Получение в E. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Алексеев, Тимофей Александрович

• Алексеев, Тимофей Александрович
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алексеев, Тимофей Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Использование ЯМР спектроскопии на различных ядрах

1.2. Биосинтез белков, содержащих фтораминокислоты

1.3. I9F ЯМР исследования белков, содержащих остатки фторароматических аминокислот

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Экстрацеллюлярный фрагмент а-субъединицы Torpedo californica а(1 -209) и его мутант [Trp60Phe]-a( 1-209)

2.2. Фторсодержащие аналоги экстрацеллюлярного фрагмента а-субъединицы Torpedo californica a(l-209)F и его мутанта [Trp60Phe]-a(l-209)F

2.3. Две формы экстрацеллюлярного домена а-субъединицы мышечного АХР человека

2.4. Экстрацеллюлярный фрагмент а7-субъединицы крысы а7(7-208) и его мутант [Cysl 16Ser, Cysl90Ser, Cysl91Ser]-a(l-209)

2.5. Цитоплазматический фрагмент 6-субъединицы Torpedo californica 8(313-455)

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение в E. coli, ренатурация и исследование внемембранных доменов холинорецепторов»

Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы являются лиганд-управляемыми каналами и подразделяются на две основные группы: рецепторы мышечного типа и нейрональные. Выводы о пространственной организации всего класса АХР до недавнего времени в значительной мере основывались на данных криоэлектронной микроскопии АХР мышечного типа, выделяемого в значительных количествах из электрического органа ската Torpedo californica [1]. Установлено, что субъединицы этого рецептора (две а- и по одной р-, у- и 8- субъединице) образуют пентамерный комплекс, вдоль оси которого располагается пронизывающий мембрану ионный канал (см. обзор [2]). Согласно существующим представлениям, каждая субъединица имеет экстрацеллюлярный домен, трансмембранный участок, а также цитоплазматический домен. К настоящему времени получена информация о форме трансмембранных фрагментов, выстилающих канал, а также об элементах вторичной и третичной структуры экстрацеллюлярного домена. Установление пространственной структуры более высокого разрешения с помощью РСА натолкнулось на трудности получения кристаллов цельного рецептора. В связи с этим представляется целесообразным провести вначале детальный структурный анализ отдельных функциональных доменов АХР.

В экстрацеллюлярном домене АХР происходит связывание ацетилхолина, а также различных других агонистов и антагонистов. Следует отметить, что экстрацеллюлярный домен а-субъединиц (или их фрагменты) были достаточно давно получены с помощью гетерологичной экспрессии в Escherichia coli, как правило, в виде тел включения. Изучение пространственных и функциональных характеристик этих белков требовало проведения их ренатурации. С помощью спектроскопии КД в ряде зарубежных лабораторий, а также в нашем институте была определена вторичная структура белков, отвечающих экстрацеллюлярному домену а-субъединиц мышечного АХР мыши и рецептора Т. calif ornica, изучено ' связывание этими доменами токсинов и моноклональных антител. При этом стало очевидно проведения оптимизации условий сборки белка, предотвращения образования агрегатов при достижении достаточно высоких концентраций белка, при которых возможно изучение пространственной структуры методом РСА или ЯМР.

Каждая субъединица АХР содержит достаточно протяженную цитоплазматическую петлю (100-150 аминокислотных остатков) между третьим и четвертым трансмембранными фрагментами. Цитоплазматическая петля играет большую роль в функционировании рецептора. Фосфорилирование внутриклеточного домена вызывает увеличение скорости десенситизации рецептора.

В связи с этим, нами были поставлены задачи разработать условия экспрессии внемембранных (экстрацеллюлярных и цитоплазматических) доменов субъединиц никотинового ацетилхолинового рецептора с последующей ренатурацией очищенных продуктов и изучения физико-химических свойств доменов. В качестве объектов исследования мы выбрали экстрацеллюлярные домены мышечного АХР а-субъединиц Torpedo и человека, а также экстрацеллюлярного домена нейронального АХР крысы. Помимо этих доменов, мы исследовали также домен, отвечающий цитоплазматической петле 8-субъединицы Torpedo. Структура цитоплазматической петли 5-субъединицы до сих пор мало изучена, поэтому одной из задач этой работы является также экспрессия и ренатурация цитоплазматического домена 5-субъединицы рецептора Torpedo с целью анализа вторичной структуры и проверки способности к фосфорилированию.

Мы решили получить фторсодержащие белки для исследования возможности применения 19Р-ЯМР для контроля процесса ренатурации и для изучения топографии лиганд-связывающих участков. Эктрацеллюлярный домен al АХР из мышц человека попытались использовать для определения уровня аутоантител у больных миастенией.

Большое значение имеют и нейрональные АХР. В частности, а7 АХР - одна из наиболее представленных в мозгу АХР. Нарушения в функционировании этого типа рецептора сопровождают ряд нейродегенеративных заболеваний, таких, например, как болезнь Альцгеймера. Отличительной чертой а7-субъединиц АХР является их способность образовывать пентамеры. Подобно рецептору Torpedo, a7 АХР с высоким сродством связывает a-бунгаротокин. Поэтому в рамках настоящей работы планировали экспрессировать в E.coli домена а7-субъединицы и изучить его свойства.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Получение белков, содержащих фторированные ароматические аминокислоты, и их исследование методом 19F ЯМР спектроскопии

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Алексеев, Тимофей Александрович

ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия продукции в E.coli внеклеточного N-концевого и цитоплазматического доменов мышечных и нейрональных холинорецепторов, а также последующего получения ренатурированных водорастворимых форм, пригодных для спектральных и функциональных исследований.

2. Получен N-концевой лиганд-связывающий домен (остатки 1-209) а-субъединицы ацетилхолинового рецептора Torpedo californica, показано его взаимодействие с а-нейротоксинами и моноклональными антителами против интактного рецептора.

3. Путем выращивания клеток E.coli на среде с 5-фтортриптофаном получен домен 1-209 а-субъединицы Torpedo, в котором включение Trp(5F) составило 50%. Проведено частичное отнесение сигналов в спектре 19Р-ЯМР с использованием мутанта Trp60Phe. Показано, что |9Р-ЯМР является удобным методом контроля при оптимизации условий рефолдинга.

4. В виде растворимого олигомера получен цитоплазматический домен (остатки 313-455) 5-субъединицы холинорецептора Torpedo californica и показана его способность фосфорилироваться протеинкиназой А. Установлено, что фосфорилирование не сопровождается существенными изменениями во вторичной структуре домена.

5. Для склонного к агрегации внеклеточного домена а7-субъединицы нейронального холинорецептора крысы найдены условия рефолдинга, приводящие к растворимым олигомерным формам.

6. Получена экспрессия в E.coli различных форм N-концевого домена а-субъединицы мышечного холинорецептора человека и показана возможность использования этих белков для определения уровня аутоантител у больных миастенией.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Суммируя полученные результаты, можно отметить целесообразность работы с доменами рецепторов. Конечно, на этом пути встречаются определенные трудности, особенно, агрегация белков. В случае "удачного" домена можно получить хорошие характеристики, например, информация о рецепторах цитокинов, ростовых факторов получена в основном при работе с экстрацеллюлярными доменами. Для G-зависимых белков много данных было получено при исследовании функций внутриклеточных петель, полученных гетерологической экспрессией.

Для экстрацеллюлярного домена a-субъединицы Torpedo californica. были получены удовлетворительные результаты по связыванию нейротоксинов и вытеснению низкомолекулярных лигандов. Менее успешные результаты в работе с доменом а7-субъединицы можно объяснить ее повышенной склонностью к агрегации. Наличие в литературе характеристик гомологичного ацетилхолин-связывающего белка позволило сопоставить полученные результаты для фрагмента а7-субъединицы.

Влияние природы белка на результат ренатурации хорошо видно из сопоставления а7(7-208) и 6(313-455). То, что оказалось приемлемым для цитоплазматической петли (КС1 в буфере) не подошло для а7(7-208), где основная масса белка выпадала на колонке, а то что выходило - соответствовало высокополимерной области (более 500000 Да).

Получение 6(313-455) в.водном буфере и не агрегированном состоянии сдело возможным проведение фосфорилирования; следовательно, белок, присутствующий в виде димера, несет на поверхности сайты фосфорилирования, доступные для протеинкиназ. Так, были локализованы сайты фосфорилирования: Ser 361 и Ser 362. Также зафиксировали фосфорилирование в лидерной последовательности белка. Фосфорилирование тирозинкиназой было менее эффективно.

Подобие КД-спектров фосфорилированной и нефосфорилированной форм свидетельствует, что фосфорилирование не вызвало глобальных изменений во вторичной структуре белка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Клонирование кДНК, соответствующей N-концевому домену (аминокислотные остатки 1-209) а-субъединицы ацетилхолинового рецептора Т. californica.

1) Экстрацеллюлярный фрагмент а-субъединицы Torpedo californica а( 1-209)

Соответствующий фрагмент кДНК получали методом ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК полноразмерной а-субъединицы. Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера (5'-»3'): АА AAA GGA ТСС GAA CAT GAA АСА CGT (прямой) AAA AAA AGC ТТА ACG CTG CAT GAT TTT (обратный).

Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами BamHVHindlU (сайты подчеркнуты) и лигировали в плазмидный вектор pQE30 (QIagen), обработанный соответствующими ферментами рестрикции. Полученной рекомбинантной плазмидой трансфецировали NovaBlue клетки, затем отбирали клоны, несущие искомую вставку, и полученной плазмидой (а(1-209) pQE) трансфецировали клетки AD494 и/или М15.

2) Экстрацеллюлярный фрагмент а7-субъединицы крысы а7(7-208) Соответствующий фрагмент кДНК получали методом ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК полноразмерной а-субъединицы. Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера (5'—>3'):

AAA AAG GAT ССС CTG ТАС AAG GAG CTG AAA AAA AGC TTA TGT CCT ACG GCG CAT

Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК обрабатывали рестриктазами BamHl/Hindlll (сайты подчеркнуты) и лигировали в плазмидный вектор pQE31 (QIagen), обработанный соответствующими ферментами рестрикции. Полученной рекомбинантной плазмидой трансфецировали NovaBlue клетки, затем отбирали клоны, несущие искомую вставку, и полученной плазмидой (а7(7-208) pQE) трансфецировали клетки Ml 5.

Мутагенез.

1) Экстрацеллюлярный фрагмент а-субъединицы Torpedo californica а(1-209)

Замену остатка Тгр на Phe в 60-положении проводили методом ПЦР, используя в качестве матрицы вектор a(l-209)pQE. Последовательности мутагенных праймеров содержат рестриктный сайт С1а\ (подчеркнуто) (5'-»3'): GG CAG САА ТТТ АТС GAT GTG AGG СТТ CGC (прямой),

GCG AAG CCT CAC АТС GAT AAA TTG CTG CC (обратный).

Праймеры содержат замены нуклеотидов: вместо триплета TGG, кодирующего ТгрбО находится последовательность ТТТ (Phe) (прямой праймер) и, соответственно, вместо ССА последовательность AAA (обратный праймер). В качестве фланкирующих использовали те же праймеры, что и для получения немутантного рекомбинантного белка. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК лигировали в плазмидный вектор pQE30 по рестриктным сайтам BamRUHindlll. Последовательности полученных клонированных фрагментов были определены по методу Сенгера. Клонирование и мутагенез проводили в клетках E.coli штамма NovaBlue.

2) Экстрацеллюлярный фрагмент а7-субъединицы крысы а7(7-208)

Замену остатка Cys на Ser в 116, 190, 191-положениях проводили методом ПЦР в два этапа. На первой стадии получили фрагмент кДНК, отвечающий замене в а7-субъеденице остатка Cys на Ser в 116 положении, используя для этих целей следующие мутагенные праймеры (5'—>3'): GGG CAT AGC CAG TAT CTC (прямой), GAG ATA CTG GCT ATG CCC (обратный).

Праймеры содержат замены нуклеотидов: вместо триплета TGC, кодирующего Cysl 16 находится последовательность AGC (Ser) (прямой праймер) и, соответственно, вместо GCA последовательность GCT (обратный праймер). В качестве фланкирующих использовали те же праймеры, что и для получения немутантного рекомбинантного белка.

На второй стадии, используя в качестве матрицы полученный ранее фрагмент кДНК, получили фрагмент кДНК, отвечающий замене в а7-субъеденице остатка Cys на Ser в 190 и 191 положениях, используя для этих целей следующие мутагенные праймеры (5'->3'):

ТС TAT GAG AGC ТСС AAA GAG СС (прямой), GG CTC ТТТ GGAGCTCTC ATA GA (обратный).

Праймеры содержат замены нуклеотидов: вместо двух триплетов TGCTGC, кодирующих Cysl90/191 находится последовательность AGCTCC (Ser) (прямой праймер) и, соответственно, вместо GCAGCA последовательность GGAGCT (обратный праймер). В результате, проведенных замен, появился сайт рестрикции SacI (подчеркнут). В качестве фланкирующих использовали те же праймеры, что и для получения немутантного рекомбинантного белка. Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК лигировали в плазмидный вектор pQE31 по рестриктным сайтам ВатЯУНтсПЕ.

Последовательности полученных клонированных фрагментов были определены по методу Сенгера. Клонирование и мутагенез проводили в клетках E.coli штамма NovaBlue.

Получение фторированных белков.

Клетки E.coli AD494, содержащие соответствующую рекомбинантную плазмиду, выращивали в среде LB до оптического плотности ОБбоо = 1. Полученную биомассу центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин и осадок два раза промывали средой М9. Клетки суспендировали в М9 до оптической плотности OD воо = 1, затем добавляли (из расчета на 200 мл клеточной суспензии) 20 мг 5Р-триптофана до конечной концентрацией 100 мкМ, 0.1 мг (100 мкл р-ра 1 мг/мл) биотина и тиамина. Выращивали 15 мин при 37°С, затем вносили IPTG до 0.2 мМ, и еще через 4 ч центрифугировали.

Выделение тел включения.

Осадок клеток, полученный при выращиваниии в 200 мл среды, суспендировали в 4 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 1мМ EDTA), добавляли 1 мг лизоцима (100 мкл раствора 10 мг/мл), выдерживали 30 мин на льду, затем инкубировали 30 мин при 37°С с 4 мг дезоксихолевой кислоты (суспензия в 1 мл воды) и еще 10 мин с MgCb (конечная концентрация 20 мМ) и 20 мкг ДНК-азы. К полученной суспензии добавляли 20 мл буфера А1 (10 мМ Трис-HCl, рН 8.0) и обрабатывали ультразвуком (6 имп. по 20 с). Центрифугировали 10 мин при 10 000 об/мин и осадок промывали 20 мл буфера А1.

Аффинная хроматография на Ni-NTA-агарозе.

Отмытые тела включений (5 мг) растворяли в 10 мл буфера А2 (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 0.2М NaCl, 5 мМ имидазол, 8М мочевина) и наносили на 2 мл Ni-NTA-агарозы, уравновешенной в том же буфере. Промывали 10 мл буфера А2, а затем специфически связанный белок смывали ступенчато возрастающей концентрацией имидазола в буфере А2 (концентрацию имидазола повышали с шагом 20 мМ).

Ренатурация белка с помощью медленного диализа.

Раствор белка, после очистки на Ni-NTA-агарозе, обрабатывали 100 мМ DTT в течение ночи при комнатной температуре. Затем ступенчато диализовали образец против буфера A3 (50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 1мМ EDTA), содержащего мочевину в следующих концентрациях: 7,6,5,4,3,2,1,0 М. Длительность каждой стадии составляла 2 ч.

Ренатурация белка с использованием тетрадецилтриметиаммонийбромида и а-циклодекстрина Г2111.

Раствор белка (10 мг/мл) в буфере А4 (50 мМ NaH2P04, рН 8.5, 6 М GuHCl) обрабатывали 30 мМ DTT в течение 24 ч при комнатной температуре. 5 мкл этого раствора добавляли, при быстром перемешивании, к 0.87 мл буфера, содержащего 143 мМ Трис-сульфат, рН 8.5, 1.43 мМ EDTA, 4 мМ GSH, 4 мМ GSSG, 4 мМ тетрадецилтриметиаммонийбромида. Через 10 мин добавили 0.375 мл 55 мМ а-циклодекстрина. Полученную смесь оставляли при 28 °С в течение ночи.

Ренатурация белков a(l-209)F и fTrp60Phe"|-a(l-209)F в присутствии SDS.

Образцы белков (1.0 мг/мл) в 5 мл буфера (50 мМ трис-HCl, рН 8.0) диализовали против 50 мМ Трис-HCl, рН 9.5, содержащего 8М мочевину, затем добавляли дитиотреит до конечной концентрации 100 мМ и инкубировали 10 ч при 20 °С. После этого раствор медленно по каплям при постоянном помешивании вносили в 50 мл 50 мМ Трис-НС1-буфера, рН 8.0, содержащего 0.05% SDS, и оставляли на 20 ч при 7°С. Раствор белка концентрировали ультрафильтрацией на мембране UM10 и затем подвергали диализу против 20 мМ трис-HCl, рН 8.0 с 0.05% SDS.

Аналитическая ВЭЖХ.

Обращенно-фазовую ВЭЖХ проводили на хроматографе System Gold (Beckman, Fullerton, USA), используя колонки Nucleosil 300-7 Protein PR и, Nucleosil 300-5 C4 MPN (4 X 125 мм, Macherey-Nagel, Duren, Germany) в градиенте ацетонитрила, содержащего 0.1% трифторуксусную кислоту.

Гельфильтрационную хроматографию проводили, используя Superdex-200 колонку (8 X 1000 мм, Pharmacia) в 20 мМ трис-HCl, рН 8.0 буфере. Наличие мочевины или детергентов в буфере оговаривается особо.

Определение концентрации белка.

Определение концентрации проводили двумя способами: а) окрашивание белков по методу Брэтфорда; б) поглощение при 280 нм, используя S280 60868 М ' см'1 для а(1-209) и a(l-209)F, е28о 16500 M'W1 для 5(313-455), е28о 43460 M"W для НЕ и HR, е28о 62760 М'см*1 для а7(7-208) и a7(7-208)Mut рассчитанные на основании аминокислотного состава белков.

Радиолигандный анализ взаимодействия экстрацеллюлярных доменов с а-нейротоксинами .

К растворам белков (концентрация 500 нМ) в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 8.0 добавляли [l25I]aBgt в том же буфере до конечной концентрации 50-2000 нМ и инкубировали 1 ч при 30 °С. Растворы белка, которые содержали 0.05% SDS, перед проведением радиолигандного анализа разбавляли водным буфером так, что конечная концентрация SDS не превышала 0.001% и не оказывала влияния на связывание. Неспецифическое связывание определяли, добавлением в инкубационную смесь 1000-кратного избытка немеченного a-Bgt (Sigma). Далее смесь наносили на фильтры DE-81, которые затем промывали тем же буфером в присутствии 0.1% Triton Х-100, высушивали на воздухе и измеряли их радиоактивность на у-счетчике.

9Р-ЯМР-исследования.

Одномерные спектры 19Р-ЯМР получены на спектрометре Avance DRX 500 (Bruker, Германия) с рабочей частотой на ядрах фтора 470.56 МГц без развязки спин-спинового взаимодействия 19F-'H при температуре 30 С Для восстановления равновесного состояния системы ядерных спинов была использована задержка ~ di 2.0 с. Данные ЯМР обрабатывали с помощью стандартного программного обеспечения XWINNMR 2.6 (Bruker). Концентрации белков в растворах для снятия спектров лежали в диапазоне 1.53.5 мг/мл.

MALDI масс-спектрометрия.

Определение проводили на Reflex MALDI-TOF масс-спектрометре (Bruker, Bremen, Germany). Образцы белков переводили в 0.1 % TFA с помощью гельфильтрации на Sephadex-25. Для проведения триптического гидролиза образцы лиофилизировали и затем растворяли в буфере, содержащий трипсин, с последующей съемкой.

КД спектроскопия.

Съемку спектров проводили при 22 °С, используя спектрополяриметр Jasco Model J-500C (Japan Spectroscopic Co., Tokyo, Japan). Скорость сканирования составила 5 nm min"1, время отклика - 4 с и диапазон сканирования от 190 до 240 шп. Аппарат откалибровали с помощью (+)-10-камфорсульфоновой кислоты. Концентрация белков была в диапазоне от 0.2 до 1.5 мг/мл и длина кюветы 0.1 или 0.5 мм, в зависимости от концентрации белка. Вторичную структуру расчитывали на основании данных КД, используя программу CONTIN.

Электрофорез в SDS-ПААГ

Диск-электрофорез в вертикальных пластинках проводили в буферной системе Laemli на приборах Midget (LKB, Швеция) или SE600 (Hoefer Scientific Instruments, США) согласно рекомендациям изготовителей. Если не указано особо, то использовали восстанавливающие условия. Для всех белков использовали разделяющий гель, содержащий 10% акриламида и 1.5% бисакриламида. Белковые полосы окрашивали красителем Кумасси бриллиантовый голубой R-250.

Флуоресцентная спектроскопия

Спектры флуоресценции регистрировали на спектрофлюорометре модели MPF-3 (Hitachi Instruments, Япония). Спектральная ширина щели возбуждения составила 3 нм., щели испускания - 5 нм. Длина волны возбуждения - 292 нм.

Фосфорилирование.

Протеин-киназа А. К раствору белка (100 - 300 мкг/мл) в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.4, содержащему 0.2 М КС1, 1.5-2 М 3-(1-пиридино)-1-пропан сульфонат (NDSB-201) (Calbiochem), 10 мМ MgCl2, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ АТФ и следы [32Р]АТФ, добавляли 2-3 ед./мкг белка протеинкиназы А. Реакционную смесь инкубировали 70 ч при 30° С. Фосфорилированный белок выделяли на обращенно-фазовой колонке Vydac С]8 (4.6x250 мм) используя градиент ацетонитрила в воде (0.1% ТФА) от 5 to 45% в течение 40 мин. Полученную фракцию лиофилизировали и использовали в дальнейших исследованиях.

АЫ тирозинкиназа. К 400 мкл раствора белка (200 мкг/мл) в 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.5, 0.2 М КС1 добавили 1/10 по объему 10х АЫ буфера (поставляется с ферментом), 5 мМ АТФ и следы [32Р]АТФ, 500 ед. АЫ тирозинкиназы (New England Biolabs). Реакционную смесь инкубировали 120 ч при 30° С, с добавлением новой порции по 500 ед. АЫ каждые 24 ч. Дальнейшие шаги были идентичны описанным при использовании протеинкиназы А.

Локализация сайтов фосфорилирования.

Гидролиз трипсином. Белок растворяли в 0.1 М аммонийбикарбонатном буфере, содержащем 2.5 М NDSB-195 и добавляли трипсин (в весовом соотношении белок : фермент = 20 : 1) и инкубировали 5 ч при 37° С. Полученные пептиды выделяли на обращенно-фазовой колонке Vydac Cig (4.6x250 мм), используя градиент ацетонитрила в воде (0.1% ТФА) от 2 to 42% в течение 80 мин. Полученные фракции пептидов лиофилизировали и анализировали с помощью MALDI масс-спектрометрии.

Гидролиз эндопротеиназой Glu-C. К 120 мкг белка в 3.4 мл 50 мМ Трис-НС1-буфере, рН 7.5, 0.2 М КС1 добавили раствор Glu-C (12 мкг в 24 мкл). Инкубировали при 25° С в течение ночи. Выделение и анализ пептидов осуществляли как описано выше.

83

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алексеев, Тимофей Александрович, 2005 год

1. Miyazawa A., Fujiyoshi Y., Stowell M., Unwin N. Nicotinic acetylcholine receptor at 4.6 Aresolution: transverse tunnels in the channel wall. J. Mol. Biol. 1999. V.288. N.4. P.765-786.

2. Hucho F., Weise C. Ligand-gated ionchannels. Angew. Chem. Int. Ed. 2001. V.40. P.31003116.

3. Fielding L. NMR methods for the determination of protein-ligand dissociation constants.

4. Curr. Top. Med. Chem. 2003. V.3. N.l. P.39-53.

5. Gonet B. Solving problems fluorine 19F with NMR spectroscopy. Med. Sci. Monit. 2001.1. V.7. N.3. P.489-495.

6. Danielson M.A., Falke J.J. Use of 19F NMR to probe protein structure and conformationalchanges. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 1996. V.25. P.163-195.

7. Oldfield E. Chemical shifts and three-dimensional protein structures. J. Biomol. NMR. 1995.1. V.5.N.3. P.217-225.

8. Gettins P.G. 1H- and 19F-NMR approaches to the study of the structure of proteins largerthan 25 kDa. Int. J. Biol. Macromol. 1994. V.16. N.5. P.227-235.

9. Frieden C., Hoeltzli S.D., Ropson I.J. NMR and protein folding: equilibrium and stoppedflow studies. Protein Sci. 1993. V.2. N.12. P.2007-2014.

10. Jenkins B.G. Detection of site-specific binding and co-binding of ligands to macromoleculesusing 19F NMR. Life Sci. 1991. V.48. N.13. P. 1227-1240.

11. Clore G.M., Gronenborn A.M. NMR structure determination of proteins and proteincomplexes larger than 20 kDa. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998. V.2. N.5. P.564-570.

12. Kalbitzer H.R., Maeda K., Rosch A., Maeda Y., Geyer M., Beneicke W., Neidig K.P.,

13. Wittinghofer A. C-terminal structure and mobility of rabbit skeletal muscle light meromyosin as studied by one- and two-dimensional 1H NMR spectroscopy and X-ray small-angle scattering. Biochemistry. 1991. V.30. P.8083-8091.

14. Oswald R.E., Bogusky M.J., Bamberger M., Smith R.A.G. and Dobson C.M. Dynamics ofthe multidomain fibrinolytic protein urokinase from two-dimensional NMR. Nature. 1989. V.337. P.579-582.

15. Bogusky M.J., Dobson C.M. and Smith R.A. Reversible independent unfolding of thedomains of urokinase monitored by 1H NMR Biochemistry. 1989. V.28. P.6728-6735.

16. Nowak U.K., Li X., Teuten A.J., Smith R.A. and Dobson C.M. NMR studies of thedynamics of the multidomain protein urokinase-type plasminogen activator. Biochemistry. 1993. V.32. P.298-309.

17. Carrell R.W, Evans D.L. and Stein P.E. Mobile reactive centre of serpins and the control ofthrombosis. Nature. 1991. V.353. P.576-578.

18. Ni F., Konishi Y., Frazier R.B., Scheraga H.A. and Lord S.T High-resolution NMR studiesof fibrinogen-like peptides in solution: interaction of thrombin with residues 1-23 of the A alpha chain of human fibrinogen. Biochemistry. 1989. V.28. P.3082-3094.

19. Zheng Z., Ashton R.W., Ni F. and Scheraga H.A. Thrombin hydrolysis of an N-terminalpeptide from fibrinogen Lille: kinetic and NMR studies. Biochemistry. 1992. V.31. P.4426-4431.

20. Ni F., Ning Q., Jackson C.M. and Fenton J.W. Thrombin exosite for fibrinogen recognitionis partially accessible in prothrombin. J. Biol. Chem, 1993. V.268. P.16899-16902.

21. Ni F., Ripoll D.R., Martin P.D. and Edwards B.F. Solution structure of a platelet receptorpeptide bound to bovine alpha-thrombin. Biochemistry. 1992. V.31. P.11551-11557.

22. Ni F., Konishi Y. and Scheraga H.A. Thrombin-bound conformation of the C-terminalfragments of hirudin determined by transferred nuclear Overhauser effects. Biochemistry.1990. V.29. P.4479-4489.

23. Ni F., Ripoll D.R., Purisima E.O. Conformational stability of a thrombin-binding peptidederived from the hirudin C-terminus. Biochemistry. 1992. V.31. P.2545-2554.

24. Glaudemans C.P., Lerner L., Dares G.D., Kovfic P., Venable R. and Bax A. Significantconformational changes in an antigenic carbohydrate epitope upon binding to a monoclonal antibody. Biochemistry. 1990. V.29. P. 10906-10911.

25. Kim J.I., Nagano Т., Higuchi Т., Hirobe M., Shimada I. and Arata Y. // J. Am. Chem. Soc.1991. V.113. P.9392-9394.

26. Anglister J., Jacob C., Assulin O., Ast G., Pinker R. And Arnon R. NMR study of thecomplexes between a synthetic peptide derived from the В subunit of cholera toxin and three monoclonal antibodies against it. Biochemistry. 1988. V.27. P.717-724.

27. Gettins P. and Choay J. Examination, by lH-n.m.r. spectroscopy, of the binding of asynthetic, high-affinity heparin pentasaccharide to human antithrombin III. Carbohydr. Res. 1989. V.185. P.69-76.

28. Home A.P. and Gettins P. 1H NMR spectroscopic studies on the interactions betweenhuman plasma antithrombin III and defined low molecular weight heparin fragments. Biochemistry. 1992. V.31. P.2286-2294.

29. Anglister J., Frey T. and McConnell H.M. Distances of tyrosine residues from a spin-labelhapten in the combining site of a specific monoclonal antibody. Biochemistry. 1984. V.23. P.5372-5375.

30. Anglister J., Bond M.W., Frey Т., Leahy D., Levitt M., McConnell H.M., Rule G.S.,

31. Tomasello J., Whittaker M. Contribution of tryptophan residues to the combining site of a monoclonal anti dinitrophenyl spin-label antibody. Biochemistry. 1987. V.26. P.6058-6064.

32. Thanabal V., de Ropp J.S. and La Mar G.N. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P.75167525.

33. Thanabal V., de Ropp J.S. and La Mar G.N. // J. Am. Chem. Soc. 1987. V.109. P.265-272.

34. Thanabal V., de Ropp J.S. and La Mar G.N. // J. Am. Chem. Soc. 1988. V.l 10. P.30273035.

35. La Mar G.N., Hernandez G. and de Ropp J.S. H NMR investigation of the influence ofinteracting sites on the dynamics and thermodynamics of substrate and ligand binding to horseradish peroxidase. Biochemistry. 1992. V.31. P.9158-9168.

36. Li X., Smith R.A.G. and Dobson C.M. Sequential 1H NMR assignments and secondarystructure of the kringle domain from urokinase. Biochemistry. 1992. V.31. P.9562-9571.

37. Bokmah A.M., Jimenez-Barbero J. and Llinas M. 1H NMR characterization of theurokinase kringle module. Structural, but not functional, relatedness to homologous domains. J. Biol. Chem. 1993. V.268. P.13858-13868.

38. Nowak U.K., Cooper A., Saunders D., Smith R.A. and Dobson C.M. Unfolding studies ofthe protease domain of urokinase-type plasminogen activator: the existence of partly folded states and stable subdomains. Biochemistry. 1994. V.33. P.2951-2960.

39. Bax A., Grzesiek S. //Acc. Chem. Res. 1993. V.26. P. 131.

40. Clore G.M., Gronenbom A.M. Structures of larger proteins in solution: three- and fourdimensional heteronuclear NMR spectroscopy. Science. 1991. V.252. N.5011. P.1390-1399.

41. Fesik S.W., Zuiderweg E.P. Heteronuclear three-dimensional NMR spectroscopy ofisotopically labelled biological macromolecules. Quart. Rev. Biophys. 1990. V.23. N.2. P.97-131.

42. Wuthrich K. Protein structure determination in solution by nuclear magnetic resonancespectroscopy. Science. 1989. V.242. N.4887. P.45-50.

43. Gerig J.T. // FMR in Biochemistry. 1978. P.139-203.

44. Danielson M.A., Falke J.J. Fluorine NMR of proteins involved in chemotaxis. In

45. Encyclopedia of Nuclear Magnetic Resonance, ed. D.M. Grant, R.K. Harris. 1996. P.855-861.

46. Gerig J.T. Fluorine NMR of proteins. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 1994. V.26.1. P.293-370.

47. Gerig J.T. Fluorine nuclear magnetic resonance of fluorinated ligands. Methods Enzymol.1989. V.177. P.3-23.

48. Lian C., Le H., Montez В., Patterson J., Harrell S. Fluoine-19 nuclear magnetic resonancespectroscopic study of fluorophenylalanine- and flurortryptophan- labeled avian egg white lysozymes. Biochemistry. 1994. V.33. P.5238-5245.

49. Duewel H.S., Daub E., Robinson V., Honek J.F. Elucidation of solvent exposure, side-chainreactivity, and steric demands of the trifluoromethionine residue in a recombinant protein. Biochemistry. 2001. V.40. N.44. P.13167-13176.

50. Duewel H., Daub E., Robinson V., Honek J.F. Incorporation of trifluoromethionine into aphage lysozyme: implications and a new marker for use in protein 19F NMR. Biochemistry. 1997. V.36. N.ll. P.3404-3416.

51. Luck L.A., Falke J.J. 19F NMR studies of the D-galactose chemosensory receptor. 1. Sugarbinding yields a global structural change. Biochemistry. 1991. V.30. P.4248-4256.

52. Westhead E.W., Boyer P.D. The incorporation of o-fluorophenylalanine into some rabbitenzymes and other proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1961. V.54. P.145-150.

53. Arseniev A.S., Kuryatov A.B., Tsetlin V.I., Bystrov V.F., Ivanov V.T., Ophchinnikov Y.A.19F NMR study of 5-fluorotryptophan-labeled bacteriorhodopsin. FEBS Lett. 1987. V.213. P.283-288.

54. Chaiken I.M., Freedman M.H., Lyerla J.R., Cohen J.S. Preparation and studies of 19Flabeled and enriched DC-labeled semisynthetic ribonuclease-S' analogues. J. Biol. Chem. 1973. V.248. P.884-891.

55. Danielson M.A., Biemann H.P., Koshland D.E., Falke J.J. Attractant- and disulfide-inducedconformational changes in the ligand binding domain of the chemotaxis aspartate receptor: a 19F NMR study. Biochemistry. 1994. V.33. N.20. P.6100-6109.

56. Drake S.K., Bourret R.B., Luck L.A., Simon M.I., Falke J.J. Activation of theposphosignaling protein CheY I. Analysis of the phosphorylated con formation by 19F NMR and protein engineering. J. Biol. Chem. 1993. V.268. N.18. P.13081-13088.

57. Gammon K.L., Smallcombe S.H., Richards J.H. Magnetic resonance studies of proteinsmall molecule interactions. Binding of N-trifluoroacetyl-D-(and L-)-jp-fluorophenylalanine to chymotrypsm. J. Am. Chem. Soc. 1972. V.94. P.4573-4580.

58. Gregory D.H., Gerig J.T. Structural effects of fluorine substitution in proteins. J. Сотр.

59. Chem. 1991. V.12. P.180-185.

60. Hull W.E., Sykes B.D. Fluorine 19 nuclear magnetic resonance study of fluorotyrosinealkaline phosphatase: the influence of zinc on protein structure and a conformation change induced by phosphate binding. Biochemistry. 1976. V.5. P.1535-1546.

61. Li E., Qian S.J., Nader L., Young C.C., Avignon A. Nuclear magnetic resonance studies of6.fluor-otryptophan-substituted rat cellular retinol-binding protein II produced in Escherichia con. J. Biol. Chem. 1989. V.264. P.17041-17048.

62. Lu P., Jarema M., Mosser K., Daniel W.E. Lac represser: 3-fluorotyrosine substitution fornuclear magnetic resonance studies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976. V.73. P.3471-3475.

63. Mirmira R.G., Tager H.S. Disposition of the phenylalanine-B25 sidechain during insulinreceptor and insulin-insulin interactions. Biochemistry 1991. V.30. P.8222-8229.

64. Post J.F., Cottam P.F., Simplaceanu V., Ho C. Fluorine-19 nuclear magnetic resonancestudy of 5-fluorotryptophan-labeled histidine-binding protein J of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 1984. V.179. P.729-743.

65. Pratt E.A., Ho C. Incorporation of fluorotryptophans into proteins of Escherichia coli.

66. Biochemistry. 1975. V.14. N.13. P.3035-3040.

67. Rule G.S., Pratt E.A., Simplaceanu V., Ho C. Nuclear magnetic resonance and moleculargenetic studies of the membrane-bound D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Biochemistry. 1987. V.26. P.549-556.

68. Tanaka H., Osaka F., Ohashi M., Shiraki M., Munekata E. Substance-P analoguescontaining para-fluoro-L-phenylalanine. Chem. Lett. 1986. P.391-394.

69. Vine WH, Brueckner DA, Needleman P, Marshall GR. Synthesis, biological activity, and

70. F nuclear magnetic resonance spectra of angiotensin II analogs containing fluorine. Biochemistry. 1973. V.12. P. 1630-1637.

71. Wilson M.L., Dahlquist F.W. Membrane protein conformational change dependent on thehydrophobic environment. Biochemistry 1985. V.24. P.1920-1928.

72. Bovy P.R., Getman D.P., Matsoukas J.M., Moore G.J. Influence of polyfluorination of thephenylalanine ring of angiotensin II on conformation and biological activity. Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.1079. P.23-28.

73. Taylor H.C., Richardson D.C., Richard son J.S., Wlodawer A., Komoriya A., Chaiken I.M.

74. Active conformation of an inactive semi-synthetic ribonuclease-S. J. Mol. Biol. 1981. V.149. P.3I3-317.

75. Pauling L. The Nature of the Chemical Bond. Ithaca: Cornell Univ. Press. 1960. P.644.

76. Wuttke D.S., Gray H.B., Fisher S.L., Imperaili B. Semisynthesis of bipyridyl-alaninecytochrome с mutants: novel proteins with enhanced electron transfer properties. J. Am. Chem. Soc. 1993. V.115. P.8455-8456.

77. Williams S.P., Fulton A.M., Brindle K.M. Estimation of the intracellular free ADPconcentration by 19F NMR studies of ferine-labeled yeast phosphoglycerate kinase in vivo. Biochemistry. 1993. V.32. P.4895-4902.

78. Gamcsik M.P., Gerig J.T., Swenson R.B. Fluorine-NMR studies of chimpanzeehemoglobin. Biochim. Biophys. Acta. 1986. V.874. P.372-374.

79. Liao Т.Н., Berlin K.D. The use of p-fluorobenzenesulfonyl chloride as a reagent for studiesof proteins by fluorine nuclear magnetic resonance. Anal. Biochem. 1985. V.148. N.2. P.365-375.

80. Thomas M.R., Boxer S.G. 19F NMR of trifluoroacetyl-labeled cysteine mutants ofmyoglobin: structural probes of nitric oxide bound to the H93G cavity mutant. Biochemistry. 2001. V.40. N.29. P.8588-8596.

81. Bouchard M., Pare C., Dutasta J.P., Chauvet J.P., Gicquaud C., Auger M. Interactionbetween G-actin and various types of liposomes: A 19F, 31P, and 2H nuclear magnetic resonance study. Biochemistry. 1998. V.37. N.9. P.3149-3155.

82. Heintz D., Капу H., Kalbitzer H.R. Mobility of the N-terminal segment of rabbit skeletalmuscle F-actin detected by 1H and 19F nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 1996. V.35. N.39. P. 12686-12693.

83. Decatur S.M., DePillis G.D., Boxer S.G. Modulation of protein function by exogenousligands in protein cavities: CO binding to a myoglobin cavity mutant containing unnatural proximal ligands. Biochemistry. 1996. V.35. N.13. P.3925-3932.

84. Hayden P.J., Yang Y., Ward A.J., Dulik D.M., McCann D.J., Stevens J.L. Hayden PJ, Yang

85. Y, Ward AJ, Dulik DM, McCann DJ, Stevens JL Biochemistry. 1991. V.30. N.24. P.5935-5943.

86. Barden J. A., Phillips L. 19F NMR study of the myosin and tropomyosin binding sites onactin. Biochemistry. 1990. V.29. N.5. P.1348-1354.

87. Harris J.W., Anders M.W. The use of 19F NMR in the study of protein alkylation byfluorinated reactive intermediates. Adv. Exp. Med. Biol. 1991. V.283. P.735-738.

88. McGee W.A., Parkhurst L.J. A combined nuclear magnetic resonance and absorbancestopped-flow apparatus for biochemical studies. Anal. Biochem. 1990. V.189. N.2. P.267-273.

89. Knowles F.C. Application of 19F NMR spectroscopy to a study of carbon monoxidebinding to human hemoglobin modified at Cys-beta 93 with the S-trifluoroethyl residue. Arch. Biochem. Biophys. 1984. V.230. N.l. P.327-334.

90. Mehta V.D., Kulkarni P.V., Mason R.P., Constantinescu A., Antich P.P. Fluorinatedproteins as potential 19F magnetic resonance imaging and spectroscopy agents. Bioconjug. Chem. 1994. V.5. N.3. P.257-261.

91. Phillips L., Separovic F., Cornell B.A., Barden J.A., dos Remedios C.G. Actin dynamicsstudied by solid-state NMR spectroscopy. Eur. Biophys. J. 1991. V. 19. N.3. P. 147-155.

92. Adriaensens P., Box M.E., Martens H.J., Onkelinx E., Put J., Gelan J. Investigation ofprotein structure by means of 19F-NMR. A study of hen egg-white lysozyme. Eur. J. Biochem. 1988. V.177. N.2. P.383-394.

93. Loewen M.C., Klein-Seetharaman J., Getmanova E.V., Reeves P.J., Schwalbe H., Khorana

94. H.G. Solution 19F nuclear Overhauser effects in structural studies of the cytoplasmic domain of mammalian rhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. N.9. P.4888-4892.

95. Pauley R J., Fredricks W.W., Smith O.H. Effect of tryptophan analogs on depression of the

96. Escherichia coli tryptophan operon by indole-3-propionic acid. J. Bacteriol. 1978. V.136. N.1.P.219-226.

97. Sykes B.D., Weiner J.H. Biosynthesis and 19F NMR characterisation of fluoroamino acidcontaining protein. 1979. P.171-196.

98. Wong C.Y., Eftink M.R. Incorporation of tryptophan analogues into staphylococcalnuclease, its V66W mutant, and Delta 137-149 fragment: spectroscopic studies. Biochemistry. 1998. V.37. N.25. P.8938-8946.

99. Hinds M.G., King R.W., Feeney J. 19F n.m.r. studies of conformational changesaccompanying cyclic AMP binding to 3-fluorophenylalanine-containing cyclic AMP receptor protein from Escherichia coli. Biochem. J. 1992. V.15. P.627-632.

100. Sixl F., King R.W., Bracken M., Feeney J. 19F-n.m.r. studies of ligand binding to 5fluorotryptophan- and 3-fluorotyrosine-containing cyclic AMP receptor protein from Escherichia coli. Biochem. J. 1990. V.266. N.2. P.545-552.

101. Eccleston J.F., Molloy D.P., Hinds M.G., King R.W., Feeney J. Conformational differencesbetween complexes of elongation factor Tu studied 19F-NMR spectroscopy. Eur. J. Biochem. 1993. V.218. N.3. P.1041-1047.

102. Yao Y.N., Zhang Q.S., Yan X.Z., Zhu G., Wang E.D. Substrate-induced conformationalchanges in Escherichia coli arginyl-tRNA synthetase observed by 19F NMR spectroscopy. FEBS Lett. 2003. V.547. N.l-3. P.197-200.

103. Campos-Olivas R., Aziz R., Helms G.L., Evans J.N., Gronenborn A.M. Placement of 19Finto the center of GB1: effects on structure and stability. FEBS Lett. 2002. V.517. N.l-3. P.55-60.

104. Hinds M.G., King R.W., Feeney J. 19F NMR evidence for interactions between the cAMP binding sites on the c-AMP receptor protein from E. coli. FEBS Lett. 1991. V.283. N.l. P.127-130.

105. Jose T.J., Conlan L.H., Dupureur C.M. Quantitative evaluation of metal ion binding to

106. PvuII restriction endonuclease. J. Biol. Inorg. Chem. 1999. V.4. N.6. P.814-823.

107. Luck L.A., Vance J.E., Connell T.M., London R.E. 19F NMR relaxation studies on 5fluorotryptophan- and tetradeutero-5-fluorotryptophan-labeled E. coli glucose/galactose receptor. J. Biomol. NMR. 1996. V.7. N.4. P.261-272.

108. Rozovsky S., Jogl G., Tong L., McDermott A.E. Solution-state NMR investigations of triosephosphate isomerase active site loop motion: ligand release in relation to active site loop dynamics. J. Mol. Biol. 2001. V.310. N.l. P.271-280.

109. Rozovsky S., McDermott A.E. The time scale of the catalytic loop motion in triosephosphate isomerase. J. Mol. Biol. 2001. V.310. N.l. P.259-270.

110. Careaga C.L., Falke J.J. Thermal motions of surface alpha-helices in the D-galactose chemosensory receptor. Detection by disulfide trapping. J. Mol. Biol. 1992. V.226. N.4. P.1219-1235.

111. Zhang Q.S., Shen L., Wang E.D., Wang Y.L. Biosynthesis and characterization of 4fluorotryptophan-labeled Escherichia coli arginyl-tRNA synthetase. J. Protein. Chem. 1999. V.18. N.2. P. 187-192.

112. Chervitz S.A., Falke J.J. Molecular mechanism of transmembrane signaling by the aspartate receptor: a model. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V.93. N.6. P.2545-2550.

113. Salopek-Sondi В., Luck L.A. 19F NMR study of the leucine-specific binding protein of Escherichia coli: mutagenesis and assignment of the 5-fluorotryptophan-labeled residues. Protein Eng. 2002. V.15. N.ll. P.855-859.

114. Luck L.A., Johnson C. Fluorescence and 19F NMR evidence that phenylalanine, 3-L-fluorophenylalanine and 4-L-fluorophenylalanine bind to the L-leucine specific receptor of Escherichia coli. Protein Sci. 2000. V.9. N.12. P.2573-2576.

115. Sun Z.Y., Truong H.T., Pratt E.A., Sutherland D.C., Kulig C.E., Homer R.J., Groetsch A.19F-NMR study of the membrane-binding region of D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Protein Sci. 1993. V.2. N.ll. P. 1938-1947.

116. Brown K. D. Maintenance and Exchange of the Aromatic Amino Acid Pool in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1971. V. 106. N.l. P.70-81.

117. Whipp M.J., Pittard A J. Regulation of aromatic amino acid transport systems in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1977. V.132. N.2. P.453-461.

118. Hoeltzli S.D., Frieden С. Stopped-flow NMR spectroscopy: real-time unfolding studies of6.19F-tryptophan-labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. N.20. P.9318-9322.

119. Furter R. Expansion of the genetic code: site-directed p-fluorophenylalanine incorporation in Escherichia coli. Protein Sci. 1998. V.7. N.2. P.419-426.

120. Browne D.T., Kenyon G.L., Hegeman G.D. Incorporation of mono fluoro tryptophans into proteins during the growth of Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Communs. 1970. V.39. N.l. P.13-19.

121. Hull W.E., Sykes B.D. Fluorotyrosine alkaline phosphate: internal mobility of individual tyrosines and the role of chemical shift anisotropy as a 19F nuclear spin relaxation mechanism in protein. J. Mol. Biol. 1975. V.98. N.l. P.121-153.

122. Robertson D.E., Kroon P. A., Ho C. NMR and fluorescence studies of substrate induced conformational changes of histidine-binding protein J of Salmonella typhimurium. Biochemistry. 1977. V.16. N.7. P.1443-1451.

123. Millet F., Raftery M.A. An NMR method for characterizing conformation changes in proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. V.47. P.625-632.

124. Gregory D.H., Gerig J.T. Prediction of fluorine chemical shifts in proteins. Biopolymers.1991. V.3I. P.845-858.

125. Chambers S.E., Lau E.Y., Gerig J.T. Origins of fluorine chemical shifts in proteins. J. Am. Chem. Soc. 1994. V.116. P.3603-3604.

126. Dios A.C., Pearson J.G., Oldfield E. Secondary and tertiary structural effects on protein NMR chemical shifts: an ab initio approach. Science. 1993. V.260. N.5113. P.1491-1496.

127. Yao J., Dyson H.J., Wright P.E. Chemical shift dispersion and secondary structure prediction in unfolded and partly folded proteins. FEBS Lett. 1997. V.419. N.2-3. P.285-289.

128. Oldfield E. Chemical shifts in amino acids, peptides, and proteins: from quantum chemistry to drug design. Annu. Rev. Phys. Chem. 2002. V.53. P.349-378.

129. Hoeltzi S.D., Frieden С. 19F NMR spectroscopy of 6-19F.tryptophan-labeled Escherichia coli dmydrofolate reductase: equilibrium folding and ligand binding studies. Biochemistry. 1994. V.33. P.5502-5509.

130. Ropson U., Frieden C. Dynamic NMR spectral analysis and protein folding: identification of a highly populated folding intermediate of rat in testinal fatty acid-binding protein by 19F NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991. V.89. P.7222-7226.

131. Pearson J.G., Montez В., Le H., Oldfield E., Chien E.Y., Sligar S.G. Assignment and analysis of fluorine nuclear magnetic resonance spectra of 4-fluorotryptophan myoglobins and hemoglobins. Biochemistry. 1997. V.36. N.12. P.3590-3599.

132. Wagner G., Wutrich K. Observation of internal motility of proteins by nuclear magnetic resonance in solution. Methods Enzymol. 1986. V.131. P.307-326.

133. Martin B.L., Graves D.J. Application of 19F nuclear magnetic resonance to examine covalent modification reactions of tyrosyl derivatives: a study of calcineurin catalysis. Anal Biochem. 1988. V.170. N.l. P.152-160.

134. Monasterio 0., Nova E., Lopez-Brauet A., Lagos R. Tubulin-tyrosine ligase catalyzes covalent binding of 3-fluoro-tyrosine to tubulin: kinetic and 19FJNMR studies. FEBS Lett. 1995. V.374. N.2. P.165-168.

135. Schmitt L., Boniface J. J., Davis M.M., McConnell H.M. Conformational isomers of a class II МНС-peptide complex in solution. J. Mol. Biol. 1999. V.286. N.l. P.207-218.

136. Bourret R.B., Brokovich K.A., Simon M.I. Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes. Annu. Rev. Biochem. 1991. V.60. P.401-441.

137. Hazelbauer G.L., Berg H.C., Matsumura P. Bacterial motility and signal transduciton. Cell.1993. V.73.P.15-22.

138. Parkinson J.S., Kofoid E.C. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 1992. V.26. P.71-112.

139. Stock J.B., Lukat G.S. Bacterial chemotaxis and the molecular logic of intracellular signal transduction networks. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 1991. V.20. P.109-136.

140. Но С., Pratt Е.А., Wu C.S., Yang J.T. Membrane-bound D-lactate dehydrogenase of

141. Escherichia coli: a model for protein interactions in membranes. Biochim. Biophys. Acta. 1989. V.988. P.173-184.

142. Hoeltzli S.D., Frieden C. Refolding of 6-19F.tryptophan-labeIed Escherichia coli dihydrofolate reductase in the presence of ligand: a stopped-flow NMR spectroscopy study. Biochemistry. 1998. V.37. N.l. P.387-398.

143. Schuler В., Kremer W., Kalbitzer H.R., Jaenicke R. Role of entropy in protein thermostability: folding kinetics of a hyperthermophilic cold shock protein at high temperatures using 19F NMR. Biochemistry. 2002. V.41. N.39. P.l 1670-11680.

144. Birdsall В., Tendler S.J., Arnold J.R., Feeney J., Griffin R.J., Carr M.D. NMR studies of multiple conformations in complexes of Lactobacillus casei dihydro folate reductase with analogues of pyrimethamine. Biochemistry. 1990. V.29. N.41. P.9660-9667.

145. Laurents D.V., Baldwin R.L. Characterization of the unfolding pathway of hen egg white lysozyme. Biochemistry. 1997. V.36. N.6. P. 1496-1504.

146. Sun Z.Y., Pratt E.A., Simplaceanu V., Ho C. A 19F-NMR study of the equilibrium unfolding of membrane-associated D-lactate dehydrogenase of Escherichia coli. Biochemistry. 1996. V.35. N.51. P.16502-16509.

147. Kranz J.K., Lu J., Hall K.B. Contribution of the tyrosines to the structure and function of the human U1A N-terminal RNA binding domain. Protein Sci. 1996. V.5. N.8. P. 15671583.

148. Hoeltzli S.D., Frieden C. Real-time refolding studies of 6-19F-tryptophan labeled Escherichia coli dihydrofolate reductase using stopped-flow NMR spectroscopy. Biochemistry. 1996. V.35. N.51. P.16843-16851.

149. Peteranderl R., Rabenstein M., Shin Y.K., Liu C.W., Wemmer D.E., King D.S., Nelson H.C. Biochemical and biophysical characterization of the trimerization domain from the heat shock transcription factor. Biochemistry. 1999. V.38. N. 12. P.3559-3569.

150. Luck L.A., Falke J J. Open conformation of a substrate-binding cleft: 19F NMR studies of cleft angle in the D-galactose chemosensory receptor. Biochemistry. 1991. V.30. N.26. P.6484-6490.

151. Smith L.J., Alexandrescu A.T., Pitkeathly M., Dobson C.M. Solution structure of a peptidefragment of human alpha-lactalbumin in trifluoroethanol: a model for local structure in the molten globule. Structure. 1994. V.2. N.8. P.703-712.

152. Neville D., Rozanas C.R., Tulk B.M., Townsend R.R., Verkman A.S. Biochemistry. 1998. V.37. P.2401-2409.

153. Xu A.S., Morris M.B., Kuchel P.W. Band-3 mediated uptake of beryllofluoride complexes by human erythrocytes. Biochemistry. 1992. V.31. N.38. P.9263-9268.

154. Grage S.L., Wang J., Cross T.A., Ulrich A.S. Solid-state 19F-NMR analysis of 19Flabeled tryptophan in gramicidin A in oriented membranes. Biophys. J. 2002. V.83. N.6. P.3336-3350.

155. Sanders C.R., Schwonek JP. Simulation of NMR data from oriented membrane proteins: practical information for experimental design. Biophys. J. 1993. V.65. N.4. P. 1460-1469.

156. Falke J. J., Luck L.A., Scherrer J. 19F nuclear magnetic resonance studies of aqueous andtransmembrane receptors. Examples from the Escherichia coli chemosensory pathway. Biophys. J. 1992. V.62. N.l. P.82-86.

157. Glaser R.W., Ulrich A.S. Susceptibility corrections in solid-state NMR experiments with oriented membrane samples. Part I: applications. J. Magn. Reson. 2003. V.l64. N.l. P.104-114.

158. Klefhaber Т., Labhardt A.M., Baldwin R.L. Direct NMR evidence for an intermediate preceding the rate-limiting step in the unfolding of ribonuclease A. Nature. 1995. V.375. N. 6531. P.513-515.

159. Hoeltzi S.D., Ropson I. J., Freiden C. Application of equilibrium and stopped-flow 19F

160. NMR spectroscopy to protein folding: studies of E. coli dihydrofolate reductase. Tech. Protein Chem. 1994. V.5. P.455-465.

161. Ropson I.J., Frieden C. Dynamic NMR spectral analysis and protein folding: identification of a highly populated folding intermediate of rat intestinal fatty acid-binding protein by 19F NMR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. N.l5. P.7222-7226.

162. Bourret R.B., Drake S.K., Chervitz S.A., Simon M.I., Falke J.J. Activation of the phosphosignaling protein CheY. II. Analysis of activated mutants by 19F NMR and protein engineering. J. Biol. Chem. 1993. V.268. N.l8. P. 13089-13096.

163. Ho C., Rule G.S., Pratt E.A. Nuclear magnetic resonance, biochemical and moleculargenetic studies of the membrane bound D-lactate dehydrogenase of E.coli. Byophys. J. 1986. V.49. N.l. P.113-115.

164. Gerig G.T., Klinkenborg J.C., Nieman R.A. Assigment of fluorine magnetic resonance signals from rabbit cyanomethemoglobin. Biochemistry. 1983. V.22. N.9. P.2076-2087.

165. HagenD.S., Weiner J.H., Sykes B.D. Fluorotyrosine M13 coat protein: fluorine-19 nuclear magnetic resonance. Studi of the motional propeties of the integral membrane protein in phospholipid vesicles. Biochemistry. 1978. V.17., N.18. P.3860-3866.

166. HagenD.S., Weiner J.H., Sykes B.D. Investigation of solvent accessibility of thefluorotyrosyl residues of M13 coat protein in deoxycholate micelles and phospholipid vesicles. Biochemistry. 1979. V.18. N.10. P.2007-2012.

167. Caplow M., Shanks J. Microtubule dynamic instability does not result from stabilization of microtubules by tubulin-GDP-Pi subunits. Biochemistry. 1998. V.37. N.37. P.12994-13002.

168. Barbar E., Martin T.M., Brown M., Rittenberg M.B., Peyton D.H. Binding of phenylphosphocholine-carrier conjugates to the combining site of antibodies maintains a conformation of the hapten. Biochemistry. 1996. V.35. N.9. P.2958-2967.

169. Scheuring J., Lee J., Cushman M., Patel H., Patrick D.A., Bacher A. (Trifluoromethyl)lumazine derivatives as 19F NMR probes for lumazine protein. Biochemistry. 1994. V.33. N.24. P.7634-7640.

170. Henry G.D., Maruta S., Ikebe M., Sykes B.D. Observation of multiple myosin subfragment

171. ADP-fluoroberyllate complexes by 19F NMR spectroscopy. Biochemistiy. 1993. V.32. N.39. P. 10451-10456.

172. Connick T.J., ReillyR.T., Dunlap R.B., Ellis P.D. Fluorine-19 nuclear magnetic resonance studies of binary and ternary complexes of thymidylate synthase utilizing a fluorine-labeled folate analogue. Biochemistry. 1993. V.32. N.38. P.9888-9895.

173. Street I.P., Lin H.K., Laliberte F., Ghomashchi F., Wang Z., Perrier H., Tremblay N.M., Huang Z„ Weech P.K., Gelb M.H. Slow- and tight-binding inhibitors of the 85-kDa human phospholipase A2. Biochemistry. 1993. V.32. N.23. P.5935-5940.

174. Percival M.D., Withers S.G. 19F NMR investigations of the catalytic mechanism of phosphoglucomutase using fluorinated substrates and inhibitors. Biochemistry. 1992. V.31.N.2. P.505-512.

175. Luck L.A., Falke J.J. 19F NMR studies of the D-galactose chemosensory receptor. 2. Ca(II) binding yields a local structural change. Biochemistry. 1991. V.30. N.17. P.4257-4261.

176. Liang T.C., Abeles R.H. Complex of alpha-chymotrypsin and N-acetyl-L-leucyl-L-phenylalanyl trifluoromethyl ketone: structural studies with NMR spectroscopy. Biochemistry. 1987. V.26. N.24. P.7603-7608.

177. Campbell A.P., Cachia P. J., Sykes B.D. Interaction of troponin I and troponin C: 19F NMR studies of the binding of the inhibitory troponin I peptide to turkey skeletal troponin C. Biochem. Cell Biol. 1991. V.69. N.9. P.674-681.

178. Rong D., Lovey A.J., Rosenberger M., Avignon D.A., Li E. NMR studies of fluororetinol analogs complexed to two homologous rat cellular retinol-binding proteins. Biochim. Biophys. Acta. 1994. V.1208. N.l. P.136-144.

179. Evans J.N., Arvidson D.N., Gunsalus R.P., Roberts M.F. Multinuclear NMR studies of the trp-repressor. Biochim. Biophys. Acta. 1992. V.1160. N.2. P.156-162.

180. Cao В., Endsley S., Andersen N.H. 19F NMR studies of tryptophan/serum albumin binding. Bioorg. Med. Chem. 2003. V.l 1. N.l. P.69-75.

181. Huwe J.K., Larsen G.L., Castellino S. An investigation of the binding site of alpha 2u-globulin using isotopically labeled ligands and inverse nuclear magnetic resonance techniques. Chem. Res. Toxicol. 1996. V.9. N.l. P.215-222.

182. Leone M., Rodriguez-Mias R.A., Pellecchia M. Selective Incorporation of 19F-Labeled Trp Side Chains for NMR-Spectroscopy-Based Ligand-Protein Interaction Studies. Chembiochem. 2003. V.4. N.7. P.649-650.

183. Rong D., Lin C.L., Avignon D.A., Lovey A.J., Rosenberger M., Li E. 19F-NMR studies of retinol transfer between cellular retinol binding proteins and phospholipid vesicles. FEBS Lett. 1997. V.402. N.2-3. P.l 16-120.

184. Jenkins B.G., Lauffer R.B. Detection of site-specific binding and co-binding of ligands to human serum albumin using 19F NMR. Mol. Pharmacol. 1990. V.37. N.l. P.l 11-118.

185. Dubois B.W., Cherian S.F., Evers A.S. Volatile anesthetics compete for common binding sites on bovine serum albumin: a 19F-NMR study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. V.90. N.l4. P.6478-6482.

186. McDowell L.M., Lee M., McKay R.A., Anderson K.S., Schaefer J. Intersubunit communication in tryptophan synthase by carbon-13 and fluorine-19 REDOR NMR. Biochemistry. 1996. V.35. N.10. P.3328-3334.

187. Dupureur C.M., Hallman L.M. Effects of divalent metal ions on the activity and conformation of native and 3-fluorotyrosine-PvuII endonucleases. Eur. J. Biochem. 1999. V.261. N.l. P.261-268.

188. Karlin A. Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors. Nature. 2002. V.3. P.102-114.

189. Changeux J.P., Edelstein S.J. Allosteric receptors after 30 years. Neuron. 1998. V.21. N.5. P.959-980.

190. Katchalski-Katzir E., Kasher R., Balass M., Scherf Т., Harel M., Fridkin M., Sussman J.L.,

191. Fuchs S. Design and synthesis of peptides that bind alpha-bungarotoxin with high affinity and mimic the three-dimensional structure of the binding-site of acetylcholine receptor. Biophys. Chem. 2003. V.100. N.l-3. P.293-305.

192. Oblas В., Boyd N.D., Singer R.H. Analisis of receptor ligand interactions using nitrocellulose gel transfer: aplication to Torpedo acetilcholine receptor and alpha-bungarotoxin. Anal. Biochem. 1983. V.130. P.l-8.

193. West A. P., Bjorkman P. J., Dougherty D. A. and Lester H. A. Expression and Circular Dichroism Studies of the Extracellular Domain of the Subunit of the Nicotinic Acetylcholine Receptor. J. Biol. Chem. 1997. V. 272. N. 41. P.25468-25473.

194. Burstein Y, Patchornik A. Selective chemical cleavage of tryptophanyl peptide bonds in peptides and proteins. Biochemistry. 1972. V.l 1. N.25. P.4641-4650.

195. Alexeev Т., Krivoshein A., Shevalier A., Kudelina I., Telyakova O., Vincent A., Utkin

196. Yu., Hucho F., Tsetlin V. Physicochemical and immunological studies of the N-terminal domain of the Torpedo acetylcholine receptor alpha-subunit expressed in Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 1999. V.259. P.310-319.

197. Donelly-Roberts D.L., Lentz T.L. // Mol. Brain. Res. 1993. V.19. P.55-61.

198. Кондаков В.И., Арсеньев A.C., Уткин Ю.Н., Карлсон Е., Гуревич А.З., Цетлин В.И., Быстрое В.Ф., Иванов В.Т. // Биоорган, химия. 1984. Т. 10. С.869-890.

199. Vincent A., Newson-Davis J. Acetylcholine receptor antibody as a diagnostic test for myasthenia gravis: results in 153 validated cases and 2967 diagnostic assays. Journal of Neurosurgery and Psychiatry. 1985. V.48. P. 1246-1252.

200. MacLennan С., Beeson D., Vincent A., Newsom-Davis J. Human nicotinic acetylcholine receptor alpha-subunit isoforms: origins and expression. Nucleic Acids Research. 1993. V.21. N.23. P.5463 -5467.

201. Brejc К., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van Der Oost J., Smit A.B., Sixma Т.К. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. 2001. Nature. V.411. N.6835. P.269-276.

202. Celie P.H., van Rossum-Fikkert S.E., van Dijk W.J., Brejc K., Smit A.B., Sixma Т.К. Nicotine and carbamylcholine binding to nicotinic acetylcholine receptors as studied in AChBP crystal structures. 2004. Neuron. V.41. N.6. P.907-914.

203. Tsetlin V.I., Dergousova N.I., Azeeva E.A., Kryukova E.V., Kudelina I.A., Shibanova

204. E.D., Kasheverov I.E., Methfessel C. Refolding of the Escherichia coli expressed extracellular domain of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor. Eur. J. Biochem. 2002. V.269. N.l 1. P. 2801-2809.

205. Dunckley Т., Wu J., Zhao L., Lukas R.J. Mutational analysis of roles for extracellular cysteine residues in the assembly and function of human alpha 7-nicotinic acetylcholine receptors.Biochemistry. 2003 V.42. N.4. P.870-876.

206. Neugebauer R., Betz H., Kuhse J. Expression of a soluble glycine binding domain of the NMDA receptor in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Coramun. 2003. V.305. N.3. P.476-483.

207. Schroeder W., Meyer H.E., Buchner K., Bayer H., Hucho F. Phosphorylation sites of the nicotinic acetylcholine receptor. A novel site detected in position delta S362. Biochemistry. 1991. V.30. P.3583-3588.

208. Wagner K., Edson K., Heginbotham L., Post M., Huganir R.L., Czernik A.J. Determination of the tyrosine phosphorylation sites of the nicotinic acetylcholine receptor. J. Biol. Chem. 1991. V.266. P.23784-23789.

209. Vuillard L., Braun-Breton C., Rabilloud T. Non-detergent sulphobetaines: a new class of mild solubilization agents for protein purification. Biochem. J. 1995. V.305. P.337-343.