Летальный фактор из Bacillus anthracis: субстратная специфичность и механизм действия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Захарова, Мария Юрьевна

• Захарова, Мария Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Захарова, Мария Юрьевна

Список сокращении.

Введение.

Глава 1. Сибирская язва: молекулярные механизмы инфекции и подходы к лечению. Обзор литературы.

1.1 Болезнь Сибирская язва.

1.1.1 Патогенез.

1.1.2 Факторы вирулентности.

1.1.2.1 ПА.

1.1.2.2 ЛФ.

1.1.2.3 ОФ.

1.1.3 Токсины СЯ.

1.1.4 Проникновение токсинов в клетку.

1.1.4.1 Рецепторы.

1.1.4.2 Сборка и транслокация токсинов.

1.1.5 Действие токсинов внутри клетки.

1.1.5.1. Расщепление МАРКК киназ с помощью ЛФ.

1.1.5.2 Повышение уровня цАМФ с помощью ОФ.

1.1.6 Клеточные мишени для токсинов СЯ.

1.1.6.1 Токсины СЯ и врожденный иммунитет.

1.1.6.1.1 ЛТ и апоптоз макрофагов.

1.1.6.1.2 ЛТ блокирует активацию макрофагов.

1.1.6.1.3 ЛТи нейтрофилы.

1.1.6.1.4 Токсины СЯ и дендритные клетки.

1.1.6.2 Токсины СЯ и приобретенный иммунитет.

1.1.6.2.1 Токсины СЯ и ДК.

1.1.6.2.2 Токсины СЯ и Т-клетки.

1.1.6.2.3 Токсины СЯ и В-клетки.

1.1.6.3 Действие токсинов на неимунные клетки.

1.1.6.3.1 Токсины СЯ и эндотелиальные клетки.

1.1.6.3.2 Токсины СЯ и эритроциты.

1.1.7 Современные подходы к лечению болезни СЯ.

1.1.7.1 Вакцины.

1.1.7.2 Антибактериальные лекарства.

1.1.7.3 Антитоксины.

1.1.7.3.1 Антитела к токсинам СЯ.

1.1.7.3.2 Свободные рецепторы.

1.1.7.3.3 Блокирование созревания и сборки токсинов.

1.1.7.3.4 Предотвращение транслокации токсинов.

1.1.7.3.5 Использование аналогов субстратов в качестве антитоксинов.

1.1.7.3.6 Низкомолекулярпые ингибиторы эффекторных субъединиц.

1.2 Методические подходы к получению ингибиторов металопротеаз, имеющих медицинское значение.

1.2.1 Структура активного центра ЛФ. Дизайн ингибиторов с помощью структурных исследований.

1.2.2 Дизайн ингибиторов с помощью ЯМР.

1.2.3 Дизайн ингибиторов с помощью масс-спектроскопии.

1.2.4 Селекция ингибиторов с помощью био-неорганического подхода.

1.2.5 Механизм действия металлопротеаз. Дизайн ингибиторов на основе информации о механизме работы фермента.

1.2.6 Получение ингибиторов путем широкомасштабного скрининга на основе активности фермента.

1.2.6.1 Подбор эффективного субстрата для измерения активное™ протеазы.

1.2.6.1.1 Использование специфичных субстратов протеаз.

1.2.6.1.2 Подбор субстрата комбинаторным способом.

1.2.6.1.2.1 Контекст-зависимые субстратные библиотеки.

1.2.6.1.2.1 Смешанные контекст-зависимые библиотеки субстратов.

1.2.6.1.2.3 Анализ библиотек пептидных субстратов методом секвенирования.

1.2.6.1.2.4 Иммобилизованные субстратные библиотеки.

1.2.6.1.2.5 Сканирующие синтетические комбинаторные библиотеки.

1.2.6.1.2.6 Субстратный фаговый дисплей.

1.2.6.1.2.7 Другие стратегии биологического субстратного дисплея.

1.2.6.2 Создание системы детекции активности протеазы для широкомасштабного скрининга ингибиторов.

1.2.6.2.1 Подбор оптимальных репортеров для детекции работы фермента in vitro.

1.2.6.2.2 Разработка системы детекции протеаз in vivo.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Летальный фактор из Bacillus anthracis: субстратная специфичность и механизм действия»

Сибирская язва (СЯ) является опасной бактериальной инфекцией. При попадании в организм человека патоген вызывает системную интоксикацию организма, которая, в случае лёгочной или кишечной форм инфекции, летальна в высоком проценте случаев. Основным фактором вирулентности патогена является бинарный экзотоксин, состоящий из одной медиаторной (протективный антиген, ПА) и двух эффекторных субъединиц (отечный фактор, ОФ) и летальный фактор, ЛФ). ПА связывается с рецепторами на клеточной мембране и обеспечивает транслокациго ЛФ и ОФ во внутриклеточные компартменты. ОФ является Са2+-зависимой аденилатциклазой, ЛФ представляет собой высокоспецифичную цинк-зависимую металлопротеазу. Известно, что ЛФ расщепляет ряд киназ семейства МКК в районе последовательностей их докинг-сайтов, отвечающих за взаимодействие киназ друг с другом и низлежащими участниками каскадов. Действие ЛФ запускает малоизученную цепь событий, приводящих к смерти клетки-хозяина, которую, на сегодняшний день, невозможно объяснить исключительно выключением каскада сигнальной трансдукции с участием МКК. Хотя полная цепь событий, индуцированная ЛФ, остается не совсем определенной, имеются веские доводы в пользу того, что ингибирование протеолитической активности ЛФ вносит существенный вклад в излечение инфекции СЯ. Информация, касающаяся механизма узнавания и превращения субстрата данным ферментом, важна для оптимизации имеющихся и дизайна новых ингибиторов ЛФ, применимых на практике. Исследование субстратной специфичности ЛФ может привести к идентификации новых природных мишеней данного фермента, что является ключевым этапом для разработки новых подходов к терапии сибирской язвы. Другой важной причиной для изучения специфичности ЛФ является необходимость получения эффективно гидролизуемого пептидного субстрата для создания системы детекции активности фермента, селекции ингибиторов и диагностики СЯ.

Глава 1. Сибирская язва: молекулярные механизмы инфекции и подходы к лечению. Обзор литературы.

1.1 Болезнь Сибирская язва.

1.1.1 Патоген ез

Сибирская язва является опасным острым инфекционным заболеванием, поражающим животных и людей. В мире ежегодно регистрируется от 2000 до 20000 случаев заболеваний человеком данной инфекцией. Возбудитель сибирской язвы - грамм-положительная бактерия Bacillus anthracis - способна более 100 лет сохраняться в почве в виде спор и может образовывать стойкие очаги инфекции, что создает постоянную угрозу эпидемических вспышек и эпизоотий [3-5]. Возникновение СЯ у человека чаще всего является результатом контакта с инфицированным домашним скотом. В XIX веке СЯ представляла серьезную экономическую угрозу, массово поражая домашних животных и людей; однако появление ветеринарных вакцин, разработанных Луи Пастером в конце 19 века и Максвеллом Стерне в начале 20 века, позволило контролировать инфекцию СЯ среди животных и практически свело на нет случаи заражения людей. После II мировой войны в нескольких странах началась разработка биологического оружия на основе СЯ, и, как следствие, были начаты интенсивные исследования молекулярных основ этой болезни. Однако с 1970 года в США и Великобритании программы разработки биологического оружия были официально свернуты, и СЯ осталась лишь объектом фундаментальных исследований молекулярных биологов. В последние годы СЯ снова привлекла внимание исследователей в связи с возобновившейся угрозой биотерроризма, что привело к возобновлению попыток углубленного исследования патогенеза СЯ.

К настоящему моменту клинически показано, что болезнь развивается в одной из трех форм — кожной, кишечной или легочной, в зависимости от пути попадания инфекции в организм. Кожная форма, самая распространенная, возникает при попадании спор на поврежденные участки кожного покрова, сопровождается характерными язвами, отеками и сравнительно легко излечивается при помощи антибиотиков. Смертность от этой формы СЯ невысока [6]. Кишечная форма, возникающая при проглатывании спор, вызывает гораздо более серьезное системное заболевание, приводящее к поражению желудочно-кишечного тракта, лимфадениту, отеку внутренних органов и, в конечном счете, к заражению крови [7].

Самая опасная легочная форма также имеет системный характер, обладает крайне быстрым развитием и высоким процентом смертности (до 80 % заболевших). Заражение происходит при вдыхании спор.

Биологическое оружие на основе С Я направлено, главным образом, на индукцию легочной формы болезни. Споры СЯ покрываются заряженными молекулами и далее применяются в форме аэрозолей, легко попадая в легкие человека, как при биологической атаке в США в 2001 году.

Макрофаги и дендритные клетки нейтрализуют большинство спор, попадающих в легкие [8-11]. Однако, часть спор выживает и прорастает в макрофагах, которые доставляют их в ближайшие лимфоузлы, после чего вегетирующие бактерии лизируют оболочку макрофагов, размножаются в лимфатической системе и затем мигрируют в кровоток. Болезнь протекает без симптомов в течение нескольких недель после инфекции, затем появляются некоторые неспецифические симптомы, такие как повышенная температура, боли и кашель. Далее, в течение нескольких дней количество бактерий достигает высокого уровня в крови, что приводит к критическому состоянию больного, характеризующемуся затруднением дыхания, шоком и обширными кровоизлияниями, часто сопровождающимися припадками. После достижения критической стадии терапия антибиотиками становится неэффективной [12], и в большом проценте случаев смерть наступает в течение 24 часов после этого момента. Лечение антибиотиками на ранних стадиях СЯ приводит к полному выздоровлению, но несвоевременно поставленный диагноз и запоздалая терапия могут стать причиной серьезных осложнений и гибели пациента.

1.1.2 Факторы вирулентности.

В. anthracis производит ряд факторов вирулентности, благодаря которым происходит проникновение инфекции в организм и развитие болезни [5, 13]. Гены, ответственные за развитие заболевания, расположены на двух плазмидах рОХ1 и рОХ2. рОХ2 кодирует белки, вовлеченные в биосинтез поли- D-глутаминовой оболочки, позволяющей делящимся бактериям избежать поглощения фагоцитами [14]. рОХ1 несет гены, кодирующие факторы вирулентности - ПА, ЛФ и ОФ. ЛФ и ОФ являются ферментами, работающими с внутриклеточными субстратами: ЛФ представляет собой высокоспецифичную цинк-зависимую металлопротеазу, ОФ является Са зависимой аденилатциклазой. ПА связывается с рецепторами на клеточной мембране и обеспечивает транслокацию ЛФ и ОФ во внутриклеточные компартменты.

1.1.2.1 ПА

Протективный антиген ПА, получивший свое название из-за использования при разработке вакцин, является центральным компонентом токсинов СЯ. Помимо обеспечения интернализации ЛФ и ОФ, ПА так же способен к транслокации искусственных химерных белков, содержащих сигнал связывания с ПА, и может использоваться как компонент системы доставки белков в клетку [15]. Мономерный ПА содержит 4 структурных домена, состоящих преимущественно из антипараллельных Р блоков (рис 1А). Домен 1 координирует 2 иона Са2+ и содержит сайт узнавания для протеаз активации (см ниже). Домен 2, ответственный за формирование поры в плазматической мембране, содержит большую гибкую петлю, вовлеченную во взаимодействие с мембраной и в связывание с рецептором. Маленький домен 3 отвечает за олигомеризацию ПА. Домен 4 участвует в связывании с рецепторами [16, 17].

1.1.2.2 ЛФ

ЛФ является высокоспецифичной Еп2+-зависимой металлопротеазой (код фермента 3.4.24.83 по IUBMB Enzyme Nomenclature), которая расщепляет последовательности киназ семейства МАРКК (от английского mitogen activated protein kinase kinases) вблизи их N -конца. Анализ трехмерной структуры этой протеазы указывает на то, что, по-видимому, эволюционно ген ЛФ появился в результате процессов дупликаций, мутаций и слияния различных генов; это привело к появлению протеазы с крайне высокой специфичностью. ЛФ - крупный белок весом 91 кДт - включает в себя 4 домена, состоящих, во-основном, из а-спиралей (рис.1Б). Домен 1 связывает ПА, он необходим для проникновения ЛФ внутрь клетки [18, 19]. Домен 2 напоминает по структуре АДФ-рибозилирующий домен VIP2 токсина из Bacillus cereus, активный сайт которого изменен ; в случае В. Anthracis этот домен вовлечен в узнавание субстрата. Домен 3, так называемый «спиральный пучок», встроен в домен 2 и, по всей видимости, состоит из повторов структурных элементов домена 2. Домен 4 является каталитическим центром и имеет некоторое сходство с доменами других Zn2+ содержащих металлопротеаз [20] (рис. 1Б). Каталитический домен содержит последовательность НЕХХН в своем активном сайте, которая является характерной чертой металлопротеиназ и участвует в связывании иона Zn2+. Однако, общая структура каталитического домена уникальна и не имеет гомологов. 8

Домен I

Участок

ЛФ и ОФ

Домен 4. связывание с рецептором

Домен 3. ол игом ер и шция

Спиральный

Домен 2, связывание субстрата

Домен 1, связывание с НА

Домен 4. каталитически)! центр

Домен 3, «V/ связывание Л-Л субстрата -J-1

Рисунок Т. Кристаллическая структура компонентов токсинов сибирской язвы: А) ПА, Б) ЛФ, С)

ОФ в комплексе с кальмодулином.

Домен 2

Домен 1. скжыкание с i [А

ЛФ является нетипичной металлопротеазой еще и потому, что не требует активации, сопровождающейся отрезанием про-пеитида, что обычно для других ферментов этой группы.

1.1.2.3 ОФ

ОФ является Са2+/ к ал ь м одул и и зависимой аденилат-циклазой (АЦ). Интересно, что активность ОФ превышает таковую для АЦ млекопитающих примерно в 1000 раз [21]. Увеличение уровня клеточного цАМФ нарушает водный баланс и препятствует нормальному функционированию сигнальных каскадов в клетке. ОФ состоит из N-концевого ПА-связывающего домена, центрального каталитического домена и С-концевого спирального домена [22, 23] (рис. 1В). N-концевой домен гомологичен по структуре и функциям ] домену ЛФ [16]. Каталитический домен структурно сходен с доменами других бактериальных АЦ токсинов, например токсинов Bordetella pertussis СуаА и Pseudomonas aerunginosa ExoY. Спиральный домен располагается напротив каталитического домена в инактивированном состоянии. Кальмодулин (СаМ) встраивается между этими двумя доменами, раздвигая их, что приводит к повороту одного домена относительно другого примерно на 30 градусов (рис. 1В). Такое взаимодействие между СаМ и ферментом вызывает конформационные изменения в линкере, соединяющем каталитический и спиральный домены, что приводит к активации ОФ [24].

1.1.3 Токсины СЯ

Бинарные комбинации этих секретируемых белков составляют два токсина сибирской язвы: ПА в комбинации с ЛФ называется летальным токсином (ЛТ), а ПА в комбинации с ОФ известен как отечный токсин (ОТ).

Особенностью сибиреязвенных токсинов является независимая секреция бактериальной клеткой их компонентов, каждый из которых сам по себе нетоксичен. ЛТ и ОТ препятствуют развитию клеточного ответа на бактериальную инфекцию, разрушают систему иммунитета клетки и способствуют распространению бактерии. По мере развития болезни, токсины накапливаются в кровотоке и на поздних этапах, по-видимому, являются главной причиной патологии.

Ранее были высказано предположение о раздельной роли токсинов: предполагалось, что ЛТ ответственен за смертность при системной сибирской язве, тогда как ОТ вызывает локальный отек при кожной форме болезни [5, 13]. Показано, что внутривенное введение ЛТ вызывает гибель исследуемых животных (грызунов и млекопитающих), однако эффективность действия токсина существенно различается среди различных видов животных. ОТ ие является смертельным при подкожном введении, но способен вызывать обширный отек. Гибель мышей от внутривенного введения ЛТ ассоциирована с шоком, разрушением сосудов и общей гипоксией, что согласуется с симптомами легочной формы сибирской язвы [12, 25, 26]. Действие ОТ приводит к повреждению тканей, дисфункции различных органов, кровоизлияниям и пониженному давлению — симптомам, которые наблюдаются у тех же пациентов. Это наблюдение поддерживает гипотезу о том, что оба токсина работают кооперативно и оба приводят к смерти при сибирской язве.

1.1.4 Проникновение токсинов в клетку. 1.1.4.1 Рецепторы

Современная модель взаимодействия токсинов сибирской язвы с клеткой хозяина представлена на рисунке 2: вначале, полноразмерный белок - ПА83 - связывается с г

ПА83 щ А

ПА20

ЛФ

Рецептор TEM8/CMG2 + корецептор LR.P6

ПА63)7 ОФ У^рин л

Липидные рафты

Ранняя эндосома

- Ж ? н

ZJw - t - 1

Поздняя эндосома | СаМ, Са2+ цАМФ ч

АТФ

ОФ н* н*

Н- №

-- 4 ж)!

Клатринзависимая транслокация

Zn2+

ЛФ мкк мкк

Рисунок 2: Модель взаимодействия токсинов сибирской швы с клеткой хозяина (371. рецепторами на поверхности клетки - белками (ТЕМ)8 (от английского tumor endothelium marker) или (CMG)2 (от английского capillary morphogenesis protein), которые встречаются в разных изоформах во многих типах клеток, включая иммунные [13, 27-29]. Ген (CMG)2 экспрессируется в большинстве человеческих тканей, тогда как экспрессия (ТЕМ)8 ограничена опухолевыми эндотелиальными и раковыми клетками [28, 30-33]. Оба рецептора относятся к трансмембранным белкам типа 1, имеющим единственный мембранный домен. Отличительной особенностью этих белков является протяженный внеклеточный домен 1 (примерно 200 ак), связывающийся непосредственно с ПА и имеющий близкую гомологию с 1 доменом интегрина а. Рецепторы имеют структурные отличия в основном в своих цитоплазматических доменах, которые, как было показано, не влияют на связывание и траслокацию токсинов СЯ [34]. К настоящему времени все изоформы рецепторов охарактеризованы, и выяснено, что их существование является результатом альтернативного сплайсинга мРНК [27, 28]. На сегодняшний день функции белков (ТЕМ)8 и (CMG)2 достоверно неизвестны, но имеются существенные доказательства в пользу того, что они являются молекулами клеточной адгезии, вовлеченными в ангиогенез [32, 33].

Недавно было показано, что для связывания и интернализации токсинов СЯ необходимо также взаимодействие рецепторов (ТЕМ)8 и/или (CMG)2 с рецептор-подобным белком (LRP)6 (от английского LDL-receptor related protein) [35]. LDL рецепторы и рецептор-подобные белки являются прототипами макромолекул, доставляющих различные лиганды в клетку путем эндоцитоза [36]. (LRP)6 участвует в сигнальном каскаде Wnt, который регулирует уровень Р-катенина в клетках и влияет на ангиогенез. Авторы работы [35] предположили, что в процессе интернализации JIT и ОТ после связывания внеклеточного домена (LRP)6 с первыми доменами рецепторов (ТЕМ)8 и (CMG)2 и формирования пре-поры, «сигнал о начале интернализации» передается на цитопламатический домен (LRP)6 и далее на цитоплазматические сигнальные молекулы, что и является необходимым условием для транслокации токсинов СЯ. Было показано, что при использовании делеционных мутантов (LRP)6 в области их цитоплазматического домена интернализация токсинов СЯ внутрь клетки не происходит [35].

1.1.4.2 Сборка и транслокация токсинов.

Как отмечалось, ПА состоит из 4 доменов с различными функциями (рисунок 1А). Ранее считалось, что только домен IV ПА служит для связывания с рецепторами [38, 39]. Однако, ко-кристаллизация ПА с доменом I (CMG)2 показала, что домен II ПА также вовлечен во взаимодействие с рецептором [38, 39] .После связывания с клеточным рецептором полноразмерный ПА83 подвергается процессингу фурин-подобными протеазами клетки-хозяина с отщеплением 20 кДт I домена [40, 41]. Активированный ПА63, связанный с рецептором, спонтанно образует гептамерную кольцевую структуру или пре-пору (рисунок 2). Сайт связывания для эффекторных субъединиц ЛФ и/или ОФ формируется только при олигомеризации ПА, причем каждый гептамер ПА может связывать до трех молекул ЛФ или ОФ. [42]. Показано, что процесс гептамеризации ПА ускоряется в присутствии ЛФ и/или ОФ in vitro [43], очевидно, потому, что ЛФ и ОФ стабилизируют мультимерные комплексы ПА. ЛФ и ОФ также содействуют скорейшей агрегации ПА in vivo, что может быть очень важным для обеспечения надежности транслокации энзиматических субъединиц токсинов и минимизации риска интернализации пустых гептамеров ПА [44].

Олигомеризация ПА сопровождается кластеризацией рецепторов. Было показано, что гептамер ПА ассоциирован с особыми липидными микродоменами внутри плазматической мембраны, называемыми липидными «рафтами» [45].

Далее комплекс рецептор-токсин транспортируется внутрь эндосомы путем клатрин-динамин-зависимого эндоцитоза [45].

Транслокация ЛФ и ОФ в цитозоль из внутреннего пространства эндосомы становится возможной только после конформационной перестройки пре-поры, происходящей при закислении внутренней среды эндосомы [13]. Показано, что только под действие кислого рН эндосомы происходит сближение двух р цепей во II домене ПА и их внедрение в мембрану эндосомы с формированием истинной поры, что делает возможным проникновение эффекторных субъединиц токсина в цитоплазму клетки [38, 39]. Интересно, что в экспериментах in vitro превращение пре-поры в истинную пору (показано на ПА гептамере) было возможно и при нейтральном рН в отсутствии рецепторов. При добавлении свободных молекул рецепторов этот процесс происходил только в кислой среде [39], что указывает на блокирование молекулами рецепторов превращения пре-поры в истинную пору в нейтральной среде.

Недавно было показано, что истинная пора формируется не во внешней мембране ранней эндосомы, а в мембране внутренних везикул эндосомы [46] (рисунок 2). ЛФ и ОФ высвобождаются во внутреннее пространство везикул, далее эндосома транспортируется вдоль микротрубочек и превращается в позднюю эндосому. Находясь внутри таких везикул, энзиматические субъединицы защищены от деградации протеазами лизосомы, в отличие от ПА, который деградирует [46]. Такой транспорт может быть необходим для доставки ЛФ и ОФ из периферических областей цитозоли в околоядерное пространство.

1.1.5 Действие токсинов внутри клетки. 1.1.5.1. Расщепление МАРККкиназ с помощью ЛФ.

ЛФ является металлопротеазой, расщепляющей большинство митогенактивируемых серин-треониновых киназ киназ (МКК или МАРКК) в районе последовательностей их докинг- сайтов [47-51], отвечающих за взаимодействие киназ друг с другом и низлежащими участниками каскадов. Не исключена возможность взаимодействия ЛФ и с другими, не известными на сегодняшний день клеточными мишенями. МАРКК являются центральным звеном в трех- компонентном каскаде киназ, запускаемом различными клеточными стимулами, например, факторами роста, цитокинами, синтез которых активируется при стрессовых состояниях [52, 53]. Эти сигналы приводят к активации киназ семейства MKKKs (от английского mitogen-activated protein kinase kinase kinases), м итоге ны лпс осмотическим шок перекись водорода клеточная факторы цитокины адгезия роста

I / \ I 1 / \ 1 I

Raf Тр12 МЕККЗ Ask1 ТАК1 МЕКК1 МЕКК2 мккк

1 \ 1 1/ 1 \ 1\ i / I

МКК1 №КК< Фф If.MKo. б JKKa мКк . МКК5 / \ / / \ / I

ERK1 р38-« р38-|1 JNK1 JNK2 ВМКt

ERK2 р38-у р38-й JNK3 ERK5

МАРК

Рисунок 3: Г1>тн сигнальной траведукцин с участием МЛРКК к-ккаэ. В зеленых прямоугольниках выделены киназы МККК, в голубых овалах - МКК, в желтых квадратах - МАРК. Киназы МКК, являющиеся мишенями для ЛФ, отмечены красным [24j. которые фосфор ил иру ют и активируют киназы МАРКК, активирующие, в свою очередь, киназы МАРК (от английского mitogen- activated protein kinases) (рис. 3). МАРК, сами по себе, фосфорилируют и активируют большое количество клеточных мишеней и играют важную роль в ответе на различные внеклеточные сигналы, влияя на транскрипционный профиль клетки. Среди МАРК можно выделить 4 семейства: ERK1/2 (от английского extracellular-signal-regulated kinase 1/2), р38, JNK (от английского c-Jun N-terminal kinase) и ВМК (от английского, big MAPK)/ERK5. 7 МКК интегрируют сигналы от примерно 20 МККК и передают их на киназы отдельных семейств МАРК.

ЛФ расщепляет все киназы семейства МКК млекопитающих, кроме МКК5 , нарушая таким образом сигнальные пути с участием ERK, INK и р38.

Действие ЛФ разрушает так называемый D-сайт или докинг-сайт в последовательности киназ МКК - мотив для связывания МАРК, также встречающийся в субстратах МАРК и фосфатазах [54, 55] (рисунок 4) . Таким образом, ЛФ препятствует фосфорилированию МАРК с помощью МКК киназ [56-59] Показано, что связывание киназ с пептидами -производными D-сайта - приводит к конформационному превращению киназы, при котором серин и треонин, находящиеся в активациопной петле фермента, становятся доступными для фосфориллирования [60, 61]. Поэтому расщепление докинг-сайта инактивирует МКК, лимитируя их способность индуцировать активированную конформацию МАРК и их дальнейшее фосфорилирование.

МКК1 МКК2 мккз

МКК4 МКК6

МКК7

Консенсус

К К К Р Т Р I GLN Т

RKPVL PALT I Т

RKKDLRISCM krkalk'lnfa

FKSTARFTLN RNPGLK?I Р К Е

PRPTLCIVPLA PRHMLGLPST

ХФ+ФХХХ Р Р Т т тт

V.

-vкаталитический домен У

Рисунок 4: Расщепление локипг сайтов кина^ МКК с помощью ЛФ. Слева даны аминокислотные последовательности докинг-сайтов кинач. Стрелками указаны сайты расщепления субстратов и их удаленность от N-конна киназы [24].

Сайты разрезания ЛФ в МКК имеют некоторые консервативные черты, включая блок основных аминокислотных остатков, расположенных за два-пять оснований от двух или более алифатических аминокислот (рисунок 4). Скрииирование библиотек пептидных субстратов ЛФ, а также анализ расщепления мутантов МКК в области докинг-сайтов показал, что отмеченные выше структурные особенности субстратных последовательностей важны для эффективного протеолиза с помощью ЛФ [48, 62, 63]. Хотя многие другие белки, такие, как субстраты МАРК, обладают докинг-мотивами, ни один из них среди исследованных на сегодняшний день, кроме киназ группы МКК, не является субстратом для ЛФ [51]. Предполагается, что уникальная способность ЛФ избирательно расщеплять только белки семейства МКК обусловлена взаимодействием ЛФ с экзо-сайтами, удаленными от сайта расщепления. Недавно, для MKKI был идентифицирован участок связывания с ЛФ в С - концевой области киназы [51], было показано, что мутации в данном регионе препятствуют связыванию ЛФ. Также был идентифицирован участок во II домене ЛФ, ответственный за связывание киназ МКК [64].

1.1.5.2 Повышение уровня цАМФ с помощью ОФ.

ОФ вызывает длительное повышение уровня цАМФ в клетке. Такая стратегия используется некоторыми другими бактериями для нарушения широкого круга физиологических процессов в организме хозяина. Увеличение концентрации цАМФ с помощью ОФ или других ферментов приводит к блокированию хемотаксиса нейтрофилов, фагоцитоза и продукции супероксида [51, 65-67]. Эти эффекты, главным образом, связывают с активацией протеин киназы РКА (от английского protein kinase А), хотя непосредственные мишени для этого фермента до настоящего времени не идентифицированы. В норме, активность РКА подвергается жесткой регуляции [68]. Например, ассиметричное распределение РКА необходимо для определения полярности и миграции нейтрофилов [69]. ОФ индуцирует появление большого количества активированной РКА в околоядерном пространстве, возможно, в результате освобождения ОФ из поздней эндосомы [70]. Таким образом, ОФ эффективно ингибирует цАМФ - зависимые процессы, продуцируя высокую концентрацию цАМФ с некорректной локализацией.

1.1.6 Клеточные мишени для токсинов СЯ.

Так же, как и многие другие патогенные бактерии, В. anthracis использует токсины для ослабления иммунитета клетки-хозяина. Основные эффекты на клетки-мишени для токсинов СЯ приведены таблице 1.

1.1.6.1 Токсины СЯ и врожденный иммунитет.

Инфекция В. anthracis способна запускать мощный воспалительный ответ клетки путем активации рецептора (TLR)4 (от английского Toll-like receptor), взаимодействующего с бактериальными молекулами группы РАМР (от английского pathogen-associated molecular patterns) на нейтрофилах и макрофагах [71]. JIT и ОТ могут препятствовать развитию воспалительного процесса, так как, во-первых, функционирование МАРКК каскада, нарушаемое ЛФ, является основным в индукции окислительного шока и запуске экспрессии цитокинов при воспалении [72, 73], а также в миграции клеток [74]; во-вторых, значительное повышение уровня цАМФ, вызванное ОТ, может потенциально блокировать эти процессы [75]. То есть, наблюдается некий дуализм противоположных эффектов, оказываемых патогенном В. anthracis на клетку-хозяипа.

Из двух токсинов ЛТ изучен лучше, идентифицированы два основных биологических эффекта ЛТ на макрофаги: супрессия генов, отвечающих за развитие реакции воспаления, и индукция апоптоза.

1.1.6.1.1 JIT и апоптоз макрофагов

Таблица 1: Клеточные мишени и эффекты токсинов сибирской язвы [21].

Токсин Клетки - мишени Эффекты

ЛТ пейтрофнлы блокирует подвижность моноциты ингибирует деление и дифференциацию активированные макрофаги вызывает гибель клеток макрофаги угнетает продукцию цитокинов незрелые дендритные клетки вызывает гибель клеток созревшие дендритные клетки угнетает продукцию цитокинов т-лнмфоциты ингибирует активацию, пролиферацию, экспрессию поверхностных молекул и цитокинов. эритроциты вызывает гибель клеток тромбоциты вызывает коагулонатию

ОТ нейтрофилы ингибирует фагоцитоз макрофаги вызывает гибель клеток созревшие дендритные клетки угнетает продукцию цитокинов т-лнмфоциты ингибирует активацию, пролиферацию, экспрсссию поверхностных молекул и цитокинов. тромбоциты вызывает коагулопатию

Высокие концентрации JIT вызывают некроз макрофагов, тогда как небольшие количества JIT способствуют переходу клеток в апоптоз, благодаря изменению проницаемости клеточной мембраны, понижению значения митохондриального мембранного потенциала и фрагментации ДНК [62, 76].

Было показано, что JIT - зависимый апоптоз ассоциирован с активацией каспаз 1,2,3,4,6 и 8 [76] и с увеличением процессинга субстрата каспазы 1 - интерлейкина (IL)-lb [77]. Эксперименты на различных линиях мышей показали, что их макрофаги обладают разной чувствительностью к JIT; это привело к открытию важной роли гена Nalplb в апоптозе макрофагов, индуцированном JIT [78]. Белок Nalplb относится к группе внутриклеточных медиаторов воспаления и является центральным компонентом так называемой «инфламмасомы», большого белкового комплекса, вовлеченного в узнавание молекулярного паттерна патогена и запускающего каспазы 1 и 5, что в свою очередь ведет к активации цитокинов IL-1/? and IL-18 [79] и дальнейшему развитию воспаления. Ген Nalplb является высоко полиморфным и кодирует несколько вариантов белковых продуктов разной длины, показано, что чувствительность ряда линий макрофагов к действию ЛТ связывают с экспрессией у них полноразмерного функционального белка Nalplb, способного принимать участие в активации каспаз после взаимодействия с ЛФ. По всей видимости, ЛФ напрямую или опосредованно специфически активирует Nalplb. В пользу этой идеи говорит то, что устойчивые к ЛТ линии мышиных макрофагов, трансфецированные функциональной аллелью гена Nalplb, становились чувствительными к действию ЛТ [78]. Однако, достоверно не известно, каким именно образом ЛТ активирует полноразмерный Nalplb, и связан ли этот процесс с нарушением МАРКК каскада.

1.1.6.1.2 ЛТ блокирует активацию макрофагов.

Для активации макрофагов строго необходимым условием является запуск МАРК каскада. Активация ЛчГК и р38 киназ служит ключевым моментом для начала биосинтеза факторов воспаления, включая цитокины (фактор некроза опухоли TNF-a, IL-1 и IL-2), хемо-атраттрактанты (IL-8 ) и ферменты (цитохром С оксидаза 2 и индуцируемая синтаза N02) [53, 80, 81]. Поэтому, неудивительно, что ЛТ способен эффективно ингибировать воспалительный процесс, блокируя МАРК-зависимый биологический ответ. Действительно, ЛТ ингибирует экспрессию нескольких цитокинов воспаления in vitro и in vivo [49, 76, 82, 83]. Более того, расщепляя МККЗ и МКК6, ЛТ предотвращает активацию NF-kB и фактора регуляции интерферона (IRF)-3 соответственно, которые необходимы для экспрессии цитокинов воспаления [62, 84, 85]. Таким образом, нарушая действие МАРК каскада, ЛТ нейтрализует процесс активации макрофагов, вызванный РАМР.

1.1.6.1.3 ЛТ и нейтрофилы.

Нейтрофилы или полиморфно-ядерные клетки (ПМЯ) вовлечены в иммунный ответ как врожденного, так и приобретенного иммунитета. ПМЯ способны эффективно уничтожать В. anthracis путем фагоцитоза [86]. ЛТ блокирует хемотаксис нейтрофилов и продукцию супероксида — раннюю ответную реакцию на бактериальную инфекцию [87, 88]. Показано, что хемотаксис нарушается также при использовании ингибиторов р38 (и, возможно, ERK) каскада [89-91].Так же, как и химические ингибиторы ERK и р38 каскадов , ЛТ частично блокирует активацию NADPH оксидазы и последующую продукцию супероксида [92, 93]

По-видимому, В. anthracis использует оба токсина для нейтрализации нейтрофилов. Показано, что ОТ ингибирует фагоцитоз нейтрофилов [66].

1.1.6.1.4 Токсины СЯи дендритные клетки.

Дендритный клетки (ДК) - одни из самых полифункциональных клеток иммунной системы, играют важную роль как во врожденном, так и в приобретенном иммунном ответе. Хотя макрофаги считались своеобразным «троянским конем», отвечающим за внедрение инфекции и транспорт В. anthracis в региональные лимфатические узлы, откуда берет начало системная инфекция, имеются доказательства значительной роли ДК в развитии СЯ. ДК поглощают споры В. anthracis , что сопровождается значительным изменением паттерна экспрессии их рецепторов [11]. Так же, как и в случае макрофагов, JIT вызывает апоптоз ДК; чувствительность этих клеток к JIT также имеет генетически обусловленную природу [94]. JIT супрессирует выработку цитокинов воспаления (TNF-a и IL-6) и иммунный ответ, сопряженный с маркерами поверхностной активации (CD40, CD80 и CD86), индуцированный ЛПС и пептидо-гликанами [95]. Показано, что профиль секреции цитокинов ДК, зараженных токсогенным штаммом В. anthracis, разительно отличается от такового для ДК, зараженных штаммом, не образующим токсинов [96].

Таким образом, В. anthracis использует стратегию нейтрализации клеточных компонентов врожденного иммунитета через комбинированное действие двух токсинов, влияющих на основные этапы клеточной сигнальной системы.

Эффективное протекание инфекции сопровождается проникновением в клетку спор бактерии, устойчивых к супероксиду и прорастающих в фагоцитах. Нужно отметить, что, по-видимому, непосредственно попадание спор в клетку усиливает экспрессию цитокинов воспаления в макрофагах и ДК [97], тогда как действие токсинов СЯ угнетает этот процесс. По всей видимости, эти два действия В. anthracis разнесены во времени в процессе патогенеза. Очень вероятно, что активация (TLR)4 спорами В. anthracis запускает активацию макрофагов, что необходимо для первичного внедрения споры в клетку и, возможно, перемещения зараженных макрофагов к лимфоузлам. Только после этого вегетирующие бактерии производят токсины, ингибирующие процессы врожденного иммунитета и способствующие клеточной смерти, что необходимо для распространения бактерий.

1.1.6.2 Токсины СЯ и приобретенный иммунитет.

Исследования взаимодействия В. anthracis с клетками приобретенного иммунитета были предприняты лишь недавно, последние исследования показали, что В. anthracis взаимодействует со всеми типами клеточной иммунной защиты, в том числе и с системой приобретенного иммунитета.

1.1.6.2.1 Токсины СЯиДК.

Помимо вклада в систему врожденного иммунитета, ДК могут являться клеточными мишенями для атаки бактерий в качестве профессиональных антиген-презентирующих клеток в ходе адаптивного иммунного ответа. ЛТ блокирует созревание ДК с нарушением регуляции экспрессии HLA-DR и лигандов CD80 и CD86, что приводит к снижению способности ДК стимулировать антигеп-специфичные Т и В клетки. Более того, инъекции ЛТ мышам вызывает ингибирование деятельности Т и В клеток [95], что подтверждает эффективность ЛТ в подавлении приобретенного иммунитета.

1.1.6.2.2 Токсины СЯи Т-клетки.

МАРК каскад является ключевым в сигнальной системе контроля активации Т-клеток [98]. Этот процесс регулируется ЛТ непосредственно и ОТ опосредованно через повышение уровня цАМФ, что блокирует активацию Т-клеток путем нарушения сигнального пути с участием РКА, которая влияет и на МАРК каскад в том числе. Действительно, начальная активация Т-клеток в ответ на сигналы с Т-клеточных рецепторов эффективно подавляется даже при очень низкой концентрации токсинов [99101], которая достигается еще до системного распространения бактериальной инфекции. Действие уже активированных Т-клеток ослабляется ЛТ и ОТ за счет угнетения синтеза цитокинов (IL-2, интерферона, TNF-a и IL-5), нарушения регуляции маркеров активации CD69 и CD25 [100, 101]. Так же в Т-клетках, обработанных ЛТ и ОТ, наблюдается ингибирование ядерного фактора активации Т-клеток NFAT, белка активации (АР)-1, различных транскрипционных факторов, необходимых для активации МАРК сигнального пути [101].

1.1.6.2.3 Токсины СЯ и В-клетки

Хотя активация антиген-специфичных В-клеток требует участия Т-клеток, В. anthracis может также ингибировать этот процесс и напрямую через выключение каскада МАРКК. Показано, что ЛТ может ингибировать пролиферацию В-клеток и продукцию ими антител in vitro и in vivo [102].

Таким образом, приведенные выше данные иллюстрируют мощную и достаточно простую стратегию, используемую В. anthracis для предотвращения специфического ответа приобретенного иммунитета хозяина. Хотя ослабленные антиген-презентирующие клетки все еще могут выполнять свою функцию, патоген ухудшает работу всех компонентов системы приобретенного иммунитета. Эта активность бактерии может играть незначительную роль при быстром мощном развитии системной легочной формы болезни, но она важна при более распространенной и медленно развивающейся кожной форме.

1.1.6.3 Действие токсинов на неимунные клетки

1.1.6.3.1 Токсины СЯ и эндотелиамьные клетки.

Хотя угнетение иммунного ответа является важной функцией токсинов при распространении инфекции, некоторые типы неиммунных клеток, по всей видимости, также подвержены влиянию токсинов СЯ.

Например, человеческие эндотелиальные клетки (венозные и периферические ) в культуре переходят в апоптоз при обработке JIT или ингибиторами МКК 1/2 [103, 104]. Показано, что JIT уменьшает электрическое сопротивление в монослойных культурах эндотелиальных клеток [105]. Увеличение проницаемости сопровождается изменением морфологии клеток, они приобретают вытянутую форму. Эти изменения предшествуют индукции процесса клеточной смерти. Интересно, что ингибиторы сигнального пути МАРК имеют противоположный эффект на проницаемость монослойных культур эндотелиальных клеток. Таким образом, остается не ясным, как действие JIT приводит к описанным выше эффектам и является ли расщепление ферментов МКК семейства, в данном случае, причиной указанных изменений.

Многие клинические признаки СЯ, такие, как разрушение сосудов, согласуются с взаимодействием токсинов СЯ и эндотелиальных клеток. Было показано, что JIT ингибирует формирование микротрубочек и нарушает развитие сосудов [104].

1.1.6.3.2 Токсины СЯ и эритроциты.

Показано, что JIT также может приводить к лизису эритроцитов [106]. Интересно, что этот процесс происходит только в присутствии нейтрофилов. Это позволяет предположить, что нейтрофилы под действием ЛФ производят некоторые токсичные факторы, убивающие эритроциты, возможно, в кооперации с ЛТ [21].

Множество данных в области влияния токсинов СЯ на клеточный сигнальные пути получено в последние годы, однако, ряд важных вопросов остается без ответа. Например, каков механизм активации NALP1B с помощью J1T? Вовлечена ли деградация МКК под действием ЛФ в этот процесс или ЛФ расщепляет другие дополнительные мишени? Существуют ли другие факторы активации каспазы 1? Каким образом активация каспазы 1 приводит к клеточной смерти? Некоторые физиологические эффекты, оказываемые ЛТ на клетки, например, гипоксия макрофагов, увеличение проницаемости монослойных культур эндотелиальных клеток, на сегодняшний день не могут быть объяснены нарушением работы МАРКК каскада. Возможно, ЛФ также расщепляет и другие внутриклеточные субстраты или оказывает дополнительные эффекты на клетки, которые могут помочь объяснить физиологические проявления инфекции СЯ с неизвестной этиологией. Что касается ОТ, множество моментов, связанных с функцией РКА, остаются неясными. Ответы на эти вопросы могут помочь в детальном понимании фундаментальных механизмов, лежащих в основе патогенеза СЯ, а также при разработке эффективных лекарственных средств, направленных против действия токсинов.

1.1.7 Современные подходы к лечению болезни СЯ.

Ранее и до настоящего момента значительные усилия ученых сконцентрированы на разработке оптимальной терапии, способной обеспечить всестороннюю защиту организма от инфекции СЯ. Профилактическое лечение осуществляется с помощью вакцинирования. Лечение болезни антибиотиками эффективно только на очень ранних стадиях, часто даже еще до появления симптомов. Появление штаммов, устойчивых к антибиотикам, побудило исследователей к разработке новых дополнительных терапевтических агентов, таких, как препараты антитоксиновой терапии. Несмотря на высокую эффективность известных на сегодняшний день антитоксиновых медикаментов, они имеют ряд недостатков, таких, например, как необходимость поддержания постоянной высокой концентрации препарата в крови пациента для достижения оптимального уровня защиты.

1.1.7.1 Вакцины

Вакцинация является наиболее дешевым способом профилактической терапии, поэтому большое количество сил и времени ученых было затрачено на разработку безопасных и эффективных вакцин [107].

К вакцинам первого поколения относятся препараты, содержащие живые бактерии или споры не болезнетворных штаммов В. anthracis. Споры для вакцинации ограниченно применялись только на территории бывшего СССР и Китая [108, 109]. Применяемая в России и странах СНГ живая сибиреязвенная вакцина СТИ обладает повышенной реактогенностью и сохраняет опасность реверсии [110]. Вакцина, применяемая в Великобритании, помимо мажорного компонента - ПА - содержит небольшие количества ЛФ и других бактериальных иммуногенов, способных вносить вклад в иммунный ответ пациента [111, 112]. Главной проблемой при применении вакцин первого поколения является проблема стандартизации иммунного ответа, связанная с тем, что количество антигенов, например ПА, в препарате может сильно варьировать [113]. Показано, что вакцины к СЯ первого поколения могут часто вызывать раздражение, покраснение, зуд и отек в месте инъекции. Кроме того, такие вакцины недостаточно эффективны и имеют ряд побочных эффектов.

Белковые вакцины второго поколения отличаются от своих предшественников тем, что их состав полностью определен, они состоят из рекомбинантных антигенов, практически не имеют побочных эффектов и производятся на средах, не имеющих в своем составе продуктов животного происхождения. Наиболее перспективные из них — гРА (рекомбинантный ПА) в США [114] и Avecia в Великобритании [115] - уже проходят клинические испытания на животных.

Вакцины третьего поколения могут быть применимы в виде оральных, назальных и наружных препаратов, чем отличаются от более ранних вариантов вакцин, вызывают быстрый иммунный ответ и представляют собой либо живые невирулентные бактерии, несущие кодирующий антигены вектор [116], либо экспрессированные в растениях антигены [117, 118]. На сегодняшний день ни одна из вакцин третьего поколения еще не имеет лицензии.

В последнее время представляется перспективным подход на основе ДНК вакцин. Основным преимуществом этой системы является то, что антиген экспрессируется in vivo в клетках хозяина, и, в связи с этим, отпадает необходимость разработки системы экспрессии и очистки белка. Ряд испытаний таких вакцин на мышах и кроликах показал возможность использования ПА-кодирующих ДНК конструкций для защиты от инфекции СЯ [119].

Несмотря на то, что вакцинация является эффективной мерой в борьбе с инфекцией СЯ, необходимо разрабатывать также терапевтические подходы для лечения уже зараженных пациентов, для этого применяются антибактериальные лекарства на ранних стадиях болезни в комбинации с препаратами антитоксиновой терапии на поздних стадиях.

1.1.7.2 Антибактериальные лекарства

Первым антибиотиком, примененным против С Я, был пенициллин. Большинство штаммов В. anthracis чувствительно к пенициллину, эритромицину, хлорамфениколу, гентамицину, ципрофлоксацину и тетрациклину [110]. Очень важно, чтобы терапия антибиотиками применялась в самые скорейшие сроки после заражения, выбор антибиотика в данном случае является менее важным моментом. Кожная форма СЯ наиболее легко излечивается с помощью антибиотиков. Однако, развитие язв может продолжаться и при применении антибактериальных препаратов, что является результатом присутствия токсина в очаге поражения. Лечение легочной формы болезни антибиотиками, напротив, обычно неэффективно, так как болезнь редко можно распознать до появления симптомов бакгеримии и токсикоза. Антибактериальное лечение СЯ необходимо проводить в течение продолжительного периода. Это связано со способностью спор СЯ сохранять жизнеспособность в легких до 60 дней и вызывать последующую инфекцию при прекращении лечения антибиотиками [120]. Для решения этой проблемы необходимо проводить вакцинацию больных вначале терапии антибиотиками, чтобы при окончании терапии активировался иммунный ответ организма [121].

Важно отметить, что в разработке биологического оружия на основе СЯ могут применяться штаммы СЯ, устойчивые к антибиотикам. На сегодняшний день известны штаммы СЯ, устойчивые к множеству антибиотиков, включая самые современные средства, такие как ципрофлоксацин, доксициклин и б-лактамные антибиотики [122-124].

1.1.7.3 Антитоксины

Современные подходы антитоксиновой терапии основываются на использовании антител к субъединицам токсинов, свободных растворимых рецепторов, доминант-негативных ингибиторов трансклокации, низкомолекулярных ингибиторов активности ЛФ и ОФ, а также аналогов их субстратов (таблица 2).

1.1.7.3.1 Антитела к токсинам СЯ.

В качестве подходов к терапии СЯ используются антитела, препятствующие связыванию токсина с клеточными рецепторами и ингибирующие сборку токсина. Антитела к ПА обеспечивают эффективную защиту при инфекции СЯ in vivo. Использование человеческие антител против ПА, блокирующих связывание с рецепторами [125-127], и анти-ЛФ антител, препятствующих процессу сборки токсинов [128], способствует выживанию мышей после введения ЛТ. Также было показано, что антитела к рецептору CMG2 препятствуют развитию интоксикации в культуре клеток [129]. Интересным результатом, полученным одновременно российскими и американскими исследователями, явилось получение потенцирующих антител [130, 131]. Так, помимо нейтрализующего эффекта, определенная группа антител к ПА может усиливать действие токсина по аналогии с феноменом антител-зависимого потенцирования вирусных инфекций. Детальная информация об эпитопах потенцирующих антител необходима для возможного исключения данных регионов ПА из состава вакцин против СЯ.

1.1.7.3.2 Свободные рецепторы

Растворимые варианты рецепторов к токсину используются для количественного связывания ПА и предотвращения его взаимодействия с естественными мембранными вариантами рецепторов. Было показано, что растворимые формы белков ТЕМ8 и CMG2 эффективно блокируют интоксикацию, вызванную действием токсинов СЯ, на культуре клеток [27]; интересно, что растворимый CMG2 является более эффективной «ловушкой» для ПА, чем ТЕМ8, возможно, из-за его большего сродства к ПА [43].

1.1.7.3.3 Блокирование созревания и сборки токсинов.

Данные стратегии сфокусированы, главным образом, на предотвращении возможности процессинга ПА, его гептамеризации и связывания эффекторных субъединицы ЛФ и ОФ. Гекса-Б-аргинин, ингибитор фуриновых протеаз, блокирующий протеолитическую активацию ПА, уменьшает токсичность, вызываемую В. anthracis, в экспериментах на модельных клеточных культурах [132]. Методом фагового дисплея был подобран пептид, ипгибирующий ассоциацию ЛФ и ОФ с гептамером ПА. Полученный на базе данного пептида поливалентный ингибитор PVI эффективно защищает крыс от гибели при введении ЛТ и может использоваться как антитоксин против СЯ [133].

Таблица 2: Современные препараты для нейтрализации тоскинов СЯ ([129])

Антитоксины Действие Эффективное соотношение антитоксин: токсин к, Стадия испытаний Ссылка

Анти-ПА антитела Предотвращает связывание ПА с рецептором 1:22 100 пМ Испытания на животных [125]

Анти-ЛФ антитела Нейтрализует ЛФ 15:12 НО Испытания на животных [128]

Растворимый рецептор ТЕМ8 Предотвращает связывание ПА с рецептором 80:1' НО Исследование на клеточных культурах [27]

Растворимый рецептор CMG2 Предотвращает связывание ПА с рецептором 3:1' НО Исследование на клеточных культурах [281 reKca-D-эргинин Предотвращает протеолитическую активацию ПА 2,000:12 но Испытания на животных [132]

PVI (поливалентный ингибитор) Предотвращает связывание ЛФ/ОФ с ПА 150:12 но Испытания на животных [1331

ДНМ ПА Блокирует транслокацию токсина 1:3' но Испытания на животных [134]

MKARRKKVYP-гидроксамат Субстратный аналог для ЛФ НО 1.1 нМ Исследование in vitro [631

NSC 12155 Низкомолекулярпын ингибитор ЛФ 150,000:1' 500нМ Исследование на клеточных культурах [135]

DS-998 Низкомолекулярный ингибитор ЛФ НО 1.1 мкМ Исследование на клеточных культурах [136]

EGCG Низкомолекулярный ингибитор ЛФ 200:1' НО Испытания на животных [137]

GM6001 Низкомолекулярный ингибитор ЛФ 3,000:1' 2.1мкМ Исследование на клеточных культурах [63 [

119804 Низкомолекулярный ингибитор ОФ НО 20мкМ Исследование на клеточных культурах [138]

Адефовир Низкомолекулярный ингибитор ОФ 1700:1' 27нМ Исследование на клеточных культурах [1391 Эффективное соотношение - это такое молярное соотношение антитоксина к ферменту, при котором 50 % активности фермента нейтрализовано.

1 Данные получены при испытаниях на культурах клегок.

2 Данные получены при испытаниях in vivo.

1.1.7.3.4 Предотвращение транслокации токсинов.

Блокирование стадии формирования поры и дальнейшей транслокации является одной из современных терапевтических стратегий для борьбы с токсинами СЯ. Недавно были разработаны доминант-негативные мутанты к ПА (ДНМ) [134]. Такие мутанты ПА имеют несколько аминокислотных замен в домене ПА, ответственном за транслокацию токсина. Нужно отметить, что единичная молекула ДНМ, встроенная в гептамер из молекул ПА дикого типа, может блокировать транслокацию комплекса [134].

1.1.7.3.5 Использование аналогов субстратов в качестве антитоксинов.

Несколько ингибиторов ЛФ были созданы на базе консенсусов сайтов разрезания в МАРКК [63, 140, 141]. Такие ингибиторы обладали способностью связываться с ЛФ и предотвращать расщепление МАРКК [140]. Примером может служить MKARRKKVYP-гидроксамат (см таблицу 2) [63].

1.1.7.3.6 Низкомолекулярные ингибиторы эффекторных субъединиц.

Был идентифицирован ряд низкомолекулярных химических соединений, ингибирующих активность ЛФ и препятствующих гибели клеток под действием ЛТ на модельной клеточной культуре [135, 136]. Ингибитор матриксных металлопротеаз GM6001 также взаимодействует с ЛФ и блокирует цитотоксичность на культуре клеток, взаимодействовавших с ЛТ [63]. Было показано, что вещество EGCG из семейства катехинов, содержащихся, например, в зеленом чае и способных инактивировать ряд матриксных металлопротеиназ, также обладает ингибирующими свойствами по отношению к ЛФ [137].

Два ингибитора аденилат циклазной активности ОФ были недавно идентифицированы путем скрининга небольшой библиотеки аналогов АТФ [139] с использованием предварительного компьютерного моделирования докинга соединения в активном центре ОФ [138]. В первой работе 19 из 200 тысяч изученных соединений были способны блокировать активность ОФ, 2 из них оказались наиболее перспективными (см таблицу 2) и были способны препятствовать изменению морфологии клеток под действием ОТ [138]. В работе [139] наилучшим препаратом оказался адефовир, который представляет собой лицензированное лекарство для лечения вирусной инфекции гепатита В. Адефовир превращается в клетках в аналог АТФ, который связывается с активным центром ОФ и ингибирует активность фермента в культуре клеток.

На сегодняшний день активно ведется разработка новых терапевтических подходов для борьбы с биологическим оружием на основе СЯ. Очень перспективным кажется применение вакцин 3 поколения и ДНК вакцин, развиваются исследования антитоксиновых препаратов. Антитела, фальш-рецепторы и ДНМ обладают сильными ингибирующими свойствами и, по всей видимости, могут стать основой для эффективных

27 лекарств. Также многообещающими являются результаты с использованием субстратных аналогов и низкомолекулярных соединений - ингибиторов ЛФ. Однако очевидно, что последние должны быть качественно оптимизированы для создания антитоксинов с терапевтическим применением.

1.2 Методические подходы к получению ингибиторов металлопротеаз, имеющих медицинское значение.

Металлопротеиназы, активность которых связана с рядом заболеваний, начиная от патогенных инфекций до рака, являются важными терапевтическими мишенями. Среди таких металлопротеаз - карбоангидразы (нарушение регуляции экспрессии этих ферментов связано с глаукомой, некоторыми раковыми заболеваниями, различными отеками), матриксные металлопротеазы (ММП, их патологическая активность ассоциирована с ревматоидным артритом, рассеянным склерозом, раком и др ), металлопотеазы семейства ADAMTS (показано изменение их уровня экспрессии при различных раках и артритах), деацетилазы гистонов (регуляцию экспрессии множества генов с помощью блокирования данных ферментов используют в качестве стратегий терапии рака и множества других заболеваний, таких, например, как СПИД, различные болезни сердца и др ), летальный фактор сибирской язвы, металлопептидазы нейротоксинов ботулизма BoNT/A и столбняка [142]. Большинство этих ферментов содержат ион цинка в активном центре. Дизайн низкомолекулярных ингибиторов металлопротеаз направлен обычно на связывание иона металла в активном центре. Для применения данных ингибиторов на практике важнейшим условием также является специфичное связывание с конкретной металлопротеазой. Ингибиторы металлопротеаз относятся к двум типам - это модифицированные пептидные аналоги субстратов и не пептидные ингибиторы. Ингибитор первого типа состоит из «остова» и «цинк-связывающей группы» (ЦСГ). «Остов»-это обычно классическая структура, реагирующая с ферментом путем нековалентных взаимодействий, таких как водородные связи, гидрофобные и электростатические взаимодействия. ЦСГ, обеспечивающая координацию иона цинка, является определяющей для эффективности связывания ингибитора с ферментом, но не для специфичности, тогда как «остов» влияет и на специфичности ингибитора, и на его аффинность. «Остов» обычно представляет из себя короткий пептид, имитирующий субстрат. Длина пептидного фрагмента различна для разных протеаз, так пептидный ингибитор ЛФ In-2-LF содержит 14 аминокислот [141], хотя в случае других металлопротеаз пептидный участок обычно короче. ЦСГ в большинстве случаев представлена гидроксаматной группировкой (-CO-NH-OH). Ингибиторы с такой группой могут иметь наномолярный или субнаномолярный порядок констант ингибирования in vitro [142]. Однако использование гидроксаматной группы имеет ряд ограничений, так, in vivo гидроксаматная кислота быстро гидролизуется до соответствующей карбокси-кислоты, что приводит к ослаблению терапевтических свойств [143], гидроксаматная группа также имеет более сильное сродство к другим переходным металлам по сравнению с цинком [144] .На сегодняшний день ни для одного гидроксаматного ингибитора нет полной картины всех стадий клинических испытаний. При создании ингибиторов металлопротеаз используются также не гидроксаматные ЦСГ, такие как карбоксильные, тиодиазолы, тиодиазины, сульфодиимины, различные гетероциклические соединения [142]. Хелатирующие агенты могут также использоваться отдельно, без пептидной составляющей в качестве ингибиторов металлопротеаз, например EDTA или о-фенантролин . Наконец, создан ряд ингибиторов без ЦСГ, не взаимодействующих с металлом активного центра. Ингибиторы ММП PF-00356231 и агеладин А, по-видимому, связываются с аминокислотами активного центра фермента [142].

Ингибиторы ЛФ сибирской язвы (ЛФи), в большинстве случаев, содержат ЦСГ для хелатировапия ципка и пептидный фрагмент для взаимодействия с активным центром фермента. Большинство ЛФи содержат гидроксаматную группу. Несколько ингибиторов ММП были успешно использованы для инактивации ЛФ [63, 141, 145, 146]. Множество подходов было использовано для идентификации эффективных ЛФи, включая скрининг библиотек и рациональную оптимизацию известной последовательности [63, 135]. В последние годы был разработан ряд новых методов, дающих возможности дизайна высокоэффективных ингибиторов металлопротеаз. Стратегии дизайна ингибиторов принято описывать в терминах взаимосвязи структуры и активности SAR (от английского Structure-Activity Relationships)

1.2.1 Структура активного центра ЛФ. Дизайн ингибиторов с помощью структурных исследований.

Информация о кристаллической структуре используется для выявления отличий исследуемого фермента от других терапевтических мишеней для обеспечения высокой специфичности при создании новых ингибиторов.

ЛФ обладает уникальным активным центром, содержащим помимо металл-связывающего мотива НЕХХН, характерного для других металлопротеаз, блок отрицательно заряженных аминокислот для связывания преимущественно положительно заряженных последовательностей природных субстратов. Вероятно поэтому ЛФ обладает высокой специфичностью [20]. Ион Zn" тетраэдрически координирован His686, His690, Glu735 и молекулой воды в структурном окружении, характерном для металлопротеаз семейства термолизина (рисунок 5). Glu687 работает как основание и активирует цинк-связанную молекулу воды в процессе катализа, а Туг728, расположенный напротив Glu687, функционирует как кислота, протонируя образовавшуюся аминогруппу .

О 686

Hii I

690 1'* 735

667 . .

A 7 \ Glu . H - OH \

О P,' '

VII I

- CH - CONH - CH - С T N - CH - CONH.Substrate (S)

I I IH

P>7 l P, s, s,

Рисунок 5: Организации аминокислот активного центра мета л л о протеазы вокруг иона Т.п. Номера соответствуют аминокислотам в активном центре ЛФ. Глутамат (Glu-687) поляризует молекулу воду, координирующую цинк, которая индуцирует расщепление пептидной связи субстрата.

Широкая глубокая бороздка длиной 40 А, взаимодействующая с субстратом, прилегает к области активного центра. Бороздка имеет общий отрицательный заряд и содержит кластер, состоящий из Glu/Gln/Asp. Нужно отметить, что подобная структура встречается также у родственных металлопептидаз нейротоксинов ботулизма и столбняка [147] . Выравнивание N-коицевых регионов МАРКК привело к определению консенсусного мотива для сайта протеолиза ЛФ (рисунок 4) [47], где в положениях р7-р4 субстрата находятся положительно заряженные аминокислоты, а в положениях р2 и рГ расположены гидрофобные аминокислоты, что хорошо согласуется с устройством отрицательно заряженной бороздки в активном центре фермента. Последовательность консенсуса была использована для создания синтетических субстратов ЛФ [140, 148], Были созданы декапептидные и тетрадекапептидные ингибиторы, несущие ЦСГ после аминокислоты в положении pt [63, 140, 141]. Так, например, MKAKKVYPYPME-гидроксамат обладал очень хорошими ингибирующими свойствами по отношению к ЛФ (Ki=0.0011 (JM) [63]. Нужно отметить, однако, что такие большие заряженные пептидные фрагменты не подходят для создания терапевтических препаратов. Соединения, содержащие более короткие пептидные участки и несущие ЦСГ на С-конце оказались гораздо менее эффективными, например ацетил-КУУР-гидроксамат обладал Ki>100 |jM. Напротив, соединения, включающие несколько аминокислот субстрата после сайта расщепления и несущие ЦСГ на N-конце обладали более приемлемыми ингибирующими свойствами, например SHAc-YPM - Ki=l 1 рМ [63]. Кристаллизация ЛФ с описанными ингибиторами показала, что длинная субстрат-связывающая бороздка и глубокий гидрофобный карман в положении S1' фермента являются основными структурными детерминантами для прочного связывания мишеней. Отбор соединений на гидрофобность был также отмечен при скрининге библиотеки низкомолекулярных непептидных ингибиторов ЛФ в работе [135]. Получение такой структурной информации подразумевает дальнейшее создание ингибиторов с большим сродством к отрицательно заряженной бороздке и S1' региону ЛФ, и содержащих ЦСГ, оптимально подходящих к активному центру фермента.

Кристаллографические данные часто сочетаются с компьютерным моделированием для создания новых ингибиторов. На основе доступной кристаллической структуры фермента с ингибитором возможно моделирование взаимодействия фермента с новыми соединениями — производными данного ингибитора с помощью технологии 3D QSAR (от английского three-dimensional quantitative structure-activity relationship), включающей докинг исследуемого соединения в активном центре фермента и его суперпозицию (окончательное эффективное расположение). 3D QSAR учитывает стерические и электростатические свойства молекулы и соотносит их с биологической активностью фермента. Применение данной технологии к ЛФ привело к созданию серии ингибиторов с суб-микромолярными значениями IC50 и позволило приблизительно в 10 раз улучшить ингибирующие свойства исходного стартового соединения (1С5о для наилучшего соединения после применения технологии 3D QSAR было равно 0,19 jiM по сравнению с IC50 исходного соединения - 1,7 цМ) [149].

Несомненным преимуществом дизайна ингибиторов металлопротеаз на основе структуры является большое количество накопленной информации о кристаллических структурах данных ферментов и их комплексов с ингибиторами. Сочетание структурной информации с компьютерными исследованиями позволяет подобрать наилучшие соединения для синтеза, уменьшая количество исследуемых на практике ингибиторов. Хотя последние достижения роботизированных и компьютерных технологий делают возможным широкомасштабный скрининг с использованием кристаллографии, ограничением в использовании этого подхода является необходимость больших временных и денежных затрат. Нужно также отметить, что кристаллография дает нам лишь статичное представление о характере взаимодействия фермента с ингибитором, что не всегда соответствует картине in vivo. Несмотря на это, дизайн терапевтических агентов, основанный на данных кристаллографии, является широко применяемым подходом, структурная информация играет ключевую роль во множестве других стратегий дизайна ингибиторов.

1.2.2 Дизайн ингибиторов с помощью ЯМР.

В работе [150] был предложен новый метод селекции ингибиторов металлопротеаз, названный «SAR с помощью ЯМР». Данная технология использовала 15N и *Н двумерный ЯМР для измерения качества связывания низкомолекулярных соединений с ферментом, меченным 15N. Основным принципом метода является исследование молекулярных фрагментов, эффективно связывающихся с одной или несколькими структурными областями интересующего фермента, отбор наилучших и затем соединение двух фрагментов подходящим линкером для создания эффективного ингибитора. Для металлопротеаз обычно один из фрагментов - это ЦСГ, другой - остов ингибитора. Так для ММП данным методом был оптимизирован остов ингибиторов, идентифицирована наилучшая ЦСГ - нафтилгидроксамат, получены ингибиторы с IC50 порядка 10 нМ [142]. Главным преимуществом «SAR с помощью ЯМР» является экономия времени и денежных затрат, связанных с масштабным синтезом большого количества ингибиторов. Метод является универсальным, позволяет использовать одни и те же библиотеки простейших молекулярных фрагментов для различных ферментов. К недостаткам метода можно отнести отсутствие структурной информации на выходе, для получения которой необходимо использование дополнительных ЯМР или кристаллографических исследований, а также низкую чувствительность метода.

Для ЛФ было осуществлено комбинированное исследование ингибиторов, основанное на детекции протеолитической активности фермента с помощью 19F мономерного ЯМР. Применение этого метода было возможно из-за использования l9F -содержащего пептидного субстрата, при разрезании которого высвобождался продукт рС19Рз-анилин, отличающийся по спектру ЯМР от исходного субстрата [151]. Была проанализирована библиотека приблизительно из 300 низкомолекулярных фрагментов, наиболее часто встречающихся в. составе лекарственных препаратов. В результате был получен ряд соединений на базе фенилфуран-2 ил-метилен-родамин-уксусной кислоты с константами ингибирования наномолярного порядка. Наилучшее из полученных соединений было примерно на порядок более эффективным по сравнению с ингибитором ММП GM6001 в исследовании инактивации ЛФ на культуре клеток [151].

1.2.3 Дизайн ингибиторов с помощью масс-спектроскопии.

SAR с помощью масс-спектрометрии (МС) использует метод мягкой ионизации электроспрей , основные принципы такого подхода сходны с SAR методом ЯМР. Данная технология позволяет проводить отбор целых ингибиторов или молекулярных фрагментов на наилучшее связывание с интересующим ферментом. Также, как и при использовании ЯМР, возможно определение констант диссоциации комплекса для реакции связывания фермента с ингибитором. Интактный комплекс ионизуется с помощью электроспрея, что визуализируется идентификацией соответствующих пиков, разделяющихся по заряду/массе на масс-спектре. Значение Kd определяется сравнением интенсивности пиков, соответствующих связанному и несвязанному с ингибитором состоянию фермента. В работе [152] подход SAR с помощью МС был применен для идентификации новых ингибиторов ММР-3. После идентификации наиболее эффективно связывающихся потенциальных ингибиторов' остается необходимость проверки способности данных соединений напрямую блокировать активность фермента. Методы масс-спектрометрии могут применяться в качестве технологии для скрининга ингибиторов на базе детекции активности соответствующей протеазы. Так, в работе [136] была разработана такая технология для идентификации ингибиторов ЛФ. Пептидный субстрат для ЛФ был иммобилизован на подложке и далее, после инкубации с ЛФ и панелью ингибиторов, продукты реакции были исследованы с помощью масс-спектрометрического метода MALDI-TOF. Глубину прохождения реакции протеолиза можно было оценить по величинам пиков, соответствующих субстрату и продукту. Авторы использовали исходную библиотеку, состоящую из примерно 10.000 потенциальных ингибиторов ЛФ. Наилучшее соединение DS-998, блокирующее активность ЛФ, полученное в данной работе, обладало константой ингибирования порядка 1 цМ и было способно блокировать цитотоксичность ЛФ на культуре макрофагов.

К преимуществам использования методов масс-спектрометрии при селекции ингибиторов можно отнести быстроту и высокую чувствительность. Также как и ЯМР метод является универсальным и может быть применен к множеству ферментов. К недостаткам метода относится отсутствие информации о структуре комплекса фермент - ингибитор, а также о специфичности их взаимодействия.

1.2.4 Селекция ингибиторов с помощью био-неорганического подхода.

Было описано применение так называемого био-неорганического подхода при дизайне ингибиторов металлопротеаз, сфокусированного на взаимодействии металл-связывающей группировки (ЦСГ) и каталитического иона металла активного центра интересующего фермента. Одной из задач данного метода является расширение библиотеки ЦСГ для ингибиторов металлопротеаз, используя принципы фундаментальной неорганической химии как основу. В основе данной технологии лежит использование низкомолекулярных комплексов как моделей активного центра металлопротеазы. Например, комплекс гидротрис(3,5-фенилметилпиразолил)борат (Трр ■ е ) использовался для моделирования активного центра нескольких металло-ферментов [153] (рисунок 6).

Комплексы, формирующиеся между Xp'lhMt; ? ионом Zn и ЦСГ могут быть легко охарактеризованы, закристаллизованы и использованы для подбора оптимальной ЦСГ. Для подтверждения правомерности использования таких низкомолекулярных соединений несколько био-неорганических комплексов для ММП сравнивались с кристаллическими структурами полноразмерных металлопротеаз в комплексе с ингибиторами ММП [154]. Такое соотнесение показало, что координационная геометрия вокруг каталитического иона цинка в модельных комплексах и внутри структуры полноразмерного фермента практически одинакова.

Используя компьютерный молекулярный докинг и SAR с помощью био-неорганического подхода, был идентифицирован ряд ингибиторов для ММП-3 с наномолярными константами взаимодействия [142] .Недавно была применена био-неорганическая стратегия дизайна ингибиторов и для ЛФ \ 155]. В результате данного исследования были идентифицированы новые ЦСГ на базе тио-пирона , приблизительно в 20 раз более эффективные по сравнению с гидрокеаматной группировкой.

К плюсам данной стратегии можно отнести возможности быстрого синтеза, модификации и кристаллизации низкомолекулярных неорганических комплексов, что позволяет быстро оценить взаимодействия фермента с ингибитором.

Рисунок 6: Использование био-неорганического подхода для моделирования ингибиторов металлопротеаз: Кристаллическая структура (А) и химическая схема (Б) модельного комплекса активного центра металл опротеазы (Тр кислотой).

Ph. Me с ионом Zn и ЦСГ (салициловой

О'Vм

Zn

К минусам - то, что использование такого подхода обязательно требует наличия разрешенной кристаллической структуры исследуемого фермента. Нужно также отметить, что не всегда модельный низкомолекулярный комплекс точно воспроизводит структуру активного центра фермента, что повышает вероятность неверного моделирования связывания ЦСГ в активном центре фермента.

1.2.5 Механизм действия металлопротеаз. Дизайн ингибиторов на основе информации о механизме работы фермента.

Оперируя описанными выше структурными подходами, кажется вполне возможным получение эффективных ингибиторов для любой интересующей металлопротеазы. Однако, в некоторых случаях это оказывается затруднительно, например, для протеиназы токсина столбняка не удавалось синтезировать ингибиторы со значением IC50 меньше 10"6 у

-10"' М, хотя наномолярные ингибиторы были успешно получены для близкородственной протеазы - нейротоксина ботулизма [147]. Этот факт может быть объяснен различием в механизмах катализа двух ферментов, так, было показано, что для эффективной работы металлопротеиназы столбняка ферменту необходимо связывание двух дополнительных областей субстратной последовательности, удаленных от сайта разрезания, это является обязательным условием для эффективного расщепления субстрата [156]. Таким образом, механистические исследования работы фермента могут привести к созданию высокоэффективных ингибиторов конкретных стадий протеолитической реакции, значительно более специфичных, чем например пептидил-гидроксаматы. Нужно отметить, что среди полученных на сегодняшний день ЛФи лишь пептидил-гидроксаматы обладают наномолярными характеристиками [63].

События, происходящие в активном центре металлопротеаз, более-менее идентичны для большинства членов этого семейства (рисунок 5).

Металлопротеазы содержат 1 ион металла (чаще всего цинка) в активном центре фермента, координированный тремя аминокислотами (в случае ЛФ - His686, His 690 и Glu 735). В свободной форме фермента четвертой координационной группой является молекула воды, при образовании же комплекса с ингибитором молекула воды вытесняется из активного центра с помощью ЦСГ [157]. Многие ферменты этой группы сохраняют способность к протеолизу при замене цинка на ряд других переходных металлов, таких как Со, Mn, Fe [158], однако их каталитическая эффективность может изменяться. Роль иона цинка состоит в усилении поляризации карбонильной группы пептидной связи субстрата. Glu (735 в случае ЛФ) действует как общий основной катализатор, активируя молекулу воды и способствуя ее атаке на карбонильную группу субстрата. Туг 728 поставляет протон пептидной связи. Под действием атаки молекулы воды происходит расщепление пептидной связи. В случае ЛФ, важным этапом протеолитической реакции , по-видимому, является докииг субстрата в отрицательно заряженной бороздке близ активного центра, о чем свидетельствует сродство данного фермента к положительно заряженным аминокислотным остаткам р4-р7 субстрата. В первой кристаллической структуре ЛФ с субстратом, полученной в работе [20], субстрат был расположен в инвертированном положении по отношению к отрицательной бороздке и расстояние от активированной молекулы воды до сайта расщепления было около 6 А; это заставило авторов сделать предположение , что был закристаллизован комплекс в неэффективной конформации, который далее претерпевает конформационное изменение и последующее расщепление (пред-расщепленный комплекс). Существование двух конформационных стадий комплекса фермент-субстрат, предшествующих расщеплению, было предположено также на основании кинетических данных для термолизина [159] , однако, не было подтверждено кристаллографически, возможно, из-за крайне короткого времени жизни комплекса прогеаза-субстрат. При рентгеноструктурном анализе комплекса ЛФ с субстратом в работе [63] субстрат LF20 был связан с ЛФ в продуктивной конформации в отличие от работы [20], что, однако, не исключает возможности существования мультистадийного механизма взаимодействия металлопротеаз с субстратом. Для исследования тонкого механизма работы ферментов часто используют методы пред-стационарной кинетики, позволяющие описать процессы, происходящие до наступления состояния кинетического равновесия и характеризующие переходные стадии реакции. Предстационарную кинетику процесса исследуют либо с помощью быстрого смешивания реагентов и регистрации изменений в системе до наступления равновесия (струевые методы), либо резким изменением внешних условий для системы, находящейся в равновесии (релаксационные методы). Сущность струевых методов заключается в том, что реакция инициируется быстрым смешиванием реагентов в проточных условиях. Наиболее широкое распространение при анализе быстрой кинетики ферментативных реакций нашел метод «остановленной струи». Для остановки струи используется простое устройство, позволяющее остановить поток через 1-2 мс. Устройство представляет собой поршень, расположенный в конце трубки для наблюдения, реакционная смесь толкает поршень, и он резко останавливается, дойдя до внешнего ограничителя. Принципиальная особенность всех «струевых» методов - быстрое смешивание реагирующих растворов в специальной смесительной камере [160].

Среди релаксационных методов наиболее популярными являются «скачок температуры» и «скачок давления». Например, пропустив через раствор импульс тока высокого напряжения , можно повысить температуру раствора на 10°С менее чем за 1 мкс. Резкое изменение давления в системе можно проводить либо скачкообразно, либо в периодической форме с использование ультразвуковых волн. Важное преимущество релаксационных методов по сравнению со струевыми состоит в том, что для них не требуется быстрого смешивания реагентов перед началом регистрации кинетики, а это в свою очередь позволяет намного уменьшить «мертвое время» установки [161]. Так как время задержки наиболее распространенного метода - «остановленного потока» -находится в суб-миллисекундном диапазоне, он дает возможность разрешения стадий каталитической реакции даже для быстрых ферментов (времена превращения для которых находятся в районе 0,1-1 мс) со сложными механизмами, например для ДНК гликозилаз, осуществляющих конверсию субстрата в продукт через три и более промежуточных конформационных шага [162].

На основе исследования предстационарной кинетики был предложен механизм действия термолизина, описывающий дополнительную стадию взаимодействия фермента с субстратом [163]. В работе [158] с помощью рентгеноструктурного анализа кристаллической структуры комплексов термолизина с субстратом и различными переходными металлами в активном центре было показано, что фермент претерпевает конформационное превращение после связывания с субстратом и переходит из «открытой» конформации в «закрытую».

Дизайн псевдосубстратных ингибиторов, способных «заморозить» состояние фермента У до перехода в продуктивную конформацию, может открыть значительные перспективы ! для создания новых специфических соединений по сравнению с классическими ингибиторами. Подобные ингибиторы, «запирающие» фермент в непродуктивной конформации, были недавно описаны для протеинкиназ [164, 165]. Для ММП-2 и ММП-9 был описан механизм-зависимый ингибитор SB-3CT, селективно блокирующий именно данные ферменты [166]. Нужно заметить, что для работы многих металлопротеиназ, в том числе ММП, требуются их предварительная активация с отщеплением N-концевого про-пептида (ЛФ является исключением). Существует предположение - «гипотеза переключения цистеинов» - что отсутствие активности такого про-фермента обусловлено координацией иона Zn2+ активного центра цистеином про-пептида, занимающим место молекулы воды [167]. В работе [166] с помощью рентгеноструктурного анализа была подтверждена данная гипотеза, было показано, что при активации фермента происходит замещение цистеина молекулой воды в активном центре фермента. Ингибитор SB-3CT, содержащий тиолатную группу, координирует Zn, вытесняя молекулу воды, и создает «исходную» конформацию активного центра, как бы восстанавливая структуру профермента. Такой подход к созданию ингибиторов может быть применим для всех металлопротеаз, нуждающихся в отщеплении про-пептида для активации.

Использование информации о механизме работы металлопротеаз в совокупности со структурными данными выглядит очень перспективным для разработки стратегий дизайна высокоспецифичных ингибиторов с константами связывания наномолярного порядка.

1.2.6 Получение ингибиторов путем широкомасштабного скрининга на основе активности фермента.

Описанные выше подходы к дизайну ингибиторов реально применимы, когда доступна структурная информация или информация о механизме действия фермента, имеются данные об его субстратной специфичности. Начальным этапом в создании ингибиторов для малоизученного фермента является обычно скрининг большого пула потенциальных ингибиторов с использованием простого метода измерения биологической активности исследуемого фермента. Для того чтобы исследовать сотни, тысячи и даже миллионы соединений необходимо, чтобы анализ активность фермента был проведен максимально быстро с использованием минимального количества реагентов. В идеальном случае, субстрат для протеаз должен быть таков, чтобы было возможно прямое измерение соответствующих кинетических констант и отслеживание глубины протекания реакции в любой интересующий момент времени. Использование множества стратегий оптимизации субстратов для широкомасштабного скрининга привело к созданию приемлемых гест-систем для разных ферментов. Так как часто исследования проводятся с использованием грубо очищенных протеазных препаратов, то специфичность используемого субстрата важна для анализа протеолитической активности фермента.

Множество примеров успешного применения широкомасштабного скрининга на базе прямого измерения активности фермента было описано. В работе [135] с помощью такого подхода были идентифицированы несколько ингибиторов ЛФ непептидного характера, наилучший из которых NSC-12155 обладал суб-микромолярной константой ингибирования. Также были получены ингибиторы ЛФ на базе аминогликозидов, которые не имели классической структуры пептидомиметика с ЦСГ. Такие ингибиторы могут быть очень перспективными для терапии сибирской язвы, так как они одновременно являются и антибиотиками, и ингибиторами активности ЛФ с наномолярными характеристиками [168, 169] .

1.2.6.1 Подбор эффективного субстрата для измерения активности протеазы.

Первым этапом в селекции ингибиторов путем широкомасштабного скрининга является подбор эффективного субстрата для создания быстрой, чувствительной и дешевой тест-системы активности фермента. Исторически, субстратная специфичность нового фермента определялась идентификацией продуктов расщепления стандартного пептидного или белкового субстрата исследуемой протеазой. Например, использовалась широко доступная В-цепь инсулина [170]. Далее продукты реакции разделялись с помощью ВЖХ и идентифицировались методами масс-спектрометрии или N-концевого секвенирования. Для определения кинетических констант необходимо было проведение множества таких исследований, варьируя концентрацию фермента, субстрата и время реакции. Так как данный подход использовался очень широко, то возможно было его применение для прямого сравнения различных протеиназ [171], минусами метода являлось то, что контекст сайта расщеплепия отличался от встречающегося в природных субстратах, в расчет также не принималась доступность потенциального сайта расщепления для фермента.

До разработки эффективных комбинаторных методов единственным путем создания пептидного субстрата для интересующей протеазы было использование баз коммерчески доступных субстратов. Применение такого подхода к ЛФ [172] выявило несколько пептидных субстратов, расщепляемых с очень низкой эффективностью ( kcat/Km= 10-50 М" V). Такое случайное тестирование пептидов дает быструю оценку их пригодности, однако вероятность обнаружения эффективного субстрата таким методом невелика.

1.2.6.1.1 Использование специфичных субстратов протеаз.

Обладая информацией о мишенях протеазы in vivo, становится возможным создание гест-систем для широкомасштабного скрининга ингибиторов на базе последовательностей природных субстратов. С момента открытия расщепления белков семейства МАРКК-киназ ЛФ [48] стало возможным детектирование его активности на основе природных субстратов, например, разделение продуктов расщепления рекомбинаптных киназ методом гель-электрофореза [47, 173]. Однако такой подход неприменим для широкомасштабных исследований ввиду его трудоемкости. В работе [174] была разработана система с использованием природного субстрата МЕК1 для широкомасштабного скрининга ингибиторов ЛФ. Слитный белок, содержащий домен глутатион-Б-трансферазы (GST) и полноразмерную киназу МЕК1, был иммобилизован на плашке, покрытой глутатионом —низкомолекулярным лигандом, способным связываться с GST. После обработки ЛФ или ЛФ с ингибитором глубина протекания ферментативной реакции определялась с помощью взаимодействия со специфическими антителами к С-концевому домену МЕК1. Такая стратегия имеет право на существование, однако она требует временных затрат на проведение ИФА, а также является достаточно дорогой из-за использования антител.

Множество стратегий детекции активности протеазы используют информацию о последовательности сайта разрезания для дизайна пептидиых субстратов. Для ЛФ большинство предложенных систем измерения активности базируются на использовании обобщенной консенсусной пептидной последовательности для докинг сайтов киназ семейства МАРКК [148]. Относительная эффективность разрезания одного из таких субстратов в 100 раз превышала эффективность разрезания пептида на базе докинг-сайта МЕК1 [148]. Нужно отметить, что пептидные последовательности, соответствующие непосредственно докинг-сайтам киназ МАРКК, являются неэффективными субстратами для ЛФ in vitro. Это может объясняться тем, что ЛФ требуются дополнительные эпитопы для связывания аминокислотных последовательностей киназ [51] или тем, что ЛФ имеет некоторые другие клеточные мишени с отличными от МАРКК сайтами протеолиза. В любом случае, пептиды, соответствующие сайтам расщепления МАРКК, не подходят для скрининга ингибиторов. В работе [140] улучшение кинетических характеристик субстрата осуществлялось за счет добавления нескольких положительно заряженных аминокислотных остатков на N-конец субстрата, также основанного на использовании МАРКК-киназного консенсуса. Данные пептиды имели приемлемые характеристики (kcat/Km = 0,5-4*106 M'V1). Однако подобные субстраты могут проигрывать в специфичности, являясь мишенями для множества протеаз за счет протяженного положительно заряженного блока. Для одновременного улучшения кинетических параметров и специфичности субстрата используют различные комбинаторные подходы.

1.2.6.1.2 Подбор субстрата комбинаторным способом. 1.2.6.1.2.1 Контекст-зависимые субстратные библиотеки.

Одним из комбинаторных подходов, основанных на использовании субстратного консенсуса в качестве "остова" с использованием точечных аминокислотных замен, является использование контекст-зависимых субстратных библиотек. Последовательно варьируя специфические аминокислотные остатки в последовательности субстрата и тестируя каждый вариант на разрезание интересующей протеазой, возможно получение более эффективного субстрата в рамках «контекста» исходной оригинальной последовательности. Для выявления позиций аминокислот, наиболее критичных для распознавания ферментом, создаются библиотеки субстратов «аланинового сканирования» [175, 176], где аминокислоты в интересующих положениях субстратной последовательности по очереди заменяются алапином путем химического синтеза или генетического мутагенеза. Так, для ЛФ методом «аланинового скана» были протестированы несколько аминокислотных позиций в субстрате LflO - производном консенсуса МАРКК киназ [63] (таблица 3).

Таблица 3: Аланиновое сканирование потенциального субстрата ЛФ [63].

Название субстрата Последовательность kcJKm (M's')

Положения в субстратной последовательности ргр-фзргрфгрг'рз'р^

LflO MCA-KKVYPYPME-DNP 130.000±20.000

Lfl0-P5 Ala MCA-AKVYPYPME-DNP 7.500±500

Lfl0-P2 Ala MCA-KKVAPYPME-DNP 60.000±I0.000

LflO-Pl' Ala MCA-KKVYPAPME-DNP 22.000±2.000

В данном случае применение аланиновых замен показало, что из исследованных позиций наиболее критичными являются р5 и рГ.

Использование библиотек субстратов на базе одного специфического контекста является перспективным для увеличения скорости превращения субстрата в том случае, когда уже известен исходный специфический субстрат.

1.2.6.1.2.1 Смешанные контекст-зависимые библиотеки субстратов.

В случае необходимости получения новых пептидных специфических субстратов применяют библиотеки пептидов, содержащих набор различных аминокислот в интересующей позиции. Некоторую сложность в данном случае представляет определение кинетических параметров субстратов, так как часто доступным является относительное значение kcat/Km только для смеси субстратов, однако в большинстве случаев этого бывает достаточно для определения наилучшего субстрата в заданном пептидном пуле. В работе [177] была создана контекст - зависимая библиотека субстратов, основанная на известной последовательности расщепления коллагеназы Dnp-Pro-Leu-GlyjXeu-Trp-Ala-DArg-NH2, где Leu и Тгр в положениях РГ и Р2' были заменены наборами различных аминокислот. Сочетанием методов МС и ВЖХ была проведена идентификация всех продуктов протеолиза. Комбинацией наилучших кандидатных аминокислот для положений РГ и Р2' был получен субстрат Pro-Leu-Gly|5'-methylC-His-Ala-DArg-NH2 с соотношением kcat/Km, превышающим в 10 раз таковое для исходного субстрата.

1.2.6.1.2.3 Анализ библиотек пептидных субстратов методом секвепирования.

Определение первичной структуры фрагментов пептидов после реакции с протеазой является другой альтернативной стратегией для прямого определения сайта разрезания, давая возможность полуколичественной оценки скоростей расщепления субстратов. Если пептидная библиотека содержит защищенные N- и С-концы, то позиция разрезания может быть определена стандартными методами N- и С-концевого секвенирования. Если используются эквимолярные соотношения субстратов, то процент встречаемости аминокислотных остатков в положениях Рп' может быть легко оценен с помощью секвенированиия по Эдману. Относительное значение kcat/Km для разрезания субстратов может быть определено по количеству той или иной аминокислоты, детектируемой на каждом цикле [178, 179].

При исследовании 13-членной пептидной библиотеки субстратов ЛФ применяли сочетание подходов контекст-зависимой библиотеки и прямого секвепирования [63]. Данная библиотека была создана на базе консенсуса докинг-сайтов МАРКК и содержала 8 специфических аминокислот в фиксированных положениях, остальная часть последовательности была представлена вырожденными аминокислотами (последовательность первого пула пептидов - КККРТРХХХХХАК, последовательность второго пула, составленного на основании данных о разрезании пептидов в первом пуле -MXXXXXPYPMEDK). Методом прямого секвенирования такой частично вырожденной библиотеки пептидов был определен новый консенсус ( RKKVYPYPNE), близкий, но немного отличающийся от описанного ранее по последовательности аминокислот. Субстрат LF15, созданный на базе нового консенсуса с добавлением нескольких положительных аминокислотных остатков на N-конец пептида, обладал прекрасными

7 II кинетическими характеристиками (kcat/KM=4 ± 1*10 М" s"). Содержание длинного положительно заряженного блока, однако, является отрицательной чертой для субстрата, созданного с целью специфической детекции протеазы, так как подобный субстрат может расщепляться целым рядом ферментов, специфичны к Arg, Lys и другим положительно заряженным аминоксилотам, т.е. с большой вероятностью может подвергаться неспецифическому протеолизу.

1.2.6.1.2.4 Иммобилизованные субстратные библиотеки.

Эффективной стратегией для преодоления эффекта «среднего субстрата», проявляющегося при анализе пулов большого количества пептидов, могло бы стать исследование всех членов библиотеки как индивидуальных соединений. Однако сложность представляет синтез большого количества индивидуальных субстратов. В работе [180] эта проблема решена с помощью синтеза серии флуоресцентно меченных субстратов на мембранных дисках методом «разделения и смешивания» [181] в формате FITC-спейсер -ХааЦХааГ-спейсер - мембрана, где Хаа представляет из себя набор из 20 природных аминокислот. Каждый индивидуальный диск с субстратом был обработан в формате 96-луночной плашки химотрипсином или папаином. Для считывания кинетики диски удалялись из лунок через определенные интервалы и измерялась флуоресценция FITC в растворе. Так как диски были физически помечены в процессе синтеза для их индивидуальной идентификации, то в дальнейшем не требовалось определение структуры пептида.

Более эффективный метод с использованием иммобилизованных субстратов был предложен в работе [182] для определения специфичности субтилизина Карлсберг. Использовался субстрат в формате NH2-Tyr(3-N02)-XXPXJ.XX -Ьуз(2-аминобензоил) -твердый носитель - шарик. Каждый шарик нес уникальный субстрат, который не был флуоресцентным до тех пор, пока протеаза не отщепляла N-конец субстрата, содержащий группу Туг (3-N02) - гаситель флуоресценции для флуорофора аминобензоил. Далее индивидуальные шарики были изолированы и пептиды были отсеквенированы. Подобные исследования специфичности протеаз, основанные на предварительном тушении флуоресценции и использовании шариков, были применены для множества протеолитических ферментов [170].

Хотя методы, основанные на использовании шариков и других носителей очень эффективны, они имеют ряд ограничений. Во-первых, «идеальный» субстрат, отобранный с использованием шариков, не всегда проявляет такие же свойства при взаимодействии с ферментом в растворе, вероятно, из-за возможного взаимодействия протеазы с твердым носителем. Во-вторых, достаточно сложно определить отношение kcat/Km для субстрата непосредственно па шариках, так же как и точное количественное измерение флуоресценции на шариках представляется затруднительным.

1.2.6.1.2.5 Сканирующие синтетические комбинаторные библиотеки.

Метод, предложенный в работе [183], предполагает использование составных библиотек из нескольких пулов смесей пептидов, в которых одна позиция в составе произвольной последовательности фиксируется, а остальные являются вариабельными, и количество пулов соответствует количеству позиций в исследуемом субстрате. При таком подходе вклад конкретной аминокислоты изучается в рамках всех возможных вариантов окружения вместо предопределенного контекста, как при использовании контекст -зависимых библиотек.

1.2.6.1.2.6 Субстратный фаговый дисплей

Субстратный фаговый дисплей является одной из наиболее мощных стратегий для идентификации новых эффективных субстратов протеиназ. Нитчатые бактериофаги могут быть генетически модифицированы таким образом, что наряду со своими белками оболочки они способны нести на поверхности рекомбинантные белки оболочки с последовательностями рекомбинантных субстратов для протеаз (рисунок 7). Для этого на 5' конец гена glllp, кодирующего белок рШ фаговой оболочки, представленный 5 копиями на одну фаговую частицу, помещают вырожденную субстратную последовательность различной длины для разных библиотек и последовательность, кодирующую аффинный эпитоп (ligand на рисунке 7), ответственный за иммобилизацию фага. В качестве лиганда используются б-His мотив, эпитопы для коммерчески-доступных антител, такие как с-туе или Flag [185], недавно было предложено применение биотин лигазы BirA для биотинилирования субстрат лиганд для дисплея

Ч—t субстрат лиганд для дисплея /

•L устойчивость ГТ фагмида к антибиотоку W fj fi on

Е coli ori фаг-помощник устойчивость к актобютику

Моновалентный фаг Поливалентный фаг

Рисунок 7: Принципы моновалентного и поливалентного фагового дисплея |184]. П ori: фаговый ориджин репликации; Е. coli ori: бактериальный ориджин репликации; I, V, VI. VIII.тены, кодирующие фаговые белки; Р:промотор,еШр - ген белка фаговой оболочки III. рекомбинантных белков III субстратных фагов с последующей их иммобилизацией на биотин-связывающих сорбентах [186]. При проведении скрининга фаговые частицы либо вначале иммобилизуются на твердой поверхности с последующей обработкой протеазой (при селекции на твердом носителе), либо подвергаются воздействию протеазы в растворе с последующей иммобилизацией не подвергшихся протеолизу фагов (селекция в растворе). В обоих случаях свободные фаги собирают, заражают ими культуру E.coli., выделяют ДНК индивидуальных фаговых клонов и определяют структуру экспонированных пептидных субстратов с помощью секвенирования. Многочисленные повторяющиеся раунды селекции таких фаг-дисплейных библиотек позволяют получить специфичные субстраты на выходе. Мэттью и Уэлш впервые применили субстратный фаговый дисплей с использованием 5 - членной пептидной библиотеки из ~107 вариантов субстратов [187]. Авторы использовали вспомогательный вектор фагемиду для переноса генетической информации в фаговую частицу. В таком случае примерно один рекомбинантный фаговый белок pill статистически попадает в фаговую частицу, поэтому метод получил название «моновалентного фагового дисплея» (рисунок 7). Используя селекцию фагов на твердом носителе, авторы получили последовательность разрезания для ряда протеаз, включая мутантную форму субтилизина, ранее считавшуюся неактивной, где каталитический His в активном центре был заменен Ala. Интересно, что 18 чувствительных к данной протеазе субстратов обязательно содержали His. Данные молекулярного моделирования показали, что субстратный His оказался способным выполнять функцию His активного центра фермента с восстановлением его каталитической активности по отношению к данным субстратам. В работе [188] была подтверждена возможность подобного субстратного катализа с помощью исследования мутантного варианта эластазы методом субстратного фагового дисплея. Возможности моповалентного фагового дисплея были продемонстрированы на примере исследования субстратной специфичности многих протеаз — фурина [189], протеиназы 1 вируса простого герпеса [190], триптазы [191], ММП мембранного типа 1 [192]. Существует несколько ограничений метода «моновалентного фагового дисплея». Так, недостатком является то, что лишь небольшая часть фагов на своей поверхности несет рекомбинантный pill, поэтому в данному случае обычно используется стратегия селекции на твердом носителе, включающая стадию связывания фагов и многочисленных трудоемких отмывок перед обработкой интересующим ферментом. Так же как и в случае использования иммобилизованных на шариках пептидных библиотек, отрицательное влияние на специфичность субстрата может оказать потенциально возможное взаимодействие фермента с твердым носителем. Для преодоления этих трудностей группа

Смита [193] разработала подход, названный «поливалентным фаговым дисплеем», при котором все pill, экспонированные на фаговой частице, являются рекомбинантными (рисунок 7). Такой подход дает возможность использовать стратегию селекции фаговых субстратов в растворе, что сокращает все ограничения метода до минимума. Используя данную стратегию , авторы смогли получить пептидные субстраты для матрилизина и стромелизина, отношение kcat/Km которых превышало таковое для всех описанных ранее субстратов. В работе группы Кори [194] применение «поливалентного фагового дисплея» привело к созданию субстрата для сериновой протеазы PSA (от английского, prostate specific antigen) с отношением kCat/Km, в 100 раз превышающим таковое для последовательности природного субстрата семеножелина. Данное исследование показало, что «идеальный» субстрат не обязательно должен быть близок по последовательности к природному, комбинаторные методы дают возможность получения гораздо более эффективного субстрата, который может быть использован для широкомасштабного скрининга ингибиторов. Множество ферментов было протестировано с помощью «поливалентного фагового дисплея»: активатор плазминогена урокиназного типа (иРА, полученный субстрат расщеплялся в 1000 раз эффективнее чем природный субстрат плазминоген) [195]; плазмин (полученный субстрат был в 700.000 более эффективным, чем субстрат на основе последовательности активации при расщеплении предшественника плазминогена) [196], человеческая коллагеназа [197] и множество других.

Хотя поливалентный метод фагового дисплея позволяет проводить стадию взаимодействия с протеазой в растворе, отсутствие предварительной иммобилизации может приводить к накоплению фагов, не содержащих полноразмерных рекомбинантных белков оболочки и аффинных эпитопов (появившихся, например, вследствие генетических мутаций или подвергшихся протеолизу ферментами E.coli.). После многочисленных раундов селекции количество таких фагов становится заметным. С другой стороны, эффективность разрезания субстратов протеазой должна быть выше, чем в случае моновалентного дисплея, так как все 5 копий субстрата должны быть расщеплены для эффективной элюции субстратного фага с твердого носителя. Фаговый дисплей дает возможность отбора циклических пептидов для изучения взаимодействия протеазы с субстратом, основанного на использовании дисульфидных связей. Особенность использования циклических пептидов заключается том, что они более устойчивы к протеолизу по сравнению с линейными пептидами, т.е. отбор идет на связывание. Так, для иРА из 109 вариантов циклических пептидов были отобраны 28, 19 из которых содержали одинаковую последовательность. [198].

Как и у любого метода, у субстратного фагового дисплея существует ряд ограничений. Так как сборка фаговой частицы происходит в E.coli., то любые субстратные последовательности, чувствительные к протеиназам хозяина, могут лишиться аффинного эпитопа и будут потеряны для скрининга. Также необходимо быть уверенным, что интересующий фермент расщепляет последовательность рекомбинантного фагового белка именно внутри вырожденной субстратной последовательности, например, расщепление внутри последовательности аффинного эпитопа делает использование библиотеки невозможным. При использовании любого биологического подхода могут применяться только природные аминокислоты, то есть создание субстратов с неприродными аминокислотами невозможно. Вырожденная последовательность субстрата расположена в неестественном для фермента окружении. Неспецифическое взаимодействие протеазы и фага может привести к отбору ложных субстратов. Селекция фаговых субстратов также подвержена статистическим ошибкам, когда псевдо-субстраты учитываются при создании консенсуса.

1.2.6.1.2.7 Другие стратегии биологического субстратного дисплея.

Было предложено несколько других генетических стратегий для оптимизации протеазных субстратов. В работе [199] был предложен метод идентификации наилучшего субстрата для протеазы вируса гепатита С (HCV). Был создан модифицированный синбдис вирус, требующий для своей корректной сборки активности протезы HCV. Вырожденные пептидные последовательность были помещены вместо нативных в структуру двух сайтов разрезания полипротеина химерного вируса, таким образом , что только вирусы, кодирующие полипептид, чувствительный к разрезанию HCV протеазой по двум сайтам, были способны к упаковке. Авторы обнаружили, что для функционирования первого сайта разрезания абсолютным условием является нахождение Cys в позиции pi, для второго положение pi может занимать как Cys ,так и Thr.

В работе [200] была разработана стратегия определения специфичности протеазы в дрожжах. Определяя оптимальный субстрат для протеазы Кех2, авторы поместили плазмиду с геном феромона про-а-фактора с потенциальным сайтом разрезания для Кех2 в стерильный а- штамм дрожжей с отсутствием гена про-а-фактора. Сайт разрезания был вырожденным по позиции р2. В отсутствии протеолиза Кех2 не происходил процессинг а-фактора и не наблюдалась конъюгация а-гаплоидных клеток друг с другом. Прямая количественная оценка частоты конъюгации клеток позволяла определить количество процессированного а-фактора и получить относительное kcaX/Km для различных вариантов пептидных последовательностей сайта разрезания Кех2.

Другой подход с использованием дрожжевой системы экспрессии был описан в работе [201] для оптимизации субстрата протеазы HCV. Мишень для HCV протеолиза была представлена слитным белком, состоящим из транскрипционного фактора GAL4, вырожденной субстратной последовательности и мембранного белка STE2. При экспрессии HCV протеазы те дрожжи, субстратная последовательность внутри мишеней которых была разрезана, высвобождали GAL4, что позволяло таким клеткам расти на селективной среде.

Была предложена технология отбора субстратов протеиназ на поверхности внешней мембраны Е.coli.[202], названная CLiPS (от английского, cellular libraries of peptide substrates). Каждая бактериальная клетка содержала флуоресцентно-меченый пептидный субстрат, соединенный с белком внешней мембраны. Гидролиз субстрата под действием исследуемой протеазы оценивался измерением общей флуоресценции клетки с использованием флуоресцентного клеточного сортера FACS. Возможности метода были продемонстрированы с помощью определения субстратной специфичности для двух неродственных протеаз — каспазы-3 и энтеропептидазы (энтерокиназы). Для оптимизации субстрата летального фактора была предложена система на основе синего и желтого флуоресцентных белков CyPet и YPet, составляющих эффективную FRET пару и соединенных чувствительным к действию ЛФ линкером [203]. При одновременной экспрессии в Е. coli. слитного белка, содержащего оба флуорофора, и летального фактора происходило падение уровня FRET сигнала, свидетельствующее о разрезании линкера между флуоресцентными белками и их пространственном удалении друг от друга. Нужно отметить, что запуск экспрессии ЛФ в данной системе регулировался арабинозным промотором, имеющим очень низкий уровень подтекания, что давало возможность включать продукцию ЛФ после синтеза и созревания хромофоров флуоресцентных белков. Оценивать степень расщепления того или иного субстрата предлагалось также с помощью FACS. В данной работе была изложена стратегия для оптимизации субстрата ЛФ.

1.2.6.2 Создание системы детекции активности протеазы для широкомасштабного скрининга ингибиторов.

Наиболее эффективный субстрат далее обычно используется для разработки хромогенных или флуоресцентных систем детекции активности фермента. Непосредственно измерение изменения поглощения или флуоресценции при протекании реакции в отсутствии и присутствии ингибитора позволяет определять соответствующие константы ингибирования. Из-за максимальной чувствительности и минимальной интерференции с другими компонентами реакции, флуоресцентные тест-системы являются более предпочтительными по сравнению с хромогенными; флуорофоры с более длинноволновыми характеристиками больше подходят для масштабного скрининга ингибиторов по сравнению с метками, возбуждаемыми в ультрафиолетовой области.

1.2.6.2.1 Подбор оптимальных репортеров для детекции работы фермента in vitro.

Хромогенные субстраты, такие, например, как «ора-нитроанилиды (pNA) (рисунок 8А) могут быть легко синтезированы на базе наилучшей субстратной пептидной последовательности, определенной для изучаемого фермента [204].

Так как хромогенная группа находится в форме анилида, то поглощение таких субстратов при X =390 нм минимально. После отщепления пара-нитроанина в процессе реакции поглощение возрастает пропорционально концентрации продукта. Несмотря на то, что чувствительности метода достаточно для измерения активности некоторых ферментов, такой подход имеет ряд недостатков. Во-первых, требуется отщепление свободного пара-нитроанина, таким образом, могут быть использованы только субстраты в форме -Р4-РЗ-P2-Plj.pNA. pNA не является природной аминокислотой и может не подходить для рГ положения субстратов многих протеаз. Во-вторых, множество низкомолекулярных соединений, тестируемых в качестве ингибиторов, имеют область поглощения при 390 нм и не могут быть использованы с pNA-субстратами [170].

Н02С Ac-Tyr4-Val3-Ala24

-N

DABCYLd

HOzC Ac-Tyr4-Va!rAla2

R = CH3; AMCb R = CF,: AFCc н I XXJ7 R

EDANS"

Рисунок 8: Субстраты для широкомасштабного скрининга ингибиторов протеаз. Стрелки указывают на сайт расщепления для получения оптического сигнала. (А) Хромогенный субстрат для каспазы-1 с использованием pNA. (Б) флуоресцентные АМС и AFC субстраты для каспазы-1. (В) FRET-субстрат для протеазы HIV-1 с DABCYL/EDANS в качестве пары флуорофора/гасителя [170].

Для ЛФ были созданы несколько субстратов с использованием pNA с хорошими кинетическими характеристиками [140, 141]. Однако такие субстраты обладали не очень высокой чувствительностью.

Флуоресцентные субстраты являются обычно более чувствительными по сравнению с хромогенными, и микромолярные значения Кт взаимодействия многих протеаз с пептидным субстратом попадают в область используемых концентраций ряда флуорофоров, таких как р-нафтамиды (PNA), аминометилкумарины (АМС) и амино-трифлуорометилкумарины (AFC) (рисунок 8Б). Продукт и субстрат имеют в данном случае максимум флуоресценции на разных длинах волн. К сожалению, эти флуорофоры могут также использоваться только рядом с сайтом расщепления , т.е. данные метки имеют те же ограничения, что и pNA-субстраты. Данные соединения неприменимы, если потенциальные ингибиторы гасят флуоресценцию субстрата (фалын-отрицательные ингибиторы) или флуоресцируют в ультрафиолетовой области возбуждения данных флуорофоров.

Использование субстратов на базе флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET, от английского "fluorescence resonance energy transfer") позволяет вводить в состав субстрата аминокислотные остатки после сайта разрезания (в позициях рп'); метки в данном случае располагаются на N и С концах полной аминокислотной последовательности субстрата. Наблюдать за процессом протекания реакции протеолиза можно по уменьшению флуоресцентного сигнала при пространственном удалении меток друг от друга. Некоторые пары из двух флуорофоров используются для дизайна системы широкомасштабного скрининга ингибиторов протеаз, такие как салициловая кислота/хелаты лантаноидов (ТЬЗ+,ЕиЗ+) [205] или триптофан/дансил [206]. Субстраты с использованием пары флуорофор/тушитель являются более предпочтительными, так как флуоресцентный сигнал до расщепления субстрата является очень низким, и увеличение сигнала в процессе протеолиза значительно. Так, для субстрата HIV-1 (рисунок 8с) флуоресцентный сигнал усиливается в 40 раз при расщеплении субстрата, что дает большую степень свободы в выборе концентраций реагентов [207]. Используется также другие пары флуорофоров и гасителей, такие как 2-аминобензоил/нитрофенилаланин, триптофан/динитрофенил, (7-метоксикумарин — 4 -ил)ацетилЯЖР, N- метилантранилоил/DNP и другие [170].

Для ЛФ было предложено использование нескольких субстратов с флуоресцентными метками. В работе [148] использовались пары МСА с гасителями флуоресценции DAB и QSY-35. Субстрат (MCA)NIeKKKKVLP IQLNAATDK(QSY-35)GG-NH2 был предложен авторами для широкомасштабного скрининга ингибиторов, однако чувствительность системы была недостаточна даже для определения кинетических констант реакции протеолиза. Флуоресцентный сигнал при разрезании субстрата увеличивался на 9-16 % . Группа Кантли [63] использовала пару флуорофор/гаситель MCA/DNP с оптимизированным субстратом, полученным селекцией из пептидной библиотеки. Полученный субстрат LF15 является лучшей на сегодняшний день системой детекции активности ЛФ по скорости превращения и чувствительности. Единственный ее недостаток - это повышенное содержание положительно заряженных аминокислотных остатков, что может сказаться на специфичности.

Возможно применение смешанных стратегий с использованием хромогенных или флуоресцентных пептидов и, например, магнитных шариков. Так, для ЛФ был разработан метод измерения активности с использованием электро-хемилюминисценции [208]. Покрытые стрептавидином магнитные шарики использовались в качестве твердого носителя и обеспечивали иммобилизацию продуктов протеолиза. В ходе реакции происходило расщепление биотинилировапного по N-концу пептида с люминесцентной меткой (хелатом металла рутения), связанной с С-концевым цистеином в последовательности пептида. Такой подход может быть использован для анализа ингибиторов, имеющих собственную флуоресценцию.

В последние годы было разработано множество подходов с использованием биологических меток - флуоресцентных белков семейства GFP. Благодаря наличию широкой панели цветовых модификаций таких белков, имеющих различные параметры возбуждения и испускания флуоресценции [209], возможно создание эффективных FRET-пар, позволяющих детектировать активность протеазы как в условиях in vitro,так и in vivo [210, 211]. Показано, что подобная FRET система может быть достаточно чувствительной для количественной характеристики протеолиза in vitro [210]. Слитные белки, содержащие два флуорофора и линкер, чувствительный к активности интересующего фермента, проявляют большую степень устойчивости к неспецифическому протеолизу благодаря тому, что структура флуоресцентных белков представляет из себя жесткую (3-бочку с хорошо защищенным хромофором внутри. Измерение кинетики протеолиза белковых FRET- субстратов возможно при значениях рН между 5.5 и 10, что удовлетворяет условиям работы множества протеаз. Метод на основе флуоресцентных белков имеет некоторые ограничения, например, длина субстратного линкера не должна превышать 25 аминокислот для эффективного переноса флуоресцентной энергии [210]. В работе [212] была разработана стратегия для широкомасштабного скрининга ингибиторов протеаз на шариках с использованием биотинилированного GFP, содержащего чувствительную к протеолизу последовательность. Технология была применена для изучения ингибирования протеолиза ЛФ и фактора Ха.

1.2.6.2.2 Разработка системы детекции протеаз in vivo.

Обычно после первой стадии отбора ингибиторов исследуемых протеаз методом широкомасштабного скрининга in vitro, следующими этапами оценки полученных соединений в качестве потенциальных терапевтических агентов является их тестирование in vivo на культурах клеток и далее на животных и человеке. На стадии селекции ингибиторов in vivo к системе детекции активности фермента предъявляется жесткое требование специфичности, помимо чувствительности субстрата. Наилучшим способом оценки специфичности конкретного субстрата по отношению к изучаемой протеазе in vivo является оценка степени расщепления субстрата в присутствии специфического ингибитора. Если не описано ингибитора, специфичного для изучаемой протеазы, то возможно использование ингибитора к классу протеаз, включая изучаемую, например AEBSF для сериновых протеаз, Е-64 для цистеиновых протеаз, бестатина и хелаторов металлов типа EDTA для металлоэндопептидаз [170].

Протеазы, работающие во внеклеточном пространстве, изучают на культурах клеток с использованием любого более-менее подходящего субстрата из-за низкого содержания протеолитических ферментов вне эукариотической клетки. В работе [213] для определения активности катепсина В, ассоциированного со множеством линий раковых клеток, использовали коммерчески доступный флуоресцентный дипептид Z-Arg-Arg-АМС.

При исследовании активности внутриклеточных протеаз еще одной проблемой, помимо сложности подбора специфичного субстрата, является плохая проницаемость клеточной мембраны для пептидов с флуорофорами. Для некоторых субстратов, таких как производные 4-нафти-метокси-2-иафтиламида (MNA), АМС и AFC, показана возможность успешного проникновения в клетку. Другой сложностью является быстрая диффузия флуоресцентных продуктов протеолиза и ослабление внутриклеточного флуоресцентного сигнала. В работе [214] авторы решили данную проблему с помощью химической фиксации флуорофора внутри клетки, получив не диффундирующее через клеточную мембрану соединение. Для преодоления описанных трудностей в работе [215] были разработаны ди-пептидил-родамин-110 диамид флуорогенные субстраты для анализа сериновых и цистеиновых протеаз in vivo. Их преимущество заключалось в том, что ди и моно-ацилированные производные родамина (субстраты) имеют низкий уровень флуоресцентного сигнала, тогда как сводный родамин (продукт) способен излучать значительное количество флуоресцентной энергии. Диамидные производные родамина способны легко дифундировать сквозь клеточную мембрану, однако, свободный родамин обладает низкой способностью к выведению из клетки. Пептидные субстраты с родаминовыми метками были использованы для ряда клеточных протеиназ, такую активность возможно было количественно оценить с помощью FACS [170]. Хотя для таких пептидов, меченных родамином, нет ограничения по длине аминокислотной последовательности, лишь аминокислоты в положениях Рп субстрата (до сайта разрезания) могут входить в состав такого пептида. В идеальном случае, субстрат должен представлять собой пептид, содержащий определенные аминокислотные основания по обеим сторонам от сайта разрезания. На основе ксантеновых меток были разработаны полноценные субстраты оптимальной длины [216], формирующие димеры с выраженным эффектом тушения флуоресценции репортеров. После разрезания субстрата происходило разрушение таких димеров и усиление флуоресцентного сигнала. Подобные субстраты использовались для оценки активности каспаз в тимоцитах, индуцированных для ухода в апоптоз. Так как данные субстраты несут пролонгированную пептидную последовательность, они могут быть использованы для исследования активности любых протеаз с известной структурой оптимального субстрата.

Широко применяется использование FRET-субстратов на базе белков семейства GFP для детектирования активности протеаз in vivo. В данном случае нет необходимости доставки субстрата внутрь клетки, т.к. используемая клеточная линия уже несет генетическую конструкцию, кодирующую такой белковый субстрат. Большинство подобных белков является совершенно нетоксичными для эукариотической клетки. Наилучшей описанной FRET-парой флуоресцентных белков на сегодняшний день является пара CyPet/Ypet [217]. С помощью белковых FRET субстратов была исследована активность ряда каспаз in vivo [211,218].

Заключение

Сибирская язва представляет собой тяжелую инфекционную болезнь, вызываемую патогенной бактерией В. anthracis. Помимо бактериемии, тяжелое течение болезни обуславливается действием бактериальных токсинов J1T и ОТ. На сегодняшний момент наименее поддаются лечению поздние стадии болезни, когда происходит накопление токсинов и интернализация эффекторных субъединиц токсинов. Описано множество терапевтических подходов для лечения СЯ, таких как применение антибиотиков и антитоксиновых реагентов. Созданы блокаторы связывания компонентов токсинов с клеточной поверхностью, интернализации токсинов, энзиматической активности ЛФ и ОФ. Описан ряд ингибиторов протеолитической активности ЛФ, обладающих кинетическими характеристиками, близкими к наномолярным. Однако, многие из них имеют ограниченное применение из-за недостаточной специфичности, токсичности и трудности внутриклеточной доставки. Поэтому, на сегодняшний день, основные подходы к разработке терапевтических агентов против СЯ сфокусированы на поиске новых и оптимизации известных ингибиторов для ЛФ.

Существует множество стратегий селекции эффективных ингибиторов протеаз, включая структурные подходы, такие как рентгеноструктурный анализ в сочетании с компьютерным моделированием, а также различные динамические подходы. Не потерял актуальности и метод прямого измерения блокирования активности фермента в присутствии ингибитора, основанный на детектировании расщепления субстрата. При проведении широкомасштабного скрининга ингибиторов in vitro и in vivo необходимо иметь чувствительную и дешевую систему детекции активности фермента. Ряд эффективных тест-систем, основанных на использовании пептидных хромо- и флуоресцентных субстратов, был создан для измерения активности ЛФ. Синтетический субстрат ЛФ15 в сочетании с концевыми метками типа флуорофор/гаситель [63] обладает приемлемыми характеристиками для детектирования активности ЛФ при широкомасштабном скрининге ингибиторов in vitro. Однако недостатком данного субстрата является протяженный блок из положительно заряженных аминокислотных остатков, что делает возможным его неспецифическое расщепление. Поэтому существует необходимость создания более специфической системы детекции активности ЛФ. Настоящая работа сфокусирована на идентификации новых специфичных пептидных субстратов для ЛФ, которые могут применяться для разработки системы детекции фермента и для создания новых пептидных ингибиторов ЛФ, а также на изучении механизма работы ЛФ как модели для создания новых эффективных ингибиторов.

Глава 2: Результаты и обсуждения.

2.1 Исследование субстратной специфичности ЛФ методом фагового дисплея.

2.1.1 Конструирование и скрининг фаг-дисплейной библиотеки.

В данной работе была создана поливалентная субстратная фаговая библиотека и проведен ее скрининг для идентификации пептидных субстратов ЛФ. Как отмечалось в обзоре литературы, в работе [63] использовался частичный рациональный дизайн сайта разрезания ЛФ на основе имеющейся информации о сайтах в МКК. В настоящей работе вся последовательность потенциального субстрата была полностью рандомизированной для того, чтобы охватить полный спектр потенциальных субстратов ЛФ. Пептиды экспрессировались в составе слитного полипротеина с белком фаговой оболочки pill, N-конец которого содержал последовательность аффинного эпитопа с-шус [219] для иммобилизации библиотеки на твердом носителе .

Ранее в литературе был описан консенсусный мотив для природных субстратов ЛФ, состоящий из 8-ми аминокислот [47], более того, было показано, что даже 7- членные пептиды являлись эффективными субстратами для ЛФ [140]. Мы использовали скрининг фаг-дисплейной библиотеки для определения минимальной длины эффективно гидролизуемого субстрата ЛФ и выявления структурных детерминант в субстратной последовательности, необходимых для формирования фермент-субстратного комплекса. Вариабельный пептидный фрагмент созданной начальной библиотеки состоял из 8 аминокислот. Последовательность субстратной библиотеки имела формат AEOKLISEEDLGGSRDLGGSGAWAWAWAWSLE. где жирным шрифтом выделена последовательность с-тус эпитопа, а обозначения N соответствуют последовательности вариабельного участка библиотеки. После вариабельного блока начинается непосредственно амнокислотная последовательность белка фаговой оболочки pill . Подчеркнута последовательность гибкого линкера из 10 аминокислот, обогащенного Gly и Ser.

Сконструированная библиотека пептидов, экспонированных на поверхности нитевидного фага fd, имела представительность 109 индивидуальных клонов. Полученное количество вариантов субстратов является типичным для субстратной фаговой библиотеки, состоящей обычно из 108-109 индивидуальных клонов [193, 195, 197].

Выделение фагов

Скрмнировэние фаговой библиотеки

Наращивание новой порции фагов

Элюция чувствительных к ЛФ фагов

Рисунок 9: Схема скрининга фаг-дисплейной субстратной библиотеки для селекннн субстратов ЛФ. !) Амплификация библиотеки фагов в штамме E.coli DH12S; 2) Выделение и очистка фагов; 3) Посадка фагов на иммуносорбент Pansorbin путём связывания эпитопа c-myc MAT 9Е10 с последующей отмывкой и обработкой ЛФ ;4) Элюция чувствительных к ЛФ фагоа и их амплификация для дальнейшего скрининга.

Хотя для поливалентной фаговой библиотеки применяют как селекцию фагов на твердом носителе, так и в растворе, в случае отбора субстрата для ЛФ нами был выбран «твердофазный метод» скрининга в качестве более жесткого условия отбора , гак как в случае проведения селекции в растворе есть вероятность обогащения субстратного пула фагами, по каким-то причинам (неполная сорбция, испорченная в результате случайного мутагенеза последовательность аффинного эпитопа и др.) не севшими на твердый сорбент. Выбранная стратегия скрининга включала иммобилизацию библиотеки на твердом носителе, удаление несвязавшихся фагов, обработку библиотеки ЛФ па твердом сорбенте после многократных отмывок, элюцию чувствительных к ЛФ фагов, как показано на рисунке 9.

Для оценки эффективности отбора были созданы фаги позитивного и негативного контроля скрининга. «Позитивный фаг» содержал последовательность субстрата LF15 (RRKKVYPYPME) [63] в идентичном последовательностям библиотеки аминокислотном окружении, а «негативный фаг» содержал единичный аргинин вместо субстратной последовательности. Перед началом скрининга библиотеки были осуществлены контрольные эксперименты с ферментативной элюцией «позитивных» и «негативных» фагов с твердого сорбента. Для этого фаги были проинкубированы с анти-с-тус антителом 9Е10 и иммобилизованы на сорбенте Pansorbin, способном к аффинному связыванию иммуноглобулинов G и М. После длительной стадии отмывания сорбента (— 40 смен реакционного буфера) фаги обрабатывались либо трипсином, ЛФ или реакционным буфером без протеаз. В случае позитивного контроля количество отщепленных трипсином фаговых частиц составляло 90%, ЛФ- 50%, в реакции с пустым буфером - менее 1%. Для «негативных» фагов эти соотношения были 60% для трипсина, менее 1% для ЛФ и свободной диффузии. Данный эксперимент подтверждает, что связывание антитела 9Е10 с c-myc эпитопом не препятствует доступу фермента ЛФ к

Фаги не обработаны ЛФ (контроль)

Фаги обработаны ЛФ

Детекция с помоидо системы биотим-«ейгрянндин пероксидаза

Антитела к Схпус элитопу

Опус эпитоп

Фаговые частиц

Антитепа и бепку фаговой оболочки

А Д I

Y Y т

S Лф прот»»за

Иммуносорбент |

Y Y Y

Рисунок 10: Схема иммуноферментно! о анализа для определения способности к разрезанию ЛФ субстратов, экспонированных на индивидуальных фаговых клонах. На плашку в качестве первого слоя наносили антитела к белку 8 фаговой оболочки, вторым слоем наносили фаги, обработанные (опыт) или необработанные (контроль) ЛФ. а в качестве третьего слоя использовали биотип илированные MAT 9Е10, связывание которых определяли окрашиванием конъгогатом нейтравидин-перокеидаза . Для каждого фагового клона проводили 2 реакции - с участием ЛФ и без участия ЛФ. субстратной последовательности, а также что ЛФ не имеет неспецифических сайтов расщепления внутри последовательностей аффинного эпитопа и/или белка фаговой оболочки pIIL Продолжительное инкубирование (до 5 часов) иммобилизованных фаговых частиц в реакционном буфере не приводило к заметному увеличению количества фагов, спонтанно диффундирующих в расгвор. Поэтому было выбрано оптимальное время для расщепления субстратов ЛФ - 4 часа. После каждого раунда селекции оценку наличия чувствительности к ЛФ индивидуальных субстратов, экспонированных на фаговых клонах, проводили с помощью ИФА на фагах по схеме, изображенной на рисунке 10. Исследовали по 20 случайно выбранных фаговых клонов после каждого раунда селекции.

2,1.2 Анализ структуры субстратов после первого этапа скрининга.

После 10 раундов селекции 50 случайных фаговых клонов, чувствительных к действию ЛФ по результатам фагового ИФА, были выбраны для определения первичной структуры субстратного участка. Секвепирование соответствующих фрагментов фаговой ДНК выявило 2 основных группы клонов. К первой группе относились фаги с последовательностями, содержащими полноразмерный c-myc-эпитоп и субстратные последовательности, обогащенные положительно заряженными аминокислотными остатками. Представители этой группы показаны в таблице 4. Вторая группа последовательностей состояла из различных изоформ укороченного с-шус эпитопа и случайных аминокислот в субстратной области, не поддающихся обобщению с созданием какого-либо консенсуса. Такие некорректные варианты аффинного эпитопа могли получиться в результате статистических ошибок при проведении ПЦР и лигирования ДНК во время создания библиотеки. Было заключено, что субстратные фаги данной группы

Таблица 4: Последовательности субстратов, полученных при скрининге фагдисплейной библиотеки.

Позиции в последовательности субстрата РюРэРвР7 Рб Р5Р4РЗ Р2 PiPi Рз 'Рз'Р«'

Консенсус из последовательностей МАРКК + + X X н

LF15 R R К К V Y PIY P M E

Субстраты после 10 раундов селекции

1 S G н Р R V Y L N H s E

2 V F Q V Т S R V S L E E T V*

3 W Р Р L R V S T S L E E

4 А R А V F К R А S L E E T V

5 Т Р L S R R Р т S L E E T

6 I S S R R А L I S L E E

7 F Y F R R V S R S L E E

8 F F R F F R R V 5 L E E T V

9 Y R М Т R R I Т S L E E T

Структура расширенной фаг-дисплейной библиотеки R X T/S/F R R V/I T/S/N/K/P/H/I X X X X X подчеркнуты консервативные последовательности , не входившие в вариабельный мотив библиотеки, жирным отмечены позиции, входящие в вариабельную субстратную последовательность библиотеки. имели пониженное сродство к антителу 9Е10, были способны к связыванию с ним , но быстро диссоциировали в раствор, что приводило к отбору псевдо-субстратов для ЛФ, поэтому подобные клоны в дальнейшем не рассматривались. Последовательности отобранных субстратов из группы 1 были выровнены относительно синтетического субстрата ЛФ15 [63] и консенсуса МАРКК (см таблицу 4). Субстраты, отобранные из 8-ми членной фаговой библиотеки, чувствительные к действию ЛФ, характеризовались несколькими общими структурными элементами, такими как гидрофобный блок на N-конце последовательности преимущественно с одним аргинином, а также центральный мотив с RRcp консенсусом, где ср представляет собой разветвленный гидрофобный аминокислотный остаток (Не или Val) в 78 % случаев. Блок RRcp четко соотносится с последовательностью KKV в составе ЛФ15. Таким образом, на первом этапе скрининга были получены субстраты, близкие по нескольким характерным признакам к последовательностям докинг-сайтов МАРКК киназ. Выравнивание отобранных последовательностей показало, что отбор аминокислот на первом этапе скрининга происходил в основном по положениям до сайта разрезания (plO-pl). Такой четкий отбор аминокислот, по всей видимости, свидетельствует о том, что для связывания ЛФ наиболее критичными являются аминокислотные позиции субстрата plO-pl, тогда как для прямой праймер

-3Z=»-TGCA 3' г тал-*^обрзтный праймер отжиг

5',

3' TCGA иилмнити

5' лигирование большинства ферментов семейства металлопротеаз, наоборот, характерно большее сродство к позициям после сайта разрезания [170]. Это обстоятельство характеризует ЛФ как уникальную металлопротеазу, имеющую лишь отдаленное родство с ферментами семейства термолизина.

Выравнивание субстратов, приведенное в таблице 4, предполагает однако попадание расщепляемой связи для некоторых из них в область инвариантных аминокислот, относящихся уже к началу последовательности рШ, что может свидетельствовать о слишком короткой длине субстратной последовательности в созданной исходной библиотеке.

Первичный анализ эффективности отобранных субстратов осуществляли с помощью фагового ИФА, результаты которого свидетельствуют о медленной конверсии ЛФ ряда субстратов (данные не приведены). Так как детектирование расщепления медленных субстратов было затруднено методом ИФА в силу его недостаточной чувствительности, для исследования кинетических свойств субстратов была создана более чувствительная система на основании принципа FRET.

2.1.3 Создание системы детекции активности ЛФ с использованием флуоресцентных белков.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Захарова, Мария Юрьевна

Выводы.

1. Путем скрининга фаговой субстратной библиотеки выявлены новые пептидные субстраты, расщепляемые ЛФ. Установлено, что аминокислотные остатки, расположенные в N-концевой области субстрата по отношению к сайту расщепления, являются определяющими для специфичного узнавания ЛФ.

2. Создана система детектирования активности ЛФ с использованием FRET-пары флуоресцентных белков, соединенных различными пептидными линкерами — субстратами ЛФ. Показана возможность сравнительной оценки кинетических параметров различных субстратов и ингибиторов ЛФ в рамках данной системы.

3. Получен новый пептидный субстрат С20, превосходящий природный субстрат по каталитической эффективности в 7 раз. Данный субстрат может применяться для разработки системы специфической детекции ЛФ.

4. С использованием методов предстационарной кинетики детализирован механизм взаимодействия ЛФ с субстратом: выявлена дополнительная стадия конформационного изменения фермент/субстратного комплекса, предшествующая каталитической стадии.

5. При исследовании взаимодействия мутантных форм ЛФ с субстратом показано, что присутствие иона Zn2+ в активном центре фермента влияет на стадию первичного связывания субстрата и на стадию конформационной перестройки фермент/субстратного комплекса, помимо каталитической стадии расщепления, и, по-видимому, стабилизирует активную конформацию фермента.

6. С помощью исследования предстационарной кинетики активации апофермента ЛФ двухвалетными металлами показана возможность связывания нескольких ионов Zn2+ с одной молекулой фермента. Показано ингибирование активности ЛФ высокими концентрациям Zn2+, а также возможность активации апофермента ЛФ ионами Са2+ и Мп2+.

Заключение

Функция ЛФ на ранних стадиях заболевания заключается в направленном разрушении каскада сигнальной трансдукции с участием МАРКК киназ. Эволюционная селекция привела к возникновению фермента с узкой специфичностью для предотвращения расщепления случайных мишеней, которое может приводить с некоторой вероятностью к активации иммунного ответа и преждевременной гибели организма хозяина. В результате, ЛФ расщепляет лишь строго ограниченный ряд субстратов в цитоплазме клетки — хозяина. Например, докинг-сайты киназ семейства МАРКК чувствительны к действию ЛФ, тогда как структурные гомологи данных доменов в последовательностях транскрипционных факторов Jun и Fos не расщепляются данным ферментом [51]. Поэтому выяснение точной последовательности элементарных событий при протеолитическом расщеплении ЛФ может быть важным для понимания принципа дискриминации субстратов данным ферментом и для разработки стратегии поиска новых ингибиторов ЛФ с повышенной специфичностью.

Скрининг 8-ми членной субстратной фаговой библиотеки показал, что ЛФ имеет строгое предпочтение к аминокислотным положениям субстрата в N-концевой области по отношению к сайту расщепления. Данные позиции, по-видимому, являются для фермента даже более важными, чем Р1 и РГ положения вокруг сайта расщепления. Наиболее консервативными аминокислотными остатками в фаговых субстратах являлись RRV/I в положениях р5-рЗ. При дальнейшем скрининге библиотеки, с помощью фиксирования консервативных аминокислотных остатков и удлинения субстратной последовательности библиотеки, был идентифицирован субстрат С20, расщепляемый ЛФ в 7 раз эффективнее, чем производное природного субстрата ЛФ - киназы МКК6.

При анализе кристаллической структуры ЛФ в комплексе с субстратом ранее было выявлено, что основные аминокислотные остатки в положениях р5-р4 реагируют с кислыми остатками в глубокой связывающей субстрат бороздке фермента вблизи активного центра, а также что после взаимодействия с рГ аминокислотой субстрата происходит растяжение гидрофобного S1' кармана фермента [63]. Сайт - направленный мутагенез определенных позиций в субстрате С20, проведенный в данной работе , показал, также, что аминокислотные остатки в положениях р7, рб, рЗ, р2 влияют на эффективность взаимодействия субстрата с ферментом, тогда как определенные комбинации аминокислотных остатков в положениях pl-p2' влияют скорее на расщепление субстрата. Ни один из субстратов с единичными точечными мутациями не отличался значительно по каталитической эффективности от исходного С20, что указывает на комплексное влияние всей совокупности аминокислот субстрата на эффективность его расщепления ЛФ.

Для дальнейшей детализации характера взаимодействия ЛФ с субстратом кинетика процесса исследовалась методом «остановленного потока» , с помощью которого были описаны элементарные стадии реакции протеолиза. Статистический анализ кинетических данных показал, что механизм взаимодействия ЛФ с субстратом включает четыре элементарных шага. Связывание субстрата ЛФ осуществляется в 2 стадии, с формированием комплексов ES1 и ES2. Далее происходит необратимое расщепление субстрата, сопровождающееся обратимой диссоциацией продуктов протеолиза.

Опираясь на литературные данные о структуре активного центра ЛФ, который помимо стандартного для металлопротеаз мотива НЕХХН, имеет еще протяженную отрицательно заряженную бороздку вблизи цинк-связывающего домена, а также глубокий S1' гидрофобный карман, растягивающийся при связывании субстрата, можно предложить следующую модель работы ЛФ с учетом результатов настоящего исследования:

На первом этапе взаимодействия фермента с субстратом (ES1), по-видимому, происходит связывание положительно заряженного мотива RRV/I субстрата в отрицательно заряженной бороздке фермента.

Первичное связывание субстрата, по всей видимости, приводит к инициированию изменения конформации фермент/субстратного комплекса, при котором аминокислота субстрата в положении рГ попадает в гидрофобный карман S1 раздвигая его, далее происходит формирование продуктивного фермент/субстратного комплекса, сопровождающееся дальнейшим протеолитическим расщеплением субстрата.

Биологический смысл такого двухстадийного связывания субстрата ЛФ эволюционно мог заключаться в повышении специфичности работы фермента, так как дискриминация субстратов происходит на каждой стадии связывания, что было показано с помощью исследования предстационарной кинетики быстрого и медленного субстрата.

После выявления конформационной перестройки в процессе формирования фермент субстратного комплекса для ЛФ, было исследовано участие ионов различных металлов в данном процессе. С помощью исследования предстационарной кинетики для мутантных форм фермента ЛФ E687D и ЛФ Н690А, характеризующихся пониженной способностью к связыванию Zn2+, было показано, что данные мутации оказывают влияние как на стадию расщепления субстрата, так и на эффективность формирования фермент/субстратного комплекса, причем , Zn , по-видимому, стабилизирует активную конформацию фермента.

Интересно, что ионы кальция и марганца были также способны активировать апофермент ЛФ, хотя и с меньшей эффективностью, чем Zn2+ Механизм и потенциальное физиологическое значение активации ЛФ ионами кальция требует дальнейших исследований.

Полученные данные могут внести существенный вклад в разработку новых терапевтических агентов против сибирской язвы - высокоспецифичных механизм-зависимых ингибиторов летального фактора, направленных на блокирование стадии первичного связывания субстрата и/или конформационной перестройки фермент — субстратного комплекса ЛФ.

Глава 3. Практическая часть

Материалы.

В работе было использовано следующее оборудование: центрифуги Eppendorf 5415D (Eppendorf, Германия), Beckman G21 (Beckman); УФ-трансиллюминатор 2011 Macrovue (LKB, Швеция); система для документирования и анализа результатов электрофореза (UVP, США); спектрофотометр Varian, спектрофлуориметр Varian Сагу Eclipse Spectrofluorimeter (Varian, Нидерланды); рН-метр CyberScan 1100 (Eutech Instruments/Oakton Instruments); термостат суховоздушный ТС 1/20 СПУ (Россия); термостат Thermolyne 17600 (Barnstead, США); прибор для горизонтального электрофореза Wide Mini-Sub Cell GT, Sub Cell 192 (BioRad, США); приборы для вертикального электрофореза BioRad , BioRad Sequi-Gen Sequencing Cell (BioRad, США); источник питания 2197 Power supply (LKB, США); ПЦР-амплификатор PTC-200 Peltier Thermal Cycler, (MJ Research, США), автоматические пипетки (Gilson, Франция); весы Sartorius laboratory (Sartorius, Германия); настольный инкубаторный шейкер Innova 4000 (New Brunswick Scientific, США); прибор для перемешивания растворов с подогревом MR 3001 (Heidolph, Германия); ламинарный шкаф Flow laboratories BSB 4А (Gelaire, Italy); плашечный спектрофотометр Tecan Genius (Швейцария); прибор для измерения быстрой кинетики stopped-flow spectrometer модель SX.18MV (Applied Photophysics, Великобритания); хроматорафы Waters 501 ВЭЖХ система; флуоресцентный хроматографический детектор Waters 470, Biorad FPLC Biologic.

В работе использовали следующие расходные материалы: пластиковые наконечники и пластиковые пробирки для ПЦР на 0.2 и 0.5 мл (Treff Lab, Швейцария); пластиковые микроцентрифужные пробирки на 1.5 и 2.0 мл - эппендорфы (Eppendorf, Германия); одноразовые центрифужные пробирки на 15 мл и 50 мл Corning (США); одноразовые чашки Петри Завода Медицинских Полимеров (Россия); рентгеновская пленка AGFA (Бельгия), пленка для детекции хемилюминесценции Hyperfilm (Amersham Biosciences, Великобритания); нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм и 0.45 мкм (Millipore, США); набор реактивов для определения последовательности ДНК CycleReader (Fermentas, Литва); пробирки для имуносорбции Immunotubes на 5 мл, 96-ти луночные плашки для ИФА прозрачные (Nunc maxisorb); 96-ти луночные плашки для измерения флуоресценции черные (Greiner).

В работе использовали следующие реактивы:

Реактивы производства Sigma- Aldrich (США): акрил амид, N,N'~ метиленбисакриламид, мочевина, ацетонитрил, ЕДТА, глицерин, фофсфаты Na, NaCl, ZnCb, СаСЬ, МпСЬ, трис-гидроксиметиламинометан (трис), тетраборат натрия, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), додецилсульфат натрия (ДСН), мочевину (sequence grade), полиэтилен гликоль (М-8000), имидазол. Использовали реактивы российского производства: этиловый спирт, изопропиловый спирт, уксусная кислота, однократно перегнанный фенол, хлороформ, бромистый этидий. Также были использованы агар, триптон, дрожжевой экстракт (Difco, Великобритания); Repel-silane, Bind-silane (LKB, Швеция); агароза LE Molecular Biology Grade (Promega, США); бромфеноловый синий (Bio-Rad, США); ксиленцианол (Bio-Rad, США); дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (Roche Diagnostics, Германия); остальные реактивы отечественного производства марки "осч" (особо чистые); плазмиды: Fd tet DOG1 (шобезно предоставлена доктором Джоном Маккафферти, Department of Biochemistry, University of Cambridge, Cambridge CB2 1QW, UK), pQe30 (Qiagen), pEt 22B (Novagen); штаммы E. coli: DH12S (Life Technologies, США), B121 и B121DE3 (Stratagene, Великобритания), эндонуклеазы рестрикции и буфера для рестрикции, все (Fermentas, Литва и New England Biolabs, Великобритания); иммупосорбент Pansorbin (Calbiochem). Все растворы готовили на воде mQ (18-MQ Н2О , Millipore Synthesis station). Растворы.

Буфер А: ЗОтМ Трис-HCl (рН=7.4), 150 mM NaCl Буфер Б: ЗОтМ Трис-HCl (рН 7.4), 70тМ NaCl

ТВЕ 10Х: 0.89 М трис-основание, 0.89 М борная кислота, 20 мМ ЭДТА, рН 8.0 Трис-глициновый буфер для белкового ПААГ: трис-основание 25тМ, глицин 250тМ, SDS 0.1%, рН=8.3

PBS: NaH2P04 1.7тМ, Na2HP04 5.2тМ, NaCl 150тМ, р! 1=7.4 PEG-NaCl: PEG 8000 20%, NaCl 2.5 М

Микробиологические среды.

2xYT: 16 г/л бактотриптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl 2xYT - агар: 2xYT, 18 г/л агара

SOB (для приготовления компетентных клеток): 20 г/л бактотриптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 0.5 г/л NaCl, 250 мМ КС1, 10 мМ MgCl2

SOC (для трансформации E.coli. электропорацией): SOB, 50 мМ глюкоза

Реагенты для ИФА. Анти-c-myc 9Е10 биотинилированные (мышиные) антитела (Pharmacia)

Нейтравидин-пероксидаза (Pharmacia)

Анти-М13 PVIII антитела конъюгат с пероксидазой (Sigma)

ОФД - орто фенилен диамин (Sigma).

Методы

Создание конструкций для экспрессии ферментов и субстратов.

Для экспрессии рекомбинантного ЛФ была создана плазмида рЕТС (на базе рЕТ22Ь), кодирующая последовательность

MASMTEDLEQKLISEEDLEDPHHHHHHGG S между сайтами рестрикции Nde I и BamHl в рЕТ22Ь. Данная последовательность содержала c-myc-эпитоп (выделен жирным) для аффинной детекции и б-His мотива (подчеркнут) для аффинной очистки белка. Для создания экспрессионной конструкции ген полноразмерного ЛФ был амплифициован с помощью ПЦР с ДНК штамма Bacillus anthracis Sterne с использованием прямого праймера 5'АСАА GA G GATCCG GCG GGC GGT CAT GGT GAT GTA GGT У и обратного, праймера 5' С ТАА ТТ GTC GAC ТТА TGA GTT ААТААТ GAA СТТ ААТ С 3', содержащих сайты рестрикции BamHI и Sail соответственно; ПЦР продукт был далее клонирован в рЕТС по сайтам рестрикции BamH I и Xho I, в результате экспрессии такой конструкции LF-pET был получен полноразмерный фермент ЛФ, содержащий N-концевые эпитопы с-тус и б-His. Конструкции для экспрессии мутантных вариантов ЛФ - LF E687D-pET и LF Н690А-рЕТ - были созданы точечным мутагенезом с использованием ПЦР, как описано в работе [231].

Для продукции флуоресцентных слитных белков, составляющих FRET пару, был использован экспрессионный вектор pCY на базе pQE30, кодирующий б-His эпитоп и содержащий гены флуоресцентных белков PS-CFP2 и phiYFP (Евроген), созданный ранее, как описано в работе [221]. Вектор был модифицирован: сайты рестрикции SacI и PstI были помещены в последовательность вектора pCY после гена PS-CFP2 и перед геном phiYFP, соответственно. Далее ряд пар олигонуклеотидов использовались для создания панели 48-ми членных линкеров, соединяющих гены двух флуоресцентных белков. Каждая пара праймеров была создана таким образом, что при их взаимном отжиге друг на друга получался продукт, содержащий липкие концы, комплементарные сайтам рестрикции SacI (5'конец продукта) и PstI (3' конец продукта) (см. рис 11). Далее такие продуты взаимного отжига праймеров использовались для клонирования в модифицированный вектор рСY, как показано на рисунке 11.

Экспрессия и очисткарекомбинантных белков

Для экспрессии рекомбинантных ферментов ЛФ, ЛФ E687D и ЛФ Н690А использовался штамм E.coli BL21(DE3). Культуру клеток выращивали в среде 2*YT, содержащей 50 мкг/мл ампицилина, при 37 °С до оптической плотности среды 0.6-0.7 при длине волны 600 нм. После этого температуру понижали до 25 °С и индуцировали экспрессию рекомбинантного белка добавлением изопропил-Р-Б-тиогалактопиранозида до 0.1 мМ. После индукции культуру инкубировали в течение 6 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием (10 минут при 5 000 g) и готовили суспензию клеток в 40 мл буфера А (для клеток с одного литра культуры), содержащего 0.5 мг/мл лизоцима и набор ингибиторов (Roche), далее инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого добавляли Triton XI00 (до 0.5 %) и инкубировали 30 минут при 25°С . Далее раствор обрабатывали дезоксирибонуклеазой с конечной концентрацией 10 (лУмл в присутствии 10 мМ MgCb в течение 30 минут при 4°С. Полученный клеточный лизат центрифугировали (20 минут при 15 000 g, 4 °С), супернатант наносили на металл-хелатную колонку 5 мл с сорбентом Talon (Clontech), предварительно уравновешенную буфером А. После промывки 50-тью объемами буфера А, фермент был элюирован буфером А, содержащим 250 мМ имидазола. Элюат наносили на гель-фильтрационную колонку Superdex 200 (Pharmacia), предварительно уравновешенную буфером Б. Фракции после гель-фильтрации далее анализировались с помощью ПААГ. Фракции, содержащие ЛФ, далее замораживались и хранились на -70°С . Фермент имел 95 % степень гомогенности по электрофорезу.

Апофермент был приготовлен из препарата ЛФ с помощью продолжительного диализа (16 часов) против буфера Б, содержащего 1 мМ 1,10-фенантролина и ЮмМ EDTA; отмывка от хелатирующих металл реагентов проводилась путем обратного диализа (2 смены по 3 часа, фактор разведения 500) против буфера Б таким образом, что в препарате апофермента оставалось приблизительно 0.004 рМ ОФТ and 0.04 рМ EDTA для предотвращения связывания апоферментом следовых количеств примесного Zn2+.

Для наработки флуоресцентных слитных белков, конструкции, кодирующие соответствующие белки, были трансформированы в клетки Е. coli BL21. После достижения культурой оптической плотности 0.6-0.7 при длине волны 600 нм, клетки инкубировались 24 часа при комнатной температуре для полного созревания хромофоров флуоресцентных белков. Первая стадия очистки флуоресцентных белков осуществлялась с помощью металл-хелатной хроматографии, как описано выше. В качестве второй стадии очистки также использовалась гель-фильтрация с использованием колонки Superdex-75 (Pharmacia) для разделения мономеров, димеров и продуктов неспецифического расщепления. Фракции, содержащие мономеры слитных флуоресцентных белков, были собраны и хранились при 4 °С в течение месяца с добавлением №N3 в качестве консерванта до 0.05 %. Спектры флуоресцентных слитных белков измерялись на спектрофлуориметре для подтверждения созревания хромофоров с возбуждением флуоресценции при 405 нм.

Концентрацию белков определяли оптически на спектрофотометре. Использовались следующие коэффициенты молярной экстинкции: при длине волны 280 нм - 56265 М^см"1 ( суммарное поглощение белка), при длине волны 405 нм — 43000 М" 'см"'( поглощение PS-CFP2), при длине волны 525 нм - 130000 М^см"1 (поглощение phiYFP) (см. www.evrogen.com).

Конструирование фаг-дисплейной библиотеки

Для приготовления вектора для экспрессии фаговой библиотеки, плазмида fd-tet DOG1 была модифицирована с внесением стоп кодона вместо сайта рестрикции Not I. Это было реализовано с помощью замены фрагмента ДНК fd-tet DOG1 между сайтами Pst I and Bam HI на другой, полученный в реакции ПЦР с fd-tet DOG1 с использованием прямого праймера XhoFdFor 5' —

AACATATATCTGCAGTAACTCGAGGAAACTGTTGAAAGTTGTTT- 3' и обратного праймера BamFdRev 5'- AACGAATGG АТС СТС ATT AAA GCC AGA ATG GAA-3'. Получившийся продукт был обработан Pst I и Bam HI и клонирован в fd-tet DOG1, обработанный теми же ферментами рестрикции. Получившийся вектор fd-Base был использован на всех дальнейших стадиях создания библиотеки.

Для приготовления конструкции позитивного контрольного фага fd-Base был обработан ферментами ApaLI и Xho I и лигирован с обработанным теми же рестриктазами ПЦР продуктом, приготовленным с помощью взаимного отжига и последующей достройки фрагментом Кленова прямого праймера FdMycFor 5'-ТС TAT ATA ACT ТАС AGT GCA CAG ACT GAG CAG AAG CTT АТС ТСС GAA GAG GAC CTG GGC GGT TCT-3' и обратного праймера +SuPhage Rev 5'-TC TCT TAT CTC GAG TTC CAT TGG GTA CGG ATA С AC TTT CTT GCG ACG GCC AGA ACC GCC CAG GTC CTC-3'. Таким образом, N-конец белка III для положительного контроля был представлен последовательностью MAOTEOKLISEEDLGGSGRRKKVY?Y?MELE. где с-тус эпитоп выделен курсивом, серин-глициновый линкер выделен жирным шрифтом, а последовательность эффективного субстрата ЛФ15 [63] подчеркнута.

Негативный контрольный фаг был получен аналогично с использованием обратного праймера -Suphage Rev 5' ТС ТСТ TAT СТС GAG ACG GCC AGA АСС GCC С AG GTC СТС-3' вместе с прямым прайм ером FdMycFor, таким образом, что N-конец белка pill имел структуру MAQTEQKLISEEDLGGSGRLE с единственным аргинином вместо субстратной последовательности.

Олигонуклеотиды XhoFdFor (упомянут выше) и RandFdXho 5'-АТС ТСТ TAT СТС GAG AGA VNN VNN VNN VNN VNN VNN VNN VNN GCC AGA ACC GCC CAG GTC CTC-3' были подвергнуты взаимному отжигу, расщеплены с помощью ApaL I and Xho I и очищены элюцией из агарозного геля параллельно с вектором для создания библиотеки. 5-ти кратный молярный избыток ПЦР-продукта был лигирован с 40 |J.g расщепленного вектора с помощью набора для быстрого лигирования (Roche Molecular), полученной конструкцией были трансформированы клетки Е. coli DH12S путем проведения 100 раундов электропорации. Результирующая представительность библиотеки составила 109 индивидуальных клонов. Так как число вариантов уникальных последовательностей задано химически с помощью использования вырожденного праймера и составляет о максимум 20 , что превышает полученное количество индивидуальных трансформантов приблизительно в 25 раз, то можно с большой долей вероятности утверждать, что все индивидуальные клоны, полученные при первой трансформации библиотеки, несут уникальные последовательности субстратов.

Для приготовления 12-членной библиотеки удлиненных субстратов вектор fd-Base был расщеплен также ApaLI и Xhol, и лигирован с обработанным соответствующими эндонуклеазами рестрикции дуплексом, полученным последовательным взаимным отжигом пары праймеров 2Мус Asc for 5'-Т TAT ТСТ AAG СТТ АТС ТСС GAA GAG GAC TTG AGC GGT ТСТ GGC GAG САА AAA CTG ATT ТСТ GAG GA-3' и 2MYC ASC REV 5'-TTA TAT АТС TCG AGG GAA GAC GGA GGC GCG CCA GAA CCT AAA TCT ТСС TCA GAA АТС AGT TTT TGC T-3' и достройкой фрагментом Кленова. Полученный вектор fd-Base II кодировал двойной с-тус-эпшоп для усиления аффиности при иммобилизации фагов и содержал сайты рестрикции для клонирования Asc I и Xho I. Последовательность вариабельного участка библиотеки субстратов была получена взаимным отжигом и достройкой пары праймеров Lib Asc For 5'-СТТ ATA TAT TCT ATT ATA GGC GCG CCT TCT GGT TCT GAC CTG GGC GGT TCT GGC-3'h 2nd Lib Rev 5'-CT ATA TAT CTC GAG NNN NNN NNN NNN NNN DDW AAY GCG ACG GRW DWH ACG AGC GCC AGA ACC GCC CAG GTC-3'; дуплекс был расщеплен Asc I и Xho I и клонирован в вектор fd-Base И. Представительность 12-членой библиотеки субстратов была определена как описано выше и составляла 108 индивидуальных клонов.

На первом раунде селекции библиотека была высеяна на большую чашку в 100 мл топ-агара (0.6% агар на среде 2xYT) поверх слоя стандартного агара (1,5% агар на среде 2xYT) с 10 pg/ml тетрациклина. После 16 часов роста клеток, топ-агар был снят с чашки и гомогенизирован с 1:1 2xYT:100% глицерином. Гомогенизированная суспензия была разделена на аликвоты по 10 мл и хранилась при -80°С. Клетки выращивались не только на поверхности чашки, но и в толще агара для увеличения количества индивидуальных клонов на чашке, необходимого для того, чтобы не потерять разнообразия субстратных фаговых клопов. Такое культивирование библиотек необходимо было лишь на первых раундах селекции, когда представительность превышала несколько тысяч клонов, свободно умещающихся на стандартной чашке Петри.

Аликвота суспензии библиотеки помещалась в 500 мл 2xYT с 10 pg/ml тетрациклина и после 2-ух часового разгона культуры при 37°С и индукции экспрессии, культура инкубировалась при 25°С в течение 12 часов. После удаления клеток Е. coli и обломков клеточных стенок путем центрифугирования при 10000 х g и 4°С, фаги были высажены добавлением охлажденного раствора PEG 8000 до 4% и NaCl до 0.5 М в течение 1 часа. Фаги были собраны центрифугированием при 12,000 X g в течение 30 мин и ресуспендированы в буфере Б.

1011 фаговых частиц были смешаны с антителом к c-myc 9Е10, инкубированы при 4°С в течение 3 часов и далее подвергались иммунопреципетации с помощью Pansorbin согласно инструкции производителя.

После многократных отмывок (около 40 раз буфером Б с 0.05 % Tween 20), иммобилизованные фаги были обработаны 100 нМ ЛФ в течение 1-4 часов при 37 °С в 100 р.1 буфера Б. Элюат был собран, фаги были оттитрованы и использованы для заражения свежей культуры Е. Coli с оптической плотности СЮбоо=0.6. Инфицированные бактерии высевались на топ-агар с тетрациклином и выращивались при 37°С в течение 16 часов. Параллельно, серийные разведения элюированных фагов и фагов в последней отмывке перед обработкой ЛФ анализировались для определения обогащения библиотеки на определенном раунде скрининга. Позитивные и негативные контрольные фаги также были подвергнуты всем описанным процедурам; для них также определялся титр на каждом раунде селекции. Наличие нужных субстратных последовательностей правильной длины в составе фаговых клонов было подтверждено ПЦР-анализом 20 случайных клонов после каждого раунда селекции.

Фаговый ИФА

Субстратные последовательности на индивидуальных фаговых клонах были протестированы на расщепление ЛФ с помощью ИФА с использованием стандартных 96-ти луночных плашек. В качестве первого слоя наносили очищенные фаги в буфере PBS и инкубировали в течение одного часа при 25 °С. Далее лунки были промыты 3 раза PBS-0,05% Tween 20, забиты с помощью 1% BSA и инкубированы с 100 нМ раствором ЛФ в буфере Б (для тестовых лунок) или с чистым буфером Б (для контрольных лунок). После трехкратой отмывки лунки были обработаны биотинилированными антителами 9Е10 (разведение 1:10000) в течение 1 часа, затем , после отмывки, нейтравидином конъюгатом с пероксидазой в течении 1 часа. Проявку проводили с использованием ОФД по инструкции производителя. Измерение сигнала ИФА проводили на плашечном спектрофлуорметре. Клоны, чувствительные к ЛФ, выявлялись по четкому сигналу ИФА в контрольных лунках и по его отсутствию в соответствующих тестовых лунках.

Определение стационарных кинетических параметров расщепления ЛФ слитных флуоресцентных белковых субстратов.

Исследование активности ЛФ проводили с использованием слитных флуоресцентных белковых субстратов в буфере Б, содержащем 100 р.М СаС12. СаС12 использовался для стабилизации флуоресцетных белковых субстратов, использовавшихся в концентрации до 20 (J.M. Реакцию проводили в черных плашках для измерения флуоресценции на плашечном спектрофлуориметре с использованием соответствующих оптических фильтров для возбуждения флуоресценции на 405 нм (максимум поглощения синего белка PS-CFP2) и для испускания флуоресценции на 535 нм (максимум испускания для желтого белка phiYFP), наблюдение за расщеплением субстрата проводили в течение 1 часа. Концентрация субстрата варьировала от 0.5 до 20 рМ при измерении кинетики расщепления субстрата ЛФ15Б. Для остальных белковых субстратов, пептидные последовательности для линкеров которых были получены скринированием фаг-дисплейной библиотеки, кинетические параметры были определены с использованием избытка фермента, концентрация ЛФ варьировала от 2.5 до 25 рМ. Концентрация субстратов в экспериментах с избытком фермента была постоянной - 0.5 рМ. Анализ кинетических данных и расчет констант был проведен с помощью программы Sigma Plot версии 8.02 (http://www.spssscience.com).

Анализ кинетики расщепления пептида ЛФ15Ф с использованием ВЭЖХ.

Раствор пептида ЛФ15Ф, меченного флуоресцеином, был приготовлен как 1мМ сток в ДМФА и хранился при -20 в защищенном от света месте. Пептид (с концентрацией от 1 до

50 цт) был инкубирован с 50 нМ ЛФ в буфере Б от 0 до 420 с. Анализ методом ВЭЖХ был проведен, как описано в работе [148]. Для остановки реакции пробы были обработаны 10-ти кратным избытком 60 % CH3CN в Н20 для осаждения белка ЛФ. Пробы далее были перемешаны и оставлены на льду на 15 минут, затем центифугированы при 2000 х g в течение 60 с, супернатант использовался для дальнейшей хроматографии. Разделение субстрата и продукта проводили с использованием колонки для гидрофобной обратно-фазовой хроматографии Symmetry300 Cig 5-цш 3.9*150 мм ВЭЖХ (Waters), градиента CH3CN/H20 с 0.1% трифторуксусной кислоты на хроматографе Waters.

Предстационарпая кинетика: получение и анализ данных.

Флуоресцентные кинетические кривые были зарегистрированы на спектрофотометре «остановленной струи» SX 18MV (Applied Photophysics, Великобритания). Для детектирования флуоресценции ЛФ15Ф были использованы Я.ех=495 nm и ^.em>530 nm; испускание флуоресценции было зарегистрировано с помощью фильтра Schott filterWG530 (Schott, Mainz, Германия), который отсекал все длины волн ниже 530 нм. Для измерения FRET между флуоресцентными белками использовались параметры Х.ех=405 nm и Хст>530 пт Для детекции FRET с участием дансильной метки (субстраты ЛФ15Д и С20Д) была 280 nm для возбуждения внутренней флуоресценции триптофанов фермента и Х.ет была 560 пт для детекции испускания флуоресценции дансила. «Мертвое I время» прибора составляло 1.4 мс. Каждую кинетическую кривую усредняли минимум по данным трех экспериментов. Обычно, концентрация субстрата была постоянной, а концентрация фермента варьировала в пределах одного порядка вокруг концентрации субстрата. Концентрация ЛФ15Ф была 5 ц,М во всех экспериментах; С20Д - 4 р.М; ЛФ15Д -5-цМ, ЛФ15Б — 0.25 цМ.

Для расчета констант скорости конформационных переходов получали несколько кинетических кривых, отражающих зависимость скорости реакции от концентрации взаимодействующих веществ. Кроме того, различные концентрации фермента подбирали таким образом, чтобы при фиксированной концентрации субстрата изменение интенсивности флуоресценции в процессе реакции было максимальным.

Количественную обработку результатов экспериментов проводили путем оптимизации параметров, входящих в кинетические схемы. Для этого использовали метод нелинейной регрессии, включающий численное интегрирование дифференциальных уравнений, описывающих кинетику процесса (Origin 7.0 (OriginLab, США) и DynaFit (BioKin, США))

Для определения минимальной кинетической модели взаимодействия фермента с субстратами и расчета констант скорости всех элементарных стадий данной модели использовали программу Dynafit. Эффективность и точность определения параметров для исследуемого процесса зависит от числа ограничений, налагаемых на обрабатываемые данные. Кинетические кривые разбивали на несколько временных диапазонов таким образом, что каждый следующий диапазон полностью включал предыдущий, например от 2 мс до 1, 10, 100 с и так далее. Это дает возможность постепенно усложнять и оптимизировать модель взаимодействия фермента с субстратом. Начальный диапазон кривых, как правило, отражает стадии связывания и дает возможность определить их константы скорости. При обработке следующего временного диапазона ранее использованный механизм усложняли, например, к нему добавляли еще одну равновесную или неравновесную стадию, при этом фиксировали константы, определенные для начальных стадий. После расчета констант скорости добавленных стадий осуществляли общее корректирование значений констант скорости путем одновременной оптимизации всех параметров системы. Такой пошаговый подход позволил дискриминировать различные схемы фермент-субстратного взаимодействия и определить константы скорости и равновесия элементарных стадий, входящих в эти схемы.

Кроме того, для подтверждения правильности числа выбранных стадий в механизме взаимодействия фермента с субстратом использовали статистический метод — так называемый "scree" тест. Для этого описывали одну или несколько кинетических кривых модельными механизмами, содержащими от 1 до 10 равновесных переходов в комплексе фермент-субстрат (Схема 4), при этом регистрировали среднеквадратичное отклонение теоретической кривой от экспериментальных данных.

Схема 4 кх к2 к3 кп кп+] Кр

Е + S (E S), *-(E S)2 у—. . . »- (E S)n-(Е Р ■«—^ Е + Р) k j k3 kn

На рис. 20 приведен пример такого метода анализа кинетической кривой, полученной при взаимодействии ЛФ с субстратом ЛФ15Ф в молярном соотношении 1:1.

3 4

Number Ы Мере. |

Рис. 20. "Scree" тест - зависимость среднеквадратичного отклонения от числа стадии реакции. А) Статистическая проверка механизма связывания ЛФ с субстратом ЛФ15Ф. Б) отклонение теоретической кривой от практической для одностадийного механизма взаимодействия с ЛФ с субстратом в зависимости от времени. В) отклонение теоретической кривой от практической для двухстадийного механизма взаимодействия ЛФ с субстратом в зависимости от времени, ЛФ и ЛФ15Ф были взяты в концентрациях 5цМ. I

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Захарова, Мария Юрьевна, 2009 год

1. Li, Y., Sherer, К., Cui, X., and Eichacker, P.Q., New insights into the pathogenesis and treatment of anthrax toxin-induced shock. Expert Opin Biol Ther, 2007. 7(6): p. 843-854.

2. Xu, L. and Frucht, D.M., Bacillus anthracis: a multi-faceted role for anthrax lethal toxin in thwarting host immune defenses. Int J Biochem Cell Biol, 2007. 39(1): p. 20-24.

3. Turnbull, P.C., Introduction: anthrax history, disease and ecology. Curr Top Microbiol Immunol, 2002. 271: p. 1-19.

4. Dixon, T.C., Meselson, M., Guillemin, J., and Hanna, P.C., Anthrax. N Engl J Med, 1999. 341(11): p. 815-826.

5. Mock, M. and Fouet, A., Anthrax. Annu Rev Microbiol, 2001. 55: p. 647-671.

6. Inglesby, T.V., Henderson, D.A., Bartlett, J.G., Ascher, M.S., Eitzen, E., Friedlander,

7. Guidi-Rontani, C. and Mock, M., Macrophage interactions. Curr Top Microbiol Immunol, 2002. 271: p. 115-141.

8. Ribot, W.J., Panchal, R.G., Brittingham, K.C., Ruthel, G., Kenny, T.A., Lane, D., Curry,

9. B., Hoover, T.A., Friedlander, A.M., and Bavari, S., Anthrax lethal toxin impairs innate immune functions of alveolar macrophages and facilitates Bacillus anthracis survival. Infect Immun, 2006. 74(9): p. 5029-5034.

10. Ruthel, G., Ribot, W.J., Bavari, S., and Hoover, T.A., Time-lapse confocal imaging of development of Bacillus anthracis in macrophages. J Infect Dis, 2004. 189(7): p. 13131316.

11. Holty, J.E., Bravata, D.M., Liu, H., Olshen, R.A., McDonald, K.M., and Owens, D.K., Systematic review: a century of inhalational anthrax cases from 1900 to 2005. Ann Intern Med, 2006. 144(4): p. 270-280.

12. Collier, R.J. and Young, J.A., Anthrax toxin. Annu Rev Cell Dev Biol, 2003. 19: p. 4570.

13. Drysdale, M., Heninger, S., Hutt, J., Chen, Y., Lyons, C.R., and Koehler, T.M., Capsule synthesis by Bacillus anthracis is required for dissemination in murine inhalation anthrax. Embo J, 2005. 24(1): p. 221-227.

14. Ascenzi, P., Visca, P., Ippolito, G., Spallarossa, A., Bolognesi, M., and Montecucco, C., Anthrax toxin: a tripartite lethal combination. FEBS Lett, 2002. 531(3): p. 384-388.

15. Lacy, D.B., Mourez, M., Fouassier, A., and Collier, R.J., Mapping the anthrax protective antigen binding site on the lethal and edema factors. J Biol Chem, 2002. 277(4): p. 30063010.

16. Petosa, C., Collier, R.J., Klimpel, K.R., Leppla, S.H., and Liddington, R.C., Crystal structure of the anthrax toxin protective antigen. Nature, 1997. 385(6619): p. 833-838.18