Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Закирова, Светлана Анатольевна

• Закирова, Светлана Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Закирова, Светлана Анатольевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика вПАСА-ацилаз

1.1.1. Систематика цефалоспорин-ацилаз

1.1.2. Гомология последовательностей цефалоспорин-ацилаз

1.1.3. Свойства цефалоспорин-ацилаз

1.1.4. Структура генов цефалоспорин-ацилаз

1.1.5. Процессинг G17АСА-ацилаз

1.1.6. Клонирование и гетерологичная экспрессия цефалоспорин-ацилаз

1.1.7. Коэкспрессия субъединиц G17 АС А-ацилаз in vivo

1.2. Пространственные структуры вПАСА-ацилаз 23 1.2.1. Конформация спейсерного пептида

1.3. Аминокислотные остатки существенные для катализа и активации 26 фермента 017АСА-ацилазы

1.4. Роль а -аминогруппы N-концевого серина р-субъединицы в катализе 28 и активации фермента С17АСА-ацилазы

1.5. Механизм и сайты автопротеолиза ОПАСА-ацнлазы

1.6. Активный центр GlTACA-ацилазы

1.7. Методы направленной эволюции в исследовании 017АСА-ацилаз

1.8. Методы сайт-направленного мутагенеза для повышения активности 40 и стабильности цефалоспорин-ацилаз

1.8.1. Сайт-направленный мутагенез поверхностных остатков для 41 повышения стабильности фермента в щелочных условиях

1.8.2. Сайт-направленный мутагенез ключевых остатков для повышения 43 активности 017АСА-ацилаз

1.9. Белок-белковые взаимодействия

1.9.1. Классификция белок-белковых взаимодействий

1.9.2. Область межсубъединичных взаимодействий белок-белкового 44 комплекса

1.9.3. Методы исследований белок-белковых взаимодействий

1.9.4. Виртуальное аланиновое сканирование

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантные аналоги ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты бактерии Brevundimonas diminuta»

Ацилазы глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (вПАСА-ацилазы, ЕС 3.5.1.93) - промышленные ферменты, наряду с пенициллинацилазами, способные превращать цефалоспорины в ценные промежуточные соединения, используемые для производства новых антибиотиков. вПАСА-ацилаза катализирует ферментативное превращение глутарил-7-АСА (G17ACA) в 7-аминоцефалоспорановую кислоту (7-АСА), при котором происходит расщепление амидной связи с образованием глутарата и 7-АСА [Ichikawa et al, 1981а; Ichikawa et al., 1981b],

Активные ферменты являются гетеротетрамерами, состоящими из 2х а- и 2х Р-субъединиц, которые формируются из одноцепочечного полипептидного предшественника в результате специфического процессинга белка-предшественника и характеризуются высокой активностью по отношению к G17ACA, при низкой активности по отношению к цефалоспорину С [Ichikawa et al., 1981а; Matsuda et al., 1985; Ishii et al., 1994].

Высокое биотехнологическое значение вПАСА-ацилаз определяет интерес к разработке эффективных и экономичных систем продукции этого фермента. В тоже время, существующие методы получения рекомбинантных 017АСА-ацилаз нельзя признать достаточно эффективными, что связано со сложной структурой предшественника и недостаточной изученностью закономерности процессинга и сборки функционально-активного тетрамера фермента [Li et al., 1998; Li et al., 2004]. Необходимость освобождения иммобилизованных препаратов С17АСА-ацилаз от примесей неспецифических бета-лактамаз и эстераз, относительно невысокая каталитическая активность фермента, нестабильность тетрамера белка под действием мягких денатурирующих агентов, при умеренных температурах, частичная инактивация фермента под действием «сшивающих» агентов, осложняют получение эффективных иммобилизованных препаратов вПАСА-ацилаз [Friehs et al., 1993; Vethanayagam et al., 2005].

В этой связи весьма актуальным является проведение исследований, посвященных созданию новых штаммов-продуцентов и усовершенствованию 7 известных методов получения препаратов GlVACA-ацилазы, а также исследований, направленных на углубленный структурно-функциональный анализ этого фермента и создание новых аналогов GnACA-ацилазы с улучшенными физико-химическими и ферментативными свойствами, с использованием методов биоинформатики и белковой инженерии.

Целью настоящей работы являлось создание систем экспрессии аналогов 017АСА-ацилазы, обеспечивающих эффективный синтез данных ферментов в клетках E.coli и упрощающих процедуры их очистки и иммобилизации, а также разработка подходов для получения более стабильных аналогов фермента, изучение особенностей процессов формирования четвертичной структуры 017АСА-ацилазы. Для этого в работе решались следующие задачи:

1. Клонирование гена GnACA-ацилазы бактерии Brevundimonas diminuta (BrdGIA), конструирование вариантов гена BrdGIA, модифицированных присоединением аффинных остатков к различным участкам кодирующей последовательности фермента.

2. Оптимизация процессов биосинтеза созданных вариантов BrdGIA в штаммах E.col/-пр оду центах, отработка условий получения и очистки рекомбинантных аналогов BrdGIA и изолированных субъединиц фермента.

3. Разработка схемы одностадийной аффинной очистки аналога BrdGIA с присоединенным N-концевым хитин-связывающим доменом на хитиновых сорбентах, определение кинетических и физико-химических параметров очищенного фермента.

4. Исследование закономерностей реконструкции и сборки функционально-активной BrdGIA in vitro с использованием изолированных рекомбинантных а- и р-субъединиц.

5. Изучение области контакта между субъединицами GnACA-ацилазы, определение относительного вклада гидрофобных и электростатических взаимодействий в поддержание четвертичной структуры тетрамера 017АСА-ацилазы.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Закирова, Светлана Анатольевна

ВЫВОДЫ:

1. Клонирован ген GlVACA-ацилазы бактерии Brevnndimonas diminuta (BrdGlA), оптимизированы системы экспрессии для получения «нативной» рекомбинантной BrdGlA и ее аналогов в клетках E.coli.

2. Показано, что продуцируемые в клетках E.coli рекомбинантные аналоги GlVACA-ацилазы, несущие N- и С-концевые аффинные модификации, подвергаются правильному автопротеолитическому процессингу с образованием функционально-активных ферментов.

3. Разработана схема одностадийной аффинной очистки аналога GlVACA-ацилазы с присоединенным N-концевым хитин-связывающим доменом на хитиновых сорбентах, позволяющая получать стабильный фермент с высоким выходом. Показано, что такой аналог GnACA-ацилазы обладает повышенными термостабильностью и улучшенными энзиматическими характеристиками по сравнению с ^модифицированными рекомбинантными вариантами этого фермента.

4. Показано, что формирование нативной пространственной конформации субъединиц С17АСА-ацилазы происходит в процессе синтеза и процессинга фермента и взаимодействия вновь синтезируемых субъединиц.

5. С помощью структурно-графического анализа димера и тетрамера GlVACA-ацилазы показано, что доминирующим типом взаимодействий в области контакта двух субъединиц являются соответственно гидрофобные и электростатические взаимодействия.

1.10. Заключение

Основным направлением белковой инженерии ОПАСА-ацилаз является создание ферментов с улучшенными ферментативными и физико-химическими характеристиками, обладающих повышенной стабильностью пространственной структуры, устойчивостью к температурным изменениям, химическим агентам.

Иммобилизация на различных носителях является распространенным способом создания более стабильных биокатализаторов на основе ОПАСА-ацилаз [Alonso-Morales et al. 2004, Park et al., 2002a, 2003b]. В работах [Park et al., 2002b, 2003a] иммобилизация осуществлялась на модифицированном силикагеле. Несмотря на ухудшение кинетических характеристик иммобилизованного фермента (снижение Vmax, повышение Km), по сравнению со свободным ферментом, иммобилизованная 017АСА-ацилаза была активна в более широком рН диапазоне и отличалась повышенной температурной стабильностью. Множество исследований посвящено получению более стабильных аналогов 017АСА-ацилазы методами белковой инженерии [Seung et al., 2001; Oh et al, 2003; Saito et al., 1996; Yamada et al, 1996].

Несмотря на известные данные о лабильности четвертичной структуры ацилазы, [Kim et al, 2000] нет работ, посвященных изучению межсубъединичных взаимодействий как в димере С17АСА-ацилазы, так и в гетеротетрамере. В то же время, представляется очевидным, что знание закономерностей фолдинга фермента, сборки активного гетеротетрамерного комплекса, определение констант взаимодействия субъединиц фермента будут способствовать рациональному дизайну и получению улучшенных аналогов С17АСА-ацилазы для создания более стабильных биокатализаторов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Реактивы

Додецил сульфат натрия (ДСН) - (Fluka, Германия), Твин 20, Кумасси R-250, гидроксид натрия, тетраборат натрия, карбонат натрия, хлорид марганца (II), хлорид калия, хлорид кальция, фосфат натрия, хлорид натрия, гидрокарбонат натрия, (3-меркаптоэтанол, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (Sigma-Aldrich, UK), глицерин - (Serva, Германия), изопропанол (Ос.ч., «Экос-1», Россия), питательные среды (Difco, США). Хитиновые гранулы для аффинной хроматографии гибридных белков с хитин-связывающим доменом (New England Biolabs, США).

2.2. Ферменты и коммерческие наборы

Эндонуклеазы рестрикции, Taq-полимераза, Pfu-ДНК-полимераза (MBI Fermentas, Вильнюс, Литва; Сибэнзим, Новосибирск, Россия), Т4ДНК лигаза (Roche Diagnostics,East Sussex, Англия). Набор для выделения плазмидной ДНК QIAprep Miniprep Kit (Qiagen, West Sussex, Англия). Набор для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, West Sussex, Англия).

2.3. Бактериальные штаммы

Различные штаммы псевдомонад находились в коллекции Центра «Биоинженерия» РАН. Штамм Brevundimonas diminuta ВКМ В-1297 был получен из Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Для конструирования рекомбинантных плазмид использовали штамм Escherichia coli XLl-Blue recAl endAl gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relAl lac [FyproAB lacPZAM15 TnlO (Tet1)] (Stratagene, США). Экспрессию вариантов 017АСА-ацилазы осуществляли в штамме E.coli BL21 (DE3) [F-, ompT, hsdSB (гв-, тв-), dcm, gal, dcm (DE3)] (Novagen, США), который синтезирует РНК-полимеразу фага Т7, а также обладает сниженной протеазной активностью, что способствует повышению выхода целевых белков.

2.4. Бактериальные среды

Для выращивания E.coli использовали среду LB (Luria-Bertani): 0.5% дрожжевого экстракта, 1% бакто-триптона, 1% NaCl, рН 7,5. Для получения твердых сред при приготовлении чашек Петри в соответствующую жидкую среду добавляли агар до концентрации 1.5%.

Для выращивания штаммов E.coli BL21(DE3) - продуцентов субъединиц вПАСА-ацилаз использовали среду Overnight Express ТВ medium (Novagen, США).

Антибиотики: ампициллин, канамицин.

Методы

2.5. ДНК манипуляции и компьютерные программы

Определение нуклеотидных последовательностей ПЦР-фрагментов и плазмид проводили путем автоматического секвенирования на приборе ABIPrizm 3100 DNA Sequencer с использованием набора Applera «fluorescent Big dye Cycle sequencing kit». Нуклеотидные последовательности анализировали с помощью пакета программ Vector NTI8 (Informax Inc., США).

2.6. Виртуальное аланиновое сканирование

С целью определения аминокислотных остатков, образующих область контакта между субъединицами в димере и тетрамере вПАСА-ацилаз и выявления среди них значимых, был выполнен анализ зоны контакта между мономерами с помощью виртуального аланинового сканирования на сервере Robetta Oittp://robetta.bakerlab.org). Для этого каждый аминокислотный остаток поочередно заменяли на аланин и оценивали изменение энергии взаимодействия между субъединицами в результате замены по уравнению, приведенному в общем виде [Kortemme et al., 2004а]:

AG А/В = (GA/В - Ga - ОД - (G'A/B " G'A " G'B), где: AGa/B ~ изменение энергии связывания между партнерами белок-белкового взаимодействия до и после замены; Gа/В — свободная энергия комплекса дикого типа; Ga - свободная энергия белка-партнера А дикого типа; Gg - свободная энергия белка-партнера В дикого типа; G'a/B ~ свободная

52 энергия комплекса мутантного типа; С'д - свободная энергия белка-партнера А мутантного типа; G'g — свободная энергия белка-партнера В мутантного типа.

Программа, используемая для визуализации результатов сканирования и структурного анализа - ViewerLite v.5.0.

2.7. Рекомбинантные плазмиды

Для экспрессии 017АСА-ацилазы и ее различных аналогов использовали сконструированную нами ранее плазмиду рАСТ7 [Эльдаров с соавт., неопубл.] и вектор рЕТ28С (Novagen, США). В качестве источника хитин-связывающего домена использовали плазмиду pTYB4 (New England Biolabs, США).

В ходе работы были получены следующие конструкции для экспрессии вариантов ИЛАСА-ацилазы и отдельных субъединиц фермента:

1. pSVH0106 - вектор экспрессии «полноразмерной» BrdGlA.

2. pSVH1811 - вектор экспрессии варианта BrdGlA без последовательности сигнального пептида.

3. pSVH1811/H - вектор экспрессии BrdGlA с гексагистидиновой последовательностью, присоединенной к С концу Р-субъединицы (BrdGlA/H).

4. pSVH0107 - вектор экспрессии, направляющий в клетках E.coli синтез BrdGlA с хитин-связывающим доменом присоединенным к С-концу а-субъединицы (BrdGLA/ChBD).

5. pSVH0108 - вектор экспрессии направляющий в клетках E.coli синтез BrdGlA с присоединенным N-концевым модифицированным хитин-связывающим доменом (BrdGlA/NmChBD).

6. pSVHCm - рекомбинантная плазмида с присоединенным мутантным хитин-связывающим доменом к С-концу а-субъединицы (BrdGlA/CmChBD)

7. pMTVl - вектор экспрессии а-субъединицы с N-концевым ChBD (ChBDa).

8. рМТУЗ - вектор экспрессии рекомбинантной BrdGlA с декапiстидиновой последовательностью HaN-коице р-субъединицы (G1A10H).

2. 8. Синтетические олигонуклеотиды

При конструировании векторов экспрессии изолированных а- и (3-субъединиц 017АСА-ацилазы использовали синтетические олигонуклеотиды, структура и номенклатура которых приведены в таблице 2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Закирова, Светлана Анатольевна, 2009 год

1. Arroyo, M., Acebal, C., & Castillon, M.P. 2003. Biotechnological applications of penicillin acylases: state-of-the-art. Appl. Microbiol. Biotechnol. 60:507-514.

2. Aramori, I., Fukagawa, M., Tsumura, M., Iwami, M., Yokota, Y., Kojo, H., Kohsaka, M., Udea, Y., and Imenaka, H. 1991a. Isolation of soil strains producing new cephalosporin acylases. J. Ferment. Bioeng. 72:227-231.

3. Aramori, I., Fukagawa, M., Tsumura, M., Iwami, M., Ono, H., Ishtani, Y., Hiroshi, K., Kojo, H., Kohsaka, M., Udea, Y., and Imenaka, H. 1992. Comparative characterization of new glutaryl-7-АСА acylase. J. Ferment. Bioeng. 73:185-192.

4. Alonso-Morales, N. A., Lopez-Gallego, F., Betancor, L., Hidalgo, A., Mateo, C., Fernandez-Lafuente, R., and Guisn, J. M. 2004. Reversible immobilization ofglutaryl acylase on SEPABEADS coated with polyethylenimine. Biotechnol. Progr. 20: 533-536.

5. Alam, M. M., N. Nikaidou, H. Tanaka, and T. Watanabe. 1995. Cloning and sequencing of chiC gene of Bacillus circulans WL-12 and relationship of its product to some other chitinases and chitinase-like proteins. J. Ferment. Bio eng. 80:454-461.

6. Abraham, E. P., and Loader, P. B. 1972. Cephalosporin C, In:Cephalosporins: Chemistry and Biology, pp. 2-26, E. H. Flynn, ed., Academic Press, New York.

7. Abraham, E. P., and Newton,G. G.F. 1961. The structure of cephalosporin C. Biochem. J. 79: 377-393.

8. Barber,M.S., Giesecke,U., Reichert,A., & Minas,W. 2004. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 88:179-215.

9. Barends, T. R., Yoshida, H., and Dijkstra, B. W. 2004. Three-dimensional structures of enzymes useful for beta-lactam antibiotic production. Curr.Opin.Biotechnol. 15: 356-363.

10. Brannigan JA, Dodson G, Duggleby HJ, Moody PC, Smith JL, Tomchick DR, Murzin AG. A 1995: protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Erratum in: Nature. 378:(6557):644-638.

11. Binder, R. G., Numata, K., Lowe, D. A., Murakami, Т., and Brown, J. L.1993. Isolation and characterization of a Pseudomonas strain producing glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase. Appl. Environ.Microbiol. 59:3321—3326.

12. Bradford M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding. Anal.Biochem. 72:248-254.

13. Battistel, E., Bianchi, D., Bortolo, R., & Bonoldi, L. 1998. Purification and stability of glutaryl-7-АСА acylase from Pseudomonas sp. Appl. Biochem. Biotechnol. 69:53-67.

14. Bruggink, A., Roos, E.C. & deVroom, E. 1998. Penicillin acylase in the industrial production of beta-lactam antibiotics. Organic Process Res. Dev. 2:128-133.

15. Balasingham, K., Warburton, D., Dunnill, P., & Lilly, M.D. 1972. The isolation and kinetics of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta 276:250-256 .

16. Choi, K. S., J. A. Kim, and H. S. Kang. 1992. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacteriol. 174:6270-6276.

17. Chilov G.G, Stroganov O.V, Svedas VK. 2008. Molecular modeling studies of subbstrat binding by penicillin acylase. Biochemistry(Mosc) 3(l):56-64.

18. Deshpande, B.S., Ambedkar, S.S., Sudhakaran, V.K. & Shewale, J.G. 1994 Molecular biology of p-lactam acylases. World J. Microbiol. Biotechnol. 10:129138.

19. Deshpande, B. S., Ambedkar, S. S., and Shewale, J. G. 1996.Cephalosporin С and penicillin V acylase formation by Aeromonas sp. ACY 95. World J. Microbiol. Biotechnol. 12:373-378.

20. Diez, В., E.Mellado, R.Fouces, M.Rodriguez, and J.I.Barredo. 1996. Recombinant Acremonium clirysogenum strain for the industrial production of cephalosporin. Microbiologia. 12:359-370.

21. Duggleby H.J, Tolley S.P, Hill C.P, Dodson E.J, Dodson G, Moody P.C. 1995 Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre. Nature. 19:373(6511):264-8.

22. Del Rio G, Rodriguez ME, Munguia ME, Lopez-Mungui A, Soberon X. Mutant 1995. Escherichia coli penicillin acylase with enhanced stability at alkaline pH. BiotechnolBioeng. 20:48(2): 141-8.

23. Eisenhaber F., Argos P. 1996.Hydrophobic regions on protein surfaces: definition based on hydration shell structure and a quick method for their computation Protein Eng. 9: 1121-1133.

24. Friehs,K. & Reardon,K.F. 1993. Parameters influencing the productivity of recombinant E. coli cultivations. Adv. Biochem. Eng Biotechnol. 48:53-77

25. Fersht A.R., and L.Serrano. 1993 Principals of protein stability derived from protein experiments.Curr.Opin.Struct.Biol. 3:75-83.

26. Franzosi, G., Battistel, E., Gagliardi, I., and Van der Goes, W. 1995. Screening and characterization of microorganisms with glutaryl-7-ADCA acylase activity. Appl. Microbiol. Biotechnol. 43:508-513.

27. Hubbard S.J., Argos P. 1994. Cavities and packing at protein interfaces . Protein Sci. 3:№ 12. 2194-2206.

28. Huabao Zheng, Jun Chena, Liuli Sua, Yuhua Zhaob, Yunliu Yang, HongYu Zenge, Gang Xue, Sheng Yang, Weihong Jiang. 2007. One-step purification and immobilization of his-tagged GL-7-ACA acylase. Enzyme and Microbial Technology. 41:474-479.

29. Ishiye, M. & Niwa,M. 1992. Nucleotide sequence and expression in Escherichia coli of the cephalosporin acylase gene of a Pseudomonas strain. Biochim. Biophys. Acta. 1132:233-239

30. Janin J. 1999. Wet and dry interfaces: the role of solvent in protein-protein and protein-DNA recognition . Structure. 7: 277-279.106

31. Jones S. and Thornton J.M. 1996. Principles of protein-protein interaction . Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:13-20.

32. Jin Kwang Kim, In Seok Yang, Sangkee Rhee, Zbigniev Dauter, Young Sik Lee, Sung Soo Park and Kyung Hyun Kim. 2003 Crystal Structures of Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase: Insight into Autoproteolytic Activation. Biochemistry. 42:4084-4093.

33. Guo, H. C., Xu, Q., Buckley, D., and Guan, C. 1998. Crystal structures of Flavobacterium glycosylasparaginase. An N-terminal nucleophile hydrolase activated by intramolecular proteolysis J. Biol.Chem. 273:20205-20212.

34. Kim, D.W., Kang, S.M. and Yoon, K.H. 1999. Isolation of New Pseudomonas diminuta KAC-1 Strain Producing Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase.J. Microbiol. 37: 200-205.

35. Kumar, K.K., Sudhakaran,V., Deshpande,B.S., Ambedkar,S.S., & Shewale,J.G. 1993.Cephalosporin acylases: enzyme production, structure and application in the production of 7-ACA. Hindustan Antibiot. Bull. 35:111-125.

36. Klibanov AM. 2001 Improving enzymes by using them in organic solvents .Nature.409 (6817):241-6.

37. Kim, S. and Kim, Y. 2001. Active site residues of cephalosporin acylase are critical not only for enzymatic catalysis but also for post-translational modification. J.Biol.Chem. 276:48376-48381.

38. Khang, Y. H., and Yoo, В. H. 2000. Isolation and characterization of a novel soil strain, Pseudomonas cepacia BY21, with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase activity. Biotech. Lett. 22:317-320.

39. Kim, Y., Kim, S., Earnest, T. N., and Hoi, W. G. 2002. Precursor structure of cephalosporin acylase. Insights into autoproteolytic activation in a new N-terminal hydrolase family. J.Biol.Chem. 277:2823-2829.

40. Kim D.E., Chivian D. and Baker D. 2004. Protein structure prediction and analysis using the Robetta server. Nucleic Acids Research. 32: 526-531.

41. Kortemme T. and Baker D. 2002. A simple physical model for binding energy hot spots in protein protein complexes .PNAS. 99: 14117 14121.

42. Kortemme T. and Baker D. 2004a. Computational design of protein protein interactions Current Opinion in Chemical Biology. 8: 91 97.

43. Kortemme Т., Kim D.E., Baker D. 2004b. Computational alanine scanning of protein protein interfaces.^/. STKE. 2004b. 219: 2-12.

44. Keskin О., Ma B. and Nussinov R. 2005. Hot regions in protein-protein interactions: the organization and contribution of structurally conserved hot spot residues J. Mol. Biol. 345: 1281-1294.

45. Youngsoo Kim, Wim GJ. Hoi. 2001. Structure of cephalosporin acylase in complex with glutaryl-7-aminocephalosporanic acid and glutarate: insight into the basis of its substrate specificity .Chemistry & Biology.8:1253-1264.

46. Lee, Y. S., Kim, H. W., and Park, S. S. 2000a. The role of alpha-amino group of the N-terminal serine of beta subunit for enzyme catalysis and autoproteolytic activation of glutaryl 7- aminocephalosporanic acid acylase. J.Biol.Chem. 275:39200-39206.

47. Luo Hui, Yu Huimin, Li Qiang, Shen Zhongyao. Rapid Cloning and Expression of Glutaryl-7-Aminocephalosporanic Acid Acylase Genes from Soil Samples. 2005. Tsinghua Science and Technology. 10:529-534.

48. Ledent P, Duez C, Vanhove M, Lejeune A, Fonze E, Charlier, et al. 1997. Unexpected influence of a C-terminal-fused his-tag on the processing of an enzyme and on the kinetic and folding parameters. FEBS Letters. 413:194-196.

49. Larsen T.A., Olson A.J., Goodsell D.S. 1998. Morphology of protein-protein interfaces. Structure. 6: 421-427.

50. Li, Y., Chen, J., Jiang, W., Мао, X., Zhao, G., and Wang, E. 1999. In vivo post-translational processing and subunit reconstitution of cephalosporin acylase from Pseudomonas sp. 130. Eur.J.Biochem. 262:713-719.

51. Lawrence M.C., Colman P.M. 1993. Shape complementarity at protein/protein interfaces .J. Mol. Biol. 234:№ 4 946 950.

52. Lopez Garcia et all. Process for modifying the enzyme 7 beta-(4-carboxybutanamido) cephalosporinacylase and purifying said enzyme in single chromatographic step. European patent EP0839914,1997-10-30.

53. Matsuda, A. & Komatsu,K.I. 1985. Molecular cloning and structure of the gene for 7 beta-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase from a Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 163:1222-1228.

54. Matsuda, A., Matsumaya, K., Yamamoto, K., Ichikawa, S., and Komatsu,K. 1987a. Cloning and characterization of the genes for two distinct cephalosporin acylases froma Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 169:5815-5820.

55. Matsuda, A., Toma, K., and Komatsu, K. 1987b. Nucleotide sequence of the genes for two distinct cephalosporin С acylases from a Pseudomonas strain. J. Bacteriol. 169:5821-5826.

56. McDonough, M.A., Klei, Y.E.,and Kelly, J.A.I999. Crystal structer of penicillinG acylase from Brol mutant strain of Providencia rcXgXgcxi.Prot.Sci. 8:1971-1981.

57. Matthews BW, Nicholson H, Becktel WJ. 1987 Enhanced protein thermostability from site-directed mutations that decrease the entropy of unfolding. Proc Natl AcadSci USA. 84(19):6663-7.

58. McCoy A J., Chandana Ера V., Colman P.M. 1997. Electrostatic complementarity at protein/protein interfaces .J. Mol. Biol. 268: 570-584.

59. Muegge I., Schweins Т., Warshel A. 1998. Electrostatic contributions to protein-protein binding affinities: application to Rap/Raf interaction .Protein. 30: 407-423.

60. Nobbs, T. J., Ishii, Y., Fujimora, Т., Saito Y., and Niwa, M. 1994. Chemical modification and site directed mutagenesis of tyrosine residue in cephalosporin С acylase from Pseudomonas strain N 176. J. Ferment.Bio eng. 77:604—609.

61. Oh, В., Kim, K, Park, J., Yoon, J., Han, D., and Kim, Y. 2004. Modifying the substrate specificity of penicillin G acylase to cephalosporin acylase by mutating active-site residues. Biochem.Biophys.Res.Comrmm. 319:486-492.

62. Otten, L. G., Sio, C. F., Vrielink, J., Cool, R. H., and Quax, W. J. 2002. Altering the substrate specificity of cephalosporin acylase by directed evolution of the Beta -subunit. J.Biol.Chem. 277:42121-42127.

63. Otten, L. G., Sio, C. F., van der Sloot, A. M., Cool, R. H., and Quax, W. J. 2004. Mutational analysis of a key residue in the substrate specificity of a cephalosporin acylase. Chembiochem. 5:820-825.

64. Oinonen C, Tikkanen R, Rouvinen J, Peltonen L. 1995. Three-dimensional structure of lysosomal aspartylglucosaminidase. Nat Struct Biol. 12:1102-8.

65. Parmar, A., Kumar, H., Marwaha, S.S., & Kennedy, J.F. Recent Trends in Enzymatic 1998. Conversion of Cephalosporin С to 7-Aminocephalosporanic Acid (7-ACA). Critical Reviews in Biotechnology. 18:1-12.

66. Politino, M., Tonzi, S. M., Burnett, W. V., Romancik, G., and Usher, J. J. 1997. Purification and characterization of a cephalosporin esterase from Rhodosporidium toruloides. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63:4807-4811.

67. Park Seung Won, Jeewon Lee, Suk In Hong, Seung Wook Kim. 2003a. Enhancement of stability of GL-7-ACA acylase immobilized on silica gel modified by epoxide silanization .Process Biochemistiy.39:359-366.

68. Park, S. W., Lee, J. W., Hong, S. I., and Kim, S. W. 2003b. Immobilization of glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase on silica gel and enhancement of its stability. Appl. Biochem. Biotechnol. 104: 185—198.

69. Park Seung Won, Sang Yong Choi, Koo Hun Chungb, Suk In Honga, Seung Wook Kima. 2002a. Characteristics of GL-7-ACA acylase immobilized on silica gel through silanization .Biochemical Engineering Journal. 11:87-93.

70. Park, S. W., Kim Y. I., Chung, К. H., Hong, S. K., and Kim, S. W. 2002b. Covalent immobilization of GL-7-ACA acylase on silica gel through silanization. Reactive and Functional Polymers 51: 79-92.

71. Querol E, Perez-Pons JA, Mozo-Villarias A. 1996. Analysis of protein conformational characteristics related to thermostability .Protein Eng. 9(3):265-71.

72. Reyes, F., Martinez, M.J. & Soliveri, J. 1989. Determination of cephalosporin-C amidohydrolase activity with fluorescamine^/. Pharm. Pharmacol. 41:136-137.

73. Russell AJ, Fersht AR. 1987. Rational modification of enzyme catalysis by engineering surface charge.Nature. 328(6130):496-500.

74. Ross, G. W. 1975. p-Lactamases. In: Methods Enzymol. 43: 678-687.

75. Richmond, M. H., and Sykes, R. B. 1973. The P-lactamases of gramnegative bacteria and their possible physiological role. Adv. Microbial. Physiol.9: 31-88.

76. Studier,F.W., Rosenberg,A.H., Dunn,J.J., & Dubendorff,J.W. 1990. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185:60-89.

77. Studier, F., 2005. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr. Purif. 4: 207—234.

78. Saarela J, Laine M, Tikkanen R, Oinonen C, Jalanko A, Rouvinen J, Peltonen L. 1998. Activation and oligomerization of aspartylglucosaminidase.7" Biol Chem. 25:273(39):25320-8.

79. Szwajcer, E., and Mosbach, K. 1985. Isolation and partial characterization of a D-amino acid oxidase active against cephalosporin С fromyeast Trigonopsis variabilis. Biotechnol. Letts. 7:1—7.

80. Saito, Y., Ishii, Y., Fujimura, Т., Sasaki, H., Noguchi, Y., Yamada, H., Niwa, M., and Shimomura, К. 1996. Protein engineering of a cephalosporin С acylase from Pseudomonas strain N176. Ann.N.Y.Acad.Sci. 782:226-240.

81. Sio, C. F., Riemens, A. M., van der Laan, J. M., Verhaert, R. M., and Quax, W. J. 2002. Directed evolution of a glutaryl acylase into an adipyl acylase. Eur.J.Biochem. 269:4495-4504

82. Charles F. Sio, Linda G. Otten, Robbert H. Cool and Wim J. Quax. 2003. Analysis of a substrate specificity switch residue of cephalosporin acylase // Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC). 312:755-760.

83. Suzuki, H., Miwa, C., Ishihara, S., and Kumagai, H. 2004. A single amino acid substitution converts gamma-glutamyltranspeptidase to a class IV cephalosporin acylase (glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase). Appl.Environ.Microbiol. 70:6324-6328.

84. Sheinerman F.B., Norel R., Honig B. 2000. Electrostatic aspects of protein-protein interactions. Curr. Opin. Struct. Biol. 10: 153-159.

85. Stites W.E. 1997. Protein-Protein Interactions: Interface Structure, Binding Thermodynamics, and Mutational Analysis.Chem Rev. 97: 1233-1250.

86. Sassenfeld HM. 1990. Engineering proteins for purification. Trends Biotechnol., 8(4):88-93.

87. Sambrook ,J., Maniatis, Т., & Fritsch, E.F. Molecular cloning a laboratory manual. (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y; 1989.

88. Sanggu Kim and Youngsoo Kim. 2001 Active Site Residues of Cephalosporin Acylase Are Critical Not Only for Enzymatic Catalysis but Also for Post-translational Modification. Journal of Biological Chemistry.276:48376-48381.

89. Sudhakaran, V. K., Deshpande, B. S., Ambedkar, S. S., and Shewale, J. G. 1992. Molecular aspects of penicillins and cephalosporin acylases. Process. Biochem. 27:131-143.

90. Sonawane, V. C., Jolly, R. S., and Vohra, R. M. 1996. Cephalosporin modification:An extracellular glutaryl 7-ACA acylase from Bacillus sp. Biotech. Lett. 18:965-968.

91. Slade, A., A. J. Horrocks, C. D. Lindsay, B. Dunbar, and R. Virden. 1991. Site-directed chemical conversion of serine to cysteine in penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105. Eur. J. Biochem. 197:75-80.

92. Seemiiller E, Lupas A, Stock D, Lowe J, Huber R, Baumeister W. 1995. Proteasome from Thermoplasma acidophilum: a threonine protease. Science. 268(5210):579-82.

93. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nussinov R. 1997. Studies of protein-protein interfaces: a statistical analysis of the hydrophobic effect Protein Sci. 6: 53-64.

94. Thorn K.S. and Bogan A.A. ASEdb: 2001. a database of alanine mutations and their effects on the free energy of binding in protein interactions.Bioinformatics. 17: 284-285.

95. Tsai C.J., Lin S.L., Wolfson H.J., Nussinov R. 1996. Protein-protein interfaces: architectures and interactions in protein-protein interfaces and in protein cores. Their similarities and differences .Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 31: 127-152.

96. Thomas RM Barends, Hiromi Yoshida and Bauke W Dijkstra. 2001. Three-dimensional structures of enzymes useful for p-lactam antibiotic production. Current Opinion in Biotechnology.15:356-363.

97. Takimoto, A., Matsushima, K., Yagi, S., and Sonoyama, T. 1994. Purification and characterization and partial amino acid sequence of anovel cephalosporin С deacetylase from Bacillus subtilis. J. Ferment. Bioeng. 77:17—22.

98. Tobias JW, Shrader ТЕ, Rocap G, Yarshavsky A. 1991. The N-end rule in bacteria. Science. 254(5036): 1374-7.

99. Veselovsky A.V., Ivanov Yu.D., Ivanov A.S., Archakov A.I., Lewi P. and Janssen P. 2002. Protein-protein interactions: mechanisms and modification by drugs .Journal of Molecular Recognition. 15: 405-422.

100. Velasco J, Luis Adrio J, Angel Moreno M, Diez B, Soler G, Barredo JL. 2000. Environmentally safe production of 7-aminodeacetoxycephalosporanic acid (7-ADCA) using recombinant strains of Acremonium chrysogenumJVcrt Biotechnol: 18(8):857-61.

101. Valle, F., Balbas, P., Merino, E., & Bolivar, F. 1991. The role of penicillin amidases in nature and in industiy. Trends Biochem. Sci. 16:36-40.

102. Vethanayagam, J. & Flower, A. 2005. Decreased gene expression from T7 promoters may be due to impaired production of active T7 RNA polymerase. Microbial Cell Factories. 4:3.

103. Wells J.A. 1996. Binding in the growth hormone receptor complex.Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93: 11-16.

104. Wang, E.D., Zheng, Y.G., Li, Y., Jiang, W.H., & Yang, Y.L. Expression of gene encoding GL-7ACA acylase in Escherichia coli. 2002. Sheng Wu Ни a Xue. Yu Sheng Wu WuLiXue. Bao. (Shanghai).34:526-531.

105. Xu D., Lin S.L., Nussinov R. 1997b. Protein binding versus protein folding: the role of hydrophilic bridges in protein associations .J. Mol. Biol. 265: 68-84.

106. Xu Q, Buckley D, Guan C, Guo HC. 1999. Structural insights into the mechanism of intramolecular proteolysis. Cell. 98(5):651-61.

107. Xu D., Tsai C.J., Nussinov R. 1997a. Hydrogen bonds and salt bridges across protein-protein interfaces .Protein Eng. 10: 999-1012.

108. Youngsoo Kim, Ki-Hong Yoon, Yongho Khang, Stewart Turley and Wim G. J. Hoi. 2000 The 2.0 A Crystal Structure of Cephalosporin Acylas^.Structure. 8:1059-1068.

109. Yamada C, Kijima K, Ishihara S, Miwa C, Wada K, Okada T, Fukuyama K, Kumagai H, Suzuki H. 2008. Improvement of the glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase activity of a bacterial gamma-glutamyltranspeptidase^j^p/Environ Microbiol.!4(11):3400-9.

110. Yamada, H., Ishii, Y., Noguchi, Y., Miura, Т., Mori, Т., and Saito, Y. 1996. Protein engineering of a cephalosporin С acylase. Ann.N.Y.Acad.Sci. 799:4-81.

111. Y. Li., Yun, D. F., Guan, Y. Q., Peng, H. L., Chen, J. M., He, Y. S., and Jiao, R. C. 1991. Cloning of GL-7-ACA acylase gene from Pseudomonas, sp. 130 and its expression in Escherichia coli. Chin J.Biotechnol. 7: 93-104.

112. Yoon, J., Oh, В., Kim, K., Park, J., Han, D., Kim, К. K, Cha, S. S., Lee, D., and Kim, Y. 2004. A bound water molecule is crucial in initiating autocatalytic precursor activation in an N-terminal hydrolase. J.Biol. Chem. 279:341-347.

113. Yau Ming-Hon, Jun Wang, Paul W.K. Tsang, Wing-Ping Fong. 2006. J1 acylase, a glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase from Bacillus laterosporus Jl, is a member of the a/b-hydrolase fold superfamily. FEBS Letters. 580:1465-1471.

114. Yong Li, Weihong Jiang, Yunliu Yang, Guoping Zhao, Enduo Wang. 1998. Overproduction and Purification of Glutaryl 7-Amino Cephalosporanic Acid Acylase // Protein Expression and Purification. 12:.233-238.

115. Young S. Lee, Sung S. Park. 1998. Two-Step Autoeatalytie Processing of the Glutaryl 7-Aminocephalosporanic Acid Acylase from Pseudomonas sp. Strain GK16. 1998. Journal of Bacteriology. 180:4576-4582.

116. Zhou, H., Wei, Z., Yang, Y., 1997. Studies on purification and properties of GL-7ACA acylase from CU334. Acta Microbiol. Sin. 37: 196-201.

117. Zemla A. LGA: 2003 A method for finding 3D similarities in protein structures.Nucleic Acids Res. 31: 3370-3374.

118. Zhang, Q. J., and Xu, W. X. 1993. Morphological physiological and enzymatic characteristics of cephalosporin acylase producing Arthrobacter strain 45-A. Arch. Microbiol. 159:392-395.

119. Zhao H, Chockalingam K, Chen Z. 2002. Directed evolution of enzymes and pathways for industrial biocatalysis. Curr Opin Biotechnol. 13(2): 104-10.

120. Wei Zhang, Xi Huang, Guoping Zhao, and Weihong Jiang. 2004. Affinity labeled glutaryl-7-amino cephalosporanic acid acylase С130 can hydrolyze the inhibitor during crystallization Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC). 313:555—558.

121. Zhang Wei, Yuan Liu, Huabao Zheng, Sheng Yang and Weihong. 2005. Improving the Activity and stability of Gl-7ACA-acylase CA130by site-directed mutagenesis. Appl Environ Microbiol.71:5290-6.

122. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984. 479с.

123. С. В. Хороненкова, В. И. Тишков. 2008. Оксидаза D-аминокислот: физиологическая роль и применение. Успехи биологической химии. 48: 359376