Разработка эффективных систем экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica для создания продуцента клеточно-связанной липазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат биологических наук Юзбашева, Евгения Юрьевна

• Юзбашева, Евгения Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Юзбашева, Евгения Юрьевна

I. ВВЕДЕНИЕ.

1. Актуальность темы.

2. Цели и задачи работы.

3. Научная новизпа.

4. Практическая значимость.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Разработанные системы для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей.

1.1. Общая характеристика подхода.

1.2. Гликопротеины, ковалентно связанные с ß-1,б-гликанами клеточной стенки, и С-концевой способ закрепления белков на поверхности клеток дрожжей.

1.3. N-концевой способ иммобилизации белков на поверхности клеточной стенки.

2. промышленно-ценный фермент липаза.

3. Существующие подходы к экспонированию липаз на поверхности клеточной стенки дрожжей.

4. аскомицетные дрожжи yarrowia lipolyt1ca.

5. Белки клеточной стенки и иммобилизация на поверхности клеток дрожжей

Y. lipolytica.

III. МАТЕРИАЛЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Штаммы, среды и условия культивирования.

2. Выявление новых потенциальных белков клеточной стенки к lipolytica.

2.1. Выявление гомологов белка клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica Ylcwpl.

2.2. Выявление ближайшего гомолога белка клеточной стенки S. cerevisiae Flolp в дрожжах Y. lipolytica.

3. Конструкция экспрессионных векторов.

3.1. Создание вектора для суперэкспрессии липазы Lip2.

3.2. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации красного флуоресцентного белка с помощью белка клеточной стенки YlPirl.

3.3. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью белка клеточной стенки YlPirl.

3.4. Конструкция вектора для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью N-домена предполагаемого гликопротеина клеточной стенки YALI0C09031p.

3.5. Создание векторов для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки.

4. Методы генетической трансформации дрожжей.

5. Микроскопия штамма с экспонированным на поверхности клеточной стенки красным флуоресцентным белком.

6. Ферментация штаммов, продуцирующих липазу.

7. Измерение липазной активности.

8. Определение термостабильности свободной и иммобилизованной на клетках липазы.

9. Получение клеток-биокатализаторов и изучение стабильности закреплённой на их поверхности липазы.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Экспонирование красного флуоресцентного белка TurboFP635 на поверхности клеток дрожжей Y. lipolyt1ca.

2. Получение штамма-продуцента секретируемой липазы Lip2.

3. Экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей

Y. lipolytica с помощью N-концевого способа закрепления.

3.1. Скрининг полученных трансформантов.

3.2. Ферментация отобранных штаммов.

4. экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей

Y. lipolytica с помощью С-доменов белков клеточной стенки.

4.1. Скрининг полученных трансформантов.

4.2. Ферментация отобранных штаммов.

5. Изучение термостабильности клеточно-связанной липазы.

6. Получение клеток-биокатализаторов и изучение стабильности закреплённой на их поверхности липазы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка эффективных систем экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica для создания продуцента клеточно-связанной липазы»

1. Актуальность темы

В век высоких технологий человечество стремится заменить энергоёмкие и вредные для окружающей среды производства процессами, использующими потенциал природы. В то время как человечество делает свои первые шаги, создавая наноматериалы, живая клетка уже давно имеет их в ассортименте. Белки — природные молекулы нанометровой величины, которые выполняют в клетке все необходимые функции, начиная от структурной и заканчивая транспортной и каталитической.

Всё большее число современных производителей переходит на использование ферментов в качестве катализаторов, имеющих ряд преимуществ по сравнению с химическим синтезом. Ферментативные реакции отличаются стереоспецифичностыо, не требуют высоких температур, и, что более важно, не образуют не встречающихся в природе вредных побочных продуктов - ксенобиотиков.

Однако производство ферментных препаратов представляет собой сложный процесс, включающий дорогостоящий этап очистки. Для возможности оптимизации свойств и повторного использования ферменты часто наносят на специальные носители (иммобилизация ферментов), что является одним из вариантов использования иммобилизованных на носителях белков.

В научной и прикладной литературе в последнее время все большее внимание привлекает к себе перспектива закрепления белков на поверхности клеток микроорганизмов (Lee et al. 2003). Иммобилизация ферментов in vivo имеет ряд преимуществ по сравнению с иммобилизацией на сорбентах. Фермент, продуцируемый клеткой, оказывается связанным с ней сразу после транспортировки его наружу, что сводит трудоемкий процесс очистки белка к простому отделению клеток фильтрацией. Более того, отпадает необходимость как в связывании фермента с сорбентом, так и в сорбенте как таковом. Таким образом, получение клеток-биокатализаторов с экспонированными на поверхности клеток ферментами открывает перспективу новых технологических решений для производственных нужд.

Помимо этого, необходимо отметить, что in vivo иммобилизация представляет собой интерес не только для создания клеточных биокатализаторов с закреплёнными на поверхности ферментами. Во-первых, на поверхности клетки рационально вести процессы биотрансформации, особенно если субстрат или продукт реакции являются токсичными* для клетки. Во-вторых, можно моделировать проведение нескольких последовательных реакций, закрепив на клетке катализирующие их ферменты. В-третьих, взаимодействие белков на поверхности клеточной стенки происходит в пределах тонкого слоя, что предоставляет возможность сборки полимерных белковых структур образующих мономолекулярный слой. Так как, полифункциональность белковых молекул позволяет им взаимодействовать с молекулами как биологического, так и синтетического происхождения, разумно предположить, что дальнейшее развитие данного направления исследований позволит использовать клеточную стенку в качестве платформы для сборки надмолекулярных полимерных структур разнообразной химической природы.

Исходя из этого, перед нами была поставлена задача, заключающаяся в поиске подходов для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки микроорганизмов. В качестве перспективного объекта нами были выбраны дрожжи Yarrowia lipolytica, как реципиент с высоким потенциалом экспрессии и секреции рекомбинантных белков, в качестве модельного белка липаза Y. lipolytica Lip2.

2. Цели и задачи работы

Данная работа посвящена разработке систем для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Анализ генома дрожжей Y. lipolytica для выявления ранее не охарактеризованных предполагаемых белков клеточной стенки, пригодных для экспонирования белков на поверхности клетки.

2. Изучение способности ранее охарактеризованного белка клеточной стенки Y. lipolytica YIP ir 1 закреплять белки на поверхности клетки на примере красного флуоресцентного белка.

3. Изучение основных способов экспонирования белков на поверхности клеточной стенки для in vivo иммобилизации липазы Y. lipolytica Lip2. Сравнение способности раннее охарактеризованных и найденных предполагаемых белков клеточной стенки закреплять липазу на поверхности клеток дрожжей.

4. Изучение свойств клеточно-связанной липазы.

5. Получение штаммов-продуцентов клеточно-связанной липазы.

3. Научная новизна

В работе разработаны подходы для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica. Посредством анализа генома найден ряд новых предполагаемых белков клеточной стенки. Было показано, что добавление их аминокислотной последовательности к аминокислотной последовательности экспрессируемого белка приводит к эффективному закреплению полученного рекомбинантного комплекса на поверхности клетки. В качестве модельного белка для иммобилизации был выбран фермент липаза. До настоящего времени множество попыток получить клеточно-связанную липазу как в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, так и в Pichia pastoris приводили к созданию штаммов с очень низкой активностью иммобилизованного фермента (Liu et al. 2010b; Suet al. 2010).

В представленной работе были изучены два» основных способа экспонированиям липазы. В первом случае закрепление осуществлялось с помощью С-концевых участков (доменов) белков клеточной стенки, обладающих сигналом прикрепления гликозилфосфатидилинозитола (GPI), что обусловливает ковалентное связывание с р-1,6-гликанами клеточной стенки (Kapteyn et al. 1999). Были проанализированы С-домены шести новых предполагаемых белков клеточной стенки, а также ранее охарактеризованного белка YlcwpT (Jaafar and Zueco 2004) на' способность экспонировать липазу Lip2 на- поверхности клетки. Второй способ — присоединение белка клеточной стенки или его N-домена к N-концу фермента. Белок YIPirl, который связывается через дисульфидные мостики с гликопротеинами клеточной стенки (Jaafar et al. 2003), а также N-домен потенциального гликопротеина YALI0C09031p, участвующего в адгезии, впервые были использованы для изучения второго способа экспонирования липазы. Следует отметить, что- проведённое исследование позволило выбрать лучшую систему для микробиологической иммобилизации in vivo. Полученные штаммы обладают высокой активностью клеточно-связанной липазы, варьирующей от 3200 до* 18800 ед/г сухого веса, в зависимости от используемой для иммобилизации* аминокислотной последовательности белков клеточной стенки.

4. Практическая значимость 4 Иммобилизация ферментов на поверхности клеток микроорганизмов является одним из приоритетных направлений современной биотехнологии.

Данный способ закрепления фермента обладает всеми преимуществами стандартной иммобилизации на носителях — возможность повторного использования, в ряде случаев повышенная термостабильность фермента. Однако экспонирование на поверхности клеточной стенки является природным вариантом иммобилизации, при этом отпадает наиболее затратные стадии в производстве ферментных препаратов — очистка фермента и связывание его с сорбентом. Сама клетка выступает в данном случае в качестве носителя, поэтому приготовление препарата с иммобилизованным ферментом сводится только к отделению клеток фильтрацией после ферментации и (или) лиофилизации.

Липаза - фермент, относящийся к классу гидролаз, катализирует расщепление сложноэфирных связей в липидах. Чаще всего липазы используются для гидролиза молекулы« триацилглицеридов с образованием диглицеридов, моноглицеридов, жирных кислот и глицерина. Помимо этого, липаза способна катализировать.этерификацию и переэтерификацию. Такая многофункциональность делает липазу ; весьма привлекательной для практического использования в пищевой, фармацевтической, кожевенной, текстильной, косметической промышленностях, в производстве ПАВ и бумаги и других отраслях промышленности (Рапёеу & а1. 1999).

Закрепление такого промышленно-важного фермента как липаза на поверхности клеточной стенки дрожжей является актуальным направлением в современной биотехнологии. Однако, несмотря на большой интерес получения подобных клеток-биокатализаторов, достигаемые в настоящий момент уровни активности клеточно-связанной липазы недостаточно высоки для их промышленного применения.

В представленной работе разработаны системы, для эффективного экспонирования липазы 1лр2 на поверхности клеточной стенки дрожжей У. Иро1уйса. Получены штаммы, наибольшая активность клеточно-связанной липазы у которых составляет 18800 ед/г сухого веса, что соответствует экспонированию 1,2 х 106 молекул на поверхности каждой клетки. Достигнутые уровни сопоставимы с уровнем продукции секретируемого фермента штаммом-продуцентом липазы (примерно 0,1 г/л при ферментации в пробирках) (Синеокий и др. 2007) и в 70 раз превышают лучшие ранее опубликованные результаты (Tanino et al. 2009; Liu et al. 2010b; Su et al. 2010). Клеточно-связанная липаза обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма фермента. Так, иммобилизованная на поверхности клеток липаза сохраняет 57% активности при инкубации на протяжении 6 часов при 45°С, а свободная липаза полностью теряет каталитическую активность в этих условиях. Полученные клетки-биокатализаторы с экспонированной на поверхности липазой сохраняют 86-98% активности после трёх повторных раундов использования, что в разы превосходит уровень остаточной активности фермента, иммобилизованного на сорбентах (Alloue et al. 2008).

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Генетика», Юзбашева, Евгения Юрьевна

VI. выводы

Из проделанной работы можно сделать следующие выводы:

1. В дрожжах У. Иро1уИса на примере липазы 1лр2 разработаны основные способы экспонирования белков на поверхности клетки - Ы-концевой способ иммобилизации и прикрепление с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки.

2. Выявлены ранее не охарактеризованные белки клеточной стенки, аминокислотные последовательности которых были успешно использованы для экспозиции липазы на поверхности клеток.

3. Было показано, что все изучаемые фрагменты белков клеточной стенки способны закреплять липазу на поверхности клеток. Однако разные белки клеточной стенки позволяют получить разные наблюдаемые активности клеточно-связанного фермента.

4. Было продемонстрировано, что липаза, иммобилизованная на поверхности клеток с помощью К- и С-концевого способов закрепления, обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма.

5. Впервые были получены штаммы-продуценты клеточно-связанной липазы, продуктивность которых сравнима с продуктивностью промышленно-значимых штаммов У. \ipolytica продуцентов секретируемой формы липазы.

У. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В представленной работе на примере липазы Lip2 были изучены принципиально возможные варианты * экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica. В качестве модельного белка была выбрана липаза, как, во-первых, высоко значимый фермент в промышленности и, во-вторых, фермент, активный центр которого расположен на С-конце молекулы, что значительно затрудняет использование наиболее изученного способа in vivo иммобилизации с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки. Следует отметить, что до настоящего момента не было получено штаммов с высокой активностью клеточно-связанной липазы (Su et al. 2010; Liu et al. 2010b).

Для N-концевого способа in vivo иммобилизации были выбраны аминокислотные последовательности белка клеточной стенки YlPirl (Jaafar et al. 2003) и N-домена выявленного гликопротеина клеточной стенки

YALI0C09031p, участвующего в процессе адгезии. Были получены i рекомбинантные белковые комплексы, в которых липаза Lip2 своим

N-концом присоединена к С-концам белка YlPirl и N-домена

YALI0C09031р. Наибольшая наблюдаемая активность клеточно-связанной липазы, закреплённой на поверхности клеток с помощью YlPirl и N-домена гликопротеина YALI0C09031р, составляла 17200 и 9200 ед/г сухого веса, соответственно.

Для изучения С-концевого способа in vivo иммобилизации сравнивали С-домены охарактеризованного гликопротеина клеточной стенки Ylcwpl (Jaafar and Zueco 2004) и шести новых выявленных белков Ylcwp2, Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5, Ylcwpó и YALI0C09031p. Были получены рекомбинантные белковые комплексы, состоящие из липазы, к С-концу которой присоединены своим N-концом С-домены изучаемых гликопротеинов клеточной стенки. Для разделения функциональных полипептидов в иммобилизованном ферменте (липазы и С-домена) использовали аминокислотный глицин-сериновый мотив (Washida et al. 2001). В зависимости от используемого белка клеточной стенки наибольшие активности клеточно-связанной липазы варьировали от 3200 ед/г сухого веса (при закреплении с помощью С-домена YALI0C09031p) до 18800 ед/г сухого веса (при экспозиции с помощью С-домена Ylcwp3). Лучшими вариантами для in vivo иммобилизации липазы оказались С-домены гликопротеинов Ylcwpl, Ylcwp3 и Ylcwpó, позволившие получить клеточно-связанный фермент с наибольшей наблюдаемой активностью.

Сравнение термостабильности клеточно-связанной липазы, иммобилизованной как N-, так и С-концевым способами, со свободной формой фермента показало, что экспонирование на поверхности клеточной стенки значительно повышает данное свойство. После 6 часов инкубации при 45°С клеточно-связанная липаза сохраняет 57% от начальной активности, тогда как секретируемый фермент полностью теряет свою каталитическую активность.

Липазная активность, ассоциированная с клетками, сохраняется на прежнем уровне после процесса лиофилизации клеток. Полученные таким образом клетки могут быть повторно использованы в качестве клеточных биокатализаторов. Было показано, что после трёх раундов использования данных клеток-биокатализаторов для процесса гидролиза остаётся 86-98% активности фермента. По литературным данным известно, что в аналогичных условиях липаза, иммобилизованная на нерастворимых носителях, сохраняет только 30-35% от начального уровня активности.

Таким образом, в работе было продемонстрировано, что оба способа иммобилизации (N- и С-концевые) могут быть эффективно использованы для экспонирования липазы на поверхности клеток Y. lipolytica. Однако наибольшие наблюдаемые значения активности клеточно-связанного фермента варьировали в зависимости от используемого белка клеточной стенки. Продуктивность штаммов, в которых липаза закреплена на поверхности клеточной стенки с помощью белка YlPirl и С-доменов Ylcwpl,

У1с\урЗ и У1слур6, сравнима с продуктивностью отечественного и мирового штаммов-продуцентов секретируемой липазы на базе дрожжей V. Иро1уйса (Синеокий и др. 2007; №саис1 е! а1. 2002). Повышенная термостабильность и высокая активность клеточно-связанной липазы, а также возможность эффективно повторно использовать полученные клеточные биокатализаторы открывают перспективы для промышленного использования данных штаммов и разработки новых технологических подходов на их основе.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Юзбашева, Евгения Юрьевна, 2011 год

1. Bankar AV, Kumar. All, Zinjarde SS (2009)- Environmental and industrial applications of Yarrowialipolytica. Appl Microbiol- Biotechnol 84 (5):847-' : 865

2. Barth G, Gaillardin C (1997) Physiology and; genetics of the dimorphic fungus

3. Yarrowia lipolytica. EEMSiMicrobibl Rev 19 (4):219-237 Bidard F, Bony M,. Blondin B, Dequin S, Barre P (1995)= The Saccharomyces cerevisiaeFL0I flbccuLatiomgene:encodes:-fdr. a cell?surface^protein: Yeast 11 (9):809-822 , •

4. Hanefeld U, Gardossi L, Magner E (2009) Understanding enzyme immobilisation.

5. Chem Soc Rev 38 (2):453-468 Hardwick KG, Boothroyd JC, Rudner AD, Pelham HR (1992) Genes that allow yeast cells to grow in the absence of the HDEL receptor. Embo J 11 (11):4187-4195

6. Hernandez-Martin E, Otero C (2008) Different enzyme requirements for the synthesis of biodiesel: Novozym 435 and Lipozyme TL IM. Bioresour Technol 99 (2):277-286 ,

7. Kapteyn JC, Van Den Ende H, Klis FM (1999) The contribution of cell wall proteins to the organization of the yeast cell wall. Biochim Biophys Acta 1426 (2):373-383

8. Klis FM (1994) Review: cell wall assembly in yeast. Yeast 10 (7):851-869

9. Kopecny D, Pethe C, Sebela M, Houba-Herin N, Madzak C, Majira A, Laloue M (2005) High-level expression and characterization- of Zea mays cytokinin oxidase/dehydrogenase in Yarrowia lipolytica. Biochimie 87 (11): 10111022

10. CF, Kurjan J, Lipke PN (1994) A pathway for cell wall anchorage of Saccharomyces cerevisiae alpha-agglutinin. Mol Cell Biol 14 (7):4825-4833

11. Madzak C, Gaillardin C, Beckerich JM (2004) Heterologous protein expression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica: a review. J Biotechnol 109 (l-2):63-81

12. Murai T, Ueda M, Kawaguchi T, Arai M, Tanaka A (1998) Assimilation of cellooligosaccharides by a cell surface-engineered yeast expressing beta-glucosidase and carboxymethylcellulase from aspergillus aculeatus. Appl Environ Microbiol 64 (12):4857-4861

13. Pignede G, Wang H, Eudalej F, Gaillardin C, Seman M, Nicaud JM (2000) Characterization of an extracellular lipase encoded by LIP2 in Yarrowia lipolytica. J Bacteriol 182 (10):2802-2810 • v

14. Ramon AM, Montero M, Sentandreu R, Valentin E (1999) Yarrowia lipolytica cell wall« architecture: interaction of Ywpl, a mycelial protein; with other wall components and the effect of its depletion. Res Microbiol 150 (2):95-103«

15. SubcellBiochem<26:165-185 Sambrook J, Maniatis T, Fritsch E (1989) Molecular cloning: a laboratory manual.