Изучение взаимодействия белка VPR вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) с клеточными структурами и белками ВИЧ-1 в процессе формирования вирусоподобных частиц тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Чикова, Анна Константиновна

• Чикова, Анна Константиновна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чикова, Анна Константиновна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ).

Общие сведения

1.2. Vpr - вспомогательный белок ВИЧ-1

1.3. Структура и свойства белка

1.4. 2 Взаимодействие Vpr с белками ВИЧ-1

1.5.2 Взаимодействие Vpr с клетками

1.5.1. Взаимодействие Vpr с клеточными мембранами

1.5.2. Особенности внутриклеточного транспорта белка Vpr. Взаимодействие с клеточными белками и нуклеиновыми кислотами

1.6. 2 Влияние Vpr на инфицированные клетки

1.6.1. Торможение клеточного цикла на

стадии G2/M

1.6.2. Активизация механизма апоптоза, индукция дифференциации клеток в присутствии Vpr

1.7. Функции белка Vpr в жизненном цикле ВИЧ-1

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Культивирование бактериальных штаммов

2.1.1. Использованные штаммы бактерий Escherichia coli

2.1.2. Питательные среды

2.2. Культивирование клеток насекомых и вируов

2.2.1. Культивирование клеток насекомых

1. Культуры клеток

2. Условия культивирования

2.2.2. Вирусы

2.3. Получение рекомбинантных штаммов

2.3.1. Полимеразная цепная реакция

1. Праймеры для амплификации vpr

2. Условия реакции

2.3.2. Получение рекомбинантных штаммов Escherichia coli

1. Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток

а. Экспресс-метод

б. Препаративное выделение плазмидной

ДНК с помощью горячей щелочи

2. Рестрикция

3. Электрофоретическое разделение

препаратов ДНК

4. Выделение фрагментов ДНК из агарозного

геля

5. Лигирование

6. Приготовление компетентных клеток Е. coli и трансформация их препаратами плазмидной ДНК

7. Селекция рекомбинантных клонов

2.3.3. Получение рекомбинантных вирусных штаммов

1. Получение вирусной ДНК,

51

2. Трансфекция

3. Селекция рекомбинантных клонов

2.4. Получение белковых препаратов

2.4.1.Получение препаратов клеток

2.4.2. Фракционирование клеток

2.4.3. Выделение ВПЧ

2.4.4. Подготовка препаратов для анализа

2.5. Анализ белковых препаратов

2.5.1. Электрофорез

2.5.2. Иммуноблот

2.6. Синтез и очистка 1Ч-концевого пептида белка Ург

2.7. Получение иммунной сыворотки к белку Ург с использованием синтетического пептида

2.7.1. Иммунизация кроликов

2.7.2. Методика ИФА

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Конструирование рекомбинантных плазмид

3.1.1. Получение фрагмента ДНК гена ург и

конструирование рекомбинантной плазмиды риСург

3.1.3. Конструирование инсерционных плазмид

1. Конструирование инсерционной

плазмиды рУЬург

2. Конструирование инсерционной плазмиды рАСург

3.2. Получениеи анализ иммунной сыворотки к Vpr с использованием синтетического пептида

3.3. Экспрессия Vpr в Е. coli

3.3.1. Получение прокариотической системы экспрессии белка Vpr на основе плазмиды

pUC18

3.3.2. Анализ экспрессии белка Vpr в Е. coli

3.4. Изучение взаимодействия сывороток крови больных СПИД с рекомбинантным белком Vpr в иммуноблоте

3.5. Анализ продукции Vpr штаммов РБВ rBVACvpr

3.5.1. Получение штамма rBVACvpr

3.5.2. Изучение экспрессии белка Vpr

штаммом rBVACvpr

3.5.3. Изучение секреции Vpr в культуральную среду

3.5.4. Выделение белка Vpr из клеток

насекомых

3.5.5. Анализ взаимодействия Vpr со структурами клетки методом субклеточного фракционирования

3.6. Изучение взаимодействия белка Vpr со структурными белками ВИЧ-1

3.5.1. Изучение инкорпорации белка Vpr в вирусоподобные частицы

3.5.2. Изучение взаимодействия Vpr с полипротеином Gag в процессе формирования ВПЧ

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

а.к. - аминокислотных остатков БОЕ - бляшкообразующая единица BSA - бычий сывороточный альбумин ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВПЧ - вирусоподобные частицы. ИФА - иммуноферментный анализ kb - тысяч пар оснований ПЦР - полимеразная цепная реакция PBS - фосфатно-буферный раствор РБВ, гВУ - рекомбинантные бакуловирусы. SIV - smian immunodeficiency virus (вирус иммунодефицита обезьян)

TBS - трис-буферный раствор

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение взаимодействия белка VPR вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) с клеточными структурами и белками ВИЧ-1 в процессе формирования вирусоподобных частиц»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) был впервые описан в 1981 г. Основными признаками СПИД являются иммунологические расстройства организма, сопровождающиеся, оппортунистическими инфекциями, неврологическими заболеваниями и необычными формами рака. Роль лен-тивирусного агента в этиологии этого заболевания в 1983 г. подтвердило открытие вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в лаборатории Монтанье в институте Пастера в Париже.

Лентивирусы отличаются от других представителей семейства ретровирусов более широким спектром регуляторных белков, влияющих как на активность тех или иных функций вируса, так и на физиологическое состояние клетки-хозяина.

Регуляторные белки Vpr, Nef, Vpu и Vif ВИЧ1, по мнению некоторых исследователей, не являются необходимыми для инфекци-онности вируса, но существенно влияют на его репродукцию в некоторых клеточных линиях. Такие белки были определены как «вспомогательные».

Одним из «вспомогательных» белков ВИЧ является Vpr — полипептид массой 14кДа, продукт поздней вирусной транскрипции. Этот белок обнаруживается в каждой из пяти групп лентивирусов приматов и отличается высокой консервативностью. К настоящему моменту известны некоторые функции Vpr: участие в транспорте вирусного преинтеграционного комплекса к ядру инфицированной клетки, активация вирусных и некоторых клеточных промоторов, торможение клеточного цикла на стадии G2/M и др., что указывает на большую роль данного белка в жизненном цикле ВИЧ.

Значительное число экспериментальных данных подтверждает

способность Vpr к взаимодействию с различными клеточными структурами и активное влияние этого белка на физиологические процессы инфицированной клетки. Интересно, что Vpr несет сильный нуклеофильный сигнал, необходимый для ядерного транспорта преинтеграционного комплекса ВИЧ, и большая часть синтезируемого белка обнаруживается в ядре инфицированной клетки. Тем не менее, в присутствии р17, р7 и рб доменов Gag этот белок инкорпорируется в вирионы в количествах, эквимолярных основным структурным белкам вирусной сердцевины. Показано, что для некоторых функций Vpr, необходимых на поздних стадиях жизненного цикла вируса, также не требуется ядерная локализация данного белка. Таким образом, некоторые авторы выделяют ранние функции Vpr, связанные с ядерным импортом, и поздние функции, не требующие ядерной локализации. С этой точки зрения «переключение» механизмов внутриклеточного транспорта Vpr на разных этапах жизненного цикла вируса представляется одним из возможных способов регуляции активности белка на разных стадиях репродукции. Если на ранних стадиях доминирует нуклеофильный сигнал, то при накоплении в цитоплазме поздних вирусных продуктов включается система, составляющая конкуренцию ядерному импорту и направляющая белок на мебрану клетки к почкующимся частицам. По некоторым данным, структурные белки ВИЧ-1 влияют на биологическую активность Vpr, однако, механизмы регуляции к настоящему моменту не выяснены.

Исследование механизмов, ответственных за внутриклеточный транспорт Vpr, представляет большой интерес не только для изучения жизненного цикла ВИЧ, но и для клеточной биологии в целом.

Цели и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействия

Ург ВИЧ1 с клеточными структурами и изменений внутриклеточного транспорта данного белка под влиянием gag-продуктов в процессе формирования ВПЧ.

В задачи исследования входило.

1. Получение рекомбинантных штаммов бакуловируса, эффективно экспрессирующих Vpr в клетках насекомых.

2. Отработка иммунологических методов тестирования белка Vpr.

3. Изучение особенностей внутриклеточного транспорта белка Vpr, несущего сигнал секреции, и его взаимодействие с различными структурами клетки.

4. Изучение инкорпорации рекомбинантного белка Vpr в вирусоподобные частицы (ВПЧ).

5. Изучение взаимодействия рекомбинантного бежа Vpr с полипротеином предшественником Pr55Gag в процессе формирования ВПЧ.

Научная новизна работы.

Для исследования биохимических свойств белка Vpr ВИЧ-1 впервые была использована модельная система на основе рекомбинантных штаммов бакуловируса.

Показано, что химерный белок Vpr, снабженный сигналом секреции, эффективно инкорпорируется в ВПЧ, формируемые Pr55Gag, при экспрессии in trans, что указывает на отсутствие значительных конформационных отличий от нативного белка ВИЧ 4.

Показано, что инкорпорация Vpr в частицы, по-видимому, не зависит от его взаимодействия с плазматической мембраной клетки-хозяина, а обеспечивается только связыванием с молекулами Pr55Gag.

Впервые показано, что благодаря высокой активности механи-

зма ядерного импорта Ург происходит подавление секреции химерного белка, содержащего лидерную последовательность поверхностного гликопротеина Ор67 вируса ядерного полиэдроза.

Полученные данные позволяют предположить, для инкорпорации Ург в частицы необходимо подавление ядерного импорта данного белка одним из доменов Рг55Са^.

* * *

Автор считает своим приятным долгом поблагодарить Юрия Аркадьевича Семилетова за осуществление синтеза олигопептида, Мансура Мухамедовича Гараева за предоставление исходной плаз-миды для амплификации Ург и рекомендации по оформлению работы, Людмилу Мидатовну Селимову и Олега Петровича Жирно-ва за предоставление ультрацентрифуги для выделения ВПЧ, сотрудников НПО «Нарвак» Татьяну Владимировну Гребенникову и Алексея Дмитривича Забережного за предоставление ДНК-ампли-фикатора и методические рекомендации, Галину Константиновну Воркунову за консультации по методу субклеточного фракционирования. И, конечно, пользуясь возможностью, автор выражает глубокую признательность коллективу лаборатории генноинже-нерных препаратов под руководством Рашита Абдрахмановича Гибадулина за терпение, поддержку и неоценимую помощь в работе.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Чикова, Анна Константиновна

5. ВЫВОДЫ.

1. Сконструировано два рекомбинантных штамма бакулови-руса, которые являются высокоэффективными продуцентами белка Vpr штамма JRCSF ВИЧ1 в клетках насекомых.

2. Получена гипериммунная антипептидная сыворотка, взаимодействующая с рекомбинантным белком Vpr в иммуноблоте.

3. Показано, что лидерная секретирующая последовательность гликопротеина Gp67 вируса ядерного полиэдроза в составе химерного белка Vpr, продуцируемого рекомбинантным штаммом rBVACvpr, не оказывает конкуренции механизму ядерного импорта данного бежа, и весь синтезируемый Vpr транспортируется в ядро инфицированной клетки.

4. Рекомбинантный белок Vpr инкорпорируется в вирусоподобные частицы (ВПЧ) при коэкспрессии in trans с полноразмерным геном gag ВИЧ-L Включение в ВПЧ химерного белка указывает на сходство его структуры с нативным Vpr.

5. Инкорпорация Vpr в ВПЧ, по-видимому, не зависит от связывания данного бежа с липопротеидной мембраной, а взаимодействие Vpr с Pr55Gag не менее прочно, чем связь молекул полипротеина предшественника между собой.

6. Полученные результаты биохимического анализа штамма rBVACvpr позволяют предположить, что для эффективной инкорпорации белка Vpr в вирионы необходимо его взаимодействие с молекулами Pr55Gag непосредственно после трансляции, в результате чего происходит блокирование нуклеофильного сигнала Vpr одним из доменов полипротеина Pr55Gag. Такое взаимодействие, по нашим данным, составляет конкуренцию механизму ядерного импорта, что и обеспечивает транспорт Vpr к почкующейся частице.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

В данной работе в качестве модели использовалась система ре-комбинантных штаммов бакуловируса. Хотя в некоторых исследованиях [Levy et al. 1994 и др.] рекомбинантные бакуловирусные штаммы применялись в качестве продуцента Vpr, биохимические свойства данного белка в такой системе не исследовались. Использованная нами модель несет значительные отличия от природной системы репродукции ВИЧ: вирус ядерного полиэдроза вызывает быстрый лизис инфицированных клеток, тогда как широко применяемые ретровирусные векторы и системы клеток COS обеспечивают условия экспрессии белков, сходные с ВИЧ-инфекцией; клетки насекомых обладают функциональными и биохимическими особенностями, не свойственными клеткам насекомых. Тем не менее, данная система имеет некоторые преимущества: бакуловирусы не представляют какой-либо инфекционной опасности для человека, высокий уровень синтеза продукта позволяет выявить даже небольшие отличия количественных соотношений белка в разных фракциях без применения высокочувствительных методов тестирования, продукция ВПЧ использованным штаммом rBVYLgag также достаточно высока для тестирования изменений в уровне инкорпорации Vpr в частицы, полученные рекомбинантные штаммы могут быть в последствии с успехом использованы для получения препаратов рекомбинантных белков в целях практического применения.

Выделение препаративных количеств бежа Vpr представляет определенную проблему. Наши попытки получить данный белок в прокариотической системе не увенчались успехом. Как было показано Bodeus М. et al. (1997), низкий уровень экспрессии Vpr в клетках Е. coli объясняется подавлением клеточного деления. Подаиным Macreadi et al. (1995), аналогичный эффект наблюдается и в дрожжевой системе. Таким образом, большинство эффективных промышленных продуцентов не может быть использовано для получения Vpr.

Учитывая все перечисленные факты, система рекомбинантных штаммов бакуловируса может иметь как научное, так и практическое применение.

Из обзора литературных данных следует, что Vpr является полифункциональным структурно-регуляторным белком ВИЧ1.

Механизмы регуляции функций данного белка на разных стадиях жизненного цикла вируса представляют большой интерес для исследования. Subbramanian et al. (1998) выделяют два основных фенотипа, связанных с ранними и поздними функциями Vpr: ядерную локализацию и индукцию G2apecra. Ядерная локализация Vpr коррелирует с его способностью к активизации ядерного импорта вирусного преинтеграционного комплекса и, возможно, транс-активации длинных концевых повторов ВИЧ на ранней, Tat-независимой стадии транскрипции. Для индукции G2apecTa, и некоторых других поздних функций данного белка, по данным Ма-chalingam et al. (1997) и Campbell et al. (1997), ядерная локализация Vpr не требуется, также как и для его инкорпорации в вирионы. Таким образом, изменения в системе внутриклеточного транспорта Vpr можно рассматривать как один из механизмов регуляции его активности в процессе репродукции ВИЧ. Взаимодействие с другими вирусными продуктами, по некоторым данным, также может влиять на биологическую активность Vpr. Поэтому изучение влияния gag-продуктов на внутриклеточный транспорт Vpr и взаимодействие этого белка со структурами клетки представляет бои льшои интерес.

Проведенные нами исследования биохимических свойств химерного белка Vpr, продуцируемого рекомбинантным штаммом бакуловируса rBVACvpr, показали, что для транспорта Vpr к цито-плазматической мембране клетки не достаточно присутствия связанного с ним сигнала секреции. Высокая активность механизма ядерного импорта Vpr приводит к транспортированию в ядро инфицированной клетки химерного бежа вместе с секретирующим пептидом. Только небольшое количество Vpr обнаруживается при анализе фракции клеточных мембран, а секреция продукта в куль-туральную среду, по-видимому, полностью блокируется. Следует также отметить высокую прочность связывания как химерного белка, так и «процессированного» Vpr с ядром. Полученные нами результаты химического анализа, а также данные Lavallee et al. (1993) заставляют предположить, что связывание Vpr с ядром происходит благодаря образованию комплексов аналогичных взаимодействию между ДНК и гистонами.

Не смотря на высокую активность ядерного импорта в данной системе, этот белок эффективно инкорпорируется в вирусоподобные частицы при экспрессии in trans. При чем, в фракции ВПЧ обнаруживается помимо «процессированного» Vpr и некоторое количество химерного белка. Этот результат позволяет предположить, что лидерная последовательность не влияет на конформацию Vpr, поскольку даже незначительные нарушения третичной структуры предотвращают встраивание данного бежа в частицы. Анализ ВПЧ показал, что инкорпорация Vpr в частицы, по-видимому, не зависит от взаимодействия этого белка с липопротеидной мембраной, и связь его с Pr55Gag, по нашим данным, является не менее прочной, чем взаимодействие молекул полипротеина-предшественника между собой. Однако, как показал анализ частиц, лизированных в отсутствие 2меркаптоэтанола, дисульфидные связи не принимают участия в образовании ВПЧ.

Взаимодействие с молекулами полипротеина Pr55Gag, по-видимому, необходимо для инкорпорации Vpr в вирионы. Учитывая высокую активность механизма ядерного импорта, следует предположить, что такое взаимодействие происходит непосредственно после трансляции указанных белков, а не в процессе формирования ВПЧ. Однако, направленный транспорт Vpr к оболочке клетки в присутствии gag-продуктов нельзя объяснить только связыванием с белком-носителем. Секретирующая последовательность поверхностного гликопротеина Gp67 вируса ядерного полиэдроза, связанная с Vpr ковалентно, по-видимому, обладает высокоактивным в данной системе сигналом мембранного транспорта. Тем не менее, химерный белок импортируется в ядро инфицированных клеток под влиянием сильного нуклеофильного сигнала. Следует отметить, что, по данным Levy et al. (1994), на продуктивной стадии ВИЧ-инфекции наблюдается не только инкорпорация Vpr в вирионы, но и секреция данного белка в кровь в свободном состоянии. Однако в нашей системе, в отсутствии gag-продуктов наблюдалось подавление секреции белка, снабженного специфической лидерной последовательностью.

Таким образом, на основании приведенных выше данных можно предположить, что взаимодействие белка Vpr с полипротеином Pr55Gag происходит непосредственно после трансляции, до начала активации системы ядерного импорта. В результате такого взаимодействия нуклеофильный сигнал Vpr, по-видимому, блокируется одним из доменов Pr55Gag, что и обеспечивает активный транспорт образовавшегося комплекса к почкующейся частице. Можно предположить, что подавление ядерного импорта gag-продуктами обеспечивает не только инкорпорацию Vpr в вирионы, но и активизирует некоторые функции данного белка, необходимые на поздних стадиях жизненного цикла ВИЧ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чикова, Анна Константиновна, 1998 год

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ.

1. «Медицинская микробиология, вирусология, иммунология» под редакцией Л. Б. Борисова.//1994. Москва. «Медицина».

2. Иорданский С.Н., Лидеман Л.Ф., Гибадулин Р.А. Функции полипротеина Gag в морфогенезе вируса иммунодефицита человека (ВИЧ1) II Успехи современной биологии. 1998. т. 118. с. 50—68.

3. Иорданский С.Н., Лидеман Л.Ф., ЧиковаА.К., Гибадулин Р.А. Взаимодействие Gag полипротеинов-предшественников Рг55 и Р48с Prl60Gag-Pol при формировании вирусоподобных частиц ВИЧ-1 рекомбинантными штаммами вируса осповакцины. //1997. т. 42. №5. с. 205—208.

4. Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук «Молекулярное клони-рование».//1984. Москва «Мир».

5. Хазелтайн У.А., Вонг-Стааль Ф. Молекулярная биология вируса СПИДа.// 1988. В мире науки. №12, с.20.

6. Р. М. Хаитов, Г. А. Игнатьева «СПИД» //1992. Москва. Народная академия культуры и общечеловеческих ценностей.

7. AgostiniL., Navarro J.M., ReyF., BouhamdanM., Spire В., Vigne R., Sire J. The human immunodeficiency virus type 1 Vpr trans-activator: cooperation with promoter-bound activator domeins and binding to TFllB.il 1996. J. Mol. Biol. 261:599—606.

8. AyyavooV., Machalingam S., RafaeliY., Kudchodkar S., Chang D., Nagashunmugam Т., Williams W.V., WeinerD.B. HIV-1 viral protein R (Vpr) regulates viral replication and cellular proliferation in T cells and monocytoid cells in vitro.//1997. J. Leukoc. Biol. 62(1): 93—99.

9. Ayyavoo V., Mahboubi A., Machalingam S., Ramalingam R., KudchodkarS., WilliamsW.V., GreenD.R., WeinerD.B. HIV-1 Vpr suppresses immune activation and apoptosis through regulation of nuc-

lear factor kappa B.//1997. Nat. Med. 3(10): 1117—1123.

10. Balotta C., Lusso P., Crowley R., Gallo R.S., Franchini G. Anisense phosphorothioate oligodeoxynucleotides targeted to the vpr gene inhibit human immunodeficiency virus type 1 replication in primary human macrophages.//1993. J. Virol. 67,4409—4414.

11. BodeusM., Margottin F., DurandH., RouerE., Benarous R. Inhibition of procaryotic cell growth by HIV-1 Vpr.//1997. Res. Virol. 148(3): 207—213.

12. Bouhamdan M., Benichou S., Rey F., Navarro J.-M., Agosti-ni I., Spire В., Camonis J., Sluppaug G., Vigne R., Benarous R., Sire J. Human immunodificiency virus typel Vpr protein binds the uracil DNA glycosylase DNA repair enzyme.//1996. J. Virol. 70,697—704.

13. Bouhamdam M., XueY., BaudatY., HuB., Sire J., Pome-rantz R.J., Duan L.X. Diversity of HIV-1 Vpr interactions involves usage of the WXXF motif of host cell proteins.//1998. J.Biol. Chem. 273(14): 8009—8016.

14. Bukrinsky M.I.S., Haggerty M., Dempsey P.,Scarova N., Adz-hubei A., Spitz L., Lewis P., Goldfarb D., Emerman M., Stevenson M. A nuclear targrting signal within HIV-1 matrix protein that governs infection of non-dividing cells.//1993. Nature 365,666—669.

15. Emerman M. HIV-1, Vpr and the ceil cycle.//1996. Curr. iol.6(9): 1096—1103.

16. Campbell B.J., Hirsch V.M. Vpr of simian immunodeficiency virus of africa green monceys is required for replication in macaque macrophages and lymphocytes. //1997. J. Virol. 71: 5593—5602.

17. Cohen E.A., DehniG., Sodroski J.G., Haseltine W.A. (1990). Human immunodeficiency virus vpr product is a virion-associated regulatory protein. J. Virol. 64, 3097—3099.

18. Cohen E.A., Terwilliger E.F., JalinoosY., ProulxJ., Sodro-

ski J. G., Haseltine W.A. Identification of HIV-lvpr product and function.//1990. J. AIDS 3:11—18.

19. Di MarzioP., ChoeS., EbrightM., Knoblauch R, Landau N.R. Mutational analysis of cell cycle arrest, nuclear localization, and virion pacakaging of human immunodeficiency virus type 1 Vpr.//1995. J. Virol. 69: 7909—7916.

20. Emerman M. HIV-1, Vpr and cell cycle.//1996. Curr. Biol. 6(9): 1096—1103.

21. Gallay P., Stitt V., Mundy C., Oettinger M., Trono D. Role of karyopherin pathway in human immunodeficiency virus type 1 nuclear import. //1996. J. Virol. 70,1027—1032.

22. Goh W.C., Rogel M.E., KinseyC.M., Michael S.F., Nowak M.A., HahnB.H., Emerman M. HIV-1 Vpr increases viral expression by manipulation of the cell cycle: a mechanism for selection of Vpr in vivo. //1998. Nat. Med. 4(1): 65—71.

23. Gruenvald S., Heitz J. Baculovirus expression vector system: procedures and methods manual. PharMingen. 1993. P. 25—26.

24. He J., ChoeS., Walker R., Di MarzioP., Morgan D.O., Landau N.R. Human immunodeficiency virus type 1 protein R (Vpr) blocks cellc in the G2 phase of the cell cycle by inhibiting p34cdc activity .//1995. J. Virol. 69: 6705—6711.

25. Jovett J.B.M., Planelles V., PoonB., ShahN.P., Chen M.-L., Chen I.S.Y. The human immunodeficiency virus type 1 vpr gene arrests infected cells in the G2+M phase of the cell cycle.// 1995. J. Virol. 69: 6304—6313.

26. Kondo E., Mammano F., Cohen E.A., Gottinger H.C. The P6Gag domain of human immunodeficiency virus type 1 is sufficient for the incorporation of Vpr into heterologous viral particles.//1995. J. Virol. 69,2759—2764.

27. Lamb R.A., Pinto L.H. Do Vpu and Vpr of human immunodeficiency virus type 1 and NB of influenza B virus have ion channel activités in the viral life cycles?//1997. Virology 229:1—11.

28. Lavallee C., YaoX.-Y., LandhaA., GottungerH., Hadel-tine W.A., Cohen E.A. Requirement of the Pr55Gag precursor for incorporation of the Vpr product into human immunodeficiency virus type 1 viral particles. //1994. J. Virol. 68:1926—1934.

29. Levy D.N., Fernandes L.S., Williams W.V, WeinerD.B. Induction of cell differentiation by human immunodeficiency type

1 Vpr.//1993. Cell 72: 541—550.

30. Levy D.N., RafaeliY., MacGregor R.R., David B.W. Serum Vpr regulates productive infection and latency of human immunodeficiency virus type 1.//1994. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10873—10877.

31. Lu Y.-L., Bennett R.P., Wills Y.W., Gorelic R., Ratner L. A leucine triplet repeat sequence (LXX)4 in P6Gag is impotant for Vpr incorporation into human immunodeficiency virus type 1 particles.//^. J. Virol. 69:6873—6879.

32. Lu Y.-L., Sperman P., Ratner L. Human immunodeficiency virus type 1 viral protein R localization in infected cells and viri-ons.//1993. J. Virol. 67:6542—6550.

33. LuoZ., Butcher D.J., MuraliR., Srinivasan A., Huang Z. Structural studies of synthetic peptide fragments derived from the HIV-1 Vpr protein.//1998. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244(3): 732—736.

34. Macreadie I.G., Castelli L.A., Hewish D.R., Kirkpatrick A., Ward A.C., AzadA.A. A domein of humfn immunodeficiency virus type 1 Vpr containing repeated H(S/F)RIG amino acis motifs causes cell growth arrest and structural defects.//1995. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:2770—2774.

35. Macreadie I.G., Thorburn D.R., KirbyD.M., Castelli L.A., de Rozario N.L., Azad A.A. HIV-1 protein Vpr causes gross mitochondrial dysfunction in the yeast Sacharomyces cerevisiae.//1997. FEBS Lett. 410(2—3): 145—149.

36. Mahalingam S., Ayyavoo V., Patel M. Kieber-Emmons T., WeinerD.B. Nuclear import, virion incorporation, and cell cycle arrest/differentiation are mediated by distinct functional domains of human immunodeficiency virus type 1 Vpr.//1997. J. Virol. 71:6339—6347.

37. Mahalingam S., Khan S.A., Murali R., Jabbar M.A., Monk-en C.E., Collman R.G., Srinivasan A. Mutagenesis of putative alpha helical domein of HIV-1 Vpr: effect on stability and virion incorporation.//^. Proc. Natl Acad. Sci. USA 92: 3794—3798.

38. Mahalingam S., MacDonald B., Ugen K.E., Ayyavoo V., Agadjanyan M.G., Williams W.V., Weiner D.B. In vitro and in vivo tumor growth suppression by HIV-1 Vpr.//1997. DNA Cell Biol. 16(2): 137—143.

39. Mansky L.M. The mutation rate of human immunodeficiency virus type 1 is influenced by the vpr gene.// 1996. Virology 222(2): 391—400.

40. Miller M.D., Farnet C.M., Bushman F.D. Human im-munodefeciency virus type 1 preintegration complex: studies of organization and composition.//1997. J. Virol. 71: 5382—5390.

41.NieZ., Bergeron D., Subbramanian R.A., Yao X.J.,Cher-coune F., Rougeau N., Cohen E.A. The putative alpha helix 2 of human immunodeficiency virus type 1 Vpr contains a determinant which is responsible for the nuclear translocation of proviral DNA in growth-arrested cells.//1998. J. Virol. 72(5): 4104—4115.

42. OgawaK., ShibataR., KiyomasuT., Higuchil., Kishida Y., Ishimoto A., Adachi A. Mutational analysis of the human immunodefi-

ciency virus vpr open reading frame.//1989. J. Virol. 63,4110—4114.

43. O'Reilly D.R., Miller L.K., LuckowV.A. Baculovirus expression vectors. A laboratory manual. Oxford University Press. 1994.

44. Piller S.C., Evart G.D., Premkumar A., Cox G.B., Gage P.W. Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1 forms cation selective channeld in planar lipid bilayers.//1996. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 93.: 111—115.

45. Piller S.C., Jans P., GageP.W., JansD.A. Extracellular HIV-1 virus protein R causes a large invard current and cell death in cultured hippoeampal neurons: implications for AIDS pathology.// 1998. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95(8): 4595-^*600.

46. PoonB., JowettJ.B., Stewart S.A., Armstrong R.W., Rish-ton G.M., Chen I.S. (1997). Human immunodeficiency virus type 1 vpr gene induces phenotypic effects similar to thouse of the DNA alkylating agent, nitrogen mustard.// 1997. J. Virol. 71(5): 3961—3971.

47. Popov S., Rexach M., Rathner L., Bolbel G., Bukrinsky M. Viral protein R regulates docking of the HIV-1 preintegration complex to the nuclear pore complex.//1998. J. Biol. Chem. 273(21): 13347—13352.

48. Popov S., Rexach M., Zybarth G., Reiling N., Lee M.A., Ratner L., Lane C.M., Moore M.S., Bolbel G., Bukrinsky M. Viral protein R regulates nuclear import of the HIV-1 pre-integration complex.//1998. EMBO J. 17(4): 909—917.

49. Rafaeli Y., Levy D.N., Weiner D.B. The glucocorticoid receptor type II complex is a target of the HIV-1 vpr gene product.// 1995. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92: 3621—3625.

50. Re F., Braaten D., Franke E.K., Luban J. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr arrest the cell cycle in G2 by inhibiting the activation of p34cdc2-cyclin B.//1995. J. Virol. 69:6859—6864.

51. Re F., Luban J. HIV-1 Vpr: G2 cell cycle arrest, macrophages

and nuclear transport.// 1997. Prog. Cell Cycle Res. 3: 21—27.

52. de Rocquigny H., Petitjean P., Tanchou V., Decimo D., Drout L., Delaunay T., Darlix J.L., Roques B.P. The zinc fingers of HIV nucleocapsid protein NCp7 direct interactions with the viral regulatory protein Vpr.// 1997. J. Biol. Chem. 272(49): 30753—30759.

53. Rogel M.E., Wu L.I., Emerman M. The human immunodeficiency virus type 1 vpr gene prevents cell proliferation during chronic infection.// 1995. J. Virol. 69: 882—888.

54. Roques B.P., Morellet N., de Rocquigny H., Demene H., Schueller W., Jullian N. Structure, biological functions and inhibition of the HIV-1 proteins Vpr and NCp7.// 1997. Biochimie. 79(11): 673—680.

55. Sato A., Igarashi H., Adachi A., Hayamy M. Identification and localization of vpr gene product of human immunodeficiency virus tipe 1.//1990. Virus Genes 4(4): 303—312.

56. Sato A., Yoshimoto J., Isaka Y., Miki S., Suyama A., Adachi A., Hayami M., Fujiwara T., Yoshie O. Evidence for direct association of Vpr and Matrix protein pl7 within the HIV-1 virion.// 1996. Virology 220:208—212.

57. Schwartz M.D., Geraghty R.G., Panganiban A.T. HIV-1 particle release mediated by Vpu is distinct from that mediated by p6.// 1996. Virology 224(1): 302—309.

58. Serio D., Rizvi T.A., Cartas M. Kalyanaraman V.S., Weber I.T., Koprowski H., Srinivasan A. Development of a novel an-ti-HIV-1 agent from within: effect of chimeric Vpr-containing protease cleavage site residues on virus replication.// 1997. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94(7): 3346—3351.

59. Stark L.A., Hay R.T. Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) viral protein R (Vpr) interacs with Lys-tRNA syntetase: implications for priming of HIV-1 reverse.// 1998. J. Virol. 72(4): 3037—3044.

60. Stivahtis G.L., Soares M.A., Vodicka M.A., Hahn B.N., Emer-man M. Conservation and host specifity of Vpr-mediated cell cycle arrest suggest a fundamental role in primate lentivirus evolution and biology.// 1997. J. Virol. 71(6): 4331-4338.

61.StrebelK.} KlimkaitT., Martin M.A. A novel gene of HIV-lvpu and its 16kilodalton product.// 1988. Science 241: 1221—1223.

62. Subbramanian R.A. and Cohen E.A. Molecular biology of the human immunodeficiency virus accessory proteins.// 1994. J. Virol. 68, 6831—6835.

63. Subbramanian R.A., Kessous-Elbaz A., Lodge R., Forget J., YaoXJ., Bergeron D., Cohen E.A. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr is a positive regulator of viral transcription and infectivity in primary human macrophages.// 1998. J. Exp. Med. 187(7): 1103—1111.

64. Subbramanian R.A., Yao X.J., Dilhuydy H., Rougeau N., Bergeron D., Robitialle Y., Cohen E.A. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr localisation: nuclear transport of a viral protein modulated by a putative amphipathic helical structure and its relevance to biological activity.//1998. J. Mol. Biol. 278(1): 13—30.

65. Summers M.D., Smith G.E. A manual of metods for baculovi-rus vectors and insect cell culture procedures. 1987. Texas Agricultural Experiment Station Bulletin. №1555.

66. Thomas M.J., Niederman W., Hastings P., Rathner L. Myris-toylation-enhanced binding of the HIV-1 Nef protein to Teell sceletal matrix.// 1993. Virology 197. P. 420—425.

67. Tristem M., Marshall С., Karpas A. Petrik J., Hill F. Orogin of vpx in lentiviruses.//1990. Nature 347: 341—342.

68. Tristem M., Purvis A., Quicke D.L. Complex evolutionary history of primate lentiviral vpr genes.//1998. Virology 240(2): 232—237.

69. TungH.Y., de RocquignyH., ZhaoLJ., CayalaX., Roques B.P., Ozon R. Direct activation of protein phosphatase -2AO by HIV-1 encoded protein complex NCp7:Vpr.//1997io FEBS Lett. 401(2—3): 197—201.

70. Wagner R., DemlL., Fliesbrach H. Wanner G., WolfH. Assembly and extracellular release of chimeric HIV-1 Pr55Gag retro virus-like perticles. //1994. Virology 200:162—175.

71. WangJ.J., LuY.-L., RatnerL. Particle assembly and vpr expression in human immunodeficiency virus type lkifected cells demonstrated by immunoelectron microscopy.//1994. J. General Virol. 75: 2607—2614.

72. Wang L., Mukherjee S., Jia F., Narayan O., Zhao L.J. Interaction of virion protein Vpr of human immunodeficiency virus type 1 with cellular and transcription facto Spl and trans-activation of viral long terminal repeat.// 1995. J. Biol. Chem. 270:25564—25569.

73.WangL., MukherjeeS., NarayanO., ZhaoLJ. Characterization of a leucine-zipper-like domeinin Vpr protein of human immunodeficiency virus type 1.//1997. Gene 178(1—2): 7—13.

74. Withers-Ward E.S., Jowett J.B.M., Stewart S.A., Xie Y.-M, Garfinkel A., ShibagakiY., Chow S.A., ShahN., Hanaoka F., Saw-itzD.G., Armstrong R.W., SouzaL.M., Chen I.S.Y. Human immunodeficiency virus type 1 Vpr interacts with HHR23A a cellular protein implicated in nucleotide excision DNA repair.//1997. J. Virol. 71: 9732—9742.

75. Wong-Staal F., Chanda P.K. and Ghrayeb J. HIV type III: the eighth gene. //1987. AIDS Res. Hum. Retroviruses 3: 33—39.

76. Wu X.Y., Liu H.M., Kappes J.C. Proteolitic activity of human immunodeficiency virus Vpr-Protease and Vpx-Protease fusion pro-teins.//1996. Virology 219: 307—313.

77. Wu X.Y., Liu H.M., XiaoH.L., Kim J., SeshaiahP., Natsou-lis G., Boece J.D., Hahn B.H., Kappers J.C. Targeting foreion proteins to human immunodeficiency virus particles via fusion with Vpr and Vpx.//1995. J. Virol. 69: 3389—3398.

77. YaoX.-J., Subbramanian R.A., RougeauN. BoisvertF., Be-gregon D., Cohen E.A. Mutagenic analysis of HIV-1 Vpr: role of a predicted №N-terminal alpha-helical structure on Vpr nuclear localisation and virion incorporation.//1995. J. Virol. 69:7032—7044.

78. Yu X., Matsuda Z., Yu. Q.-C. Lee T.H., Essex M. Vpx of simian immunodeficiency virus is localised primarily outside the core in mature virions. //1993. J. Virol. 67:4386—4390.

79. Yuan X., Matsuda Z., Matsuda M., Essex M., LeeT.-H. Human immundeficiency virus vpr gene encodes a virion-associated protein. //1990. AIDS Res. Hum. Retroviruses 6:1265—1271.

80. Zhang C., Rasmussen C., Chang L.G. Cell cycle inhibitory effects of HIV and SIV Vpr and Vpx in the yeast Schizosaccharomyces pombe. //1997. Virology 230 (1): 103—112.

81. Zhang L., Huang Y., YuanH., Tuttleton S., Ho D.D. Genetic characterization of vif, vpr and vpu sequences from long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection. //1997. Virology 228(2): 340—349.

82. Zhang S., Pointer D., Singer G., FengY., ParkK., Zhao L.J. Direct binding to nucleic acids by Vpr of human immunodeficiency virus type 1. //1998. Gene 212:157—156.

83. Zhao L.-Z., MukherjeeS., NarayamO. Biochemical mechanism of HIV-1 Vpr function: soecific interaction with a cellular protein. //1994. J. Biol. Chem. 269:15577—15582.

84. Zhao L.-Z., WangL., MukherjeeS., NarayanO. Biochemical mechanism of HIV-1 Vpr function: oligomerization mediated by the

N-terminal domein. //1994. J. Biol. Chem. 269: 32131—32137.

85. Zhou Y., Lu Y., Ratner L. Arginine residues in the Cterminus fo HIV-1 Vpr are impotant for nuclear localization and cell cycle arrest. //1998. Virology 242(2): 414—424.