Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Гришин, Дмитрий Викторович

• Гришин, Дмитрий Викторович
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гришин, Дмитрий Викторович

Список принятых сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1. Характеристика синдрома мальабсорбции.

2. Обзор методов конверсии лактозы в пищевой промышленности.

3. Общая характеристика ферментов класса гликозилгидролаз.

3.1. Общая характеристика ферментов класса Р-галактозидаз.

3.1.1. Мезофильные Р-галактозидазы.

3. 1.2. р-галактозидазы термофильных микроорганизмов.

4. Технология слитных генно-инженерных конструкций в науке и практике.

4.1. Общая характеристика метода.

4.2. Современный взгляд на применение химерных белков.

4.2.1. Fusion - технология и биокатализ.

4.2.2. Создание рекомбинантных антител.

4.2.3. Субъединичные генно-инженерные вакцины.

4.2.4. Химерные белки для оптимизации аффинной хроматографии.

5. Декстрансвязывающий домен и его биологические источники.

6. Иммобилизованные ферменты.

7. Цели и задачи работы.

Глава П. Материалы и методы.

1. Материалы.

1.1. Химические реагенты.

1.2. Составы используемых буферов.

1.3. Бактериальные штаммы и ростовые среды для бактериальных культур.

1.4. Используемые коммерческие плазмидные векторы и синтетические олигонуклеотиды.

1.4.1. Коммерческие плазмидные векторы.

1.4.2. Синтетические олигонуклеотиды.

2. Методы молекулярного клонирования в бактериях.

2.1. Бактериальные штаммы и используемые среды.

2.2. Клонирование плазмидной ДНК в бактериях.

2.2.1. Молекулярные методы получения генно-инженерных конструкций.

2.2.2.Получение компетентных клеток штаммов E.coli.

2.2.2.1 .Подготовка клеток к электропорации.

2.2.2.2. Проведение электропорации.

2.3. Выделение хромосомной ДНК методом фенол-хлороформной экстракци

2.4. Анализ клонированных генов.

2.5. Полимеразная цепная реакция (ПНР).

2.6. Источники клонируемого материала.

3. Метод изоляции культур Leuconostoc mesenteroides.

4. Используемые методы очистки белков.

4.1. Катионообменная хроматография.

4.2. Гельфильтрация.

5. Метод количественного определения белка (метод Мэрион Бредфорд).

Глава Ш. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Создание бактериальных штаммов продуцентов белка ДСД-сп- Р-ГАЛ.

1.1.Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего клонирование гена и экспрессию белка LacZThEh.

1.2.Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию белка DBD(Gly-Ser)5.

1.2.1. Получение и клонирование гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides.

1.2.2. Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.

1.2.2.1. Получение гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С конце.

1.2.2.2. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка DBD (Gly-Ser)5.

1.2.3. Создание бактериальных продуцентов белка DBD(Gly-Ser)5.

1.3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающего экспрессию химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ в цитоплазме клеток Е. coli.

1. 3. 1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка ДСД-сп-р-ГАЛ.'.

1.3.2. Секвенирование аутентичных нуклеотидных последовательностей гена белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

1.3.3. Создание бактериальных продуцентов гена белка ДСД-сп-Р-ГАЛ.

2. Оптимизация условий экспрессии белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

2.1. Оптимизация времени индукции.

2.2. Оптимизация количества индуктора.

2.3. Оптимизация ионного состава ростовой среды.

3. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп-Р-ГАЛ.

3.1. Анализ растворимости белка ДСД-сп-р-ГАЛ в лизатах клеток Е. coli штамма DH5a.

3. 2. Изучение термостабильности белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

3.3. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-Р-ГАЛ в лизатах клеток Е. coli штамма DH5a.

4. Хроматографическое выделение белка ДСД-сп-р-ГАЛ и изучение его декстрансвязывающих свойств.

4.1. Определение изоэлектрической точки ДСД-сп-р-ГАЛ.

4.2. Катионообменная хроматография.

4.3. Изучение декстрансвязывающих свойств целевого белка.

4.4. Изучение степени очистки белка ДСД-сп-р-ГАЛ посредством аффинной хроматографии на декстране.

5. Сравнительная характеристика влияния различных физических факторов на исследуемый белок.

6. Создание модельной системы для ферментации бета-галактозидов на базе декстрана и рекомбинантного белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента»

Актуальность проблемы. Известно, что недостаточность фермента (3-галактозидазы (лактазы), расщепляющей лактозу молока имеет особое значение в раннем детстве, так как дисахарид лактоза, содержащийся в молоке является основным источником галактозы, которая в свою очередь участвует в синтезе галактоцереброзидов, необходимых для нормального развития ЦНС и сетчатки глаза, вследствие чего уменьшение количества лактозы и производных её гидролиза нежелательно, особенно в детском возрасте. Между тем 15-20% населения Земли стабильно подвержено синдрому мальабсорбции (СМА), который выражается, в частности, в лактозонепереносимости и сопряженных с этим явлением последствиях [1].

Наиболее радикальным и эффективным способом профилактики и лечения СМА, является промышленное создание безлакгозных продуктов, либо приём ферментных препаратов (мезофильная р-галактозидаза), расщепляющих лактозу, которые назначаются вместе с молоком и молочными продуктами, однако, при этом наблюдается инактивация фермента протеазами желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) и его скорый унос, вследствие физиологической перистальтики ЖКТ [2], а кроме того отсутствие оптимальной системы очистки фермента приводит к ряду негативных моментов, речь о которых пойдёт далее.

В современной биотехнологической практике одно из наиболее важных мест принадлежит ферментам и ферментным системам, которые широко используются в различных отраслях промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Известно, что большинство ферментов, являясь веществами белковой природы, неустойчивы при хранении, а также чувствительны к тепловым воздействиям и к воздействию различных химических реагентов. Решить эти проблемы для ряда промышленных отраслей помогает создание на основе новейших биотехнологических приёмов, иммобилизованных ферментов.

Принципиально новым подходом к получению таких препаратов как Р-галактозидазы с улучшенными характеристиками является внедрение методов биотехнологии и генной инженерии. С использованием этих методов возможно создание различных ферментов, в том числе и Р-галактозидаз, обладающих повышенной термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с биологически совместимыми субстратами (декстран) [3]. Это значительно облегчало бы процесс очистки фермента, что важно не только в свете возможности использования данного иммобилизованного на декстране фермента в качестве медицинского препарата, но и при оптимизации процессов конверсии лактозы в пищевой промышленности, в частности для создания безлактозных молочных продуктов [4].

Получение подобных ферментных препаратов становится возможным при использовании штаммов бактерий, трансформированных плазмидной ДНК, несущей ген р-галакгозидазы с улучшенными свойствами [5].

В настоящее же время используемые в мировой научной и промышленной практике штаммы E.coli продуценты, экспрессируют ферменты способные быть иммобилизованными в основном только химическими методами, что, может повлечь за собой значительную инактивацию целевого белкового продукта [6].

Положения, выносимые на защиту. 1. Созданный плазмидный вектор с регуляторными областями и геном химерного белка ДСД-сп-р-ГАЛ. 2. Рекомбинантная белковая конструкция ДСД-сп-р-ГАЛ содержащая декстрансвязывающий домен и каталитическую последовательность фермента термостабильной р-галактозидазы и её пггамм-продуцент. 3. Стратегия очистки рекомбинантных белков, основанная на сочетании использования. термостабильности целевого продукта и его декстрансвязывающих свойств. 4. Декстран-белковый комплекс на основе белка ДСД-сп-Р-ГАЛ и декстранового сорбента для гидролиза бета-галактазидов.

Научная новизна. Концепция разработки слитных генно-инженерных конструкций, позволила нам создать плазмидный вектор с геном химерного белка и экспрессироватъ сам белок ДСД-сп-Р-ГАЛ, обладающий одновременно декстрансвязывающими свойствами и активностью фермента термостабильной Р-галактозидазы. Так же была предложена стратегия аффинной очистки рекомбинантного белка и получения декстран-белкового комплекса на базе данного двудоменного белка, а также изучены возможности его практического использования.

Практическое значение работы. Технологическая схема получения химерного белка ДСД-сп-Р-ГАЛ, а также способ очистки и иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применение в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов дня профилактики синдрома мальабсорбции (недостаточности фермента лактазы). Также данный декстран-белковый комплекс может быть использован в пищевой промышленности при реализации схем получения безлактозных продуктов.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Гришин, Дмитрий Викторович

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1) Разработан способ получения гибридного белка ДСД-сп-|3-ГАЛ, отличающегося наличием аутентичной последовательности декстрансвязывающего домена, объединённой через глицин-сериновый спейсер с последовательностью термостабильной бета-галактоз ид азы

2) Сконструирована экспрессионная плазмида pGD-Ю, кодирующая химерный белок ДСД-сп-р-ГАЛ.

3) Создан штамм E.coli [pGD-10] - продуцент белка ДСД-сп-р-ГАЛ. Оптимизированы условия индукции и синтеза химерной белковой конструкции, вследствие чего был достигнут уровень экспрессии целевого белка 10% от общего белка Е. coli.

4) Определены физико-химические показатели и удельная ферментативная бета- галактозидазная активность гибридного белка ДСД-сп-р-ГАЛ.

5) Получен комплекс декстрана и белка ДСД-сп-р-ГАЛ, который может быть использован в качестве компонентной базы для ферментативного гидролиза различных бета-галактозидов в пищевой промышленности и медицине.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бета галактоз идаза является одним из первых ферментов, ставших объектами исследования учёных в различных областях биологической науки, по этой причине изучение её свойств и возможных направлений её использования, задействующих данный фермент казались уже исчерпанными. Однако генная инженерия и /гш'оя-технология как молодое направление биотехнологии позволили нам разрушить данный стереотип. В различных отраслях современной науки остаются ещё не решенными проблемы, где подобный фермент в рекомбинантном виде мог бы найти широкое применение. К данным проблемам относятся как собственно синдром мальабсорбции, выражающийся в недостаточности лактазы и в сопряжённых с этим состоянием паталогических последствиях, так и сложная схема получения безлактозных продуктов и ферментных препаратов лекарственного назначения, что сводится к трудоёмкой химической очистке фермента, приводящей к его инактивации, а также проникновению химических реагентов, используемых для элюции, в пищевой продукт и организм человека. Кроме того, используемые в настоящее время лактазы, являются преимущественно мезофильными, что ограничивает их применение в тех случаях, когда производственный процесс необходимо проводить непрерывно при высоких температурах, к примеру при пастеризации, - процессе одноразового нагревания жидкостей или пищевых продуктов, обычно до 60-70°С, в течение 15-30 минут.

Принципиально новым подходом к получению препаратов |3-галактозидаз с улучшенными характеристиками является технология слитных (химерных) рекомбинантных конструкций, когда в одной рамке трансляции объединяются генные последовательности разных по своей функциональности белков. Использование подобной технологии позволило нам осуществить создание фермента, обладающего улучшенными свойствами: повышенной термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию с биологически совместимым субстратом (декстран), что призвано значительно облегчить процесс очистки белка, что важно не только в свете возможности использования данного иммобилизованного на декстране фермента в качестве медицинского препарата с пролонгированным действием, но и при оптимизации процессов конверсии лактозы в пищевой промышленности, в частности при создании безлактозных молочных продуктов.

Благодаря выше описанным генно-инженерным приёмам нами был получен ген декстрансвязывающего домена (ДСД) из Leuconostoc mesenteroides с глицин-сериновым спейсером на С-конце; была спланирована и создана генная последовательность химерного белка на базе гена ДСД со спейсером и гена термостабильной Р - галактозидазы из Thermoanaerobacter Ethanolicus; Впервые были получены эффективные бактериальные продуценты конструкции ДСД-сп-р-ГАЛ E.coli DH5a, обеспечивающие экспрессию целевого белка на уровне 10% от тотального белка клеток, а также были изучены физико-химические свойства и ферментативная активность рекомбинантной конструкции ДСД-сп-Р-ГАЛ. Следствием вышеописанных манипуляций явилось создание системы для гидролиза бета-галактозидов на базе комплекса декстрана и нашего белка.

Так же была предложена высокоэффективная схема выделения, очистки и иммобилизации рекомбинантного белка на декстрановом сорбенте, основанная на уникальных свойствах декстрансвязывающего домена и позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 90%. Впервые получен в препаративных количествах высокоочшценный рекомбинантный белок ДСД-сп-Р-ГАЛ, а также декстран-белковый комплекс для эффективного гидролиза бета-галактозидов. Благодаря данным тонкослойной хроматографии и хромогенного проточного гидролиза можно утверждать о том, что созданный химерный белок ДСД-сп-р-ГАЛ имеет более высокие показатели удельной активности при иммобилизации на декстрановом сорбенте, с которым способен оставаться в стабильном комплексе и в течение длительного времени осуществлять гидролиз различных бета-галактозидов.

Таким образом, разработанная схема получения химерного белка ДСД-сп-р-ГАЛ, а также способ очистки и иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применение в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов для профилактики синдрома мальабсорбции, связанного с недостаточностью фермента лактазы; также комплекс данной белковой конструкции с декстраном может быть использован в пищевой промышленности при реализации новых схем получения безлактозных продуктов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гришин, Дмитрий Викторович, 2009 год

1. Ладодо К.С. Руководство по лечебному питанию детей. М.: 2000. -384 с.

2. Чубарова А.И., Гераськина В.П., Кыштымов М.В. и др. Эффективность применения ферментотерапии и диетотерапии при лактазной недостаточности у новорожденных // Вопросы детской диетологии. 2003. - № 4. - С. 21-24.

3. Cavataio, F., Guandalini, S. Cow's milk allergy. In: Essential pediatric gastroenterology, hepatology, & nutrition. / F. Cavataio, S. Guandalini // S. Guandalini, ed. New York: McGraw-Hill. -2005. P. 175-192.

4. Кунижев C.M., Шуваев В.А., ЬСимова Э.Т. Низколактозные и безлактозные молочные продукты: Обзорная информация // Обзор. АгроНИИТЭИММП. 1988. - 30 с.

5. Zverlov, V.V., Fokina, N.A., Velikodvorskaya, G.A. Sequence P~ galactosidase gene Thermoanaerobacter ethanolicus. 1996. - EMEL ac. №Y08557

6. Березин И.В., Клячко Н.П., Левашов A.B. Иммобилизованные ферменты. -М.: Высшая школа, 1987.-160 с.

7. Мухина Ю.Г., Чубарова А.И., Гераськина В.П. Современные аспекты проблемы лактазной недостаточности у детей раннего возраста // «Вопросы детской диетологии» 2003.- т. 1, № 1. - С. 50 - 56.

8. Корниенко Е.А., Митрофанова Н.И., Ларченкова Л.В. Лактазная недостаточность у детей раннего возраста // «Вопросы современной педиатрии» 2006.- т. 5, №4. - С. 25 - 46.

9. Мухина Ю.Г., Чубарова А.И., Боровик Т.Э., Рославцева Е.А. и др. «Рабочий протокол по диагностике и лечению лактазной недостаточности у детей» // изд. Научного центра здоровья детей РАМН 2005. - № 1. - С. 38-46.

10. Чубарова А.И., Гераськина В.П., Кыштымов М.В., Потапова О.В., Попова И.Д., Дьяконова Г.В. Эффективность применения ферментотерапии и диетотерапии при лактазной недостаточности у новорожденных // Вопросы детской диетологии — 2003. т. 1, № 4. — С. 21-25.

11. П.Тихомирова О.В., Бехтерева М.К. Диетическая коррекция функциональных нарушений желудочно-кишечного тракта у детей грудного возраста после перенесенных острых кишечных инфекций // Педиатрия 2007. - № 2. - С. 65-69.

12. Фотометрическое измерение массовых концентраций бета-галакгазидазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания / под ред. Оншценко Г.Г.. Москва. 2003. С. 2-11.

13. Тепел А. Физика и химия молока: учеб. для вузов. — М.: Пшцепромиздат, 1979. 465 с.

14. Твердохлеб, Г.В., Диланян З.Х., Чекулаева JI.B. Технология молока и молочных продуктов. -М.: Агро ripомиздат, 1991. -463 с.

15. Шуваев В.А., Кунижев С.М„ Омельянчук П.А. Исследование процесса экстракции лактозы из сухого обезжиренного молока // Вестник СевКавГТУ 2003. - Вып. 6. - С. 15-24.

16. Шуваев В.А., Харитонов В.Д., Грановский В.Я., Кунижев С.М., Евдокимов И.А., Гацулина М.М. Способ производства сухого безлакгозного молочного продукта // Бюл. Открытия. Изобретения — 1986. -№33.- С.6—7.

17. Эдельстен Д., Фриис П., Меерзон М.Ф. Новый вид сухого обезжиренного молока с пониженным содержанием лактозы // Международный молочный конгресс 1982. - т. 1, кн. 1. - С.8-10.

18. Шуваев В.А., Кунижев С.М., Лагошина С.А., Лельчук Ю.В. Способ получения сухого безлакгозного молока // Бюл. Открытия. Изобретения 1987. -№27. - С.11-13.

19. Bora, К. Changes in physico-chemical properties of goat milk due to boiling and simmering processes Indian/ K. Bora, J. Singh, G. Goyal // J. Anim. Sci. 1990. - V. 60, №1,-P. 112-114.

20. Coveney, J. Goat's milk and infant feeding/ J. Coveney, I. Darnton // J. Aust. 1985. - V. 143. - P.508-511.

21. Диксон M., Уэбб Э. Ферменты. M.: Мир, 1982. - т.З. - 906 с.

22. Henrissat, В. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities/ B. Henrissat // J. Biochem. 1991. - V. 280. - P. 309—316.

23. Henrissat, В., Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases/ B. Henrissat, A. Bairoch // J. Biochem. 1996. - V. 316. - P. 695-696.

24. Волова Т.Г. Биотехнология. Новосибирск: Изд-во Сибирского отделения Российской Академии наук, 1999. - 252 с.

25. Sheridan, P. P., Characterization of a Salt-Tolerant Family 42 р-Galactosidase from a Psychrophilic Antarctic Planococcus Isolate and Brenchley/ P. P. Sheridan, E. Jean // Appl. Environ Microbiol. 2000. -V.66. - P. 2438-2444.

26. Corral, J. Cloning and characterization of a P-galactosidase encoding region in Lactobacillus coryniformis CECT 5711/ J. Corral, O. Banuelos, J. Adrio, J. Velasco // Appl. Microbiology and Biotechnology. 2006. - V. 73, №3. - P. 640-646.

27. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М.: Наука, 1975. - 389 с

28. Tanthanuch, W., Chantarangsee, M. Genomic and expression analysis of glycosyl hydrolase family 35 genes from rice (Oryza sativa L.) / W.Tanthanuch, M. Chantarangsee, J. Maneesan, J. Ketudat // BMC Plant Biology. -2008. -V.84, №8. P. 1-17.

29. КонР.М., Рот K.C. Ранняя диагностика болезней обмена веществ, пер. с англ. М.: Мир, 1986. - с. 281- 450.

30. Зубова Н. Н., Савицкий А. П. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих // Успехи биологической химии. —2005. т. 45. - С. 391—454.

31. Лодыгин А. Д., Рябцева А. Б. Лакгосахароза и галактоолигосахариды — новые перспективные пребиотики из лактозосодержащего сырья // Сборник научных трудов СевКавГТУ, серия «Продовольствие». -2006. -№2.

32. Ramesh, M. Thermophilic Fungi: Their Physiology and Enzymes/ M. Ramesh, G. Bharadwaj, K. Mahalingeshwara II J. Microbiolodgy and Molecular Biolodgy Reviews. 2000. - P. 461-488.

33. Tischer, W., Immobilization of Enzymes. In Enzyme Catalysis in Organic Synthesis / W. Tischer // VCH-Verlag Weinheim. 1995. - P. 73-87.

34. Гдик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология (принципы и применение). М.: Мир, 2002. - С. 158-330.

35. Комаров С. Биохимики прогнозируют свойства химерных белков // Информнаука: науч. пед. интернет-журн. 12.01.06 URL: http://http://www.informnauka.ru (дата обращения: 20.02.2008).

36. Friedhandler, L., Berk, J.E. Affinity characteristics of amylase-binding substance (s) prepared from macroamylase complexes/ L. Friedhandler, J.E. Berk, E. Wong // Clin. Chem. 1974. - V.20, №1. - P. 5-22.

37. Keefe, A.D., Wilson, D.S. One-step purification of recombinant proteins using a nanomolar-afmity strptavidin-binding peptide, the SBP-tag / A.D. Keefe, D.S. Wilson, B. Seelig, J.M. Szostak // Protein Expr Purif. 2001. - V.23. - P. 440-446.

38. Jungbauer, A., Hahn, R. Engineering protein A affinity chromatography / A. Jungbauer, R. Hahn // Curr. Opin Drug Discov Devel. 2004. - V.7, №2.-P. 248-256.

39. Wilson, M.J., Freedman, R.B., Fitton, J.E. Recovery, Refolding and Purification a2 -Interferon / M.J. Wilson, R.B. Freedman, J.E. Fitton // Biochemical Society Transactions 1988. - V.76, №1. - P. 58-60.

40. Vaillancourt, P. E. E. Coli Gene Expression Protocols/ P. E. Vaillancourt // Humana Press 2003. - V. 205. - P. 119-140.

41. Tuan, R. S. Recombinant Gene Expression Protocols / R. S. Tuan// Methods in Molecular Biology 1997. - V. 62. - P. 3-62.

42. De Marco, A., Casatta, E., Savaresi, S., Geerlof, A. Recombinant proteins fused to thermostable partners can be purified by heat incubation / A. De Marco, E. Casatta, S. Savaresi, A. Geerlof // J. of Biotechnology -2004. -V. 107.-P. 125-133.

43. Koerdt, A., Paulick, A., Mock, M. MotX and MotY are required for flagellar rotation in Shewanella oneidensis MR-1/ A. Koerdt, A. Paulick, M. Mock, K. Jost, M. Thormann // J. Bacterid 2009. - P. 10-23.

44. Льюин, Б. Гены / Пер. с англ.- М.: Мир, 1987. 544 с.

45. Кострюкова Е.С., Лазарев В.Н., Титова Г.А., Акопиан Т.А., Левицкий С.А., Говорун В.М. Экспрессия генов белков мембраны включения IncB и IncC Chlamydia trachomatis в Escherichia coli. // Биохимия -2006. т.71, №3. - С. 333-340.

46. Maski, К., Masuda, R., Tacase, К. Stability of the molten globule state of a domain-exchanged chimeric protein between human and bovine a-lactalbumins / K. Maski, R. Masuda, K. Tacase, K. Kawano, K. Nitta // Protein Engineering 2000. - V. 13. - P. 1-4.

47. Яненко A.C. Биокаталические процессы в органическом синтезе: состояние и перспективы развития // Биотехнология 2009. - № 2. -96 с.

48. Шелдон Р.А. Экологический фактор, или окружающая среда как стимул эволюции промышленной химии // Перевод Г.В.Низовой, «Химия и жизнь ХХ1век». - 1999. - №4. - С. 4-9.

49. Madrid (ES) (All Except US). ES / ES.; (ES) (US Only); Publication Date: 28.08.2003.

50. Goyal, A., Batra, J. K. Inclusion of a form-sensitive spacer enhances the cytotoxicity of ribotoxin restrictocin containing recombinant single-chain immunotoxins/ A. Goyal, J. K. Batra // Biochem. J. 2000. - V. 345, -P.247-254.

51. Белозоров А. П. Лекарственные препараты гуманизированных антител. // интернет-журн. «Провизор», 20.05.1998. URL: http: // www.provisor.com.ua /archive/2007/N20/antitelo20.php. (дата обращения: 15.01.2009)

52. Shepherd, P., Dean, Ch. Monoclonal antibodies / P. Shepherd, Ch. Dean // Practical Approach. Edited by Oxford University Press. 2000. - 479 p.

53. Фибих X. Получение моноклональных антител путем слияния клеток. Иммунологические методы. М.: Медицина, 1987. - С. 15-37.

54. Janda, K.D. New strategies for the design of catalytic antibodies / K.D. Janda // Biotechnol. Prog. 1990. - №6. - P. 178 - 181.

55. Arnon, R., Ben-Yedidia T Old and new vaccine approaches / R. Arnon // Int. Immunopharmacol. 2003. -V.3,№8. - P. 1195-1204.

56. Dertzbaugh, M.T. Genetically engineered vaccines: an overview / M.T. Dertzbaugh // Plasmid 1998. - V. 39. - P. 100-113.

57. Ada, G. Overview of vaccines/ G. Ada // Methods in molecular medicine -2003. -V.87. -P. 1-17.

58. Studier, F.W:, Rosenberg, A.H. Use. of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned1 genes. / F. W. Studier, A. H. Rosenberg, J. J. Dunn,

59. J. W. Dubendorff// Methods: Enzymol. Companion Methods. 1990. -P.60-89.

60. Liljeqvist, S., Stahl, S. Production of recombinant subunit vaccines: protein immunogens, live delivery systems and nucleic acid vaccines / S. Liljeqvist., S. Stahl. //J.Biotechnol. 1999. - V.73, №1. -P. 1-33.

61. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems / K. Terpe // Appl. Microbiol. Biotechnol. Review 2003. -V. 60. - P. 523-533.

62. Lichty, J.J., Malecki, J.L., Agnew, H.D. Comparison of affinity tags for protein purification / J.J. Lichty, J.L. Malecki, H.D. Agnew, D. J. Michelson-Horowitz, S. Tan. // Protein Expr Purif. 2005. - V.41, №1. -P. 98-105.

63. Karpeisky, M.Y., Senchenko, V.N., Dianova, M.V., Formation and properties of S protein complex with S peptide containing fusion protein /

64. M.Y. Karpeisky, V.N. Senchenko, M.V. Dianova // FEBS Lett. 1994. -V.339. - P.209-212.

65. Spinell, D. M., Gibbons, R. J. Influence of Culture Medium on the Glucosyl Transferase and Dextran-Binding Capacity of Streptococcus mutans 6715 Cells / D. M. Spinell, R. J. Gibbons, // J.Infection and Immunity - 1974. -V. 10. - P. 1448-1451.

66. Freedman, M. L., Guggenheim, B. Dextran-induced aggregation in a mutant of Streptococcus sobrinus 6715-13 / M. L. Freedman, B. Guggenheim // J. Infection and Immunity -1983. V.41, №1. - P. 264274.

67. Morisaki, H., Igarashi, Т., Yamamoto, A., Goto, N. Analysis of a dextran-binding domain of the dextranase of Streptococcus mutans / H. Morisaki, T. Igarashi, A. Yamamoto, N. Goto // Letters in Applied Microbiology. -2002. V.35. - P.223-227.

68. Ахметова Л.И., Перевалова Е.Ю., Розанова C.M. Бактерии рода Leuconostoc: клиническое значение, идентификация, чувствительность к антибиотикам // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия 2001. - №1, т.З. - С. 48-53.

69. Funane, К., Ookura, Т., Kobayashi; М. Glucan Binding Regions of Dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F / K. Funane, T. Ookura, M. Kobayashi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1998. -V. 62.-P. 123-127.

70. Kobayashi, M., Mihara, K., Matsuda, K. Dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F: characterization of the enzyme bound to Sephadex gel / M. Kobayashi, K. Mihara, K. Matsuda // Agric. Biol. Chem. 1986. - P.551-557.

71. Патент RU 2273662 C2, CI2N1/20, A23C9/12, C12R1/01, опубл. 10.04.2006 г.

72. Dimic, G. R. Characteristics of the Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides strains from fresh vegetables/ Gordana R. Dimic // ARTEFF. 2006. - V.37. - C. 3-11.

73. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. M.: Наука, 2000. - 830 с.

74. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1998. - 704 с.

75. QIAGEN protocols: Sample & Assay Technologies, Analyzing Gene Expression and Regulation., 2003 2009. - http: I! wwwl.qiagen.com/literature/brochures/Category.aspx?ID = 301.

76. Morstadt, L., Bohm, A., Stollar, В., Engineering and characterization of a single chain surrogate light chain variable domain / L. Morstadt, A. Bohm, D. Yuksel, K. Kumar, B. Stollar // Protein Sci. 2008. - V.17, №3. - P. 458^165.

77. Cao H., Expression, Purification, and Biochemical Characterization of the Antiinflammatoiy Tristetraprolin: A Zinc-Dependent mRNA Binding Protein Affected by Posttranslational Modifications / H. Cao // Biochemistry. 2004. - V.43, №43. - P. 13724-13738.

78. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli / F. Baneyx // Curr Opin Biotechnol. 1999. - V.10, №5. - P.411-21.

79. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. - С.450.

80. Cave, H., Bingen., E., Elion, J., Denamur, E. Differentiation of Escherichia coli strains using randomly amplified polymorphic DNA analysis/ H. Cave, E. Bingen, J. Elion, E. Denamur // Res. Microbiol. 1994. - V.145. -P.141-150.

81. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике/ под редакцией Алиханяна С.И. М.: Мир, 1976. - С. 324-327.

82. Stupak, Е.Е., Stupak, I.V. Inheritance and state switching of genetic toggle switch in. different culture growth phases / E.E. Stupak, I.V. Stupak // FEMS Microbiol. Lett. 2006.- V. 258.- P. 37-42.

83. Craven, G.R., Steers, Jr.E., Anfinsen, C.B. Purification, composition and' molecular weight of the J3-Galactosidase of Escherichia coli K12 / G.R.

84. Craven, Jr.E. Steers, C.B. Anfinsen // J. Biol. Chem. 1965. - V.240. - P. 2468-2477.

85. Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding / M. M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - V.72. - P.248-254.

86. Шапкин Н.П., Жамская H.H., Скобун A.C. Адсорбция белков и жиров из сточных вод пищевых предприятий на природных сорбентах // Известия Вузов. Пищевая технология — 2001. №4. - С.36-38.

87. Тарасевич Ю.И. Природные сорбенты в процессах очистки воды. -Киев: «Наукова думка», 1981. —278 с.

88. Бобровник Л.Д., Семененко В.З., Федорова Н.С. Влияние поверхностных свойств осадков на адсорбцию несахаров в процессе II сатурации и сульфитации // Сахарная промышленность 1987. - № 2. -С. 18-20.

89. Кагановский A.M. Адсорбционная технология очистки сточных вод. Киев: "Техника", -1983. с. 10-24.

90. Сова В.В., Кусайкин М.И. Выделение и очистка белков: Методическое пособие к практическим занятиям по очистке белков по курсу «Химия и биохимия белков и ферментов» Владивосток: изд-во Дальневост. ун-та, 2006. - 42 с.

91. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М.: Мир, 1965. - 508 с.

92. Кирхнер Ю. Тонкослойная хроматография / Перевод под ред. В.Г. Березкина. М.: Мир, 1981. - т. 1; 2. -1100с.