины, оспы коров, оспы обезьян и эктромелии.

Впервые получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела человека sb9, slF4, si 16, и s2I19, подтверждена их способность связывать ортопоксвирусы.

Впервые из имеющейся синтетической и сконструированной нами наивной библиотеки одноцепочечных антител отобраны одноцепочечные антитела человека против белков вируса Эбола, созданы штаммы Escherichia coli E.coli НВ2151 /pHEN-4D 1 и E.coli HB2151/pHEN-2E3, продуцирующие антитела s4Dl и s2E3 в растворимой форме.

Впервые в нашей стране сконструированы полноразмерные антитела человека против вируса Эбола и ортопоксвирусов. Показано, что полноразмерные антитела человека против ортопоксвирусов обладают вируснейтрализующей активностью.

Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli. Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного вируснейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs), содержащего два остатка цистеина, что обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью МКА, направленных к основной антигенной детерминанте HBs-антигена. На основе сконструированных векторов созданы штаммы E.coli, продуцирующие мономерные и димерные одноцепочечные антитела против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита с уровнем продукции около 20% суммарного клеточного белка.

Практическая значимость работы.

В результате работы созданы оригинальные генетические конструкции, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных мономерных и димерных антител в клетках E.coli. Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано для масштабирования наработки одноцепочечных антител к различным антигенам.

Сконструирована и охарактеризована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами против ортопоксвирусов. Данная библиотека является источником вариабельных доменов иммуноглобулинов человека против ортопоксвирусов и предназначена для поиска специфических антител и создания на их основе терапевтических препаратов для лечения ортопоксвирусных инфекций и профилактики поствакцинальных осложнений, а также для разработки диагностических тест-систем.

Сконструирована и охарактеризована наивная библиотека одноцепочечных антител человека, которая является источником вариабельных доменов антител человека против широкого спектра антигенов.

Получено одноцепочечное антитело человека против фактора некроза опухоли, обладающее константой аффинности около 4х108М"\ Это дает основание рассматривать данное антитело перспективным для терапии вирусных геморрагических лихорадок и ряда аутоиммунных заболеваний.

Сконструированы полноразмерные антитела человека против ортопоксвирусов, обладающие вируснейтрализующей активностью. Эти антитела являются перспективными для разработки на их основе препаратов нового поколения для профилактики и терапии поствакцинальных осложнений.

Работа выполнялась во ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора с 1994 по 2006 гг. в рамках научных тем организации, по гранту РФФИ (04-360)-а, по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: Защита от патогенов», контракты 43.035.11.1527 и 43.035.11.1529, по гранту Международного научно-технического центра ISTC#1638p «Комбинаторные библиотеки против ортопоксвирусов».

На разных этапах выполнения в работе приняли участие Г.Н. Николенко, Т.А. Батанова, В.В. Морозова, В.В. Дубровская, Т.Э. Юн, у которых автор являлся научным руководителем диссертационных работ

Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: VI Всероссийская конференция «Новые направления биотехнологии», 1994, Пущино; «Bayev memorial conference», 1996, Москва; Международная конференция «Tick-borne viral, rickettsial and bacterial infections», 1996, Иркутск; Международный симпозиум "Protein Structure, Stability, and Folding. Fundamental and Medical Aspects", 1998, Москва; «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего

Востока и Крайнего Севера», 1998, 2002, 2006, Новосибирск; школы-конференции «5th, 6th, 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, 2000, 2002, 2005, Пущино, Россия; «Human Antibodies and Hybridomas» 2001, Prague, Czech Republic, 2002, Berne, Switzerland; XII International Congress of Virology, 2002, Paris, France; Международный семинар "Basic Science in ISTC Activities", 2001, Novosibirsk, Russia; Международная научно-практическая школа-конференция "Цитокины. Воспаление. Иммунитет." 2002, Санкт-Петербург, Россия; 15th, 16th International Symposium of Antiviral Research, 2002, Prague, Czech Republic, 2003, Savannah, USA, 2004, Tucson, USA, 2005, Barcelona, Spain; VII International Potsdam Symposium on Tick-Borne Diseases, 2003, Berlin, Germany; Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», 2005, Судак, Украина; Международная конференция «Физико-химическая биология» 2006, Новосибирск; International conference "Basic Science for Biotechnology and Medicine" 2006, Новосибирск, Россия; VII Межгосударственная научно-практическая конференция. 2006, Оболенск, Россия. Кроме того, результы докладывались на ежегодных встречах Наблюдательного Комитета ВОЗ по контролю за исследованиями вируса натуральной оспы в 2004, 2005 и 2006 годах.

Материалы диссертации изложены в 15 статьях в научных журналах. Часть результатов защищена патентами РФ (6 патентов )

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах

1. Дубровская В. В., Улитин А.Б., Ламан А.Г., Гилева И.П., Бормотов Н.И., Ильичев А.А., Бровка Ф.А., Щелкунов С.Н., Беланов Е.Ф., Тикунова Н.В. Конструирование комбинаторной иммунной клонотеки одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов и селекция из нее антител к рекомбинантному белку ргАЗОЬ вируса натуральной оспы.// Мол. биол. 2007, т. 41, № 1, с. 173-185.

2. Дубровская В. В., Тикунова Н. В. Получение одноцепочечных антител человека к основному иммунодоминантному белку ортопоксвирусов. //Вестник НГУ.-2007,-Том 5.-выпуск 1. с. 100-105.

3. Юн Т.Э., Тикунова Н.В., Шингарова Л.Н., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Морозова В.В., Швалов A.A., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина A.A., Ильичев A.A., Кирпичников М.П., Сандахчиев JI.C. Полноразмерное рекомбинантное антитело человека против вируса осповакцины. //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2007, т. 407: №5, с. 98-101.

4. Батанова Т.А., Улитин А.Б., Морозова В.В., Ламан А.Г., Жираковская Е.В., Воронина В.В., Бровко Ф.А., Тикунова Н.В. Создание и характеризация наивной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека. //Мол. Ген. ВируСол. И микробиол. 2006, № 3, с. 35-41.

5. Тикунова Н.В., Батанова Т.А., Чепурнов A.A. Рекомбинантные антитела человека против вируса Эбола: селекция и характеризация. //Вопр. Вирусол. 2005, т. 50, № 5, с. 25-29.

6. Тикунова Н.В., Бовшик Е.И., Юн Т.Э., Жираковская Е.В., Морозова В.В., Батанова Т.А., Гуськов A.A., Сокунова Е.Б., Ильичев A.A., Сандахчиев JI.C. Рекомбинантные антитела человека против вируса натуральной оспы. //Вопр. Вирусол. 2005, т. 50, № 6, с. 20-25.

7. Морозова В.В., Тикунова Н.В., Батанова Т.А., Юн Т.Э., Бовшик Е.И., Жираковская Е.В., Воронина В.В., Бобко Д.И., Беланов Е.Ф., Ильичев A.A., Сандахчиев JI.C. Мини-антитела человека против ортопоксвирусов. //Вестник РАМН, 2004, № 8, с. 22-27.

8. Тикунова Н.В., Беланов Е.Ф., Морозова В.В., Батанова Т.А. Бормотов Н.И., Овечкина Л.Г., Ильичев A.A., Сандахчиев Л.С. Фаговые антитела способны нейтрализовать вирусы. //Доклады Российской Академии Наук (ДАН), 2002, т.382, №1, с. 124-126/

9. Николенко Г.Н., Протопопова Е.В., Ильичев A.A., Коновалова С.Н., Карпенко Л.И., Локтев В.Б., Порываева В.А., Тикунова Н.В. Рекомбинантные антитела к вирусу клещевого энцефалита. //Вопр. Вирусологии, 2002, №5, с. 31-36.

10.Tikunova N.V., Morozova V.V., Batanova Т.A., Belanov E.F., Bormotov N.I., Ilyichev A.A. Phage antibodies from combinatorial library neutralize vaccinia virus. //Himan Antibodies, 2001, v. 10, p. 95-99.

П.Тикунова Н.В., Колокольцов А.А., Чепурнов А.А. Рекомбинантные моноклональные антитела человека против вируса Эбола. //ДАН, 2001, т. 378, №4, с. 551-554.

12.Тикунова Н. В., Николенко Г. Н., Протопопова Е. В., Котелкин А. Т., Локтев В. Б., Белавин П. А., Нетесова Н. А., Деев С. М., Ильичев А. А. Получение одноцепочечных антител против поверхностного гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита. // Вопр. Вирусологии, 1999, №1, с. 12-15.

13.Ильичев А.А., Меламед Н.В., Тикунова Н.В. Нитевидный бактериофаг М13 в бинарной системе экспрессии, основанной на РНК-полимеразе Т7. // Биотехн., 1997, № 1, с. 12-20.

14. Николенко Г. Н., Головин С. Я., Виноградов С. М., Ильичев А. А., Тикунова Н. В. Клонирование и секвенирование гена, кодирующего одноцепочечный иммуноглобулин (scFv) на поверхностный гликопротеин Е вируса клещевого энцефалита.// Жур. Инфекц. Патологии, 1996, т. 3, № 4, с. 47-52.

15. Тикунова Н.В., Головин С.Я., Микрюков Н.Н., Хрипин Ю.Л., Черненко В.Ю., Иванов В.Г., Ильичев А.А., Петренко В.А.Синтез, клонирование и определение первичной структуры кДНК а 1-антитрипсина человека. //Биоорг. Химия, 1991, т. 17, № 12, с. 1694-1697.

Патенты

1. Николенко Г. Н., Тикунова Н. В., Головин С. Я., Протопопова Е. В., Локтев В. Б., Деев С. М, Ильичев А. А Рекомбинантная плазмидная ДНК pTLS, содержащая ген одноцепочечного антитела против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. Патент РФ №-2158309. 2000 г.

2. Николенко Г. Н., Тикунова Н. В., Протопопова Е. В., Локтев В. Б., Карпенко Л.И., Коновалова С.Н., Ильичев А. А Рекомбинантная плазмидная ДНК p7SHSHis для продукции димерных одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита, и штамм бактерий Escherichia coli - продуцент димерной формы одноцепочечных антител против вируса клещевого энцефалита. Патент РФ № 2190017. 2002 г.

3. Шингарова Л.Н., Тикунова Н.В., Юн Т.Э., Батанова Т.А., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина А.А., Кирпичников

М.П., Ильичев А.А., Сандахчиев JI.C. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCLl, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи антитела человека против вируса Эбола, рекомбинантная плазмидная ДНК рСН1, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи указанного антитела, и их применение. Патент РФ № 2285043. 2006 г.

4. Батанова Т.А., Тикунова Н.В., и Юн Т.Э. Рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека; рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека. //Заявка на патент РФ, справка о приоритете № 2005129664 от 22.09.05. Решение о выдачи патента от 07.03.07.

5. В. В. Дубровская, Н. В. Тикунова, В. В. Морозова, Н. И. Бормотов, А. Г. Ламан, А. Б. Улитин, Ф. А. Бровко, Е. Ф. Беланов, А. А. Ильичев Комбинаторная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами против вируса осповакцины, рекомбинантная фагмидная ДНК pHEN-ЗАЮ, содержащая уникальный ген одноцепочечного антитела человека, способного нейтрализовать ортопоксвирусы, и искусственное одноцепочечное антитело человека ЗА10, способное нейтрализовать ортопоксвирусы.// Заявка на патент РФ. Справка о приоритете № 2005125994 от 15.08.05. Решение о выдачи патента от 24.05.07.

6. Тикунова Н.В., Шингарова JI.H., Юн Т.Э., Морозова В.В., Алиев Т.К., Болдырева Е.Ф., Некрасова О.В., Полыхалова И.В., Панина А.А., Кирпичников М.П., Ильичев А.А. и Сандахчиев JI.C. Рекомбинантные плазмидные ДНК pCL37 и рСН37, кодирующие полипептиды со свойст-вами легкой и тяжелой цепей антитела человека против вируса осповак-цины, обеспечивающие совместно биосинтез полноразмерных антител человека против вируса осповакцины в клетках млекопитающих, и рекомбинантное полноразмерное антите-ло человека класса IgGl, взаимодействующее с вирусом осповакцины. Заявка на патент РФ. Справка о приоритете № 2006100694 от 16.01.06.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Тикунова, Нина Викторовна

выводы

1. Создана экспериментально-методическая база для получения рекомбинантных антител человека методами фагового дисплея, что позволило впервые получить одноцепочечные антитела человека против вирусных патогенов, включая особо опасные вирусы.

2. Созданы две натуральные комбинаторные библиотеки одноцепочечных антител человека: наивная библиотека и иммунная библиотека одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов. Размер библиотек

П Й достигал 3x10 и 2x10 независимых трансформантов, соответственно. Иммунная библиотека к ортопоксвирусам создана впервые.

3. На основе созданных нами иммунной и наивной библиотек и синтетической библиотеки Griffin 1 проведен комплекс работ по получению и изучению рекомбинантных антител человека против различных антигенов.

В рамках исследования: а) впервые получена и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител человека против жизнеспособных ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, штаммы Ind3A {variola major) и Butler {variola minor alastrim); константы аффинности отобранных антител составляли от 106 до 108 М"1; б) впервые получены одноцепочечные антитела человека, обладающие вируснейтрализующей активностью в отношении вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии; в) показано, что большая часть вируснейтрализующих одноцепочечных антител связывает продукт открытой рамки считывания ОРТ H3L вируса осповакцины; антитела против этого белка преобладают в сыворотке людей, вакцинированных вирусом осповакцины; г) впервые выявлены одноцепочечные антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы; д) на основе одноцепочечных антител человека, направленных к ортопоксвирусов, сконструированы полноразмерные антитела человека fhb9, fhlF4, fhlI6 и fh2119, константы аффинности которых достигали 108 - 109 М"1; антитело fhb9 способно ингибировать инфекционность ортопоксвирусов; е) впервые создана и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител

6 7 человека против вируса Эбола, с константами аффинности от 10 до 10 М"1; ж) сконструировано полноразмерное антитело человека, специфически взаимодействующее с нуклеопротеином вируса Эбола с константой аффинности (7.7±1.5) х 107 М"1; з) получена и охарактеризована коллекция одноцепочечных антител

7 8 1 человека против ФНОа, с константами аффинности от 10 до 10 М" .

4. Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli. Введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного линейного эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (HBs), содержащего два остатка цистеина, обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью моноклональных антител, направленных к основной антигенной детерминанте HBs-антигена. С использованием сконструированных векторов получены мономерные и димерные формы одноцепочечных антител, направленные к гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита; продемонстрирована их способность конкурировать с исходными моноклональными антителами за связывание с вирусом клещевого энцефалита; измерены их константы диссоциации, которые составили (9.2 ± 0.2) х КГ'М1 и (3.2 ± 0.3) х 10"8М\ соответственно.

5. Созданы и охарактеризованы бактериальные штаммы-продуценты одноцепочечных антител человека, направленых к вирусу Эбола, к ортопоксвирусам, включая вирус натуральной оспы и оспы обезьян, к ФНОа; мономерных и димерных одноцепочечных антител, направленных к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита; штамм-продуцент рекомбинантного белка р35 вируса оспы коров. Штаммы депонированы в коллекции культур микроорганизмов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа - плод коллективного труда, и автор приносит искреннюю благодарность всем, кто участвовал в ней - И.В. Матяш, Е.В. Жираковской, В.В. Морозовой, Т.Э. Юн, Т.А. Батановой, В.В. Дубровской, Е.И. Бовшику, Г.Н. Николенко, Л.И. Карпенко, Е.В. Протопоповой, Е.Ф. Беланову, З.Ф. Киселевой, Н.И. Бормотову, Е.И. Рябчиковой, Г.В. Кочневой, И.П. Гилевой, A.B. Качко, И.В. Гавриловой, Н.Т. Денисовой, А.Н. Швалову и другим сотрудникам ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор".

Также автор благодарит к.х.н. Л.Н. Шингарову, обеспечившую помощь при конструировании полноразмерных антител и предоставившую рекомбинантный ФНОа, и к.х.н. А.Г. Ламана, к.х.н. Ф.А. Бровко, без помощи которых конструирование библиотек затянулось бы на годы.

Автор искренне признателен своим рецензентам профессору Э.Г. Малыгину и профессору A.A. Гуляевой, чьи замечания существенно помогли при написании данной диссертации, а также профессору В.Б. Локтеву, научные дискуссии с которым способствовали развитию исследований и представлению результатов.

Особую благодарность автор выражает профессору A.A. Ильичеву, который был инициатором проведения в ГНЦ ВБ «Вектор» исследований, основанных на методологии фагового дисплея, в дальнейшем уделял много внимания развитию этой работы и сыграл важную роль в качестве научного консультанта.

Автор хотел бы выразить искреннюю признательность академику РАН профессору Л.С. Сандахчиеву, а также A.A. Гуськову и Е.В. Сокуновой, без чьей поддержки и помощи не смогли бы осуществиться исследования, связанные с использованием вируса натуральной оспы.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Тикунова, Нина Викторовна, 2007 год

1. Берзовски Д., Берковер Д. Взаимодействие антиген-антитело. Иммунология. М.: "Мир". 1989. 89 с.

2. Беспалов И. А., Шиянов П. А., Лукашевич Л. В., Лунев В.Е., Трибуш С.С, Гапонова Г.И., Деев С.М. Получение одноцепочечных антител к ферритину человека в клетках Escherichia coli. // Мол. биол. -1995. Т. 27. - С. 451-460.

3. Букреев А. А., Скрипченко А. А., Гусев Ю. М. И др. Перспективный метод препаративной наработки и очистки вируса Марбург // Вопр. Вирусол. 1995. -Т. 40, №4.-С. 161-165.

4. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика: Практический курс. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999.

5. Галактионов В.Г., Иммунология. М.: "РИЦ МКД". 2000. 488 с.

6. Глик Б. и Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: "Мир", 2002. 589 с.

7. Досон Р., Элиот Д., Элиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М.: "Мир". 1991.466с.

8. Ильичев А.А., Миненкова О.О., Татьков С.И. и др. Получение жизнеспособного варианта фага М13 со встроенным чужеродным пептидом в основной белок оболочки // Доклады АН СССР. 1989, - Т. 307, - С.481-483.

9. Ильичев А.А., Меламед Н.В., Тикунова Н.В. Нитевидный бактериофаг М13 в бинарной системе экспрессии, основанной на РНК-полимеразе Т7. //Биотехнология. 1997. - Т. 1. - С. 12-20.

10. Казачинская Е.И., Перебоев А.В., Чепурнов А.А., Беланов Е.Ф., Разумов И.А. Моноклональные антитела к вирусу Эбола: получение, характеристика и изучение перекрестной реактивности с вирусом Марбург // Вопр. Вирусол. -2000.-Т. 45, №3.-С. 40-45.

11. Льюин Б. Гены. М.: "Мир". 1987, 544 с.

12. Ляшенко В.А., Воробьев A.A. Молекулярные основы иммуногенности антигенов. М.: "Медицина". 1982. С.76-99.

13. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д, Краев A.C., и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: "Наука. Сиб. Отделение", 1990. 248 с.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: "Мир". 1984.

15. Маренникова С.С., Щелкунов С.Н. Патогенные для человека ортопоксвирусы, M.: "КМК Scientific Press Ltd". 1998. 386 с.

16. Марстон Ф.А.О. Выделение эукариотических пептидов, продуцируемых в клетках E.coli. В кн. Новое в клонировании ДНК. Методы. Под ред. Д. Гловера. М.: "Мир". 1989. 367 с.

17. Миненкова, О.О., Ильичев, A.A., Кищенко, Г.П., Ильичева, Т.Н., Хрипин Ю.Л., Орешкова С.Ф., Петренко В.А. Получение специфического иммуногенеза на основе бактериофага М13. //Мол. Биол. 1993. - Т. 27, - С. 561-568.

18. Некрасов Б.Г., Кувшинов В.Н., Каледин В.И., Николин В.П., Ушакова Т.А., Туманова О.Ю., Ильичев A.A. Использование пептидных фаговых библиотек для получения пептидов, специфичных к аденокарциноме легкого мышей. // Вестник РАМН. 2004. - №8, - С. 35-37.

19. Остерман Л.А. Методы исследований белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: "Наука", 1981.

20. Петренко В.А., Татьков С.И., Семенова Л.Н., Ильичев A.A., Поздняков П.И. Экспрессия в Escherichia coli гена лейкоцитарного интерферона альфа 2, слитого с N-концевым фрагментом бета-галактозидазы. // Мол. ген. микробиол. вирусол., 1988, -С. 37-41.

21. Протопопова Е. В., Хусаинова А. Д., Коновалова С. Н., Локтев В. Б. Получение и изучение свойств антиидиотипических антител, несущих на своей поверхности гемагглютинирующие паратопы вируса клещевого энцефалита. // Вопр. вирусол. 1996. - № 2. - С. 50-53.

22. Разумов И А., Беланов Е.Ф., Букреев A.A., Казачинская Е.И. Моноклональные антитела к белкам вируса Марбург и их иммунохимическая характеристика // Вопр. Вирусол. 1998. - Т.43. - № 6. - С. 274-279.

23. Ройт А. Основы иммунологии. М.: "Мир". 1991. 327 с.

24. Туманова О.Ю., Кувшинов В.Н., Ильичев A.A., Иванисенко В.А, Козлов А.П., Сандахчиев Л.С. Локализации конформационного эпитопа гликопротеина gpl20 ВИЧ-1, узнаваемого моноклональными антителами 2G12.// Мол. биол. -2002, Т. 36. - С. 1-7.

25. Чепурнов A.A., Мерзликин Н.В., Рябчикова Е.И. и др. Получение очищенного вируса Эбола // Вопр. вирусол. 1994. - Т. 39, № 6. - С. 254-257.

26. Шингарова JI.H., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Недоспасов С.А., Есипов Д.С., Коробко В.Г. Мутанты фактора некроза опухолей человека: получение и некоторые свойства. Биоорганическая химия. 1996. - Т.22 (4). - С. 243-251.

27. Эпштейн О.И., Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M. // Патент РФ №2192888. 2001.

28. Adair J. Engineering antibodies for therapy. //Immunol. Rev. 1992. - V. 130, - P. 5-40.

29. Aliev Т.К., Panina A.A., Petrovskaya L.E., Shingarova L.N., Radko B.V., Nedospasov S.A., Korobko V.G., Zavyalova G.A., Zavyalov V.P. // Clinical Immunology. 2002. - V.103 (3). Part 2. - P. S90.

30. Alfthan K., Takkinen K., Sizmann D., Soderlund H., Terri T.T. Properties of a single-chain antibody containing different linker peptides. // Protein Eng. 1995. - V. 8.-P. 725-731.

31. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W. and Lipman D J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - P. 3389-3402.

32. Amersdorfer P., Wong C., Smith Т., Chen S., Deshpande S., Sheridan R. and Marks J.D. Genetic and immunological comparison of anti-botulinum type A antibodies from immune and non-immune human phage libraries. // Vaccine. 2002. - V. 20. -P. 1640-1648.

33. Amit A., Mariuzza R., Phillips S., Poljak R. Three-dimensional structure of an antigen-antibody complex at 2.8 A resolution.// Science. -1996. -V.233. P.747-753.

34. Baca M., Presta L.G., O'Connor S.J., and Wells J.A. Antibody humanization using monovalent phage display. // J. Biol. Chem. 1997. -V. 272, - P. 10678-10684.

35. Baert F., Noman M., Vermeire S., Van Assche G., D' Haens G., Carbonez A. and Rutgeerts P. Influence of immunogenicity on the long-term efficacy of infliximab in Crohn's disease. //N. Engl. J. Med. 2003. -V. 348. - P. 601-608.

36. Barbas CF. Ill, Kang A.S., Lerner R.A., Bencovic SJ. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: The gene III site. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.-V. 88,- P. 7978-7982.

37. Barbas C.F., Bain J.D., Hoekstra, DM. and Lerner, R.A. Semisynthetic combinatorial antibody libraries: a chemical solution to the diversity problem. // Proc.Natl.Acad. Sci. USA. 1992. -V. 89. - P. 4445-4457.

38. Barbie V. and Lefrans M. The human immunoglobulin kappa variable (IGKV) genes and joining (IGKJ) segments. //Exp Clin Immunogenet. 1998. - V.15. - P. 171-183.

39. Barbas C.F., Burton D.R. Cold Spring Harbor laboratory courses on Monoclonal antibodies from combinatorial libraries. 1994. 54 p.

40. Batra J.K., FitzGerald D.F., Gately M., Chaudhary V.K., Pastan I. Anti-Tac(Fv)-PE40, a single chain antibody Pseudomonas fusion protein directed at interleukin 2 receptor bearing cells. // J. Biol. Chem. 1990. - V.265. - P. 15198-15202.

41. Beck E. and Zink B. Nucleotide sequence and genome organisation of filamentous bacteriophages fl and fd. // Gene. 1981. - V. 16(1-3). - P. 35-58.

42. Beer B., Kurth R., Bukreyev A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. //Naturwissenschaften. 1999. - V. 86. - P. 8-17.

43. Berger M., Shankar V., and Vafai A. Therapeutic applications of monoclonal antibodies. //Am. J. Med. Sci. 2002. - V. 324. - P. 14-30.

44. Bernard O., Gough N. Nucleotide sequence of immunoglobulin heavy chain joining segments between translocated VH and \x constant region genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. USA. 1980. -V. 77. - P. 3630-3634.

45. Better M., Chang C.P., Robinson R.R. and Horwitz A.H. Escherichia coli secretion of an active chimeric antibody fragment. // Science. 1988. - V.240. - P. 1041-1043.

46. Better M., Hortwitz A.H. Expression of engineered antibodies and antibody fragments in microorganisms. // Meth. Enzymol. 1989. - V. 178. - P. 476-496.

47. Bianchi A.A. and McGrew J.T. High-level expression of full-length antibodies using trans-complementing expression vectors. //Biotechnol. Bioeng. 2003. - V. 84. - P. 439-444.

48. Bird R.E., Hardman K.D., Jacobson J.W., Jonson S., Kaufman B.M., Lee S.-M., Lee T., Pope S.H., Riovdan G.S., WhitlowM. Single-chain antigen-binding protein. // Science. 1988. - V. 242. - P. 423-426.

49. Birnboim H.C. and Doly J. A rapid aikalin extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. // Nucl. Acids Res. 1979. - V.7. - P. 1513-1523.

50. Blam M.E., Stein R.B., Lichtenstein G.R. Integrating anti-tumor necrosis factor therapy in inflammatory bowel disease: current and future perspectives.// Am. J. Gastroenterol. 2001. - V. 96. - P. 1977-1997.

51. Bolivar F., Rodrigues R.L., Green P.J., Betlach M.C. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system. // Gene. 1977. - V. 2. - P. 95-99.

52. Bond Ch., Marsters J.C., Sidhu S. Contributions of CDR3 to VHH Domain Stability and Design of Monobody Scaffolds for Naive Antibody Libraries. // J. Mol. Biol. -2003. V.332. - P.643-655.

53. Bowden G., Georgiou G. Folding and aggregation of ^-lactamase in the periplasmic space of Escherichia coli. // J. Biol.Chem. 1990. - V. 265. - P. 16760-16766.

54. Braunagel M. and Little M. Construction of a semisynthetic antibody library using trinucleotide oligos. //Nucleic Acids Res. 1997. - V.25. - P.4690-4691.

55. Breedveld F.C. Therapeutic monoclonal antibodies. //Lancet. 2000. - V. 355. -P.735-740.

56. Brinkmann U., Pai L., Fitzgerald D., Willingham M., Pastan I. B3(Fv)-PE38KDEL, a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 8616-8620.

57. Bruyns A.M., DeJaeger G., DeNeve M., DeWilde C., VanMontagu M., Depicker A. Bacterial and plant-produced scFv proteins have similar antigen-binding properties. // FEBS Lett. 1996. - V. 386. - P. 5-10.

58. Burton D., Saphire E., Parren P. A model for neutralization of viruses based on antibody coating of the virion surface. // Curr.Topics Microbiol. Immunol. 2001, -V. 260.-P. 109-143.

59. Carlson D.L., Willis M.S., White D.J., et al., Tumor necrosis factor-alpha-induced caspase activation mediates endotoxin-related cardiac dysfunction. //Crit Care Med. -2005.- 33(5).- P. 1021-1028.

60. Carlsson R. and Soderlind E. n-CoDeR concept: unique types of antibodies for diagnostic use and therapy. // Expert. Rev. Mol. Diagn. 2001. - V.l. - P.102-108.

61. Carter P., Presta L., gorman C.M., Ridway J.B.B., Henner D., Wong W.C.T., Rowland A.M., Koch C., Carver M., Shepard H.M. Humanization of an anti-pi 85HER2 antibody for human cancer therapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992.-V. 89.-P. 4285-4289.

62. Chaudhary V.K., Queen C., Junghans R.P., Waldmann T.A., FitzGerald D.J., Pastan I. A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudomonas exotoxin. //Nature. 1989. - V. 339. - P. 394-397.

63. Chaudhary V.K., Gallo M.G., FitzGerald D.J., Pastan I. A recombinant single-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheria toxin. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990a . - V. 87. - P. 9491-9494.

64. Chaudhary V., BatraJ., GalloM., Willingham M., FitzGerald D., Pastan I. A Rapid method of cloning funcnional variable-region antibody genes in E.coli as single-chain immunotoxins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. - P. 1066-1070.

65. Chothia C., Lesk A.M., Tramontano A., Levitt M., Smith-Gill S.J., Air G., Sheriff S., Padlan E.A., Davies D., Tulip W.R. and . Conformations of immunoglobulin hypervariable regions. //Nature. 1989. - V. 342. - P. 877-883.

66. Chothia C., Lesk A.M., Gherardi E., Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. // J. Mol. Biol. 1992. - V. 227. - P. 799-817.

67. Co M.S., Deschavps M., Whilley R.J., Queen C. Humanized antibodies for antiviral therapy. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 2869-73.

68. Colman P.M., Larer W.G., Varghese J.N., Baker A.T., Tulboch P.A., Air C.M., Webster R.G. Three-dimensional structure of a complex of antibody with influenza virus neuraminidase. //Nature. 1987. - V. 326. - P. 358-363.

69. Conrath, K.E., Wernery, U., Muyldermans, S., Nguyen, V.K. Emergence and evolution of functional heavy-chain antibodies in Camelidae. //Development and Comparative Immunology. 2003. - V. 27. - P. 87-103.

70. Cox J.P., Tomlinson I.M. and Winter G. A directory of human germ-line V kappa segments reveals a strong bias in their usage. // Eur. J. Immunol. 1994. - V.24. - P. 827-836.

71. Czerny P. And Mahnel H. Structural and functional analysis of orthopoxvirus epitops with neutralizing monoclonal antibodies.//J.Gen.Virol. 1990. - V. 71. - P. 2341-2352.

72. Dantas-Barbosa C., Brigido M.M. and Maranhao A.Q. Construction of a human Fab phage display library from antibody repertoires of osteosarcoma patients. // Genet. Mol. Res. 2005. - V.4.- P. 126-140.

73. Davies A., Greene A., Lullau E., and Abbott W.M. Optimisation and evaluation of a high-throughput mammalian protein expression system. //Protein Expr. Purif. 2005. -V. 42.-P. 111-121.

74. Davis C.G., Jia X.C., Feng X., and Haak-Frendscho M. Production of human antibodies from transgenic mice. //Methods Mol. Biol. 2004. - V. 248. - P. 191-200.

75. Dekruif J.M, Logtenberg T. Leucine zipper dimerized bivalent and bispecific scFv antibodies from semi-synthetic antibody phage display library. // J. Biol. Chem. -1996.-V. 271.-P. 7630-7635.

76. Demkovicz W., Maa J., Esteban M. Identification and characterization of Vaccinia virus genes encoding proteins that are highly antigenic in animals and are immunodominant in vaccinated humans.// J. Virol. 1992 - V. 66. - P. 386-398.

77. Desidero, A., Fanconi, R., Lopez, M., E., V., M., Viti, F., Chiaraluce, R. A semisynthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a singleframework scaffold. // J. Mol. Biol. 2001. - V. 310. - P. 603-615.

78. DeSutter K., Feys V., Vande Voorde A., Fiers W. Production of functionally active murine and murine: :human dimeric F(ab')2 fragments in COS-1 cells. // Gene. -1992.-V. 113.-P. 223-230.

79. DeWildt R.M., Hoet R.M., van Venrooij W.J., Tomlinson I.M. and Winter G. Analysis of heavy and light chain pairings indicates that receptor editing shapes the human antibody repertoire. // J. Mol. Biol. 1999. - V.285. - P.895-901.

80. Deyev S.M., Lieber A., Radko B.V., Polanovsky O.L. Expression of immunoglobulin genes tandem in eucariotic cells under control of T7 bacteriophage RNA polymerase. // Appl. Biochem. and Biothechnol. 1994. - V. 47. - P. 143-155.

81. Dimmock N. Neutralization of animal viruses. // Curr. Topics Microbiol. Immunol. 1993.-V. 12.-P. 70-75.

82. Dimmock N. Update on the Neutralization of animal viruses. // Rev. Med. Virol. -1995.-V. 5. P. 165-169.

83. Dorsam H., Rohrbach P., Kurscher T., Kipriyanov S., Renner S., Braunagel M., Welschof M., Little M. Antibodies to steroids from a small human naive IgM library. FEBS Lett.-1997.-V. l.-P. 7-13.

84. Dotto G., Horiuchi K. and Zinder N. The functional origin of bacteriophage fl DNA replication. Its signals and domains. // J. Mol. Biol. 1984. - V. 172. - P. 507-521.

85. Esposito J., Obijeski J.,Nakano J. The virion and soluble antigen proteins of variola, monkeypox and vaccinia virus. // J. Med. Virol. -1977. V. 1. - P. 95-110.

86. Ewert S., Huber T., Honegger A. and Pluckthun A. Biophysical properties of human antibody variable domains. // J. Mol. Biol. 2003. - V.325. - P.531-553.

87. Fendly BM., Toy KJ., Creasey AA., Vitt CR., Larrick JW., Yamamoto R., Lin LS. Murine monoclonal antibodies defining neutralizing epitopes on tumor necrosis factor. // Hybridoma. 1987. - V. 6(4). - P. 359-370.

88. Fenner F.,Wittek R., Dumbell K. The Orthopoxviruses. USA. Acad.Press. 1989. p. 432.

89. Fishwild D.M., Hudson D.V., Deshpande U. and Kung,A.H. Differential effects of administration of a human anti-CD4 monoclonal antibody, HM6G, in nonhuman primates. // Clin. Immunol. 1999. - V. 92. - P. 138-152.

90. Franchini M., Rituximab in the treatment of adult acquired hemophilia A: A systematic review. //Crit Rev. Oncol. Hematol. 2007, in press.

91. Friguet B., Chaffote A.F., Djavadi-Ohaniance L., Goldberg M.F. Measurement of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzime-linked immunosorbent assay. // J. Immunol. Methods. 1985. - V.77. - P. 305-319.

92. Froehler B.C., Ny P.G. and Mattencci M.D. Synthesis of DNA via deoxynucleoside H-phosphonate intermediates. // Nucl. Acids. Res. 1986. - V. 14. - P. 5399-5407.

93. Frost E.H. Investigation of sera reactive to hepatitis C virus by second-generation enzyme immunoassay. // J Clin Microbiol. 1993. - V. 31(1). - P. 163-4.

94. Fuchs P., Breitling F., Dubel S., Seehaus T., Dubel S., Little M. Targeting recombinant antibodies to the surface of Escherichia coli: Fusion to a peptidoglycan associated lipoprotein. //BioTechnology. 1991. -V. 9. - P. 1369-1372.

95. Galmiche M.C., Goenaga J., Wittek R., Rindisbacher L. Neutralizing and protective antibodies directed against vaccinia virus envelope antigens. // Virology. -1999. V. 254.-P. 71-80.

96. Garrard LJ. and Henner D.J. Selection of an anti-IGF-1 Fab from a Fab phage library created by mutagenesis of multiple CDR loops. // Gene. 1993. - V.128. - P. 103-109.

97. Gavilondo J.V. and Larrick J.W. Antibody engineering at the millennium. // Biotechniques. 2000. - V.29. - P. 128-138.

98. Geoffroy F., Sodoyer R. and Aujame L. A new phage display system to construct multicombinatorial libraries of very large antibody repertoires. // Gene. 1994.1. V.151. P.109-113.

99. Ghahroudi, A., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., & Muyldermans, S. Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. // FEBS Letters. 1997. - V. 414. - P. 521-526.

100. Gispen R. and Brand-Saathof B. Three specific antigens produced in vaccinia, variola and monkeypox infections. // J. Inf. Dis. 1974. - V. 129. - P. 289-293.

101. Glockshuber R., Nalia M., Pfitzinger I., Pluckthun A. A comparison of strategies to Stabilize immunoglobulin Fv-fragment. // Biochemistry. 1990. v. 29. p. 1362-1368.

102. Goding J.W. Monoclonal antibodies: principles and practice: production and application of monoclonal antibodies in cell biology, biochemistry and immunology. NY. Acad. Press. 2nd ed. 1986. 315 p.

103. Golomb H., Chamberlin M. Characterisation of T7-specific ribonucleic acid polymerase. // J.Biol.Chem. 1974. - V. 249. - P. 2858-2863.

104. Gotter S., Haas C., Kipriyanov S.M., Dubel S., Breitling F., Khazaie K., Schirmachen V., Little M. A single-chain antibody for tumor cells infected with Newcastle disease virus. // Tumor Targeting. 1995. - V. 1. - P. 107-114.

105. Goyenecha B., Milstein C. Modifying the sequence of an immunoglobulin V-gene alters resulting pattern of hypermutation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93.-P. 13979-13984.

106. Griffiths A.D. and Duncan A.R. Strategies for selection of antibodies by phage display. Curr. Opin. Biotech. 1998. - v. 9. - P. 102-108.

107. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis // Antiviral Research 2003a. - Vol. 57. - P. 129-146.

108. Hames-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S., Robinson, G., Hames, C., Songa, EB., Bendahman, N., Hames, R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. // Nature. 1993. - V. 363. - P. 446-458.

109. Hanes J and Pluckthun A., In vitro selection and evolution of functional proteins by using ribosome display. // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. - V. 94. - P. 4937-42.

110. Hasemann C.A., Capra J.D. High-level production of a functional immunoglobulin heterodimer in a baculovirus expression system. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1990.-V. 87. P. 3942-6.

111. Hawkins R.E., Russel S.K., Winter G. Selection of phage antibodies by binding affinity. Mimicking naive combinatorial library. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992.-V. 89.-P. 3576-3580.

112. Hiatt A. Cafferkey R., Bowdish K. Production of antibodies in transgenic plants. // Nature. 1989. - V. 342. - P. 76-78.

113. Hirai M., Okamura N., Terano Y., Tsujimoto M., Nakazato H. Production and characterization of monoclonal antibodies to human tumor necrosis factor. // J Immunol Methods. 1987. - V. 26(1). - P. 57-62.

114. Hoess R.H., Brinkmann U., Handel T., Pastan I. Identification of a peptide which binds to the carbohydrate-specific monoclonal antibody B3. // Gene. 1993. - V. 128.-P. 43-49.

115. Honjo T., Nakai S., Nishida Y., Kataoka T., Yamavaki-Kataoka Y., Takahashi N., Obata M., Shimizu A., Yaoita Y., Nikaido T., Ishida N. Rearrangment of immunoglobulin genes during differentiation and evolution. // Imm. Reviews. -1981.-V. 59.-P. 33-67.

116. Horwitz A.H., Chang P., Better M., Hellstrom K.E., Robinson R.R. Secretion of functional antibody and Fab fragment from yeast cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V. 85. - P. 8678-8682.

117. Hsiao J-C., Chung C., Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the absorption of intracellular mature virions to cells. // J.Vrol. -1999. -V. 73. P. 8750-8761.

118. Hsu E. Canonical VH CDR1 nucleotide sequences are conserved in all jawed vertebrates. // Int. Immunol. 1996. - V. 8. - P. 847-854.

119. Huber C., Schable,K.F., Huber,E., Klein,R., Meindl,A., Thiebe,R. Lamm,R. Zachau,H.G The V kappa genes of the L regions and the repertoire of V kappa gene sequences in th human germ line. // Eur J.Immunol. -1993. V. 23 (11). - P. 2868-2875.

120. Huse WD, Iverson SA., Kang AS., Alting-Mees M., Burton DR., Bencovic SJ., Lerner RA. Generation of large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. // Science. 1989. - V. 246. - P. 1275-1281.

121. Huston J.S., Mudgett-Hunter M., Nai M.S., McCartney J., Warren F., Haber E.,

122. Opperman H. Protein engineering of single-chain Fv analogs and fusion proneins. //Meth. Enzymology. 1990. - V. 203. - P. 46-89.

123. Ichihashi Y., Oie M. Epitope Mosaic on the Surface Proteins of Orthopoxviruses.// Virology. 1988.- V. 163.-P. 133-144.

124. Ichihashi Y. and Oie M. Neutralizing epitope on penetration protein of vaccinia virus. // Virology. 1996. - V. 220. - P. 491-494.

125. Ichihashi I. Extracellular enveloped Vaccinia virus escapes neutralization. // Virology. 1996b. - V. 217. - P.478-485.

126. Ignatovich O., Tomlinson I.M., Jones P.T. and Winter G. The creation of diversity in the human immunoglobulin V(lambda) repertoire. // J. Mol. Biol. 1997. - V.268. - P. 69-77.

127. Ippen-Ihler K., Maneewannekul S. Conjugation among enteric bacteria: Mating systems dependent on expression of pili. In: «Microbial cell-cell interactions». 1991. p. 35-69.

128. Jakobovits A., Production of fully human antibodies by transgenic mice.// Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V. 6. - P. 561-566.

129. Jang Y.J., Lecerf J.M., Stollar B.D. Heavy chain dominance in the binding of DNA by a lupus mouse monoclonal autoantibody. // Mol. Immunol. 1996 . - V. 33. - P. 197-210.

130. Jiang W., Bonnert T.P., Venugopal K., Gould E.A. A single chain antibody fragment expressed in bacteria neutralizes tick-borne flaviviruses. // Virology. -1994.-V. 200.-P. 21-28.

131. Johnson G. and Wu T.T. Kabat Database and its applications: future directions. // Nucleic Acids Res. 2001. - V.29. - P.205-206.

132. Jones P.T., Dear P.H., Foote J., Neuberger M.S., Winter G. Replasing the complrmentary-determing region in a human antibody with those from a mouse. // Nature. 1986. - V. 321. - P. 522-525.

133. Karpas A., Dremucheva A. and Czepulkowski B.H. A human myeloma cell line suitable for the generation of human monoclonal antibodies. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V. 98. - P. 1799-1804.

134. Kawasaki K., Minoshima S., Nakato E., Shibuya K., Shintani A., Schmeits J.L., Wang J. and Shimizu N. One-megabase sequence analysis of the human immunoglobulin lambda gene locus. // Genome Res. 1997. - V.7. - P.250-261.

135. Kay B.K., Winter G., McCafferty J. Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual. NY.: Academic press. 1996. 306 p.

136. Kieke MC., Cho BK., Boden ET., Kranz DM., Wittrup KD. Isolation of anti-T cell receptor scFv mutants by yeast surface display. // Protein Eng. 1997. - V. 10(11). -P. 1303-1310.

137. Kellermann S.A. and Green L.L. Antibody discovery: the use of transgenic mice to generate human monoclonal antibodies for therapeutics. // Curr. Opin. Biotechnol. -2002. V.13. - P.593-597.

138. Kempeni J. Preliminary results of early clinical trials with the fully human anti-TNFa monoclonal antibody D2E7. // Ann. Rheum. Dis.- 1999. V.58. - P. 170-172.

139. Khazaeli M.B., Conry R.M., and LoBuglio A.F., Human immune response to monoclonal antibodies. //J. Immunother. 1994. - V. 15. - P. 42-52.

140. Kieke M, Cho B., Boden E., Kranz D., Wittrup K. Isolation of anti-T cell receptor scFv mutants by yeast surface display. // Protein Eng. 1997. - V. 10(11). - P. 1303-1310.

141. Kim S.J., Jang M.H., Stapleton J.T, Yoon S.O., Kim K.S., Jeon E.S. and Hong H.J. Neutralizing human monoclonal antibodies to hepatitis A virus recovered by phage display. // Virology. 2004. - V.318. - P.598-607.

142. Kipriyanov S.M., Dubel S., BreitlingF., KontermannR.E., Little M. Recombinant single-chain Fv fragments carrying C-terminal cysteine residues: production of bivalent and bioninylated miniantibodies. // Mol. Immunol. 1994. - V. 31. -P.1047-1058.

143. Kipriyanov S.M., Breitling F.,Little M.,Dubel S. Single-chain antibody strepnavidin fusion: tetrameric bifunctional scFv-complexes with biotin binding activity and enchanced affinity to antigen. // Hum. Antibod. Hybridomas. 1995a. - V. 6. - P. 93-101.

144. Kipriyanov S.M., Dubel S., Breitling F., Kontermann RE., Heymann S., Little M. Bacterial expression and refolding of single-chain Fv fragments with C-terminal cysteines. // Cell Biophisics. 1995b. - V. 26. - P. 187-204.

145. Kipriyanov S.M., Moldenhauer G., Little M. High level production of soluble single chain antibodies in small-scale Escherichia coli cultures. // J. Immunol. Methods. -1997.-V. 200.-P. 69-77.

146. Kipriyanov S.M. and Little M. Generation of recombinant antibodies. // Mol. Biotechnol. 1999. - V.12. - P.173-201.

147. Klasse P. and Sattentau Q. Occupancy and mechanism in antibody mediated neutralization of animal viruses. // J. Gen. Virol. 2002. - V. 83. - P. 2091-2108.

148. Knappik A., Krebber C., Pluckthun A. The effect of folding catalysts on the in vivo folding process of different antibody fragment expressed in Escherichia coli. // Bio/Thecnology. 1993. - V. 11. - P. 77-82.

149. Kohl J., Ruker F., Himmler G., Razazzi E., Katinger H. Cloning and expression of an HIV-1 specific single-chain Fv region fused to Escherichia coli alkaline phosphatase. //Ann. NY. Acad. Sci. 1991. - V. 646. - P. 106-114.

150. Kohler G. and Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. //Nature. 1975. - V.256. - P.495-497.

151. Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V. Main features of tick-borne encephalitis eco-epidemiology in Russia // Zentralbl Bakteriol 1999 - V. 289. - P. 525-539.

152. Labrijn A.F., Koppelman M.H., Verhagen J., Brouwer M.C., Schuitemaker H., Hack

153. C.E. and Huisman H.G. Novel strategy for the selection of human recombinant Fab fragments to membrane proteins from a phage-display library. // J. Immunol. Methods. 2002. - V. 261. - P. 37-48.

154. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

155. Laffly E. and Sodoyer R. Monoclonal and recombinant antibodies, 30 years after . // Hum. Antibodies. 2005. - V. 14. - P. 33-55.

156. Lee C., Sidhu S., Fuh G. Bivalent antibody phage display mimics natural immunoglobulin. J. Immunol. Meth. 2004. - V.284. - P 119-132.

157. Le Hir H., Nott A., Moore M.J. How introns influence and enhance eukaryotic gene expression. //Trends in Biochem. Sci. 2003. - V. 284. - P. 215-220.

158. Liu A.Y., Robinson R.R., Murray E.D., Chang J.C.P., Hellstrom I. Chimeric mouse-human IgGl antibody that can mediate lysis of cancer cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - P. 3439-3443.

159. Lo K.M., Sudo Y., Chen J., Li Y., Lan Y., Kong S.M., Chen L., An Q. and Gillies S.D. High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells. //Protein Eng. 1998. - V. 11. - P. 495-500.

160. Lustig Sh., Fogg Ch., Whitbeck J.C., Moss B. Synergistic neutralizing activities of antibodies to outer membrane proteins of the two infectious forms of vaccinia virus in the presence of complement. // Virology. 2004. - V. 328. - P. 30-35.

161. Luzzago A., Felici F., Tramontano A., Pessi A., CorteseR. Mimicking of discontinuous epitopes by phage-displayed library of contrained peptides. // Gene. -1993.-V. 128.-P. 51-57.

162. MacCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G. and Chiswell, D.J. Phage antibodies: filamentous phage displaying antibody variable domains. // Nature 1990. - V. 348. -P. 552-554.

163. Maeda H., Matsushita S., Eda Y., Rimachi K., Tokiuoshi S., Bendig M.M. Construction of reshaped human antibodies with HIV-neutralizing activity. // Hum. Antibodies Hybridomas. 1991. - V. 2. - P. 124-134.

164. Mamula P., Cohen S.A., Ferry G.D., Kirschner B.S., Winter H.S., Innes A., Patel J., Baldassano R.N. CDP571, a humanized anti-tumor necrosis factor-alpha monoclonal antibody in pediatric Crohn's disease.// Inflamm. Bowel Dis. 2004. - V. 10.-P. 723.

165. Manser T., Wysocky L.J., Margolies M.N., Gerter M.L. Evolution of antibody variable region structure during the immune response. // Imm. Reviews. 1997. - V. 96.-P. 141-162.

166. Marks J.D., Hoogenboom H.R., Bonnert T.P., McCafferty J., Griffiths A.D. and Winter G. By-passing immunization. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage. // J. Mol. Biol. 1991. - V. 222. - P. 581-597.

167. Matsuda F. and Honjo T. Organization of the human immunoglobulin heavy-chain locus. // Adv. Immunol. 1996. - V. 62. - P. 1-29.

168. Matsuda F., Ishii,K., Bourvagnet,P., Kuma,K., Hayashida,H., Miyata,T., Honjo,T. The complete nucleotide sequence of the human immunoglobulin heavy chain variable region locus. // J Exp Med. 1998. - V. 7 (188). - P. 2151-2162.

169. Maynard J. and Georgiou G. Antibody engineering. // Annu. Rev. Biomed. Eng.2000. V. 2. - P. 339-376.

170. Mease P.J. Tumour necrosis factor (TNF) in psoriatic arthritis: pathophysiology and treatment with TNF inhibitors. // Ann. Rheum. Dis. 2002. - V. 61. - P. 298-304.

171. Minnencova O.O., Ilyichev A.A., Kishchenko G.P. Design of specific immunogenes using filamentous phage at the carrier. // Gene. 1993. - V. 128. - P. 85-88.

172. Mitchell, T., Sugden, B. Stimulation of NF-kB-mediated transcription by mutant derivatives of the latent membrane protein of Epstein-Barr virus. // J. Virol. 1995.- V. 69. P. 2968-2976.

173. Model, P., Russel, M. The bacteriophages. In: Calendar R.(Ed). V.2. Plenum, N.Y. 1988. p.375-456.

174. Morea V., Tramontano A., Rustici M., Chothia C. and Lesk A.M. Conformations of the third hypervariable region in the VH domain of immunoglobulins. // J. Mol. Biol.- 1998.-V. 275.-P. 269-294.

175. Moreland L., Baumgartner SW., Schiff MH. Treatment of rheumatoid arthritis with a recombinant human necrosis factor receptor (p75)-Fc fision protein. // N. Engl. Med.-1997.-V. 337.-P. 141-147.

176. Mosialos, G., Birkenbach, M., Yalamanchili, R., VanArsdale, T., Ware, C.& Kieff, E. The Epstein-Barr virus transforming protein LMP1 engages signaling proteins for the tumor necrosis factor receptor family. // Cell. 1995. - V. 80. - P. 389-399.

177. Mulligan R.C., Berg P.J. Expression of a bacterial gene in mammalian cells. // Science. 1980. - V. 209. - P. 1422-1427.

178. O'Neil K.T., Hoess R.H., Jackson SA., Ramachandran NS., Mousa SA., DeGrado W.F. Identification of novel peptide antagonists for GPIIb/IIIa from a conformationally constrained phage peptide library. // Proteins. 1992. - V. 14. - P. 509-515.

179. Nissim A., Hoogenboom H.R., Tomlinson I.M., Flynn G., Midgley C., Lane D. and Winter G. Antibody fragments from a 'single pot' phage display library as immunochemical reagents. // EMBO J. 1994. - V. 13. - P. 692-698.

180. Noronha E.J., Wang X., Desai S.A., Kageshita T. and Ferrone S. Limited diversity of human scFv fragments isolated by panning a synthetic phage-display scFv library with cultured human melanoma cells. // J. Immunol. 1998. - V.161. - P. 2968-2976.

181. O'Connell D., Becerril B., Roy-Burman A., Daws M. and Marks J.D. Phage versus phagemid libraries for generation of human monoclonal antibodies. // J. Mol. Biol. -2002,- V. 321.-P. 49-56.

182. Orlandi, R., Gussov, D.H., Jones, P.T., Winter, G. Cloning immunoglobulin variable domains for expression by the polymerase chain reaction. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 3833-3837.

183. Padlan E.A., Silveston E.W., Sheriff S., Cohen G.H., Smith-GillS J., Davies D.R. Structure of antibody- antigen complex: crystal structure of the My HEL-10 Fab-lisozime complex. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 5938-5942.

184. Pallares N., Frippiat J.P., Giudicelli V. and Lefranc M.P. The human immunoglobulin lambda variable (IGLV) genes and joining (IGLJ) segments. // Exp. Clin. Immunogenet. 1998. - V. 15. - P. 8-18.

185. Park S.S., Kim J., Brandts J.F., and Hong H.J. Stability of murine, chimeric and humanized antibodies against pre-S2 surface antigen of hepatitis B virus. //Biologicals. 2003. - V. 31. - P. 295-302.

186. Parmley S.F. and Smith G.P. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. // Gene. -1988. V.73.- P.305-318.

187. Perelson A.S. and Oster G.F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. // J. Theor. Biol. 1979. - V. 81. - P. 645-670.

188. Persic L., Roberts A., Wilton J., Cattaneo A., Bradbury A. and Hoogenboom H.R. An integrated vector system for the eukaryotic expression of antibodies or their fragments after selection from phage display libraries. //Gene. 1997. - V. 187. - P. 9-18.

189. Persson MA., Caothien RH., Burton DR. Generation of diverse high-affinity human monoclonal antibodies by repertoire cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. -V. 88. - P. 2432-2436.

190. Pescovitz M.D., Rituximab, an anti-cd20 monoclonal antibody: history and mechanism of action. //Am. J. Transplant. 2006. - V. 6. - P. 859-866.

191. Peters C.J., Sanchez A., Rollin P.E., Nichol S., Ksiazek T.G., Murphy F.A. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses // Fields virology /Eds B.N Fields et al. 3d Ed.-NY.: Raven Press, 1996. Vol. 1. p. 1161-1176.

192. Petrov N.A., Karginov V.A., Mikriukov N.N., Serpinski O.I., Kravchenko V.V. Complete nucleotide sequence of the bacteriophage X DNA region containing gene Q and promotor PR> // FEBS Lett. -1981. V. 133 (2). - P. 316-320.

193. Presta L.G. Engineering of therapeutic antibodies to minimize immunogenicity and optimize function. //Adv. Drug Deliv. Rev. 2006. - V. 58. - P. 640-656.

194. Radko B.V., Boitchenko V. E., Nedospasov S. A. and Korobko V. G. Characterization of the genes encoding variable light and heavy chains of the high-affinity monoclonal antibody against human tumor necrosis factor. // Russian

195. Journal of Immunology. 2002. - V. 7(4). - P. 371-374.

196. Rastetter W., Molina A., and White C.A. Rituximab: expanding role in therapy for lymphomas and autoimmune diseases. //Annu. Rev. Med. 2004. - V. 55. - P. 477503.

197. Ravanello M.P., Hruby D.E.Conditional lethal expression of the vaccinia virus L1R myristylated protein reveals a role in virion assembly.// J Virol. 1994a - V.68 - P. 6401-6410.

198. Ravanello M.P., Hruby D.E.Characterization of the vaccinia virus L1R myristylprotein as a component of the intracellular virion envelope.// J Gen Virol. -1994b.-V. 75.-P. 1479-1483.

199. Reading S.A., and Dimmock NJ. Neutralization of animal virus infectivity by antibody. //Arch. Virol. -2007. V. 152. - P. 1047-1059.

200. Reff,M.E. High-level production of recombinant immunoglobulins in mammalian cells. //Curr. Opin. Biotechnol. 1993. - V. 4. - P. 573-576.

201. Reichert J.M., Rosensweig C.J., Faden L.B., and Dewitz M.C. Monoclonal antibody successes in the clinic. //Nat. Biotechnol. 2005. - V. 23. - P. 1073-1078.

202. Reichmann L., Clark M., Waldman H., Winter G. Reshaping human antibody for therapy. //Nature. 1988. - V. 332. - P. 323-327.

203. Riechmann L., Davies J. Backbone assignment, secondary structure and protein A binding of an isolated, human antibody VH domain. // Journal of Biomolecular NMR. 1995. - V. 6. - P. 141-152.

204. Ridder R., Schmitz R., Legay F., Gram H. Generation of rabbit monoclonal antibody fragments from a combinatorial phage display library and their production in the yeast Pichia pastoris. // Biotechnology. 1995. -V. 13. - P. 255-260.

205. Ridder R., Geisse S., Kleuser B., Kanallek P., Gram H. A COS: cell-based system for rapid production and quantification of scFv::IgGk antibody fragments.// Gene -1995. V. 166. - P. 273-276.

206. Rodrigues M., Snedecor B., Chen C., Wong W., Carg S., Blank G., Maneval D.,

207. Carter P. Engineering Fab' fragments for efficient F(ab)2 formation in Escherichia coli and for improved in vivo stability. //J Immunol. 1993. - V. 15. - P. 69546961.

208. Queen C., Schneider W.P., Selick H.E., Landolfi N.F., Duncan J.F., Avdalovic N.M., Levitt M., Junghans R.F., Waldmann T.A. A humaniezed antibody that binds to the interleukin 2 receptor. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 1002910033.

209. Sanders D.S. Mucosal integrity and barrier function in the pathogenesis of early lesions in Crohn's disease.// J. Clin. Pathol. 2005. - V. 58. - P. 568-572.

210. Sastry, L., Alting, M.M., Huse, W.D., Short, J.M., Sorge, J.A., Hay, B.N., Janda, K.D., Benkovic, S.J., Lerner, R. // Proc. Natl.Acad.Sci.USA. 1989. - V.86. -P.5728-32.

211. Sblattero D. and Bradbury A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. //Nat. Biotechnol. 2000. - V.18. - P.75-80.

212. Schmaljohn C., Cui Y., Kerby S., Pennock D. and Spik K. Production and characterization of human monoclonal antibody Fab fragments to vaccinia virus from a phage-display combinatorial library. // Virology. 1999. - V. 258. - P. 189200.

213. Schroder K., Hertzog P.J., Ravasi T., Hume D.A. Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions. // J. Leukoc. Biol. 2004. - V. 75. - P. 163-189.

214. Skerra A., and Pluckthun A. Assembly of a functional immunoglobulin Fv fragment in Escherichia coli. // Science. 1988. - V. 240. - P. 1038-1041.

215. Smith G.P. Filamentous fusion phage: Novel expression vectors that display cloned antigens on the surface of the virion. //Science. 1985. - V. 228. - P. 1315-1317.

216. Smith and Scott. Libraries of peptides and proteins displayed on filamentous phage. // Methods in Enzymology. 1993. - V. 217. - P. 228-257.

217. Solar I., Gershoni J.M. Linker modification introduces useful molecular instability in a single chain antibody. // Protein Engineering . 1995. - V. 8. - P. 717-723.

218. Stevens F.J. Modification of an ELISA-based procedure for affinity determination: correction necessary for use with bivalent antibody. // Mol. Immunol. 1987. - V. 24.-P. 1055-1060.

219. Suss J., Schrader C., Abel U. et al. Characterization of tick-borne encephalitis (TBE) foci in Germany and Latvia (1997-2000). // Int. J. Med. Microbiol. 2002. -V. 291(Suppl. 33). - P. 34-42.

220. Takashima I., Morita K., Chiba M. et al. A case of tick-borne encephalitis in Japan and isolation of the virus // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 1943-1947.

221. Takashima I., Hayasaka D., Goto A. et al. Epidemiology of tick-borne encephalitis (TBE) and phylogenetic analysis of TBE viruses in Japan and Far Eastern Russia // J. Infect. Dis. 2001. - V. 54. - P. 1 -11.

222. Tang Y., Jiang N., Parakh C. and Hilvert D. Selection of linkers for a catalytic single-chain antibody using phage display technology. // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271.-P. 15682-15686.

223. Taub R., Gould R.J., Garsky V.M., Ciccarone M., Hoxie J., Friedmann P.A., Shattil

224. J. A monoclonal antibody against the platelet fibrinogen receptor contains a sequence that mimics a receptor recognition domain in fibrinogen. // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. - P. 259-65.

225. Thomas P. and Smart T.G. HEK293 cell line: a vehicle for the expression of recombinant proteins. // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 2005. - V. 51. - P. 187200.

226. Thompson J. Applications of antisense and siRNA during preclinical drug development. // Drug Discov. Today. 2002. - V. 7. - P. 912-917.

227. Tomlinson I.M., Walter G., Marks J.D., Llewelyn M.B. and Winter G. The repertoire of human germline VH sequences reveals about fifty groups of VH segments with different hypervariable loops. // J. Mol. Biol. 1992. - V. 227. - P. 776-798.

228. Tomlinson I.M., Cox J.P., Gherardi E., Lesk A.M. and Chothia C. The structural repertoire of the human V kappa domain. // EMBO J. 1995. - V. 14. - P. 46284638.

229. Towbin H., Staehelin T. and Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poly aery lamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

230. Trikha M., Zhou Z., Timar J., Raso E., Kennel M., Emmell E., and Nakada M.T., Multiple roles for platelet GPIIb/IIIa and alphabeta 3 integrins in tumor growth, angiogenesis, and metastasis. //Cancer Res. 2002. - V. 62. - P. 2824-2833.

231. Trill J.J., Shatzman A.R., and Ganguly S. Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells. //Curr. Opin. Biotechnol. 1995. - V. 6. - P. 553-560.

232. Tsehanovskaya N., Matveev L., Rubin S. et al. Epitope analysis of tick-borne encephalitis (TBE) complex viruses using monoclonal antibodies to envelope glycoprotein of TBE virus (persulcatus subtype). // Virus Res. 1993. - V. 30. - P. 290-295.

233. Turner D.J., Ritter M.A. and George A.J. Importance of the linker in expression of single-chain Fv antibody fragments: optimisation of peptide sequence using phage display technology. // J. Immunol. Methods. 1997. - V. 205. - P. 43-54.

234. Tutter A., Riblet R. Conservation of immunoglodulin variable-region gene family indicates a specific, noncoding function. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 7460-7464.

235. Van Wezenbeek P., Huloenmakers J.G. Nucleotise sequence of the filamentous bacteriophage M13 DNA genome: Comparison with phage fd. // Gene. 1980. - V. 11.-P. 129-148.

236. Virnekas B., Ge L., Plucthun A., Schneider K., Wellnhofer G, Moroney S.E. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotodis for random mutagenesis. // Nucl.Acids Res. 1994. - V. 22. -P. 5600-5607.

237. Ward E.S., Gussow D.H., Griffiths A.D., Jones P.T., Winter G. Binding activities of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherichia coli. //Nature. 1989. - V. 341. - P. 544-546.

238. Ward E.S., Bibbington C.R. Genetic manipulation and expression of antibodies. In Monoclonal antibodies: principles and application. Willey-Liss Inc. 1995. p. 137185.

239. Waterhouse P., Griffiths A.D., Johnson K.S. and Winter G. Combinatorial infection and in vivo recombination: a strategy for making large phage antibody repertoires. // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - P. 2265-2266.

240. Weigert M., Gatmaitan L., Loh E., Schilling J., Hood L.E.//Nature. 1978. - V. 276. -P. 785-790.

241. Weiss R. Virulence and pathogenesis. // Trends Microbiol. 2002. - V. 10. - P. 314317.

242. Weissenhorn W., Weiss E., Schwirzke M., Kahnze B., Weidle U.H. Chimerization of antibodies by isolation of rearranged genomic variable regions by the polymerase chain reaction. // Gene. 1991. - V. 106. - P. 273-277.

243. Welschof M., Terness P., Kipriyanov S.M., Stanescu D., Breitling F., Dorsam H., Dubel S., Little M. and Opelz G. The antigen-binding domain of a human IgG-anti-F(ab')2 autoantibody. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V. 94. - P. 1902-1907.

244. Willats W.G. Phage display: practicalities and prospects. // Plant Mol. Biol. 2002. -V. 50.-P. 837-854.

245. Williams W.V., Hoss D.a., Kieber-Emmons T., Cohen J.A., Myers J.N., Weiner D.B., Greene M.I. Development of biologically active peptides based on antibody structure. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - V. 86. - P. 5537-5541.

246. Williams S.C., Frippiat J.P., Tomlinson I.M., Ignatovich O., Lefranc M.P. and Winter G. Sequence and evolution of the human germline V lambda repertoire. // J. Mol. Biol. 1996. - V. 264. - P. 220-232.

247. Williamson R.A., Burioni R., Sanna P.P., Partridge L.J., Barbas C.F., Burton D.R. Human monoclonal antibodies against a plethora of viral pathogens from single combinatorial libraries. // Proc.Natl.Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 4141-4145.

248. Wilson A., Rini J., Fremont D., Fieser G., Stura E.A. X-ray crystallographic analysis of free and antigen-complexed Fab fragments to investigate structural basis of immune recognition. // Meth. Enzymol. 1991. - V. 203. - P. 153-176.

249. Wilson J.A., Hevey M., Bakken R., Guest R, Bray M., Schmaljohn A., Hart M. Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus.// Science. -2000.-V. 287.-P. 1664-1666.

250. Winter G., Griffiths A.D., Hawkins R.E. and Hoogenboom H.R. Making antibodies by phage display technology. // Annu. Rev. Immunol. 1994. - V. 12. - P. 433-455.

251. Whitlou M., Filpula D. Single-chain Fv proteins and their fusion proteins. // Methods Companion Methods Enzymol. 1991. - V. 2. - P. 97-103.

252. Wolffe EJ, Vijaya S, Moss B. A myristylated membrane protein encoded by the vaccinia virus L1R open reading frame is the target of potent neutralizing monoclonal antibodies.// Virology. 1995 - V. 211- P. 53-63.

253. Wood C.R., Dorner A.J., Morris G.E., Alderman E.M., Wilson, D., O'Hara, R.M., Jr., and Kaufman, R.J. High level synthesis of immunoglobulins in Chinese hamster ovary cells. //J. Immunol. 1990. - V. 145. - P. 3011-3016.

254. Wright A. and Morrison S. Effect of glycosylation on antibody function: implications for genetic engineering. //Trends Biotechnol. 1997. - V. 15. - P.26-32.

255. Wu T.T., Kabat E.A. An analysis of the sequences of the variable region of Bence Jones protein and myeloma light chains and their implications for antibody complementarity. // J. Exp. Med. 1970. -V. 132. - P. 211-250.

256. Wu, T.T., Johnson, G., Kabat E.A. Length distribution of CDRH3 in antibodies. // Proteins:Struct. Funct. Genet. -1993. V. 16. - P. 1-7.

257. Xiong H., Ran Y., Xing J., Yang X., Li Y., and Chen Z. Expression vectors for human-mouse chimeric antibodies. // J. Biochem. Mol. Biol. 2005. - V. 38. -P.414-419.

258. Zhou, Y., Takekoshi, M., Maeda, F., Ihara, S., Esumi, M. Recombinant antibody Fab against the hypervariable region 1 of hepatitis C virus blocks the virus adsorption to susceptible cells in vitro. Antiviral Research. 2002. - V.56. - P.51-59.

259. Zinkernagel R. Anti-infection immunity and autoimmunity. // Ann. N.Y. Acad.Sci. -2002.-V. 958.-P. 3-6.

260. Zinoviev V.V., Tchikaev N.A., Chertov O.Yu., Malygin E.G. Identification of the gene encoding vaccinia virus immunodominant protein p35. // Gene. 1994. - V. 147 (2). - P. 209-14.