Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Гудков, Денис Андреевич

• Гудков, Денис Андреевич
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Гудков, Денис Андреевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фермент органофосфатгидролаза.

1.1.1. Структура активного центра и центра связывания субстрата ОРН, а также механизм действия фермента.

1.1.2. Пространственная структура ОРН.

1.2. Создание гибридных белков.

1.2.1. Гибридные партнеры, увеличивающие выход растворимой формы целевого белка в клетках.21 '

1.2.2. Флуоресцентные белки.

1.2.2.1. Зеленый флуоресцентный белок.

1.2.2.2. pH-чувствительные генетически модифицированные аналоги GFP.

1.2.3. ОРН в составе гибридных белков.

1.3. Рефолдинг белков из телец включения.

1.3.1. Общие принципы проведения рефолдинга.

1.3.2. Рефолдинг полигистидинсодержащих белков.

1.4. Применение биотехнологических приемов усовершенствования культивирования клеток Е. coli для увеличения выхода растворимой формы рекомбинантных белков.

1.4.1. Культивирование микроорганизмов в периодическом режиме.

1.4.2. Культивирование микроорганизмов в полупериодическом режиме.

1.4.3. Аэрация среды, использование перфторуглеродных соединений для увеличения растворимости кислорода в среде культивирования.

1.4.4. Экспрессия генно-инженерных конструкций в рекомбинантных клетках микроорганизмов.

1.5. Применение растворимой формы фермента His6-OPH.

1.5.1. Применение ОРН в процессе обезвреживания реакционных масс, полученных в результате химического уничтожения ФОБ.

1.5.2. Фильтрующесорбирующие материалы для средств индивидуальной защиты от воздействия ФОС.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.1. Материалы и приборы.

2.1.1. Реактивы.

2.1.2. Ферменты.

2.1.3. Бактериальные штаммы.

2.1.4. Питательные среды.

2.1.5. Составы растворов.

2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды.

2.1.7. Приборы.

2.2. Методы.

2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой ОРН.

2.2.2. Определение pH оптимума действия фермента.

2.2.3. Исследование термостабильности.

2.2.4. Приготовление компетентных клеток Е. coli.

2.2.5. Трансформация компетентных клеток Е. coli.

2.2.6. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli.

2.2.7. Рестрикция ДНК и выделения фрагментов электрофорезом в агарозном геле.

2.2.8. Цитирование фрагментов ДНК.

2.2.9. Конструирование плазмид pTES-His6-deGFP4-(RA)5-OPH и pTES-His6-deGFP4-(AS)5-OPH.

2.2.10. Определение уровня экспрессии генно-инженерных конструкций pTES-Hisr,-deGFP4-(RA)5-OPH и pTES-His6-deGFP4-(AS)5-OPH и органофосфатгидролазной активности гибридных белков. Изучение кинетики роста клеток Е. coli DH5oc.

2.2.11. Определение растворимости белка.

2.2.12. Выделение и очистка полигистидинсодержащих белков с использованием металл-хелатирующих носителей.

2.2.13. Подготовкакрио-ПААГ носителей.

2.2.14. Очистка белка His6-deGFP4-(AS)5-OPH.

2.2.15. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле (ДСН-электрофорез).

2.2.16. Исследование флуоресцентных свойств гибридных белков.

2.2.17. Компьютерное моделирование.

2.2.18. Наработка препарата фермента HIsö-OPH для его применения в экспериментах прикладного характера.

2.2.19. Приготовление фильтрующесорбирующего самодегазирующегося материала.

2.2.20. Дезактивация РМ, полученных в результате химического гидролиза вещества типа Vx с применением рецептуры РД-ГД с использованием препарата фермента His6-OPH.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание гибридных белков, имеющих в своем составе флуоресцентный белок и фермент ОРН.

3.1.1. Выбор межмолекулярных спейсеров.

3.1.2. Создание генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPHH ffis6-deGFP4-(AS)5-OPH.

3.1.3. Экспрессия полученных генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH.

3.1.4. Выделение и очистка новых гибридных белков.

3.1.5. Физико-химические и каталитические характеристики генетически-модифицированных аналогов ОРН.

3.1.6. Исследования структуры ОРН и полученных гибридных белков методами молекулярного моделирования.

3.1.6.1. Моделирование структуры димера ОРН.

3.1.6.2. Моделирование структуры мономера ОРН.

3.1.7. Исследование термостабильности белка His6-deGFP4-(RA)5-OPH.

3.1.8. Исследование флуоресцентных свойств полученных гибридных белков.

3.2. Рефолдинг гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы.

3.2.1. Зависимость эффективности солюбилизации ТВ от условий проведения процесса.

3.2.2. Проведение рефолдинга Hise-OPH на металл-хелатирующем носителе.

3.2.3. Активация фермента после рефолдинга.

3.3. Оптимизация условий культивирования клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, для увеличения выхода растворимой формы фермента Hise-OPH.

3.3.1. Влияние времени введения индуктора в среду культивирования клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, на их удельную органофосфатгидролазную активность.

3.3.2. Влияние температуры культивирования на выход удельной органофосфатщцролазной активности в клетках Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hisg-OPH.

3.3.3. Культивирование клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, в периодическом режиме с внесением подпиток.

3.3.4. Влияние перфторуглеводородов на выход активной биомассы клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hisö-OPH.

3.4. Применение ферментного препарата.

3.4.1. Исследование процесса разрушения клеток Е. coli SG13009[pREP4] -продуцентов Hise-OPH ультразвуком.

3.4.2. Длительное хранение ферментного препарата Hise-OPH в различных условиях.

3.4.3. Фильтрующесорбирующий самодегазирующийся материал, содержащий Hise-OPH, для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС.

3.4.3.1. Разработка самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС.

3.4.3.2. Испытание самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС.

3.4.4. Детоксикация реакционных масс, полученных в результате химического гидролиза ФОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы»

На современном этапе развития сельского хозяйства интенсивное применение пестицидов, из которых более 40% составляют фосфорорганические соединения (ФОС), широко вошло в практику по всему миру. Несмотря на то, что применение химических средств защиты растений строго регламентируется ГОСТами (в России 4-6 кг/га) [1], низкая водорастворимость и низкая скорость биодеструкции ФОС приводят к их накоплению в почвах и сточных водах [2]. Кроме того, исследования свидетельствуют о наличии ФОС в различной сельскохозяйственной продукции, например в хлопке, собранном с обработанных пестицидами территорий [3], в мясомолочных продуктах питания, овощах, фруктах и продуктах их переработки [4-5].

Показано, что ФОС обладают сильным кумулятивным эффектом и оказывают мутагенное воздействие на млекопитающих. Так, у жителей территорий, прилегающих к сельскохозяйственным зонам, подвергавшимся когда-либо обработке ФОС, возникают хромосомные аберрации лимфоцитов [6].

Чрезвычайно высокую опасность для окружающей среды представляют складированные некондиционные пестициды. К настоящему времени в России накопилось несколько тысяч тонн таких веществ, причем некоторые места их хранения находятся в аварийном состоянии [7].

Помимо пестицидов к ФОС относятся и высокотоксичные агенты нервно-паралитического действия, фосфорорганические отравляющие вещества (ФОБ) - зарин, зоман, Ух, суммарные запасы которых на территории Российской Федерации, составляют 32,3 тыс. т [8].

Согласно Международной конвенции об уничтожении химического оружия запасы данных веществ должны быть полностью уничтожены к 2012 г. [9-10].

Согласно принятым в РФ методам уничтожения ФОБ [11], остаточные концентрации ФОБ в составе реакционных масс достигают 0,1%, кроме того, продукты разложения ОБ также являются токсичными для человека [12]. Важной составной частью процесса уничтожения химического оружия является обеспечение безопасности персонала, занятого в данном процессе, что предполагает использование средств защиты на объекте уничтожения ФОС [8].

В связи с этим поиск эффективных путей деградации ФОС, исключающих проведение процесса в «жестких» условиях (высокая температура, повышенное давление, сильные окислители), становится чрезвычайно актуальной проблемой. Ее решением может стать разложение ФОС с помощью биологических катализаторов.

Применение биокатализаторов, а именно, ферментов, предполагает использование неагрессивных сред для проведения гидролиза и использование температур в диапазоне 25-37°С, что значительно расширяет спектр возможностей данного метода.

Ключевым ферментом в процессе биодеструкции ФОС является органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1, арилдиалкилфосфатаза), катализирующая гидролиз эфирной связи в триэфирах фосфорной кислоты [2]. Фермент обладает широкой субстратной специфичностью и высокими каталитическими константами и может быть использован для разработки новых препаратов, непосредственно готовых к применению. С помощью сайт-направленного мутагенеза ОРН была изучена структура активного центра фермента, изменена его субстратная специфичность и увеличено сродство к соединениям, представляющим собой ФОВ [13-14].

Препараты, созданные на основе ОРН, могут быть предназначены для удаления и последующей детоксикации остаточных количеств пестицидов с различных поверхностей, например, сельскохозяйственного и садового оборудования и инвентаря, а также для применения в качестве эффективных средств индивидуальной защиты. Кроме того, данный фермент может быть использован в составе препаратов, применяющихся для дегазации различных поверхностей, подвергшихся заражению ФОС [15].

Возможность широкого применения фермента ОРН на практике стимулирует исследования, направленные на создание высокоэффективных систем для его синтеза в рекомбинантных клетках, упрощение процедуры его выделения и очистки. На Химическом факультете МГУ имени М. В. Ломоносова была создана новая высокоэффективная система для синтеза нативного фермента в клетках Е, coli [16], изучены свойства полученной рекомбинантной ОРН. Также были созданы генетические конструкции, кодирующие синтез рекомбинантных ферментов, содержащих гексагистидиновые последовательности на N-конце (Hise-OPH) [17] и С-конце молекулы ОРН [18]. Введение аффинной последовательности в структуру белка было обусловлено тем, что очистка и выделение такого фермента существенно проще в технологическом плане [19]. Наличие таких последовательностей на N- или С-конце молекулы белка позволяет проводить его выделение и очистку с использованием аффинных хроматографических носителей. Кроме того, оказалось, что введение последовательности из шести остатков гистидина на N-конец молекулы белка влияет на свойства фермента [17-18]. Для фермента Hise-OPH были характерны улучшенные константы эффективности действия по ряду субстратов по сравнению с ОРН [17]. Например, константа эффективности гидролиза вещества Ух ферментом Hise-OPH оказалась в 2 раза выше, чем данная величина, характерная для ОРН, а константа эффективности гидролиза зарина — практически в 10 раз [20].

Данный факт делает масштабное использование фермента Hise-OPH для гидролиза ФОВ очень привлекательным. Однако, исследования синтеза His6-OPH в клетках Е. coli показали, что до 50% белка образуется в нерастворимой неактивной форме, в виде телец включения (ТВ), в результате чего его выход оказался сниженным по сравнению с ферментом ОРН более, чем в 2 раза [20].

Для увеличения выхода растворимой активной формы белка могут быть использованы различные методы. Во-первых, использование гибридного партнера, белка, связанного с целевым белком спейсером из нескольких аминокислот. Гибридный партнер синтезируется раньше целевого белка, проходит процедуру фолдинга и удерживает целевой продукт в растворенном состоянии. Кроме того, в данном случае работает принцип ингибирования процесса совместной агрегации белков [21-22]. Во-вторых, применение процедуры рефолдинга активного фермента из ТВ совместно с параллельным выделением активной растворимой формы белка из клеток может существенно увеличить суммарный выход целевого продукта из биомассы клеток. Следует отметить, что ранее рефолдинг белков Hise-OPH и ОРН никем не проводился. В-третьих, применение биотехнологического подхода, оптимизация условий культивирования штамма-продуцента может привести к снижению агрегации белка внутри клетки и увеличению выхода растворимой формы фермента. Кроме того, культивирование рекомбинантных микроорганизмов до высокой плотности биомассы позволит снизить затраты, связанные с обработкой клеток, полученных в процессе ферментации.

Целью данной работы являлось получение фермента Hise-OPH в растворимой активной форме с использованием различных подходов: генно-инженерного (создание гибридных белков), биохимического (проведение рефолдинга из телец включения) и биотехнологического (оптимизация условий культивирования штамма-продуцента Hise-ОРН).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Гудков, Денис Андреевич

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые генно-инженерные конструкции, кодирующие синтез гибридных белков №зб-с1еОРР4-(КА)5-ОРН и Шзб-с1еОРР4-(А8)5-ОРН, обладающих органофосфатгидролазной активностью и свойствами флуоресцентного белка <ЗевРР4. Установлены условия получения максимального выхода гибридных белков в растворимой активной форме: 28°С, 0,10 мМ ИПТГ, 10 ч культивирования после индукции синтеза белков. Достигнутый уровень синтеза белка Н1зб-с1еОРР4-(КА)5-ОРН в растворимой активной форме оказался в 2 раза выше выхода растворимой формы Шэб-ОРН и в 25 раз выше выхода аналогичного гибридного белка в клетках Е. соИ, описанного в литературе.

2. Исследованы каталитические характеристики полученных гибридных белков. На примере белка Н1Бб-с1еОРР4-(КА)5-ОРН показана взаимозависимость его флуоресцентных характеристик и ОРН-активности, проявляющейся в реакциях гидролиза ФОС.

3. Моделирование структуры ОРН позволило сделать предположение о том, что стабильность фермента при нейтральных значениях рН выше, чем при щелочных значениях, что было подтверждено экспериментально при исследовании условий хранения фермента ЬШб-ОРН и термоинактивации гибридных белков. Кроме того, показано, что специфичность действия фермента увеличивается в пользу субстратов с более объемными заместителями у фосфорного центра, что было подтверждено экспериментально: установлено двукратное уменьшение значения Кт для реакции гидролиза ДФФ под действием гибридного белка по сравнению с гидролизом ДФФ нативной ОРН.

4. Впервые был осуществлен рефолдинг фермента Ибс-ОРН из телец включения. Впервые показана возможность применения для рефолдинга Кэб-содержащих белков металл-хелатирующего носителя на основе крио-ПААГ. Эффективность рефолдинга Кэб-ОРН из ТВ составила 20%, а суммарный выход белка из клеток в растворимой активной форме был увеличен до 60%.

5. Показано, что культивирование клеток-продуцентов Кэб-ОРН в периодическом режиме с однократным внесением подпиток субстрата и дробным внесением индуктора в питательную среду обеспечивает максимальный выход растворимой активной формы фермента, выраженный в количестве единиц активности, получаемых с 1 л среды. В данной работе выход ОРН-активности был максимально в 7,5-10 раз по сравнению с ранее известным уровнем.

6. Был разработан сомодегазирующийся защитный материал от воздействия ФОВ, содержащий препарат фермента Hise-OPH в качестве активной каталитической составляющей. Показано, что при нанесении на поверхность такого материала ФОВ в концентрации 10 г/м2 отсутствие токсичных паров за слоем защитного материала гарантировано на протяжении не менее 96 ч при температуре от 22 до 45 °С. Данный показатель полученного материала более, чем в 4 раза превосходит показатели, характерные для защитных материалов, применяемых сегодня на практике. Каталитическая самодегазация материала (разложение ФОВ внутри материала) происходит в течение 3 ч.

7. Препарат фермента Hise-OPH впервые был успешно использован для гидролиза ФОВ в составе РМ-ГД, получаемых после химического уничтожения вещества типа Vx с применением щелочного гидролиза, в лабораторных условиях и на пилотной установке (в 50 л реакторе). Показано, что в течение 150 ч вещество типа Vx (20 мг/л) полностью ферментативно гидролизуется в составе РМ-ГД, характеризующихся сложным химическим составом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Гудков, Денис Андреевич, 2009 год

1. II. Мельников. Пестициды: Химия, технология, применение. 1987. М.: Химия. 712 с.

2. Е. Ефременко, В. Сергеева. Органофосфатгидролаза фермент, катализирующий деградацию фосфорсодержащих отравляющих веществ и пестицидов. Изв. Акад. Наук. Сер. хим., 2001, 10, 1743-1749.

3. L. Luchini, Т. Peres, M. deAndrea. Monitoring of pesticide residues in a cotton crop soil. J. Environ. Sci. HealB, 2000, 35, 51-59.

4. J. Shah, M. Jan, M. Nafees, S. Noureen, N. Bhatti. Monitoring pesticide residues in fresh fruits marketed in Peshawar, Pakistan. Am. Lab., 2005, Mar., 22-24.

5. Y.-Z. Zheng, W.-S. Lan, C.-L. Qiao, A. Mulchendani, W. Chen. Decontamination of vegetables sprayed with organophosphate pesticides by organophosphorus hydrolase and carboxylesterase (Bl). Appl. Biochem. Biotech., 2007, 136, 233-242.

6. W. Lambert, M. Lasarev, J. Muniz, J. Scherer, J. Rothlein, J. Santana, L. McCauley. Variation in organophosphate pesticide metabolites in urine of children living in agricultural communities. Environ. Health Persp., 2005, 113(4), 504-508.

7. О. Максименко. Пестициды: защита для растений или отрава для окружающей среды. Наука и жизнь, 2003, 3, 54-58.

8. Б. Филатов, Н. Британов, В. Клаучек. Медико-санитарные проблемы уничтожения химического оружия (российский опыт). Хим. Биол. Безопасн., 2004, 1—2, 13-14.

9. Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и о его уничтожения (исправленный вариант). 8 августа 1994 г. PTS PC OPCW. 1994. с. 191.

10. Федеральный закон "Об уничтожении химического оружия". Принят Государственной Думой 25 апреля 1997 г. Российская газета. 6 мая 1997. с. 4-5.

11. Сборник инструктивно-методических документов по проблеме уничтожения химического оружия. Часть II. Фосфорорганические отравляющие вещества. T. I. М.: ФУ "Медбиоэкстрим", 2001, с. 208.

12. N. В. Munro, S. S. Talmage, G. D. Griffin, L. C. Waters, A. P. Watson, J. F. King, V. Hauschild. The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products. Environ. Health Persp, 1999, 107(12), 933-974.

13. В. diSioudi, J. Grimsley, К. Lai, J. Wild. Modification of near active site residues in organophosphorus hydrolase reduces metal stoichiometry and alters substrate specificity. Biochemistry, 1999,38(10), 2866-2872.

14. T. Reeves, M. Wales, J. Grimsley, P. Li, D. Cerasoli, J. Wild. Balancing the stability and the catalytic specificities of OP hydrolases with enhanced V-agent activities. Protein Eng. Des. Sel., 2008, 21(6), 405-412.

15. D. Crabb, J. DeFrank, Ch. Penet, J. Warner. Look at opportunities for enzymes for chemical decontamination. Chem.-lnd. London, 2004, Jul., 14.

16. Варфоломеев С.Д., Ефременко E.H., Алиев Т.К., Вотчицева Ю.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pTrcTE-ОРН и продуцент фермента органофосфатгидролазы. Патент РФ на изобретение № 2232807, 2004.

17. Ю. Вотчицева, Е. Ефременко, Т. Алиев, С. Варфоломеев. Свойства гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы. Биохимия, 2006, 71(2), 216-222.

18. Ю. Вотчицева. Органофосфатгидролаза: получение игенетически-модифицированных аналогов и анализ каталитических характеристик. Дисс. на соиск. степени к.х.н., 2006, 165 с.

19. Ya. Liu, G. Gotte, M. Libonati, D. Eisenberg. A domain-swapped RNase A dimer with implications for amyloid formation. Nat. Struct. Biol., 2001, 8(3), 211-214.

20. F. Rousseau, J. Schymkowitz, H. Wilkinson, L. Itzhaki. Three-dimensional domain swapping in pl3sucl occurs in the unfolded state and is controlled by conserved proline residues. Proc. Natl. Acad. Sci, 2001, 98(10), 5596-5601.

21. E. Ефременко, С. Варфоломеев. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. Успехи биол. Хим., 2004, 44, 307-340.

22. D. Dumas, S. Caldwell, J. Wild, F. Raushela. Purification and properties of the phosphotricsterase from Pseudomonas diminuta. J. Biol. Chem., 1989, 264(33), 19659-19665.

23. W. Donarski, D. Dumas, D. Heitmeyer, V. Lewis, F. Raushel. Structure-activity relationships in the hydrolysis of substrates by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminnta. Biochemistry, 1989, 28, 4650-4655.

24. J. Vanhooke, M. Benning, F. Raushel, H. Holden. Three-dimensional structure of the zinc-containing phosphotriesterase with the bound substrate analog diethyl 4-methylbenzylphosphonate. Biochemistry, 1996, 35(19), 6020-6025.

25. M. Benning, J. Kuo, F. Raushel, II. Holden. Three-dimensional structure of phosphotriesterase: an enzyme capable of detoxifying organophosphate nerve agents. Biochemistry, 1994,33(50), 15001-15007.

26. M. Benning, J. Kuo, F. Raushel, H. Holden. Three-dimensional structure of the binuclear metal center of phosphotriesterase. Biochemistry, 1995, 34(25), 7973-7978.

27. M. Benning, H. Shim, Fr. Raushel, H. Holden. High resolution X-ray structures of different metal-substituted forms of phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Biochemistry, 2001, 40, 2712-2722.

28. H. Shim, F. Raushel. Self-assembly of the binuclear metal center of phosphotriesterase. Biochemistry, 2000, 39, 7357-7364.

29. S.-B. Hong, J. Kuo, L. Mullins, F. Raushel. CO2 is required for the assembly of the binuclear metal center of phosphotriesterase. J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 7580-7581.

30. M. Krauss. Ab initio structure of the active site of phosphotriesterase. J. Chem. Inf. Comput. Sci., 2001, 41, 8-17.

31. M. Krauss, L. Olsen, J. Antony, L. Hemmingsen. Coordination Geometries of Zn(II) and Cd(II) in phosphotriesterase: influence of water molecules in the active site. J. Phys. Chem. B, 2002,106, 9446-9453.

32. Ch.-G. Zhan,F. Zheng. First computational evidence for a catalytic bridging hydroxide ion in a phosphodiesterase active site. J. Am. Chem. Soc., 2001, 123(12), 2835-2838.

33. J. Koca, Ch.-G. Zhan, R. Rittenhouse, R. Ornstein. Mobility of the active site bound paraoxon and sarin in zinc-phosphotriesterase by molecular dynamics simulation and quantum chemical calculation. J. Am. Chem. Soc., 2001, 123, 817-826.

34. Sh.-L. Chen, W.-H. Fang, F. Himo. Theoretical study of the phosphotriesterase reaction mechanism. J. Phys. Chem. B, 2007,111(6), 1253-1255.

35. J. Коса, Ch.-G. Zhan, R. Rittenhouse, R. Ornstein. Coordination number of zinc ions in the phosphotriesterase active site by molecular dynamics and quantum mechanics. J. Comput. Chem., 2003, 24(3), 368-378.

36. C. Samples, T. Howard, F. Raushcl, V. DeRose. Protonation of the binuclear metal centcr within the active site of phosphotriesterase. Biochemistry, 2005, 44(33), 11005-11013.

37. Г. Казанков. Реакции координированных нуклеофилов. Ж. Орг. Хим., 1993, 29(6), 1239-1267.

38. A. Russell, М. Erbeldinger, J. DeFrank, J. Kaar, G. Drevon. Catalitic buffers enable positive-response inhibition-based sensing of nerve agents. Biotechnol. Bioeng., 2002, 77(2), 352-357.

39. Большой энциклопедический справочник. Под ред. К. Люцис., М.: Рус. энциклопед. тов., 2003, 576 с.

40. F. Raushel. Bacterial detoxification of organophosphate nerve agents. Curr. Opin. Microbiol., 2002, 5, 288-295.

41. M. Ortiz-Hernandez, R. Quintero-Ramirez, A. Nava-Ocampo, A. Bello-Ramirez. Study of the mechanism of Flavobacterium sp. for hydrolyzing organophosphate pesticides. Fund. Clin. Pharmacol., 2003, 17, 717-723.

42. C. Samples, F. Raushel, V. DeRose. Activation of the binuclear metal center through formation of phosphotriesterase-inhibitor complexes. Biochemistry, 2007, 46, 3435-3442.

43. M. Benning, S.-B. Hong, F. Raushel, H. Holden. The Binding of substrate analogs to phosphotriesterase. J. Biol. Chem., 2000, 275(39), 30556-30560.

44. C. Jackson, J.-W. Liu, M. Coote, D. Ollis. The effects of substrate orientation on the mechanism of a phosphotriesterase. Org. Biomol. Chem., 2005, 3, 4343^1350.

45. V. Lewis, W. Donarski, J. Wild, and F. Raushel. Mechanism and stereochemical course at phosphorus of the reaction catalyzed by a bacterial phosphotriesterase. Biochemistry, 1988, 27(5), 1591-1597.

46. S. Caldwell, F. Raushel. Transition-state structures for enzymatic and alkaline phosphotricster hydrolysis. Biochemistry, 1991, 30(30), 7444-7450.

47. S.-B. Hong, F. Raushel. Stereochemical constraints on the substrate specificity of phosphotriesterase. Biochemistry, 1999,38(4), 1159-1165.

48. Органикум. 1992. В 2-х т. T.l: Пер. с нем.-М.: Мир, 587 с.

49. S. Caldwell, J. Newcomb, K. Schlecht, F. Raushel. Limits of diffusion in the hydrolysis of substrates by the phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta. Biochemistry, 1991,30(30), 7438-7444.

50. G. Omburo, J. Kuo, L. Mullins, F. Raushel. Characterization of the zinc binding site of bacterial phosphotriesterase. J. Biol. Chem., 1992, 67(19), 13278-13283.

51. G. Omburo, L. Mullins, F. Raushel. Structural characterization of the divalent cation sites of bacterial phosphotriesterase by 13Cd NMR spectroscopy. Biochemistry, 1993, 32(15), 9148-9155.

52. W.-S. Li, K. Lum, M. Chen-Goodspeed, M. Sogorb, F. Raushel. Stereoselective detoxification of chiral sarin and soman analogues by phosphotriesterase. Bioorgan. Med. Chem., 2001, 9, 2083-2091.

53. G. Mei, A. Venere, N. Rosato, A. Finazzi-Agro. The importance of being dimeric. FEBSJ., 2005, 272, 16-27.

54. A. Veselovsky, Yu. Ivanov, A. Ivanov, A. Archakov, P. Lewi, P. Janssen. Proteinprotein interactions: mechanisms and modification by drugs. J. Mol. Recognit., 2002, 15, 405422.

55. T. Topping, D. Hoch, L. Gloss. Folding mechanism of FIS, the intertwined, dimeric factor for inversion stimulation. J. Mol. Biol., 2004, 335, 1065-1081.

56. K. Neet, D. Timm. Conformational stability of dimeric proteins: quantitative studies by equilibrium denaturation. Protein Sci., 1994, 3, 2167-2174.

57. S. Hobart, S. Ilin, D. Moriarty, R. Osuna, W. Colyn. Equilibrium denaturation studies of the Escherichia coli factor for inversion stimulation: implications for in vivo function. Protein Sci., 2002,11, 1671-1680.

58. J. Grimsley, J. Scholtz, C. Pace, J. Wild. Organophosphorus hydrolase is a remarkably stable enzyme that unfolds through a homodimeric intermediate. Biochemistry, 1997, 36, 14366-14374.

59. J. Ramstein, N. Hervouet, F. Coste, Ch. Zelwer, J. Oberto, B. Castaing. Evidence of a thermal unfolding dimeric intermediate for the Escherichia coli histone-like HU proteins: thermodynamics and structure. J. Mol. Biol., 2003, 331, 101-121.

60. A. Clark, J. Sinclair, T. Baldwin. Folding of bacterial luciferase involves a non-native heterodimeric intermediate in equilibrium with the native enzyme and the unfolded subunits. J. Biol. Chem., 1993,2(15), 10773-10779.

61. L. Gloss, C. Matthews. Urea and thermal equilibrium denaturation studies on the dimerization domain of Escherichia coli Trp repressor. Biochemistry, 1997, 36(19), 5612-5623.

62. B. Gorovits, P. Horowitz. The molecular chaperonin cpn60 displays local flexibility that is redused after binding with unfolded protein. J. Biol. Chem., 1995, 270(22), 13057-13062.

63. D. Rochu, N. Beaufet, F. Renault, N. Viguie, P. Masson. The wild type bacterial Co2+/Co2^-phosphotriesterase shows a middle-range thermostability. Biochimica et Biophysica Acta, 2002,1594, 207-218.

64. E. Efremenko, I. Lyagin, Yu. Votchitseva, M. Sirotkina, S. Varfolomeev. Polyhistidine-containing organophosphorus hydrolase with outstanding properties. Biocatal. Biotransfor., 2007,25(1), 103-108.

65. C. Roodveldt, D. Tawfik. Directed evolution of phosphotriesterase from Pseudomonas diminuta for heterologous expression in Escherichia coli results in stabilization of the metal-free state. Protein Eng. Des Sel, 2005, 18(1), 51-58.

66. H. Niwa, S. Inouye, T. Hirano, T. Matsuno, S. Kojima, M. Kubota, M. Ohashi, F. Tsuji. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 13617-13622.

67. D. Gudkov, Yu. Votchitseva, E. Efremenko. Paraoxon hydrolysis catalyzed by organophosphate hydrolase containing the polyhistidine tag at the C-terminus of the protein molecule. Rus. Chem. Bull., 2006, 61(1), 1-7.

68. R. Kapust, D. Waugh. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sci., 1999, 8, 1668-1674.

69. J. Fox, K. Routzahn, M. Bucher, D. Waugh. Maltodextrin-binding proteins from diverse bacteria and archaea are potent solubility enhancers. FEBS Lett., 2003, 537, 53-57.

70. J. Fox, R. Kapust, D. Waugh. Single amino acid substitutions on the surface of Escherichia coli maltose-binding protein can have a profound impact on the solubility of fusion proteins. Protein Sci., 2001, 10, 622-630.

71. K. Routzahn, D. Waugh. Differential effects of supplementary affinity tags on the solubility of MBP fusion proteins. J. Struct. Func. Genomics, 2002, 2, 83-92.

72. S. Sati, S. Singh, N. Kumar, A. Sharma. Extra terminal residues have a profound effect on the folding and solubility of a Plasmodium falciparum sexual stage-specific protein over-expressed in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 2002, 269, 5259-5263.

73. R. Kern, A. Malki, A. Holmgren, G. Richarme. Chaperone properties of Escherichia coli thioredoxin and thioredoxin reductase. Biochem. J., 2003, 371, 965-972.

74. J. Winter, P. Neubauer, R. Glockshuber, R. Rudolph. Increased production of human proinsulin in the periplasmic space of Escherichia coli by fusion to DsbA. J. Biotechnol., 2000, 84, 175-185.

75. Ya. Arii, H. Yamaguchi, Sh.-I. Fukuoka. Producing of a soluble recombinant prion protein fused to blue fluorescent protein without refolding or detergents in Escherichia coli cells. Biosci. Biotechnol. Biochem., 2007, 71(10), 2511-2514.

76. R. Tsien. The green fluorescent protein. Annn. Rev. Biochem., 1998, 67, 509-544.

77. N. Shaner, P. Steinbach, R. Tsien. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Meth., 2005, 2(12), 905-915.

78. M. Ashby, K. Ibaraki, J. Henley. It's Green Outside: tracking cell surface proteins with pH-sensitive GFP. Trends Neurosci., 2004, 27(5), 257-261.

79. V. Verkhusha, K. Lukyanov. The molecular properties and applications of Anthozoa fluorescent proteins and chromoproteins. Nat. Biotechnol., 2004, 22(3), 289-296.

80. H. Зубова, А. Булавина, А. Савицкий. Спектральные и физико-химические свойства зеленого (GFP) и красного (drFP583) флюоресцирующих белков. Успехи биолог, хим., 2003, 43, 163-224.

81. В. Верхуша, Н. Аковбян, Е. Ефременко, С. Варфоломеев, П. Вржещ. Кинетический анализ созревания и денатурации красного флюоресцентного белка DsRed. Биохимия, 2001, 66(12), 1659-1670.

82. М.-А. Elsliger, R. Wachter, G. Hanson, К. Kallio, J. Remington. Structural and spectral response of green fluorescent protein variants to changes in pH. Biochemistry, 1999, 38, 5296-5301.

83. M. Chatroraj, B. King, G. Bublitz, S. Boxer. Ultra-fast excited state dynamics in green fluorescent protein: multiple states and proton transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 8362-8367.

84. A. Saxena, J. Udgaonkar, G. Krishnamoorthy. Protein dynamics control proton transfer from bulk solvent to protein interior: a case study with a green fluorescent protein. Protein Sei., 2005, 14, 1787-1799.

85. G. Patterson, S. Knobel, W. Sharif, S. Kain, D. Piston. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophys. J., 1997, 73, 27822790.

86. G. Miesenbok, D. De Angelis, J. Rothman. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature, 1998, 394, 192-195.

87. P. Paroutis, N. Touret, S. Grinstein. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiology, 2004, 19, 207-215.

88. M. Ng, R. Roorda, S. Lima, B. Zemelman, P. Morcillo, G. Miesenböck. Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly. Neuron, 2002, 36(3), 463-474.

89. S. Sankaranarayanan, D. De Angelis, J. Rothman, T. Ryan. The use of pHluorines for optical measurements of presynaptic activity. Biophys. J., 2000, 79, 2199-2208.

90. T. McAnaney, E. Park, G. Hanson, S. Remington, S. Boxer. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 2. Excited-state dynamics. Biochemistry, 2002, 41(52), 15489-15494.

91. H. Зубова, А. Савицкий. Молекулярные клеточные сенсоры, созданные на основе цветных флуоресцирующих белков. I. Сенсоры pH, ионов СГ, Са2+, Zn2+, Cu2+. Yen. Биол. Химии, 2005, 45, 391-454.

92. R. Richins, A. Mulchandani, W. Chen. Expression, immobilization, and enzymatic characterization of cellulose-binding domain organophosphorus hydrolase fusion enzymes. Biotechnol. Bioeng., 2000, 69(6), 591-596.

93. A. Mansee, W. Chen, A. Mulchandani. Detoxification of the organophosphate nerve agent coumaphos using organophosphorus hydrolase immobilized on cellulose materials. J. Ind. Microbiol. Biot., 2005, 32, 554-560.

94. R. Richins, 1. Kaneva, A. Mulshandani, W. Chen. Biodegradation of organophosphate pesticide by surface-expressed organophosphorus hydrolase. Nat. Biotechnol., 1997, 15, 984987.

95. M. Shimazu, A. Nguyen, A. Mulchandani, W. Chen. Cell surface display of organophosphorus hydrolase in Pseudomonas putida using an ice-nucleation protein anchor. Biotechnol. Progr., 2003, 19, 1612-1614.

96. M. Shimazu, A. Mulchandani, W. Chen. Cell surface display of organophosphorus hydrolase using ice nucleation protein. Biotechnol. Progr., 2001, 17, 76-80.

97. W. Chungjatupornchai, S. Fa-aroonsawat. Biodégradation of organophosphate pesticide using recombinant cyanobacteria with surface- and intracellular-expressed organophosphorus hydrolase. J. Microbiol. Biotechn., 2008, 18(5), 946-951.

98. C. Cho, A. Mulchandani, W. Chen. Bacterial cell surface display of organophosphorus hydrolase for selective screening of improved hydrolysis of organophosphate nerve agents. Appl. Environ. Microb., 2002, 68(4), 2026-2030.

99. D. Kang, J. Kim, H. Cha. Enhanced detoxification of organophosphates using recombinant Escherichia coli with co-expression of organophosphorus hydrolase and bacterial hemoglobin. Biotechnol. Lett., 2002, 24, 879-883.

100. Y. Kim, D. Kang, S.-S. Choi, J. Kim, J. Chung, II. Cha. Co-expression of bacterial hemoglobin overrides high glucose-induced repression of foreign protein expression in Escherichia coli W3110. Biotechnol. Lett., 2004, 26, 1173-1178.

101. W. Lan, J. Gu, J. Zhang, B. Shen, H. Jiang, A. Mulchandani, W. Chen, C. Qiao. Coexpression of two detoxifying pesticide-degrading enzymes in a genetically engineered bacterium. Int. Biodeter. Biodegr., 2006, 58, 70-76.

102. M. Shimazu, A. Mulchandani, W. Chen. Thermally triggered purification and immobilization of elastin-OPH fusions. Biotechnol. Bioeng., 2003, 81(1), 74-79.

103. C.-F. Wu, H. Cha, G. Rao, J. Valdes, W. Bentley. A green fluorescent protein fusion strategy for monitoring the expression, cellular location, and separation of biologically active organophosphorus hydrolase. Appl. Microbiol. Biot., 2000, 54, 78-83.

104. H. Cha, Ch.-F. Wu, J. Valdes, G. Rao, W. Bentley. Observations of green fluorescent protein as a fusion partner in genetically engineered Escherichia coli: monitoring protein expression and solubility. Biotechnol. Bioeng., 2000, 67(5), 565-574.

105. Ch.-F. Wu, J. Valdes, W. Bentley. Effects of in situ cobalt ion addition on the activity of a GFP-OPH fusion protein: the fermentation kinetics. Biotechnol. Progr., 2001, 17, 606-611.

106. Ch.-F. WU, J. Valdes, G. Rao, W. Bentley. Enhancement of organophosphorus hydrolase yield in Escherichia coli using multiple gene fusions. Biotechnol. Bioeng., 2001, 75(1), 100-103.

107. Ch. Li, Y. Zhu, I. Benz, M. Schmidt, W. Chen, A. Mulchandani, Ch. Qiao. Presentation of functional organophosphorus hydrolase fusions on the surface of Escherichia coli by the A1DA-I autotransporter pathway. Biotechnol. Bioeng., 2008, 99(2), 485-490.

108. Ch.-F. Wu, H. Cha, J. Valdes, W. Bentley. GFP-visualized immobilized enzymes: degradation of paraoxon via organophosphorous hydrolase in a packed column. Biotechnol. Bioeng, 2002, 77(2), 212-218.

109. К. Маркосян, Б. Курганов. Фолдинг, неправильный фолдинг и агрегация белков. Образование телец включения и агресом. Биохимия, 2004, 69(9), 1196-1212.

110. В. van der Berg, R. Ellis, Ch. Dobson. Effects of macromolecular crowding on protein folding and aggregation. EMBOJ., 1999,18(24), 6927-6933.

111. M. Silow, Y.-J. Tan, A. Fcrsht, M. Oliveberg. Formation of short-lived protein aggregates directly from the coil in two-state folding. Biochemistry, 1999, 38(40), 13006-13012.

112. А. Вульфсон, P. Тихонов, С. Печенов. Общий подход к ренатурации рекомбинантных белков, продуцируемых в составе тел включения. Доклады А.Н., 2001, 380(3), 400-403.

113. N. Fawzi, V. Chubukov, L. Clark, S. Brown and T. Head-Gordon. Influence of denatured and intermediate states of folding on protein aggregation. Protein Sci., 2005, 14, 9931003.

114. S. Idicula-Thomas, P. Balaji. Protein aggregation: a perspective from amyloid and inclusion-body formation. Curr. Sci., 2007, 92(6), 758-767.

115. V. Uvcrsky, J. Li, P. Souillac, I. Millett, S. Doniach, R. Jakes, M. Goedert, A. Fink. Biophysical properties of the synucleins and their propensities to fibrillate. J. Biol. Chem., 2002, 277(14), 11970-11978.

116. S. Reuveny, Y. Kim, C. Kemp, J. Shiloach. Effect of temperature and oxygen on cell growth and recombinant protein production in insect cell cultures. Appl. Microbiol. Biot., 1993, 38, 619-623.

117. S. Hong, S. Lee. Importance of redox balance on the production of succinic acid by metabolically engineered Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biot., 2002, 58, 286-290.

118. M. Kosinski, U. Rinas, J. Bailey. Isopropyl-p-D-thiogalactopyranoside influences the metabolism of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biot., 1992, 36, 782-784.

119. L.-F. Vallejo, U. Rinas. Strategies for the recovery of active proteins through refolding of bacterial inclusion body proteins. Microb. Cell Fact., 2004, 3, 11-22.

120. P. Тихонов, С. Печенов, А. Гуревич, P. Есипов, В. Швец, А. Вульфсон. Методы получения рекомбинантных белков-цитокинов IV. Ренатурация рекомбинантного человеческого интерлейкина-3. Бгюорг. Хгш., 2001, 27(1), 40-44.

121. A. Middelberg. Preparative protein refolding. TRENDS Biotechnol., 2002, 20(10), 437-443.

122. A. Jungbauer, W. Kaar, R. Schleg. Folding and refolding of proteins in chromatographic beds. Curr. Opin. Biotech., 2004, 15, 487^94.

123. G. Lemerciera, N. Bakalara, X. Santarelli. On-column refolding of an insoluble histidine tag recombinant exopolyphosphatase from Trypanosoma brucei overexpressed in Escherichia coli. J. Chromatogr. B, 2003, 786, 305-309.

124. K. Glynou, P. Ioannou, Th. Christopoulos. One-step purification and refolding of recombinant photoprotein aequorin by immobilized metal-ion affinity chromatography. Protein Exprès. Pari/., 2003, 27, 384-390.

125. V. Lozinsky, I. Galaev, F. Plieva, I. Savina, H. Jungvid, B. Mattiasson. Polymeric cryogels as promising materials of biotechnological interest. Trends Biotechnol., 2003, 21(10), 445-451.

126. D. Riesenberg. High-cell-density cultivation of Escherichia coli. Curr. Opin. Biotech, 1991,2(3), 380-384.

127. H. Markl, C. Zenneck, A. Dubach, J. Ogbonna. Custivation of Escherichia coli to high cell densities in a dialysis reactor. Appl. Microbiol. Biot., 1993, 39, 48-52.

128. S. Lee. High cell-density culture of Escherichia coli. Tibech March, 1996,14, 98-105.

129. Б. Глик, Дж. Пастернак. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. 2002, М: Мир, 128 с.

130. S. Lee, H. Chang. High cell density cultivation of Escherichia coli W using sucrose as a carbone sourse. Biotechnol. Adv., 1993, 15(9), 971-974.

131. J. Lee, S. Lee, S. Park. Fed-batch culture of Escherichia coli W by exponentional feeding of sucrose as a carbon sourse. Biotechnol. Tech., 1997, 11(1), 59-62.

132. D. Korz, U. Rinas, K. Hellmuth, E. Sanders, W.-D. Deckwer. Simple fed-batch technique for high cell density cultivation of Escherichia coli. J. Biotechnol., 1995, 39, 59-65.

133. S. Lee, K. Yim, H. Chang, Y. Chang. Construction of plasmids, estimation of plasmid stability, and use of stable plasmids for the production of poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant of Escherichia coli. J. Biotechnol., 32, 203-211.

134. D. Fan, Y. Luo, Y. Mi, X. Ma, L. Shang. Characteristics of fed-batch cultures of recombinant Escherichia coli containing human-like collagen cDNA at different specific growth rates. Biotechnol. Lett., 2005, 27, 865-870.

135. S. Kwon, S. Kim, E. Kim. Effects of glycerol on b-lactamase production during high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Progr., 1996, 12(2), 205208.

136. Y.-C. Liu, L.-C. Liao, W.-T. Wu. Cultivation of recombinant Escherichia coli to achieve high cell density with a high level of penicillin G acylase activity. Proc. Natl. Sei. Counc. ROC(B), 2000, 24(4), 156-160.

137. J. Shiloacha, R. Fass. Growing E. coli to high cell density A historical perspective on method development. Biotechnol. Adv., 2005, 23, 345-357.

138. J. Lee, S. Lee, S. Park, A. Middelberg. Control of fed-batch fermentations. Biotechnol. Adv., 1999, 17, 29^8.

139. T. Suzuki, T. Yamane, S. Shimizu. Phcnomenological background and some preliminary trials of automated substrate supply in pH-stat modal fed-batch culture using a setpoint of high limit. J. Ferm. Bioeng., 1990, 69, 292-297.

140. В. Kim, S. Lee, S. Lee, Y. Chang, H. Chang. High cell density fed-batch cultivation of Escherichia coli using exponential feeding combined with pH-stat. Bioprocess. Biosyst. Eng., 2004, 26, 147-150.

141. D. Riesenberg, R. Guthke. High-cell-density cultivation of microorganisms. Appl. Microbiol. Biot., 1999, 51, 422-430.

142. J. Cutayar, D. Poillon. High cell density culture of E. coli in a fed-batch system with dissolved oxygen as substrate feed indicator. Biotechnol. Lett., 1989, 11, 155-160.

143. D. Riesenberg, K. Menzel, V. Schulz, K. Schumann, G. Veith, G. Zuber, W. Knorre. High ccll density fermentation of recombinant Escherichia coli expressing human interferon alpha 1 .Appl. Microbiol. Biot., 1990, 34, 77-82.

144. S. Bauer, J. Shiloach. Maximal exponential growth rate and yield of E. coli obtainable in a bench-scale fermentor. Biotechnol. Bioeng., 1974, 16, 933-941.

145. M. Бакулин. "Голубая кровь" нужна микробиологам и биотехнологам. Рос. Биомед. Ж, 2004, 5(81), 240-241.

146. J. Shiloach, S. Bauer. High-yield growth of E. coli at different temperatures in a bench scale fermentor. Biotechnol. Bioeng., 1975, 17, 227-239.

147. S. Bauer, E. Ziv. Dense growth of aerobic bacteria in a bench-scale fermentor. Biotechnol. Bioeng., 1976, 18, 81-94.

148. K. Lowe, M. Davey, J. Power. Perfluorochemicals: their applications and benefits to cell culture. Trends biotechnol., 1998, 16, 272-277.

149. A. King, B. Mulligan, K. Lowe. Perfluorochemicals and cell culture. Nat. Biotechnol., 1989, 9, 1037-1042.

150. T. Wong, T. Ho. Retained perfluorodecalin after retinal detachment surgery. Int. Ophthalmol., 1997,20,293-294.

151. A. Chernykh, A. Leont'evstii, L. Golovleva. New approaches to increasing the yield of Laccase from Panus tigrinus. Appl. Biochem. Microbiol., 2005, 41(5), 508-511.

152. M. Bakulin, V. Zakharov, E. Chebotarev. Intensification of microbial degradation of crude oil and oil products in the presence of perfluorodecalin. Appl. Biochem. Microbiol., 2004, 40(3), 266-271.

153. M. Bakulin, A. Grudtsyna, A. Pletneva. Biological fixation of nitrogen and growth of bacteria of the genus Azotobacter in liquid media in the presence of perfluorocarbons. Appl. Biochem. Microbiol., 2007, 43(4), 399-402.

154. M. Bakulin, A. Grudtsyna, A. Pletneva, A. Kuchcrenko, A. Lyapustin, I. Malakhov. Effect of perfluorodecalin, carbogal, and perfluoromethyldccalin on growth and ice-forming activity ofbacteria. Microbiology, 2006, 75(3), 312-316.

155. D. Damiano, S. Wang. Novel use of perfluorocarbon for supplying oxygen to aerobic submerged cultures. Biotechnol. Lett., 1985, 7(2), 81-86.

156. D. Chandler, M. Davey, K. Lowe, B. Mulligan. Effects of emulsified perflourchemicals on growth and ultrastructure of microbial cells in culture. Biotechnol. Lett., 1987, 9(3), 195-200.

157. L. Brownlie, J. Stephenson, J. Cole. Effect of growth rate on plasmid maintenance by Escherichia coli HB101 (pATl53). J. Gen. Microbiol., 1990, 136, 2471-2480.

158. V. Bugeja, M. Kleinman, P. Stanbury, E. Gingold. The segregation of the 2 mu-based yeast plasmid pJDB248 breaks down under conditions of slow, glucose-limited growth. J. Gen. Microbiol., 1989,135, 2891-2897.

159. C. Keevil, B. Spillane, N. Major. Plasmid stability and antibiotic resistance of Neisseria gonorrhoea during glucose-limited continuous culture. J. Med. Microbiol., 1987, 24, 351-357.

160. U. Horn, M. Krug, J. Sawistowski. Effect of high cell density cultivation on plasmid copy number in recombinant Escherichia coli cells. Biotechnol. Lett., 1990, 12(3), 191-196.

161. В. А. Жданов, В. M. Кошелев, В. К. Новиков, А. А. Шувалов. Методы уничтожения фосфорорганических отравляющих веществ. Рос.хим.журнал, 1993, 37(3), 22-25.

162. Дегазирующая рецептура и способ ее получения. Патент РФ на изобретение №2288016, 2005.

163. Способ уничтожения боеприпасов, снаряженных фосфорорганическими отравляющими веществами и имеющих в корпусе технологические резьбовые отверстия. Заявка на выдачу патента РФ №2006133269, 2006.

164. К. LeJeune, A. Mesiano, S. Bower, J. Grimsley, J. Wild, A. Russell. Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agent degradation. Biotechnol. Bioeng., 1997, 54(2), 105-114.

165. J. Kolakowski, J. DcFrank, S. Harvey, L. Szafraniee, W. Beaudry, K. Lai, J. Wild. Enzymatic hydrolysis of the chemical warfare agent VX and its neurotoxic analogues by organophosphorus hydrolase. Biocatal. Biotransfor., 1997,15, 297-302.

166. V. Rastogi, J. DeFrank, T.-C. Cheng, J. Wild. Enzymatic hydrolysis of Russian-Vx by organophosphorus hydrolase. Biochem. Bioph. Res. Co., 1997, 241, 294-299.

167. Chemical and/or biochemical decontamination system. Patent WO 01/56380 Al, 2001.

168. Hydrolysis of cholinesterase inhibitors using parathion hydrolase. Patent US 5589386, 1996.

169. Способ ферментативного гидролиза фосфоорганических боевых отравляющих веществ. Патент РФ на изобретение №2296164, 2007.

170. V. Sergeeva, E. Efremenko, G. Kazankov, S. Varfolomeev. Double effect of organic amines (activation and inhibition) on the phosphotriesterase. J. Mol. Cat. B-Enzym., 2000, 10, 571-576.

171. S. Hong, S. Lee. Metabolic flux analysis for succinic acid production by recombinant Escherichia coli with amplified malic enzyme activity. Biotechnol. Bioeng., 2001, 74(2), 89-95.

172. S. Lec, H. Chang. Effect of complex nitrogen source on the synthesis and accumulation of Poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli in flask and fed-batch cultures. J. Environ. Polim. Degr., 1994, 2(3), 169-175.

173. И. Логинов, E. Морозова, А. Брильков. Математическое моделирование автоселекции микробных популяций при субстратном ингибировании их роста в непрерывной культуре. Вестник КрасГУ. Серия физ.-мат. науки, 2005, 1, 44-49.

174. А. Шуваев, А. Брильков. Стохастическая модель внутриклеточной динамики многокопийных бактериальных плазмид с учетом контроля репликации. Мат. Биол. Биоинф., 2007, 2(1), 66-72.

175. Active topical skin protectants using combinations of reactive nanoparticles and polyoxometalates or metal salts. Patent US 6410603, 2002.

176. Preparation of enzymatically active sponges or foams for detoxification of hazardous compounds. Patent US№ 6642037, 2003.

177. К. Е. LeJeune, В. С. Dravis, F. Yang, A. D. Hetro, В. P. Doctor, A. J. Russell. Fighting nerve agent chemical weapons with enzyme technology. Annals. NY Acad. Science, 1998,864,153-170

178. К. E. LeJeune, J. R. Wild, A. J. Russel. Nerve agents degraded by enzymatic foams. Nature, 1998,392,27-28

179. P. L. Havens, H. F. Rase. Reusable Immobilized Enzyme/Polyurethane Sponge for Removal and Detoxification of Localized Organophosphate Pesticide Spills. Ind. Eng.Chem. Res., 1993,32 (10), 2254-2258.

180. К. E. LeJeune, A. J. Russell. Biocatalytic nerve agent detoxification in fire fighting foams. Biotechnol.Bioeng., 1999, 62 (6), 659-665.

181. Protective and/or camouflage material. Patent US№4781959, 1988.

182. I. B. Wilson, J. Dayan. The free energy of hydrolysis of phosphoryl-phosphatasa. iochemistry, 1965, 4 (4), 645-649

183. Y. C. Yang, J. A. Baker, J. R. Ward. Decontamination of chemical warfare agents. Chem. Rev., 1992, 92, 1729-1743.

184. R. Ramaseshan, S. Sundarrajan, Y. Liu, R. S. Barhate, N. L. Lala, S. Ramakrishna. Functionalized polymer nanofibre membranes for protection from chemical warfare stimulants. Nanotechnology, 2006, 17, 2947-2953.

185. Клонирование ДНК. Методы. Ред. Д. Гловер. 1988. М.: Мир. 162 с.

186. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование 1984, М.: Мир. 239 с.

187. М. М. Bradford. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, 72, 248-254.

188. С. Д. Варфоломеев, С. В. Калюжный. Биотехнология: Кинетические основы микробиологических процессов. Учеб. пособие для биол. и хим. спец. вузов. М.: Высш. шк„ 1990, 296 с.

189. Ch. Lei, М. Valenta, К. Saripalli, Е. Ackerman. Biosensing paraoxon in simulated environmental samples by immobilized organophosphorus hydrolase in functionalized mesoporous silica. J. Environ. Qual., 2007, 36, 233-238.

190. D. Curiel, J. Engler. Ligands added to adenovirus fiber. US Patent №6683170B2, 2004.

191. D. Borhani, D. Rogers, J. Engler, C. Brouillette. Crystal structure of truncated human apolipoprotein A-I suggests a lipid-bound conformation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94, 12291-12296.

192. L. Roberts, M. Ray, T.-W. Shih, E. Hayden, M. Reader, C. Brouillette. Structural analysis of apolipoprotein A-I: limited proteolysis of methionine-reduced and -oxidized lipid-frec and lipid-bound human apo A-I. Biochemistry, 1997, 36(24), 7615-7624.

193. Основы общей биологии. Ред. Э. Либберт. М.: Мир. 1982. 422 с.

194. E. Efremenko, Yu. Votchitseva, T. Aliev, S. Varfolomeyev. Expression of recombinant organophosphorus hydrolase in active form. 2004. In: Biocatalytic Technology and Nanotoxicology (Ed. Zaikov G.E.), Nova Science Publishers, Inc., 65-71.

195. Y. Zhang, R. Autcnrieth, J. Bonner, S. Harvey, J. Wild. Biodégradation of neutralized sarin. Biotechnol. Bioeng., 1999, 64(2), 221-231.

196. S. Gaberlein, F. Spencr, C. Zaborosch. Microbial and cytoplasmic membrane-based potentiometric biosensors for direct determination of orgdnophosphorus instcticides. Appl. Microbiol. Biot., 2001, 54, 652-658.

197. D. Spoel, E. Lindahl, B. Hess, G. Groenhof, A. Mark, H. Berendsen. GROMACS: fast, flexible, and free. J. Comput. Chem., 2005, 26(16), 1701-1718.

198. A. E. Любарев, Б. И. Курганов. Изучение необратимой тепловой денатурации белков методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Успехи биол. Хим., 2000, 40, 43-84.

199. W. D. Kumler, J. J. Eiler. The ultraviolet absorption spectra and resonance in benzene derivatives-sulfanilamide, metanilamide, p-aminobenzoic acid, benzenesulfonamide, benzoic acid and aniline. J. Am. Chem. Soc. 1943, 65(12), 2355-2361.

200. В. В. Шелковников. Расчеты ионных равновесий в химии: Учеб.-мет. пособие. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2006, 70 с.

201. J. Pandey, P. Gorla, В. Manavathi, D. Siddavattam. mRNA secondary structure modulates the translation of organophosphate hydrolase (OPH) in E. coli. Mol. Biol. Rep., 2007, DOI 10.1007/sl 1033-007-9200-5.

202. M. Li, Z.-G. Su, J.-С. Janson. In vitro protein refolding by chromatographic procedures. Protein Exprès. Purif., 2004, 33, 1-10.

203. H. Wong, Y. Kim, S. Lee, H. Chang. Effect of post-induction nutrient feeding strategies on the production of bioadhesive protein in Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng., 1998, 60(3), 271-276.

204. В. К. Гореленков, В. Я. Онойко, Ю. П. Соболев, С. JI. Шашков. Пути создания материалов для перспективной боевой экипировки мирного и военного времени военнослужащих общевойсковых подразделений Российской Армии. М.: ВУ РХБЗ, 2001, 166 с.

205. Г. Я. Легин, Н. М. Шехтман, В. М. Андреев. Консервация косметических изделий и эффективные современные консерванты. 1983, Вып. 3, с. 1-36.