Разработка способа биосинтеза рекомбинантных белков и пептидов в форме активных телец включения в клетках Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Комолов Александр Сергеевич

• Комолов Александр Сергеевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Комолов Александр Сергеевич

1.1 Актуальность и степень разработанности темы

1.2 Цель и задачи

1.3 Научная новизна и практическая значимость

1.4 Методология и методы исследования

1.5 Положения, выносимые на защиту

1.6 Степень достоверности и апробация результатов

1.7 Личный вклад автора

1.8 Публикации и апробация работы

1.9 Структура и объем диссертации

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Рекомбинантные белки

2.2 Организмы, применяемые для синтеза рекомбинантных белков

2.3 Очистка белков от клеточных примесей

2.3.1 Хроматография

2.3.1.1 Аффинная хроматография

2.3.1.2 Гельпроникающая хроматография

2.3.1.3 Ионообменная хроматография

2.3.2 Синтез белка в форме телец включения

2.4 Активные тельца включения

2.4.1 Формирование активных телец включения в специальных условиях культивирования клеток E. coli

2.4.2 Универсальные подходы к формированию активных телец включения

2.4.3 Использование самоассоциирующих последовательностей

2.4.3.1 Самоассоциирующие последовательности, применяемые для формирования активных телец включения

2.4.3.2 Промежуточные полипептидные последовательности, применяемые для формирования активных телец включения

2.4.4 Возможные приложения подхода к синтезу белков в форме активных телец включения

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Бактериальные штаммы

3.2 Методы работы с ДНК

3.2.1 ПЦР, рестрикция, лигирование, горизонтальный электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

3.2.2 Амплификация плазмидной ДНК

3.2.3 Конструирование плазмид

3.3 Методы работы с бактериальными культурами

3.3.1 Среды для культивирования клеток E. coli

3.3.2 Культивирование штаммов E. coli и синтез целевого белка

3.3.3 Определение накопления биомассы клетками E. coli

3.3.4 Дезинтеграция клеток E. coli

3.3.4.1 Ферментативная дезинтеграция

3.3.4.2 Ультразвуковая дезинтеграция

3.3.4.3 Экструзионная дезинтеграция

3.3.5 Оптическая и флуоресцентная микроскопия

3.4 Методы работы с белками

3.4.1 Выделение целевого белка из клеточной биомассы с применением металл-хелатной аффинной хроматографии

3.4.2 Гельпроникающая хроматография

3.4.3 Диализ

3.4.4 Вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле

3.4.5 Определение концентрации белка

3.4.6 Обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная хроматография

3.4.7 Определение молекулярных масс белков и пептидов

3.4.8 Гидролиз белков с использованием протеазы Ulp1

3.4.9 Измерение флуоресценции

3.4.10 Измерение ферментативной активности L-аспарагиназы

3.4.11 Оценка эффективности препаратов супероксиддисмутазы по конверсии супероксидного анион-радикала

3.5 Программное обеспечение и базы данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Выбор элементов платформы и синтез активных телец включения

4.1.1 Синтез активных телец включения, содержащих белки с разной эффективностью сворачивания полипептидной цепи

4.1.2 Синтез активных телец включения, содержащих белки, обладающие четвертичной структурой

4.1.3 Синтез активных телец включения, содержащих белки, формирующие дисульфидные связи

4.1.4 Синтез активных телец включения, содержащих пептиды

4.1.5 Влияние белка SUMO в составе L6KD-SUMO на синтез и свойства активных телец включения

4.2 Изучение пространственной организации активных телец включения, формируемых гибридным белком L6KD-SUMO-sfGFP в клетках E. coli

4.3 Анализ фрагментации активных телец включения в процессе дезинтеграции клеток E. coli. Модификация самоассоциирующего пептида для повышения устойчивости активных телец включения

4.3.1 Влияние способа дезинтеграции клеток E. coli на изоляцию активных телец включения

4.3.2 Ультразвуковое диспергирование изолированных активных телец включения

4.3.3 Повышение устойчивости активных телец включения к фрагментации в условиях механической дезинтеграции клеток E. coli

4.3.3.1 Выбор модификаций самоассоциирующего пептида L6KD для повышения устойчивости активных телец включения

4.3.3.2 Влияние модифицированных самоассоциирующих пептидов на синтез активных телец включения

4.3.3.3 Оценка устойчивости активных телец включения с модифицированными самоассоциирующими пептидами в условиях ультразвуковой дезинтеграции клеток

4.3.3.4 Оценка устойчивости активных телец включения с модифицированными самоассоциирующими пептидами в условиях экструзионной дезинтеграции клеток

4.3.3.5 Влияние модификаций самоассоциирующего пептида на устойчивость активных телец включения

4.4 Применение платформы L6KD-SUMO для получения биологически активных рекомбинантных белков и пептидов в E. coli

4.4.1 Синтез и высвобождение целевых продуктов из активных телец включения

4.4.1.1 Оценка эффективности SUMO-специфичного протеолиза АТВ

4.4.1.2 Оценка способности активных телец включения препятствовать деградации целевых молекул в клетках E. coli

4.4.2 Использование активных телец включения для получения ферментных комплексов Cu, Zn супероксиддисмутазы 1 человека

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

91

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка способа биосинтеза рекомбинантных белков и пептидов в форме активных телец включения в клетках Escherichia coli»

1.1 Актуальность и степень разработанности темы

Получение рекомбинантных белков - важная и активно развивающаяся область биотехнологии, продукты которой находят широкое применение при решении исследовательских, терапевтических, диагностических и промышленных задач. Несмотря на высокие уровни синтеза, производство биологически активных рекомбинантных белков и пептидов в большинстве случаев сохраняет высокую стоимость из-за дорогостоящей стадии очистки целевого продукта, в том числе с использованием многоэтапной хроматографии. Оптимизация данного процесса может достигаться за счет универсальных решений. Существуют подходы, позволяющие выделять целевой продукт, содержащий искусственные удлинения, детерминирующие очистку с использованием аффинных сорбентов. Также возможен синтез целевых белков в форме телец включения (ТВ) в клетках E. coli. Такой подход позволяет получать чистые первоначальные препараты, но требует ренатурации целевого продукта.

Технология активных телец включения (АТВ) предлагает относительно новый подход к биосинтезу и очистке рекомбинантных белков и пептидов [1, 2]. При ее реализации в клетках E. coli обычно синтезируют слитую молекулу, состоящую из: (а) основной части, включающей самоассоциирующий пептид (САП) и промежуточный полипептид; (б) целевого белка. АТВ также называют каталитическими (КатТВ) или флуоресцентными (ФТВ) тельцами включения, если целевая молекула является ферментом или флуоресцентным белком, соответственно. В отличие от стандартных ТВ, при синтезе которых агрегирует целевой белок, в АТВ он попадает в биологически активном состоянии, т.к. формирование агрегатов происходит за счёт САП. Этапы получения целевого продукта с помощью данной технологии включают: культивирование клеток и синтез АТВ; дезинтеграцию клеток и фракционирование нерастворимых АТВ; высвобождение целевого белка путем протеолитической обработки АТВ; повторное фракционирование. Реже используются интеины, для высвобождения целевой молекулы без участия протеаз. Таким образом, в ходе данного процесса, целевой белок синтезируют и очищают от клеточных примесей без использования хроматографии, растворимые белки клеток отделяют на первом этапе фракционирования, а нерастворимые на втором. Обычно в качестве САП используются сурфактантоподобные пептиды, также встречаются молекулы, формирующие а-спирали или ß-слои. Наличие промежуточной

последовательности не является ключевым фактором для синтеза АТВ, но большинство современных решений её содержат. Обычно используют полипептиды: неструктурированные 17 аминокислотные пролин-треониновые (PT) и глицин-сериновые (GGGS)3-5 или «жесткие» (АААКЕ)5. Эффективность применения технологии АТВ была продемонстрирована на большом количестве целевых молекул.

Таким образом, разработки новых решений для экспрессии белков в форме АТВ позволят увеличить диапазон синтезируемых молекул и повысить универсальность технологии. Изучение пространственной организации и свойств АТВ позволит расширить спектр их применения.

1.2 Цель и задачи

Целью настоящей работы является разработка платформы для синтеза рекомбинантных белков и пептидов в форме активных телец включения (АТВ) в клетках Escherichia coli, основанной на использовании последовательности L6KD-SUMO, слитой с целевой молекулой.

В процессе работы решались следующие задачи:

1) Синтезировать в клетках E. coli гибридные белки, содержащие N-концевую последовательность L6KD-SUMO, и изучить их способность к формированию АТВ.

2) Исследовать влияние белка SUMO в составе L6KD-SUMO на синтез и свойства АТВ. Оценить эффективность высвобождения целевых белков из АТВ под действием SUMO-специфичной протеазы Ulp 1.

3) Изучить пространственную организацию АТВ, сформированных in vivo в клетках E. coli.

4) Изучить устойчивость АТВ к фрагментации в условиях механической дезинтеграции клеток E. coli и разработать модификации самоассоциирующего пептида L6KD, способствующие повышению стабильности.

5) Оценить способность АТВ препятствовать деградации целевых молекул в клетках E. coli.

6) Синтезировать Cu, Zn супероксиддисмутазу 1 человека в форме АТВ и оценить преимущества и недостатки разработанного подхода.

1.3 Научная новизна и практическая значимость

В настоящей работе разработана новая платформа для синтеза целевых белков и пептидов в клетках E. coli, основанная на использовании последовательности, включающей самоассоциирующий пептид L6KD и белок SUMO из Saccharomyces cerevisiae, слитой с целевой молекулой.

Было показано, что гибридные белки, содержащие N-концевую последовательность L6KD-SUMO, формируют активные тельца включения, в которых целевые молекулы обладают биологической активностью. Высокая эффективность данного подхода была продемонстрирована на примере репортерных белков, различавшихся молекулярной массой от 2,5 кДа до 36 кДа, четвертичной структурой, эффективностью сворачивания полипептидной цепи и наличием дисульфидных связей. Также было показано, что наличие SUMO между самоассоциирующим пептидом и целевой молекулой: (i) повышает синтез биологически активного белка; (ii) способствует формированию и более эффективному осаждению активных телец включения; (iii) обеспечивает высвобождение целевого белка/пептида с использованием каталитического домена C204 SUMO-специфичной протеазы Ulpl с эффективностью до 95%.

В ходе работы была исследована пространственная организация АТВ на основе L6KD-SUMO-sfGFP. Были получены микрофотографии клеток E. coli, и охарактеризованы агрегаты, формируемые целевыми молекулами in vivo. С помощью корреляционной световой и электронной микроскопии показано, что АТВ состоят из сети мицеллярных структур, которые представляют собой нанотрубки длиной от 40 до 100 нм с диаметром 23-25 нм, что соотносится с удвоенным теоретически рассчитанным размером одной молекулы L6KD-SUMO-sfGFP.

Показано, что использование механических методов дезинтеграции клеток E. coli приводит к фрагментации АТВ, что снижает эффективность их осаждения из клеточного лизата. Так экструзионная и ультразвуковая обработка приводят к уменьшению количества целевых молекул в осадочной фракции, что влияет на выход целевого белка.

Были разработаны модифицированные самоассоциирующие пептиды (C2-4L6KD и L8KD), повышающие устойчивость АТВ к фрагментации в процессе ультразвуковой и экструзионной дезинтеграции клеток.

На примере молекулы модифицированного глюкагоноподобного пептида-1 человека, R34-GLP-1(7-37) было показано, что синтез в составе АТВ препятствует внутриклеточной деградации целевого продукта в E. coli. Продемонстрировано, что

активные тельца включения обеспечивают синтез целевого пептида с корректной молекулярной массой в течение 70 часов культивирования клеток, в отличие от контрольной молекулы, синтезируемой в растворимом виде.

На примере Cu, Zn супероксиддисмутазы 1 человека был проведен анализ преимуществ и недостатков технологии активных телец включения. Показано, что АТВ обеспечивают получение большего количества рекомбинантного фермента без использования хроматографии с суммарной эффективностью конверсии супероксид анион-радикала сравнимой с контрольным препаратом.

Таким образом, в ходе выполнения диссертационной работы были получены результаты, которые расширяют знания о возможностях технологии активных телец включения, а также свойствах и пространственной организации формируемых агрегатов. Кроме того, полученные результаты имеют важное практическое значение и могут быть использованы для производства рекомбинантных белков и пептидов.

1.4 Методология и методы исследования

В ходе выполнения работы применялись стандартные методики молекулярной биологии. Для создания плазмид использовались традиционные методы генетической инженерии. В рамках исследования были разработаны генетически модифицированные штаммы-продуценты на основе бактерии E. coli. Для них проводили анализ продукции целевого белка, его распределения между фракциями клеточного лизата, и биологической активности. Изучение пространственной организации АТВ проводилось с использованием корреляционной световой и электронной микроскопии. Разрушение клеточных суспензий проводили с использованием ферментативной, ультразвуковой и экструзионной дезинтеграция. Определение молекулярных масс белков и пептидов проводилось с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Очистка белков проводилась с использованием стандартных хроматографических методик.

1.5 Положения, выносимые на защиту

1) Разработанная N-концевая последовательность, состоящая из самоассоциирующего пептида L6KD и белка SUMO, обеспечивает формирование активных телец включения в клетках E. coli с различными белками, отличающимися молекулярной массой от

2.5 кДа до 36 кДа, эффективностью сворачивания полипептидной цепи, четвертичной структурой и наличием дисульфидных связей.

2) Наличие SUMO в составе L6KD-SUMO, повышает синтез биологически активного белка, способствует формированию и более эффективному осаждению активных телец включения, а также обеспечивает возможность высвобождения целевой молекулы под действием SUMO-специфичной протеазы Ulp1.

3) Ультразвуковая и экструзионная дезинтеграция клеток E. coli способствует фрагментации активных телец включения на основе L6KD-SUMO, что приводит к их менее эффективному осаждению.

4) Модификация самоассоциирующего пептида L6KD посредством инсерции N-концевых гидрофобных или цистеиновых аминокислотных остатков увеличивает устойчивость АТВ к разрушению в процессе механической дезинтеграции E. coli.

5) Синтез целевых молекул в составе гибридных белков с L6KD-SUMO, формирующих АТВ, препятствует деградации в клетках E. coli.

1.6 Степень достоверности и апробация результатов

Степень достоверности положений, выносимых на защиту, и выводов, представленных в диссертации, обоснованы фактическим материалом, полученным в процессе проведения экспериментов с применением апробированных и современных биохимических и молекулярно-генетических методов, корректной обработкой полученных результатов исследований.

1.7 Личный вклад автора

Все основные результаты получены лично автором, либо при его участии в планировании и проведении экспериментов. Изучение пространственной организации активных телец включения с использованием корреляционной световой и электронной микроскопии было выполнено в ресурсном центре зондовой и электронной микроскопии «НАНОЗОНД» НИЦ «Курчатовский институт» совместно с сотрудником Плохих К.М.

Исследования с использованием масс-спектрометрии и обращенно-фазной ВЭЖХ были проведены совместно с сотрудниками лаборатории химии белка ресурсного центра "Белковая фабрика" НИЦ «Курчатовский институт».

1.8 Публикации и апробация работы

Результаты диссертационной работы представлены в 7 научных публикациях, в том числе в 3 статьях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК, и в 1 патенте.

Материалы диссертации были опубликованы в виде стендовых и устных докладов на Курчатовской междисциплинарной молодёжной научной школе (Москва, 2023); XXIII Зимней молодежной школе ПИЯФ по биофизике и молекулярной биологии (Гатчина, 2024); 66-ой Всероссийской научной конференции МФТИ (Москва, 2024).

1.9 Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из 8 разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список сокращений и условных обозначений» и «Список литературы». Работа изложена на 103 страницах, включая 22 рисунка и 11 таблиц. Список литературы содержит 127 источников.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Рекомбинантные белки

Белки являются важным классом биологических макромолекул, представляющих интерес для пищевой, сельскохозяйственной, биотехнологической, фармацевтической и косметической промышленности. Растущая потребность в продукции данных отраслей, стимулирует научные исследования, направленные на повышение уровня синтеза целевых молекул. Это достижимо как использованием разнообразных регуляторных элементов, так и подбором организма для гетерологической экспрессии, который позволяет получать биологически активную форму препарата и обладает минимальными затратами для культивирования. Также не менее важной задачей является разработка методов быстрой и эффективной очистки целевого продукта от примесей, образующихся в клетках. Существует множество подходов к очистке белков и можно утверждать, что любой стабильный белок может быть очищен до приемлемого стандарта однородности. Однако данный этап является довольно сложным, т.к. требует дорогого оборудования, высококвалифицированных кадров и предварительного этапа подготовки методики. В связи с этим стоимость производства остается довольно высокой, что приводит к необходимости разработки и внедрения универсальных решений.

Рекомбинантный белок — это белок, полученный с применением технологии рекомбинантной ДНК, которая сильно упрощает модификацию целевого продукта и позволяет получать его в организмах, изначально не имеющих соответствующего гена, что в свою очередь открывает множество возможностей для эффективного синтеза и применения в биотехнологии.

2.2 Организмы, применяемые для синтеза рекомбинантных белков

Выбор организма для синтеза рекомбинантных белков является одним из важнейших этапов разработки технологии, т.к. определяет затраты на производство и возможность получения корректной биологически активной формы целевой молекулы. На данный момент используют следующие системы экспрессии [3]:

1) Прокариотические системы (Escherichia coli, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,

Bacillus licheniformis, Bacillus brevis, Ralstonia eutropha, Pseudomonas fluorescens,

Staphylococcus carnosus);

2) Дрожжи (Saccharomyces cerevisiae и Pichiapastoris);

3) Грибы (Aspergillus niger, Aspergillus awamori, Chrysosporium lucknowense);

4) Клеточные линии насекомых (Кукурузная листовая совка - Spodoptera frugiperda);

5) Клеточные линии млекопитающих (клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки мышиной миеломы (NS0), клетки почки хомячка (BHK), клетки почек зеленой обезьяны, человеческие клеточные линии, такие как клетки эмбриональной почки человека (HEK) и др.);

6) Трансгенные животные: такие, как козы, мыши, коровы, свиньи, кролики и овцы используются для производства рекомбинантных белков в молоке, яичном белке, крови, моче, семенной плазме и коконах тутового шелкопряда;

7) Трансгенные растения.

По мере возрастания данного списка, возрастает и сложность организма, что неизбежно приводит к росту затрат на генетическое манипулирование, поддержание роста, получение штаммов-продуцентов и целевых продуктов. При этом высшие организмы способны производить эукариотические белки, обладающие корректными посттрансляционными модификациями, такими как гликозилирование, фосфорилирование и пр., что является крайне важным для фармацевтической промышленности. Организмы также отличаются патогенностью и токсичностью, которые, в некоторых случаях, ограничивают или усложняют их применимость в производстве. В связи с вышеизложенными фактами, наиболее предпочтительными являются штаммы-продуценты, выполненные на основе организма, который способен производить биологически активную форму целевой молекулы и является наиболее простым в использовании.

Escherichia coli часто является первоначальным выбором для оценки экспрессии рекомбинантных белков, поскольку около 30% всех биофармацевтических препаратов, производимых на данный момент, синтезируются именно в данном организме [4]. Также у данной системы есть множество преимуществ, таких как: глубокое понимание физиологии и генетики, быстрая кинетика роста на недорогих субстратах, высокие выходы биомассы, простота генетических манипуляций и культивирования. E. coli используется для разработки штаммов-продуцентов коммерчески важных белков, в особенности негликозилированных [3]. Кишечная палочка может накапливать рекомбинантные белки в количестве до 80% от своего сухого веса. Несмотря на большое количество достоинств, данный организм не лишен недостатков, к которым можно отнести:

1) сложности рекомбинантной продукции белков с дисульфидными связями;

2) невозможность производства гликозилированных белков, в связи с отсутствием систем посттрансляционных модификаций;

3) условная патогенность организма и необходимость очистки целевого продукта от эндотоксинов;

4) нестабильность мРНК;

5) необходимость дорогостоящей очистки целевого продукта от примесных белков;

6) проблемы с корректной укладкой некоторых белков, что приводит к формированию водонерастворимых агрегатов, называемых тельцами включения (ТВ).

На основе исходной бактерии E. coli было разработано множество специальных штаммов, которые могут частично компенсировать указанные выше недостатки. Штаммы BL21 и его производные обычно используются для массового производства рекомбинантных белков. Их особенностью является дефицит протеаз Lon и OmpT, что повышает стабильность белка [5]. Штамм BL21(DE3) содержит хромосомную копию гена РНК-полимеразы T7 для простой и эффективной экспрессии генов под контролем Т7-промотора [5]. BL21Star(DE3) содержит мутацию в rne, гене, кодирующем РНКазу E, что повышает стабильность мРНК и соответственно экспрессию белка [6, 7]. BL21trxB, производный от BL21(DE3), несет мутацию в гене тиоредоксинредуктазы (trxB), а штамм Origami(DE3) содержит мутации как в trxB, так и в гене, кодирующем глутатионредуктазу (gor), что способствует образованию дисульфидных связей в цитоплазме и соответственно используется для продукции цистеинсодержащих белков [8]. BL21(DE3)pLysS содержит плазмиду pLysS, несущую ген, кодирующий лизоцим фага Т7. Лизоцим снижает уровень фоновой экспрессии целевого белка до момента индукции изопропил-ß-D-l-тиогалактопиранозид (ИПТГ). Этот штамм используется для экспрессии белков, токсичных для клеток [9]. Штаммы BL21-CodonPlus(DE3) содержат дополнительные копии редких генов тРНК, например, BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL (содержит наибольшее количество генов тРНК в серии BL21-CodonPlus) несет гены для Arg-, Ile-, Leu- и Pro-тРНК [10]. Штаммы Rosetta и Rosetta (DE3) несут плазмиду pRARE, в которой экспрессируются гены, кодирующие аминоацил-тРНК-синтетазы для аргинина, изолейцина, лейцина, пролина и глицина [11]. Штаммы BL21-CodonPlus(DE3) и Rosetta (DE3) способствуют экспрессии генов, содержащих много кодонов с низкой частотой

встречаемости в E. coli, что в некоторых случаях может повлиять на корректный синтез и сворачивание белка. Также существуют штаммы, способные эффективно экспрессировать токсичные для E. coli белки (в том числе мембранные) - C41(DE3) и C43(DE3) [12, 13]. Они были разработаны с помощью ненаправленного мутагенеза и отбора соответствующих клонов [13]. Также были получены штаммы ClearColi™ BL21(DE3), с генетически модифицированной молекулой липополисахарида, которые не синтезируют эндотоксины [14]. Такое разнообразие штаммов E. coli открывает широкие возможности для производства рекомбинантных белков.

2.3 Очистка белков от клеточных примесей

В большинстве случаев к препаратам, полученным микробиологическим синтезом, предъявляют требования по высокой степени очистки от различного рода примесей, таких как клеточные белки, ДНК, РНК, фрагменты клеточной мембраны. Оптимизация протоколов позволяет свести данную задачу к отделению только белковых целевых молекул от нецелевых, при этом необходимо по максимуму сохранить биологическую активность и химическую целостность полипептида.

Этап очистки целевого белка обычно является наиболее трудоемким и сложным аспектом производства. Финальный препарат должен быть свободен не только от примесей, но и от присутствия различных изоформ, возникающих в результате синтеза [15]. Разделение целевых и нецелевых молекул может базироваться на различиях в химических, структурных и функциональных особенностях. К ним относятся: размер, форма, заряд, изоэлектрическая точка, распределение заряда, гидрофобность, растворимость, плотность, сродство к связыванию лигандов или металлов, обратимая ассоциация, посттрансляционные модификации, а также специфические последовательности или структуры. Обычно можно отделить большую часть примесей основываясь только на одном из перечисленных свойств, но для получения высокоочищенных и пригодных для применения препаратов, необходимо использовать несколько различных этапов фракционирования и хроматографии [16, 17].

Последнее время наиболее эффективным и часто используемым методом является аффинная хроматография, при которой целевая молекула синтезируется в виде гибридного белка с меткой, обладающей сродством к сорбенту. Независимо от выбора системы экспрессии необходимо оптимизировать использование таких меток, а именно надо ответить на вопросы: какие и сколько аффинных меток использовать; как

присоединять метку к белку, чтобы она не повлияла на его биологическую активность; как потом удалять данную метку из состава целевой молекулы и финального препарата.

При микробиологическом синтезе целевых молекул в клетках бактерии E. coli обычно реализуется один из двух вариантов продукции и очистки целевого белка: во фракции растворимых белков, в случае если данная молекула может синтезироваться в таком виде; в форме нерастворимых агрегатов, называемых тельцами включения (ТВ).

Для очистки белков, синтезируемых в растворимом виде, обычно используют многоэтапную хроматографию. В случае с ТВ необходимо предварительно денатурировать нерастворимые белковые агрегаты и получить ренатурированный целевой продукт.

2.3.1 Хроматография

Хроматография - один из наиболее эффективных и универсальных методов очистки целевых молекул из белковых смесей. Существуют разные типы: аффинная, гидрофобная, ионообменная, гельпроникающая, адсорбционная и другие. Наиболее часто используемые виды описаны далее в соответствующих разделах. В основе принципа хроматографии лежит различие степени сродства целевых и нецелевых молекул к неподвижной фазе (сорбенту), что обеспечивает различную скорость движения компонентов смеси и, соответственно, их разделение. В процессах биосепарации часто используют только жидкостную хроматографию (ЖХ) [18].

Выделяют два типа хроматографии: аналитическую и препаративную. Если аналитическая хроматография обычно отвечает на вопрос: какие молекулы белковой смеси и как отличаются по признаку, лежащему в основе данного типа хроматографии. Препаративная в свою очередь позволяет разделять большие объемы смесей для получения целевой молекулы в промышленных количествах.

2.3.1.1 Аффинная хроматография

Аффинная хроматография - разновидность жидкостной хроматографии, в которой в качестве неподвижной фазы используется агент, обладающий высоким сродством к целевой молекуле. Примерами взаимодействий, обеспечивающих такое связывание, являются: взаимодействие между антителом и антигеном, ферментом и субстратом, гормоном и рецептором [19-21]. Высокая селективность и простота аффинной хроматографии сделали этот метод полезным для очистки многих биомолекул,

биофармацевтических препаратов и других веществ. Кроме того, этот метод применяется в изучении и характеристике биологических взаимодействий [22, 23]. Среди различных вариантов аффинной хроматографии, наиболее часто используемый метод — это металл-хелатная аффинная хроматография (МХАХ).

2.3.1.2 Гельпроникающая хроматография

Гельпроникающая или эксклюзионная хроматография (ГПХ) позволяет осуществлять разделение молекул по форме и размеру в общем случае и по молекулярной массе, если форма близка к сферической. Также данный метод иногда называть гельфильтрацией. Гельпроникающая хроматография (ГПХ) широко используется для разделения и определения характеристик полимеров, в том числе биологических макромолекул, особенно белков. Помимо получения информации о размере белка, ГПХ может использоваться для препаративной очистки, анализа чистоты и изучения взаимодействия белков, как между собой, так и с другими молекулами [24].

2.3.1.3 Ионообменная хроматография

Ионообменная хроматография (ИОХ) позволяет дифференцировать молекулы на основе различий в заряде в целом или отдельных её доменов. Большая емкость для обработки образцов, широкая применимость, умеренная стоимость, мощная разрешающая способность, простота масштабирования и автоматизации привели к тому, что этот метод стал одним из самых универсальных и широко используемых среди всех методов жидкостной хроматографии (ЖХ) [18].

2.3.2 Синтез белка в форме телец включения

Несмотря на популярность бактерии Escherichia coli в качестве экспрессионного организма и наличия большого количества отработанных технологий на её основе, примерно 40% сверхэкспрессируемых рекомбинантных продуктов производится в виде телец включения [25]. ТВ - белковые агрегаты, которые имеют плотную структуру и не растворяются в воде. Бактериальные тельца включения считаются основным препятствием на пути получения активных и растворимых рекомбинантных белков. Однако у ТВ есть определенные преимущества: простота отделения от большинства клеточных белков из-за различий в их размере и плотности, устойчивость к

протеолитической деградации, механическая стабильность, возможность получения

токсичных для клетки белков [26].

Общая стратегия выделения биологически активных белков из бактериальных ТВ

включает четыре основных этапа:

1) Изоляцию ТВ из клеточного лизата, центрифугированием или фильтрацией. Из-за более высокой плотности и заряда белковых агрегатов они часто ассоциируют с ДНК, белком и клеточным мусором при первичном разделении. Поэтому необходимы следующие этапы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Комолов Александр Сергеевич, 2025 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Lin, Z., et al., Facile expression and purification of active human growth hormone in E. coli by a cleavable self-aggregating tag scheme. Protein Expr Purif, 2021. 188: p. 105974.

2. Wang, X., et al., Formation of active inclusion bodies induced by hydrophobic self-assembling peptide GFIL8. Microb Cell Fact, 2015. 14: p. 88.

3. Demain, A.L. and P. Vaishnav, Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnology Advances, 2009. 27(3): p. 297-306.

4. Walsh, G. and E. Walsh, Biopharmaceutical benchmarks 2022. Nat Biotechnol, 2022. 40(12): p. 1722-1760.

5. Joseph, B.C., S. Pichaimuthu, and S. Srimeenakshi, An Overview of the Parameters for Recombinant Protein Expression in Escherichia coli. Journal of Cell Science & Therapy, 2015. 06(05): p. 1-7.

6. Lopez, P.J., et al., The C-terminal half of RNase E, which organizes the Escherichia coli degradosome, participates in mRNA degradation but not rRNA processing in vivo. Mol Microbiol, 1999. 33(1): p. 188-99.

7. Wu, X., et al., Codon optimization reveals critical factors for high level expression of two rare codon genes in Escherichia coli: RNA stability and secondary structure but not tRNA abundance. Biochem Biophys Res Commun, 2004. 313(1): p. 89-96.

8. Prinz, W.A., et al., The role of the thioredoxin and glutaredoxin pathways in reducing protein disulfide bonds in the Escherichia coli cytoplasm. J Biol Chem, 1997. 272(25): p. 15661-7.

9. Zhang, H.C., et al., Efficient synthesis of mouse thymidylate synthase in Escherichia coli. Gene, 1989. 84(2): p. 487-91.

10. Jia, B. and C.O. Jeon, High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives. Open Biol, 2016. 6(8): p. 160196.

11. Loyevsky, M., et al., Expression of a recombinant IRP-like Plasmodium falciparum protein that specifically binds putative plasmodial IREs. Mol Biochem Parasitol, 2003. 126(2): p. 231-8.

12. Dumon-Seignovert, L., G. Cariot, and L. Vuillard, The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif, 2004. 37(1): p. 203-6.

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

Miroux, B. and J.E. Walker, Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol, 1996. 260(3): p. 289-98.

Mamat, U., et al., Endotoxin-free protein production—ClearColi™ technology. Nature Methods, 2013. 10(9): p. 916-916.

Kalyanpur, M., Downstream processing in the biotechnology industry. Mol Biotechnol, 2002. 22(1): p. 87-98.

Kallberg, K., H.O. Johansson, and L. Bulow, Multimodal chromatography: an efficient tool in downstream processing of proteins. Biotechnol J, 2012. 7(12): p. 1485-95. Labrou, N.E., Protein purification: an overview. Methods Mol Biol, 2014. 1129: p. 3-10. Cummins, P.M., K.D. Rochfort, and B.F. O'Connor, Ion-Exchange Chromatography: Basic Principles and Application. Methods Mol Biol, 2017. 1485: p. 209-223. Turkova, J., Affinity chromatography. J Chromatogr, 1974. 91: p. 267-91. Walters, R.R., Affinity chromatography. Anal Chem, 1985. 57(11): p. 1099A-1101A, 1102A-1106A passim.

Wilchek, M., T. Miron, and J. Kohn, Affinity chromatography. Methods Enzymol, 1984. 104: p. 3-55.

Hage, D.S., High-performance affinity chromatography: a powerful tool for studying serum protein binding. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2002. 768(1): p. 3-30.

Winzor, D.J., Quantitative affinity chromatography. J Biochem Biophys Methods, 2001. 49(1-3): p. 99-121.

Irvine, G.B., Determination of molecular size by size-exclusion chromatography (gel filtration). Curr Protoc Cell Biol, 2001. Chapter 5: p. Unit 5.5.

Jürgen, B., et al., Quality control of inclusion bodies in Escherichia coli. Microb Cell Fact, 2010. 9: p. 41.

Singhvi, P., et al., Bacterial Inclusion Bodies: A Treasure Trove of Bioactive Proteins. Trends Biotechnol, 2020. 38(5): p. 474-486.

Upadhyay, V., et al., Recovery of bioactive protein from bacterial inclusion bodies using trifluoroethanol as solubilization agent. Microb Cell Fact, 2016. 15: p. 100. Gorbunov, A.A., et al., Vaccine building 'kit': combining peptide bricks to elicit a desired immune response without adding an adjuvant. Nanomedicine (Lond), 2022. 17(7): p. 461-475.

29. Worrall, D.M. and N.H. Goss, The formation of biologically active beta-galactosidase inclusion bodies in Escherichia coli. Aust J Biotechnol, 1989. 3(1): p. 28-32.

30. Tokatlidis, K., et al., High activity of inclusion bodies formed in Escherichia coli overproducing Clostridium thermocellum endoglucanase D. FEBS Lett, 1991. 282(1): p. 205-8.

31. Garcia-Fruitos, E., et al., Aggregation as bacterial inclusion bodies does not imply inactivation of enzymes and fluorescent proteins. Microb Cell Fact, 2005. 4: p. 27.

32. Park, S.Y., S.H. Park, and S.K. Choi, Active inclusion body formation using Paenibacillus polymyxa PoxB as a fusion partner in Escherichia coli. Anal Biochem, 2012. 426(1): p. 63-5.

33. Li, S., et al., Production, characterization, and application of an organic solvent-tolerant lipase present in active inclusion bodies. Appl Biochem Biotechnol, 2013. 169(2): p. 61223.

34. Dong, Q., et al., Characterization of an extremely thermostable but cold-adaptive beta-galactosidase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus for use as a recombinant aggregation for batch lactose degradation at high temperature. J Biosci Bioeng, 2014. 117(6): p. 706-10.

35. Nahalka, J., et al., Bioenergy beads: a tool for regeneration of ATP/NTP in biocatalytic synthesis. Artif Cells Blood Substit Immobil Biotechnol, 2006. 34(5): p. 515-21.

36. Korovashkina, A.S., et al., Enzymatic synthesis of c-di-GMP using inclusion bodies of Thermotoga maritima full-length diguanylate cyclase. J Biotechnol, 2012. 164(2): p. 27680.

37. Raghunathan, G., et al., A variant of green fluorescent protein exclusively deposited to active intracellular inclusion bodies. Microb Cell Fact, 2014. 13: p. 68.

38. Flores, S.S., et al., Superactive beta-galactosidase inclusion bodies. Colloids Surf B Biointerfaces, 2019. 173: p. 769-775.

39. Gatti-Lafranconi, P., et al., Concepts and tools to exploit the potential of bacterial inclusion bodies in protein science and biotechnology. FEBS J, 2011. 278(14): p. 240818.

40. Krauss, U., et al., Catalytically-active inclusion bodies-Carrier-free protein immobilizates for application in biotechnology and biomedicine. J Biotechnol, 2017. 258: p. 136-147.

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

Jäger, V.D., et al., Catalytically-active inclusion bodies for biotechnology-general concepts, optimization, and application. Appl Microbiol Biotechnol, 2020. 104(17): p. 7313-7329.

Belkova, M., R. Köszagova, and J. Nahalka, Active Inclusion Bodies: The Unexpected Journey. Journal of microbiology, biotechnology and food sciences, 2022. Lin, Z., et al., Aggregating tags for column-free protein purification. Biotechnol J, 2015. 10(12): p. 1877-86.

Wu, W., et al., Active protein aggregates induced by terminally attached self-assembling peptide ELK16 in Escherichia coli. Microb Cell Fact, 2011. 10: p. 9. Zhang, S., et al., Zuotin, a putative Z-DNA binding protein in Saccharomyces cerevisiae. Embo j, 1992. 11(10): p. 3787-96.

Bowerman, C.J. and B.L. Nilsson, Self-assembly of amphipathic beta-sheet peptides: insights and applications. Biopolymers, 2012. 98(3): p. 169-84.

Vauthey, S., et al., Molecular self-assembly of surfactant-like peptides to form nanotubes and nanovesicles. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(8): p. 5355-60. von Maltzahn, G., et al., Positively Charged Surfactant-like Peptides Self-assemble into Nanostructures. Langmuir, 2003. 19: p. 4332-7.

Zhou, B., et al., Small surfactant-like peptides can drive soluble proteins into active aggregates. Microb Cell Fact, 2012. 11: p. 10.

Zhao, X. and S. Zhang, Fabrication of molecular materials using peptide construction motifs. Trends Biotechnol, 2004. 22(9): p. 470-6.

Zhao, X., Design of self-assembling surfactant-like peptides and their applications. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 2009. 14(5): p. 340-348. Gurevich, L., et al., PH-dependent self-assembly of the short Surfactant-like peptide KA6. J Nanosci Nanotechnol, 2010. 10(12): p. 7946-50.

Lin, Z., et al., Self-assembling amphipathic alpha-helical peptides induce the formation of active protein aggregates in vivo. Faraday Discuss, 2013. 166: p. 243-56. Harris, F.M., et al., Carboxyl-terminal-truncated apolipoprotein E4 causes Alzheimer's disease-like neurodegeneration and behavioral deficits in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(19): p. 10966-71.

Naskar, J., G. Palui, and A. Banerjee, Tetrapeptide-based hydrogels: for encapsulation and slow release of an anticancer drug at physiological pH. J Phys Chem B, 2009. 113(35): p. 11787-92.

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

Ge, X., et al., Self-cleavable stimulus responsive tags for protein purification without chromatography. J Am Chem Soc, 2005. 127(32): p. 11228-9.

Meyer, D.E. and A. Chilkoti, Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nat Biotechnol, 1999. 17(11): p. 1112-5. Urry, D.W., et al., Mechanochemical coupling in synthetic polypeptides by modulation of an inverse temperature transition. Proc Natl Acad Sci U S A, 1988. 85(10): p. 3407-11. Meyer, D.E. and A. Chilkoti, Quantification of the effects of chain length and concentration on the thermal behavior of elastin-like polypeptides. Biomacromolecules, 2004. 5(3): p. 846-51.

Ramirez, M., et al., Engineering split intein DnaE from Nostoc punctiforme for rapid protein purification. Protein Eng Des Sel, 2013. 26(3): p. 215-23. Shi, C., Q. Meng, and D.W. Wood, A dual ELP-tagged split intein system for non-chromatographic recombinant protein purification. Appl Microbiol Biotechnol, 2013. 97(2): p. 829-35.

Zeng, G., et al., A novel protein purification scheme based on salt inducible self-assembling peptides. Microb Cell Fact, 2023. 22(1): p. 224.

Wagner, D.E., et al., Toward the development of peptide nanofilaments and nanoropes as smart materials. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(36): p. 12656-61. Choi, S.-L., et al., Generation of catalytic protein particles in Escherichia coli cells using the cellulose-binding domain from Cellulomonas fimi as a fusion partner. Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2011. 16(6): p. 1173-1179.

Choi, S.L., et al., Controlled localization of functionally active proteins to inclusion bodies using leucine zippers. PLoS One, 2014. 9(6): p. e97093.

Nahalka, J., A. Vikartovska, and E. Hrabarova, A crosslinked inclusion body process for sialic acid synthesis. J Biotechnol, 2008. 134(1-2): p. 146-53.

Nahalka, J., Physiological aggregation of maltodextrinphosphorylase from Pyrococcus furiosus and its application in a process of batch starch degradation to alpha-D-glucose-1-phosphate. J Ind Microbiol Biotechnol, 2008. 35(4): p. 219-23.

Greenwood, J.M., et al., Fusion to an endoglucanase allows alkaline phosphatase to bind to cellulose. FEBS Lett, 1989. 244(1): p. 127-31.

Sugimoto, N., K. Igarashi, and M. Samejima, Cellulose affinity purification of fusion proteins tagged with fungal family 1 cellulose-binding domain. Protein Expr Purif, 2012. 82(2): p. 290-6.

70. Kopka, B., et al., Purification and simultaneous immobilization of Arabidopsis thaliana hydroxynitrile lyase using a family 2 carbohydrate-binding module. Biotechnol J, 2015. 10(5): p. 811-9.

71. Stetefeld, J., et al., Crystal structure of a naturally occurring parallel right-handed coiled coil tetramer. Nat Struct Biol, 2000. 7(9): p. 772-6.

72. Peters, J., W. Baumeister, and A. Lupas, Hyperthermostable surface layer protein tetrabrachion from the archaebacterium Staphylothermus marinus: evidence for the presence of a right-handed coiled coil derived from the primary structure. J Mol Biol, 1996. 257(5): p. 1031-41.

73. Diener, M., et al., Fusion of a Coiled-Coil Domain Facilitates the High-Level Production of Catalytically Active Enzyme Inclusion Bodies. ChemCatChem, 2015. 8(1): p. 142-152.

74. Hayakawa, T., et al., Novel strategy for protein production using a peptide tag derived from Bacillus thuringiensis Cry4Aa. FEBS J, 2010. 277(13): p. 2883-91.

75. Hayakawa, T., et al., Mutational analyses of Cry protein block7 polypeptides that facilitate the formation of protein inclusion in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol, 2011. 90(6): p. 1943-51.

76. Arie, J.P., et al., Formation of active inclusion bodies in the periplasm of Escherichia coli. Mol Microbiol, 2006. 62(2): p. 427-37.

77. Nahalka, J. and B. Nidetzky, Fusion to a pull-down domain: a novel approach of producing Trigonopsis variabilisD-amino acid oxidase as insoluble enzyme aggregates. Biotechnol Bioeng, 2007. 97(3): p. 454-61.

78. Nahalka, J. and V. Patoprsty, Enzymatic synthesis of sialylation substrates powered by a novel polyphosphate kinase (PPK3). Org Biomol Chem, 2009. 7(9): p. 1778-80.

79. Huang, Z., et al., Active inclusion bodies of acid phosphatase PhoC: aggregation induced by GFP fusion and activities modulated by linker flexibility. Microb Cell Fact, 2013. 12: p. 25.

80. Argos, P., An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structures and possible candidates for general gene fusion. J Mol Biol, 1990. 211(4): p. 943-58.

81. Gokhale, R.S. and C. Khosla, Role of linkers in communication between protein modules. Curr Opin Chem Biol, 2000. 4(1): p. 22-7.

82. Arai, R., et al., Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Eng, 2001. 14(8): p. 529-32.

83. George, R.A. and J. Heringa, An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding. Protein Eng, 2002. 15(11): p. 871-9.

84. Jager, V.D., et al., Tailoring the properties of (catalytically)-active inclusion bodies. Microb Cell Fact, 2019. 18(1): p. 33.

85. Koszagova, R., et al., Magnetization of active inclusion bodies: comparison with centrifugation in repetitive biotransformations. Microb Cell Fact, 2018. 17(1): p. 139.

86. Kusters, K., et al., Construction and comprehensive characterization of an EcLDCc-CatIB set-varying linkers and aggregation inducing tags. Microb Cell Fact, 2021. 20(1): p. 49.

87. Xu, W., et al., Recombinant production of influenza hemagglutinin and HIV-1 GP120 antigenic peptides using a cleavable self-aggregating tag. Sci Rep, 2016. 6: p. 35430.

88. Zhao, Q., et al., Recombinant production of medium- to large-sized peptides in Escherichia coli using a cleavable self-aggregating tag. Microb Cell Fact, 2016. 15(1): p. 136.

89. Xing, L., et al., Facile expression and purification of the antimicrobial peptide histatin 1 with a cleavable self-aggregating tag (cSAT) in Escherichia coli. Protein Expr Purif, 2013. 88(2): p. 248-53.

90. Castro, G.R. and T. Knubovets, Homogeneous biocatalysis in organic solvents and water-organic mixtures. Crit Rev Biotechnol, 2003. 23(3): p. 195-231.

91. Sheldon, R.A. and D. Brady, The limits to biocatalysis: pushing the envelope. Chem Commun (Camb), 2018. 54(48): p. 6088-6104.

92. Santos, J.C.S.d., et al., Importance of the Support Properties for Immobilization or Purification of Enzymes. ChemCatChem, 2015. 7(16): p. 2413-2432.

93. Hrabarova, E., et al., Pull-Down Into Active Inclusion Bodies and Their Application in the Detection of (Poly)-Phosphates and Metal-Ions. Front Bioeng Biotechnol, 2022. 10: p. 833192.

94. Jiang, L., et al., Comparative study of the insoluble and soluble Ulp1 protease constructs as Carrier free and dependent protein immobilizates. J Biosci Bioeng, 2019. 127(1): p. 23-29.

95. Han, Y., X. Zhang, and L. Zheng, Engineering actively magnetic crosslinked inclusion bodies of Candida antarctica lipase B: An efficient and stable biocatalyst for enzyme-catalyzed reactions. Molecular Catalysis, 2021. 504: p. 111467.

96. Schwaighofen A., et al., Production of Active Recombinant Hyaluronidase Inclusion Bodies from Apis mellifera in E. coli Bl21(DE3) and characterization by FT-IR Spectroscopy. Int J Mol Sci, 2020. 21(11).

97. Kloss, R., et al., Catalytically active inclusion bodies of L-lysine decarboxylase from E. coli for 1,5-diaminopentane production. Sci Rep, 2018. 8(1): p. 5856.

98. Kulig, J., et al., An Enzymatic 2-Step Cofactor and Co-Product Recycling Cascade towards a Chiral 1,2-Diol. Part I: Cascade Design. Adv Synth Catal, 2019. 361(11): p. 2607-2615.

99. Jäger, V.D., et al., An Enzymatic 2-Step Cofactor and Co-Product Recycling Cascade towards a Chiral 1,2-Diol. Part II: Catalytically Active Inclusion Bodies. Advanced Synthesis & Catalysis, 2019. 361(11): p. 2616-2626.

100. Jager, V.D., et al., A Synthetic Reaction Cascade Implemented by Colocalization of Two Proteins within Catalytically Active Inclusion Bodies. ACS Synth Biol, 2018. 7(9): p. 2282-2295.

101. Han, G.H., et al., Leucine zipper-mediated targeting of multi-enzyme cascade reactions to inclusion bodies in Escherichia coli for enhanced production of 1-butanol. Metab Eng, 2017. 40: p. 41-49.

102. Talafova, K., et al., Bacterial inclusion bodies as potential synthetic devices for pathogen recognition and a therapeutic substance release. Microb Cell Fact, 2013. 12: p. 16.

103. Chen, Z., et al., A novel protein purification strategy mediated by the combination of CipA and Ssp DnaB intein. J Biotechnol, 2019. 301: p. 97-104.

104. Yang, X., M. Pistolozzi, and Z. Lin, New trends in aggregating tags for therapeutic protein purification. Biotechnol Lett, 2018. 40(5): p. 745-753.

105. Bogush, V.G., et al., Method for producing web protein, a fused protein, recombinant dna, an expression vector, a host cell and strain-producers. US Patent 2010(US9475852B2).

106. Sannikova, E.P., et al., Specific Activity ofRecombinant Modified Human Glucagon-Like Peptide 1. Applied Biochemistry and Microbiology, 2019. 55(7): p. 722-732.

107. Subach, O.M. and F.V. Subach, GAF-CaMP3-sfGFP, An Enhanced Version of the Near-Infrared Genetically Encoded Positive Phytochrome-Based Calcium Indicator for the Visualization of Neuronal Activity. Int J Mol Sci, 2020. 21(18).

108. Sannikova, E.P., et al., The Modified Heparin-Binding L-Asparaginase of Wolinella succinogenes. Mol Biotechnol, 2016. 58(8-9): p. 528-39.

109. Reverter, D. and C.D. Lima, Preparation of SUMO proteases and kinetic analysis using endogenous substrates. Methods Mol Biol, 2009. 497: p. 225-39.

110. Singh, R.S., A comparative study on cell disruption methods for release of aspartase from E. coli K-12. Indian J Exp Biol, 2013. 51(11): p. 997-1003.

111. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54.

112. Komolov, A.S., et al., Synthesis of biologically active proteins as L6KD-SUMO fusions forming inclusion bodies in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng, 2024. 121(2): p. 535550.

113. Костюк, В.А., А.И. Потапович, и Ж.В. Ковалева, Простой и чувствительный метод определения активности супероксиддисмутазы, основанный на реакции окисления кверцетина. Вопросы медицинской химии, 1990. 36(2): p. 88-91.

114. Zhang, J., et al., Self-assembly of surfactant-like peptides and their applications. Science China Chemistry, 2014. 57(12): p. 1634-1645.

115. Malakhov, M.P., et al., SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification ofproteins. J Struct Funct Genomics, 2004. 5(1-2): p. 75-86.

116. Marblestone, J.G., et al., Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein Sci, 2006. 15(1): p. 182-9.

117. Hanwell, M.D., et al., Avogadro: an advanced semantic chemical editor, visualization, and analysis platform. Journal of Cheminformatics, 2012. 4(1): p. 17.

118. Papastamatiou, T., et al., Evaluation of Protective Efficacy of Selected Immunodominant B-Cell Epitopes within Virulent Surface Proteins of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun, 2018. 86(3).

119. Knudsen, L.B. and J. Lau, The Discovery and Development of Liraglutide and Semaglutide. Front Endocrinol (Lausanne), 2019. 10: p. 155.

120. Hellekant, G. and V. Danilova, Brazzein a small, sweet protein: discovery and physiological overview. Chem Senses, 2005. 30 Suppl 1: p. i88-9.

121. Islam, M.N., et al., Superoxide dismutase: an updated review on its health benefits and industrial applications. Crit Rev Food Sci Nutr, 2022. 62(26): p. 7282-7300.

122. Rakhit, R. and A. Chakrabartty, Structure, folding, and misfolding of Cu,Zn superoxide dismutase in amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta, 2006. 1762(11-12): p. 1025-37.

123. Cormack, B.P., R.H. Valdivia, and S. Falkow, FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene, 1996. 173(1 Spec No): p. 33-8.

124. Pedelacq, J.D., et al., Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol, 2006. 24(1): p. 79-88.

125. Timofeev, V.I., N.E. Zhukhlistova, and I.P. Kuranova, Features of the Three Dimensional Structure of the Mutant Form of Wolinella succinogenes L-Asparaginase in Complexes with L-Aspartic and L-Glutamic Acids. Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2020. 46(2): p. 171-180.

126. Lubkowski, J., et al., Crystal structure and amino acid sequence of Wolinella succinogenes L-asparaginase. Eur J Biochem, 1996. 241(1): p. 201-7.

127. Harrison, S.T.L., Cell Disruption, in Comprehensive Biotechnology. 2011. p. 619-640.