Биоинженерия каталитических свойств и стабильности дрожжевой оксидазы D-аминокислот тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Атрошенко Денис Леонидович

• Атрошенко Денис Леонидович
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Атрошенко Денис Леонидович

Список сокращений

I. Введение

II. Обзор литературы

2.1. Оксидаза D-аминокислот

2.1.1. Общие сведения

2.1.2. DAAO в микроорганизмах

2.1.3. Первичная структура и олигомерный состав

2.1.4. Трехмерная структура и механизм действия

2.2. Свойства оксидазы D-аминокислот из различных источников

2.2.1. Кинетические свойства

2.2.2. Стабильность

2.3. Применение оксидазы D-аминокислот

2.3. Белковая инженерия оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis

III. Материалы и методы

3.1. Материалы

3.2. Методы исследования

3.2.1. Направленный мутагенез гена tvdaoo

3.2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле и выделение ДНК из агарозного геля

3.2.3. Выделение ДНК фрагмента из агарозного геля

3.2.4. Рестрикция и лигирование фрагментов ДНК

3.2.5. Трансформация клеток E. coli и выделение плазмидной ДНК

3.2.6. Секвенирование ДНК

3.2.7. Экспрессия TvDAAO клетках E. coli

3.2.8. Выделение и очистка TvDAAO

3.2.9. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях

3.2.10. Определение концентрации TvDAAO

3.2.11. Определение активности TvDAAO

3.2.12. Определение кинетических параметров TvDAAO с набором D-аминокислот

3.2.13. Определение кинетических параметров TvDAAO с цефалоспорином С

3.2.14. Изучение температурной стабильности TvDAAO

3.2.15. Математический аппарат теории диссоциативной термоинактивации

3.2.16. Изучение окислительной стабильности TvDAAO

3.2.17 Рациональный белковый дизайн

IV. Результаты и обсуждение

4.1. Мутантные формы TvDAAO с заменами остатков метионина

4.1.1. Выбор положений для введения аминокислотных замен

4.1.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами Met104Leu, Met156Leu и Met209Leu

4.1.3. Кинетические свойства мутантных TvDAAO с заменами Met156Leu и Met209Leu

4.1.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAO Met156Leu и TvDAAO Met209Leu

4.1.5. Стабильность к действию H2O2 мутантных TvDAAO с заменами Met104Leu, Met156Leu, Met209Leu и фермента дикого типа

4.2. Мутантные формы TvDAAO с заменами остатка Cys298

4.2.1. Анализ остатков цистеина в структуре TvDAAO и выбор аминокислотных замен

4.2.2. Получение мутантных TvDAAO с заменами Cys298

4.2.3. Кинетические свойства мутантных TvDAAO с заменами остатка Cys298

4.2.4. Температурная стабильность мутантных TvDAAO с заменами остатка Cys298

4.2.5. Стабильность к действию H2O2 мутантных TvDAAO с заменами остатка Cys298

4.3. Многоточечные мутантные формы TvDAAO с улучшенными свойствами

4.3.1. Получение многоточечных мутантных TvDAAO

4.3.2. Кинетические свойства многоточечных мутантных TvDAAO

4.3.3. Температурная стабильность многоточечных мутантных TvDAAO

4.3.4. Стабильность к действию H2O2 многоточечных мутантных TvDAAO

V. Выводы

VI. Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

FAD - флавинадениндинуклеотид

DAAO - оксидаза D-аминокислот

wt-TvDAAO - дикий тип оксидазы D-аминокислот из дрожжей

Trigonopsis variabilis

TvDAAO - оксидаза D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis

variabilis

RgDAAO - оксидаза D-аминокислот из дрожжей Rhodotorula gracilis

pkDAAO - оксидаза D-аминокислот из почки свиньи

hDAAO - оксидаза D-аминокислот из человека

ApDAAO - оксидаза D-аминокислот из Arthrobacter protophormiae

CbDAAO - оксидаза D-аминокислот из дрожжей Candida boidinii

ИПТГ - изопропил-Р^-тиогалактопиранозид

ПХ - пероксидаза из корней хрена

АБТС - 2,2-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфонат)

БСА - бычий сывороточный альбумин

КФБ - калий-фосфатный буфер

CPC - цефаллоспорин С

7-АЦК - 7-аминоцефалоспорановая кислота

а-кетоадипил -7-АЦК - а-кетоадипил-7-аминоцефалоспорановая кислота

глутарил -7-АЦК - глутарил-7-аминоцефалоспорановая кислота

PDB - база данных белковых структур (Protein Data Bank)

GLA - глутарил-7-АЦК ацилаза

I. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность. Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) относится к классу FAD-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты с образованием пероксида водорода в качестве второго продуктарг. Этот фермент выполняет важные функции в живых организмах. В микроорганизмах DAAO участвует в катаболизме экзогенных D-аминокислот. В случае высших эукариот роль DAAO заключается в поддержании определенного уровня D-аминокислот в клетке, которые участвуют в регуляции самых разнообразных процессов (функционирование нервной системы, старение, секреция гормонов). Кроме того, фермент используется для решения различных задач биотехнологии.

Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике нашли два фермента, выделенные из дрожжей Rhodotorula gracilis и Trigonopsis variabilis (TvDAAO). TvDAAO считается наиболее значимым ферментом, поскольку среди известных оксидаз D-аминокислот он обладает наилучшей температурной стабильностью и наиболее высокой активностью с цефалоспорином С, который используется в синтезе 7-аминоцефалоспорановой кислоты - прекурсора для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений. Помимо этого, DAAO активно применяется в аналитической биотехнологии, хиральном синтезе, получении а-кетокислот и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда (в первую очередь нейродегненеративных) заболеваний.

Одним из главных ограничений при использовании ферментов на практике является их низкая операционная стабильность. В случае DAAO операционная стабильность в основном определяется воздействием пероксида водорода, который является продуктом ферментативной реакции. Под действием пероксида водорода происходит окисление аминокислотных остатков фермента и, как следствие, его инактивация. Вторым ограничением в использовании большинства ферментов является их невысокая термостабильность, что ограничивает температуру применения

и требует пониженных температур при хранении. Поэтому повышение температурной стабильности ферментов также является очень важным фактором, определяющим эффективность применения биокатализаторов. Кроме того, в ходе работ по направленному улучшению операционной и температурной стабильностей также необходимо как минимум сохранять, а лучше и улучшать каталитическую эффективность исследуемого фермента с заданным субстратом.

Одним из подходов решения вышеуказанных проблем является метод рационального дизайна, который предполагает целенаправленное введение аминокислотных замен, выбранных на основе анализа трехмерной структуры и множественного выравнивания аминокислотных последовательностей. Данный подход требует фундаментальных знаний о взаимосвязи структура-функция ферментов.

Таким образом, направленное улучшение операционной и температурной стабильности, равно как каталитических свойств является актуальной задачей как с фундаментальной, таки с практической точки зрения.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является получение мутантных форм TvDAAO с увеличенными температурной стабильностью, стабильностью к действию пероксида водорода и улучшенными кинетическими параметрами в реакции окисления цефалоспорина C.

Задачи исследования:

- разработка методики определения стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода;

- получение точечных мутантных форм TvDAAO с улучшенной температурной стабильностью;

- получение точечных мутантных форм TvDAAO с улучшенной стабильностью к действию Н2О2;

- объединение единичных положительных замен в многоточечные мутантные формы TvDAAO, перспективные для применения в реакции окисления цефалоспорина C.

Научная новизна. В ходе выполнения данной работы были проведены

систематические исследования о роли ряда остатков метионина и цистеина TvDAAO в

температурной и химической стабильностях фермента. Разработана и оптимизирована методика определения стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода. Определена важность отдельных остатков цистеина в химической инактивации TvDAAO. Получены мутантные ферменты с несколькими (3-6) аминокислотными заменами, лучшие из которых по сравнению с TvDAAO дикого типа обладали в 4-5 раз

и и и 1 /О

более высокой каталитической константой в реакции окисления цефалоспорина С, в 15-30 раз более высокой температурной стабильностью и в 5-10 раз более высокой стабильностью к действию Н2О2.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в данной работе, важны для понимания взаимосвязи структуры и функции TvDAAO. Разработанная методика определения стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода может быть использована с другими оксидазами. Установлено, что остатки Cys298 и Cys108 отвечают за стабильность фермента при инактивации TvDAAO продуктом ферментативной реакции - пероксидом водорода. Получены новые точечные и многоточечные мутантные формы TvDAAO с улучшенными свойствами, такими как кинетические параметрами в реакции окисления цефалоспорина С, температурная стабильность и стабильность к действию пероксида водорода. Показана, что при объединении точечных замен (каждая из которых отвечала за улучшение одного из трех параметров) в многоточечные мутанты наблюдается. аддитивность положительных эффектов. Новые мутантные TvDAAO обладают наилучшими кинетическими свойствами в реакции окисления цефалоспорина С и наивысшей температурной и химической стабильностями среди всех описанных DAAO. Они являются перспективными для использования в промышленности при получении 7-аминоцефалоспорановой кислоты.

Методология и методы исследования. В рамках данной работы были использованы следующие методы и подходы: биоинформатика (поиск последовательностей DAAO по базам данных, построение множественных выравниваний аминокислотных последовательностей, конструирование праймеров, докинг, молекулярная динамика, моделирование влияния аминокислотных замен на

структуру); методы генетической инженерии (полимеразная цепная реакция, рестрикция, лигирование, выделение ДНК, получение плазмид); методы молекулярной биологии (трансформация, экспрессия рекомбинантных DAAO в клетках E. coli); хроматографические методы (анионообменная хроматография, гель-фильтрация); аналитические методы характеризации ферментов (спектрофотометрия, ВЭЖХ).

Вклад автора в проведенное исследование. Все научные результаты, изложенные в диссертации, получены при личном участии Атрошенко Дениса Леонидовича под руководством проф., д.х.н. Тишкова Владимира Ивановича.

Положения, выносимые на защиту:

1. Мутантная форма TvDAAO Met156Leu проявляет повышенную температурную стабильность. Остатки Met104, Met156 и Met209 не влияют на стабильность фермента к действию пероксида водорода.

2. Замены остатка Cys298 приводят к увеличению стабильности к действию пероксида водорода. TvDAAO Cys298Gly, TvDAAO Cys298Asn и TvDAAO Cys298Gln обладают повышенной температурной стабильностью.

3. Окисление остатка Cys298 является скорость определяющим для инактивации TvDAAO дикого типа под действием пероксида водорода. При наличии замены остатка Cy298 скорость определяющим для инактивации TvDAAO под действием пероксида водорода является окисление остатка Cys108.

4. Замены F54S/C108F/M156L, E32R/F33D/F54S/C108F/M156L и E32R/F33D/F54S/C108F/M156L/C298N привели к увеличению значений каталитических констант с цефалоспорином C в 4-5 раз по сравнению с TvDAAO дикого типа. Все ферменты с многоточечными заменами, кроме TvDAAO F54S/M156L, обладали значительно увеличенной температурной стабильностью. Мутантные ферменты, содержащие замены остатков Cys108 и Cys298 одновременно (TvDAAO с заменами E32R/F33D/F54S/C108F/M156L/C298G, E32R/F33D/F54S/C108F/M156L/C298N и E32R/F33D/F54S/C108F/M156L/C298Q), обладают улучшенной стабильностью к окислению пероксидом водорода.

Степень достоверности и апробация работы. Достоверность данных экспериментов обеспечена использованием современных методов исследования, проведением ряда независимых экспериментов с использованием положительных и отрицательных контролей. Все эксперименты проводили на сертифицированном оборудовании в трех и более независимых повторах, для анализа данных использовали современные методы статистической обработки.

Основные результаты работы были представлены на международных конгрессах и конференциях: 42nd and 43rd FEBS Congresses, (Иерусалим, Израиль, 2017; Прага, Чехия, 2018), International Conference "OxiZymes", (Вена, Австрия, 2014; Вагенинген, Нидерланды, 2016), International Conference on Protein Stability (Стреза, Италия, Stresa, 2014), International Conference "INPEC" (International Network of Protein Engineering Centers, С.-Петербург, Россия, 2014; Дажеон, Корея, 2016), International Conference "Biocatalysis: Fundamentals and Applications", (Истра, 2015 и 2017; С.-Петербург, 2019 ), V и VI Съезды Биохимиков России (Дагомыс, Сочи, Россия, 2016 и 2019), XX и XXI Менделеевские съезды по общей и прикладной химии (Екатеринбург, 2016; С.Петербург, 2019), VIII и IX Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы». (Москва 2015, 2017), Первый, Третий и Пятый Междисциплинарные Симпозиумы по Медицинской, Органической и Биологической Химии и Фармацевтике (Новый Свет, Крым, 2014; Севастополь, 2017).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в Web of Science и Scopus, 3 тезиса докладов в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в Web of Science и Scopus, и 27 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертационная работа изложена на 128 страницах и содержит 34 рисунка, 28 таблиц и 122 ссылки

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Оксидаза D-аминокислот

2.1.1. Общие сведения

Оксидаза D-аминокислот (DAAO, КФ 1.4.3.3) — это флавин аденин динуклеотид (FAD) содержащий фермент, который катализирует реакцию окислительного дезаминирования D-аминокислот с образованием а-кетокислот и иона аммония. Этот фермента был открыт более 80 лет назад Кребсом [1]. С 1935 года DAAO является объектом большого количества исследований как модельный фермент класса флавопротеинов. Все флавопротеины имеют некоторые общие свойства: они быстро взаимодействуют с кислородом в восстановленной форме, стабилизируют красный анионный радикал через одноэлектронный перенос, образуют флафин-Ы(5)-сульфит при взаимодействии с сульфитом [2]. Активность DAAO было обнаружена во многих организмах от грибов до человека, где DAAO связана с выполнением важных физиологических функций [3].

Окислительно-восстановительная реакция, катализируемая DAAO, может быть использована в различных биотехнологических процессах, таких как получение глутарил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (ГЛ-7-АЦК) из цефалоспорина C, получение а-кетокислот из синтетических D-аминокислот, разделение смесей рацематов аминокислот, аналитическое определение D-аминокислот и т.д. Дрожжевые DAAO наиболее перспективные для биотехнологического применения благодаря их высокой активности, сильному связыванию молекулы FAD и широким спектром субстратной специфичности [3, 4].

2.1.2. DAAO в микроорганизмах

Наиболее интересными для биотехнологии являются DAAO из микроорганизмов, поскольку они обычно обладают лучшими кинетическими параметрами и стабильностью. Бактерии способны синтезировать и разлагать D-аминокислоты. D-Ala и D-Glu являются функциональными компонентами

пептидогликанового слоя бактериальной клеточной стенки. Незаряженные аминокислоты, в частности D-Ala, окисляются в соответствующие а-кетокислоты при помощи FAD-содержащей дегидрогеназы D-аминокислот, состоящей обычно из двух субъединиц массой 45 и 55 кДа. Дегидрогеназа D-аминокислот окисляет D-аминокислоты без участия кислорода. По результатам биоинформатического анализа было найдено более 200 генов, которые могут кодировать DAAO в бактериях. Все они принадлежат к грамположительным актинобактериям, которые включают в себя некоторые важные патогены, такие как Mycobacteria и Nocardia [5]. Однако анализ последовательностей не может предсказать их субстратную специфичности и физиологическую роль. На данный момент была охарактеризована только одна бактериальная DAAO из Arthrobacter protophormiae (ApDAAO) [6]. ApDAAO представляет собой DAAO, высокоспецифичную к D-Met (180 Ед/мг). В бактериях Bacillus subtilis оксидазная активность определяется глицин оксидазой, которая имеет много структурных сходств с дрожжевыми DAAO, однако данный фермент не связывают с метаболизмом D-аминокислот, а считают его компонентом биосинтеза тиамина [7, 8]. Глицин оксидаза в том числе катализирует окислительное дезаминирование различных аминов, преимущественно имеющих малый размер, и D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты.

Что касается DAAO в эукариотах, то присутствие DAAO было показано во многих грибах: Rhodotorula gracilis [9], Candida utilis [10], Trigonopsis variabilis [11], Hansenula polymorpha [12], Fusarium solani [13], Candida boidinii [14], Fusarium oxysporum [15], Verticillium luteoalbum, and Candidaparapsilosis [16].

DAAO является пероксимальным белком. При индукции при помощи D-Ala в клетках Rhodotorula gracilis размер пероксисом увеличился на 30 % и их число увеличилось почти на 240 % [17]. Увеличение количества пероксисом также наблюдалось при экспрессии DAAO в клетках Candida boidinii [18]. Несмотря на локализацию в пероксисомах DAAO правильно собирается и в цитозоле дрожжей Candida boidinii и Hansenula polimorpha [12, 14]. При индукции D-Ala присутствие L-изомеров ослабляет индукцию посредством ингибирования транспорта D-Ala

через специфичные пермиазы [19]. В метилотрофных дрожжах Candida boidinii DAAO включен в метаболизм D-Ala как источника углерода, но другие ферменты вовлечены в метаболизм DAAO как источник азота [14]. В большинстве дрожжей синтез DAAO может быть индуцирован добавлением D-аминокислот, однако наилучший индуктор отличается для разных микроорганизмов. В дрожжах Trigonopsis variabilis синтез DAAO лучше всего индуцируется в присутствии D,L-Met, D,L-Ala, D,L-Leu и D,L-Val. Индукция TvDAAO также может быть вызвана аналогами D-аминокислот, которые не метаболизируются [20].

2.1.3. Первичная структура и олигомерный состав

Первая cDNA для DAAO из микроорганизмов была получена для дрожжей Trigonopsis variabilis в 1988 в патенте от компании Asahi Chemical Ind. [5]. Затем последовательно были выделены гены из Fusarium solani [13], Rhodotorula gracilis [21] и Candida boidinii [14].

Используя первичную последовательность RgDAAO было найдено большое количество генов возможных DAAO в царстве грибов [22]. DAAO была найдена во всех царствах кроме растений. Также DAAO была найдена в водорослях Chlorella vulgaris [23]. При помощи множественного выравнивания было найдено 6 консервативных областей [24]. Области I и II включают FAD-связывающий домен. Области II, IV и V содержат высококонсервативные остатки. Область VI на C-конце содержит пероксимальную сигнальную последовательность PTS1 (Ser-(Lys/His/Arg)-Leu). Эта последовательность отсутствует в бактериальных оксидазах, таких как глицин оксидазе и ApDAAO. Первая DAAO из не млекопитающих животных была выделена из гепатопанкреаса карпа CbDAAO [25]. Первичная структура CbDAAO очень схожа с первичной структурой для DAAO из млекопитающих. Для поиска DAAO используют два подхода. Первый заключается в скрининге оксидазной активности у микроорганизмов, выращенных на определенных средах. Второй заключается в поиске генов, возможно кодирующих

DAAO на основе биоинформатического анализа. На данный момент наиболее часто используется второй подход.

Очищенный препарат RgDAAO представляет собой димер массой ~ 80 кДа. Димерное состояние не зависит от концентрации фермента. Олигомерное состояние TvDAAO описывалось как димерное [11, 26], так и как тетрамерное [27]. pkDAAO представляет собой смесь димерных и мономерных форм в зависимости от концентрации фермента и его формы. hDAAO представляет собой димер и его олигомерное состояние не зависит от концентрации и формы фермента , хотя hDAAO и pkDAAO имеют 85% идентичности по первичной аминокислотной последовательности [28].

2.1.4. Трехмерная структура и механизм действия

Первая структура DAAO была решена для DAAO из почек свиньи (pkDAAO) в 1996 году с разрешением 2,6 Ä (PDB ID: 1KIF) [29]. Первая структура для дрожжевой DAAO была решена для RgDAAO в 2000 году (PDB ID: 1C0K, 1C0L и 1C0P) [30]. Структура была решена в различных состояниях и комплексах с разрешениями 1,2, 1,7 и 1,5 Ä. Первая человеческая DAAO (hDAAO) была решена в 2006 году с разрешением 2,5 Ä (PDB ID: 2DU8) [31]. Для TvDAAO долгое время не удавалось получить кристаллическую структуру. В нашей лаборатории в 2007 году удалось получить кристалл TvDAAO с разрешением 2,8 Ä и 1,8 Ä [32].

На август 2019 года в базе PDB имеется 35 структур оксидаз D-аминокислот (таблица 2.1). Все они представлены тремя ферментами: pkDAAO, RgDAAO и hDAAO. На данный момент наибольший интерес проявляется к структурам hDAAO, поскольку hDAAO проявляет важные физиологические функции и является потенциальной мишенью для ингибирования при лечении нейродегенеративных заболеваний. Так, с момента аннотирования первой структуры человеческой DAAO было опубликовано 18 структур hDAAO, из которых 13 представлены комплексами с различными ингибиторами.

Таблица

Структуры оксидаз D-аминокислот, аннотированные в PDB на август 2019 года.

PDB ID Год Разрешение Фермент Описание* Ссылка

1KIF 1996 2,6 А pkDAAO D-amino acid oxidase from pig kidney [29]

1DAO 1997 3,2 А pkDAAO Covalent adduct of D-amino acid oxidase from pig kidney with 3-methyl-2-oxo-valeric acid [33]

1DDO 1997 3,1 А pkDAAO Reduced D-amino acid oxidase from pig kidney in complex with imino-Trp [33]

1AN9 1997 2,5 А pkDAAO D-amino acid oxidase complex with o-aminobenzoate [34]

1EVI 2000 2,5 А pkDAAO Three-dimensional structure of the purple intermediate of porcine kidney D-amino acid oxidase [35]

1C0K 2000 1,46 А RgDAAO Crystal structure analysis of D-amino acid oxidase in complex with L-lactate [30]

1C0L 2000 1,73 А RgDAAO D-amino acid oxidase: structure of substrate complexes at very high resolution reveal the chemical reacttion mechanism of flavin dehydrogenation [30]

1C0P 2000 1,2 А RgDAAO D-amino acic oxidase in complex with D-alanine and a partially occupied biatomic species [30]

1C0I 2002 1,9 А RgDAAO Crystal structure of D-amino acid oxidase in complex with two anthranylate molecules [36]

1VE9 2004 2,5 А pkDAAO Porcine kidney D-amino acid oxidase [37]

2DU8 2006 2,5 Â hDAAO Crystal structure of human D-amino acid oxidase [31]

2E48 2007 2,9 Â hDAAO Crystal Structure of Human D-Amino Acid Oxidase: Substrate-Free Holoenzyme [38]

2E49 2007 3,2 Â hDAAO Crystal Structure of Human D-Amino Acid Oxidase in Complex with Imino-Serine [38]

2E4A 2007 2,6 Â hDAAO Crystal Structure of Human D-Amino Acid Oxidase in complex with o-aminobenzoate [38]

2E82 2007 2,7 Â hDAAO Crystal structure of human D-amino acid oxidase complexed with imino-DOPA [38]

3CUK 2008 2,49 Â hDAAO Crystal structure of human D-amino acid oxidase: bound to an inhibitor [39]

3G3E 2009 2,2 Â hDAAO Crystal structure of human D-amino acid oxidase in complex with hydroxyquinolin-2(1H) [40]

3ZNN 2013 1,9 Â hDAAO IN VITRO AND IN VIVO INHIBITION OF HUMAN D-AMINO ACID OXIDASE: REGULATION OF D-SERINE CONCENTRATION IN THE BRAIN [41]

3ZNO 2013 2,3 Â hDAAO IN VITRO AND IN VIVO INHIBITION OF HUMAN D-AMINO ACID OXIDASE: REGULATION OF D-SERINE CONCENTRATION IN THE BRAIN [41]

3ZNP 2013 2,4 Â hDAAO IN VITRO AND IN VIVO INHIBITION OF HUMAN D-AMINO ACID OXIDASE: REGULATION OF D-SERINE CONCENTRATION IN THE BRAIN [41]

3ZNQ 2013 2,75 À hDAAO IN VITRO AND IN VIVO INHIBITION OF HUMAN D-AMINO ACID OXIDASE: REGULATION OF D-SERINE CONCENTRATION IN THE BRAIN [41]

3W4I 2013 2,5 À hDAAO Crystal Structure of human DAAO in complex with coumpound 8 [42]

3W4J 2013 2,74 À hDAAO Crystal Structure of human DAAO in complex with coumpound 12 [42]

3W4K 2013 2,86 À hDAAO Crystal Structure of human DAAO in complex with coumpound 13 [42]

3WGT 2014 1,88 À pkDAAO Crystal structure of D-amino acid oxidase mutant [43]

4QFC 2014 2,4 À hDAAO Co-crystal structure of compound 3 (4-hydroxy-6-[2-(7-hydroxy-2-oxo-4-phenyl-2h-chromen-6-yl)ethyl]pyridazin-3(2h)-one) and FAD bound to human DAAO at 2.4A [44]

4QFD 2014 2,85 À hDAAO Co-crystal structure of compound 2 (3-(7-hydroxy-2-oxo-4-phenyl-2H-chromen-6-yl)propanoic acid) and FAD bound to human DAAO at 2.85 [44]

4YJF 2016 2,2 À pkDAAO Crystal structure of DAAO(Y228L/R283G) variant (S-methylbenzylamine binding form)

4YJG 2016 2,5 À pkDAAO Crystal structure of DAAO(Y228L/R283G) variant (R-3-amino 1-phenylbutane binding form)

4YJH 2016 2,7 À pkDAAO Crystal structure of DAAO(Y228L/R283G) variant (R-2-phenylpyrrolidine binding form)

5WWV 2018 3,2 Â pkDAAO Crystal structure of porcine kidney D-amino acid oxidase mutant (I230A/R283G)

5WX2 2018 3 Â pkDAAO Crystal structure of porcine kidney D-amino acid oxidase mutant (I230A/R283G)

5ZJ9 2018 2,6 Â hDAAO human D-amino acid oxidase complexed with 5-chlorothiophene-3 -carboxylic acid [45]

5ZJA 2018 2,6 Â hDAAO human D-amino acid oxidase complexed with 5-chlorothiophene-2-carboxylic acid [45]

*Описание соответствует заголовку структур с сайта http://www.rcsb.org

**Публикация на момент написания отсутствует

Структура RgDAAO 1С0Р была получена в комплексе с D-Ala (рис. 2.1.). Поэтому данная структура может дать хорошее представление о устройстве субстрат-связывающего домена. Связывание карбоксильной группы D-аминокислоты происходит за счет А^285 и Туг223. Связывание аминогруппы происходит при помощи остатков Asn54 и Gln339 через молекулу воды. Также аминогруппа фиксируется кислородом полипептидной цепи остатка Ser335.

Бег335

Рис. 2.1. Связывание D-Ala в структуре RgDAAO. PDB ID 1С0Р. Цифрами указано расстояние в А. Красным цветом обозначены атомы кислорода, синим - азота, светло-синими - углерода. Кислород молекулы воды обозначен красной сферой.

Мы сделали выравнивания структур TvDAAO, pkDAAO и hDAAO к структуре RgDAAO проанализировали остатки, участвующие в связывании карбоксильной и аминогруппы других DAAO. Как видно из таблицы 2.2 данные остатки схожи для TvDAAO и RgDAAO. Различие заключается только в остатке

Gly330 у TvDAAO, соответствующие Ser335 у RgDAAO. Данное отличие несущественно, поскольку у данных остатков кислород полипептидной цепи участвует в связывании. pkDAAO и hDAAO имеют полностью идентичные остатки в этих положениях, однако они сильно отличаются от остатков у дрожжевых DAAO. Вместо остатков Asn54 и Gln339 у RgDAAO у pkDAAO и hDAAO в данных положениях находятся остатки Leu51 и ТИг317. Остаток Leu51 может образовывать водородную связь только кислородом полипептидной цепи, а ТИт317 будет обеспечивать более слабую водородную связь в сравнении с остатком Gln. Возможно более слабые взаимодействия при связывании D-аминокислот и объясняют в большинстве случаев худшие кинетические параметры DAAO из млекопитающих в сравнении с DAAO из микроорганизмов.

Также интересным фактом являются межатомные расстояния при связывании аминогруппы у pkDAAO. В структуре 1DDO, которая была получена в комплексе pkDAAO и иминотриптофаном видно, что отсутствует жестко связанная молекула воды как в случае с дрожжевыми DAAO. Возможно это может приводить к связыванию этих DAAO с более сложными аминокислотами, содержащими на одну -СН2- группу больше, подобных Р-аланину или ^)-Р-аминоизомасляной кислоты. Данные аминокислоты играют важные биохимические функции, однако для подтверждения теории связывания pkDAAO и hDAAO с этими аминокислотами необходимо проводить дополнительные исследования.

Касательно кармана связывания бокового радикала D-аминокислот, то делать какие-то обобщенные выводы сложно, поскольку в структурах DAAO наблюдаются существенные отличия. Кроме того, в связывании боковых радикалов будут участвовать различные остатки в зависимости от размера и природы D-аминокислоты. Отличительную особенность можно указать только для pkDAAO и hDAAO. Для них практически все остатки, участвующие в связывании бокового радикала D-аминокислоты идентичные. Отличия минимальные и заключаются только в остатках 11е215 и Leu215 для pkDAAO и hDAAO соответственно.

Таблица

Остатки, участвующие в связывании карбоксильной и аминогруппы D-аминокислот с структурах RgDAAO, TvDAAO, pkDAAO и hDAAO. Для наглядности остатки выделены цветами, соответствующими цветам на рис

RgDAAO TvDAAO pkDAAO hDAAO

Arg285 Arg302 Arg283 Arg283

Tyr223 Tyr243 Tyr228 Tyr228

Asn54 Asn50 Leu51 Leu51

Gln339 Gln334 Thr317 Thr317

Ser335 Gly330 Gly313 Gly313

В структуре RgDAAO имеется петля на C-конце, которая отсутствует у других DAAO. Эта петля играет ключевую роль в образовании димерной формы RgDAAO. Также у RgDAAO отсутствует петля, которая действует как «крышка» у pkDAAO [30]. Для pkDAAO было показано, что диссоциация продукта лимитирует скорость реакции [46]. Отсутствие данной крышки приводит к более быстрому субстратному фермент-субстратному обмену и большим скоростям реакций.

2.2. Свойства оксидазы D-аминокислот из различных источников

Все DAAO содержат в своем составе молекулу FAD. FAD в составе DAAO проявляет типичный спектр поглощения с двумя основными максимумами поглощения в видимой области (360-380 нм и 455 нм) и один большой пик в ультрафиолетовой области (272-274 нм). Во время каталитического акта два электрона переносятся с субстрата на кофактор. Более того, в некоторых условиях может быть получен красный анионный радикал кофактора FAD. Эта форма проявляет спектр с большим пиком на 375 нм [9, 47]. Молекула FAD также является флуорофорум с максимумом эмиссии на 530 нм при экстинкции на 450 нм. Однако эмиссия значительно ниже, чем для свободной формы FAD [48].

2.2.1. Кинетические свойства

DAAOs проявляют широкий спектр субстратной специфичности и сильную стереоселективность (они не реагируют с L-аминокислотами и L-аминокислоты не являются ингибиторами). ApDAAO является исключением и L-Met незначительно ингибирует ApDAAO (Ki = 315 мМ) [6]. К сожалению прямое сравнение кинетических свойств для различных DAAO не представляется возможным, поскольку данные получены в различных условиях. В целом, дрожжевые DAAOs проявляют более высокие значения активностей в сравнении с DAAO из млекопитающих. DAAOs по их субстратной специфичности можно поделить на 2 группы. Первые наиболее активны с D-аминокислотами, содержащими небольшие неполярные боковые группы (D-Ala наилучший субстрат для них). К этой групп относятся CbDAAO, DAAO из Candidaparapsilosis и DAAO из Fusarium oxysporum. Вторые наиболее активны с D-аминокислотами, содержащими большие гидрофобные боковые группы (D-Phe, D-Trp и D-Met) [22, 49]. Обычно глицин и заряженные аминокислоты являются плохими субстратами для DAAOs. Однако, бывают исключения. TvDAAO взаимодействует с D-Arg и D-Lys. DAAO из Candida parapsilosis взаимодействует с D-Glu. pkDAAO проявляет наибольшую активность с D-Pro, за ним следуют D-Met, D-Ala, D-norLeu, D-Ile и D-Phe. pkDAAO также не взаимодействует с заряженным аминокислотами [50].

Некоторые DAAO способны окислять неприродные соединения, интересные с биотехнологической точки зрения. Например, RgDAAO и TvDAAO эффективно окисляют цефалоспорин С [51]. TvDAAO и RgDAAO имеют сравнимые значения каталитических констант в реакции окисления цефалоспорина С и они более чем в 100 раз выше, чем для pkDAAO. Учитывая высокую гомологию аминокислотных последовательностей DAAO из млекопитающих можно сделать предположение, что другие DAAO из млекопитающих также будут являться плохими катализаторами окисления цефалоспорина C. Значения константы Михаэлиса для TvDAAO почти в два раза ниже, чем у RgDAAO. Это делает TvDAAO наиболее перспективным

ферментом для использования в окислении цефалоспорина С среди описанных в литературе.

Что касается каталитического механизма, то имеется большое количество доказательств, что реакция происходит посредством переноса гидрид иона с D-аминокислоты на изоаллоксазиновое кольцо молекулы FAD (восстановительная полуреакция). Затем происходит окисление кофактора молекулой кислорода, в результате чего образуется пероксид водорода (окислительная полуреакция). Исследование стационарной кинетики для RgDAAO и TvDAAO с D-Ala и D-Val в качестве субстратов и различной концентрацией кислорода указало на то, что реакция протекает по механизму «пинг-понг» [52]. Однако более позднее исследование двух полуреакций в остановленной струе указывает на механизм тройного комплекса, в котором отщепление протона от D-аминокислоты и окисление FAD полностью необратимы. Также было показано, что скорость реакции лимитируется окислением молекулы FAD.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биоинженерия каталитических свойств и стабильности дрожжевой оксидазы D-аминокислот»

2.2.2. Стабильность

Благодаря широкому кругу практического применения DAAO были активно исследованы стабильности в различных условиях. RgDAAO и TvDAAO имеют схожие профили pH-стабильности. Ферменты наиболее стабильны в диапазоне от 6 до 8. При pH выше 8 наблюдается медленное падение стабильности [51]. CbDAAO проявляет более высокую стабильность в щелочных pH, оставаясь стабильной вплоть до pH 10,5 [53]. Фермент ApDAAO имеет схожий профиль pH-стабильности как и для дрожжевых DAAO и стабилен между pH 6 и 9 [6].

Наибольшие отличия наблюдаются в температурной стабильности. TvDAAO наиболее стабильный фермент среди описанных. Он полностью стабилен при 45 °C в течение 30 минут, в то время как RgDAAO в данных условиях полностью инактивируется [51]. Стабильность к действию повышенных температур для CbDAAO и ApDAAO схожа со стабильностью для RgDAAO, и они полностью инактивируются при 50 °С [6, 53].

Неоднократно было показано, что концентрации DAAO часто влияет на их температурную стабильность [51, 54, 55]. Для RgDAAO это выражается в значительном увеличении температуры Тm (температуры, при которой фермент теряет половину активности при 30 мин инкубации) с 48 °С при концентрации 0,1 мг/мл до 57 °С при 3,5 мг/мл [54]. В другой работе было показано, что уменьшение концентрации RgDAAO в три раза (с 0,15 до 0,05 мг/мл) приводит к снижению периода полуинактивации при 48 °С с 8 часов до 45 мин [56].Таким образом было доказано, что диссоциация RgDAAO на субъединицы является первой стадией процесса термоинактивации. Стоит отметить, что для pkDAAO, которая проявляет активность в мономерной форме, такой зависимости не наблюдается. Что доказывает, что термоинактивация мономерных и димерных DAAO происходит по различным механизмам [57].

В нашей лаборатории был подробно изучен процесс термоинактивации рекомбинантной TvDAAO [49]. Было показано, что TvDAAO наиболее устойчива в диапазоне pH = 7,0-8,0, а процесс ее термоинактивации в диапазоне температур 50^60 °C протекает согласно диссоциативному механизму (рис. 2.2) [58]. При этом зависимость остаточной активности от времени описывается суммой двух экспоненциальных функций, и стабильность фермента зависит от его концентрации.

h к2 Е2 ^^ 2Е —► Eden к. 1

Рис. 2.2. Механизм диссоциативной термоинактивации TvDAAO. E2 - активный димерная форма, E - неактивный мономерная форма, Eden - денатурированная форма TvDAAAO, ki и k-1 - прямая и обратная константы скорости диссоциации фермента, k2 - константа скорости инактивации мономерной формы.

Наличие экзогенного FAD значительно стабилизирует RgDAAO, в то время как на TvDAAO не оказывает значительного эффекта [51]. Другими авторами было показано, что наличие экзогенного FAD влияет на стабильность TvDAAO [55].

DAAO могут инактивироваться пероксидом водорода. Это проблема особенно актуальна для DAAO, поскольку одним из продуктов катализируемой реакции является пероксид водорода. Апоформа DAAO обычно менее стабильно к действию

пероксида водорода [48, 55]. TvDAAO очень чувствителен к окислению. При хранении TvDAAO наибольшую стабильность фермент проявлял при добавлении тиол-содержащих добавок (ß-меркаптоэтанол, дитиотреитол и восстановленный глутатион) в присутствии ЭДТА в анаэробных условиях [59]. Титрование TvDAAO реактивом Эллмана приводило к инактивации TvDAAO, коррелирующей с модификацией двух остатков цистеина на одну субъединицу TvDAAO [27]. Было исследовано влияние окисления остатка Cys108 у TvDAAO на свойства фермента. Окисление остатка Cys108 приводило в четырехкратному снижению активности и двукратному уменьшению стабильности TvDAAO [60]. Попытки направленного мутагенеза данного остатка (замены Cys108Ser и Cys108Asp) привели к снижению активности и температурной стабильности [61]. В нашей лаборатории были получены мутантные формы с заменами Cys108Ala, Cys108Ser и Cys108Phe [32, 6264]. Мутантные формы TvDAAO Cys108Ala и TvDAAO Cys108Phe проявляли более высокую каталитическую эффективность при окислении цефалоспорина C. Кроме того, замена Cys108Phe приводила к увеличению температурной стабильности TvDAAO. Стабильность данных мутантов к действию окислителей не изучалась. Группой авторов из Тайваня были получены мутантные формы TvDAAO с заменами остатков метионина [65]. Согласно утверждениям авторов замены Met104Leu, Met156Leu и Met209Leu привели к увеличению стабильности TvDAAO при окислении пероксидом водорода. Однако, как будет показано в данной работе, введение данных замен не привело в нашем случае к изменению стабильности к действию пероксида водорода [66].

2.3. Применение оксидазы D-аминокислот DAAO используется в различных биотехнологических процессах [5]. Одним из них является процесс получения чистых L-аминокислот из смесей рацематов. Чистые L-аминокислоты используются как пищевые добавки, компоненты растворов для инъекций и как исходный материал для фармацевтического производства. Иммобилизованная TvDAAO с растворенной каталазой из Micrococcus lysodeikticus была использована для разделения смеси рацематов

D,L-Phe [67]. Выход а-кетокислоты составил практически 100 %, однако L-Phe составляет только 50 % от исходного количества.

С использованием DAAO были получены оптически чистые неприродные нафтиламинокислоты, которые используются при разработке лекарств [68]. Также была получена мутантная форма RgDAAO Met213Gly, которая проявляла лучшие кинетические свойства с некоторым нафтиламинокислотами чем RgDAAO дикого типа. Практически полная конверсия смеси рацематов в L-аминокислоту была достигнута при комбинировании DAAO, L-аспартат аминотрансферазы и каталазы [69] (рис. 2.3). Так как реакция L-аспартат аминотрансферазы равновесная, то для полной конверсии целевой а-кетокислоты в L-aминокислоту необходимо постоянно иметь избыток второго субстрата для L-aспaртaт аминотрансферазы. В качестве такого субстрата была использована цистеин сульфокислота, которая преобразуется в нестабильную Р-кетосульфиновую кислоту, которая разлагается с образованием пирувата и диоксида серы. Благодаря такой системе L-формa составляла 99,5% от общего количества аминокислоты.

Определение D-aминокислот в биологических объектах интересно для пищевой промышленности. D-aминокислоты являются компонентами пептигликанов бактериальной стенки и их присутствие в пищевых продуктах может быть показателем свежести и бактериальных загрязнений [70]. В последнее время определение D- и L-aминокислот в биологических объектах становится все более актуальной задачей для медицины. Уровень различных D-aминокислот можно использовать для диагностики нейродегенеративных заболеваний [3].

Традиционные аналитические методы определения D-aминокислот технически сложные, включают множество стадий и требуют разнообразного оборудования. В основном используются газовая и обращенно-фазовая жидкостная хроматографии [71].

соон

соон

, _ ^соон т2

цистеин сульфокислота

СООН

соон

+ эо5

Рис. 2.3. Схема получения оптически чистого L-2-нафтилаланина. LAspAT - L-аспартат аминотрансфераза.

Хроматографические методы достоверные и чувствительные, однако они занимают много времени и не подходят для пищевой промышленности. Были разработаны сенсоры различной чувствительности и селективности на основе DAAO [72-81]. Часто эти сенсоры комбинируют со вторым ферментом, таким как пероксидаза из корней хрена [82-85] или пируват оксидаза [86]. В последнее время все больше работ, связанных с созданием сенсоров на основе DAAO с одновременной иммобилизаций на наноматериалах [81, 87]. В работе 2016 года удалось создать сенсор на основе DAAO и многостенных углеродных нанотрубок, функцианализированных перилен-3,4,9,10-тетракарбоновой кислотой, предел обнаружения которого по D-Ala достиг 3,3 10-9 М, а линейный диапазон определения составлял 1,010-8 - 1,010-3 М [87].

Интересные аналитические применения нашла апо-форма DAAO (apo-DAAO). apo-DAAO может быть использована для определения различных гидролаз, в частности щелочной фосфатазы [88]. Детекция основана на расщеплении гидролазами производных молекулы FAD, с последующим определением активности DAAO (рис. 2.4). Активность DAAO может быть определена с любым подходящим субстратом. Выделяемый в ходе реакции пероксид водорода может быть определен стандартным методом при помощи пероксидазы из корней хрена и любым подходящим субстратом. Апо-фермент не обязательно должен быть DAAO. Вместо apo-DAAO можно использовать оксидазу L-аминокислот, глюкозооксидазу и др. Однако многие апо-формы DAAO хорошо изучены и некоторые из них обладают большой стабильностью. Подобные каскады усиления сигнала с FADP и DAAO могут быть использованы в различных системах, включая иммунноанализ и гибридизацию нуклеиновых кислот [89, 90].

FADP

щелочная фосфатаза

apo-DAAO + FAD

holo-DAAO пируват -е-^—^-D-аланин

Н202 02

определение

НА

Рис. 2.4. Схема определения щелочной фосфатазы при помощи апо-формы DAAO. аро-ОААО - апо-форма DAAO, ^1о-ОААО - холо-форма DAAO.

Белковая инженерия pkDAAO позволила получить мутантные формы полностью неактивные с D-аминокислотами, но способные окислять энантиомеры замещенных бензиламинов, которые являются важными соединениями для

фармацевтической промышленности. Так pkDAAO Tyr228Leu/Arg283Gly замещенные бензиламины, а pkDAAO Ile230Ala/Arg283Gly эффективно окисляет замещенные дибензиламины амины [43, 91]. Было показано, что данные ферменты катализируют реакцию посредством переноса протона с амина, то есть также, как и в случае с D-аминокислотами для DAAO дикого типа [92]. Для данных мутантных форм pkDAAO в 2018 году были получены кристаллические структуры (PDB ГО: 4YJF, 4YJG, 4YJH, 5WWV, 5WX2), однако полноценной статьи, описывающей данные структуры авторы еще не написали.

DAAO также может быть использована вместе с ^)-селективными трансаминазами для разделения смесей энантиомеров различных аминов [93]. DAAO используется для обратного превращения D-Ala в пируват, который используется трансаминазой. Были созданы ковалентные конструкции трансаминазы и DAAO посредством белкового сплайсинга, которые повысили эффективность данного процесса [94].

Несмотря на широкое применении DAAO, наиболее важным процессом с использованием DAAO является процесс получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК) из цефалоспорина С. Ежегодное производство 7-АЦК составляет более 2000 тонн и общий рынок составляет более 400 миллионов долларов США. 7-АЦК является прекурсором множества цефалоспориновых антибиотиков различных поколения, включая цефотаксим, цефтриаксон, цефазолин, цефоперазон, цефиксим и др. Общий рынок антибиотиков оценивается в 10 миллиардов долларов США [95, 96].

На данный момент существует несколько способов получения 7-АЦК. Исторически 7-АЦК получали химическим методом, начиная с 1970-х годов. Для данного метода необходимо использовать большое количество опасных органических растворителей [96]. Был разработан биокаталитический метод. Он основан на использовании двух ферментов: DAAO и глутарил-7-АЦК-ацилазы (GLA). Схема процесса представлена на рис. 2.5. DAAO катализирует превращение цефалоспорина С в а-кетоадипил-7-АЦК. а-кетоадипил-7-АЦК затем неферментативно

декарбоксилизируется в глутарил-7-АЦК при помощи пероксида водорода. Затем GLA гидролизует глутарил-7-АЦК в 7-АЦК. Для биокаталитического метода количество отходов почти в 10 раз меньше, а стоимость продукта почти в 2 раза ниже. Недостатком биокаталитического метода является сложность стандартизации и высокие требования к персоналу ввиду сложности процесса.

Иммобилизированные ферменты показывают значительно большую стабильность. Иммобилизация на глиоксил-агарозе привела к ~ 15000 кратному увеличению температурной стабильности RgDAAO благодаря стабилизации димерной формы [56]. Для TvDAAO эффект был значительно ниже при иммобилизации на различных подложках. Это обуславливается тем, что TvDAAO изначально обладает намного большей температурной стабильностью чем RgDAAO.

В последнее время все чаще появляются работы, связанные с иммобилизацией DAAO на различных наноматериалах [97-99]. Была оптимизирована иммобилизация RgDAAO на мезопористом диоксиде кремния с использованием аффинной полипептидной сшивки [99]. Наличие аффинной сшивки повысило активность и стабильность иммобилизованной RgDAAO в сравнении с иммобилизацией без её использования. Было проведено сравнение иммобилизации DAAO на наноматериалах MCF, SBA-15 и MCM-41 [98]. Активность и стабильность иммобилизованных вариантов DAAO уменьшалась в ряду: MCF > SBA-15 > MCM-41.

Иммобилизация приводит к уменьшению активности DAAO в основном из-за ограничений диффузии молекулярного кислорода. Увеличение давления кислорода приводит к увеличению активности DAAO, однако одновременно с этим уменьшает операционную стабильность. Был получен химерный белок RgDAAO с гемоглобином из бактерии Vitreoscilla, который в иммобилизованном виде проявлял в 12,5 более высокую каталитическую эффективность чем RgDAAO, иммобилизованный отдельно [100].

Биоконверсия с использованием DAAO может быть проведена с целыми клетками. Диффузные ограничения могут быть уменьшены пермеабилизацией клеток [101]. Агрегаты клеток Trigonopsis variabilis были получены пермеабилизацией, а

затем сшиванием полиэтиленамином с глутаровым альдегидом [102]. В результате время полуинактивации составило 142 цикла с 92% конверсией цефалоспорина C в каждом цикле. Важным ограничением в использовании целых клеток является наличие активных каталаз и эстераз, которые уменьшают чистоту глутарил-7-АЦК и уменьшают выходы реакции. Был сконструирован штамм E. coli D11, которой не может продуцировать каталазу и ß-лактамазу [103]. Данный штамм был использован для одновременной экспрессии DAAO и GLA. В результате удалось достигнуть выхода 7-АЦК, равного 74 %. Одним из основных недостатков ферментов является операционная стабильность. Эта проблема особенно актуальна для процесса получения 7-АЦК, поскольку одним из продуктов реакции окисления цефалоспорина C является пероксид водорода, который может окислять ферменты [101]. Для решения проблемы окисления пероксидом водорода была разработана трехферментативная система DAAO-GLA-каталаза [104]. При использовании данной системы образовавшийся пероксид водорода сразу разлагается, поэтому не происходит такого сильного окисления ферментов как без использования каталазы. Однако также не происходит конверсии а-кетоадипил-7-АЦК в глутарил-7-АЦК и GLA гидролизует непосредственно а-кетоадипил-7-АЦК. Недостатком данной системы является то, что GLA намного менее активна по отношению а-кетоадипил-7-АЦК в сравнении с активностью с гулатрил-7-АЦК, однако удалось достичь выхода ~ 80 %. Авторами также было исследовано использование трех реакторов, в одном из которых происходит окисление цефалоспорина C в а-кетоадипил-7-АЦК посредством системы DAAO-каталаза, во втором декарбоксилирование а-кетоадипил-7-АЦК пероксидом водорода в глутарил-7-АЦК, а в третьем гидролиз глутарил-7-АЦК в 7-АЦК при помощи GLA. В таком случае не происходило окисление ферментов пероксидом водорода, однако общий выход 7-АЦК составил только 47 % и наблюдалось большое количество примесей. Это было обусловлено низкой стабильностью а-кетоадипил-7-АЦК во время продолжительной реакции в первом реакторе, что привело к образованию большого количества примесей, не реагирующих с GLA.

Также активно разрабатывается подход с использование цефалоспорин С ацилазы вместо GLA [4, 105, 106]. Цефалоспорин С ацилазой называют модифицированную GLA, которая проявляет активность в расщеплении цефалоспорина С. Такой подход может позволить полностью исключить DAAO из биокаталитического метода, однако на данный момент лучшая цефалоспорин С ацилаза расщепляет цефалоспорин С примерно в 20 раз хуже, чем она же расщепляет глутарил-7-АЦК.

кетоади п ил-7-АЦК

со,, н,о

глутарил-7-АЦК

„ЛХу

но'^о

О-А

Рис. 2.5.

7-АЦК

НО" ^О

Биокаталитическая схема синтеза 7-аминоцефалоспорановой кислоты. 7-АЦК - 7-аминоцефалоспорановая кислота. DAAO - оксидаза D-аминокислот. GLA -глутарил-7-АЦК-ацилаза.

2.3. Белковая инженерия оксидазы D-аминокислот из дрожжей

Trigonopsis variabilis

Первые работы по инженерии TvDAAO заключались в получении рекомбинантной формы фермента с удаленным интроном при помощи ПЦР [107]. Полученный фермент был экспрессирован в клетках E. coli. Также в данной работе к полученному гену также были добавлены 6 остатков Hisи один остаток фенилаланина на N-конец. Во время очистки при помощи металл-аффинной хроматографии с Ni2+ И Cu2+ фермент необратимо связывался с носителем и инактиваировался. Очистку удалось провести при использовании Co2+ в металл-аффинной хроматографии, поскольку Co2+ слабее связывает остатки гистидина. Также модифицированная форма TvDAAO с гистидиновой меткой была экспрессирована в клетках Pichia pastoris под контролем промотора алкоголь оксидазы и под контролем промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы [108]. Под контролем промотора глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы экспрессия TvDAAO проходила быстрее, чем под контролем промотора алкоголь оксидазы. Была проведена очистка химерной формы TvDAAO при помощи металл-аффинной хроматографии с Co2+.

Интересной является работа, в которой были сшиты две субъединицы TvDAAO при помощи дипепетида Lys-Leu [109]. Авторы утверждают, что сшивка привела к небольшому увеличению температурной стабильности, а также к увеличению стабильности при окислении пероксидом водорода в 1,5 раза. Однако, результаты, полученные данными авторами требует более глубокого изучения поскольку неясно как происходит сшивание двух субъединиц. Исходя из структуры TvDAAO С-конец субъединицы первой и N-конец второй субъединицы находятся на удалении более 60 А друг от друга.

Были получены гибридные ферменты TvDAAO с мальтоза-связывающим белком и TvDAAO с гемоглобином из бактерии Vitreoscilla [110]. К сожалению авторы опубликовались к китайском журнале и полный текст статьи недоступен. По информации из доступной аннотации сшивка с мальтоза-связывающим белком привела к почти в 4 раза большей растворимости TvDAAO при экспрессии в E. coli

BL21 (DE3), однако гибридный фермент обладал намного более низкой активностью. TvDAAO, сшитый с гемоглобином, проявлял почти в два раза более высокой активностью в культуральной среде. Отсутствует информация связано ли это с повышением локальной концентрации кислорода или с увеличением выхода растворимого фермента при культивировании.

TvDAAO был экспрессирован совместно с GLA в клетках E. coli BL21(DE3), используя pET плазмиду [111]. Уровень экспрессии TvDAAO и GLA отдельно друг от друга составлял 250 Ед/л и 3000 Ед/л соответственно. При объединении уровень экспрессии снизился до 140 Ед/л для TvDAAO и 950 Ед/л для GLA. Было показано, что такие клетки могут конвертировать цефалоспорин C прямо в 7-АЦК. Однако происходило накопление большого количества глутарил-7-АЦК.

Был получен химерный белок GLA-линкер-TvDAAO, способный напрямую преобразовывать цефалоспорин C в 7-АЦК [112]. Клетки E. coli, содержащие химерный белок GLA-линкер-TvDAAO могут преобразовывать цефалоспорин C прямо в 7-АЦК, однако, как и в предыдущей работе, происходило накопление большого количества интермедиата глутарил-7-АЦК. В обратной конструкции TvDAAO-линкер-GLA не было обнаружено ацилазной активности, в то время как оксидаза D-аминокислот проявляла активность.

Была изучена роль остатка Asp206 в связывании молекулы FAD [113]. Для этого были получены 6 мутантных форм TvDAAO с заменами данного остатка на Ala, Glu, Leu, Asn, Gly и Ser. Все замены привели к ухудшению кинетических свойств TvDAAO. Наименьшее влияние оказала замена Asp206Glu, что объясняется схожестью остатков глутамата и аспартата. Замены Asp206Ser привела к снижению активности TvDAAO в 3 раза, замена Asp206Ala привела к снижению активности почти в 20 раз. Мутантные формы с заменами Asp206Gly, Asp206Leu и Asp206Asn привели к полной потери активности фермента. Наличие ферментов во всех случаях было доказано проведением Вестерн-блот анализа. Также снижение активности при введении замен коррелировало со спектром поглощения, соответствующего молекуле FAD. В случае замен, которые не проявляли активность (Asp206Gly, Asp206Leu и Asp206Asn) спектр поглощения

молекулы FAD отсутствовал. Исходя из этих данных авторы сделали вывод, что данный остаток участвует в поддержании стабильной структуры TvDAAO, которая необходима для связывания молекулы FAD. Данные выводы являются неинформативными, поскольку любой аминокислотный остаток в ферменте является важным для подержания его правильной структуры. Также практически всегда можно найти аминокислотную замену, которая приведет к дестабилизации фермента. Исходя из структуры TvDAAO (рис. 2.6 А) остаток Asp206 находится на расстоянии более 10 Â до ближайшего атома молекулы FAD и не принимает непосредственного участия в связывании молекулы FAD. Остаток Asp206 образует водородные связи с боковыми радикалами остатков Tyr326 и Arg305, а также с азотом полипептидной цепи остатка Lys208. Кроме того, рядом с остатком Asp206 располагаются положительно заряженные остатки Lys208 и Arg310, которые в растворе могут образовывать дополнительны ионные взаимодействия с отрицательно заряженным остатком Asp206. Исходя из окружения остатка Asp206 понятно, что введение нейтрально заряженного остатка в данное положение должно привести к дестабилизации структуры в целом, что мы и наблюдаем в данной статье. И эффект дестабилизации не связан непосредственно со взаимодействием остатка с молекулой FAD.

Кроме того, в статье авторы проводили очистку фермента при помощи гистидиновой метки, что приводит к совместной очистке как апо-формы, так и холо-формы фермента. Затем авторы находят концентрацию TvDAAO методом Брэдфорда с БСА в качестве стандарта и исходя из кинетических данных определяют значения каталитических констант и удельных активностей мутантных ферментов. Данная методика является некорректной, поскольку значения каталитических констант и удельных активностей могут быть значительно занижены вследствие совместной очистки холо-формы и апо-формы TvDAAO при использовании металл-аффинной хроматографии.

Также данной группой ученых подобным образом была исследована роль остатка His324 [114]. Для этого были получены мутантные формы TvDAAO с заменами остатка His324 на остатки Leu, Arg, Tyr, Glu, Ala, Lys, Gln и Asn. Наименьшее влияние

на активность оказали замены на остатки Asn и Gln. Замены на Leu, Arg и Lys привели к полной потере активности фермента. Авторы снова делают предположение, что данный остаток является важным для связывания молекулы FAD и для каталитической активности. Эти выводы также являются некорректными.

При анализе окружения данного остатка в структуре TvDAAO (рис. 2.6 Б) видим, что His324 образует водородные связи с остатками Asn192 и Glu314. Этим объясняется то, что замены на Gln и Asn привели к наименьшему уменьшению активности, поскольку данные остатки также могут образовывать две аналогичные водородные связи. Кроме того, остаток His324 также находится на расстоянии более 10 Â от близлежащего атома молекулы FAD и не принимает непосредственного участия в связывании.

Рис. 2.6. Расположение остатков Asp206 (А) и Н^324 (Б) в структуре TvDAAO.

Данной группой ученых была опубликована работа [115], в которой методом случайного мутагенеза были получены неактивные мутантные TvDAAO с заменами: Val167Ala, Pro309Ser, Рго29^ег, А1а343А8р. Из этого авторы сделали вывод, что данные остатки необходимы для наличия активности TvDAAO. Этот вывод некорректен и активность данные мутантные TvDAAO наиболее вероятно не проявляли из-за сильной дестабилизации структуры TvDAAO при введении данных замен. Исходя из структуры остатки Val167, Рго309, Рго291 и Ala343 находятся на большом удалении от активного

А

Б

центра. Замены Pro309Ser и Pro291Ser скорее всего привели к дестабилизации за счет большей подвижности Ca атома остатка Ser в сравнении с остатком Pro. Val167 находится рядом с гидрофобными остатками Val30 и Leu180, и по-видимому замена Val167Ala привела дестабилизации за счет уменьшения гидрофобных взаимодействий. Остаток Ala343 находится внутри белковой глобулы в гидрофобном кармане и замена на Asp очевидно должна привести к сильной дестабилизации.

Также данной группой ученых были получены мутантные формы TvDAAO с заменами остатков метионина [65]. Согласно утверждениям авторов замены Met104Leu, Met156Leu и Met209Leu привели к увеличению стабильности TvDAAO к действию пероксида водорода. Однако, как будет показано в данной работе, введение данных замен в нашем случае не привело в нашем случае к изменению стабильности к действию пероксида водорода [66].

Была изучена роль остатков Arg169 и Arg220 в стабильности TvDAAO [116]. Остатки Arg169 и Arg220 располагаются в месте межсубъединичного контакта и образуют по 2 водородные связи между двумя субъединицами. Были введены замены Arg220Glu и Arg169Ala/Arg220Ala. Введение замен привело к отсутствию растворимой формы TvDAAO при экспрессии в клетках E. coli. Мутантные ферменты экспрессировались в тельцах включения, которые проявляли активность в отношении D-аминокислот, однако спектр субстратной специфичности существенно изменился. Остатки Arg169 и Arg220 располагаются далеко от активного центра и полученные результаты свидетельствуют о том, что наличие межсубъединичного контакта необходимо для обеспечения субстратной специфичности. Кроме того, исходя из структуры TvDAAO область межсубъединичного контакта участвует в формировании кислородного канала фермента, что также может объяснять изменение спектра субстратной специфичности. Также в данной работе было показано, что замены привели к сильному уменьшению температурной стабильности. Tm (температура, при которой происходит потеря 50% активности за 30 мин) для TvDAAO Arg220Glu и TvDAAO Arg169Ala/Arg220Ala уменьшилась на 26 и 34 °C соответственно. Полученные данные

могут свидетельствовать о том, что наличие межсубъединичного контакта значительно стабилизирует структуру TvDAAO.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Атрошенко Денис Леонидович, 2019 год

VI. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Krebs H.A. Metabolism of amino-acids: Deamination of amino-acids // Biochem. J. 1935. № 29(7). С. 1620-1644.

2. Massey V., Hemmerich P. Active-site probes of flavoproteins // Biochem. Soc. Trans. 1980. № 8(3). С. 246.

3. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. D-amino acid oxidase: physiological role and applications // Biochemistry (Moscow). 2008. № 73(13). С. 1511-8.

4. Conti G., Pollegioni L., Rosini E. One-pot conversion of cephalosporin C by using an optimized two-enzyme process // Catal. Sci. Technol. 2015. № 5(3). С. 1854-1863.

5. Pollegioni L., Molla G., Sacchi S., Rosini E., Verga R., Pilone M.S. Properties and applications of microbial D-amino acid oxidases: current state and perspectives // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. № 78(1). С. 1-16.

6. Geueke B., Weckbecker A., Hummel W. Overproduction and characterization of a recombinant D-amino acid oxidase from Arthrobacter protophormiae // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. № 74(6). С. 1240-1247.

7. Settembre E.C., Dorrestein P.C., Park J.-H., Augustine A.M., Begley T.P., Ealick S.E. Structural and Mechanistic Studies on ThiO, a Glycine Oxidase Essential for Thiamin Biosynthesis in Bacillus subtilis // Biochemistry. 2003. № 42(10). С. 2971-2981.

8. Mörtl M., Diederichs K., Welte W., Molla G., Motteran L., Andriolo G., Pilone M.S., Pollegioni L. Structure-Function Correlation in Glycine Oxidase from Bacillus subtilis // J. Biol. Chem. 2004. № 279(28). С. 29718-29727.

9. Pilone M.S., Vanoni M.A., Casalin P. Purification and properties of d-amino-acid oxidase, an inducible flavoenzyme from Rhodotorula gracilis // Biochim. Biophys. Acta - Protein Struct. Mol. Enzymol. 1987. № 914(2). С. 136-142.

10. Zwart K.B., Veenhuis M., Harder W. Significance of microbodies in the metabolism of L-aspartate in Candida utilis // FEMSMicrobiol. Lett. 1983. № 19. С. 273-279.

11. Kubicek-Pranz E.M., Röhr M. D-amino acid oxidase from the yeast Trigonopsis variabilis //Appl. Biochem. Biotechnol. 1985. № 7(2). С. 104-113.

12. Suiter G.J., Waterham H.R., Goodman J.M., Veenhuis M. Proliferation and metabolic significance of peroxisomes in Candida boidinii during growth on d-alanine or oleic acid as the sole carbon source // Arch. Microbiol. 1990. № 153(5). C. 485-489.

13. Isogai T., Ono H., Ishitani Y., Kojo H., Ueda Y., Kohsaka M. Structure and Expression of cDNA for D-Amino Acid Oxidase Active against Cephalosporin C from Fusarium solani // J. Biochem. 1990. № 108(6). C. 1063-1069.

14. Yurimoto H., Hasegawa T., Sakai Y., Kato N. Physiological role of the D-amino acid oxidase gene, DAO1, in carbon and nitrogen metabolism in the methylotrophic yeast Candida boidinii // Yeast. 2000. № 16(13). C. 1217-1227.

15. Gabler M., Fischer L. Production of a new D-amino acid oxidase from the fungus Fusarium oxysporum // Appl. Environ. Microbiol. 1999. № 65(8). C. 3750-3753.

16. Gabler M., Hensel M., Fischer L. Detection and substrate selectivity of new microbial D-amino acid oxidases // Enzyme Microb. Technol. 2000. № 27(8). C. 605-611.

17. Perotti M.E., Pollegioni L., Pilone M.S. Expression of D-Amino Acid Oxidase in Rhodotorula Gracilis under Induction Conditions: a Biochemical and Cytochemical Study // Eur. J. Cell Biol. 1991. № 55(1). C. 104-113.

18. Sakai Y., Yurimoto H., Matsuo H., Kato N. Regulation of peroxisomal proteins and organelle proliferation by multiple carbon sources in the methylotrophic yeast, Candida boidinii // Yeast. 1998. № 14(13). C. 1175-1187.

19. Pilone M.S., Verga R., Fretta A., Hanozet G.M. Induction of d-Amino-acid Oxidase by d-Alanine in Rhodotorula gracilis Grown in Defined Medium // Microbiology. 1989. № 135(3). C. 593-600.

20. Horner R., Wagner F., Fischer L. Induction of the d-Amino Acid Oxidase from Trigonopsis variabilis // Appl. Environ. Microbiol. 1996. № 62(6). C. 2106-2110.

21. Pollegioni L., Molla G., Campaner S., Martegani E., Pilone M.S. Cloning, sequencing and expression in E. coli of a d-amino acid oxidase cDNA from Rhodotorula gracilis active on cephalosporin C // J. Biotechnol. 1997. № 58(2). C. 115-123.

22. Pollegioni L., Piubelli L., Sacchi S., Pilone M.S., Molla G. Physiological functions of D-amino acid oxidases: from yeast to humans // Cell. Mol. Life Sci. 2007. № 64(11). C. 1373-1394.

23. Pollegioni L., Sacchi S., Caldinelli L., Boselli A., Pilone M.S., Piubelli L., Molla G. Engineering the properties of D-amino acid oxidases by a rational and a directed evolution approach // Curr. Protein Pept. Sci. 2007. № 8(6). C. 600-618.

24. Faotto L., Pollegioni L., Ceciliani F., Ronchi S., Pilone M.S. The primary structure of D-amino acid oxidase from Rhodotorula gracilis // Biotechnol. Lett. 1995. № 17(2). C. 193-198.

25. Sarower M.G., Okada S., Abe H. Molecular characterization of D-amino acid oxidase from common carp Cyprinus carpio and its induction with exogenous free D-alanine // Arch. Biochem. Biophys. 2003. № 420(1). C. 121-129.

26. Szwajcer E., Mosbach K. Isolation and Partial Characterization of a D-Amino-Acid Oxidase Active against Cephalosporin-C from the Yeast Trigonopsis Variabilis // Biotechnol. Lett. 1985. № 7(1). C. 1-7.

27. Schrader T., Andreesen J.R. Studies on the inactivation of the flavoprotein D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1996. № 45(4). C. 458-64.

28. Molla G., Sacchi S., Bernasconi M., Pilone M.S., Fukui K., Pollegioni L. Characterization of human D-amino acid oxidase // FEBS Lett. 2006. № 580(9). C. 2358-2364.

29. Mattevi A., Vanoni M.A., Todone F., Rizzi M., Teplyakov A., Coda A., Bolognesi M., Curti B. Crystal structure of D-amino acid oxidase: a case of active site mirror-image convergent evolution with flavocytochrome b2 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. № 93(15). C. 7496-7501.

30. Umhau S., Pollegioni L., Molla G., Diederichs K., Welte W., Pilone M.S., Ghisla S. The x-ray structure of d-amino acid oxidase at very high resolution identifies the chemical mechanism of flavin-dependent substrate dehydrogenation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. № 97(23). C. 12463-12468.

31. Kawazoe T., Tsuge H., Pilone M.S., Fukui K. Crystal structure of human D-amino acid oxidase: context-dependent variability of the backbone conformation of the VAAGL hydrophobic stretch located at the si-face of the flavin ring // Protein Sci. 2006. № 15(12). C. 2708-2717.

32. Хороненкова С.В. Рекомбинантная оксидаза D-аминокислот: получение и структрурно-функциональные исследования // Дис.канд.хим.наук. М. МГУ. 2008. 162 с.

33. Todone F., Vanoni M.A., Mozzarelli A., Bolognesi M., Coda A., Curti B., Mattevi A. Active Site Plasticity in d-Amino Acid Oxidase: A Crystallographic Analysis // Biochemistry. 1997. № 36(19). С. 5853-5860.

34. Miura R., Setoyama C., Nishina Y., Shiga K., Mizutani H., Miyahara I., Hirotsu K. Structural and Mechanistic Studies on D-Amino Acid Oxidase ■ Substrate Complex: Implications of the Crystal Structure of Enzyme ■ Substrate Analog Complex // J. Biochem. 1997. № 122(4). С. 825-833.

35. Mizutani H., Miyahara I., Hirotsu K., Nishina Y., Shiga K., Setoyama C., Miura R. Three-Dimensional Structure of the Purple Intermediate of Porcine Kidney D-Amino Acid Oxidase. Optimization of the Oxidative Half-Reaction through Alignment of the Product with Reduced Flavin // J. Biochem. 2000. № 128(1). С. 73-81.

36. Pollegioni L., Diederichs K., Molla G., Umhau S., Welte W., Ghisla S., Pilone M.S. Yeast d-Amino Acid Oxidase: Structural Basis of its Catalytic Properties // J. Mol. Biol. 2002. № 324(3). С. 535-546.

37. Mizutani H., Miyahara I., Hirotsu K., Nishina Y., Shiga K., Setoyama C., Miura R. Three-Dimensional Structure of Porcine Kidney D-Amino Acid Oxidase at 3.0 A Resolution // J. Biochem. 1996. № 120(1). С. 14-17.

38. Kawazoe T., Tsuge H., Imagawa T., Aki K., Kuramitsu S., Fukui K. Structural basis of d-DOPA oxidation by d-amino acid oxidase: Alternative pathway for dopamine biosynthesis // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. № 355(2). С. 385-391.

39. Sparey T., Abeywickrema P., Almond S., Brandon N., Byrne N., Campbell A., Hutson P.H., Jacobson M., Jones B., Munshi S., Pascarella D., Pike A., Prasad G.S., Sachs N., Sakatis M., Sardana V., Venkatraman S., Young M.B. The discovery of fused pyrrole carboxylic acids as novel, potent d-amino acid oxidase (DAO) inhibitors // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008. № 18(11). С. 3386-3391.

40. Duplantier A.J., Becker S.L., Bohanon M.J., Borzilleri K.A., Chrunyk B.A., Downs J.T., Hu L.-Y., El-Kattan A., James L.C., Liu S., Lu J., Maklad N., Mansour M.N.,

Mente S., Piotrowski M.A., Sakya S.M., Sheehan S., Steyn S.J., Strick C.A., Williams V.A., Zhang L. Discovery, SAR, and Pharmacokinetics of a Novel 3-Hydroxyquinolin-2(1H)-one Series of Potent d-Amino Acid Oxidase (DAAO) Inhibitors // J. Med. Chem. 2009. № 52(11). C. 3576-3585.

41. Hopkins S.C., Heffernan M.L.R., Saraswat L.D., Bowen C.A., Melnick L., Hardy L.W., Orsini M.A., Allen M.S., Koch P., Spear K.L., Foglesong R.J., Soukri M., Chytil M., Fang Q.K., Jones S.W., Varney M.A., Panatier A., Oliet S.H.R., Pollegioni L., Piubelli L., Molla G., Nardini M., Large T.H. Structural, Kinetic, and Pharmacodynamic Mechanisms of d-Amino Acid Oxidase Inhibition by Small Molecules // J. Med. Chem. 2013. № 56(9). C. 3710-3724.

42. Hondo T., Warizaya M., Niimi T., Namatame I., Yamaguchi T., Nakanishi K., Hamajima T., Harada K., Sakashita H., Matsumoto Y., Orita M., Takeuchi M. 4-Hydroxypyridazin-3(2H)-one Derivatives as Novel d-Amino Acid Oxidase Inhibitors // J. Med. Chem. 2013. № 56(9). C. 3582-3592.

43. Yasukawa K., Nakano S., Asano Y. Tailoring D-Amino Acid Oxidase from the Pig Kidney to R-Stereoselective Amine Oxidase and its Use in the Deracemization of a-Methylbenzylamine // Angew. Chem. Int. Ed. 2014. № 53(17). C. 4428-4431.

44. Terry-Lorenzo Ryan T., Chun Lawrence E., Brown Scott P., Heffernan Michele L.R., Fang Q.K., Orsini Michael A., Pollegioni L., Hardy Larry W., Spear Kerry L., Large Thomas H. Novel human D-amino acid oxidase inhibitors stabilize an active-site lid-open conformation // Bioscience Rep. 2014. № 34(4). C. e00133.

45. Kato Y., Hin N., Maita N., Thomas A.G., Kurosawa S., Rojas C., Yorita K., Slusher B.S., Fukui K., Tsukamoto T. Structural basis for potent inhibition of d-amino acid oxidase by thiophene carboxylic acids // Eur. J. Med. Chem. 2018. № 159. C. 23-34.

46. Porter D.J., Voet J.G., Bright H.J. Mechanistic features of the D-amino acid oxidase reaction studied by double stopped flow spectrophotometry // J. Biol. Chem. 1977. № 252(13). C. 4464-73.

47. Pilone S.M., Pollegioni L., Casalin P., Curti B., Ronchi S. Properties of D-amino-acid oxidase from Rhodotorula gracilis // Eur. J. Biochem. 1989. № 180(1). C. 199-204.

48. Casalin P., Pollegioni L., Curti B., Pilone S.M. A study on apoenzyme from Rhodotorula gracilis D-amino acid oxidase // Eur. J. Biochem. 1991. № 197(2). С. 513-517.

49. Tishkov V.I., Khoronenkova S.V. D-Amino acid oxidase: structure, catalytic mechanism, and practical application // Biochemistry (Moscow). 2005. № 70(1). С. 4054.

50. Dixon M., Kleppe K. D-Amino Acid Oxidase II. Specificity Competitive Inhibition and Reaction Sequence // Biochim. Biophys. Acta. 1965. № 96(3). С. 368-382.

51. Pollegioni L., Caldinelli L., Molla G., Sacchi S., Pilone M.S. Catalytic properties of D-amino acid oxidase in cephalosporin C bioconversion: A comparison between proteins from different sources // Biotechnol. Prog. 2004. № 20(2). С. 467-473.

52. Pollegioni L., Langkau B., Tischer W., Ghisla S., Pilone M.S. Kinetic mechanism of D-amino acid oxidases from Rhodotorula gracilis and Trigonopsis variabilis // J. Biol. Chem. 1993. № 268(19). С. 13850-13857.

53. Yurimoto H., Hasegawa T., Sakai Y., Kato N. Characterization and High-level Production of D-Amino Acid Oxidase in Candida boidinii // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2001. № 65(3). С. 627-633.

54. Pollegioni L., Iametti S., Fessas D., Caldinelli L., Piubelli L., Barbiroli A., Pilone M.S., Bonomi F. Contribution of the dimeric state to the thermal stability of the flavoprotein D-amino acid oxidase // Protein Sci. 2003. № 12(5). С. 1018-1029.

55. Dib I., Slavica A., Riethorst W., Nidetzky B. Thermal inactivation of D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis occurs via three parallel paths of irreversible denaturation // Biotechnol. Bioeng. 2006. № 94(4). С. 645-54.

56. Betancor L., Hidalgo A., Fernandez-Lorente G., Mateo C., Rodriguez V., Fuentes M., Lopez-Gallego F., Fernandez-Lafuente R., Guisan J.M. Use of Physicochemical Tools to Determine the Choice of Optimal Enzyme: Stabilization of d-Amino Acid Oxidase // Biotechnol. Prog. 2003. № 19(3). С. 784-788.

57. Голубев И.В. Структурно-функциональные исследования дрожжевой оксидазы D-аминокислот методом рационального дизайна // Дис.канд.хим.наук. М. МГУ. 2014. 246 c.

58. Полторак О.М., Чухрай Е.С., Ташлицкий В.Н., Сванидзе Р.С. К теории диссоциативной термоинактивации ферментов с четвертичной структурой // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. 1980. № 21(3). С. 224-234.

59. Schrader T., Andreesen J.R. Evidence for the functional importance of Cys298 in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis // Eur. J. Biochem. 1993. № 218(2). С. 735-44.

60. Slavica A., Dib I., Nidetzky B. Single-site oxidation, cysteine 108 to cysteine sulfinic acid, in D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis and its structural and functional consequences // Appl. Environ. Microbiol. 2005. № 71(12). С. 8061-8.

61. Mueller M., Kratzer R., Schiller M., Slavica A., Rechberger G., Kollroser M., Nidetzky B. The role of Cys108 in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase examined through chemical oxidation studies and point mutations C108S and C108D // Biochim. Biophys. Acta. 2010. № 1804(7). С. 1483-91.

62. Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. Recombinant D-amino acid oxidase with improved properties // Chin. J. Biotech. 2008. № 24(12). С. 2122-2124.

63. Cherskova N.V., Khoronenkova S.V., Panteleev M.A., Tishkov V.I. Site-directed mutagenesis of D-amino acid oxidase from yeast Trigonopsis variabilis // J. Biotechnol. 2010. № 150(S1). С. 442.

64. Тишков В.И., Хороненкова С.В., Савина Л.И. Мутантные оксидазы D-аминокислот. Российская Федерация, 2362806, C12N9/06. 2007

65. Ju S.S., Lin L.L., Chien H.R., Hsu W.H. Substitution of the critical methionine residues in Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase with leucine enhances its resistance to hydrogen peroxide // FEMSMicrobiol. Lett. 2000. № 186(2). С. 215-9.

66. Atroshenko D.L., Golubev I.V., Savin S.S., Tishkov V.I. Influence of Met/Leu Amino Acid Changes on Catalytic Properties and Oxidative and Thermal Stability of Yeast D-Amino Acid Oxidase // Mosc. Univ. Chem. Bull. 2016. № 71(4). С. 243-252.

67. Trost E.M., Fischer L. Minimization of by-product formation during d-amino acid oxidase catalyzed racemate resolution of d/l-amino acids // J. Mol. Catal. B Enzym. 2002. № 19-20. С. 189-195.

68. Caligiuri A., D'Arrigo P., Rosini E., Tessaro D., Molla G., Servi S., Pollegioni L. Enzymatic Conversion of Unnatural Amino Acids by Yeast D-Amino Acid Oxidase // Adv. Synth. Catal. 2006. № 348(15). C. 2183-2190.

69. Caligiuri A., D'Arrigo P., Gefflaut T., Molla G., Pollegioni L., Rosini E., Rossi C., Servi S. Multistep enzyme catalysed deracemisation of 2-naphthyl alanine // Biocatal. Biotransformation. 2006. № 24(6). C. 409-413.

70. Friedman M. Chemistry, Nutrition, and Microbiology of d-Amino Acids // J. Agric. Food Chem. 1999. № 47(9). C. 3457-3479.

71. Brückner H., Westhauser T. Chromatographic determination of L- and D-amino acids in plants // Amino Acids. 2003. № 24(1). C. 43-55.

72. Sacchi S., Pollegioni L., Pilone M.S., Rossetti C. Determination of D-amino acids using a D-amino acid oxidase biosensor with spectrophotometry and potentiometric detection // Biotechnol. Tech. 1998. № 12(2). C. 149-153.

73. Lata S., Batra B., Kumar P., Pundir C.S. Construction of an amperometric d-amino acid biosensor based on d-amino acid oxidase/carboxylated mutliwalled carbon nanotube/copper nanoparticles/polyalinine modified gold electrode // Anal. Biochem. 2013. № 437(1). C. 1-9.

74. Wu X., Van Wie B.J., Kidwell D.A. An enzyme electrode for amperometric measurement of d-amino acid // Biosens. Bioelectron. 2004. № 20(4). C. 879-886.

75. Wcislo M., Compagnone D., Trojanowicz M. Enantioselective screen-printed amperometric biosensor for the determination of d-amino acids // Bioelectrochemistry. 2007. № 71(1). C. 91-98.

76. Yao T., Wasa T. High-performance liquid chromatographic detection of L- and D-amino acids by use of immobilized enzyme electrodes as detectors // Anal. Chim. Acta. 1988. № 209. C. 259-264.

77. Varadi M., Adanyi N., Szabo E.E., Trummer N. Determination of the ratio of d- and lamino acids in brewing by an immobilised amino acid oxidase enzyme reactor coupled to amperometric detection // Biosens. Bioelectron. 1999. № 14(3). C. 335-340.

78. Albery W.J., Bartlett P.N., Bycroft M., Craston D.H., Driscoll B.J. Amperometric enzyme electrodes: Part III. A conducting salt electrode for the oxidation of four different flavoenzymes // J. Electroanal. Chem. 1987. № 218(1). C. 119-126.

79. Sarkar P., E. Tothill I., J. Setford S., P. F. Turner A. Screen-printed amperometric biosensors for the rapid measurement of L- and D-amino acids // Analyst. 1999. № 124(6). C. 865-870.

80. Zhang Z.J., Gong Z.L., Ma W.B. An Enzyme-Based Fiber Optic Biosensor for Determination of D-Amino Acid in Serum // Microchem. J. 1995. № 52(2). C. 131138.

81. Shoja Y., Rafati A.A., Ghodsi J. Enzymatic biosensor based on entrapment of d-amino acid oxidase on gold nanofilm/MWCNTs nanocomposite modified glassy carbon electrode by sol-gel network: Analytical applications for d-alanine in human serum // Enzyme Microb. Technol. 2017. № 100. C. 20-27.

82. Kulys J., Schmid R.D. Bienzyme Sensors based on Chemically Modified Electrodes // Biosens. Bioelectron. 1991. № 6(1). C. 43-48.

83. Kacaniklic V., Johansson K., Marko-Varga G., Gorton L., Jonsson-Pettersson G., Csoregi E. Amperometric biosensors for detection of L- and D-amino acids based on coimmobilized peroxidase and L- and D-amino acid oxidases in carbon paste electrodes // Electroanalysis. 1994. № 6(5-6). C. 381-390.

84. Dominguez R., Serra B., Reviejo A.J., Pingarron J.M. Chiral Analysis of Amino Acids Using Electrochemical Composite Bienzyme Biosensors // Anal. Biochem. 2001. № 298(2). C. 275-282.

85. Shoja Y., Rafati A.A., Ghodsi J. Polythiophene supported MnO2 nanoparticles as nano-stabilizer for simultaneously electrostatically immobilization of d-amino acid oxidase and hemoglobin as efficient bio-nanocomposite in fabrication of dopamine bi-enzyme biosensor //Mater. Sci. Eng. C. 2017. № 76. C. 637-645.

86. Inaba Y., Mizukami K., Hamada-Sato N., Kobayashi T., Imada C., Watanabe E. Development of a d-alanine sensor for the monitoring of a fermentation using the improved selectivity by the combination of d-amino acid oxidase and pyruvate oxidase // Biosens. Bioelectron. 2003. № 19(5). C. 423-431.

87. Xia Q., Huang Y., Lin X., Zhu S., Fu Y. Highly sensitive d-alanine electrochemical biosensor based on functionalized multi-walled carbon nanotubes and d-amino acid oxidase // Biochem. Eng. J. 2016. № 113. C. 1-6.

88. Rabin B.R., Harbron S., Eggelte H.J., Hollaway M.R., Holloway A. Amplification assay for hydrolase enzymes. USA, 5445942, 1995

89. Obzansky D.M., Rabin B.R., Simons D.M., Tseng S.Y., Severino D.M., Eggelte H., Fisher M., Harbron S., Stout R.W., Dipaolo M.J. Sensitive, Colorimetric Enzyme Amplification Cascade for Determination of Alkaline-Phosphatase and Application of the Method to an Immunoassay of Thyrotropin // Clin. Chem. 1991. № 37(9). C. 15131518.

90. Harbon S. Hybridization assay for detecting a single-stranded target nucleic acid in which excess probe is destroyed. USA, 6423492, 2002

91. Yasukawa K., Motojima F., Ono A., Asano Y. Expansion of the Substrate Specificity of Porcine Kidney D-Amino Acid Oxidase for S-Stereoselective Oxidation of 4-Cl-Benzhydrylamine // ChemCatChem. 2018. № 10(16). C. 3500-3505.

92. Trimmer E.E., Wanninayake U.S., Fitzpatrick P.F. Mechanistic Studies of an Amine Oxidase Derived from d-Amino Acid Oxidase // Biochemistry. 2017. № 56(14). C. 2024-2030.

93. Truppo M.D., Turner N.J., Rozzell J.D. Efficient kinetic resolution of racemic amines using a transaminase in combination with an amino acid oxidase // ChemComm. 2009. № (16). C. 2127-2129.

94. Du K., Li R., Zhang D., Feng W. Covalent Linkage of an ^-©-Transaminase to a d-Amino Acid Oxidase through Protein Splicing to Enhance Enzymatic Catalysis of Transamination // ChemBioChem. 2019. № 20(5). C. 701-709.

95. Barber M.S., Giesecke U., Reichert A., Minas W. Industrial enzymatic production of cephalosporin-based beta-lactams // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2004. № 88. C. 179-215.

96. Bayer T. 7-Aminocephalosporanic Acid - Chemical versus Enzymatic Production Process. In Asymmetric Catalysis on Industrial Scale: Challenges, Approaches and Solutions, // 2004; pp 117-130.

97. Li R., Sun J., Fu Y.Q., Du K., Cai M.S., Ji P.J., Feng W. Immobilization of Genetically-Modified D-Amino Acid Oxidase and Catalase on Carbon Nanotubes to Improve the Catalytic Efficiency // Catalysts. 2016. № 6(5). C.

98. Dang P.T., Le H.G., Hoang V.T., Tran H.T.H., Dao C.D., Nguyen K.T., Le G.H., Nguyen Q.K., Nguyen T.V., Vu T.A. Immobilization of D-Amino Acid Oxidase (DAAO) Enzyme on Hybrid Mesoporous MCF, SBA-15 and MCM-41 Nanomaterials // J. Nanosci. Nanotechnol. 2017. № 17(2). C. 947-953.

99. Wang M., Qi W., Xu H., Yu H., Zhang S., Shen Z. Affinity-binding immobilization of d-amino acid oxidase on mesoporous silica by a silica-specific peptide // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2019. №. C.

100. Khang Y.-H., Kim I.-W., Hah Y.-R., Hwangbo J.-H., Kang K.-K. Fusion protein of Vitreoscilla hemoglobin with D-amino acid oxidase enhances activity and stability of biocatalyst in the bioconversion process of cephalosporin C // Biotechnol. Bioeng. 2003. № 82(4). C. 480-488.

101. Pilone M.S., Pollegioni L. D-amino acid oxidase as an industrial biocatalyst // Biocatal. Biotransformation. 2002. № 20(3). C. 145-159.

102. Becka S., Skrob F., Plhackova K., Kujan P., Holler P., Kyslik P. Cross-linked cell aggregates of Trigonopsis variabilis: D-amino acid oxidase catalyst for oxidation of cephalosporin C // Biotechnol. Lett. 2003. № 25(3). C. 227-233.

103. Zheng H., Zhu T., Chen J., Zhao Y., Jiang W., Zhao G., Yang S., Yang Y. Construction of recombinant Escherichia coli D11/pMSTO and its use in enzymatic preparation of 7-aminocephalosporanic acid in one pot // J. Biotechnol. 2007. № 129(3). C. 400-405.

104. Lopez-Gallego F., Batencor L., Hidalgo A., Mateo C., Fernandez-Lafuente R., Guisan J.M. One-Pot Conversion of Cephalosporin C to 7-Aminocephalosporanic Acid in the Absence of Hydrogen Peroxide // Adv. Synth. Catal. 2005. № 347(14). C. 1804-1810.

105. Ishii Y., Saito Y., Fujimura T., Sasaki H., Noguchi Y., Yamada H., Niwa M., Shimomura K. High-level Production, Chemical Modification and Site-directed Mutagenesis of a Cephalosporin C Acylase from Pseudomonas Strain N176 // Eur. J. Biochem. 1995. № 230(2). C. 773-778.

106. Tan Q., Qiu J., Luo X., Zhang Y., Liu Y., Chen Y., Yuan J., Liao W. Progress in One-pot Byconversion of Cephalosporin C to 7-Aminocephalosporanic Acid // Curr. Pharm. Biotechnol. 2018. № 19(1). C. 30-42.

107. Alonso J., Barredo J.L., Armisén P., Diez B., Salto F., Guisán J.M., García J.L., Cortés E. Engineering the D-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis to facilitate its overproduction in Escherichia coli and its downstream processing by tailor-made metal chelate supports // Enzyme and Microbial Technology. 1999. № 25(1). C. 88-95.

108. Zheng H., Wang X., Chen J., Zhu K., Zhao Y., Yang Y., Yang S., Jiang W. Expression, purification, and immobilization of His-tagged D-amino acid oxidase of Trigonopsis variabilis in Pichia pastoris // Applied Microbiology and Biotechnology. 2006. № 70(6). C. 683-689.

109. Wang S.-J., Yu C.-Y., Lee C.-K., Chern M.-K., Kuan I.C. Subunit fusion of two yeast d-amino acid oxidases enhances their thermostability and resistance to H2O2 // Biotechnol. Lett. 2008. № 30(8). C. 1415-1422.

110. Yu H., Ma X., Luo H., Wen C., Shen Z. Fusion expression of D-amino acid oxidase from Trignoposis variabilis with maltose binding protein and Vitreoscilla hemoglobin // Chin. J. Biotechnol. 2008. № 24(6). C. 1004-1009.

111. Luo H., Yu H.M., Li Q., Shen Z.Y. Cloning and co-expression of D-amino acid oxidase and glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase genes in Escherichia coli // Enzyme Microb. Technol. 2004. № 35(6-7). C. 514-518.

112. Luo H., Li Q., Yu H.M., Shen Z.Y. Construction and application of fusion proteins of D-amino acid oxidase and glutaryl-7-aminocephalosporanic acid acylase for direct bioconversion of cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid // Biotechnol. Lett. 2004. № 26(11). C. 939-945.

113. Ju S.-S., Lin L.-L., Wang W.-C., Hsu W.-H. A conserved aspartate is essential for FAD binding and catalysis in the d-amino acid oxidase from Trigonopsis variabilis // FEBS Lett. 1998. № 436(1). C. 119-122.

114. Lin L.-L., Wang W.-C., Ju S.-S., Chien H.R., Hsu W.-H. The role of a conserved histidine residue, His324, in Trigonopsis variabilis d-amino acid oxidase // FEMS Microbiol. Lett. 1999. № 176(2). C. 443-448.

115. Lin L.-L., Chien H.R., Wang W.-C., Hwang T.-S., Fu H.-M., Hsu W.-H. Expression of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase gene in Escherichia coli and characterization of its inactive mutants // Enzyme Microb. Technol. 2000. № 27(7). С. 482-491.

116. Cherskova N.V., Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. The role of residues Arg169 and Arg220 in intersubunit interactions of yeast D-amino acid oxidase // Russ. Chem. Bull. 2010. № 59(1). С. 269-275.

117. Komarova N.V., Golubev I.V., Khoronenkova S.V., Chubar T.A., Tishkov V.I. Engineering of substrate specificity of D-amino acid oxidase from the yeast Trigonopsis variabilis: Directed mutagenesis of Phe258 residue // Biochemistry (Moscow). 2012. № 77(10). С. 1181-1189.

118. Wong K.S., Fong W.P., Tsang P.W. A single Phe54Tyr substitution improves the catalytic activity and thermostability of Trigonopsis variabilis D-amino acid oxidase // New Biotechnol. 2010. № 27(1). С. 78-84.

119. Komarova N.V., Golubev I.V., Khoronenkova S.V., Tishkov V.I. Mutant D-amino acid oxidase with higher catalytic efficiency toward D-amino acids with bulky side chains // Russ. Chem. Bull. 2012. № 61(7). С. 1489-1496.

120. Комарова Н.В. Инженерия каталитических свойств и стабильности оксидазы D-аминокислот // Дис.канд.хим.наук. М. МГУ. 2012. 166 c.

121. Ornstein L. DISC ELECTROPHORESIS-! BACKGROUND AND THEORY // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1964. № 121(2). С. 321-349.

122. Laemmli U.K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4 // Nature. 1970. № 227(5259). С. 680-685.