Каталитическая субъединица энтеропептидазы человека: получение, характеризация ферментативных свойств и моделирование мутаций, облегчающих ренатурацию и повышающих специфичность фермента тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат физико-математических наук Остапченко, Валерий Геннадиевич

• Остапченко, Валерий Геннадиевич
• кандидат физико-математических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат физико-математических наук Остапченко, Валерий Геннадиевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Энтеропептидаза - ключевой фермент пищеварения.

2.1.1. История открытия и физиологическая роль.

2.1.2. Структура энтеропептидазы.

2.1.3. Экспрессия гена энтеропептидазы.

2.2. Взаимодействия сериновых протеиназ с субстратом при ферментативном катализе.

2.2.1. Специфичность сериновых протеиназ.

2.2.2. Сайты распознавания субстрата.

2.2.3. Распознавание субстратов во время катализа.

A. Критерии специфичности сериновых протеиназ.

Б. Специфичность определяется этапами связывания и ацилирования.

B. Вклад в специфичность ассоциации субстрата.

Г. Следствия, касающиеся специфичности гидролиза сложных эфиров.

2.2.4. Как удаленные взаимодействия влияют на катализ?.

A. Дальние взаимодействия выравнивают субстрат в активном центре.

Б. Удаленные взаимодействия оптимизированы в переходном состоянии.

B. Удаленные взаимодействия индуцируют конформационные изменения, содействующие катализу.

Г. Удаленные взаимодействия экранируют каталитическую триаду от растворителяЗ 1 Д. Удаленные взаимодействия связывают катализ с движением структуры протеиназы.

2.3. Экспрессия рекомбинантных гибридных белков и их ренатурация.

2.3.1. Экспрессия рекомбинантных белков.

2.3.2. Гибридные (слитные) белки.

Проблемы при экспрессии слитных белков.

Расщепление слитных белков.

Слитные белки с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2.3.3. Ренатурация рекомбинантных белков.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Реактивы и ферментные препараты.

3.1.2. Штаммы и плазмидные вектора.

3.1.3. Питательные среды для роста бактерий.

3.1.4. Синтетические олигонуклеотиды.

3.2. Методы.

3.2.1. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

3.2.2. Выделение плазмидной ДНК.

3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле.

3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК.

3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля.

3.2.6. Определение нуклеотидной последовательности (секвенирование) ДНК.

3.2.7. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pET-32/L-HEP.

3.2.7. Олигонуклеотид-направленный мутагенез.

3.2.8. Экспрессия гена L-HEP и ее мутантных вариантов.

3.2.9. Идентификация белков по N-концевой последовательности.

3.2.10. Ренатурация гибридных белков с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

3.2.11. Очистка активной L-HEP и ее мутантных вариантов.

3.2.12. Определение количества белка в растворах и гелях.

3.2.13. Измерение каталитической активности L-HEP и ее мутантных вариантов.

Гидролиз тиоэфира Z-Lys-SBzl.

Гидролиз специфического субстрата GD4K-na.

Гидролиз неспецифических хромогенных пептидных субстратов.

Гидролиз белковых субстратов.

Вычисление кинетических параметров.

3.2.14. Реакции ингибирования каталитической акитвности L-HEP.

3.2.15. Построение пространственных моделей L-HEP и ее мутантных вариантов.

3.2.16. Молекулярная динамика каталитических субъединиц энтеропептидаз.

3.2.17. Оценка мутантных вариантов L-HEP.

3.2.18. Моделирование взаимодействий L-BEP, L-HEP и ее мутантных вариантов с пептидными субстратами.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Синтез гена L-HEP, его клонирование в плазмидные вектора и подбор экспрессионной системы.

4.2. Ренатурация слитного белка Trx/L-HEP и очистка активного фермента L-HEP.

4.3. Исследование ферментативных свойств L-HEP.

4.4. Построение пространственной модели L-HEP.

4.5. Моделирование и получение мутантных вариантов L-HEP с увеличенным выходом ренатурации.

4.6. Исследование специфичности L-HEP.

4.7. Моделирование взаимодействия активного центра энтеропептидазы с пептидными субстратами.

4.8. Получение и исследование каталитических свойств мутантных вариантов L-HEP с заменами R96K, K219Q и R96K/K219Q.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Каталитическая субъединица энтеропептидазы человека: получение, характеризация ферментативных свойств и моделирование мутаций, облегчающих ренатурацию и повышающих специфичность фермента»

Энтеропептидаза - ключевой фермент пищеварения млекопитающих. Она управляет каскадом пищеварительных ферментов, превращая трипсиноген в трипсин, который в свою очередь активирует другие зимогены и, кроме того, активно участвует непосредственно в протеолизе белковой пищи.

Катионный трипсиноген (предшественник трипсина I) не является единственным субстратом энтеропептидазы. Помимо него существуют проферменты анионного трипсина (трипсина II), мезотрипсина и нейронального трипсина, для активации которых также необходима энтеропептидаза. Помимо самого распространенного сайта DDDDK в трипсиногенах встречаются укороченные сайты DK и DDK. Несмотря на то, что экспрессия энтеропептидазы in vivo локализована преимущественно в дуоденальных энтероцитах, при патологиях может наблюдаться побочная экспрессия, например, в раковых клетках. В таком случае можно ожидать существования отличного от трипсиногена субстрата.

В связи с этим важно оценить в полной мере специфичность энтеропептидазы и выявить факторы, влияющие на нее. В последние годы подобная работа проделана в отношении десятков ферментов. Для многих из них определена специфичность по отношению не только к остатку, идущему непосредственно перед разрезаемой связью (Pi), но и к более удаленным остаткам, как с N-конца сайта узнавания (Рг-Рп), так и с С-конца (Pi'-Pn')- Для подобного исследования необходим многосторонний подход к изучению специфичности фермента, включая использование широких наборов или библиотек пептидных субстратов, а также исследование неспецифического гидролиза различных белков.

Не менее важной проблемой является понимание роли дистальных по отношению к разрезаемой связи аминокислотных остатков в ферментативном катализе. Считается, что их 5 связывание с субстратом может понижать барьер реакции ферментативного расщепления путем передачи энергии по сети водородных связей. Кроме того, предполагается, что взаимодействия дистальных остатков с сайтами связывания протеиназы может влиять на внутренние движения фермента и субстрата, необходимые для осуществления некоторых этапов протеолитической реакции. Для проверки этого предположения необходимо накопление большого объема данных по подобным взаимодействиям, включая каталитические константы, энергетику процесса и молекулярную динамику взаимодействия фермент-субстрат.

Для полноценного исследования рекомбинантных белков очень важно наличие эффективных систем экспрессии, позволяющих нарабатывать белки в значительных количествах. В случае энтеропептидазы потребности современной науки весьма широки: помимо интереса ее изучения как важного элемента физиологии человека, энтеропептидаза стала важным инструментом биотехнологии, где используется для расщепления рекомбинантных гибридных белков. В связи со значительной трудностью получения в Escherichia coli правильно сложенного белка с несколькими дисульфидными связями в цитоплазме, периплазме или секретированного в культуральную среду, часто используют такие условия экспрессии, при которых происходит агрегация белка и образование телец включения. В этом случае для получения правильно сложенного белка производят его ренатурацию из телец включения. Разработка и оптимизация процедуры ренатурации важна не только для получения конкретного белка, но и для выявления элементов структуры, важных для фолдинга родственных белков.

В настоящей диссертационной работе разработана процедура получения рекомбинантной каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP). Для этого создан штамм-продуцент Е. coli, обеспечивающий высокий уровень экспрессии гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, и разработана методика ренатурации этого белка из телец включения. Для повышения выхода ренатурации было проведено молекулярное моделирование оптимизированной аминокислотной последовательности энтеропептидазы. Один из предсказанных моделированием мутантных вариантов дал значительно увеличенный выход ренатурации, что позволило получать до 40 мг активного фермента с 1 л бактериальной культуры. Исследования ферментативной кинетики полученного препарата показали его на порядок более высокую, чем у бычьего аналога, активность при гидролизе специфического субстрата, и, кроме того, обнаружили вторичную специфичность к субстратам с гидрофобными остатками в положении Рг. Моделирование комплексов ферментов человека и быка со специфическим субстратом позволило предположить, что различные константы Михаэлиса обосновываются различными аминокислотными остатками в положения 96 и 219 полипептидной цепи ферментов. Введение в названные положения L-HEP соответствующих аминокислотных остатков энтеропептидазы быка подтвердило эту гипотезу и, кроме того, значительно уменьшило гидролиз белковых субстратов по сайтам, отличающимся от специфического отсутствием отрицательно заряженного остатка в положениях V2 и Рз.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Остапченко, Валерий Геннадиевич

выводы

1. Синтезирован ген каталитической субъединицы энтеропептидазы человека (L-HEP) и осуществлена ее экспрессия в Escherichia coli в составе гибридного белка с тиоредоксином в качестве белка-носителя.

2. Разработана процедура ренатурации гибридного белка тиоредоксин/L-HEP, позволяющая получать до 10 мг активного фермента с литра культуры.

3. Впервые охарактеризованы ферментативные свойства легкой цепи энтеропептидазы человека. Определены кинетические параметры L-HEP по гидролизу пептидных субстратов и гибридных белков, содержащих сайт узнавания энтеропептидазы DDDDK. Обнаружено, что константа специфичности (кСй1/Кт) L-HEP при гидролизе подобных субстратов на порядок превышает константу специфичности L-BEP.

4. Показано, что взаимодействие L-HEP с ингибиторами проходит по типу трипсин-подобных сериновых протеиназ. Показано, что ионы одно- и двухвалентных металлов (Na+, Са2+) ингибируют гидролиз специфических субстратов. Изучение влияния денатурирующих агентов на L-HEP показало ее высокую стабильность.

5. Построена пространственная модель L-HEP. С помощью молекулярного моделирования найдена мутация C122S, введение которой в L-HEP повышает выход ренатурации в 4 раза. Показана критичность образования дисульфидной связи 136-201 для рефолдинга L-HEP.

6. Обнаружена вторичная специфичность L-HEP по отношению к хромогенным субстратам и белкам, содержащим в положении Рг ароматические и большие гидрофобные боковые цепи. Показано, что L-HEP расщепляет белковые субстраты, даже если в сайте связывания субстрата в позициях Р2-Р5 содержится менее 4-х остатков с отрицательно заряженными боковыми цепями (Asp/Glu).

7. С помощью методов молекулярного моделирование показано, что аминокислотные остатки в положениях 96 и 219 отвечают за различия каталитических свойств легких цепей энтеропептидаз быка и человека. Показано, что введение в l-hep мутаций r96k и k219q улучшает специфичность белка, практически не меняя скорость гидролиза специфических субстратов.

8. Показан кооперативный эффект улучшения специфичности при одновременном введении мутаций r96k и k219q в l-hep. Неспецифическое расщепление белков trail и bsa по сайтам qeeik-len и dehvkIlv, соответственно, значительно уменьшается при использовании мутантного варианта l-hep/r96k/k219q, по сравнению с диким типом и вариантами с одиночными заменами r96k и k219q.

4.9. Заключение

В настоящей работе был получен активный препарат рекомбинантной легкой цепи энтеропептидазы человека высокой степени чистоты. Исходя из сложности сборки подобной протеиназы при использовании прокариотической системы экспрессии был выбран выриант производства целевого белка в виде единой полипептидной цепи с тиоредоксином в нерастворимом виде для последующей его ренатурации. Использование схемы с дисульфидным обменом цистеинов белка с парой окисленный/восстановленный глутатионы (помогающей сборке белков с дисульфидными связями в эукариотических клетках) позволило получить достаточное для биохимических и физико-химических исследований количество высокоактивного фермента. Однако значительная трудоемкость и существенный расход материалов (реактивов) делают такую ренатурацию малоперспективной процедурой получения рекомбинантных белков. Для облегчения этой задачи была проведена оптимизация, затронувшая как процедуру ренатурации, так и структуру самого ренатурируемого белка. В результате удалось не только достичь почти десятикратного увеличения выхода ренатурации каталитической субъединицы энтеропептидазы, но и получить существенные результаты по влиянию на фолдинг белка некоторых структурных элементов. Эти результаты могут быть использованы при получении и исследованиях других сериновых протеиназ химотрипсинового типа.

Важнейшей характеристикой регуляторных протеиназ, каковой является энтеропептидаза, считается специфичность по отношению к определенным пептидным последовательностям. Физиологическая роль энтеропептидазы с середины прошлого века предполагалась исключительно в активации трипсиногена. Обнаруженная при исследовании L-HEP побочная специфичность позволяет предположить существование иных мишеней у энтеропептидазы человека. Например, может существовать белок-мишень, подобный TRAIL, у которого энтеропептидаза способна расщепить одну из экспонированных на поверхность белка петель, что может привести к блокированию сигнала. Другой результат подобного изменения специфичности - появление нестрогого соблюдения иерархии в каскаде пищеварительных ферментов. Расширение специфичности энтеропептидазы может позволить ей как активацию других зимогенов панкреатического сока, помимо трипсиногена, так и более значительное участие в переваривании белковой составляющей пищи, особенно при денатурации последней. Возможно, такой эволюционный шаг требуется для улучшения пищеварения всеядных млекопитающих (человека, свиньи). Либо, наоборот, травоядность быка потребовала более высокорегулированного каскада пищеварительных протеиназ, опосредованного более высокоспецифичной энтеропептидазой в его корне.

Полученные результаты влияния различных участков субстрат-связывающего центра энтеропептидазы на гидролиз субстратов позволили не только выявить конкретные структурные различия, приводящие к отличиям в специфичности ферментов человека и быка по отношению к различным субстратам, но и сделать вывод об их недостаточности для полного обоснования этой разницы. Так как фермент человека более активно гидролизует все рассмотренные субстраты, вне зависимости от остатков Рг-Рп, логично предположить, что одно из главных различий L-HEP и L-BEP кроется в структуре активного центра. Его устройство чрезвычайно тонко: десятые доли ангстрема в расстояниях между остатками каталитической триады, оксианионной дыры и субстратом играют большую роль; поэтому даже небольшие изменения в укладке ядра молекулы фермента могут привести к серьезному изменению эффективности работы каталитической машины. Подобные перемещения ее элементов особенно должны влиять на расщепление амидной связи, так как для уменьшения ее жесткости при образовании тетраэдрического интермедиата необходимо идеальное взаиморасположение субстрата и всех элементов активного центра. Исследование двух ферментов с практически одинаковыми структурами, но отличающимися параметрами катализа может значительно прояснить сам процесс катализа, который до сих пор не имеет однозначного объяснения. Другая возможная причина обнаруженного различия - это влияние связывания субстрата в отдаленных от расщепляемой связи сайтах на его гидролиз не через простое увеличение сродства, а более сложными путями, каковыми считаются изменения внутреннего движения фермента и реорганизация обширной сети водородных связей, в которую входят и связи, непосредственно влияющие на процесс ферментативного катализа. В частности, преимущество L-HEP может быть связано с большей сопряженностью энергии водородных связей (или опосредуемых этими связями структурных изменений комплекса), образуемых петлей 216-220 и основной цепью субстрата, с каталитическим процессом.

Для подтверждения или опровержения этих гипотез необходимо накопление статистических данных по разным ферментам, включая параметры катализируемых ими реакций, моделирование динамики их взаимодействий с различными субстратами, кристаллографические данные и др. Однако несомненным фактом является то, что получение подобной информации для одного фермента (чему посвящена данная работа) указывает направление исследований и может способствовать изучению других ферментов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат физико-математических наук Остапченко, Валерий Геннадиевич, 2006 год

1. Pavlov, I. P.(1902). The Work of the Digestive Glands, Trans, Charles Griffin & Co.1. W.H.Thompson, London.

2. Kunitz M. (1939) Formation of trypsin from crystalline trypsinogen by means ofenterokinase. J Gen Physiol, 22, 429-446.

3. Davie, E.W. & Neurath, H. (1955) Identification of a peptide released during autocatalyticactivation of trypsinogen. J. Biol. Chem. 212, 515-529.

4. Yamashina, I. (1956) The action of enterokinase on trypsinogen, Acta Chem. Scand. 10,739.743.

5. A. Light, H. Janska, Enterokinase (enteropeptidase): comparative aspects, Trends

6. Biochem. Sci. 14(1989) 110-112.

7. Lu,D. & Sadler,J.E. (1998) Enteropeptidase. In Handbook of Proteolytic Enzymes

8. Barrett,A.J., Rawlings,N.D., & Woessner,J.F.J., eds), pp. 50-54. Acadenic Press Ltd, London.

9. Hadorn,B., Tarlow,M.J„ Lloyd,J.K, & Wolff,O.H. (1969) Intestinal enterokinasedeficiency. Lancet, 1, 812-3.

10. Hadorn B, Haworth JC, Gourley B, Prasad A, Troesch V. (1975) Intestinal enterokinasedeficiency. Occurrence in two sibs and age dependency of clinical expression. Arch. Dis. Child. Apr;50(4):277-82.

11. Haworth,J.C., Gourley,В., Hadorn,В., & Sumida,C. (1971) Malabsorption and growthfailure due to intestinal enterokinase deficiency. JPediatr, 78,481-90.

12. Kitamoto,Y., Yuan,X., Wu,Q., McCourt,D.W., & Sadler,J.E. (1994) Enterokinase, the initiator of intestinal digestion, is a mosaic protease composed of a distinctive assortmentof domains. Proc Natl Acad Sci USA, 91, 7588-92.

13. Matsushima,M., Ichinose,M., Yahagi,N., Kakei,N., Tsukada,S., Miki,K., Kurokawa,K., Tashiro,K., Shiokawa,K., Shinomiya,K., & et,a.l. (1994) Structural characterization of porcine enteropeptidase. J Biol Chem, 269, 19976-82.

14. J.D. Hooper, J.A. Clements, J.P. Quigley, T.M. Antalis, Type II transmembrane serine proteases. Insights into an emerging class of cell surface proteolytic enzymes, J. Biol. Chem. 276 (2001) 857-860.

15. Light, A. & Fonseca P. (1984) The preparation and properties of the catalytic subunit of bovine enterokinase. J Biol Chem. 259(21):13195-8.

16. Anna G. Mikhailova, Lev D. Rumsh (1999). Autolysis of bovine enteropeptidase heavy chain: evidence of fragment 118-465 involvement in trypsinogen activation. FEBS Lettrs 442, 226-230.

17. LaVallie,E.R., Rehemtulla,A., Racie,L.A., DiBlasio,E.A., Ferenz,C., Grant,K.L., Light,A., & McCoy,J.M. (1993) Cloning and functional expression of a cDNA encoding the catalytic subunit ofbovine enterokinase. J Biol Chem, 268,23311-7.

18. Lu,D., Yuan,X., Zheng,X., & Sadler,J.E. (1997) Bovine proenteropeptidase is activated by trypsin, and the specificity of enteropeptidase depends on the heavy chain. J Biol Chem, 272,31293-300.

19. Lu,D„ Futterer,K., Korolev,S., Zheng,X., Tan,K., Waksman,G., & Sadler,J.E. (1999) Crystal structure of enteropeptidase light chain complexed with an analog of the trypsinogen activation peptide. JMolBiol, 292,361-73.

20. Kitamoto,Y., Veile,R.A, Donis-Keller,H., & Sadler,J.E. (1995) cDNA sequence andchromosomal localization of human enterokinase, the proteolytic activator of trypsinogen. Biochemistry, 34, 4562-8.

21. Svetina,M., Krasevec,N., Gaberc-Porekar,V., & Komel,R. (2000) Expression of catalytic subunit of bovine enterokinase in the filamentous fungus Aspergillus niger. J Вiotechnol, 76,245-51.

22. Blow, D. M. (1997) The tortuous story of Asp . His . Ser: structural analysis of alpha-chymotrypsin. Trends Biochem. Sci. 22, 405-408.

23. Dodson, G.; Wlodawer, A. (1998) Catalytic triads and their relatives. Trends Biochem. Sci. 23, 347-352.

24. Rawlings, N. D.; Barrett, A. J. (2000) MEROPS: the peptidase database Nucleic Acids Res. 28, 323-325.

25. Neurath, H. (1984) Evolution of proteolytic enzymes. Science 224, 350-357.

26. Johnson, D. E. (2000) Programmed cell death regulation: basic mechanisms and therapeutic opportunities. Leukemia 1695-1703.

27. Joseph, К.; Ghebrehiwet, В.; Kaplan, A. P. (2001) Activation of the kinin-forming cascade on the surface of endothelial cells. Biol. Chem. 382, 71-75.

28. Coughlin, S. R. (2000) Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature 407, 258-264.

29. Barros, C.; Crosby, J. A.; Moreno, R. D. (1996) Early steps of sperm-egg interactions during mammalian fertilization. Cell Biol. Int. 20, 33-39.

30. Davidson, D. J.; Higgins, D. L.; Castellino, F. J. (1990) Plasminogen activator activities of equimolar complexes of streptokinase with variant recombinant plasminogens. Biochemistry 29, 3585-3590.

31. Sim, R. В.; Laich, A. (2000) Serine proteases of the complement system Biochem. Soc. Trans. 28, 545-50.

32. Collen, D.; Lijnen, H. R. (1986) The fibrinolytic system in man. CRC Crit. Rev. Oncol. Hematol. 4, 249-301.

33. LeMosy, E. K.; Hong, С. C.; Hashimoto, C. (1999) Signal transduction by a protease cascade. Trends Cell Biol. 9, 102-107.

34. Van den Steen, P. E.; Opdenakker, G.; Wormald, M. R.; Dwek, R. A.; Rudd, P. M. (2001) Matrix remodelling enzymes, the protease cascade and glycosylation. Biochim. Biophys. Acta 1528, 61-73.

35. Selvarajan, S.; Lund, L. R.; Takeuchi, Т.; Craik, C. S.; Werb, Z. (2001) A plasma kallikrein-dependent plasminogen cascade required for adipocyte differentiation. Nat. Cell Biol. 3, 267-275.

36. Perona, J. J.; Craik, C. S. (1995) Structural basis of substrate specificity in the serine proteases. Protein Sci. 4, 337-360.

37. Perona, J. J.; Hedstrom, L.; Rutter, W. J.; Fletterick, R. J. (1995) Structural origins of substrate discrimination in trypsin and chymotrypsin. Biochemistry 34.

38. Czapinska, H.; Otlewski, J. (1999) Structural and energetic determinants of the SI-sitespecificity in serine proteases. Eur. J. Biochem. 260, 571-595.

39. Blow, D. M. In The Enzymes', 3rd ed.; Boyer, P. D., Ed.; Academic Press: Boca Raton, (1971) Vol. 3.

40. Kraut, J. (1977) Serine proteases: structure and mechanism of catalysis. Annu. Rev. Biochem. 46, 331-358.

41. Patthy, L. (1993) Modular design of proteases of coagulation, fibrinolysis, and complement activation: implications for protein engineering and structure-function studies. Methods Enzymol. 222, 10-21.

42. Schechter, I.; Berger, A. (1967) On the size of the active site in proteases. I. Papain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 27, 157-162.

43. Knowles, J. R. (1965) Enzyme specificity: alpha-chymotrypsin. J. Theor. Biol. 9, 213228.

44. Dorovskaya, V. N.; Varfolomeyev, S. D.; Kaznskaya, N. F.; Klyosov, A. A.; Martinek, K. (1972) The influence of the geometric properties of the active centre on the specificity of -chymotrypsin catalysis. FEBSLett. 23, 122.

45. Kreiger, M.; Kay, L. M.; Stroud, R. M. (1974) Structure and specific binding of trypsin: comparison of inhibited derivatives and a model for substrate binding. J. Mol. Biol. 83, 209-230.

46. Shotton, D. M.; Watson, H. C. (1969) Three-dimensional structure of tosyl-elastase. Nature 25, 811-816.

47. Waugh, S. M.; Harris, J. L.; Fletterick, R.; Craik, C. S. (2000) The structure of the pro-apoptotic protease granzyme В reveals the molecular determinants of its specificity. Nat.1. Struct. Biol. 7, 762-765.

48. Huber, H.; Bode, W. (1978) Crystal structure of bovine trypsinogen at 1-8 A resolution. II. Crystallographic refinement, refined crystal structure and comparison with bovine trypsin. Act. Chem. Res. 11, 114-122.

49. Bone, R.; Shenvi, А. В.; Kettner, C. A.; Agard, D. A. (1987) Serine protease mechanism: structure of an inhibitory complex of alpha-lytic protease and a tightly bound peptide boronic acid. Biochemistry 26, 7609-7614.

50. Laskowski, M.; Qasim, M. A. (2000) What can the structures of enzyme-inhibitor complexes tell us about the structures of enzyme substrate complexes? Biochim. Biophys. Acta 1477, 324-337.

51. Bode, W.; Huber, R. (1992) Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases. Eur. J. Biochem. 204, 433-451.

52. Dixon, M. M.; Matthews, B. W. (1989) Is gamma-chymotrypsin a tetrapeptide acyl-enzyme adduct of alpha-chymotrypsin? Biochemistry 28, 7033-7038.

53. Blanchard, H.; James, M. N. (1994) A crystallographic re-investigation into the structure of Streptomyces griseus proteinase A reveals an acyl-enzyme intermediate. J. Mol. Biol. 241,574-587.

54. Read, R. J.; James, M. N. G. Elsevier Science Publishing Co., Inc.: New York, 1986.

55. Bone, R.; Sampson, N. S.; Bartlett, P. A.; Agard, D. A. (1991) Crystal structures of alpha-lytic protease complexes with irreversibly bound phosphonate esters. Biochemistry 30, 2263-2272.

56. Coombs, G. S.; Rao, M. S.; Olson, A. J.; Dawson, P. E.; Madison, E. L. (1999) Revisitingcatalysis by chymotrypsin family serine proteases using peptide substrates and inhibitors with unnatural main chains. J. Biol. Chem. 274, 24074-24079.

57. Thompson, R. C. (1973) Use of peptide aldehydes to generate transition-state analogs of elastase. Biochemistry 12, 47-51.

58. Kettner, C. A.; Bone, R.; Agard, D. A.; Bachovchin, W. W. (1988) Kinetic properties of the binding of alpha-lytic protease to peptide boronic acids. Biochemistry 27, 7682-7688.

59. Brady, K.; Abeles, R. H. (1990) Inhibition of chymotrypsin by peptidyl trifluoromethyl ketones: determinants of slow-binding kinetics. Biochemistry 29, 7608-7617.

60. Schellenberger, V.; Braune, K.; Hofmann, H. J.; Jakubke, H. D. (1991) The specificity of chymotrypsin. A statistical analysis of hydrolysis data. Eur. J. Biochem. 199, 623-636.

61. Stein, R. L.; Strimpler, A. M.; Hori, H.; Powers, J. C. (1987) Catalysis by human leukocyte elastase: mechanistic insights into specificity requirements. Biochemistry, 26, 1301-1305.

62. Bode, W.; Meyer, E., Jr.; Powers, J. C. (1989) Human leukocyte and porcine pancreatic elastase: X-ray crystal structures, mechanism, substrate specificity, and mechanism-based inhibitors. Biochemistry, 28, 1951-1963.

63. Baggio, R.; Shi, Y.-Q.; Wu, Y.-Q.; Abeles, R. H. (1996) Biochemistry, 35, 3351-3353.

64. Hedstrom, L.; Szilagyi, L.; Rutter, W. J. (1992) Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops. Science, 255, 1249-1253.

65. Harper, J. W.; Cook, R. R.; Roberts, C. J.; McLaughlin, B. J.; Powers, J. C. (1984) Biochemistry, 23, 2995-3002.

66. Stein, R. L. (1985) Catalysis by human leukocyte elastase: III. Steady-state kinetics for the hydrolysis of p-nitrophenyl esters. Arch. Biochem. Biophys., 236, 677-680.

67. Thompson, R. C.; Blout, E. R. (1970) Evidence for an extended active center in elastase. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 67, 1734-1740.

68. Stein, R. L. (1985)7. Am. Chem. Soc., 107, 5767-5775.

69. Hess, G. P.; McConn, J.; Ku, E.; McConkey, G. (1970) Studies of the activity of chymotrypsin. Philos. Trans. R. Soc. London, В 257, 89-104.

70. Tanizawa, K.; Kanaoka, Y.; Lawson, W. B. (1987) Acc. Chem. Res., 20, 337-343.

71. Liang, Т.; Abeles, R. H. (1987) Complex of alpha-chymotrypsin and N-acetyl-L-leucyl-L-phenylalanyl trifluoromethyl ketone: structural studies with NMR spectroscopy. Biochemistry 26, 7603-7608.

72. Cassidy, C. S.; Lin, J.; Frey, P. A. (2000) Biochem. Biophys. Res. Commun., 273, 789792.

73. Lin, J.; Cassidy, C. S.; Frey, P. A. (1998) Correlations of the basicity of His 57 with transition state analogue binding, substrate reactivity, and the strength of the low-barrier hydrogen bond in chymotrypsin. Biochemistry 37, 11940-11948.

74. Cassidy, C. S.; Lin, J.; Frey, P. A. (1997) Biochemistry, 36, 4576-4584.

75. Tobin, J. В.; Whitt, S. A.; Cassidy, C. S.; Frey, P. A. (1995) Biochemistry, 34, 6919-24.

76. Inagami, Т.; Murachi, T. (1964) J. Biol Chem., 239, 1395-1401.

77. Ascenzi, P.; Menegatti, E.; Guarneri, M.; Bortolotti, F.; Antonini, E. (1982)

78. Biochemistry, 21, 2483-2490.

79. Robertus, J. D.; Kraut, J.; Alden, R. A.; Birktoft, J. J. (1972) Subtilisin; a stereochemical mechanism involving transition-state stabilization. Biochemistry, 11, 4293-4318.

80. Read, R. J.; Fujinaga, M.; Sielecki, A. R.; James, M. N. G. (1983) Biochemistry, 22, 4420-4433.

81. Katz, B. A.; Finer-Moore, J.; Mortezaei, R.; Rich, D. H.; Stroud, R. M. (1995) Episelection: novel Ki approximately nanomolar inhibitors of serine proteases selected by binding or chemistry on an enzyme surface. Biochemistry, 34, 8264-8280.

82. Corey, D. R.; Craik, C. S. (1992)7. Am. Chem. Soc., 114, 1784-1790.

83. Cannon, W. R.; Benkovic, S. J. (1998) Solvation, reorganization energy, and biological catalysis. J. Biol. Chem., 213, 26257-26260.

84. Jencks, W. P. (1975) Binding energy, specificity, and enzymic catalysis: the circe effect. Adv. Enzymol., 43, 219-410.

85. Gandour, R. D.; Nabulsi, N. A. R.; Fronczek, F. R. (1990) J. Am. Chem. Soc., 112, 78167817.

86. Satterthwait, A. C.; Jencks, W. P. (1974) J. Am. Chem. Soc., 96, 7018-7031.

87. Dufton, M. J. (1990) Could domain movements be involved in the mechanism of trypsin-like serine proteases FEBS Lett., 271, 9-13.

88. Stormo, G.D., Schneider, T.D. and Gold, L. (1982) Characterization of translation initiation sites in E. coli. Nucl. Acids Res. 10:2971-2996.

89. Casadaban MJ, Martinez-Arias A, Shapira SK, Chou J (1983) |3-galactosidase gene fusion for analyzing gene expression in Escherichia coli and yeast. Methods Enzymol 100:293-308,.

90. Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Single-step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli as fusions with glutathione S-transferase. Gene 67:31-40.

91. LaVallie ER, DiBlasio EA, Kovacic S, Grant KL, Schendel PF, McCoy JM. (1993) A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11(2): 187-93.

92. Mitraki, A. and King, J. (1989) Protein folding intermediates and inclusion body formation. Bio/Technology 7: 690-697.

93. Lunn, C.A., Kathju, S., Wallace, B.J., Kushner, S.R. and Pigiet, V. (1984) Amplification and purification of plasmid-encoded thioredoxin from Escherichia coli К12. J. Biol. Chem. 259:10469-10474.

94. Katti, S.K., LeMaster, D.M. and Eklund, H. (1990) Crystal structure of thioredoxin from Escherichia coli at 1.68 angstroms resolution. J. Mol. Biol. 212: 167-184.

95. Stader, J.A. and Silhavy, T.J. (1990) Engineering Escherichia coli to secrete heterologous gene products. Methods inEnzymol. 165: 166-187.

96. S. Ohnishi and K. Takano (2003) Amyloid fibrils from the viewpoint of protein folding. Cell Mol Life Sci, 61 (5), pp.511-524.

97. Grojean H, Fiers W (1982) Preferential codon usage in prokariotic genes: The optimal codon-anticodon interaction energy and the selective codon usage in efficiently expressed genes. Gene 18:199-209.

98. Kalafatis,M. & Mann,K.G. (1993) Role of the membrane in the inactivation of factor Va by activated protein C. J Biol Chem, 268,27246-57.

99. Bradford,М.М. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 72, 248-54.

100. Gill,S.C. & von Hippel,P.H. (1989) Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem, 182, 319-26.

101. Green,G.D. & Shaw,E. (1979) Thiobenzyl benzyloxycarbonyl-L-lysinate, substrate for a sensitive colorimetric assay for trypsin-like enzymes. Anal Biochem, 93, 223-6.

102. Grant, D.A. & Hermon-Taylor,J. (1979) Hydrolysis of artificial substrates by enterokinase and trypsin and the development of a sensitive specific assay for enterokinase in serum. Biochim Biophys Acta, 567, 207-15.

103. Baratti,J., Maroux,S., Louvard,D., & Desnuelle,P. (1973) On porcine enterokinase. Further purification and some molecular properties. Biochim Biophys Acta, 315, 147-61.

104. Anderson,L.E., Walsh,K.A., & Neurath,H. (1977) Bovine enterokinase. Purification, specificity, and some molecular properties. Biochemistry, 16,3354-60.

105. Liepnieks,J.J. & Light,A. (1979) The preparation and properties of bovine enterokinase. J Biol Chem, 254,1677-83.

106. Morrison,J.F. & Walsh,C.T. (1988) The behavior and significance of slow-binding enzyme inhibitors. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol, 61, 201-301.

107. Berendsen, H. J. C,, van der Spoel, D., van Drunen, R. (1995) GROMACS: A message-passing parallel molecular dynamics implementation. Сотр. Phys. Comm. 91:43-56.

108. Lindahl, E., Hess, В., van der Spoel, D. (2001) Gromacs 3.0: A package for molecular simulation and trajectory analysis. J. Mol. Mod. 7:306-317.

109. Berendsen, H. J. C., Postma, J. P. M., DiNola, A., Haak, J. R. (1984) Molecular dynamics with coupling to an external bath. J. Chem. Phys. 81:3684-3690.

110. Darden, Т., York, D., Pedersen, L. (1993) Particle mesh Ewald: An N-log(N) method for Ewald sums in large systems. J. Chem. Phys. 98:10089-10092.

111. Luthy R, Bowie JU, Eisenberg D (1992) Assessment of protein models with three-dimensional profiles, Nature 356 (6364), 83-5.

112. Kabsch, W. & Sander, C. (1983) Dictionary of protein secondary structure: Pattern recognition of hydrogen bonded and geometrical features, Biopolymers, 22, 2577-2637.

113. Hedstrom, L. (2002) Serine protease mechanism and specificity. Chem Rev, 102, 45014523.

114. Stein RL, Strimpler AM, Edwards PD, Lewis JJ, Mauger RC, Schwartz JA, Stein MM, Trainor DA, Wildonger RA, Zottola MA. (1987) Mechanism of slow-binding inhibition of human leukocyte elastase by trifluoromethyl ketones. Biochemistry. 26(10):2682-2689.

115. Case A, Stein RL (2003) Mechanistic origins of the substrate selectivity of serine proteases. Biochemistry 42(11): 3335-48.

116. Thompson RC, Blout ER. (1973) Dependence of the kinetic parameters for elastase-catalyzed amide hydrolysis on the length of peptide substrates. Biochemistry 12(1 ):51-57.1. БЛАГОДАРНОСТИ

117. Выражаю глубокую благодарность своим научным руководителям, д.б.н., профессору Д.А. Долгих и к.б.н. М.Э. Гаспарян, за доброе внимание, поддержку начинаний и своевременную, и потому неоценимую, помощь при выполнении моей диссертационной работы.

118. Я очень признателен моему консультанту по молекулярному моделированию к.ф.-м.н. Ю.А. Косинскому за терпеливое обучение методам и ценные обсуждения результатов.

119. Также не могу не отметить важную роль моей семьи и друзей в стабилизации фона проводимых исследований: благодарю их и надеюсь, что смогу быть полезен в ответ.