Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Макаров, Дмитрий Александрович

• Макаров, Дмитрий Александрович
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Макаров, Дмитрий Александрович

Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Литературный обзор

1.1. Тимозины и их свойства. Тимозин бета 4

1.2. Структура Тр4

1.3. Способы получения Тр4

1.4. Ацилирование белков in vivo

1.5. Биологическая активность Тр4

1.5.1. Кардиопротекторные свойства Тр4

1.5.2. Tp4 стимулирует ангиогенез и неоваскуляризацию ишемизированного миокарда

1.5.3. Роль Tp4 в развитии опухолей и метастазировании

1.5.4. Влияние Tp4 на восстановление кожных покровов и рост волос

1.6. Обзор молекулярных механизмов, регулируемых активностью Tp4

1.7. Стратегия контролируемого высвобождения вещества: способ доставки Tp4 к тканям

1.8. Сульфоксид TP4 (TP4SO)

1.9. Активные аминокислотные фрагменты в составе молекулы Tp4

1.10. Применение Tp4 в клинике

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы исследований

2.1.1. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения рекомбинантного Tp4 человека до пилотного производства

2.1.1.1. Материалы

2.1.1.2. Приготовление буферных растворов

2.1.1.3. Выращивание инокулята штамма ER2566/ pERTEVrsTB4 для засева ферментёра

2.1.1.4. Культивирование штамма-продуцента ER2566/pERTEVrsTB4 в ферментёре

2.1.1.5. Разрушение биомассы

2.1.1.6. Подбор условий осаждения балластных белков из осветлённого клеточного лизата

2.1.1.7. Масштабирование процесса температурной обработки клеточного лизата

2.1.1.8. Хроматографическая очистка гибридного белка

2.1.1.9. Подготовка телец включения TEV-протеиназы

2.1.1.10. Поиск оптимального соотношения фермент/субстрат протеолитического расщепления гибридного белка

2.1.1.11. Масштабирование реакции протеолитического расщепления гибридного белка

2.1.1.12. Хроматографическое разделение дезацетилтимозина бета 4 и остаточного белка

2.1.1.13. Определение условий ингибирования реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4

2.1.1.14. Масштабирование реакции ацетилирования дезацетилтимозина бета 4 и очистка продуктов реакции на ОФ ВЭЖХ

2.1.1.15. Аналитические методы контроля

2.1.2. Разработка способов получения аналогов Tp4 в виде конъюгатов, устойчивых к деградации в токе крови

2.1.2.1. Материалы

2.1.2.2. Подбор условий проведения реакции ацилирования дезацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты

2.1.2.3. Масштабирование реакции ацилирования деацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты

2.1.2.4. Очистка моногексаноилтимозина бета 4

2.1.2.5. Подбор условий проведения реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4

2.1.2.6. Масштабирование реакции сиалирования дезацетилтимозина бета 4

2.1.2.7. Очистка моносиалированного Tß4

2.1.2.8. Подбор условий проведения реакции ПЭГилирования дезацетилтимозина бета 4

2.1.2.9. Масштабирование реакции ПЭГилирования дезацетилтимозина бета 4

2.1.2.10. Очистка моноПЭГилированного Tß4

2.1.2.11. Определение структуры модифицированного Tß4

2.1.2.12. Тестирование стабильности аналогов Tß4 и химически синтезированного Tß4 с использованием сыворотки крови

2.1.2.13. Аналитические методы контроля

2.1.3. Разработка интеин-опосредованного метода получения рекомбинантного Tß4 из ацетилированного гибридного белка in vivo

2.1.3.1. Материалы

2.1.3.2. Приготовление питательных сред

2.1.3.3. Приготовление буферных растворов

2.1.3.4. Синтез олигонуклеотидов для клонирования

2.1.3.5. Создание рекомбинантной плазмиды pER-Tb4-Gyr

2.1.3.6. Создание рекомбинантной плазмиды pER -Tb4Gyr-RBS

2.1.3.7. Создание рекомбинантных плазмид pER-Tb4GyrA-AcAla и pER-Tb4GyrA-AcSer

2.1.3.8. Подбор условий ацетилирования in vivo

2.1.3.9. Оптимизация условий культивирования штамма-продуцента E. coli C3030/pER-Tb4GyrA-AcSer

2.1.3.10. Аффинная хроматография гибридного белка

2.1.3.11. ОФ ВЭЖХ

2.1.3.12. Аналитические методы контроля

2.1.3.13. Метод отбора клонов

2.1.3.14. Методы трансформации

2.1.4. Эффективность рекомбинантного Tß4 в спонтанной мышиной модели хронического дерматита

2.1.4.1. Материалы

2.1.4.2. Определение эффективности рекомбинантного Tß4 в спонтанной мышиной модели хронического дерматита

2.2. Результаты и обсуждение

2.2.1. Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения рекомбинантного Tß4 человека до пилотного производства

2.2.1.1. Масштабирование стадии культивирования штамма-продуцента и стадии разрушения клеточной биомассы

2.2.1.2. Осаждение балластных белков из осветлённого клеточного лизата

2.2.1.3. Оптимизация и масштабирование стадии анионообменной хроматографии гибридного белка

2.2.1.4. Оптимизация и масштабирование стадии протеолитического расщепления гибридного белка

2.2.1.5. Оптимизация и масштабирование стадии очистки дезацетилтимозина бета 4

2.2.1.6. Оптимизация и масштабирование стадии ацетилирования дезацетилтимозина бета 4

2.2.2. Разработка способов получения аналогов Tß4 в виде конъюгатов, устойчивых к деградации в токе крови

2.2.2.1. Ацилирование дезацетилтимозина бета 4 ангидридом гексановой кислоты

2.2.2.2. Сиалирование дезацетилтимозина бета 4

2.2.2.3. ПЭГилирование дезацетилтимозина бета 4

2.2.2.4. Определение структуры полученных аналогов Tß4

2.2.2.5. Определение стабильности полученных аналогов Tß4

2.2.3. Разработка интеин-опосредованного метода для производства рекомбинантного Tß4 из ацетилированного гибридного белка in vivo

2.2.3.1. Создание рекомбинантных плазмид pER-Tb4GyrA-AcSer и pER - Tb4GyrA - AcAla

2.2.3.2. Проверка экспрессии генов штаммов-продуцентов и расщепления гибридного белка

2.2.3.3. Подбор условий ацетилирования in vivo

2.2.3.4. Протеолитический анализ последовательности Tß4

2.2.4. Эффективность рекомбинантного Tß4 в спонтанной мышиной модели хронического дерматита

2.2.4.1. Влияние монотерапии препарата Tß4 на проявление признаков дерматита

2.2.4.2. Отдаленные эффекты препарата Tß4 на фоне дополнительной противомикробной и противогрибковой терапии

3. Выводы

4. Список литературы

Список сокращений

ACE -ангиотензин конвертирующий фермент CHX - хлоргексидин

eEPCs - эмбриональные эндотелиальные клетки-предшественники EPDCs - эпикардиальные клетки-предшественники ILK - интегрин связанная киназа MLC - лёгкая цепь миозина

MRTF-A -миокардин-связанный фактор транскрипции А

MSCs - мезенхимальные стволовые клетки

SDS - додецилсульфат натрия

Tß4 - тимозин бета

Tß4SO -сульфоксид тимозин бета

TF5- термостабильная фракция

АО - аминокислотные остатки

ОФ ВЭЖХ - Обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография ПААГ - Полиакриламидный гель ПСК - Полисиаловая кислота ПЭГ - Полиэтиленгликоль

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологий получения рекомбинантного тимозина бета-4 человека и его аналогов»

Введение

Актуальность проблемы. Открытие тимозинов в середине 1960-х годов произошло в ходе исследований роли тимуса в развитии иммунной системы позвоночных. Тимозинами были названы небольшие белки, первоначально выделенные из вилочковой железы, но как стало известно из дальнейших исследований, большинство из этих белков присутствует во многих тканях организма [1]. Среди тимозинов пептид тимозин бета 4 (Тр4) считается наиболее распространённым, наиболее изученным и, вероятно, наиболее биологически активным членом семьи бета тимозинов. Благодаря тому, что молекула Тр4 является актин-связывающим пептидом, она регулирует полимеризацию актина, и, как следствие, регулирует клеточную миграцию, которая важна для процесса ангиогенеза, регенерации повреждённых тканей [2]. В разных клеточных моделях и на уровне организма неоднократно было показано, что молекула Тр4 обладает уникальными кардиопротекторными свойствами, принимает участие в стимулировании ангиогенеза в условиях ишемии сердечной мышцы, блокирует в кардиомиоцитах проапоптотические каскады и, наоборот, активизирует внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за выживаемость клеток в условиях стресса. Регенерационный потенциал молекулы Тр4 активно исследуется и в других областях медицины. Активность этой молекулы проявляется при лечении трофических язв, ран и ожогов роговицы глаза человека [3]. Благодаря противовоспалительным свойствам Тр4 зарекомендовал себя как действующее вещество в препаратах для лечения признаков воспаления кожи - хронических дерматитов. [4].

Учитывая модулирующее влияние Тр4 на клеточную дифференцировку, миграцию, регенерацию и другие процессы в организме, активно исследуются способы применения пептида в составе лекарственных препаратов различной направленности.

Исследование биораспределения ТР4 по основным органам мыши выявило, что концентрация Тр4 в сыворотке крови мыши падает до исходного состояния уже через 40 мин после введения пептида, а через 2 часа ТР4 практически полностью выводится из организма [5], поэтому в настоящее время перспективным направлением является совершенствование лекарственных форм на основе Тр4 с устойчивой и пролонгированной активностью.

С точки зрения технологии производства Тр4 в настоящее время существуют несколько способов его получения: выделение из природных источников или синтетический подход с использованием химических и микробиологических методов синтеза. Биотехнологический способ получения Тр4 с использованием экспрессии

рекомбинантного гена в бактериальных клетках E. coli является достаточно эффективным и экологически безопасным по сравнеию с химическим синтезом, однако существующие на сегодня биотехнологические методы получения целевого пептида громоздки и не в состоянии обеспечить получение нативного Tß4.

Актуальной задачей является получение аналогов Tß4 с улучшенными фармакокинетическими показателями.

Цель исследования. Разработать эффективную биотехнологию производства рекомбинантного тимозина бета 4 человека (рекомбинантный Tß4 человека) и его аналогов с улучшенными фармакокинетическими показателями.

Задачи исследования.

1. Разработать эффективную биотехнологию пилотного производства рекомбинантного Tß4 человека.

2. Изучить биологическую активность рекомбинантного Tß4 человека.

3. Синтезировать аналоги рекомбинантного Tß4 с улучшенными фармакокинетическими показателями. Разработать эффективный способ их очистки.

4. Разработать биотехнологический метод получения рекомбинантного Tß4 человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.

Научная новизна.

1) Впервые разработана эффективная и легко масштабируемая технология получения рекомбинантного Tß4 человека с использованием интеин-опосредованной экспрессионной системы, обеспечивающая селективное высокоэффективное ацетилирование рекомбинантного Tß4 in vivo.

2) Исследована биологическая активность рекомбинантного Tß4 человека на спонтанной мышиной модели хронического дерматита и показана его эффективность в лечении хронических заболеваний кожи.

3) Синтезированы три аналога рекомбинантного Tß4 человека с улучшенными фармакокинетическими показателями. Разработан эффективный способ очистки аналогов рекомбинантного Tß4 человека с использованием методов ОФ ВЭЖХ.

Практическая значимость работы. С использованием разработанной биотехнологии пилотного производства рекомбинантного Tß4 человека была наработана опытная партия 2,5 г рекомбинантного Tß4 человека для медико-биологических испытаний. Разработанная технология ацетилирования пептида in vivo обеспечила эффективный и экономичный способ получения рекомбинантного Tß4 человека.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработана эффективная биотехнология пилотного производства рекомбинантного Тр4 человека.

2. Биологические исследования продемонстрировали эффективность рекомбинантного Тр4 человека в спонтанной мышиной модели хронического дерматита.

3. Проведён синтез аналогов рекомбинантного Тр4 с улучшенными фармакокинетическими показателями. Разработаны эффективные способы их очистки.

4. Разработан биотехнологический метод получения рекомбинантного Тр4 человека, исключающий стадию химического ацетилирования пептида.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на XXV Международной зимней молодёжной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Россия, Москва, 2013), VI российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Россия, Уфа, 2013), Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвящённой 80-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Россия, Москва, 2014).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 4 статьи в реферируемых научных журналах, 3 тезисов докладов на российских и международных конференциях, получено 4 патента.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; материалов и методов исследований; описания собственных исследований; результатов исследований; обсуждения полученных результатов; выводов; списка литературы. Работа изложена на 100 страницах, включая 46 рисунков, 9 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 185 источника.

1. Литературный обзор

1.1. Тимозины и их свойства. Тимозин бета 4

В 1966 г Goldstein с коллегами выделили из тимусовой железы телёнка термостабильную фракцию 5 (TF5). Эта фракция состояла из 30 полипептидов с молекулярной массой от 1 до 15 кДа [6] и обладала способностью стимулировать созревание Т- клеток, модулирулируя Т-клеточный ответ [7], что впоследствие позволило применять TF5 при лечении детей с опасными для жизни болезнями иммунодифицита. Входящие в TF5 пептиды образуют несколько видов тимозинов, которые принадлежат к семейству модификаторов биологических реакций (BRMs), регулирующих иммунные реакции и участвующих в процессах регенерации тканей после повреждения. Среди них отдельно можно выделить тимозин альфа 1 , обладающий иммуномодулирующими свойствами. Этот пептид применяется при лечении хронического вируса гепатита С и в противораковой терапии, в частности, при лечении гепатоцеллюлярной карциномы [8]. Пептиды тимозин бета 4 (Тр4) , а также тимозин бета 10 и тимозин бета 15 , за счет актин-связывающей способности играют важную роль в организации цитоскелета [2,9-11], а также регулируют иммунные реакции и участвуют в регенерации тканей после повреждений.

Тр4 считается наиболее распространённым, наиболее изученным и, вероятно, наиболее биологически активным членом семейства бета тимозинов. Он присутствует практически во всех клетках, за исключением кровяных телец (эритроцитов), а также присутствует в жидкостях тела, таких как: слюна, кровь, плазма, жидкость раны, слёзы [12]. Этот короткий полипептид локализован как в цитоплазме, так и в ядре клетки.

Тр4 был охарактеризован как актин-связывающий белок, стимулирующий клеточную миграцию [13,14]. Недавно было обнаружено, что связывание Тр4 с мономером актина (G-актином) регулирует процессы синтеза металлопротеиназы и полимеризации актина в микрофиламенты (F-актин). Под действием градиента концентрации Тр4, металлопротеиназа уменьшает своё взаимодействие с G- актином, что делает G-актин доступным для филаментной сборки и, в свою очередь, способствует увеличению подвижности клетки [15]. Благодаря тому, что Тр4 стимулирует миграцию клеток, ангиогенез во многих тканях организма [16,17]. Он также способствует восстановлению кожного покрова за счёт своей высокой хемотаксической активности и быстрым притоком клеток к ране [18-21]. Тр4 стимулирует миграцию стволовых клеток из выступающего региона волосяных фолликул, что приводит к увеличению роста волос

[22], а также эмбриональных клеток-предшественников из зоны эпикарда к сердечной мышце, что приводит к формированию новых сосудов [23]. Однако Тр4 действует и на раковые клетки, что способствует их метастазированию [24].

В связи с регенеративным потенциалом молекула Тр4 является сегодня объектом многочисленных исследований и рассматривается в качестве перспективной основы лекарственных препаратов различной направленности.

1.2. Структура Тр4

Тр4 представляет собой короткий полипептид c молекулярной массой 4,96 кДа, состоящий из 43 аминокислотных остатков (AO), N-концевой серин, которого ацетилирован (рис. 1).

Ac-SDKPDMAEIEKFDKSKLKKTETQEKNPLPSKETIEQEKQAGES

Рис. 1. Аминокислотная последовательность TP4.

У Тр4 отсутствует третичная структура, поскольку в его составе нет цистеинов. Более того, пептид имеет динамичную, неструктурированную и подвижную конформацию. Так, анализ методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) показал, что во фторсодержащей водно-спиртовой смеси Тр4 принимает конформацию с двумя протяжёнными участками от 4 до 16 АО и от 30 до 40 АО, представляющими собой альфа спирали [25]. В воде Тр4 принимает конформацию спирали, которая формируется из 5-16 АО, стабильной только при температурах ниже 14°С. Сегмент, представляющий собой последовательность от 31 до 37 АО, также образует альфа спираль, но только при температурах ниже 4°С [26]. Анализ, проведённый методом кругового дихроизма, показал, что ТР4 в водном растворе в диапазоне рН 4,5-7,5 и диапазоне температур от 5 до 40 °С проявляет слабовыраженную вторичную структуру [27].

1.3. Способы получения Тр4

Впервые ТР4 получен из природного источника - тимусовой железы [6], однако выход целевой фракции этого пептида составил не более 1%. Наибольшее распространение в 90е годы получил химический синтез Тр4. Так, в работе Low и соавторов [28] представлен автоматический твердофазный синтез пептида на PAM-смоле (4-гидроксиметилфенилацетамидометильная смола). В других работах был осуществён синтез не только дезацетилированного Тр4 [29], но и его аналога с более высокой восстанавливающей активностью [30]. Стоит отметить, что синтезировалась не только полноразмерная версия Тр4, но и его фрагменты - короткие пептидные

последовательности [31]. Так в работе Esposito и др. [32] описан синтез ацетилированного короткого фрагмента Tß4, представляющего последователность 17-24 АО.

В настоящее время наибольшую популярность приобрёл биотехнологический способ получения Tß4 с использованием экспрессии рекомбинантного гена в бактериальных клетках E. coli, поскольку данный способ является достаточно эффективным с точки зрения стоимости конечного продукта и наименее вредным с точки зрения отходов производства. В работе Но и др. [33], Tß4 был получен с шестью остатками гистидина, упрощающими процесс очистки целевого пептида с помощью аффинной хроматографии. Однако наличие дополнительных последовательностей могло повлиять на его функциональную активность. Исследователи Li и др. [34] создали генетическую конструкцию, при экспрессиии которой синтезировался гибридный белок, в состав которого входил Tß4. Авторы добились высокой продукции гидридного белка, до 40% от общей массы белка в клетке. Однако разработанный ими метод представляется сложным для масштабирования, поскольку авторы работы использовали для очистки гибридного белка аффинную хроматографию, а для отщепления целевого пептида от аффинной метки тромбин, который выделяют из природных источников, что сильно влияет на цену конечного продукта. Таким образом, с точки зрения масштабирования большинство предложенных подходов синтеза Tß4 является нерентабельным. Существуют ещё примеры получения Tß4 биотехнологическим способом, где целевой пептид синтезировался в составе гибридного белка с интеином [35]. Однако разница в подходах к получению Tß4 не имела большого значения, поскольку у всех вышеперечисленных биотехнологических способов имелся один и тот же недостаток - все способы позволяли получить только дезацетилированную форму Tß4.

В работе Бейраховой и др. [36] была предложена эффективная масштабируемая схема получения рекомбинантного препарата Tß4 со структурой, полностью идентичной природной. На первой стадии получали гибридный белок, состоящий из последовательностей тиоредоксина и Tß4, между которыми был расположен специфический сайт для расщепления протеиназой вируса гравировки табака (TEV-протеиназой). После расщепления гибридного белка выделяли рекомбинантный дезацетилированный Tß4, который затем с помощью уксусного ангидрида направленно ацетилировали по N-концевой аминогруппе остатка серина. Однако выход ацетилированной формы Tß4 не превышал 55% от исходного количества дезацетилированного Tß4. Также реакционная смесь содержала побочные продукты реакции, что требовало ввести дополнительную стадию очистки. Более перспективным

представляется использование для ацетилирования аминогруппы N-концевого серина высокоспецифичных ферментов - N-ацетилтрансфераз [37].

1.4. Ацилирование белков in vivo

Ацилирование белков, т.е. посттрансляционное и ковалентное присоединение ацильной группы к белкам, является широкораспространённым способом модификации белков (Рис. 2). Реакция катализируется специфическими ацилтрнасферазами и включает перенос ацильной группы ацил-коэнзима А к аминокислоте. Ацилирование можно классифицировать в соответствии с длиной / структурой ацильных групп.

Рис. 2. Различные типы ацилирования белка. A) Lys ацилирирование. B) N-концевое ацетилирование. C) N-миристоилирование и N-пальмитоилирование. D) S-пальмитоилирование. E) Ser/Thr ацилирование. F) Ser/Thr-пальмитолеилирование [38].

Ацилирование белка может иметь различные функции в клетках; небольшой ацил, например, формил или ацетил, работает в качестве элемента распознавания для белок-белковых взаимодействий, в то время как длинные цепи жирных кислот, такие как пальмитат (эфир пальмитиновой кислоты), могут участвовать во внутриклеточной сортировке белков и доставке к мембранам, а также влияют на передачу сигнала [38]. Ацилирование обычно происходит по аминокислотным остаткам Lys, Cys, Ser / Thr, несущим нуклеофильные группы -NH2, -SH, -ОН, и, соответсвенно называется N-ацилированием (амидная связь), S-ацилированием (тиоэфирная связь) или O-

ацилированием (эфирная связь). Есть несколько исключений, где ацилирование происходит по белковому N-концу, такие реакции называются N-концевое (№) ацетилирование, №-миристоилирование или №-пальмитоилирование [39].

№-ацетилирование является одним из наиболее распространённых видов модификации белка в эукариотах, где ацетил переносится от ацетил коэнзима А к аминогруппе рождающегося пептида. №-ацетилирование специфических белков может быть либо полным, либо частичным, в последнем случае белок существует как в ацетилированной, так и в неацетилированной формах. Процесс ацетилирования нейтрализует положительный заряд, обычно ассоциированный со свободной аминогруппой, и таким образом эффективно блокирует аминогруппу от дальнейшей ионизации и других модификаций. №-ацетилирование катализируется набором ферментов - N - концевых ацетилтрансфераз (NATs). Энзиматические механизмы сохраняются от низших к высшим эукариотам, что говорит о сопоставимых системах №-ацетилирования [40]. NATs проявляют различную субстратную специфичность, которая обусловлена особенностью первых двух аминокислот в последовательности пептида [41]. В основном, №-ацетилирование катализируется NatA, NatB и NatC ацетилтрансферазами. NatA, основной NAT-комплекс, состоит из каталитической субъединицы Naa10 и регуляторной субъединицы Naa15 [42]. Комплекс NatA ацетилирует N-конец белка, начиная с Ala, Cys, Gly, Ser, Thr или Val после удаления iMet [41]. NatB комплекс состоит из каталитической субъединицы Naa20 и вспомогательной субъединицы Naa25 [43] и ацетилирует N-концевые Met-Asn-, Met-Asp-, Met-Gln- и Met-Glu- [44]. NatC состоит из трёх субъединиц Naa30 (ответсвенна за реакцию ацетилирования), Naa35 и Naa38. Активность NatC нацелена на iMet, за которым следует гидрофобный остаток, такой как: Ile, Leu, Phe, или Trp [45].

В отличие от эукариот, где большинство из аминогрупп ацетилированы (80% в организме человека), о №-ацетилировании белков в прокариот сообщается редко [46]. В основном ацетилирование связано с процессом трансляции. Например, в Escherichia coli три № ацетилтрансферазы (Rimi, RimJ и Riml) специфично модифицируют рибосомные белки S18, S5 и L12 с N-концевыми Ala-Arg-, Ala-His- и Ser-Ile- соответственно [47, 48].

Наиболее перспективным с точки зрения производства представляется ацетилирование белка in vivo, при котором мог бы использоваться ацетилкоэнзим А самой клетки. Идея биотехнологического способа получения белка в E. coli c ацетилированием in vivo не нова. Так, например, Yuantao с коллегами применили N -концевое ацетилирование in vivo для тимозина альфа 1 [49]. В качестве ацетилирующего фермента использовали рибосомальную аланиновую N - ацетилтрансферазу (RimJ). Авторы статьи

пишут о высокой эффективности этого процесса. Однако, остаётся не понятно, почему для ацетилирования тимозина альфа 1, у которого, также как и в Тр4, первым N - концевым аминокислотным остатком является серин, использовали не специфичную для этой аминокислоты ацетилтрансферазу. Применение рибосомальной сериновой N -ацетилтрансферазы ^т1), которая имеет более высокую специфичность по отношению к серину, вероятно, может привести к более высокой эффективности ацетилирования пептида.

1.5. Биологическая активность Тр4

1.5.1. Кардиопротекторные свойства Тр4

На основании большого количества исследований, посвященных изучению активности пептида Тр4, можно утверждать, что эта молекула является уникальным кардиопротектором. Тр4 способен стимулировать ангиогенез в условиях ишемии сердечной мышцы, блокировать в кардиомиоцитах проапоптотические каскады и, наоборот, активизировать внутриклеточные сигнальные пути, ответственные за их выживаемость в условиях стресса. Более того Тр4 обладает способностью регулировать ферментативную активность в строме миокарда, а также подавлять в миокарде образование токсичных свободных радикалов кислорода. Применение экзогенного Тр4 в условиях острого экспериментального инфаркта миокарда снижает риск разрыва сердца и поддерживает его инотропную функцию.

В работе Воск-Мащиейе и др. [50] был описан потенциал ТР4 повышать выживаемость и восстановление кардиомиоцитов. На уровне паракринного воздействия показано, что локальное высвобождение Тр4 способствует увеличению выживаемости и пролиферативного потенциала кардиомиоцитов, способствует стимуляции неоангиогенеза и воздействует на стволовые клетки и клетки-предшественники, вследствие чего улучшается процесс формирования новых сосудов, восстановления ткани миокарда, ослабляется развитие фиброза, восстанавливается сердечная деятельность [23,51]. Стволовые клетки и клетки-предшественники высоко секретируют целый спектр цитокинов, ростовых факторов, в том числе Тр4. Например, эмбриональные эндотелиальные клетки-предшественники (еБРСв) обладают кардиопротекторными свойствами, в том числе за счет секреции Тр4 [52].

На рисунке 3 представлены разнообразные кардиопротекторные свойства Тр4 у млекопитающих.

1

Модуляция воспаления

I

Ангиогенез и неоваскуляризация

1

Ж

Рис. 3. Разнообразные кардиопротеторные свойства Тр4 при ишемической болезни сердца у млекопитающих [53].

К месту повреждения миокарда под действием медиаторов - хемокинов и цитокинов, мигрируют клетки врожденной иммунной системы - нейтрофилы и макрофаги [54]. Макрофаги фагоцитируют разрушенные клетки миокарда и стимулируют образование грануляционной ткани [55]. Фибробласты дифференцируются в миофибробласты и формируют внеклеточный матрикс (ЕСМ) с высоким содержанием коллагена для формирования рубца. Хотя инфильтрация иммунными клетками необходима для заживления сердца, гиперактивация этих клеток ведёт к хроническому воспалению, усиленному рубцеванию, что снижает интенсивность восстановления сердечной деятельности и патологическому изменению структур миокарда [56]. Известно, что Тр4 способен ингибировать воспалительный процесс в зоне ишемии сердца, что способствует заживлению зоны инфаркта и нормальному формированию рубца. Тр4 может взаимодействовать в месте повреждения с токсичной перекисью водорорда (Н202), и образовывать производное пептида - Тр4-сульфоксид (Тр4^0), обладающего сильным противовоспалительным действием, способствующего заживлению ран [57]. На мышиной модели инфаркта миокарда было показано, что Тр4 и Тр4^0 увеличивают инфильтрацию макрофагами на ранней стадии повреждения, когда эти клетки необходимы для удаления фрагментов разрушенных клеток некротических тканей. Кроме того, воздействие Тр4/Тр4^0 на более поздних сроках после некроза, способствовало удалению макрофагов из зоны заживления, очищению от фагоцитозного материала, тем самым, предотвращая избыточное образование грануляционной ткани и рубцевание [53].

1.5.2. Tp4 стимулирует ангиогенез и неоваскуляризацию ишемизированного

миокарда

Способность Тр4 индуцировать ангиогенез была впервые показана более 15 лет назад [16,17]. Еще на этапе эмбрионального развития сердца была выявлена существенная роль Тр4 в формировании коронарных сосудов из эмбриональных клеток.

В постнатальный период «дремлющие» резидентные эпикардиальные клетки-предшественники (EPDCs) практически неактивны. В условиях ишемии в зоне эпикарда запускается процесс плюрипотентной активации EPDCs, под действием TP4 усиливается миграция клеток-предшественников из эпикардиальной зоны к миокарду, активируется дифференцировка EPDCs в фибробласты и кардиомиоциты [23,56,58,59]. В качестве механизма индукции дифференцировки EPDCs в новые кардиомиоциты после инфаркта миокарда рассматривается Тр4-индуцированная реактивация специфических эмбриональных генов Wilm's Tumor 1 (Wt1) [60]. Помимо того, что Тр4-опосредованная стимуляция in vivo индуцирует во «взрослых» EPDCs реактивацию экспрессии эмбрионального гена Wt1, такие активированные клетки все же отличаются по фенотипу от эмбриональных EPDCs [61]. Можно выделить особые субпопуляции «взрослых» EPDCs, которые характеризуются экспрессией маркеров Sca-1, CD90 и CD44 с четко выраженной кардиоваскулярным потенциалом дифференцировки [62,63]. Следует отметить, что субпопуляция Тр4-активированных «взрослых» EPDCs с фенотипом Sca-1+ также характеризовалась значительной активацией маркеров фибробластов [64,65].

Таким образом, стимулируя дифференцировку EPDCs в гладкомышечные клетки, эндотелиальные клетки, фибробласты, TP4 создает условия для роста, восстановления мышечного и эндотелиальных слоев коронарных сосудов и заживления раны [66].

Активированные под действием TP4 клетки EPDCs поддерживают васкуляризацию миокарда не только в результате их конечной дифференцировки в зрелые клетки, но и посредством паракринного воздействия [53]. TP4 способен стабилизировать вновь сформированные коронарные сосуды. Так, исследования, проведённые Rossdeutsch и др. [67], установили, что клетки эндотелия секретируют Тр4, необходимый для дифференцировки мезодермальных клеток- предшественников в муральные клетки, формирующие каппиляры (Рис. 4).

Рис. 4. Роль Tp4 в развитии эмбриональной сосудистой системы [67].

На мышиных моделях было продемонстрировано, что эмбрионы, в которых TP4 не секретируется или представлен в виде неактивной молекулы, подвержены сосудистым кровоизлияниями в связи с дефектами развития гладкой мускулатуры в развивающихся сосудах [68].

Как уже упоминалось, фиброзная ткань формируется из фибробластов и нужна для упрочнения ослабленной стенки миокарда после инфаркта, но чрезмерный фиброз ткани ухудшает регенерацию и мешает формированию мышечного слоя и сосудистой сетки в строме миокарда. Предварительное введение Тр4 важно для обеспечения сдвига дифференцировки EPDC в направлении миокардиальных и коронарно-васкулярных клеток, а не фибробластов [64].

Таким образом, TP4 способен проявлять кардиопротекторные свойства, влияя на клеточную миграцию, модулирование воспаления, механизмы дифференцировки клеток-предшественников в специализированные клетки, необходимые для регенерации поврежденного миокарда.

1.5.3. Роль Tp4 в развитии опухолей и метастазировании

Стимулируя клеточную миграцию, адгезию и инвазию, в том числе раковых клеток, Тр4 может усиливать процесс метастазирования [24].

Было обнаружено, что TP4 высоко экспрессируется в развивающихся клетках опухоли, что способствует увеличению потенциала миграции in vitro, онкогенности и активности метастазирования in vivo [69]. Показано, что экспрессия TP4 увеличена в медуллярной карциноме щитовидной железы [70] и опухоли почек [71] по сравнению с клетками нормальной ткани. Clark с коллегами [72] недавно продемонстрировали, что Тр4 может способствовать формированию метастаз клеток меланомы как мыши, так и человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Макаров, Дмитрий Александрович, 2017 год

4. Список литературы

1) Hannappel, E. The thymosins. Prothymosin alpha, parathymosin, and beta-thymosins: structure and function / E. Hannappel, T. Huff // Vitamins and hormones.- 2003. - V. 66.- P. 257-96.

2). Goldstein, A. L. Thymosin P4: actin sequestering protein moonlights to repair injured tissues / A. L. Goldstein, E. Hannappel and H. K. Kleinman // Trends Mol. Med.- 2005.- V. 11.-P. 421- 429.

3) Goldstein, Allan L. Advances in the basic and clinical applications of thymosin b4 / Allan L Goldstein and Hynda K Kleinman // Expert Opin. Biol. Ther. - 2015. - P. 1-7.

4) Anti-inflammatory effects in the skin of thymosin beta4 splice variants / M. Giradi, M. A. Sherling, R. B. Filler, J. Shires, E. Theodoridis, A. C. Hayday, R. E. Tigelaar // Immunology.-2003.- V. 109. - P. 1-7.

5) Biodistribution of synthetic thymosin beta 4 in the serum, urine, and major organs of mice / C.A. Mora , C.A. Baumann, J.E. Paino, A.L. Golstein, M. Badamchian // Int. J. Immunopharmacol.- 1997. - V. 19(1). - P.1-8.

6). Goldstein, A. L. Preparation, assay, and partial purification of the thymic lymphocytopoietic factor (thymosin) / A. L. Goldstein, F. D. Slater and A.White // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.- 1966.- V. 56.- P. 1010 -1017.

7) Purification and properties of bovine thymosin / J.A. Hooper, M.C. McDaniel, G.B. Thurman, G.H. Cohen, R.S. Schulof, A.L. Goldstein // Ann. N. Y. Acad Sci. - 1975. - V. 249. -P. 125-44.

8) Goldstein, A.L. From lab to bedside: emerging clinical applications of thymosin alpha 1 / A.L. Goldstein, A.L. Goldstein // Expert Opin. Biol. Ther. - 2009. - V. 9(5). - P. 593-608.

9). Mannherz, H. G. The beta thymosins: Intracellular and extracellular activities of a versatile actin binding protein family / H. G. Mannherz and E. Hannappel // Cell Motil. Cytoskeleton. - 2009. - V. 66. - P. 839 - 851.

10). Thymosin beta10, a new analog of thymosin beta4 in mammalian tissues / S. Erickson-Viitanen , S. Ruggieri , P. Natalini , B.L. Horecker // Arch. Biochem. Biophys. - 1983. - V. 225. - P. 407-13.

11) Baynard, J. Thymosin beta-NB is the human isoform of rat thymosin beta15 / J. Baynard, L.M. Hutchinson, B.R. Zetter // Ann N. Y. Acad. Sci. - 2007. - V. 1112. -P. 286-96.

12) Biological activities of thymosin 4 defined by activesites in short peptide sequences / Gabriel Sosne, Ping Qiu, Allan L. Goldstein and Michelle Wheater // The FASEB Journal. -2010. - V. 24. - P. 2144- 2151.

13). Safer, D. Thymosin beta 4 and Tx, an actin-sequestering peptide, are indistinguishable / D. Safer, M. Elzinga and V. T. Nachmias // J. Biol. Chem. - 1991. -V. 266. - P. 4029 -4032.

14). Malinda, K. M. Thymosin beta 4 stimulates directional migration of human umbilical vein endothelial cells / K. M. Malinda, A. L. Goldstein and H. K. Kleinman // FASEB J. - 1997. V. 11. - P. 474 - 481.

15) Spatial coordination of actin polymerization and ILK-Akt2 activity during endothelial cell migration / Y. Fan, Y. Gong, P. K. Ghosh, L. M. Graham and P. L. Fox // Dev. Cell. - 2009.

- V. 16. -P. 661- 674

16). The actin- binding site on thymosin P4 promotes angiogenesis / D. Philp, T. Huff, Y.S. Gho, E. Hannappel and H. K. Kleinman // FASEB J. - 2003. - V.17. - P. 2103-2105.

17) Matrigel induces thymosin beta4 gene in differentiating endothelial cells / D.S. Grant, J.L. Kinsella, M.C. Kibbey, S. LaFlamme, P.D. Burbelo, A. L. Goldstein and H. K. Kleinman // J. Cell Sci. - 1995. - V. 108. - P. 3685-3694.

18) Malinda, K. Thymosin beta 4 accelerates wound healing / K. Malinda, A.L. Goldstein and H. K. Kleinman // J. Invest. Dermatol. - 1999. -V.113. - P. 364 -368.

19) Recombinant thymosin beta 4 can promote full thickness cutaneous wound healing / X. Li, L. Zheng, F. Peng, C. Qi, X. Zhang, A. Zhou, Z. Liu and S. Wu // Protein Expr. Purif. - 2007.

- V. 56. - P. 229 -236.

20). Thymosin beta4 promotes corneal wound healing and modulates inflammatory mediators in vivo / G. Sosne, C.C. Chan, K. Thai, M. Kennedy, E. A. Szliter, L.D. Hazlett and H.K. Kleinman // Exp. Eye Res. - 2001. - V.72. - P. 605- 608.

21) Thymosin beta 4 promotes corneal wound healing and decreases inflammation in vivo following alkali injury / G. Sosne, E.A. Szliter, R. Barrett, K.A. Kernacki, H. Kleinman and L.D. Hazlett // Exp. Eye Res. - 2002. - V.74(2). - P. 293-299.

22) Thymosin P4 increases hair growth by activation of hair follicle stem cells / D. Philp, M. Nguyen, B. Scheremeta, S. St-Surin, A.M. Villa, A. Orgel, H.K. Kleinman and M. Elkin // The FASEB journal. - 2004. - V. 18(2). - P. 385-387.

23). Thymosin beta 4 induces adult epicardial progenitor mobilization and neovascularization / N. Smart, C.A. Risebro, A.A.D. Melville, K. Moses, R.J. Schwartz, K.R. Chien and P R. Riley // Nature. - 2007. - V. 445(7124). - P. 177-182.

24) Cha, H.-J.Role of thymosin P4 in tumor metastasis and angiogenesis / H.-J. Cha, M.-J. Jeong and H.K. Kleinman // Journal of the National Cancer Institute. - 2003. - V. 95(22). - P. 1674-1680.

25) Solution conformation of thymosin beta 4: a nuclear magnetic resonance and simulated annealing study / J. Zarbock , H. Oschkinat , E. Hannappel , H. Kalbacher , W. Voelter , T.A. Holak // Biochemistry. - 1990. - V. 29. - №. 34. - P. 7814-7821.

26) Conformation of thymosin P4 in water determined by NMR spectroscopy / M. Czisch, M. Schleicher, S. Horger, W. Voelter, T.A. Holak //European Journal of Biochemistry. - 1993. -V. 218(2). - P. 335-344.

27) Thymosin beta4: structure, function, and biological properties supporting current and future clinical applications / D. Crockford, N. Turjman, C. Allan, J. Angel // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2010. - V. 1194(1). - P. 179-189.

28) Low, Teresa L. K. Solid-Phase Synthesis of Thymosin beta 4: Chemical and Biological Characterization of the Synthetic Peptide / Teresa L. K. Low, Su-Sun Wang and Allan L. Goldstein // Biochemistry. - 1983. - V. 22(4). - P. 733-740.

29) Abiko, T. Deacetyl-thymosin P4: Synthesis and effect the impaired peripheral T-cell subsets in patients with chronic renal failure / T. Abiko, H. Sekino // Chemical and pharmaceutical bulletin. - 1984. - T. 32. - №. 11. - C. 4497-4505.

30) Abiko, T. Synthesis of a new biological response modifier thymosin beta 4 analogue and its restorative effect on depressed / Takashi Abiko and Hiroshi Sekino // Mediators of inflammation. - 1992. - V. 1(2). - P. 113-119.

31) Abiko, T. Synthesis of six common amino acid sequence fragments of thymosins P4, P8 and P9 and determination of their effects on the low E-rosette forming cells of lupus nephritis patients / Abiko T, Sekino H. //Chemical and pharmaceutical bulletin. - 1984. - V. 32(1). - P. 228-236.

32) Synthesis and characterization of the N - terminal acetylated 17-23 fragment of thymosin beta 4 identified in TB - 500, a product suspected to possess doping potential / Simone Esposito, Koen Deventer, Jan Goeman, Johan Van der Eyckenb and Peter Van Eenooa //Drug testing and analysis. - 2012. - V. 4. - №. 9. - P. 733-738.

33) Ho, J.H. Internalization is essential for the antiapoptotic effects of exogenous thymosin P-4 on human corneal epithelial cells / J.H. Ho, C.H. Chuang, C.Y. Ho, Y.R. Shih, O.K. Lee, Y. Su // Investigative ophthalmology & visual science. - 2007. - V. 48(1). - P. 27-33.

34) Production and characterization of highly purified recombinant thymosin beta 4 in Escherichia coli / Li Teng, Ma Su-Yong, Tang Xiao-Chuang, Nie Li-Ya, Huang He // Protein expression and purification. - 2013. - V. 90(2). - P. 90-95.

35) Recombinant thymosin P4 can promote full-thickness cutaneous wound healing / X. Li, L. Zheng, F. Peng, C. Qi, X. Zhang, A. Zhou, Z. Liu, S. Wu // Protein Expr. Purif. - 2007. -V.56(2). - P.229-36.

36) Biotechnological production of acetylated thymosin beta4/ K.A. Beîrakhova, V.N. Stepanenko, A.I. Miroshnikov, R.S. Esipov // Bioorg Khim. - 2011. - V.37(2). - P. 223-32.

37) Evans D. A. P. N-acetyltransferase / D. A. P. Evans // Pharmacology & therapeutics. -1989. - V. 42(2). - P. 157-234

38) Thinon, E. Chemical Reporters for Exploring Protein Acylation / Emmanuelle Thinon and Howard C. Hang // Biochemical Society Transactions. - 2015. - V. 43(2). - P. 253-261.

39) Varland, S. N - terminal modifications of cellular proteins: The enzymes involved, their substrate specificities and biological effects / S. Varland, C. Osberg, T. Arnesen // Proteomics. - 2015. - V. 15(14). - P. 2385-2401.

40) Polevoda, B. Composition and function of the eukaryotic N-terminal acetyltransferase subunits / B. Polevoda, F. Sherman // Biochemical and biophysical research communications. -2003. - V. 308(1). - P. 1-11.

41) Identification and specificities of N-terminal acetyltransferases from Saccharomyces cerevisiae / B. Polevoda, J. Norbeck, H. Takakura, A. Blomberg, F. Sherman // EMBO J. - 1999. - V. 18(21). - P. 6155-6168.

42) Identification and characterization of the human ARD1-NATH protein acetyltransferase complex / Thomas Arnesen, Dave Anderson,Christian Baldersheim, Michel Lanotte, Jan E. Varhaug and Johan R. Lillehaug //Biochemical Journal. - 2005. - V. 386(3). - P. 433-443.

43) Identification of the human N(alpha) - acetyltransferase complex B (hNatB): a complex important for cell-cycle progression / K.K. Starheim, T. Arnesen, D. Gromyko, A. Ryningen, J.E. Varhaug, J R. Lillehaug // Biochemical Journal. - 2008. - V. 415(2). - P. 325-331.

44) N-terminal acetylome analyses and functional insights of the N-terminal acetyltransferase NatB / Petra Van Damme, Marta Lasa, Bogdan Polevoda, Cristina Gazquez, Alberto Elosegui-Artola, Duk Soo Kim, Elena De Juan-Pardo, Kimberly Demeyer, Kristine Hole, Esther Larrea, Evy Timmerman, Jesus Prieto, Thomas Arnesen, Fred Sherman, Kris Gevaert and Rafael Aldabe // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2012. - V. 109(31). - P. 12449-12454.

45) Knockdown of human N alpha-terminal acetyltransferase complex C leads to p53-dependent apoptosis and aberrant human Arl8b localization / Kristian K. Starheim, Darina Gromyko, Rune Evjenth, Anita Ryningen, Jan Erik Varhaug, Johan R. Lillehaug and Thomas Arnesen // Molecular and cellular biology. - 2009. - V. 29(13). - P. 3569-3581.

46) Polevoda, B. N-terminal acetyltransferases and sequence requirements for N-terminal acetylation of eukaryotic proteins / B. Polevoda, F. Sherman //Journal of molecular biology. -2003. - V. 325. - №. 4. - P. 595-622.

47) Cloning and molecular characterization of the gene rimL which encodes an enzyme acetylating ribosomal protein L 12 of Escherichia coli K 12 / S. Tanaka, Y. Matsushita, A. Yoshikawa, and K. Isono // Molecular and General Genetics. - 1989. - V. 217. - №. 2. - P. 289293.

48) Cloning and nucleotide sequencing of the genes rimI and rimJ which encode enzymes acetylating ribosomal proteins S18 and S5 of Escherichia coli K12 / A. Yoshikawa, S. Isono, A. Sheback and K. Isono // Molecular and General Genetics MGG. - 1987. - V. 209. - №. 3. - P. 481-488.

49) Production of N a -acetylated thymosinal in Escherichia coli / R. Yuantao, Y. Xueqin, D. Hongmei, L. Shulong, F. Hongqing, C. Huipeng and Z. Changlin // Microbial cell factories. -2011. - V. 10. - №. 1. - P. 1.

50) Thymosin beta4 activates integrin- linked kinas and promotes cardiac cell migration, survival and cardiac repair / Ildiko Bock-Marquette, Ankur Saxena, Michael D. White, J. Michael DiMaio & Deepak Srivastava // Nature. - 2004. - V. 432(7016). - P. 466-472.

51) van Berlo, J.H. An emerging consensus on cardiac regeneration / J.H. van Berlo, J.D. Molkentin // Nature medicine. - 2014. - V. 20(12). - P. 1386-1393.

52) Kupatt, C. Embryonic endothelial progenitor cell-mediated cardioprotection requires Thymosin beta4 / C. Kupatt, I. Bock-Marquette, P. Boekstegers // Trends in cardiovascular medicine. - 2008. - V. 18(6).- P. 205-210.

53) Bollini, S. Thymosin P4: multiple functions in protection, repair and regeneration of the mammalian heart / S. Bollini, P.R. Riley, N. Smart // Expert opinion on biological therapy. -2015. - V. 15(1). - P. 163-174.

54) Frangogiannis, N.G. The immune system and cardiac repair / N.G. Frangogiannis // Pharmacological research. - 2008. - V. 58(2). - P. 88-111.

55) Frangogiannis, N.G. Targeting the inflammatory response in healing myocardial infarcts / N.G. Frangogiannis // Current medicinal chemistry. - 2006. - V. 13(16). - P. 18771893.

56) Elevated peripheral blood mononuclear cell count is an independent predictor of left ventricular remodeling in patients with acute myocardial infarction / Satoshi Aoki, Akihiro Nakagomi, Kuniya Asai, Hitoshi Takano, Masahiro Yasutake, Yoshihiko Seino, Kyoichi Mizuno // Journal of cardiology. - 2011. - V. 57(2). - P. 202-207.

57) Thymosin p4-sulfoxide attenuates inflammatory cell infiltration and promotes cardiac wound healing / Mark A. Evans, Nicola Smart, Karina N. Dubé, Sveva Bollini, James E. Clark, Hayley G. Evans, Leonie S. Taams, Rebecca Richardson, Mathieu Lévesque, Paul Martin, Kevin

Mills, Johannes Riegler, Anthony N. Price, Mark F. Lythgoe and Paul R. Riley // Nature communications. - 2013. - V. 4.

58) Thymosin beta4 facilitates epicardial neovascularization of the injured adult heart / N. Smart, C.A. Risebro, J.E. Clark, E. Ehler, L. Miquerol, A. Rossdeutsch, M.S. Marber, P R. Riley // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2010. - V. 1194(1). - P. 97-104.

59) In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes / Li Qian, Yu Huang, C. Ian Spencer, Amy Foley, Vasanth Vedantham, Lei Liu, Simon J. Conway, Ji-dong Fu & Deepak Srivastava // Nature. - 2012. - V. 485(7400). - P. 593-598.

60) De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury / Nicola Smart, Sveva Bollini, Karina N. Dube, Joaquim M. Vieira, Bin Zhou, Sean Davidson, Derek Yellon, Johannes Riegler, Anthony N. Price, Mark F. Lythgoe, William T. Pu & Paul R. Riley // Nature. - 2011. - V. 474(7353). - P. 640-644.

61) Re-activated adult epicardial progenitor cells are a heterogeneous population molecularly distinct from their embryonic counterparts / Sveva Bollini, Joaquim Miguel Nunes Vieira, Sara Howard, Karina Natasha Dube, Gemma Mary Balmer, Nicola Smart and Paul Richard Riley. // Stem cells and development. - 2014. - V. 23(15). - P. 1719-1730.

62) Postnatal isl1+ cardioblasts enter fully differentiated cardiomyocyte lineages / K.-L. Laugwitz, A.Moretti, J.Lam, P.Gruber, Y.Chen, S.Woodard, L.-Z.Lin, C.-L.Cai, M.M.Lu, M.Reth, O. Platoshyn, J.X.-J.Yuan, S. Evans, K.R. Chien // Nature. - 2007. - V. 446. - P. 934

63) Martin-Puig, S. Lives of a heart cell: tracing the origins of cardiac progenitors / S. Martin-Puig, Z. Wang, K.R. Chien // Cell stem cell. - 2008. - V. 2(4). - P. 320-331.

64) Thymosin beta 4 treatment after myocardial infarction does not reprogram epicardial cells into cardiomyocytes / Bin Zhou, Leah B. Honor, Qing Ma, Jin-Hee Oh, Ruei-Zeng Lin, Juan M. Melero-Martin, Alexander von Gise, Pingzhu Zhou, Tianyuan Hu, Lingjuan He, Kai Hong Wu, Hui Zhang, Yuebo Zhang William T. Pu // Journal of molecular and cellular cardiology. - 2012. - V. 52(1). - P. 43-47.

65) Characterization of epicardial-derived cardiac interstitial cells: differentiation and mobilization of heart fibroblast progenitors / A. Ruiz-Villalba, A. Ziogas, M. Ehrbar, J.M. Perez-Pomares // PloS one. - 2013. - V. 8(1). - P. e53694.

66) Winter, E.M. Epicardium-derived cells in cardiogenesis and cardiac regeneration/ E.M. Winter, A C. Gittenberger-de Groot // Cell Mol. Life Sci. - 2007. - V. 64(6). - P. 692-703.

67) Essential role for thymosin beta4 in regulating vascular smooth muscle cell development and vessel wall stability/ A. Rossdeutsch, N. Smart, K.N. Dube, M. Turner and P R. Riley // Circulation research. - 2012. - V. 111. - №. 4. - P. e89-e102.

68) Smart, N. Identification of Thymosin beta4 as an effector of Hand1-mediated vascular development / N. Smart, K.N. Dube, P.R. Riley // Nature communications. - 2010. - V. 1. - P. 46.

69) Roles and mechanisms of P-thymosins in cell migration and cancer metastasis: an update / S. Sribenja, S. Wongkham, C. Wongkham, Q. Yao, C. Chen // Cancer investigation. -2013. - V. 31. - №. 2. - P. 103-110.

70) Isolation and structural characterization of thymosin-beta 4 from a human medullary thyroid carcinoma / J.M. Conlon, L. Grimelius, G. Wallin, L. Thim // Journal of endocrinology.

- 1988. - V. 118. - №. 1. - P. 155-159.

71) Hall, A.K: Differential expression of thymosin genes in human tumors and in the developing human kidney / A.K. Hall // International journal of cancer. - 1991. - V. 48. - №. 5.

- C. 672-677.

72) Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for Rho C / E.A. Clark, T.R. Golub, E.S. Lander, R.O. Hynes // Nature. - 2000. - V. 406. - №. 6795. - P. 532-535.

73) Thymosin beta-4 expression is correlated with metastatic capacity of colorectal carcinomas / T. Yamamoto, M. Gotoh, M. Kitajima, S. Hirohashi // Biochemical and biophysical research communications. - 1993. - V. 193. - №. 2. - P. 706-710.

74) Thymosin-beta4 regulates motility and metastasis of malignant mouse fibrosarcoma cells / T. Kobayashi, F. Okada, N. Fujii, N. Tomita, S. Ito, H. Tazawa, T. Aoyama, S.K. Choi, T. Shibata, H. Fujita, M. Hosokawa // The American journal of pathology. - 2002. - V. 160. - №. 3. - P. 869-882.

75) Thymosin beta 4 enhances NK cell cytotoxicity mediated by ICAM-1 / Ha-reum Lee, Sun Young Yoon, Ho-Bum Kang, Sunyoung Park, Kyung-Eun Kim, Young Hoon Cho, Seonghan Kim, Chul-woo Kimd, Byung Joo Cho, Wang Jae Lee, Sa Ik Bang, Hyunjeong Park , Daeho Cho // Immunology letters. - 2009. - V. 123. - №. 1. - P. 72-76.

76) The regenerative peptide thymosin b4 accelerates the rate of dermal healing in preclinical animal models and in patients / T. Treadwell, H.K. Kleinman, D. Crockford, M.A. Hardy, G.T. Guarnera, A.L. Goldstein // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2012.

- V. 1270. - №. 1. - P. 37-44.

77) Thymosin Beta-4 Induces Mouse Hair Growth / X. Gao, H. Liang, F. Hou, Z. Zhang, M. Nuo, X. Guo, D. Liu // PloS one. - 2015. - V. 10. - №. 6. - P. e0130040.

78) Structural basis of actin sequestration by thymosin-beta4: implications for WH2 proteins / E. Irobi, A.H. Aguda, M. Larsson, C. Guerin, H.L. Yin, L.D. Burtnick, L. Blanchoin, R.C. Robinson // The EMBO journal. - 2004. - V. 23. - №. 18. - P. 3599-3608.

79) Structural basis of thymosin-ß4 / profilin exchange leading to actin filament polymerization / B. Xue, C. Leyrat, J.M. Grimes, R.C. Robinson // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2014. - V. 111. - №. 43. - P. E4596-E4605.

80) G- to F-actin modulation by a single amino acid substitution in the actin binding site of actobindin and thymosin beta 4 / K. Vancompernolle, M. Goethals, C. Huet, D. Louvard, J. Vandekerckhove // The EMBO journal. - 1992. - V. 11. - №. 13. - P. 4739.

81) The LIM-only protein PINCH directly interacts with integrin-linked kinase and is recruited to integrin-rich sites in spreading cells / Y. Tu, F. Li, S. Goicoechea, C. Wu // Molecular and cellular biology. - 1999. - V. 19. - №. 3. - P. 2425-2434.

82) Integrin-linked kinase is responsible for Ca2+-independent myosin diphosphorylation and contraction of vascular smooth muscle / D. P. Wilson, C. Sutherland, M. A. Borman, J. T. Deng, J. A. MacDonald and M. P. Walsh // Biochemical Journal. - 2005. - V. 392. - №. 3. - P. 641-648.

83) Jaafar, L. The Effect of Thymosin Beta 4 on Cell Mechanics and Motility: ahc ... phD: 6.06.2014. / Leila Jaafar. - Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (FAU), 2014. -C. 98.

84) The integrin-linked kinase regulates cell morphology and motility in a rho-associated kinase-dependent manner / W.A. Khyrul, D.P. LaLonde, M.C. Brown, H. Levinson and C.E. Turner // Journal of Biological Chemistry. - 2004. - V. 279. - №. 52. - P. 54131-54139.

85) Integrin-linked kinase controls vascular wall formation by negatively regulating Rho/ROCK-mediated vascular smooth muscle cell contraction / N. Kogata, R.M. Tribe, R. Fässler, M. Way and R.H. Adams // Genes & development. - 2009. - V. 23. - №. 19. - P. 22782283.

86) Cell migration: integrating signals from front to back / Anne J. Ridley, Martin A. Schwartz, Keith Burridge, Richard A. Firtel, Mark H. Ginsberg, Gary Borisy, J. Thomas Parsons, Alan Rick Horwitz // Science. - 2003. - V. 302. - №. 5651. - P. 1704-1709.

87) Overexpression of thymosin beta 4 increases pseudopodia formation in LNCaP prostate cancer cells / M. Ito, K. Iguchi, S. Usui, K. Hirano // Biological and Pharmaceutical Bulletin. - 2009. - V. 32. - №. 6. - P. 1101-1104.

88) In vivo growth suppression of CT-26 mouse colorectal cancer cells by adenovirus-expressed small hairpin RNA specifically targeting thymosin beta-4 mRNA / T.C. Chao, L.C. Chan, S.Y. Ju, M-C Tang, C-Y Liu, P.M. Chen, C.H. Tzeng and Y. Su // Cancer gene therapy. -2014. - V. 21. - №. 9. - P. 389-396.

89) Thymosin beta 4 induces invasion and migration of human colorectal cancer cells through the ILK/AKT/b-catenin signaling pathway / Zhengri Piao, Chang-Soo Hong, Mi-Ran

Jung, Chan Choi, Young-Kyu Parka // Biochemical and biophysical research communications. -2014. - V. 452. - №. 3. - P. 858-864.

90) Hypoxia/reoxygenation-experienced cancer cell migration and metastasis are regulated by Rap1- and Rac1-GTPase activation via the expression of thymosin beta-4 / Jae-Wook Lee, Yun-Kyoung Ryu, Young-Hoon Ji, Joo Hyun Kang, Eun-Yi Moon // Oncotarget. - 2015. - V. 6.

- №. 12. - P. 9820.

91) Caught in the act: in vivo molecular imaging of the transcription factor NF-kappaB after myocardial infarction / Jochen Tillmanns, Harald Carlsen, Rune Blomhoff, Guro Valen, Laura Calvillo, Georg Ertl, Johann Bauersachs, Stefan Frantz // Biochemical and biophysical research communications. - 2006. - V. 342. - №. 3. - P. 773-774.

92) Hall, G. Regulating the regulator: NF-kappaB signaling in heart / G. Hall, J.D. Hasday, T.B. Rogers // Journal of molecular and cellular cardiology. - 2006. - V. 41. - №. 4. - P. 580591.

93) Thymosin beta 4 suppression of corrneal NFKappaB: a potential anti-inflammatory pathway / G. Sosne, P. Qui, P. L.Christopherson and M. K. Wheater// Experimental eye research.

- 2007. - V. 84. - №. 4. - P. 663-669.

94) Gene therapy in vascular medicine: recent advances and future perspectives / R. Morishita, M. Aoki, Y. Kaneda, T. Ogihara // Pharmacology & therapeutics. - 2001. - V. 91. -№. 2. - P. 105-114.

95) Nuclear factor-kappaB protects the adult cardiac myocyte against ischemia- induced apoptosis in a murine model of acute myocardial infarction / Arunima Misra, Sandra B. Haudek, Pascal Knuefermann, Jesus G. Vallejo, Zhijian J. Chen, Lloyd H. Michael, Natarajan Sivasubramanian, Eric N. Olson, Mark L. Entman, Douglas L. Mann // Circulation. - 2003. - V. 108. - №. 25. - P. 3075-3078.

96) PINCH-1 is an obligate partner of integrin-linked kinase (ILK) functioning in cell shape modulation, motility, and survival / T. Fukuda, K. Chen, X. Shi, C. Wu // Journal of Biological Chemistry. - 2003. - V. 278. - №. 51. - P. 51324-51333.

97) Early stage-specific inhibitions of cardiomyocyte differentiation and expression of Csx/Nkx-2.5 and GATA-4 by phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor LY294002 / Atsuhiko T. Naito, Aki Tominaga, Masahito Oyamada, Yumiko Oyamada, Isao Shiraishi, Koshiro Monzen, Issei Komuro, Tetsuro Takamatsu // Experimental cell research. - 2003. - V. 291. - №. 1. - P. 56-69.

98) McDevitt, T.C. Proliferation of cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells is mediated via the IGF/PI 3-kinase/Akt signaling pathway / T.C. McDevitt, M.A.

Laflamme, C.E. Murry // Journal of molecular and cellular cardiology. - 2005. - V. 39. - №. 6. -P. 865-873.

99) Shiojima, I. Regulation of cardiac growth and coronary angiogenesis by the Akt/PKB signaling pathway / I. Shiojima, K.Walsh // Genes & development. - 2006. - V. 20. - №. 24. -P. 3347-3365.

100) Akt promotes survival of cardiomyocytes in vitro and protects against ischemia-reperfusion injury in mouse heart / Y. Fujio, T. Nguyen, D. Wencker, R. N. Kitsis and K. Walsh // Circulation. - 2000. - V. 101. - №. 6. - P. 660-667.

101) MRTF-A controls vessel growth and maturation by increasing the expression of CCN1 and CCN2 / Rabea Hinkel, Teresa Trenkwalder, Björn Petersen, Wira Husada, Florian Gesenhues, Seungmin Lee, Ewald Hannappel, Ildiko Bock-Marquette, Daniel Theisen, Laura Leitner, Peter Boekstegers, Czeslaw Cierniewski, Oliver J. Müller, Ferdinand le Noble, Ralf H. Adams, Christine Weinl, Alfred Nordheim, Bruno Reichart, Christian Weber, Eric Olson, Guido Posern, Elisabeth Deindl, Heiner Niemann and Christian Kupatt // Nature communications. -2014. - V. 5.

102) Mechanical regulation of the proangiogenic factor CCN1/CYR61 gene requires the combined activities of MRTF-A and CREB-binding protein histone acetyltransferase / Mary Hanna, Haibo Liu, Jawaria Amir, Yi Sun, Stephan W. Morris, M.A.Q. Siddiqui, Lester F. Lau and Brahim Chaqour // Journal of Biological Chemistry. - 2009. - V. 284. - №. 34. - P. 2312523136.

103) CCN2/connective tissue growth factor is essential for pericyte adhesion and endothelial basement membrane formation during angiogenesis / Faith Hall-Glenn ,R. Andrea De Young ,Bau-Lin Huang, Ben van Handel, Jennifer J. Hofmann, Tom T. Chen, Aaron Choi, Jessica R. Ong, Paul D. Benya, Hanna Mikkola, M. Luisa Iruela-Arispe, Karen M. Lyons // PloS one. - 2012. - V. 7. - №. 2. - P. e30562

104) Role of thymosin beta 4 in hair growth / X.Y. Gao, F. Hou, Z.P. Zhang, M.T. Nuo, H. Liang, M. Cang, Z.G. Wang, X. Wang, T. Xu, L.Y. Yan, X.D. Guo, D.J. Liu // Molecular Genetics and Genomics. - 2016. - P. 1-8.

105) Thymosin beta4 mediated PKC activation is essential to initiate the embryonic coronary developmental program and epicardial progenitor cell activation in adult mice in vivo / Ildiko Bock-Marquette, Santwana Shrivastava, G.C. Teg Pipes, Jeffrey E. Thatcher, Allissa Blystone, John M. Shelton, Cristi L. Galindo, Bela Melegh, Deepak Srivastava, Eric N. Olson, J. Michael DiMaio // Journal of molecular and cellular cardiology. - 2009. - V. 46. - №. 5. - P. 728-738.

106) Thymosin beta4 is an essential paracrine factor of embryonic endothelial progenitor cell-mediated cardioprotection / Rabea Hinkel, Chiraz El-Aouni, Tonia Olson, Jan Horstkotte, Stefan Mayer, Sebastian Müller, Michael Willhauck, Christine Spitzweg, Franz-Josef Gildehaus, Wolfgang Münzing, Ewald Hannappel, Ildiko Bock-Marquette, J. Michael DiMaio, Antonis K. Hatzopoulos, Peter Boekstegers and Christian Kupatt // Circulation. - 2008. - V. 117. - №. 17. -P. 2232-2240.

107) Pipes, G. T. Cardioprotection by systemic dosing of thymosin beta four following ischemic myocardial injury/ G. T. Pipes //Frontiers in pharmacology. - 2013. - V. 4. - P. 149.

108) Stimulation of adult resident cardiac progenitor cells by durable myocardial expression of thymosin beta 4 with ultrasound-targeted microbubble delivery / S. Chen, M. Shimoda, J. Chen, P.A. Grayburn // Gene therapy. - 2013. - V. 20. - №. 2. - P. 225-233.

109) Adeno-associated viral vector 2.9 thymosin ss4 application attenuates rejection after heart transplantation: results of a preclinical study in the pig / Johannes Postrach, Maximilian Schmidt, Michael Thormann, Eckart Thein, Lars Burdorf, Bruno Reichart, Karl Sotlar, Christoph Walz, Claudius Faber, Andreas Bauer, Michael Schmoeckel, Christian Kupatt, Rabea Hinkel // Transplantation. - 2014. - V. 98. - №. 8. - P. 835-843

110) Chiu, L.L. Controlled release of thymosin beta4 using collagen- chitosan composite hydrogels promotes epicardial cell migration and angiogenesis / L.L. Chiu, M. Radisic // Journal of controlled release. - 2011. - V. 155. - №. 3. - P. 376-385.

111) Cardiac tissue engineering: current state and perspectives / L.L. Chiu, R.K. Iyer, L.A. Reis, S.S. Nunes and M. Radisic// Frontiers in bioscience (Landmark edition). - 2011. - V. 17. -P.1533-1550.

112) Controlled release of thymosin Beta 4 using a collagen-chitosan sponge scaffold augments cutaneous wound healing and increases angiogenesis in diabetic rats with hindlimb ischemia / Dongdong Ti, Haojie Hao, Lei Xia, Chuan Tong, Jiejie Liu, Liang Dong, Shenjun Xu, Yali Zhao, Huiling Liu, Xiaobing Fu and Weidong Han // Tissue Engineering Part A. - 2014. -V. 21. - №. 3-4. - P. 541-549.

113) Controlled release of thymosin beta4 from injected collagen- chitosan hydrogels promotes angiogenesis and prevents tissue loss after myocardial infarction / L.L. Chiu, L.A. Reis, A. Momen, M. Radisic // Regenerative medicine. - 2012. - V. 7. - №. 4. - P. 523-533.

114) Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction / Thomas P. Kraehenbuehl, Lino S. Ferreira, Alison M. Hayward, Matthias Nahrendorf, André J. van der Vlies, Eliza Vasile, Ralph Weissleder, Robert Langer, Jeffrey A. Hubbell // Biomaterials. - 2011. - V. 32. - №. 4. - P. 1102-1109.

115) Thymosin beta4 increases the potency of transplanted mesenchymal stem cells for myocardial repair / L.Ye, P. Zhang, S. Duval, L. Su, Q. Xiong and J. Zhang // Circulation. -

2013. - V. 128. - №. 11 suppl 1. - P. S32-S41.

116) Perfusable branching microvessel bed for vascularization of engineered tissues / L. L. Chiu, M. Montgomery, Y. Liang, H. Liu and M. Radisic // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2012. - V. 109. - №. 50. - P. E3414-E3423.

117) Thymosin beta4 coated nanofiber scaffolds for the repair of damaged cardiac tissue / A. Kumar, A. Patel, L. Duvalsaint, M. Desai and E.D. Marks // Journal of nanobiotechnology. -

2014. - V. 12. - №. 1. - P. 1.

118) Rudat, C. Wt1 and epicardial fate mapping / C. Rudat, A. Kispert // Circulation research. - 2012. - V. 111. - №. 2. - P. 165-169.

119) Thymosin P4. Actin Regulation and More / Elena G. Yarmola, Evguenia S. Klimenko, Go Fujita and Michael R. Bubbann // N.Y. Acad. Sci. - 2007. - V. 1112. - P. 76-85.

120) Thymosin beta 4 sulfoxide is an anti-inflammatory agent generated by monocytes in the presence of glucocorticoids / J.D. Young, A.J. Lawrence, A.G. MacLean, P. Leung, I.B. McInnes, B. Canas, D.J. Pappin and R.D. Stevenson // Nature medicine. - 1999. - V. 5. - №. 12.

- P. 1424-1427.

121) Muscle injury-induced thymosin P4 acts as a chemoattractant for myoblasts / Yuka Tokura, Yuki Nakayama, So-ichiro Fukada, Noriko Nara, Hiroshi Yamamoto, Ryoichi Matsuda and Takahiko Hara // Journal of biochemistry. - 2011. - V. 149. - №. 1. - P. 43-48.

122) beta-Thymosins, small acidic peptides with multiple functions / T. Huff, C.S. Müller, A.M. Otto, R. Netzker and E. Hannappel // The international journal of biochemistry & cell biology. - 2001. - V. 33. - №. 3. - P. 205-220.

123) HPLCESI-MS analysis of oral human fluids reveals that gingival crevicular fluid is the main source of oral thymosins beta(4) and beta(10) / R. Inzitari, T. Cabras, E. Pisano, C. Fanali, B. Manconi, E. Scarano, A. Fiorita, G. Paludetti, A. Manni, S. Nemolato, G. Faa, M. Castagnola, I. Messana // Journal of separation science. - 2009. - V. 32. - №. 1. - P. 57-63.

124) Oxidation of either methionine 351 or methionine 358 in alpha 1-antitrypsin causes loss of anti-neutrophil elastase activity / C. Taggart, D. Cervantes-Laurean, G. Kim, N.G. McElvaney, N. Wehr, J. Moss, R.L:Levine // Journal of Biological Chemistry. - 2000. - V. 275.

- №. 35. - P. 27258-27265.

125) P-thymosins and interstitial lung disease: study of a scleroderma cohort with a one-year follow-up / Maria De Santis, Rosanna Inzitari, Silvia L. Bosello, Giusy Peluso, Chiara Fanali, Federica Iavarone, Gaetano Zizzo, Mario Bocci, Tiziana Cabras, Irene Messana,

Leo Fuso, Francesco Varone, Gabriella Pagliari, Massimo Castagnola and Gianfranco Ferraccioli // Respiratory research. - 2011. - V. 12. - №. 1. - P. 1.

126). Goldstein, A.L. Advances in the basic and clinical applications of thymosin P4 / A.L. Goldstein , H.K. Kleinman // Expert opinion on biological therapy. - 2015. - V. 15. - №. supl. -P. 139-145.

127) N-Acetyl-Seryl-Aspartyl-Lysyl-Proline (Ac-SDKP) Delays the Development of Hypertension and Renal Damage in Systemic Lupus Erythematosus (SLE) / Pablo Nakagawa, T-

D. Liao, M. Worou, H. Basha, E. Peterson, B. Janic, X-P. Yang, N-E. Rhaleb and Oscar Carretero. // The FASEB Journal. - 2015. - V. 29. - №. 1 Supplement. - P. 667.7.

128) N-Acetyl-Seryl-Aspartyl-Lysyl-Proline: mechanisms of renal protection in mouse model of systemic lupus erythematosus / Tang-Dong Liao, Pablo Nakagawa, Branislava Janic, Martin D'Ambrosio, Morel E. Worou, Edward L. Peterson, Nour-Eddine Rhaleb, Xiao-Ping Yang, Oscar A. Carretero // American Journal of Physiology-Renal Physiology. - 2015. - V. 308. - №. 10. - P. F1146-F1154.

129) High plasma level of N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline: a new marker of chronic angiotensin-converting enzyme inhibition / M. Azizi, E. Ezan, L. Nicolet, J. M. Grognet and J. Menard // Hypertension. - 1997. - V. 30. - №. 5. - P. 1015-1019.

130) Prolyly oligopeptidase is involved in release of the anti fibrotic peptide As-SDKP / M. A.Cavasin, N.E. Rhaleb, X.P. Yang and O.A. Carretero // Hypertension. - 2004. - V. 43. -№. 5. - P. 1140-1145.

131) Reduction of cardiac fibrosis decreases systolic performance with an affect on diastolic function in hypertensive rats / O.H. Cingolani, X-P. Yang, Y-H. Liu, M. Villanueva, N.

E. Rhaleb and O.A. Carretero // Hypertension. - 2004. - V. 43. - №. 5. - P. 1067-1073.

132) Inhibition of human bone marrow progenitors by the synthetic tetrapeptide AcSDKP / M. Guigon, D. Bonnet, F.M. Lemoine, L. Kobari, C. Permentier, J.Y. Mary and A. Najman // Experimental hematology. - 1990. - V. 18. - №. 10. - P. 1112-1115.

133) Decreased endogenous levels of Ac- SDKP promote organ fibrosis / M.A. Cavasin, T.D. Lioa, X.Z.P. Yang, J.J. Yang and O.A. Carretero // Hypertension. - 2007. - V. 50. - №. 1. -P. 130-136.

134) AcSDKP reverses inflamma- tion and fibrosis in rats with heart failure after myocardial infarction / F. Yang, X.P. Yang, Y.H. Liu, J. Xu, O. Cingolani, N.E. Rhaleb and O.A. Carretero // Hypertension. - 2004. - V. 43. - №. 2. - P. 229-236.

135) N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline inhibits DNA synthesis in hu- man mesangial cells via upregulation of cell cycle modulators / K. Kanasaki, M. Haneda, T. Sugimoto, K.

Shibya, M. Isono, K. Isshiki, S. Araki, T. Uzu, A. Kashiwagi and D. Koya // Biochemical and biophysical research communications. - 2006. - V. 342. - №. 3. - P. 758-765.

136) Prevention of aortic fibrosis by N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline in angiogentisn II-induced hypertension / C.X. Lin, N.E. Rhaleb, X.P. Yang, T.D. Liao, M.A. D'Ambrosio and O.A. Carretero // American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. - 2008. -V. 295. - №. 3. - P. H1253-H1261.

137) N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline prevents renal insufficiency and mesangial matrix expansion in diabetic db/db mice / K. Shibya, M. Kanasaki, H. Isono, M. Sato, T. Omata, S. Sugimoto, K. Araki, A. Isshiki, M. Kashiwagi, D. Haneda and D. Koya // Diabetes. - 2005. -V. 54. - №. 3. - P. 838-845.

138) Antifibrotic effects of N-acetyl-seryl-aspar- tyl-lysyl-prline on the heart and kidney in aldosterone-salt hyptensive rats / H. Peng, O.A. Carretero, L. Raji, F. Yang, A. Kapke and N. E. Rhaleb // Hypertension. - 2001. - V. 37. - №. 2. - P. 794-800.

139) Decreased endogenous levels of Ac-SDKP promote organ fibrosis / M.A. Cavasin, T.D. Liao, X.P. Yang, J. J. Yangand, O.A. Carretero // Hypertension. - 2007. - V. 50. - №. 1. -P. 130-136.

140) N- acetyl-ser-asp-lys-pro inhibits phosphorylation of Smad2 in cardiac fibroblasts / S. Pokharel, S. Rasoul, A.J.M. Roks, R.E.W. van Leeuwen, M.J.A. Van Luyn, L.E. Deelman, J.F. Smits, O.A. Carretero, W.H. van Gilst and Y.M. Pinto // Hypertension. - 2002. - V. 40. - №. 2. - P. 155-161.

141) N-acetyl seryl-aspartyl-lysly-proline inhibits TGF-beta mediated plasminogen activator inhibitor-1 expression via an inhibition of the Smad pathway in human mesangial cells / K. Kanasaki, D. Koya, T. Sugimoto, M. Isono, A. Kashiwagi and M. Haneda // Journal of the American Society of Nephrology. - 2003. - V. 14. - №. 4. - P. 863-872.

142) Direct and reversible inhibitory effect of the tetrapeptide acetyl-N-Ser-Asp-Lys-Pro (Seraspenide) on the growth of human CD34+ subpopulations in response to growth factors / D. Bonnet, F.M. Lemoine, S. Pontvert-Deluq, C. Baillou, A. Najman and M. Guigon // Blood. -1993. - V. 82. - №. 11. - P. 3307-3314.

143) N-acetyl-seryl-aspartyl-lysylproline stimulates angiogenesis in vitro and in vivo / D. Wang, O.A. Carretero, X.Y. Yang, N.E. Rhaleb, Y.H. Liu, T.D. Liao and X.P. Yang, // American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. - 2004. - V. 287. - №. 5. -P. H2099-H2105.

144) Novel anti-inflammatory mechanisms of N-acetyl ser-asp-lys-pro in hypertension-induced target organ damage / U. Sharma, N.E. Rhaleb, S. Pokharel, P. Harding, S. Rasoul, H.

Peng, O.A. Carretero // American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. -2008. - V. 294. - №. 3. - P. H1226-H1232.

145) The tetrapeptide AcSDKP, a negative regulator of cell cycle entry, inhibits the proliferation of human and chicken lymphocytes / L.P. Volkov Quere, F. Coudert, L. Compte, Y. Antipov, V. Praloran // Cellular immunology. - 1996. - V. 168. - №. 2. - P. 302-306.

146) Actin is a surface component of calf pulmonary artery endothe- lial cells in culture / J. Morianu, J.W. Fett, J.F. Riordan and B.L. Vallee // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1993. - V. 90. - №. 9. - P. 3815-3819.

147) Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes / Kazu Kikuchi, Jennifer E. Holdway, Andreas A. Werdich, Ryan M. Anderson, Yi Fang, Gregory F. Egnaczyk, Todd Evans, Calum A. MacRae, Didier Y. R. Stainier, Kenneth D. Poss // Nature. - 2010. - V. 464. - №. 7288. - P. 601-605.

148) Thymosin beta 4 and thymosin beta 4-derived peptides induce mast cell exocytosis / J. Wyczoikowska, A. Walczak-Drzewiecka, W. Wangner and J. Dastych // Peptides. - 2007. -V. 28. - №. 4. - P. 752-759.

149) Thymosin beta 4 and its N-terminal tetrapeptide, AcSDKP, inhibit proliferation, and induce dysplas- tic, non-apoptotic nuclei and degranulation of mast cells / W. Leeananasakisiri, S. K. Desimone, T. Huff, E. Hannappel and T.F. Huff // Chemistry & biodiversity. - 2004. - V. 1. - №. 7. - P. 1091-1100.

150) Guarnera, G. The effect of thymosin treatment of venous ulcers / G. Guarnera, A. DeRosa, R. Camerini // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2010. - V. 1194. - №. 1. - P. 207-212.

151) Regenerx biopharmaceuticals [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.regenerx.com/clinical-trials - Product Development Pipeline. - (дата обращения: 04.05.2016)

152) Bradford, M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding / M.M. Bradford // Analytical biochemistry. - 1976. - V. 72. - №. 1-2. - P. 248-254.

153) Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U. K. Laemmli //nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

154) Standard operating procedures for serum and plasma collection: early detection research network consensus statement standard operating procedure integration working group / M.K. Tuck, D.W. Chan, D. Chia, A.K. Godwin, W.E. Grizzle, K.E. Krueger, W. Rom, M. Sanda, L. Sorbara, S. Stass, W. Wang, D.E. Brenner // Journal of proteome research. - 2008. -V. 8. - №. 1. - P. 113-117.

155) Kurfürst, M.M. Detection and molecular weight determination of polyethyleneglycol modified hirudin by staining after sodium dodecyl sulfate-poly acrylamide gel electrophoresis / M.M. Kurfürst // Analytical biochemistry. - 1992. - V. 200. - №. 2. - P. 244-248.

156) Moiseeva, E. Anti-breast cancer drug testing. Original approaches / E. Moiseeva // Novel Set of Mouse Models. - 2009. - № 2.

157) Quantitative validation of different protein precipitation methods in proteome analysis of blood platelets / M. Zellner, W. Winkler, H. Hayden, M. Diestinger, M Eliasen, B. Gesslbauer, I. Miller, M. Chang, A. Kungl, E. Roth, R. Oehler // Electrophoresis. - 2005. - Т. 26. - №. 12. - С. 2481-2489.

158) Harrison, R.G. Bioseparations Science and Engineering / R.G. Harrison, W.T. Paul, R.R. Scott. - New York: Oxford University Press., 2003. - P. 406

159) Esipov, R.S. Production and purification of recombinant human glucagon overexpressed as intein fusion protein in Escherichia coli / R.S. Esipov, V.N. Stepanenko, A.I. Gurevich, L.A. Chupova, A.I. Miroshnikov // Protein and peptide letters. - 2006. - V. 13. - №. 4. - P. 343-347.

160) Duong-Ly, K.C. Salting out of proteins using ammonium sulfate precipitation / K.C. Duong-Ly, S B. Gabelli // Methods Enzymol. - 2014. - V. 541 - P. 85-94.

161) Ruggiero, Alessia. Structure and stability of a thioredoxin reductase from Sulfolobus solfataricus: A thermostable protein with two functions / Alessia Ruggiero, Mariorosario Masullo, Maria Rosaria Ruocco, Pasquale Grimaldi, Maria Angela Lanzotti, Paolo Arcari, Adriana Zagari, Luigi Vitagliano // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. - 2009. - V. 1794. - №. 3. - P. 554-562.

162) Оптимизация и масштабирование лабораторного метода получения рекомбинантного тимозина-бета 4 человека до пилотного производства / Д.А. Макаров, Т.И. Муравьева, В.Н. Степаненко, В.И. Швец, Р.С. Есипов // Биотехнология. - 2014. - № 4.

- С. 35-44

163) Fernandes, A.I. Polysialylated asparaginase: preparation, activity and pharmacokinetics / A.I. Fernandes, G. Gregoriadis // Biochim Biophys Acta. -1997. - V 1341(1).

- P. 26-34.

164) Макаров, Д.А. Разработка способов получения аналогов тимозина бета 4 в виде конъюгатов, устойчивых к деградации в токе крови / Д.А. Макаров, Р.С. Есипов // Биотехнология. - 2016. - № 2. - С. 57-71

165) Ковалентный моноконъюгат капроновой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения : пат. 2604686 Рос. Федерация : МПК A61K38/22 / Р.С. Есипов, Д.А. Макаров, А.И. Мирошников, В.Н.

Степаненко; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова российской академии наук - № 2015150087; заявл. 23.11.2015; опубл. 10.12.2016., бюл. № 34.

166) A.I. Fernandes, G. Gregoriadis / Polysialylated asparaginase: preparation, activity and pharmacokinetics // Biochim Biophys Acta. -1997. - V 1341(1), - P. 26-34.

167) I. Fernandes, G. Gregoriadis / The effect of polysialylation on the immunogenicity and antigenicity of asparaginase: implication in its pharmacokinetics // Int J Pharm. -2001.- V. 217. (1). - P. 215-22.

168) Kinstler, O.B. Characterization and stability of N-terminally PEGylated rhG-CSF / O.B. Kinstler, D.N. Brems, S.L. Lauren, A.G. Paige, J.B. Hamburger, M.J. Treuheit // Pharm Res. - 1996. - V. 13(7). - V. 996-1002.

169) Способ получения моноконъюгата полисиаловой кислоты с тимозином бета 4 и ковалентный моноконъюгат полисиаловой кислоты с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови: пат. 2605385 Рос. Федерация : МПК A61K38/00, A61K38/17 / Р.С. Есипов, Д.А. Макаров, В.Н. Степаненко, А.И. Мирошников; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова российской академии наук - № 2015150088; заявл. 23.11.2015; опубл. 20.12.2016., бюл. № 35.

170) Delgado, С. The uses and properties of PEG - linked proteins / С. Delgado, G.E. Francis, D. Fisher // Critical reviews in therapeutic drug carrier systems. - 1991. - V. 9. - №. 34. - P. 249-304.

171) Gabizon, A. Polyethylene glycol - coated (pegylated) liposomal doxorubicin/ A. Gabizon, F. Martin // Drugs. - 1997. - V. 54. - №. 4. - P. 15-21.

172) Resh, Marilyn D. Regulation of cellular signalling by fatty acid acylation and prenylation of signal transduction proteins / Marilyn D. Resh // Cellular Signalling. - 1996. - V 8(6). - P. 403-412.

173) Oesterhelt, F. Single molecule force spectroscopy by AFM indicates helical structure of poly(ethylene- glycol) in water / F. Oesterhelt, M. Rief, H.E. Gaub // New Journal of Physics. - 1999. - V. 1. - №. 1. - P. 6.

174) Ковалентный моноконъюгат полиэтиленгликоля с тимозином бета 4, устойчивый к деградации в токе крови, и способ его получения: пат. 2607527 Рос. Федерация : МПК A61K38/00, A61K38/17 / Р.С. Есипов, Д.А. Макаров, А.И. Мирошников, В.Н. Степаненко; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное

бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова российской академии наук - № 2015150089; заявл. 23.11.2015; опубл. 10.01.2017., бюл. № 1.

175) Ingrosso, D. Specificity of endoproteinase Asp-N (Pseudomonas fragi): cleavage at glutamyl residues in two proteins / D. Ingrosso, A.V. Fowler, J. Bleibaum, S. Clarke // Biochem Biophys Res Commun. - 1989. -V. 162(3). - P. 1528-34.

176) Molbiol.ru [электронный ресурс]. - Режим доступа: http://molbiol.ru/scripts/01_18.html - Анализ последовательности белка - (дата обращения: 09.08.2016)

177) Rasoul, S. Antifibrotic effect of Ac-SDKP and angiotensin-converting enzyme inhibition in hypertension / S. Rasoul, O.A. Carretero, H. Peng, M.A. Cavasin, J. Zhuo, A. Sanchez-Mendoza, D R. Brigstock, N.E. Rhaleb // J Hypertens. - 2004. - V. 22(3). - P. 593-603.

178) An Л^-acetyltransferase responsible for acetylation of the N-terminal residues of histones H4 and H2A / S. Ok-kyu, W. Xiaorong, H. W. Jakob and S. Rolf // The Journal of Biological Chemistry. - 2003. - V. 278(40). - P. 38109-38112.

179) An acetylase with relaxed specificity catalyses protein N-terminal acetylation in Sulfolobussolfataricus / D.T. Mackay, C.H. Botting, G.L. Taylor, M.F. White, // Molecular microbiology. - 2007. - V. 64(6). - P. 1540-1548.

180) Evans, T.C. Jr. Semisynthesis of cytotoxic proteins using a modified protein splicing element / T.C. Jr. Evans, J. Benner and M-Q. Xu // Protein science. - 1998. - V. 7(11). - P. 2256-2264.

181) Howard, M.S. Automated design of synthetic ribosome binding sitestocontrol protein expression / M.S. Howard, A.M. Ethan, A.V. Christopher // Nature biotechnology. - 2009. - V. 27(10). - P. 946-950.

182) Lee, H. C. Construction a RBS library with different translational activity / H. C. Lee // BBF RFC. - 2010. -№ 79. - P. 1-8.

183) Development of the intein-mediated method for production of recombinant thymosin P4 from the acetylated in vivo fusion protein / Roman S. Esipov, Dmitry A. Makarov, Vasily N. Stepanenko, Anatoly I. Miroshnikov // Journal of Biotechnology. - 2016. - V. 228. - P. 73-81

184) Рекомбинантная плазмидная ДНК pER-TB4GyrA-AcSer, кодирующая сериновую ацетилтрансферазу, способную in vivo ацетилировать N - концевой серин дезацетилтимозина Р4 и гибридный белок, способный к автокаталитическому расщеплению с образованием тимозина Р4 человека, штамм Eschrichia coli C3030/pER-TB4GyrA-AcSer продуцент указанных белков и способ получения генно-инженерного тимозина Р4 человека: пат. 2592860 Рос. Федерация : МПК51 С07К 14/195 / Р.С. Есипов,

Д.А. Макаров, В.Н. Степаненко, А.И. Мирошников; заявитель и патентообладатель Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова российской академии наук -№ 2015116744; заявл. 05.05.2015; опубл. 27.07.2016., бюл. № 21.

185) Эффективность рекомбинантного тимозина Р4 в спонтанной мышиной модели хронического дерматита / Е.В. Моисеева, К.А. Бейрахова, С.Г. Семушина, Д.А. Аронов, Д.А. Макаров, Р.С. Есипов// Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 158. - № 11. - С. 620-623.