Рекомбинантная оксидаза D-аминокислот: получение и структурно-функциональные исследования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Хороненкова, Светлана Владимировна

• Хороненкова, Светлана Владимировна
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Хороненкова, Светлана Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

I. ВВЕДЕНИЕ.б

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Общие сведения об оксидазе D-аминокислот.

2.2. Локализация и физиологическая роль DA АО.

2.2.1. Регуляция уровня D-серина.

2.2.2. Регуляция секреции гормонов.

2.2.3. Регуляция кровяного давления.

2.2.4. Регуляция уровня D-аланина.

2.2.5. Регуляция уровня D-пролина.

2.3. Первичная структура DAAO.

2.4. Пространственная структура.

2.5. Клонирование генов и экспрессия рекомбинантных DААО.

2.6. ochobi1ые свойства DAAO.

2.6.1. Субстратная специфичность.

2.6.2. Температурная стабильность.

2.6.3. pH-Стабильность.

2.7. Кинетическая схема катализируемой DAAO реакции.

2.8. Белковая инженерия DAAO.

2.9. Практическое применение фермента.

2.9.1. Определение D-аминокислот и активности DAAO.

2.9.2. Профилактика психосоматических и онкологических заболеваний.

2.9.3. Получение физиологически активных соединений.

2.9.4. Конверсия цефалоспорина С.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы исследования.

3.2.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.2. Рестрикция ДНК.

3.2.3. Выделение ДНК-фрагментов из агарозного геля.

3.2.4. Лигирование фрагментов ДНК.

3.2.5. Трансформация клеток Е. coli.

3.2.6. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.7. Направленный мутагенез гена оксидазы D-аминокислот.

3.2.8. Секвенирование ДНК.

3.2.9. Экспрессия TvDAAO и ее мутантов в клетках Е. coli.

3.2.10. Очистка DAAO.

3.2.11. Белковый электрофорез в денатурирующих условиях.

3.2.12. Изоэлектрофокусирование.

3.2.13. Светорассеяние.

3.2.14. Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации.

3.2.15. Определение концентрации белков.

3.2.16. Определение активности DAAO.

3.2.17. Определение кинетических параметров.

3.2.18. Изучение стабильности при различных температурах.

3.2.19. Стабильность в буферах с различной ионной силой.

3.2.20. pH-стабильность.

3.2.21. Определение кинетических параметров реакции с цефалоспорином С.

3.2.22. Детекция микроколичеств DAAO на мембранах.

3.2.23. Детекция активности DAAO в колониях целых клеток Е. coli.

3.2.24. Рентгеноструктурный анализ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Оптимизация экспрессии гена оксидазы D-аминокислот из дрожжей т. variabilis в клетках е. coli.

4.1.1. Общие положения оптимизации условий культивирования.

4.1.2. Выбор среды для культивирования и температуры процесса.

4.1.3. Влияние количества рибофлавина.

4.1.4. Тип и концентрация индуктора, время индукции.

4.1.5. Влияние условий аэрации на экспрессию гена tvdaao.

4.1.6. Влияние добавок на биосинтез целевого фермента.

4.1.7. Продолжительность культивирования.

4.2. Выделение рекомбинантного фермента.

4.2.1. Термообработка бесклеточного экстракта.

4.2.2. Ион-обменная хроматография.

4.2.3. Гель-проникающая хроматография.

4.3. Стабильность рекомбинантной Т vD ААО.

4.3.1. Концентрационная и температурная зависимости активности.

4.3.2. Стабильность рекомбинантной TvDAAO.

4.3.3. рН-Стабильность рекомбинантного фермента.

4.4. Субстратная специфичность рекомбинантного фермента.

4.5. Механизм температурной инактивации рекомбинантной TvDAAO.

4.6. Белковая инженерия DAAO из дрожжей т. variabilis.

4.6.1. Получение и выделение мутантных TvDAAO.

4.6.2. Субстратная специфичность мутантных TvDAAO.

4.6.3. Температурная стабильность мутантных ферментов.

4.6.4. Изменение размера белковой глобулы.

4.7. Определение трехмерной структуры TvDAAO.

4.8. Практические аспекты применения полученных TvDAAO.

4.8.1. Детекция фермента на мембранах.

4.8.1.1. Оптимизация условий детекции DAAO на мембранах.

4.8.1.2. Применимость метода.

4.8.1.3. Скрининг библиотек мутантных клонов.

4.8.2. Окисление цефалоспорина С.

V. ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Рекомбинантная оксидаза D-аминокислот: получение и структурно-функциональные исследования»

Оксндаза D-аминокислот относится к классу FAD-содержащих оксидоредуктаз и катализирует окислительное дезаминирование D-аминокислот в соответствующие а-кетокислоты (КФ 1.4.3.3, DAAO). Фермент играет исключительно важную роль в метаболизме микроорганизмов. В организме животных и человека DAAO отвечает за поддержание определенного уровня D-аминокислот в клетке. Например, в тканях мозга фермент контролирует содержание D-серина, который участвует в регуляции деятельности нервной системы. В настоящее время установлено, что повышенная активность DAAO в мозге служит одной из причин возникновения шизофрении. У пациентов, страдающих болезнью Альцгеймера, наблюдается снижение активности фермента, в результате чего в тканях мозга значительно возрастает содержание D-аланипа. Пониженная активность DAAO характерна также для некоторых почечных заболеваний. Кроме того, оксидаза D-аминокислот принимает участие в регуляции процессов старения.

На практике этот фермент используется главным образом в биокаталитическом процессе окисления цефалоспорина С в 7-аминоцефалоспорановую кислоту - исходное соединение для производства полусинтетических цефалоспоринов различных поколений (доля бета-лактамных антибиотиков составляет 10% от стоимости всех производимых в мире фармацевтических препаратов). Помимо этого, DAAO активно применяется в аналитической биотехнологии, хиральном синтезе, получении а-кетокислот и имеет большое потенциальное значение для создания систем диагностики и мониторинга ряда психосоматических (шизофрении, болезни Альцгеймера и Паркинсона и др.) и онкологических заболеваний.

Несмотря на высокую теоретическую и практическую значимость, оксидаза D-аминокислот до недавнего времени была малоизученным ферментом. Фактически в настоящее время накоплен достаточно большой объем экспериментальных данных для DAAO из почки свиньи (pkDAAO) и из дрожжей Rhodotorula gracilis (RgDAAO). Трехмерные структуры этих ферментов были определены в 1996 и 2000 годах соответственно. Для pkDAAO и RgDAAO в литературе имеются данные по детальному изучению механизма действия этих ферментов методом направленного мутагенеза. В 2006 году была опубликована структура еще одной DAAO - фермента из человека (hDAAO). Интерес ученых к этому ферменту активно растет в последние годы в связи с открытием новых аспектов, связанных с физиологической ролью hDAAO в организме человека.

Результаты по изучению механизма действия совместно с данными о структуре позволяют создать основу для направленного изменения свойств фермента с целью получения биокатализаторов с заданными свойствами. В настоящий момент такая работа начата для DAAO из R. gracilis, однако для ферментов из других источников подобных данных в литературе не представлено.

Среди всех известных оксидаз D-аминокислот наиболее широкое применение на практике находит фермент из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO). Это связано с его высокой температурной стабильностью и наиболее высокой активностью с цсфалоспорином С среди DAAO из других источников. Однако, несмотря на более чем 30-летнюю историю исследования TvDAAO, количество экспериментальных данных о структуре и механизме действия этого фермента в настоящий момент невелико. Это приводит к тому, что для практических целей используется только фермент дикого типа, который не является оптимальным даже для уже разработанных процессов с его участием. Можно выделить несколько первоочередных задач и проблем, которые требуют решения для масштабного применения фермента на практике. Первой проблемой является отсутствие эффективной и дешевой системы получения TvDAAO. В основном для биосинтеза фермента используют мутантные штаммы Т. variabilis и рекомбипантные штаммы бактерий Е. coli и дрожжей Pichia pastoris, однако высокого выхода фермента по активности с литра среды на единицу времени (Ед активности/объем/время, space/time yield), равно как и содержания целевого продукта в клетке, достичь не удается. Поэтому в настоящее время себестоимость получения TvDAAO достаточно высока. Во-вторых, несмотря на то. что TvDAAO является наиболее термостабильным ферментом среди известных оксидаз D-аминокислот, ее операционная и температурная стабильности недостаточно высоки для эффективного применения на практике. В-третьих, фермент проявляет высокую активность с ограниченным набором D-аминокислот, в то время как спектр соединений, интересующих биотехнологов, значительно шире. Кроме того, для целей медицинской диагностики необходимы ферменты, высокоспецифичные к определенной D-аминокислоте и не активные с другими соединениями, содержащимися в определенных тканях организма. Поэтому для повышения его каталитической активности с целевыми D-аминокислотами и другими перспективными субстратами (как природными, так и неприродными) стоит задача получения мутантных форм фермента с заданной субстратной специфичностью. Наконец, среди четырех наиболее активно исследуемых оксидаз D-аминокислот - pkDAAO, RgDAAO, hDAAO и TvDAAO, данные о трехмерной структуре имеются только для первых трех ферментов. Для DAAO из Т. variabilis данные о структуре отсутствуют, что не позволяет проводить детальное исследование механизма действия фермента и направленное изменение его свойств методами белковой инженерии (rational design approach).

Целью настоящей работы было проведение систематических исследований по разработке высокоэффективной системы экспрессии оксидазы D-аминокислот из дрожжей Т. variabilis в клетках Е. coli, изучение свойств рекомбинантного фермента дикого типа, получение новых мутантных форм фермента с заданными свойствами и определение трехмерной структуры TvDAAO.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Катализ», Хороненкова, Светлана Владимировна

У. выводы

1. Проведена оптимизация экспрессии гена оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis в клетках Е. coli. Изучено влияние различных параметров (штамм-хозяин, среда для культивирования, температура культивирования, содержание добавок, тип и концентрация индуктора, время индукции, условия

1 аэрации, общая продолжительность культивирования) на выход фермента. В i результате оптимизации условий процесса выход активного фермента был повышен с 1500 до 35000 единиц с литра среды, что превышает известные мировые аналоги в 1,5 раза.

2. Получены три мутантные формы фермента TvDAAO C108F, С108А, C108S. Исследование кинетических свойств показало, что введение замены в положение 108 приводит к значительному изменению профиля субстратной специфичности TvDAAO. Замены Cysl08Phe и Cysl08Ala обеспечивают значительное увеличение каталитической эффективности фермента по отношению к D-аминокислотам с

I большим гидрофобным радикалом в боковой цепи. Все три мутантные формы не реагируют с D-Ala. Кроме того, мутанты TvDAAO C108F и С108А обладают в 3 и 4,4 раза более высокой каталитической эффективностью в реакции окисления цефалоспорина С, чем фермент дикого типа. Получение мутантных форм фермента с различными спектрами субстратной специфичности позволяет осуществить индивидуальный подбор биокатализаторов в зависимости от поставленной задачи.

3. Изучен механизм термоинактивации рекомбинантной оксидазы D-аминокислот. Для фермента дикого типа показано, что в диапазоне концентраций 8-33 мкг/мл и температур 50-60 °С реализуется диссоциативный механизм термоинактивации, при

I более высоких и низких температурах инактивация протекает в соответствии с мономолекулярным механизмом. При концентрации фермента выше 33 мкг/мл диссоциативной термопнактивации предшествует стадия обратимой диссоциации тетрамерных форм TvDAAO на димерные. В случае мутантных ферментов наблюдается сдвиг температурного диапазона, в котором реализуется механизм диссоциативной термоинактивации. Введение аминокислотной замены Cysl08Phe приводит к повышению температурной стабильности фермента в 2,2 раза и компактизации белковой глобулы.

4. Получены кристаллы мутантной TvDAAO C108F и определена ее трехмерная структура методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,8 А. Данная структура является первой для оксидазы D-аминокислот из дрожжей Trigonopsis variabilis. Анализ полученной структуры свидетельствует, что общая конформация полипептидной цепи в субъединице TvDAAO C108F близка к таковой в субъединице оксидазы D-аминокислот из дрожжей Rhodotomla gracilis, однако в димерах наблюдается различная взаимная ориентация субъединиц. Наиболее существенными отличиями в структурах субъеднниц TvDAAO C108F и RgDAAO является больший объем полости активного центра и отсутствие петель, отвечающих в структуре фермента из R. gracilis за образование димера.

5. Разработана методика высокочувствительного определения DAAO в различных типах образцов, в том числе в сложных биологических жидкостях. Чувствительность детекции составляет 0,13 нг фермента в пробе. Методика также применима для определения оксидазы D-аминокислот в колониях целых клеток, что позволяет проводить простой и эффективный скрининг библиотек мутантпьтх клонов по активности с требуемым субстратом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Хороненкова, Светлана Владимировна, 2008 год

1. Ghisla, S., Massey, V. (1989) Mechanisms of flavoprotein-catalyzed reactions. Eur. J. Biochem., v.181, p. 1-17.

2. Pilone, M.S. (2000) D-Amino acid oxidase: new findings. Cell Mol. Life Sci., v.51, p.1732-1747.

3. Krebs, H.A. (1935) Metabolism of amino acids: Deamination of amino acids. Biochem. J., v.29, p.l620-1644.

4. Conlon, H.D., Baqai, J., Baker, K., Shen, Y.Q., Wong, B.L., Noiles, R., Rausch, C.W. (1995) Two-step immobilized enzyme conversion of cephalosporin С to 7-aminocephalosporanic acid. Biotechnol. Bioeng., v.46, p.510-513.

5. Курочкина В.Б., Ныс П.С. (2002) Новые беталактамные структуры. Проблемы конструирования. Антибиотики и химиотерапия, т.47, с.29-37.

6. Brodelius, P., Nilsson, К., Mosbach, К. (1981) Production of a-keto acids. Part I. Immobilized cells of Trigonopsis variabilis containing D-amino acid oxidase. Appl. Biochem. Biotechnol., v.6, p.293-308.

7. Beard, T.M., Turner, N.J. (2002) Deracemisation and stereoinversion of alpha-amino acids using D-amino acid oxidase and hydride reducing agents. Chem. Commun.•Camb.), v.2, p.246-247.

8. Dominguez, R., Serra, В., Reviejo, A J., Pingarron, J.M. (2001) Chiral analysis of amino acids using electrochemical composite bienzyme biosensors. Anal. Biochem., v.298, p.275-282.

9. Тишков В.И., Савин С.С., Хороненкова С.В. (2008) Получение биокатализаторов с заданными свойствами. Изв. Акад. Наук. Сер. Химическая, т.57, с.1014-1022.

10. Meister, A. in Biochemisry of the aminoacids (2nd edn.). N. Y.: Academic Press, 1965, v.l, p. 297-304.

11. Pistorius, E.K., Voss, H. (1977) A D-amino acid oxidase from Chlorella vulgaris. Biochim. Biophys. Acta, v.481, p.395-406.

12. Sikora, L., Marzluf, G.A. (1982) Regulation of L-amino acid oxidase and of D-amino acid oxidase in Neurospora crassa. Mol. Gen. Genet., v.186, p.33-39.

13. Benz, F., Liersch, M., Nuesch, J., Treichler, H.J. (1971) Methionine metabolism and cephalosporin C synthesis in Cephalosporium acremonium. D-amino acid oxidase. Eur. J. Biochem., v.20, p.81-88.

14. Isogai, T., Ono, H., Ishitani, Y., Kojo, H., Ueda, Y., Kohsaka, M. (1990) Structure and expression of cDNA for D-amino acid oxidase active against cephalosporin C from Fusarium solani. J. Biochem. (Tokyo), v. 108, p. 1063-1069.

15. Kubicek-Pranz, E.M., Rohr, M. (1985) D-amino acid oxidase from the yeast Trigonopsis variabilis. J. Appl. Biochem., v.7, p.104-113.

16. Yoshizawa, M., Ueda, M., Mozaffar, S., Tanaka, A. (1986) Some properties of peroxisome-associated D-amino acid oxidase from Candida tropicalis. Agric. Biol. Chem., v.50, p.2637-2638.

17. Simonetta, M.P., Vanoni, M.A., Curti, B. (1982) D-Amino acid oxidase activity in the yeast Rhodotorula gracilis. FEMSMicrobiol. Lett., v. 15, p.27-31.

18. Yurimoto, H., Hasegawa, T., Sakai, Y., Kato, N. (2001) Characterization and high-level production of D-amino acid oxidase in Candida boidinii. Biosci. Biotechnol. Biochem., v.65, p.627-633.

19. Hils, M., Munch, P., Altenbuchner, J., Syldatk, C., Mattes, R. (2001) Cloning and characterization of genes from Agrobacteriinn sp. IP 1-671 involved in hydantoin degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol., v.51, p.680-688.

20. LaRue, T.A., Spencer, J.F. (1967) The utilization of D-amino acids by yeasts. Can. J. Microbiol., v.13, p.777-788.

21. Pollegioni, L., Piubelli, L., Sacchi, S., Pilone, M.S., Molla, G. (2007) Physiological functions of D-amino acid oxidases: from yeast to humans. Cell Mol. Life Scl, v.64, p.1373-1394.

22. Momoi, K., Fukui, K., Watanabe, F., Miyake, Y. (1988) Molecular cloning and sequence analysis of cDNA encoding human kidney D- amino acid oxidase. FEES Lett., v.238, p.180-184.

23. D'Aniello, A., D'Onofrio, G., Pischetola, M., D'Aniello, G., Vetcre, A., Petrucelli, L., Fisher, G.H. (1993) Biological role of D-amino acid oxidase and D-aspartate oxidase.

24. Effects of D-amino acids. J. Biol. Chem., v.268, p.26941-26949.

25. Maekawa, M., Watanabe, M., Yamaguchi, S., Konno, R., Hon, Y. (2005) Spatial learning and long-term potentiation of mutant mice lacking D-amino-acid oxidase. Neurosci. Res., v.53, p.34-38.

26. Hasegawa, H., Matsukawa, T., Shinohara, Y., Konno, R., Hashimoto, T. (2004) Role of renal D-amino-acid oxidase in pharmacokinetics of D-leucine. Am. J. Physiol Endocrinol. Metab, v.287, p. 160-165.

27. Owen, M.J., Craddock, N., O'Donovan, M.C. (2005) Schizophrenia: genes at last? Trends Genet., v.21, p.518-525.i1 37. Korostishevsky, M., Kaganovich, M., Cholostoy, A., Ashkenazi, M., Ratner, Y.,

28. Dahary, D., Bernstein, J., Bening-Abu-Shach, U., Ben-Asher, E., Lancet, D., Ritsner,

29. M., Navon, R. (2004) Is the G72/G30 locus associated with schizophrenia? Single nucleotide polymorphisms, haplotypes, and gene expression analysis. Biol. Psychiatry, v.56, p.169-176.

30. Schell, M.J., Molliver, M.E., Snyder, S.H. (1995) D-serine, an endogenous synaptic modulator: localization to astrocytes and glutamate-stimulated release. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, v.92, p.3948-3952.

31. Nishikawa, T. (2005) Metabolism and functional roles of endogenous D-serine in mammalian brains. Biol. Pharm. Bull., v.28, p.1561-1565.

32. Harrison, P.J., Owen, M.J. (2003) Genes for schizophrenia? Recent findings and their pathophysiological implications. Lancet, v.361, p.417-419.

33. Corvin, A., Donohoe, G., McGhee, K., Murphy, K., Kenny, N., Schwaiger, S., Nangle,

34. J J.M., Morris, D., Gill, M. (2007) D-amino acid oxidase (DAO) genotype and moodsymptomatology in schizophrenia. Neurosci. Lett., v.426, p.97-100.

35. MacDonald, A.W., Chafee, M.V. (2006) Translational and developmental perspective on N-methyl-D-aspartate synaptic deficits in schizophrenia. Dev. PsychopathoL, v.l 8, p.853-876.

36. Collingridge, G. (1987) Synaptic plasticity. The role of NMDA receptors in learning and memory. Nature, v.330, p.604-605.

37. Meldrum, B.S., Akbar, M.T., Chapman, A.G. (1999) Glutamate receptors andtransporters in genetic and acquired models of epilepsy. Epilepsy Res., v.36, p.189-204.

38. Chung, S., Jung, J., Chung, H.Y., Yoo, H.K., Kim, C.Y., Joo, Y.H., Choi, S.E., Hong, J.P. (2007) No association between polymorphisms of DAO and DAOA genes and homicidal behaviors in Korean schizophrenia. Psychiatr. Genet., v.17, p.313.

39. Furuchi, T. Homma, H. (2005) Free D-aspartate in mammals. Biol. Pharm. Bull., v.28,1.p.1566-1570.

40. D'Aniello, G., Tolino, A., D'Aniello, A., Errico, F., Fisher, G.H., Di Fiore, M.M. (2000) The role of D-aspartic acid and N-methyl-D-aspartic acid in the regulation of prolactin release. Endocrinology, v.141, p.3862-3870.

41. D'Aniello, A., Di, C.A., Di, C.C., Annunziato, L., Petrucelli, L., Fisher, G. (1996) Involvement of D-aspartic acid in the synthesis of testosterone in rat testes. Life Sci., v.59, p.97-104.

42. Helfrnan, P.M. Bada, J.L. (1975) Aspartic acid racemization in tooth enamel from living humans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, v.12, p.2891-2894.

43. Man, E.H., Sandhouse, M.E., Burg, J., Fisher, G.H. (1983) Accumulation of D-aspartic acid with age in the human brain. Science, v.220, p.1407-1408.

44. Fisher, G., Lopez, S., Peterson, K., Goff, T., Philip, I., Gaviria, R., Lorenzo, N., Tsesarskaia, M. (2007) Is there a correlation between age and D-aspartic acid in human knee cartilage? Amino. Acids, v.32, p.27-30.

45. Man, E.H., Fisher, G.H., Payan, I.L., Cadilla-Perezrios, R., Garcia, N.M., Chemburkar, R., Arends, G., Frey, W.H. (1987) D-Aspartate in human brain. J. Neurochem., v.48, p.510-515.

46. Wang, Y.X., Zhou, Т., Pang, C.C. (1991) Pressor effects of L- and D-enantiomers of № -nitro-arginine in conscious rats are antagonized by L- but not D-arginine. Eur. J. Pharmacol., v.200, p.77-81.

47. Wang, Y.X., Poon, C.I., Pang, C.C. (1993) In vitro and ex vivo inhibitory effects of Land D-enantiomers of NG-nitro-arginine on endothelium-dependent relaxation of rat aorta. J. Pharmacol. Exp. Ther., v.265, p.112-119.

48. Xin, Y.F., Zhou, X.J., Cheng, X., Wang, Y.X. (2005) Renal D-amino acid oxidase mediates chiral inversion ofN(G)-nitro-D-arginine. J. Pharmacol. Exp. Ther., v.312, p.1090-1096.

49. Abe, H., Yoshikawa, N., Sarower, M.G., Okada, S. (2005) Physiological function and metabolism of free D-alanine in aquatic animals. Biol. Pharm. Bull., v.28, p.1571-1577.

50. Fisher, G.H., D'Aniello, A., Vetere, A., Padula, L., Cusano, G.P., Man, E.H. (1991) Free D-aspartate and D-alanine in normal and Alzheimer brain. Brain Res. Bull., v.26, p.983-985.

51. Fisher, G., Lorenzo, N., Abe, H., Fujita, E., Frey, W.H., Emory, C., Di Fiore, M.M., D'Aniello, A. (1998) Free D- and L-amino acids in ventricular cerebrospinal fluid from Alzheimer and normal subjects. Amino. Acids, v. 15, p.263-269.

52. Hamase, K., Konno, R., Morikawa, A., Zaitsu, K. (2005) Sensitive determination of D-amino acids in mammals and the effect of D-amino-acid oxidase activity on their amounts. Biol. Pharm. Bull., v.28, p.1578-1584.

53. Hamase, K., Takagi, S., Morikawa, A., Konno, R., Niwa, A., Zaitsu, K. (2006) Presence and origin of large amounts of D-proline in the urine of mutant mice lacking D-amino acid oxidase activity. Anal. Bioanal. Chem., v.386, p.705-711.

54. Rossman, M.G., Liljas, A., Branden, C.-I., Banaszak, L.J. in The Enzymes (Boyer, P.D., edr., 3rd edn.), N. Y.: Academic Press, 1975, v.l 1, p.61-102.

55. Subramani, S. (1993) Protein import into peroxisomes and biogenesis of the organelle. Annual Rev. Cell Biol, v.9, p.445-478.

56. Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K., Nishina, Y., Shiga, K., Setoyama, C., Miura, R.1996) Three-dimensional structure of porcine kidney D-amino acid oxidase at 3.0 A resolution. J. Biochem. (Tokyo), v. 120, p. 14-17.

57. Miura, R., Setoyama, C., Nishina, Y., Shiga, K., Mizutani, H., Miyahara, I., Hirotsu, K.1997) Structural and mechanistic studies on D-amino acid oxidase x substratecomplex: implications of the crystal structure of enzyme x substrate analog complex. J.

58. Biochem. (Ток)ю), v.122, p.825-833.i 77. Todone, F., Vanoni, M.A., Mozzarelli, A., Bolognesi, M., Coda, A., Curti, В., Mattevi, A. (1997) Active site plasticity in D-amino acid oxidase: a crystallographic analysis. Biochemistry, v.36, p.5853-5860.

59. Pollegioni, L., Diederichs, 1С., Molla, G., Umhau, S., Welte, W., Ghisla, S., Pilone, M.S. (2002) Yeast D-amino acid oxidase: structural basis of its catalytic properties. J. Mol. Biol., v.324, p.535-546.

60. Kawazoe, Т., Tsuge, H., Imagawa, Т., Aki, K., Kuramitsu, S., Fukui, K. (2007) Structural basis of D-DOPA oxidation by D-amino acid oxidase: alternative pathway for dopamine biosynthesis. Biochem. Biophys. Res. Cornmun., v.355, p.385-391.