Мембранные белки семейства KCNE: создание эффективных бактериальных штаммов-продуцентов, очистка и изучение структурных особенностей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Гончарук, Сергей Александрович

• Гончарук, Сергей Александрович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гончарук, Сергей Александрович

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.И

Калиевые каналы и белки семейства КСЫЕ.

Потенциал-зависимые калиевые каналы.

Белки семейства КСЫЕ.

КСЫЕ1 (МшК).

КСМЕ2 (М1КР1).

КСЫЕЗ (М1ИР2).

Разнообразие М1КР-ов.

ЯМР-спектроскопия.

Резюме.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалы.

Штаммы Е.соИ.

Вектора и плазмиды.

Среды для выращивания микроорганизмов.

Ферменты.

Реактивы.

Буферы для выделения белков.

Олигонукл еотиды.

Методы.

Основные генно-инженерные методики.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Рестрикция.

Л игиров ание.

ДНК-электрофорез.

Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

Выделение плазмидной ДНК из Е. coli.

ПЦР анализ клонов.

Секвенирование ДНК.

PIPES - трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

Конструирование экспрессионных векторов. pGEMEX-1/Thio-EK-dKCNEl. pGEMEX-l/KCNEl-H6. pET32/Mist-TR-KCNE2-H6. pGEMEX-l/Thio-TR-KCNE3.

Денатурирующий электрофорез белков.

Подбор условий индукции.

Выращивание рекомбинантного штамма Е. coli.

Выделение белков. dKCNEl.

KCNE1-H6.

KCNE2-H6.

KCNE3.

Солюбилизация белков.

КД-спектроскопия.

Динамическое светорассеяние.

ЯМР-спектроскопия.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Создание эффективных систем экспрессии генов с1КСЫЕ1, КСЫЕ1,

КСШ2 и КСЫЕЗ.

1КСЫЕ1.

КСЫЕ1.

КСЫЕ2.

КСЫЕЗ.

Разработка эффективных систем очистки.

Отмывка телец включения (схема 1, А).

Металлохелатная аффинная хроматография (схема 1, Б).

Расщепление гибридных белков (схема 1, В).

Разделение продуктов гидролиза (схема 1, Г).

Дополнительная очистка (схема 1, Д).

Структурные исследования.

Удаление детергента.

Выбор мембраноподобного окружения.

ЯМР-спектроскопия.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мембранные белки семейства KCNE: создание эффективных бактериальных штаммов-продуцентов, очистка и изучение структурных особенностей»

Мембранные белки (МБ) составляют более четверти всех белков, кодируемых геномом человека. Они представляют собой существенную часть биологической мембраны и участвуют во многих процессах жизнедеятельности клетки. Именно МБ ответственны за передачу сигналов, производство и преобразование энергии, распознавание и транспорт веществ через мембрану. Дисфункции МБ нередко лежат в основе различных заболеваний. Это делает МБ исключительно привлекательными объектами разработки лекарственных препаратов. В настоящее время действие приблизительно 50% лекарств направлено именно на МБ. Знание пространственной структуры МБ, а также механизмов их функционирования, способствовало бы более глубокому пониманию биологических процессов и заложило бы основу для рационального дизайна лекарственных препаратов.

Несмотря на то, что в последнее время были достигнуты немалые успехи в изучении структуры и функции различных МБ, очень многое ещё предстоит сделать. Среди огромного разнообразия данных о пространственной структуре водорастворимых белков в Protein Data Bank данные о МБ составляют лишь 1% от общего числа. Главным образом, подобная ситуация связана с отсутствием эффективных технологий получения МБ. Если на сегодняшний день рекомбинантные водорастворимые белки можно синтезировать в любых количествах и без особых сложностей, то наработка каждого нового функционально-активного МБ в количествах, достаточных для физико-химических методов исследования, является значимым событием для структурных биологов.

Существует три основных способа получения МБ. Это химический синтез, экспрессия генов МБ в клетках различных организмов(преимущественно в бактериях) и бесклеточный синтез. Каждая из представленных стратегий имеет свои плюсы и минусы. Так, говоря о химическом синтезе, обычно подразумевают синтез небольших (<50 аминокислотных остатков (а. о.)) пептидов. Агрегация, присущая гидрофобным пептидам, ставит под сомнение возможность получения чистого белкового препарата в больших количествах. Другим широко распространенным методом является экспрессия генов МБ в бактериях. Здесь также имеются сложности. В силу гидрофобности трансмембранных (ТМ) участков, МБ являются токсичными для клетки-хозяина, особенно когда синтезируется большое количество гетерогенного белка. Поэтому для достижения эффективной экспрессии генов МБ нередко применяются различные ухищрения, такие как использование специальных бактериальных штаммов, белков-носителей, или же прибегают к строгому контролю генной экспрессии. Наконец, третья стратегия, которая в последнее время пользуется все большей популярностью - бесклеточный синтез. Несмотря на то, что данных подход позволяет не принимать во внимание проблему токсичности МБ, для получения больших количеств целевого продукта могут потребоваться весьма существенные временные и финансовые затраты, так как успех данной процедуры зависит от множества факторов, каждый из которых требует отдельного рассмотрения.

Синтезированные МБ необходимо очистить и рефолдировать, и здесь также возможны проблемы. Так, для поддержания гидрофобных МБ в растворимом состоянии на всех этапах очистки используются детергенты. Правильный их выбор очень важен для предотвращения агрегации белка и поддержания его в функционально-активном состоянии. От выбора окружения, имитирующего мембрану, напрямую зависит успех проведения структурных исследований МБ.

Данная работа посвящена изучению МБ семейства КСЫЕ, регуляторов потенциал-зависимых калиевых каналов.

Ранее считалось, что калиевые каналы представляют собой гомомеры и состоят из нескольких а-субъединиц. Дальнейшие исследования показали, что при экспрессии гена а-субъединицы в гетерологичных системах наблюдались токи, несколько отличающиеся от нативных. Сравнительный анализ каналов, состоящих только из а—субъединиц, и нативных каналов показал, что в природе калиевые каналы представлены гетерокомплексами, состоящими из а—субъединиц и регуляторных (иначе - вспомогательных, или р—) субъединиц. При коэкспрессии а— и Рсубъединиц в различных гетерологичных системах, регистрируемые токи были аналогичны нативным. Также было показано, что множество болезней, которые ранее связывали с патологиями а-субъедициц, на самом деле возникают из-за неправильной работы именно регуляторных субъединиц калиевых потенциал-зависимых каналов (1, 2, 3, 4).

Подробное изучение именно регуляторных субъединиц калиевых каналов представляется чрезвычайно актуальным как с прикладной, так и фундаментальной точек зрения. Так, например, было показано, что белки семейства КСЫЕ способны модулировать свойства калиевых каналов, а именно - проводимость, селективность, скорость активации и дезактивации канала, и некоторые другие. Мутации в этих белках связывают с наследственной и приобретенной аритмией, семейным периодическим параличом и другими болезнями (5, 6, 7, 8). На текущий момент усилия многих лабораторий мира направлены на изучение свойств регуляторных субъединиц калиевых каналов, однако, механизмы взаимодействия этих белков с а-субъединицами до сих пор не понятны. Знание пространственной структуры этих молекул, несомненно, поможет разобраться в структурнойорганизации функциональных и комплексообразующих доменов калиевых каналов.

В данной работе представлены результаты исследований по изучению трех белков данного семейства - КХЖЕ1, КСЫЕ2, КСМЕЗ, а так же укороченного варианта КСЫЕ1, именуемого в дальнейшем сИССКЕ 1, имеющего достаточно протяженные делеции как в № так и в С-концевых областях молекулы, тем не менее, сохраняющего полную функциональную активность, свойственную КСМЕ1 (9).

ЛИТЕРАТУРНЫМ ОБЗОРКалиевые каналы и белки семейства KCNEСуществуют три основных типа калиевых каналов: хемовозбудимые, механовозбудимые и потенциал-возбудимые. Однако далее речь пойдет о последнем типе калиевых каналов (т.е. потенциал-возбудимых или, по-другому, потенциал-зависимых), так каь именно они взаимодействуют с белками семейства КСКЕ. Строение типичного потенциал-зависимого калиевого канала показано на рисунке 1. Каждая из четырех поробразующих субъединиц (а-субъединиц) канала имеет шесть ТМ сегментов и одну петлю (Р-петлю), содержащую последовательнолъ ТхОУв, которая обеспечивает селективность канала. Тетрамерный комплекс формирует одну центральную ион-селективную пору, образованную четырьмя Р-петлями и ТМ сегментами. Эти сегменты фланкируют каждую петлю в первичной структуре и называются Б5 и Б6 (10, II». Четвертый ТМ сегмент каждойА. ВнеклеточноепространствоВнутриклеточно епространствоАльфа-су&ъединица кали шого потенциал-зависимого ка нала«Г £КСЫЕ1 КСМЕ2 КСЫЕЗ (М(пК> (ИШР1) (М(ЯР2)Б.

Рисунок 1.

Сзема взаимодействия а- и р-су гьединиц потенциал-зависимого калиевого канала.

А. Строение а- и р- субъединиц кашевого канала.

Б. Образование комплекса из 4" а-субъединиц (синий цвет) и 2>ч (З-субъединиц (красный) с образованием поры.субъединицы (S4) содержит периодически расположенные положительно заряженные остатки и является сенсором напряжения. Чаще всего в результате экспрессии такой а-субъединицы (например, KCNQ1, HERG или Kv3.4) в экспериментальных клетках (например, в ооцитах Xenopus laevis или тканях млекопитающих в культуре) образуются функциональные каналы. Но токи, возникающие в этих каналах, отличаются от токов в клетках, в которых эти каналы экспрессируются in vivo.

Белки семейства KCNE, длина которых варьируется от 103 до 177 а.о., взаимодействуют с а-субъединицами и формируют с ними стабильные комплексы, для которых характерно повторение свойств нативных токов в экспериментальных системах (рисунок П.

Семейство белков, кодируемых KCNE, включает пять известных членов, и на сегодня охарактеризованы только три из них. Первый, MinK, кодируемый KCNE1, был открыт в 1988 году при экспрессии фракционированной РНК из клеток крысиной почки (12). Спустя десять лет, были открыты KCNE2, KCNE3 и KCNE4 как результат поиска белков, гомологичных minK. Продукты этих генов были названы MiRP 1, 2 и 3 (от англ. MinK-Related Peptides), соответственно (таблица 1) (13, 14). Ген KCNE5, кодирующий MÍRP4, был найден в генетически богатом сегменте ДНК, делеция в котором приводит к синдрому, известному как АММЕ, или умственная отсталость (недоразвитость, эллиптоцитозная анемия) (15). Мутации в KCNE1, KCNE2 и KCNE3 связаны с унаследованными и приобретенными болезнями (16, 1, 2). Было показано, что MinK экспрессируется в клетках сердца и уха, MiRPl - в клетках сердца, MÍRP2 - в клетках скелетной мышцы, а вот роли MÍRP3 и MÍRP4 до сих пор мало изучены (17, 18).

Название белка Аминокислотная последовательность Кол., а.о.

Известно, что MinK, MiRPl и MiRP2 изменяют функции потенциал-зависимых калиевых каналов, влияя на их открытие и закрытие, ионную селективность, проводимость одиночного канала и скорость потока ионов. Кроме этого, они меняют чувствительность потенциал-зависимых калиевых каналов к лекарствам, и способны регулировать уровень их поверхностной экспрессии.

Далее рассмотрим характерные особенности KCNQ1 и HERG, как наиболее ярких представителей а-субъединиц потенциал-зависимых калиевых каналов, взаимодействующих с белками семейства KCNE.

Потенциал-зависгшые калиевые каналыКлючевую роль в процессе сердечного биения играет согласованная работа различных типов потенциал-зависимых калиевых каналов. Она определяет форму и длительность потенциала действия в клетках сердечной мышцы. Токи задержанного выпрямления 1к, формирующиеся в процессе реполяризации клетки, играют основную роль в регулировании длительности потенциала действия (19). Эти токи формируется из трех основных составляющих: IKur (ultra rapid — сверхбыстрый калиевый ток, активируется за 10 мс), 1кг (rapid — быстрый калиевый ток, активируется за 200 мс), (slow — медленный калиевый ток, активируется за 800 мс), которые различаются по своим фармакологическим и биофизическим свойствам (20,21).

Изначально, 1Кг был описан как компонента 1К на основании его чувствительности к антиаритмическому агенту Е-4031 (20). Для 1Кг свойственна быстрая активация, которая в значительной степени зависит от разности потенциалов и достигает своего полумаксимального значения примерно при +20 мВ. В свою очередь IKs в ответ на деполяризацию мембраны активируется медленнее, чем все другие калиевые токи, а его амплитуда остается постоянной только в случае длительной деполяризациимембраны. Из-за медленной скорости активации максимальный вклад IKs достигается только на поздней стадии фазы медленной реполяризации.

Несмотря на то, что биофизические и фармокологические свойства 1Кг и Iks в клетках сердечной мышцы были хорошо охарактеризованы, в последнее время все больше работ направлено на выявление взаимосвязи структуры и функции каналов, определяющих эти токи. Так, исследования HERG и KCNQ1, а-субъединиц потенциал-зависимых калиевых каналов, позволили лучше понять образование токов 1Кг и IKs соответственно.

Изначально HERG был клонирован из библиотеки кДНК гиппокампа, однако, высокий уровень его экспрессии наблюдается и в клетках сердечной ткани (22). Обнаружение мутаций в HERG, приводящих к удлинению QT интервала в процессе сердцебиения, позволило предположить, что HERG играет важную роль в процессе реполяризации клеток сердца (23). В результате гетерологической экспрессии HERG, было показано, что этот ген кодирует альфа-субъединицу 1кг канала (24). 1Кг и HERG каналы обладают схожими вольт-амперными характеристиками, свойствами единичных каналов, потенциал-зависимыми активацией и инактивацией, а также скоростью инактивации канала. В то же время, скорости активации и деактивации 1Кг каналов намного превышают соответствующие скорости, характерные для HERG каналов. Кроме того, 1кг и HERG отличаются чувствительностью к антиаритмическим агентам III класса и кинетикой блокады канала. Было высказано предположение о том, что каналы in vivo состоят не только из а-субъединиц и в клетках сердечной мышцы присутствуют вспомогательные белки, способные взаимодействовать с HERG каналами и изменять некоторые их свойства. Так, при совместной экспрессии KCNE2 и HERG в гетерологических системах, наблюдалось повторение кинетики и фармакологической чувствительности, свойственной1Кг (13). На основании этого был сделан вывод о том, что полноценный 1Кг канал формируется а-субъединицами - НЕБШ, и вспомогательными р-субъединицами - КСКЕ2.KCNQ1 (первоначально КуЬС)Т1, с неправильной работой которого связывают возникновение нарушений сердечного ритма, или, точнее, длинного С^Т синдрома — ЬС^Т) кодирует классическую потенциал зависимую а-субъеденицу канала, состоящую из 676 а.о. (25). В результате гетерологической экспрессии КСЫ01 наблюдаемые биофизические свойства канала не повторяли свойств 1К5. Как и в случае с НЕЯО, это позволило предположить, о присутствии регуляторных субъединиц в клетках сердечной мышцы. Гипотеза подтверждалась несколькими работами, в которых в результате гетерологичной экспрессии КСЫ01 и КСЫЕ1 в клетках млекопитающих наблюдалось повторение свойств, характерных для 1К8 каналов (39, 1).

Как уже отмечалось выше, для всех потенциал-зависимых калиевых каналов, в том числе КСЫС>1 и НЕБЮ, свойственно образование порообразующего комплекса за счет 4 симметрично расположенных а-субъединиц, которые имеют характерную топологию в мембране, включающую 6 ТМ участков и Р-петлю. В свою очередь, а-субъединицу обычно подразделяют на два домена — потенциал-чувствительный (81-84) и поровый (85-86). Большие успехи в понимании взаимосвязи структуры и функции доменов калиевых каналов были достигнуты благодаря получению структуры КсбА методом кристаллографии (26). Данный белок содержит 2 ТМ спирали и связывающую их петлю. При сравнении аминокислотных последовательностей этого белка и поровых доменов потенциал-зависимых калиевых каналов была обнаружена высокая гомология, как между ТМ спиралями, так и соединяющей их петлей. Динамические модели,построенные на основе структуры KcsA для потенциал-зависимых калиевых каналов хорошо описывают процесс селективного пропускания иона сквозь мембрану (27, 28). В закрытом состоянии 4 внутренние спирали, соответствующие S6 доменам канального комплекса, образуют пору канала. JV-концевые ТМ области этих спиралей расположены достаточно далеко друг от друга, в то время как их С-концевые участки сходятся (скрещиваются). Таким образом, со стороны цитоплазмы образуется узкое отверстие, препятствующее прохождению ионов калия через канал. При переходе в открытое состояние, расстояние между S6 спиралями увеличивается, в результате чего расширяется пора канала. Шарнирный участок, позволяющий спиралям перемещаться, представляет собой консервативный остаток глицина, расположенный на S6 спирали в непосредственной близости к селективному фильтру канала (Р-петле). Наиболее вероятно, что аналогичным конформационным изменениям в процессе активации подвержены все потенциал-зависимые калиевые каналы. Хотя, стоит заметить, что в S6 сегменте KCNQ1 глициновая шарнирная область отсутствует. Вместо аминокислотного остатка глицина, на соответствующей позиции расположен остаток аланина, способствующий поддержанию структуры а-спирали.

При анализе аминокислотных последовательностей S6 сегментов из различных каналов была обнаружена консервативная последовательность Рго-Х-Рго, расположенная вблизи порового отверстия (29). Данный мотив, предположительно, разрушает а-спиральную структуру S6 и может играть ключевую роль в процессе активации воротного механизма. В KCNQ1 данная последовательность представлена а.о. Pro-Ala-Gly. Несмотря на замену Pro на Gly, данная последовательность таюке может приводить к структурным изменениям в S6 и влиять на активацию воротного механизмаканала. В S6 субъединице HERG подобный мотив не был обнаружен. Кроме того, в результате аланин-сканирующего мутагенеза были выявлены два ароматических а.о. в S6 домене (Туг652 и Phe656) HERG, направленные в область поры (30) По-видимому, за счет электростатических взаимодействий этих остатков с лекарственными препаратами, можно объяснить, почему множество химических соединений избирательно блокируют именно HERG каналы. Суммируя изложенное выше, стоит заметить, что структура поры HERG каналов, по-видимому, отличается от пространственной организации поры большинства комплексов калиевых потенциал-зависимых каналов.

Модели, построенные на основе KcsA не содержат структурной информации о потенциал-чувствительном домене, содержащем сенсор напряжения (S4). Имеющаяся на данный момент информация об этой части калиевых потенциал-зависимых каналов основана на данных, полученных в результате сайт-направленного мутагенеза и функциональных электрофизиологических измерений. Группы Миллера (Miller С) и Шварца (Swartz KJ) использовали аланиновые и триптофановые замены с целью обнаружения периодических остатков, важных для функицонирования канала (31, 32). Они показали, что S1-S4 домены действительно формируют ТМ а-спирали, однако, общего мнения по поводу того, как эти спирали располагаются в мембране, так и не было достигнуто. Осталось неясным, образуют ли эти ТМ спирали внутримолекулярные контакты между собой или нет. Данная информация необходима для понимания функционирования и построения полных молекулярно-динамических моделей работы каналов. Использование дисульфидного сканирования позволило получить некоторые сведения о взаимном расположении S1-S4 спиралей в канальном комплексе. Основываясь на том, что а.о. двух различных а-спиралей, расположенных в непосредственной близости друг к другу, будут образовывать дисульфидныесвязи, при замене этих аминокислот на цистеин, была выявлена структурная топология 82 и 84 субъединиц (33, 34). Авторы показали, что эти участки располагаются под наклоном друг к другу и таким образом могут образовывать контакты между своими заряженными группами.

Стоит отметить и ряд исследований, посвященных взаимодействию регуляторных субъединиц с калиевыми потенциал-зависимыми каналами. В работах Ме1шап УБ и соавт. при изучении структурно-функциональных участков членов семейства КСИЕ было высказано предположение, что взаимодействие между вспомогательными (КСЫЕ1 и КСЫЕЗ) и а-субъединицами (КСЫСИ) происходит в области 86 и 85 сегментов канала, т.е. непосредственно в районе порообразвания (41). Данную гипотезу подтверждают результаты, полученные в работе Рапа§Ые О и соавт. (90). Используя сайт-направленный мутагенез и электрофизиологические методы, авторы выявили а.о. ТМ участка КСЫС)1 (338-340), замена которых приводила к ключевому изменению свойств канала. Было показано, что свойства каналов, образующихся только из обособленных а-субъедениц КСЫС)1 сравнимы со свойствами комплексов KCNQ1/KCNE1 и КСКр1/КСИЕЗ, в которых были введены найденные мутации. Это свидетельствует в пользу взаимодействия именно 86 сегмента КСКС)1 с белками семейства КСКЕ.

Для выявления близко расположенных участков КХЛЧСН и КОМИ в комплексе КСЫр1/КСМЕ1 Мака] о К и КиЬо У ввели ряд цистиновых замен как в а-субъединицу калиевого канала КСЫСН, так и в регуляторные субъединицы КС№1 и КСЫЕЗ (87). Было выявлено, что при замене остатка, расположенного в 84 сегменте КСК<31 на цистеин (А226С), образуется дисульфидная связь с ТУ-концевым ТМ остатком цистеина в КСИЕ1 при введении соответствующей мутации (Е44С). На этом основании былавыдвинута гипотеза о том, что KCNE1 расположен рядом с S4 KCNQ1. При этом не исключается возможность их непосредственного взаимодействия, приводящего к изменению ряда функций канального комплекса. Дисульфидная связь образовывалась только при деполяризации мембраны, что позволяет судить о динамике соответствующих участков KCNE1 и KCNQ1. Для регуляторной субъединицы KCNE3 таких связей найдено не было, что, по-видимому, свидетельствует о разном расположении регуляторных субъединиц KCNE1 и KCNE3 в канальных комплексах. Схожие выводы об относительном расположении а- и р- субъединиц были сделаны и другой группой ученых в работе Panaghie G и Abbott GW, где авторы заменяли заряженные остатки в S4 сегменте на остатки аланина (35).

Таким образом, на сегодняшний день нет точной пространственной информации о строении канальных комплексов. Приведенные выше сведения могут служить лишь иллюстрацией этого факта. Структурные исследования могли бы пролить свет на то, как происходит взаимодействие между субъединицами калиевых потенциал-зависимых каналов и вспомогательными субъединицами и какова связь между их структурой и функцией.

Далее мы рассмотрим вспомогательные субъединицы MinK, MiRPl, MiRP2 и их влияние на потенциал-зависимые калиевые каналы более подробно.

Белки семейства KCNEKCNE1 (MinK)Впервые KCNE1 был экспрессирован Takumi Т в 1989 году (12). Продукт гена представлял собой небольшой белок, состоящий из 129 а.о., и был назван MinK, что означает минимальный калиевый канал (таблица 1). В1995 году другой группой ученых были получены сведения о возможности образования собственного калиевого канала из 14 или более субъединиц МтК (36). Третья группа показала, что ток в ооцитах Хепорш 1аеу1$ появляется при взаимодействии, как мигимум, двух субъединиц М1пК с эндогенным мембранным белком (37,38). Эти данные породили многочисленные споры о том, сколько же именно субъединиц МтК необходимо для формирования функщонального калиевого канала и действительно ли эти белки способны образовывать собственные каналы, проводящие ионы калия. Ответы на эти вопросы были найдены только после клонирования его поробразующего партнера KCNQ1. Был сделан вывод о том, что пору в ооцитах Хепориз laevis образует белок-гомолог КСЫС>1, в то время как МтК является регулятором его свойств. Действительно, эксперименты в клетках яичника китайского хомячка показали, что М1пК не генерирует токи, если нет эндогенного КСМ01 (39).

Наиболее заметным эффектом действия МтК на КСЫСМ канал является приблизительно десятикратное замедление активации (рисунок 2) и некоторое изменение характеристик дезактивации этого канала (2, 40). Более<•>0а. ? ?й «£ 2.

1 1* 1 §отток К+ приток К+КСЫ01ВремяКСЫСИ + КСЫЕ1 Время Рисунок 2. Зависимость потока ионов через к;п ал от взаимодействия М1вК и КС^(01.

Клетки, которые имели потенциал покоя -80 мВ, подвергали различным степеням деполяризации: до -60 мВ (красный), -40 мВ (зеленый), -20 мВ (желтый), 0 мВ (фиолетовый), 20 мВ (оранжевый) и 40 мВ (синий >, 60 мВ (розовый).того, наблюдается увеличение примерю в четыре раза проводимости МтК/КСЫС>1 (около 140 мМ калиевых ионов на канал) по сравнению с проводимостью обособленного КСЫС)1 канала (41). Кроме этого, МтК изменяет селективность к одновалентнь м катионам, чувствительность к внешним и внутренним блокаторам поры и активацию молекулярными регуляторами (42, 43, 44, 45). Помимо описшных выше функций, МтК также влияет на функционирование НЕБЮ каналов (см. ниже).

На сегодняшний день известно достаточно много мутаций в КСКЕ1 (рисунок 3), появление которых связывают с наследственным ЬОТ синдромом (46, 47). В основном, мутащи в КСИЕ1 являются причиной уменьшения суммарного калиевого тока через канал. Их наличие также приводит к повышению потенциала активации канала, снижению проводимости одиночного канала и его ускоренной инактивации (48, 49). Кроме того, мутации в генах КСЫЕ1 и КСИО! способствуют появлению Ь(ЗТ синдрома у человека, принимающего определенные лекарственные препараты (50), Наличие двух мутантных аллелей КС№Е1 может привести квнеклеточноепростр а нствоВнутриклеточн с епростр з нствоРисунок 3. Расположение мутаций в МтК.

Аминокислотные остатки, выделенные краснымцветом были найдены у людей страдающихудлиненными С?Тинтервалами.возникновению продолжительных QT интервалов, что в свою очередь, с высокой вероятностью, приводит к глухоте (точнее, к синдрому Джервелла— Ланге-Нильсена; 16, 51, 52). Помимо экспрессии KCNE1 в клетках слухового эпителия, продукт этого гена представлен на клеточных мембранах почек, глаз, желудочно-кишечного тракта и Т-клеток. Таким образом, точечные мутации в KCNE1 приводят к патологиям многих тканей и органов человека, в которых он экспрессируется. Это еще раз подтверждает важность MinK в поддержании правильного функционирования калиевых потенциал-зависимых каналов.

Стоит отметить и ряд работ по исследованию функциональных участков KCNE1. Группа ученых во главе с Takumi Т (1991 год) проделала ряд экспериментов, в которых некоторые аминокислоты этого белка замещались или делегировались (9). Помимо этого, были созданы несколько производных KCNE1, в которые входили ТМ домен и несколько аминокислот с его N— и С— концов. В результате исследований были найдены остатки как изменяющие активность каналов, так и не влияющие на нее. Интересно, что одно из производных MinK обладало теми же свойствами, что и нативный KCNE1, и состояло из 63 а.о. с сохранением 9 остатков с N— конца молекулы и ТМ сегмента с прилегающими к нему участками (а.о. 41— 94) (этот белок был назван нами dKCNEl). Позже, в 1994 году, другая группа ученых подтвердила эти данные (53).

На сегодняшний день работ, посвященных структурному исследованию KCNE1, не так уж и много. Наиболее значимая работа в этой области принадлежит группе ученых во главе с Sanders CR (54). Им удалось экспрессировать в достаточных количествах и очистить KCNE1. При помощи ряда электрофизиологических тестов было показано, что при инъекции KCNE1 в составе мицелл лизомиристоилфосфатидилглицерола(ЛМФГ) в ооциты, где экспрессируется KCNQ1, канал полностью повторяет свою природную функциональность. 'H-^N TROSY ЯМР эксперименты показали, что ЛМФГ мицеллы являются удобным инструментом для изучения резонанса и релаксации. В работе были получены данные по элементам вторичной структуры KCNE1. Так, были выявлены элементы (3-структуры (остатки 31-35), а также несколько а-спиральных участков (остатки 9-23, 44-66 [ТМ часть]). Интересно, что внутри ТМ участка авторы обнаружили нарушение в спиральной области (59-61), которое, по имеющимся в литературе сведениям, содержит аминокислоты ответственные за функционирование KCNE1 (см. ниже, 55). На основании этих данных пока сложно судить о механизмах взаимодействия KCNE1 с каналом, однако, это первый шаг на пути к пониманию взаимосвязи структуры и функции.KCNE2 (MiRPI)Как говорилось выше, экспрессии обособленного потенциал-зависимого калиевого канала HERG не достаточно, чтобы полностью повторить природные токи (IKr) in vitro. Было обнаружено, что MiRPI и HERG формируют стабильные комплексы, которые по свойствам сходны с природными 1Кг каналами (рисунок 4), полностью повторяя характеристики проводимости одиночного канала, его чувствительность к ионам калия, скорость инактивации и, что важно, ингибирование при помощи антиаритмического агента Е—4031 (56, 57). В то время как гомомерные HERG каналы ингибируются Е-^031 только при постоянных биениях сердца, MiRPI /HERG и 1кг каналы блокируются до первого активирующего импульса. Хотя единичная проводимость, а так же кинетика проводимости изменяются в присутствии MiRPI, HERG каналы продолжают активироваться в результате деполяризации, но генерируют невысокий токВремяотток К+ приток К+НЕЯв* отток К+ приток К+ВремяНЕРв +КСЫЕ2Рисунок 4. Зависимость потока ионов через канал от взаимодействия М|КР1 и НЕЙС. Клетки, которые имели потенциал покоя 80 мВ, подвергали различным степеням деполяризации: до -60 мВ (красный), -40 мВ (зеленый). -20 мВ (желтый), 0 мВ (фиолетовый), 20 мВ (оранжевый) и 40 мВ (сини?).благодаря быстрой инактивации. В результате ре поляризации, переходы к закрытому состоянию замедляются, что способствует дальнейшему притоку ионов (58).

Мутации, которые не влияют на деполяризацию клеток сердечной мышцы, но при этом изменяют функцию М111Р1, связаны с наследственной сердечной аритмией (13). В КСМЕ2 быги обнаружены мутации, которые приводят к появлению длительного С>Т интервала (рисунок 5). Так, замены С>9Е и Т10М находятся в пределах внеклеточного домена М1ЯР1, М54Т, 157Т и У65М - в ТМ, а А116У - в цитоплазматическом домене. Все эти четыре мутации уменьшают калиевый ток через УПКР1/НЕКС каналы. Замена 09Е увеличивает потенциал активации, замена Т10М замедляет инактивациюВнеклеточноепространствоРисунок 5. Расположение мутаций в М1ЯР1.

Аминокислотные остатки, выделенные красным цветом, считаютсяответственными зааритмию.

Внутрикпвп очноепросг чранствоканала, в то время как замены М54Т и У6 >М ускоряют инактивацию канала, а замены 157Т и А116У изменяют ток единичного канала и время жизни канала на клеточной поверхности, соответственно (2, 59, 60).

Несмотря на то, что наследственная аритмия встречается редко, приобретенная аритмия является достаточно частым заболеванием, возникающим из-за нарушений метаболизма, побочных эффектов различных лекарственных препаратов, а также их злоупотребления. Приобретенный синдром, как и в случае большинства общих заболеваний, предположительно имеет полифункцион шьную основу. Так, чаще всего существуют несколько инициирующих факторов, которые действуют накопительно, мешая правильной работе сердечной мышцы в результате реполяризации ее клеток (61). Например, гели при принятии лекарственных препаратов (прокаинамида, оксатомида и куинидина и других) возникает аритмия (62, 63, 64), то, скорее всего, зто связано с наличием в \liRPiмутаций М54Т, 157Т и А116У. Наличие таких мутаций в КСЫЕ2 не изменяет чувствительность канала к данному лекарству. Напротив, С)9Е вариант 1уПИ?1, сопряженный с продолжительным С)Т интервалом, не только влияет на связывание белков М1КР1 с НЕ1Ш, уменьшая приток калия, но и увеличивает чувствительность М1ЯР1/НЕКХ} каналов к ингибированию лекарствами и антибиотиком макролидом (13, 65). Несмотря на то, что основная масса людей не подвержены риску наследственной аритмии (болезнь встречается не более чем у 0.02 % всей популяции), у них есть склонность к приобретению аритмии в ответ на принятие лекарств. Так, Т8А полиморфизм М1КР1 присутствует у 1.6 % процента населения. Хотя он напрямую не связан ни с наследуемым ЬС)Т синдромом, ни с изменениями в функциях М1КР1/НЕ1Ш каналов, он уменьшает чувствительность к некоторым антибиотикам и, таким образом, приводит к приобретенной аритмии (61). Структурные характеристики МЖР1, обусловленные восприимчивостью 1Кг к блокаде лекарствами, пока еще не были исследованы.

Стоит отметить недавно опубликованную работу, посвященную структурному исследованию КСЫЕ2 (66). При помощи инфракрасной Фурье и спектроскопии кругового дихроизма (КД) авторы показали, что структура М1КР1 в мицеллах ДСН содержит 34% а-спиралей, 23% Р-листов. В растворе мицелл из лизофосфотидилхолина /»/-концевая область, прилегающая к ТМ участку, структурируется. В свою очередь С-концевая область приобретает вторичную структуру в виде альфа-спирали, при этом увеличение спиральности зависит от присутствия в растворе типа липида (соответствует последовательности додецилсульфат натрия (ДСН) < димиристаилфосфотидилхолин (ДМФХ) < лизофосфотидилхолин < трифторэтанол (ТФЭ)). Как и в случае с КС№П эти данные пока не могутобъяснить механизмов взаимодействия KCNE2 с каналом, поэтому структурно-функциональные исследования по-прежнему являются актуальными.KCNE3 (MiRP2)MiRP2 является самым маленьким белком семейства KCNE, состоящим из 103 а.о. и имеющим короткий внутриклеточный домен (таблица П. В отличие от KCNE1 и KCNE2, ген KCNE3, в основном, экспрессируется в клетках скелетной мышцы. Поробразующим партнером MiRP2 является белок Kv3.4, также представленный на поверхности клеток скелетной мышцы (67). Kv3.4 формирует стабильные комплексы с MiRP2, в результате чего меняются биофизические и фармакологические свойства этого канала (68).

При рассмотрении Kv3.4 у дрозофил Shaw, было обнаружено, что каналы активируются при потенциалах выше порогового и быстро инактивируются (рисунок 6). При взаимодействии Kv3.4 с MiRP2 наблюдается активация при потенциалах ниже порогового, и их состояние активности характеризуется потенциалами приблизительно в 80 раз большими, чем в гомомерных каналах (68). Однако у человека или животного в клетках скелетной мышцы эти свойства не наблюдаются, хотя там и присутствует Kv3.4.

Помимо этого, известно, что взаимодействие Kv3.4 с MiRP2 приводит к уменьшению чувствительности канала к токсину морской анемоны BDS-II. Этот токсин способен ингибировать каналы, расположенные на поверхности мускульных клеток, а также изменять проводимость одиночного канала и скорость перехода канала из инактивированного состояния в активированное (68, 69).

Рисунок 6. Зависимость потока ионов через ка1 ал от взаимодействия \liRP2 и Ку3.4. Клетки, которые имели потенциал покоя 40 мВ, подвергали различным степеням деполяризации: до -70 мВ (красный), -40 мВ (зеленый), -20 мВ (желтый), 20 мВ (оранжевый), 70 мВ (синий) и 90мВ (черный).

Описанные выше эффекты изменили мнение относительно роли Ку3.4 в физиологии скелетной мышцы. Прежде существовала гипотеза, что каналы Ку3.4, вследствие их активации выше порогового значения потенциала, способны модулировать кальциевые токи и, благодаря медленному восстановлению из инактивированного состояния, приводят к последующей гиперполяризации (70). Напротив, М]КР2/Ку3.4 каналы активируются ниже порогового значения, и поэтому их функционирование происходит при потенциалах, близких к потенциалу пскоя мембраны (68). Более того, быстрый выход канала М1ЯР2/Ку3.4 из инактивированного состояния способствует его очередной активации, подавляя последующую гиперполяризацию.

Семейный периодический паралич - это нарушение в работе скелетных мышц. Раньше его связывали с мутациями в натриевом 8СЫ4А канале и вРисунок 7. Расположение мутаций в \liRP2.

Ам и нокислотные остатки, выделенные краснымцветом, считаютсяответственными зазаболевания.Скальциевом САСМЛАЗ канале Ь-типа (7 72, 73, 74). Однако, при проверке больных на наличие мутаций в гене КСЫЕЗ, но не имеющих мутаций в генах каналов 8СЫ4А и САСКИАЗ, была найдена замена Я83Н (рисунок 7) (68, 75, 76, 77). Считается, что мутации в \liRP2, натриевом и кальциевом (8С^4А и САСЬЛЛАЗ) каналах приводят к схоким эффектам. Их присутствие приводит к нарушению реполяризащ и, снижению возбудимости и деполяризации мембраны. Эти процессы становятся наиболее заметными у больных периодическим параличом при отравлении барием. Предположительно, это результат уменьшения калиевого притока в ответ на блокировку канала. В то же время в литературе встречается и опровержение данных о взаимосвязи мутации Я83Н и гене КСМЕЗ и периодического паралича (78). Таким образом, семейный периодический паралич является сложным заболеванием, которое зависит о г многих факторов.

Другую недавно найденную мутацио У17М связывают с нарушением сердечного ритма, болезнью известной как мерцательная аритмия илифибрилляция. предсердий (79, 80, 81, 82). Мерцательная аритмия удваивает риск смерти, а также увеличивает в 5-7 раз риск развития инсультов у больных (по сравнению с людьми без подобных нарушений сердечного ритма).

В настоящее время, на основании результатов, полученных при проведении генетических исследований, разрабатываются методы, позволяющие как верно диагностировать болезнь, так и выбрать правильную стратегию ее лечения.

Разнообразие МШР-овПомимо описанных выше взаимодействий (МтК с КСМС>1, М1КР1 с НЕ1Ю, М1ПР2 с Ку3.4), были обнаружены и другие комплексы в составе с белками семейства КОЖ. Так, было обнаружено, что МтК формирует стабильные комплексы с НЕ1Ш и удваивает плотность тока посредством увеличения количества активных каналов на поверхности мембраны. Тем не менее, образование комплекса М11^1/НЕКХл предпочтительнее, чем М1пК/НЕКО, и свойства этих комплексов различаются (83, 84, 85). Считается, что МтК может взаимодействовать с НЕКО в тех клетках, где М1КР1 не производится, либо МтК может влиять на М1КР1/НЕ1Ш комплексы, изменяя их уровень активности.

В свою очередь, М1ИР1 также проявляет разностороннюю активность. Помимо комплексов с НЕ1Ш, он способен взаимодействовать с каналом Ку4.2 (этот канал генерирует сердечные и нейрональные кратковременные токи) и приводить к замедлению его активации и дезактивации, а также к увеличению потенциала активации (86). До сих пор остается непонятным, существуют ли комплексы MiR.Pl/Kv4.2 в природе.

Что касается М1ИР2, то он взаимодействует с субъединицамиразличных калиевых каналов. Было показано, что совместная экспрессия31генов КСМЕЗ и КСЫО! приводит к образованию открытого канала при потенциале покоя мембраны (2, 87, 88). Эксперименты в других системах показали возможность образования комплексов М1КР2/НЕЯО и М1КР2/КСКС)4, с подавлением проходящих через них токов (89).

Существует предположение о том, что эквивалентные а.о. в М1ИР2 и МтК влияют на функционирование каналов схожим образом. Например, мутация В76И в М1пК, связанная с ЬС)Т синдромом, приводит к изменению функций КСИСН путем повышения потенциала активации, уменьшения амплитуды тока одиночного канала и понижения устойчивости открытого состояния. Аналогичная мутация 09(Ш в М1КР2 оказывает такой же эффект на Ку3.4 и КСКСМ каналы. Мутация Я83Н в М111Р2, связанная с периодическим параличом, приводит к увеличению потенциала активации и уменьшению проводимости одиночного канала в комплексах М1КР2/Ку3.4 и М1КР2/КСМС>1. Эквивалентная мутация в М1пК (К69Н) оказывает схожий эффект на комплекс МтК/КСМС)1 (3).

Помимо этого, было показано, что за взаимодействие КСИЕ1 и КСИЕЗ с каналом отвечают три последовательно расположенных а.о., представляющие из себя «активационный триплет» (55). Центральной аминокислотой в этом триплете является ТЬг-58 в КСЫЕ1 и Уа1-72 в КСИЕЗ. При исследовании этого триплета при помощи сайт-направленного мутагенеза было обнаружено, что гидроксилирование центральной аминокислоты в случае КС№Н необходимо для медленной активации канала. Более того, если в качестве ТЬг-58 выступает алифатическая аминоксилота, то кинетика комплекса с КС№)1 меняется и становится аналогичной кинетике комплекса с КСЫЕЗ. Другая группа ученых при помощи сайт-направленного мутагенеза подтвердила и дополнилаполученные результаты, проводя исследование в пределах Б6 домена КСКС>1 (90).

ЯМР-спекшроскопияДля определения структур МБ одним из наиболее перспективных методов является спектроскопия ЯМР. В отличие от кристаллографических методов, структурные исследования при помощи ЯМР не требуют получения правильных кристаллов исследуемого белка, что для МБ представляет собой очень непростую задачу. Также метод ЯМР позволяет исследовать белковые молекулы в средах, максимально близко моделирующих биологическую мембрану (детергенты или липид-детергентные смеси).

Однако метод ЯМР имеет и некоторые недостатки, в основном связанные с размером систем которые могут изучаться. Дело в том, что при увеличении размера белковой молекулы или белково-липидного комплекса скорость вращения изучаемых молекул в растворе замедляется. Это приводит к увеличению скорости релаксации намагниченности, уширению сигналов и, соответственно, к значительному понижению чувствительности ЯМР-эксперимента и перекрыванию сигналов в спектре. Следовательно, необходимо использовать технологии, позволяющие расширить диапазон применимости метода ЯМР для молекул и комплексов большой массы. Наиболее удобным объектом для ЯМР исследований, безусловно, являются мицеллы. Варьируя состав детергентов в мицелле, можно изменять размер, поверхностный заряд мицеллы. Наряду с детергентными, широкое применение нашли также липид-детергентные мицеллы и бицеллы. Бицеллы имеют гораздо более низкую концентрацию детергента или липида с коротким хвостом, по сравнению с традиционными мицеллами и некоторые бислойные характеристики улучшают солюбилизацию МБ без потери нативной структуры. К тому же бицелла более похожа на мембрану, нежели мицелла, так как мембрана является бислойным образованием. Однако, всвязи с тем, что бицелла является более крупным образованием, нежели мицелла, необходимо помнить, что переход от мицеллы к бицелле вызывает уширение ЯМР-сигналов.

Спектроскопия ЯМР основана на наблюдении сигналов различных ядер биомолекул, помещенных в сильное магнитное поле. Для успешного установления структуры по данным ЯМР необходимо, чтобы большинство сигналов ядер макромолекулы были разрешены в спектрах. Это означает, что отдельные сигналы должны иметь малую степень перекрывания и достаточную интенсивность. Однако число и интенсивность сигналов ЯМР ядер напрямую зависят от размера изучаемой системы. Основную роль в этом играют следующие факторы.

1) Увеличение размеров белковой молекулы ведет к пропорциональному росту числа ядер в ней, и соответственно к росту числа сигналов в спектрах ЯМР. В результате даже для сравнительно небольших молекул, сигналы отдельных ядер сильно перекрываются и становятся неразличимы. Эта проблема успешно решается путем использования многомерной спектроскопии ЯМР, в которой спектр ЯМР биомолекулы раскладывается по нескольким частотным направлениям, приводя к двумерным, трехмерным, и т.д. спектрам ЯМР. Для использования этого метода необходимо получение -изотопно меченых белковых молекул. Этот подход позволяет идентифицировать отдельные ядра не только по их собственной резонансной частоте, но и по частоте соседних ядер.

2) Увеличение размеров изучаемой молекулы или молекулярного комплекса ведет также к значительному замедлению его переориентации в растворе. Эмпирическое выражение для этой зависимости дается формулой тс [не] 0.4*МК [кДа], где тс — характерное время корреляции для вращательного движения молекулы в растворе, а Мк — масса комплекса.

Замедление скорости вращения молекулы в растворе ведет к уширению сигналов ЯМР и, соответственно, к значительному понижениючувствительности эксперимента. Как уже упоминалось выше, это особенноактуально для МБ, которые исследуются в составе белок—липидного илибелок—детергентного комплексов, суммарная масса которых складывается измассы белка и массы присоединенных липидов. Уменьшение скоростирелаксации может быть достигнуто двумя методами: либо уменьшениемразмера комплекса, например подбором липидов, образующих маленькиемицеллы (что не всегда возможно, так как структура МБ часто зависит отокружения), либо изменением свойств самой молекулы. Например, былиразработаны технологии по получению Н-меченых (дейтерированных)белков, а так же их последующей солюбилизации в растворы детергентов изамене дейтерия в составе амидных групп на протоны ('Н), необходимые дляструктурных исследований. Замена всех алифатических и ароматических 1 2протонов ( Н) на дейтерий ( Н), не меняя структуры молекулы, значительно замедляет скорость релаксации ядер 13С и амидных протонов. Однако необходимо помнить, что использование методов ЯМР при изучении структуры больших МБ целесообразно только в том случае, если белки имеют нативную структуру.

Хорошим примером является рефолдинг калиевого канала КсбА (91). Для определения структуры белка использовались ДСН мицеллы, содержащие тетрамерный 68-кДа калиевый канал КсбА, выделенный из бактерии З^ер^тусея \ividans. Вторичная структура, определённая по изменению химических сдвигов и по данным протон-дейтериевого взаимодействия, хорошо согласуется с данными рентгенокристаллографии и указывает на наличие относительно длинных а-спиралей в С-концевом цитоплазматическом домене. Количественные кросс-релаксационные измерения позволили нарисовать «карту» взаимодействий между детергентом и белком. Изменения химических сдвигов в селективном фильтре КсзА в мицеллах ДСН, индуцированные ионами К+, показали, что при данных условиях канал сохраняет свою биологическую активность. Приизменении рН наблюдали структурные перестройки обоих ТМ доменов рН-зависимого КсбА, что также указывало на нативность структуры канала в мицеллах ДСН.

Полученные данные по исследованию калиевого канала КсбА указывают на то, что метод ЯМР спектроскопии может успешно использоваться для определения пространственной структуры сравнительно больших МБ в составе мицелл.

РезюмеВ представленном выше литературном обзоре автор попытался показать, что, несмотря на достаточно большое количество работ, посвященных семейству КСЫЕ, на сегодняшний день нет общего понимания процессов взаимодействия белков данного семейства с потенциал-зависимыми калиевыми каналами. Имеющиеся данные, к сожалению, не дают исчерпывающей информации, необходимой для создания эффективных лекарственных препаратов. Причина неправильного функционирования МБ нередко кроется в дефектах их строения, а также механизмах их взаимодействий со своими порообразующими партнерами. Использование структурных методов представляется наиболее актуальным для решения всех этих вопросов. Однако подобные исследования требуют большого количества белкового материала. Если на сегодняшний день биохимическое получение водорастворимых белков обычно не представляет особых трудностей, то получение каждого нового МБ до сих пор остается сложной, а зачастую и вовсе невыполнимой задачей. В связи с этим большой интерес представляет разработка эффективных систем экспрессии МБ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫМатериалы Штаммы E.coliВ работе использовались следующие штаммы Е. coli:S XLIO-Gold strain ("Stratagene", США): Tetr, A(mcrA)183, A(mcrCB-hsdSMR-mrr)l73, endAl, supE44, thi-1, recAl, gyrA96, relAl, lac Hte [F' proAB laclq, ZAM15, TnlO.(Tetr) Amy Camr];✓ BL21(DE3)pLysS ("Novagen", США): FompT, hsd SB, (rB"mB"), dem, gal, DE3, pLysS, Cmr;S C41(DE3) ("Lucigen", США): FompT, hsd SB, (rB mB"), dem, gal, DE3; S C43(DE3) ("Lucigen", США): FompT, hsd SB, (rB mB"), dem, gal, DE3.

Вектора и плазмидыs pGEMEX-1 ("Promega", США);■S pGEMEX-l/Thio был получен ранее в нашей лаборатории; ^ pET32b ("Novagen", США);•S pET32b/Mistic был получен ранее в нашей лаборатории.

Ферменты•S эндонуклеазы рестрикции фирм: "New England Biolabs" (США), "Fermentas" (Канада);S термостабильная Vent—ДНК полимераза фирмы "New England Biolabs" (США);•S термостабильная Pfu-ДНК полимераза фирмы "Fermentas" (Канада); S термостабильная Taq-ДНК полимераза (Россия, ИБХ РАН); S Т4 ДНК лигаза MBI (Литва) и "Fermentas" (Канада).

РеактивыВ работе использовались реактивы "Merck" (США), "Sigma" (США), "Fluka" (Германия), "Bio-Rad" (США), "Gerbu" (Германия), "Рапгеас" (Испания) и "Difco" (США): бакто-триптон, дрожжевой экстракт, бакто-агар агароза, акриламид, бисакриламид, глицин, ТЕМЕД, ДСН, ПСА, ампициллин, натрия ацетат, ß-меркаптоэтанол (ß-ME), ДМСО, бромфеноловый синий, ЭДТУ, имидазол, бромистый этидий, уксусная кислота, 2-изопропанол, этиловый спирт, соляная кислота, глицерин, PEG 6000, PEG 8000, хлорамфеникол, аммоний сульфат, хлористый натрий, глюкоза, хлористый аммоний и другие. Для получения меченых производных использовали (15NH4)C1 и/или [U-13С]глюкоза ("CIL", США).

В процессе очистки белков применялись хроматографические смолы: У Chelating-Sepharose FF "Amersham" (США); S Q Sepharose FF "Amersham" (США);С8-гамма-гель совместная разработка ГНИИОЧБ (Санкт-Петербург) и ИБХ РАН (Москва) (Россия); ^ Диасорб-С4 (250) "Биохиммак" (Россия); -У Диасорб-С4 (500) "Биохиммак" (Россия). Растворы и буферы приготавливали на воде МПН-(^ "МПНроге" (США).

Буферы аля выделения белковБуфер А Трис, рН 8.0 50 мМ№С1 0.125 МТритон Х-100 1 %Р-МЕ 20 мМБуфер А1 Трис, рН 8.0 50 мМЫаС1 0.3 МЛаурилсаркозин 0.1 %Р-МЕ 10 мМБуфер В Трис, рН 8.0 50 мМЫаС1 0.025 МТритон Х-100 1 %р-МЕ 20 мМБуфер В1/С1 В1/С1ЫаОАс, рН 6.0 50 мМАцетонитрил 10% /70%Буфер С Трис, рН 9.0 50 мМТритон Х-100 1 %Буфер 01/Е1 1)1 /Е1ТФУ 0.1 %Ацетонитрил 10%/70%Буфер А2 Трис, рН 8.0 50 мМЫаС1 0.3 МЛаурилсаркозин 0.5 %Буфер АЗ Трис, рН 8.0 50 мМЫаС1 0.2 МЛаурилсаркозин 0.1 %Буфер В2 Трис, рН 8.0 25 мМЫаС1 0.3 мЛаурилсаркозин 0.1%Буфер т/Е1 В1/Е1ТФУ 0.1 %Ацетонитрил 10%/70%Буфер В1/С1 В1/С1ШОАс, рН 6.0 50 мМАцетонитрил 10%/70%ОлигонуклеотилыNdKClGATGATCCTGTCTAACACCAC CdKClCGGGATCCTTATTACTTGTCCTTCTCTTGCCAG NKC1GGAATTCCATATGATCCTGTCTAACACC CKC1CGGGATCCTTATCATGGGGAAGGCTTCGTC NKC2GGAATTCCATATGTCTACTTTATCCAATTTC CKC2CCCAAGCTTATCAGTGATGGTGGTGATGGTGGGGGGACATTTTGAACC NKC3GGTCTGGTTCCTCGTGGATCCATGGAGACTACGAACGGTACTGAAACC CKC3ATACTCAAGCTTATCAGATCATAGACACACGATTCTTGATATAAACGTG lrKC3TGCTTTCAGGACCGCGTGCAGGGATTCGTACCAGGTTTCAGTACCGT 2dKC3CGGTCCTGAAAGCACTGAACGCGACCCTGCATTCTAACCTGCTGTGC 2rKC3CTGGTTATCTGGACCGAGGCCCGGACCCGGACGGCACAGCAGGTTAG 3dKC3GTCCAGATAACCAGACCGAGGAACGTCGCGCAAGCCTTCCGGGCCGTЗгКСЗAACGAACAGAATATACATATAGGAGTTATCGTCACGGCCCGGAAG 4dKC3GTATATTCTGTTCGTTATGTTCCTGTTTGCCGTTACCGTAGGTTCGCTG 4rKC3GTCCACTTTACGGCTGCGGGTGTAACCGAGGATCAGCGAACCTACGG 5dKC3GCCGTAAAGTGGACAAACGCTCTGACCCGTACCACGTTTATATCAAGAA TrThioGGATCCACGAGGAACCAGACCAGAACCAGAGCCGTGAT T7prTAATACGACTCACTATAGGGМетодыОсновные генно-инженерные методикиПолпмеразная цепная реакция (ПЦР)Реакционная смесь содержала:50 нг ДНК;0.2 мМ каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов;1 мкМ каждого из праймеров;1 единицу активности термостабильной Vent—полимеразы; в 50 мкл реакционного однократного буфера для Vent-полимеразы, поставляемого с ферментом.

РестрикцияДНК гидролизовали при помощи эндонуклеаз рестрикции в условиях, рекомендованных поставщиками ферментов.

ЛигировагшеФрагменты ДНК лигировали при помощи ДНК лигазы фага Т4 в условиях, рекомендованных поставщиком фермента.

ДНК-электрофорезДНК фрагменты разделяли в агарозном геле согласно лабораторному руководству Маниатиса и соавторов при напряженности электрического поля 12В/см (92). Процентность агарозного геля выбирали исходя из длины фрагментов ДНК.

Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелейФрагменты ДНК выделяли из геля согласно инструкции к набору по очистке ДНК "MinElute Gel Extraction Kit (50)" ("QIAGEN", США).

Выделение плазмидной ДНК из К coliДля выделения плазмидной ДНК из клеток Е. coli использовали набор "QIAprep Spin Miniprep Kit (250)" фирмы "QIAGEN", следуя инструкции производителя.

ПЦР анализ клоновНаличие вставки и ее ориентацию в плазмидном векторе определяли при помощи ПЦР. Для этого клетки отдельных колоний, выросших на селективной агаризованной среде, суспендировали в 20 мкл реакционной смеси. Один из праймеров был комплиментарен последовательности вставки, другой - вектора. Реакцию проводили в буфере: 10 мМ Трис (pH 9.0), 1.5 мМ MgCb, 50 мМ KCl, 0.1 % Тритон Х-100, 0.01 % желатин. Реакционная смесь содержала 0.2 мМ dNTPs, 1 мкМ каждого из праймеров, 1 ед. Тац-полимеразы (93). Продукты реакции разделяли при помощи электрофореза (ЭФ) в 1.5 % агарозном геле pi анализировали по подвижности.

Продукты ПЦР разделяли в агарозном геле, из которого при УФ освещении вырезали скальпелем полосу, имеющую правильную подвижность. После выделения из геля (см. выше) фрагмент ДНК обрабатывали эндонуклеазой рестрикции ВатИ. I. После разделения продуктов гидролиза в агарозном геле, скальпелем вырезали полосу требуемой подвижности и выделяли ДНК из геля (см. выше).

Для получения экспрессионного вектора pGEMEX-1/Thio-EK-dKCNEl лигировали имеющийся в лаборатории фрагмент PshA UBamH I вектора pGEMEX-1/Thio-EK (содержащего ген устойчивости к ампициллину, orí, Т7 промотор и терминатор, а также ген тиоредоксина) и приготовленный фрагмент dKCNEl.

Продукты ПЦР разделяли в агарозном геле, из которого при УФ освещении вырезали скальпелем полосу, имеющую правильную подвижность. После выделения из геля (см. выше) фрагмент ДНК45обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Hind III и Nde I. После разделения продуктов гидролиза в агарозном геле, скальпелем вырезали полосу требуемой подвижности и выделяли ДНК из геля (см. выше). Параллельно подготавливали два фрагмента вектора pGEMEX-VAat II) и pGEMEX-1 ai WHind III) с использованием эндонуклеаз рестрикции Nde I, Aal II, Hind III.

Для получения экспрессионного вектора pGEMEX-l/KCNEl-H6 проводили трехкомпонентное лигирование фрагментовpGEMEX-1СNde VAat II), pGEMEX-1 (Aat WHind III) иKCNE1 -H6(Nde У Hind III).

Продукты ПЦР разделяли в агарозном геле, из которого при УФ освещении вырезали скальпелем полосу, имеющую правильную подвижность. После выделения из геля (см. выше) фрагмент ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Hind III и Nde I. После разделения продуктов гидролиза в агарозном геле, скальпелем вырезали полосу требуемой подвижности и выделяли ДНК из геля (см. выше). Параллельноподготавливали фрагмент вектора pET32/Mist-TR(iVöfe У Hind III) с использованием эндонуклеаз рестрикции Nde I и Hind III.

Для получения экспрессионного вектора pET32/Mist-TR-KCNE2-H6 лигировали фрагменты рЕТЗ 2/Mi s t-TR(/Vc/e У Hind III) иKCNE2-H6(Mfc VHind 1П).

Реакционной смесью трансформировали штамм Е. coli XL 10. Полученные клоны анализировали при помощи ПЦР с использованием праймеров Т7/СКС2, затем плазмидную ДНК отобранных клонов секвенировали. Результирующий вектор получил название рЕТЗ 2b/Mist-KCNE2.pGEMEX-lJThia-TR-KCNE3Ген KCNE3 составляли с использованием таблицы оптимальных кодонов Е. coli (95). Ген KCNE3 собирали при помощи последовательных ПЦР на основании химически синтезированных олигонуклеотидов (NKC3, 1гКСЗ, 2dKC3, 2rKC3, 3dKC3, ЗтКСЗ, 4dKC3, 4rKC3, 5dKC3, СКСЗ).

Продукты ПЦР разделяли в агарозном геле, из которого при УФ освещении вырезали скальпелем полосу, имеющую требуемую подвижность. После выделения из геля (см. выше) фрагмент ДНК обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Hind III и Nde I. После разделения продуктовгидролиза в агарозном геле, скальпелем вырезали полосу правильной подвижности и выделяли ДНК из геля (см. выше). Параллельно подготавливали два фрагмента вектора pGEMEX-1(Л^е J/Aat II) и pGEMEX-1 (Aat WJHind III) с использованием эндонуклеаз рестрикции Nde I, Aat И, Hind III.

Для получения экспрессионного вектора pGEMEX- l/Thio-TR-KCNE3 лигировали фрагменты pGEMEX-1 {Nde У Aat II), pGEMEX-1 {Aat WJHind III) и Thio-TR-KCNE3 {Nde У Hind III).

Реакционной смесью трансформировали штамм Е. coli XL 10. Полученные клоны анализировали при помощи ПЦР с использованием праймеров Т7/СКСЗ, затем плазмидную ДНК отобранных клонов секвенировали. Результирующий вектор получил название pGEMEX- l/Thio-TR-KCNE3.

Гель фиксировали и отмывали от ДСН в 10 % уксусной кислоте в течение 15 мин. После окрашивания в растворе (10% уксусная кислота, 0.1 % Кумаси R-250) в течение 20 мин, гель отмывали от краски в 10% уксусной кислоте.

Расщепление гибридного белка энтерокиназой человека, полученной в нашей лаборатории (98), проводили при комнатной температуре в течение 24 часов. Фермент добавляли из расчета 1 ед. на 1 мг гибридного белка. Полноту гидролиза контролировали при помощи трицинового ЭФ.

Реакционную смесь центрифугировали при 9000 в течение 1 часа. Супернатант наносили на колонку (10 мл №2+-С11е1а1:т§—БерЬагозе ББ), уравновешенную буфером В + 40 мМ имидазол. Фракцию белка, не связавшегося с сорбентом, собирали, подводили рН до 9.0 и наносили на колонку с анионообменной смолой (5 мл С2 ЭерЬагозе БЕ). Колонку отмывали буфером С. Белок элюировали линейным градиентом соли (от 0 М до 1 М ЫаС1, 10 объемов колонки). Элюат собирали по фракциям объемом 2.5 мл и анализировали при помощи трицинового ЭФ.

КС№1-Н6Клетки (с 1 л культуры) суспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис (рН 8.0), 150 мМ ЫаСЛ. Суспензию обрабатывали ультразвуком семь раз по 30 секунд, охлаждая в промежутке в ледяной бане в течение 5 минут, и центрифугировали в течение 30 мин при 10000 Супернатант декантировали, а осадок телец включения обрабатывали ультразвуком в том же буферном растворе. Суспензию центрифугировали в тех же условиях. Супернатант декантировали, а осадок телец включения суспендировали ультразвуком до разрушения макроскопических частиц (5-7 раз по 20-30 сек.) в буфере: 50 мМ Трис (рН 8.0), 0.3 М ЫаС1, 1 % лаурилсаркозин и 20 мМ р-МЕ. Для полного растворения полученную суспензию осторожно перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре с последующим центрифугированием и декантацией.

Колонку, набитую № -СЬеМищ-ЗерИагозе ГТ, уравновешивали буфером А1 + 10 мМ гшидазол. После нанесения раствора телец включения тщательно отмывали колонку от не связавшегося с нею белка буфером А1 + 10 мМ гшидазол. Далее осуществляли отмывку буфером А1 + 30 мМ гшидазол. Белок элюировали буфером А1 + 200 мМ имидазол.

Предварительно отмученный сорбент С8-гамма-гель (или С4 Диасорб) набивали в соответствующую колонку (конечный объёмупакованного сорбента 20 мл позволяет связать порядка 10 мг белка). Колонку отмывали последовательно буферами Bl, С1 и уравновешивали буфером В1. Во фракцию целевого белка после металлохелатной аффинной хроматографии (МХАХ) добавляли буфер С1 в соотношении 1/10 от объёма фракции и наносили на подготовленную колонку. Под контролем УФ-детектора собирали элюат несорбируемых веществ, после чего колонку промывали буфером В1 до выхода оптической плотности на базовый уровень. Колонку промывали линейным градиентом В1-С1 (10 объемов колонки) и уравновешивали буфером D1. Белок элюировали линейным градиентом D1-E1 (10 объемов колонки) под контролем УФ-детектора. Полученные фракции немедленно высушивали (на установке Eppendorf Concentrator 5301) в течение 30-40 мин, замораживали и лиофилизовали.KCNE2-H6Клетки суспендировали в буфере, содержащем 50 мМ Трис (рН 8.0), 150 мМ NaCl. Суспензию обрабатывали ультразвуком семь раз по 30 секунд, охлаждая в промежутки в ледяной бане в течение 5 минут, и центрифугировали в течение 30 мин при 10000 g. Супернатант удаляли, а осадок телец включения обрабатывали ультразвуком в том же буферном растворе с добавлением 1 % Тритон Х-100. Суспензию центрифугировали в тех же условиях. Супернатант декантировали, а осадок телец включения суспендировали ультразвуком до разрушения макроскопических частиц (5-7 раз по 20-30 сек. без охлаждения льдом или водой) в буфере, содержащем 50 мМ Трис (рН 8.0), 0.3 М NaCl, 1,5 % лаурилсаркозин. Для полного растворения полученную суспензию осторожно перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. Раствор центрифугировали с последующей декантацией.

Колонку, набитую М2+-СИе1а1:н"^--8ер11аго5е, уравновешивали буфером А2 + 10 мМ имидазол. Раствор телец включения разбавляли в 5 раз буфером А2 + 10 мМ имидазол и наносили на колонку. После последовательной отмывки буфером А2 + 10 мМ имидазол и буфером А2 + 40 мМ имидазол, белок элюировали буфером А2 + 200 мМ имидазол. Фракцию, содержащую белок, разбавляли в 5 раз буфером: 50 мМ Трис (рН 8.0), 0.1 % лаурилсаркозин.

Гибридный белок гидролизовали тромбином при комнатной температуре в течение 18 часов. Фермент добавляли из расчета 0.2 ед. на 1 мг гибридного белка. Полноту гидролиза контролировали при помощи трицинового ЭФ.

Реакционную смесь центрифугировали при 10000 g в течение 1 часа.

Л IСупернатант наносили на колонку (10 мл М -СЬекит^-БерЬагозе БР), уравновешенную буфером В2 + 10 мМ гшидазол. Колонку отмывали буфером В2 + 50 мМ имидазол. Белок элюировали буфером В2 + 200 мМ имидазол.кстзРазрушение клеток и отмывку телец включения проводили по аналогии с описанным выше протоколом для КС1<ГЕ2. Колонку, набитую 15 мл №2+-СЬе1айп§-8ер11аго8е БР, уравновешивали буфером АЗ + 10 мМ имидазол. После нанесения раствора телец включения последовательно отмывали колонку при помощи буфера АЗ + 10 мМ имидазол и буфера АЗ + 45 мМ имидазол. Белок элюировали буфером АЗ + 200 льМ имидазол. Элюат разбавляли в 5 раз буфером, содержащим 50 мМ Трис (рН 8.0), 0.1% лаурилсаркозин.

Гибридный белок гидролизовали тромбином человека при комнатной температуре в течение 18 часов. Фермент добавляли из расчета 0.3 ед. на 1 мг гибридного белка. Полноту гидролиза контролировали при помощи трицинового ЭФ.

Реакционную смесь центрифугировали при 9000 g в течение 1 часа.--у.

Супернатант наносили на колонку (10 мл Ni -Chelating—Sepharose FF), уравновешенную буфером ВЗ + 20 мМ имидазол.

Заключительную стадию очистки проводили с использованием гидрофобной смолы С8-гамма-гель (или С4 Диасорб). Процедура очистки полностью совпадает с методикой, описанной выше для KCNE1-H6.

Солюбилизация белковЛиофилизованный или высушенный белок растворяли в ТФЭ и смешивали с водным раствором детергента до соотношения ТФЭ/вода 1/1. Полученную суспензию озвучивали в течение нескольких минут в ультразвуковой бане, до полного просветления раствора. Медленно удаляли ТФЭ в условиях низкого вакуума и оставшуюся смесь лиофилизовали. Для снятия ЯМР спектров получившийся белок с детергентом растворяли в воде до нужной концентрации.

ЯМР-спектроскопияВсе спектры ЯМР получены на спектрометре AVANCE 700 (Bruker) с рабочей частотой на протонах 700 МГц. Измерение спектров, их обработка и расчет вторичной структуры проведены совместно с сотрудниками Лаборатории Биомолекулярной ЯМР-Спектроскопии: Соболем В.А. и к.х.н. Бочаровым Э.В.

Исследование белка KCNE3 проводили на изотопно-меченом образце, что частично решило проблему малой дисперсии химических сдвигов протонов в а-спиральных участках белка с помощью дву- и трехмерной гетероядерной ЯМР-спектроскопии. Был снят стандартный набор спектров13 15для С/ N- меченых образцов KCNE3, используемых для получения пространственной структуры (таблица 2а), и ряд экспериментов для описания динамики белка (таблица 26).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕЦелью данной диссертационной работы является создание эффективных систем экспрессии и очистки <1КСЫЕ1, КСЫЕ1, КСЫЕ2 и КСЬЛЕЗ в клетках Е. соН, а также изучение структурных особенностей, присущих белкам семейства КСЫЕ.

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:• Создание эффективных систем экспрессии генов с1КС1ЯЕ1, КСШ1, КСЫЕ2, КСЫЕЗ.• Разработка эффективных методик очистки белков сНССИЕ 1, КСЫЕ1, КСЫЕ2 и ЮЧСЕЗ.• Определение структурных характеристик, присущих белкам семейства KCNE, на основании данных, полученных методами КД-спектроскопии, динамического светорассеяния и ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

Создание эффективных систем экспрессии генов сНССЫЕК КСЫЕ1. КСЫЕ2 и КСЫЕЗсЖСЫЕ!В качестве первого объекта исследований был выбран укороченный вариант белка КСКЕ1 - ёКСЫЕ1. МБ имеют тенденцию встраиваться в клеточную мембрану. Чрезмерная продукция этих белков бактерией способна нарушить целостность мембраны, и, как следствие, вызвать клеточный лизис. Поэтому с!КСМЕ1 необходимо было синтезировать в связке с другим белком-партнером, который бы не позволял ему проникать в клеточную мембрану. В качестве такого белка был выбран тиоредоксинE. coli (Тгх). Это - небольшой белок с молекулярной массой 12 кДа, содержащийся во многих животных, растительных и бактериальных клетках. Он участвует в восстановительных реакциях через обратимое окисление его дитиола в активном центре, представленным последовательностью -Cys-Gly-Pro-Cys-, до дисульфида и катализирует реакции дитиол-дисульфидного обмена (99). Окисленная форма белка восстанавливает НАДФ и флавопротеин - тиоредоксинредуктазу. Восстановленная форма тиоредоксина представляет собой активную дисульфидоксидоредуктазу, которая участвует во многих тиолзависимых процессах (100). Тиоредоксин и его гомологи играют значительную роль в исправлении повреждений, поддержании структуры и сборке белковых молекул. Представители тиоредоксинового семейства служат как шапероны, связывающие неправильно свернутые белки (101).Ряд свойств Тгх делают его весьма привлекательным партнером для коэкспрессии, в частности, высокая растворимость (он может накапливаться в клетке до 40 % от общей белковой массы Е. coli, при этом полностью оставаясь в растворимой форме), а также доступность расположенных на поверхности белковой глобулы С— и TV-концов молекулы. Так как тиоредоксин - сравнительно небольшой белок, его доля в гибридной конструкции невелика и обычно сравнима с долей целевого белка.

Ген dKCNEl экспрессировали в составе вектора pGEMEX-1/Thio-EK, который был получен ранее в нашей лаборатории. При помощи ПЦР добавляли к 3'-концу гена dKCNEl рестрикционный сайт ВатН I. Клонирование в вектор проводили по тупому 5'-концу гена dKCNEl и сайту ВатН I. Полученный вектор pGEMEX-1/Thio-EK-dKCNEl (рисунок 8А) направлял синтез белкового продукта Trx-GS-H6-GS-EK-dKCNEl (рисунок 8Б), где Тгх - тиоредоксин, GS — а.о. Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (гибкийРисунок 8. Схематическое прдставление экепресснонных векторов {Л) и соответствующих им белковых продуктов (Б).

НШ IIIPs/iAIнеdKCNEISarnHlТ7 ргТ Р№ИЕХ-1/Thio-EK-dKCNE1 TterКС МЕЗHindТ7/1ис pr.

Т7 prX pGEMEX-1/Thio-TR-KCNE3 T,erРЕТ32/ "ГГ** '" lMist-TR-KCNE2-H6eterKCNE1-H6:es® СЗЭ Thk)-EK-dKCNE1 : GS Ш Ci IKH2MUThk)-TR-KCNE3: ttes GS Mlst-TR-KCNE2-H6: ШШЭ GS m gg?mlлинкер), Н6 — последовательность из шести гистидинов (гистидиновый таг), ЕК - сайт узнавания энтерокиназой (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys), dKCNEl — целевой белок dKCNEl. Последовательность ЕК предусматривали для возможности отделения целевого белка от белка-носителя, а элементы GS -для доступности сайта узнавания энтерокиназы и увеличения подвижности гистидинового тага. Для краткости последовательность Trx-GS-H6-GS-EK была названа Thio-EK, а для гибридного белка было введено обозначение Thio-EK-dKCNE 1.

Для наработки белка полученную плазмиду переносили в штамм Е. coli BL21(DE3)pLysS, содержащий хромосомную копию гена Т7 РНЕС-полимеразы. Этот штамм является лизогенным по бактериофагу (DE3), несущему ген lacl, промотор lacUV5 и ген РНК-полимеразы фага Т7. Промотор lacUV5 в отсутствие индуктора блокирован белком-репрессором — продуктом гена lacl (102). После добавления ИПТГ к растущей культуре этот индуктор связывается с белком-репрессором I, освобождая тем самым промотор lacUV5 от репрессирующего влияния. В результате начинается экспрессия Т7 РНК-полимеразы, индуцирующая в свою очередь транскрипцию гена, находящегося в плазмиде под контролем промотора Т7 РНК-полимеразы фага Т7. Однако, следует заметить, что синтез Т7 РНК-полимеразы возможен и без индукции ИПТГ, так как промотор lacUV5 не обеспечивает строгого контроля синтеза белка. Штамм BL21(DE3)pLysS содержит плазмиду pLysS с геном лизоцима фага Т7. Как следствие, внутри клеток этого штамма постоянно поддерживается небольшая концентрация лизоцима. Это, однако, никак не сказывается на жизнеспособности клеток, так как лизоцим находится в цитоплазме и, таким образом, физически отделен от пептидогликанового слоя. Лизоцим является эффективнымингибитором Т7 РНК-полимеразы. Поэтому активность Т7 Р1Ж-полимеразы в клетках, содержащих плазмиду рЬуэЗ, существенно снижена.

КС№1Следующим объектом для исследования был выбран полноразмерный КСЫЕ1. По аналогии с с!КСМЕ1, был собран вектор рОЕМЕХ-1 /ТЫо-ЕК-КСЫЕ 1. Плазмидным вектором трансформировали штамм ВЬ21(ВЕЗ)рЬу58 и проводили подбор температуры клеточного роста, а также поиск оптимальной концентрации химического индуктора. Как и ожидалось, выход гибридного белка был достаточно высоким (более 200 мг/л), однако, растворить в присутствии 1% Тритон Х-100 удалось не более 70% белка. Кроме того, в процессе дальнейшей очистки белок частично образовывал агрегаты, а расщепление гибридной конструкции энтерокиназой человека было крайне не специфичным. Попытки использовать другойдетергент для солюбилизации не увенчались успехом. Таким образом, встал вопрос о разработке другой экспрессионной конструкции.

Прибегли к наиболее простому способу - прямой экспрессии гена KCNE1. При помощи ПЦР модифицировали концы гена KCNE1, а именно добавляли рестрикционные сайты Nde I и Hind III, необходимые для клонирования в экспрессионный вектор pGEMEX-1. Кроме того, при помощи ПЦР присоединяли к 3'-концу гена KCNE1 нуклеотидную последовательность, кодирующую шесть гистидинов (Н6). Результирующий вектор, получивший название pGEMEX-1 /KCNE1-H6 (рисунок 8А), направлял синтез белкового продукта KCNE1-H6 (рисунок 8Б), где Н6 -последовательность из шести гистидинов (гистидиновый таг). Наличие последней последовательности позволяет использовать для очистки белка МХАХ.

Подбор условий культивирования проводили так, как это описано выше для Thio-EK-dKCNEl. Белок KCNE1-H6 накапливался преимущественно в тельцах включения. Такой вывод был сделан на основании того, что при солюбилизации в присутствии 1 % Тритон Х-100 удавалось растворить лишь небольшое количество белка. Понижение температуры культивирования никак не способствовало увеличению его растворимости. Накопление максимального количества белка (приблизительно 40 мг с литра минимальной среды М9), а также изотопно-меченых производных, наблюдалось в присутствии 0.01 мМ ИПТГ. Стоит отметить, что введение 15N-, 15N/13C- меток не повлияло на эффективность экспрессии, в то время как культивирование рекомбинантного штамма в присутствии 80 % D20 привело к снижению уровня внутриклеточного синтеза дейтерированных производных не менее чем в 2 раза.KCNE2KCNE2 оказался самым сложным белком для синтеза в бактериях. Во-первых, проблематично было даже собрать плазмиду pGEMEX-l/KCNE2-H6 для экспрессии этого гена. Трансформанты росли крайне медленно, хотя в штамме XL-10, который использовался для генноинженерных манипуляций, транскрипционная активность гена должна была быть на базальном уровне. Видимо, белковый продукт, кодируемый геном, очень токсичен для бактериальных клеток. Трансформация клеток штамма BL21(DE3)pLysS была безуспешной. Попытки использования бактериальных штаммов, специально разработанных для высокоуровневой экспрессии генов токсичных белков, также не увенчались успехом (были использованы штаммы Е. coli C41(DE3), C43(DE3) (103, 104)).

Использование белков-носителей, таких как тиоредоксин или глютатион S трансфераза (GST), позволило справиться с токсичностью белка, однако не в полной мере. В случае тиоредоксина наблюдался замедленный клеточный рост и низкие плотности культуры клеток. Накопление гибридного белка в этом случае обнаруживалось только при помощи вестерн-блот анализа. В случае с GST гибридного белка нарабатывалось мало, причем, наряду с гибридным белком, на гель-электрофорезе наблюдалось накопление двух дополнительных полос, соответствующих, скорее всего, белкам, появившимся в результате деградации гибридной конструкции внутри клетки. Достичь сравнительно высоких выходов KCNE2 (по сравнению с предыдущими итерациями) удалось только при использовании в качестве белка-партнера Mistic (105). Это необычный интегральный МБ из Bacillus subtilis, имеет массу около 13 кДа. Известно, что при гетерологичной экспрессии в Е. coli мистик тесно взаимодействует с бактериальной мембраной, что особенно интересно, так как он являетсягидрофильным белком. На сегодняшний день существует ряд статей, в которых применение мистика в качестве белка-партнера обеспечивает высокий уровень экспрессии МБ в Е. coli (105, 106). В нашем случае использование мистика также позволило существенно повысить уровень экспрессии гена KCNE2.

Сборку экспрессионной конструкции проводили с использованием вектора pGEMEX-1/Thio-EK-dKCNEl. При помощи ПЦР заменяли нуклеотидную последовательность, кодирующую сайт узнавания энтерокиназы, на последовательность, кодирующую сайт узнавания тромбина (TR) с образованием гена Thio-TR. Замена была необходима, так как ранее мы показали, что в присутствии детергента энтерокиназа теряет свою специфичность (по крайней мере, когда дело касается достаточно больших белков). Ген KCNE3 собирали из десяти синтетических олигонуклеотидов при помощи ПЦР с введением на 5' конец последовательности, комплементарной 3' концу гена Thio-TR. С целью повышения эффективности экспрессии ген KCNE3 составляли с учетом частоты встречаемости кодонов в Е. coli. При помощи ПЦР рекомбинировали последовательности Thio-TR и KCNE3 с добавлением на концы гена Thio-TR-KCNE3 сайтов рестрикции Nde I и Hind III. Клонирование гена Thio-TR-KCNE3 в вектор pGEMEX-1 проводили по этим же сайтам. Результирующий вектор, получивший название pGEMEX-1 /Thio-TR-KCNE3 (рисунок 8А), направлял синтез белкового продуктаTrx-GS-H6-GS-TR-KCNE3 (рисунок 8Б), где Тгх - тиоредоксин, GS - гибкий линкер, Н6 —гистидиновый таг, TR — сайт узнавания тромбина (Lys-Val-Pro-Arg-Gly-Ser), KCNE3 - целевой белок KCNE3. Последовательность TR была необходима для отделения целевого белка от белка-носителя. Для краткости последовательность Trx-GS-H6-GS-TR названа Thio-TR, а для гибридного белка введено обозначение Thio-TR-KCNE3.

Интересно, что хотя все исследуемые МБ являются членами одного семейства, создать универсальную систему продукции этих белков в бактериях не удалось. Это еще одна иллюстрация тех проблем, которые приходится решать при работе с МБ. Каждый из МБ требует индивидуального подхода.

Разработка эффективных систем очисткиОсновные этапы получения целевых белков dKCNEl, KCNE1-H6, KCNE2-H6, KCNE3 представлены на схеме 1.

Отмывка телец включения (схема 1, А)Накопление белка в составе телец включения позволяет значительно упростить процедуру его очистки. Для этого клеточную биомассу разрушают в буфере, не содержащем детергент, после чего тельца включения осаждают центрифугированием при низких скоростях (от 500 g). При этом большинство белков Е. coli остаются в растворе. Кроме того, для повышения эффективности очистки, осадок телец включения можно промывать с использованием высоких концентраций (до 1 %) Тритон Х-100. В случае белков Mist-TR-KCNE2-H6 и Thio-TR-KCNE3 эта процедура оказалась эффективной и была включена в протокол очистки. Однако в случае KCNE1-H6 от нее пришлось отказаться, поскольку в ходе ее исполнения терялась значительная часть белка.

Схема 1. Основные стадии выделения исследуемых объектов.

МХАХ - металлохелатная аффинная хроматография, сорбент Chelating Sepharose FF. Гидрофоб, хромат. - гидрофобная хроматография, сорбент С4 Диасорб. Ионообмен. хромат. — ионообменная хроматография, сорбент Q Sepharose FF.KCNE1-H6 Thio-EK-dKCNE1 Thio-TR-KCNE3 M Ist-TR-KC N E2-H бIОтмывка телец включенияI!IОтмывка телец включения с Triton Х-100J!МХАХВ.д.I!I3 сРасщепление гибридных белков.-.1 t.-.-.

Энтерокиназа□ сТромбинJ\\

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Гончарук, Сергей Александрович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной диссертационной работе предложены оригинальные методы получения МБ в клетках Е. coli. Данные методы позволяют получать миллиграммовые количества чистого МБ, а также его изотопно-меченых производных (15N, 13С, 2Н), для структурно-функциональных исследований. Эффективность представленных методов подтверждается высокими выходами изучаемых объектов - dKCNEl, KCNE1, KCNE2 и KCNE3.

Сравнение структурных данных по KCNE1 и KCNE3, последние из которых были получены в ходе данной работы, позволяет предположить, что все белки семейства KCNE имеют характерные а-спиральные участки в N- и С- концевых доменах, а также а-спиральный ТМ регион и примембранный заряженный квадруплет.

Кроме того, основываясь на литературных данных относительно различных заболеваний, связанных с белками семейства KCNE выдвинута гипотеза об опосредованном влиянии N- и С- концевых участков белков семейства KCNE на функционирование калиевых потенциал-зависимых каналов.

Выявлены «гликофориновые мотивы» в ТМ участках всех представителей семейства KCNE, а также S5/S6 доменах каналов KCNQ1 и HERG. Предполагается, что эти мотивы ответственны за образование функционально активных комплексов калиевых потенциал-зависимых каналов.

выводы

Разработаны эффективные системы бактериальной экспрессии генов с1КСЫЕ1, КСИЕ1, КСЫЕ2 и КСЫЕЗ.

Разработаны эффективные методики очистки ёКСЫЕ1, КСЫЕ1-Н6, КСЫЕ2-Н6иКСЫЕЗ.

^ Мембранные белки dKCNEl, КСЫЕ1-Н6 и KCNEЗ, в том числе их изотопно-меченые 151Ч-, 15>Т/13С-, 15М/13С/2Н-, 15>Т/2Н- производные, выделены в количествах, достаточных для определения их структурной организации с помощью оптических методов анализа и спектроскопии ЯМР.

^ Получена информация по вторичной структуре КСЫЕЗ в мембраноподобном окружении и охарактеризованы структурные особенности dKCNEl, КСЫЕ1-Н6 и КСЫЕЗ в составе липидных комплексов методами КД-спектроскопии, динамического светорассеяния и ЯМР-спектроскопии.

Выявлены основные структурные особенности, присущие белкам семейства КСЫЕ: ТУ- и С-концевые а-спиральные участки, трансмембранные а-спирали и примембранные заряженные квадруплеты.

На основании анализа структурной организации КСМЕ1-Н6 и КСЫЕЗ была выдвинута гипотеза об опосредованном влиянии ТУ- и С-концевых

участков белков семейства КСКЕ на функционирование калиевых потенциал-зависимых каналов.

^ Наличие «гликофориновых мотивов» в трансмембранных участках всех представителей семейства КСКЕ, а также 85/86 доменах а-субъединиц калиевых потенциал-зависимых каналов, по-видимому, свидетельствует об их участии в образовании функционально активных комплексов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гончарук, Сергей Александрович, 2008 год

1. K(V)LQT1 and lsK (minK) proteins associate to form the 1.Ks) cardiac potassium current. Nature 1996 Nov 7;384(6604):24-5.

2. Abbott GW, Goldstein SA. Potassium channel subunits encoded by the KCNE gene family: physiology and pathophysiology of the MinK-related peptides (MiRPs). Mol Intei-v 2001 Jun;l(2):95-107.

3. Abbott GW, Goldstein SA. Disease-associated mutations in KCNE potassium channel subunits (MiRPs) reveal promiscuous disruption of multiple currents and conservation of mechanism. FASEB J 2002 Mar;16(3):390-400.

4. Sanguinetti MC, Spector PS. Potassium channelopathies. Neuropharmacology 1997 Jun;36(6):755-62.

5. Schwartz PJ, Priori SG, Spazzolini C, et al. Genotype-phenotype correlation in the long-QT syndrome: gene-specific triggers for life-threatening arrhythmias. Circulation 2001 103(l):89-95.

6. Cheng JH, Kodama I. Two components of delayed rectifier K+ current in heart: molecular basis, functional diversity, and contribution to repolarization. Acta Pharmacol Sin 2004 Feb;25(2): 137-45.

7. Splawski I, Shen J, Timothy KW, Lehmann MH, Priori S, Robinson JL, Moss AJ, Schwartz PJ, Towbin JA, Vincent GM, Keating MT. Spectrum of mutations in long-QT syndrome genes. KVLQT1, HERG, SCN5A, KCNE1, and KCNE2. Circulation 2000 Sep 5; 102(10): 1178-85.

8. Takumi T, Moriyoshi K, Aramori I, Ishii T, Oiki S, Okada Y, Ohkubo H, Nakanishi S. Alteration of channel activities and gating by mutations of slow Isk potassium channel. J Biol Chem 1991 Nov 25;266(33):22192-8.

9. Jan LY, Jan YN. Potassium channels and their evolving gates. Nature 1994 Sep 8;371(6493):119-122.

10. MacKinnon R. Determination of the subunit stoichiometry of a voltage-activated potassium channel. Nature 1991 Mar 21 ;350(6315):232-23 5.

11. Takumi T, Ohkubo H, Nakanishi S. Cloning of a membrane protein that induces a slow voltage-gated potassium current. Science 1988 Nov 18;242(4881): 1042-1045.

12. Abbott GW, Sesti F, Splawski I, Buck ME, Lehmann MH, Timothy KW, Keating MT, Goldstein SA. MiRPl forms IKr potassium channels with HERG and is associated with cardiac arrhythmia. Cell 1999 Apr 16;97(2):175-87.

13. Abbott GW, Goldstein SA. A superfamily of small potassium channel subunits: form and function of the MinK-related peptides (MiRPs). Q Rev Biophys 1998 31(4):357-398.

14. Duggal P, Vesely MR, Wattanasirichaigoon D, Villafane J, Kaushik V, Beggs AH. Mutation of the Gene for IsK Associated With Both Jervell and Lange-Nielsen and Romano-Ward Forms of Long-QT Syndrome. Circulation 1998 Jan 20;97(2): 142-6.

15. Pourrier M, Schram G, Nattel S. Properties, expression and potential roles of cardiac K* channel accessory subunits: MinK, MiRPs, KChIP, and KChAP. JMembr Biol 2003 194:141 -152.

16. Крыжановский С А, Вититнова МБ. Антиаритмические лекарственные средства. Академия 2008 11-26.

17. Sanguinetti МС, Jurkiewicz NK. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class Ш antiarrhythmic agents. J Gen Physiol 1990 Jul;96(l): 195-215.

18. Warmke JW, Ganetzky B. A family of potassium channel genes related to eag in Drosophila and mammals. Proc Natl Acad Sci USA 1994 Apr 12;91(8):3438-42.

19. Curran ME, Splawski I, Timothy KW, Vincent GM, Green ED, Keating MT. A molecular basis for cardiac arrhythmia: HERG mutations cause long QT syndrome. Cell 1995 Mar 10;80(5):795-803.

20. Sanguinetti MC, Jiang C, Curran ME, Keating MT. A mechanistic link between an inherited and an acquired cardiac arrhythmia: HERG encodes the IKr potassium channel. Cell 1995 Apr 21;81(2):299-307.

21. Barhanin J, Lesage F, Guillemare E, Fink M, Lazdunski M, Romey G. K(V)LQT1 and lsK (minK) proteins associate to form the I(Ks) cardiac potassium current. Nature 1996 Nov 7;384(6604):78-80.

22. Doyle DA, Morais Cabral J, Pfuetzner RA, Kuo A, Gulbis JM, Cohen SL, Chait ВТ, MacKinnon R. The structure of the potassium channel:molecular basis of K+ conduction and selectivity. Science 1998 Apr 3;280(5360):69-77.

23. Roux B. Theoretical and computational models of ion channels. Curr Opin Struct Biol 2002 Apr; 12(2): 182-9.

24. Roux B, Allen T, Berneche S, Im W. Theoretical and computational models of biological ion channels. O Rev Biophys 2004 Feb;37(1): 15-103.

25. Yellen G. The moving parts of voltage-gated ion channels. O Rev Biophys 1998 Aug;31(3):239-95.

26. Sanchez-Chapula JA, Navarro-Polanco RA, Culberson C, Chen J, Sanguinetti MC. Molecular determinants of voltage-dependent human ether-a-go-go related gene (HERG) K+ channel block. J Biol Chem 2002 Jun 28;277(26):23587-95.

27. Hong KH, Miller C. The lipid-protein interface of a Shaker K(+) channel. J Gen Physiol 2000 Jan; 115(1):51-8.

28. Li-Smerin Y, Hackos DH, Swartz KJ. Alpha-helical structural elements within the voltage-sensing domains of a K(+) channel. J Gen Physiol 2000 Jan; 115(l):33-50.

29. Seoh SA, Sigg D, Papazian DM, Bezanilla F. Voltage-sensing residues in the S2 and S4 segments of the Shaker K+ channel. Neuron 1996 Jun; 16(6): 1159-67.

30. Tiwari-Woodruff SK, Lin MA, Schulteis CT, Papazian DM. Voltage-dependent structural interactions in the Shaker K(+) channel. J Gen Physiol 2000 Feb; 115(2): 123-3 8.

31. Panaghie G, Abbott GW. The role of S4 charges in voltage-dependent and voltage-independent KCNQ1 potassium channel complexes. J Gen Physiol 2007 Feb; 129(2): 121-33.

32. Tzounopoulos T, Guy HR, Durell S, Adelman JP, Maylie J. Min K channels form by assembly of at least 14 subunits. Proc Natl Acad Sei USA 1995 Oct 10;92(21):9593-9597.

33. Wang KW, Goldstein SA. Subunit composition of MinK potassium channels. Neuron 1995 Jun; 14(6): 1303-1309.

34. Wang KW, Tai KK, Goldstein SA. MinK residues line a potassium channel pore. Neuron 1996 Jan 17;16(3):571-577.

35. Sanguinetti MC, Curran ME, Zou A, Shen J, Spector PS, Atkinson DL, Keating MT. Coassembly of K(V)LQT1 and MinK (IsK) proteins to form cardiac I(Ks) potassium channel. Nature 1996 Nov 7;384(6604):80-83.

36. Sesti F, Goldstein SA. Single-channel characteristics of wild-type IKs channels and channels formed with two minK mutants that cause long QT syndrome. J Gen Physiol 1998 Dec; 112(6):651-63.

37. Melman YF, Krummerman A, McDonald TV. KCNE regulation of KvLQTl channels: structure-function correlates. Trends Cardiovasc Med 2002 May; 12(4): 182-187.

38. Seebohm G, Lerche C, Pusch M, Steinmeyer K, Brüggemann A, Busch AE. A kinetic study on the stereospecific inhibition of KCNQ1 and I(Ks) by the chromanol 293B. Br J Pharmacol 2001 Dec;134(8):1647-54.

39. Gerlach U, Brendel J, Lang HJ, Paulus EF, Weidmann K, Brüggemann A, Busch AE, Suessbrich H, Bleich M, Greger R. A kinetic study on the stereospecific inhibition of KCNQ1 and I(Ks) by the chromanol 293B. J Med Chem 2001 Nov 8;44(23):3831-7.

40. Kupershmidt S, Yang IC, Hayashi K, Wei J, Chanthaphaychith S, Petersen CI, Johns DC, George AL Jr, Roden DM, Baiser JR. The IKr drug response is modulated by KCR1 in transfected cardiac and noncardiac cell lines. FASEB J2003 Dec;17(15):2263-5.

41. Sesti F, Tai KK, Goldstein SA. MinK endows the I(Ks) potassium channel pore with sensitivity to internal tetraethylammonium. Biophys J 2000 79(3):1369-1378.

42. Koo SH, Teo WS, Ching CK, Chan SH, Lee EJ. Mutation screening in KCNQ1, HERG, KCNE1, KCNE2 and SCN5A genes in a long QT syndrome family. Ann Acad Med Singapore 2007 Jun;36(6):394-8.

43. Hoppe UC, Marbán E, Johns DC. Distinct gene-specific mechanisms of arrhythmia revealed by cardiac gene transfer of two long QT disease genes, HERG and KCNE1. Proc Natl Acad Sei USA 2001 Apr 24;98(9):5335-40.

44. Splawski I, Tristani-Firouzi M, Lehmann MH, Sanguinetti MC, Keating MT. Mutations in the hminK gene cause long QT syndrome and suppress IKs function. Nat Genet 1997 Nov; 17(3):338-40.

45. Priori SG, Napolitano C. Genetic defects of cardiac ion channels. The hidden substrate for torsades de pointes. Cardiovasc Drugs Ther 2002 Mar;16(2):89-92.

46. Jervell A, Länge-Nielsen F. Congenital deaf mutism, functional heart disease with prolongation of the QT interval and sudden death. Am Heart J 1957 Jul;54(l):59-68.

47. Ben-Efraim I, Strahilevitz J, Bach D, Shai Y. Secondary structure and membrane localization of synthetic segments and a truncated form of the Isk (minK) protein. Biochem 1994 Jun 7;33:6966-6973.

48. Melman YF, Krumernian A, McDonald TV. A single transmembrane site in the KCNE-encoded proteins controls the specificity of KvLQTl channel gating. J Biol Chem 2002 Jul 12;277(28):25187-94.

49. Ohya S, Asakura K, Muraki K, Watanabe M, Imaizumi Y. Molecular and functional characterization of ERG, KCNQ, and KCNE subtypes in rat stomach smooth muscle. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2002 Feb;282(2):G277-87.

50. Sanguinetti MC, Jurkiewicz NK. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class HI antiarrhythmic agents. J Gen Physiol 1990 Jul;96(l):195-215.

51. Smith PL, Baukrowitz T, Yellen G. The inward rectification mechanism of the HERG cardiac potassium channel. Nature 1996 Feb 29;379(6568):833-836.

52. Sesti F, Abbott GW, Wei J, Murray KT, Saksena S, Schwartz PJ, Priori SG, Roden DM, George AL Jr, Goldstein SA. A common polymorphism associated with antibiotic-induced cardiac arrhythmia. Proc Natl Acad Sei USA 2000 97(19): 10613-10618.

53. Minardo JD, Heger JJ, Miles WM, Zipes DP, Piystowsky EN. Clinical characteristics of patients with ventricular fibrillation during antiarrhythmic drug therapy. N Engl J Med 1988 Aug 4;319(5):257-62.

54. Curran ME, Splawski I, Timothy KW, Vincent GM, Green ED, Keating MT. A molecular basis for cardiac arrhythmia: HERG mutations cause long QT syndrome. Cell 1995 Mar 10;80(5):795-803.

55. Lee KL, Jim MH, Tang SC, Tai YT. QT prolongation and Torsades de Pointes associated with clarithromycin. Am J Med 1998 Apr; 104(4):395-6.

56. Abbott GW, Ramesh B, Srai SK. Secondary structure of the MiRPl (KCNE2) potassium channel ancillary subunit. Protein Pept Lett 2008;15(l):63-75.

57. Abbott GW, Butler MH, Goldstein SA. Phosphorylation and protonation of neighboring MiRP2 sites: function and pathophysiology of MiRP2-Kv3.4 potassium channels in periodic paralysis. FASEB J 2006 Feb;20(2):293-301.

58. Abbott GW, Butler MH, Bendahhou S, Dalakas MC, Ptacek LJ, Goldstein SA. MiRP2 forms potassium channels in skeletal muscle with Kv3.4 and is associated with periodic paralysis. Cell 2001 104(2):217-231.

59. Choi E, Abbott GW. The MiRP2-Kv3.4 potassium channel: muscling in on Alzheimer's disease. Mol Pharmacol 2007 Sep;72(3):499-501.

60. Ruppersberg JP, Frank R, Pongs O, Stocker M. Cloned neuronal IK(A) channels reopen during recovery from inactivation. Nature 1991 Oct 17;353(6345):657-60.

61. Venance SL, Jurkat-Rott K, Lehmann-Horn F, Tawil R. SCN4A-associated hypokalemic periodic paralysis merits a trial of acetazolamide. Neurology 2004 Nov 23;63(10):1977.

62. Hudson AJ, Ebers GC, Bulman DE. The skeletal muscle sodium and chloride channel diseases. Brain 1995 Apr; 118:547-63.

63. Lane AH, Markarian K, Braziunene I. Thyrotoxic periodic paralysis associated with a mutation in the sodium channel gene SCN4A. J Pediatr Endocrinol Metab 2004 Dec; 17(12): 1679-82.

64. Ptacek LJ, George AL Jr, Griggs RC, Tawil R, Kallen RG, Barchi RL, Robertson M, Leppert MF. Identification of a mutation in the gene causing hyperkalemic periodic paralysis. Cell 1991 Nov 29;67(5):1021-7.

65. Jurkat-Rott K, Lehmann-Horn F. Genotype-phenotype correlation and therapeutic rationale in hyperkalemic periodic paralysis. Neurotherapeutics 2007 Apr;4(2):216-24.

66. Jurkat-Rott K, Lehmann-Horn F. Periodic paralysis mutation MiRP2-R83H in controls: Interpretations and general recommendation. Neurology 2004 Mar 23 ;62(6): 1012-5.

67. Dias Da Silva MR, Cerutti JM, Arnaldi LA, Maciel RM. A mutation in the KCNE3 potassium channel gene is associated with susceptibility tothyrotoxic hypokalemic periodic paralysis. J Clin Endocrinol Metab 2002 Nov;87(l l):4881-4.

68. Sternberg D, Tabti N, Fournier E, Hainque B, Fontaine B. Lack of association of the potassium channel-associated peptide MiRP2-RS3H variant with periodic paralysis. Neurology 2003 Sep 23;61(6):857-9.

69. Lundby A, Ravn LS, Svendsen JH, Hauns S, Olesen SP, Schmitt N. KCNE3 mutation V17M identified in a patient with lone atrial fibrillation. Cell Physiol Biochem 2008;21(l-3):47-54.

70. Benjamin EJ, Wolf PA, D'Agostino RB, Silbershatz H, Kannel WB, Levy D. Impact of atrial fibrillation on the risk of death: the Framingham Heart Study. Circulation 1998 Sep 8;98(10):946-52.

71. Wolf PA, Dawber TR, Thomas HE Jr, Kannel WB. Epidemiologic assessment of chronic atrial fibrillation and risk of stroke: the Framingham study. Neurology 1978 Oct;28(10):973-7.

72. Wattigney WA, Mensah GA, Croft JB. Increased atrial fibrillation mortality: United States, 1980-1998. Am J Epidemiol 2002 May 1;155(9):819-26.

73. McDonald TV, Yu Z, Ming Z, Palma E, Meyers MB, Wang KW, Goldstein SA, Fishman GI. A minK-HERG complex regulates the cardiac potassium current I(Kr). Nature 1997 Jul 17;388(6639):289-92.

74. Anantharam A, Abbott GW. Does hERG coassemble with a beta subunit? Evidence for roles of MinK and MiRPl. Novartis Found Symp 2005;266:100-12; discussion 112-7, 155-8.

75. Um SY, McDonald TV. Differential Association between HERG and KCNE1 or KCNE2. PLoS ONE 2007 Sep 26;2(9):e933.

76. Zhang M, Jiang M, Tseng GN. minK-related peptide 1 associates with Kv4.2 and modulates its gating function: potential role as beta subunit of cardiac transient outward channel? Circ Res 2001 May 25;88(10):1012-9.

77. Nakajo К, Kubo Y. KCNE1 and KCNE3 stabilize and/or slow voltage sensing S4 segment of KCNQ1 channel. J Gen Physiol 2007 Sep; 130(3):269-81.

78. Robbins J. KCNQ potassium channels: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol Ther 2001 Apr;90(l):l-19.

79. Schroeder ВС, Waldegger S, Fehr S, Bleich M, Warth R, Greger R, Jentsch TJ. A constitutively open potassium channel formed by KCNQ1 and KCNE3. Nature 2000 Jan 13;403(6766): 196-9.

80. Panaghie G, Tai KK, Abbott GW. Interaction of KCNE subunits with the KCNQ1 K+ channel pore. J Physiol 2006 Feb l;570(Pt 3):455-67.

81. Valiyaveetil FI, Zhou Y, MacKinnon R. Lipids in the structure, folding, and function of the KcsA K+ channel. Biochemistry 2002 Sep 3;41(35):10771-7.

82. Маниатис Т., Фрич Э., Сембрук Д. Молекулярное клонирование.МирША.

83. Lee АВ, Cooper ТА. Improved direct PCR screen for bacterial colonies: wooden toothpicks inhibit PCR amplification. Biotechniques 1995 Feb;18(2):225-6.

84. Inoue H, Nojima H, Okayama H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 1990 Nov 30;96(l):23-8.

85. Codon Usage in E. coli and Baculovirus AcNPV. Novagen Catalog 2002-2003.

86. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 .Nature 1970 Aug 15;227(259):680-5.

87. Schagger H, von Jagow G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 1987 Nov l;166(2):368-79.

88. Gasparian ME, Ostapchenko VG, Schulga AA, Dolgikh DA, Kirpichnikov MP. Expression, purification, and characterization of human enteropeptidase catalytic subunit in Escherichia coli. Protein Expr Pur if 2003 Sep;31:133-9.

89. Takahashi N, Creighton TE. On the reactivity and ionization of the active site cysteine residues of Escherichia coli thioredoxin. Biochemistry 1996 Jun 25;35(25):8342-53.

90. Holmgren A. Thioredoxin. Annu Rev Biochem 1985 54:237-71.

91. Buchanan BB, Schurmann P, Decottignies P, Lozano RM. Thioredoxin: a multifunctional regulatory protein with a bright future in technology and medicine. Arch Biochem Biophys 1994 Nov 1 ;314(2):257-60.

92. Georgiou G. Expression of protein in bacteria. Protein Eng 1996101.27.

93. Miroux B, Walker JE. Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels. J Mol Biol 1996 Jul 19;260(3):289-9.

94. Dumon-Seignovert L, Cariot G, Vuillard L. The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3). Protein Expr Purif 2004 Sep;37(l):203-6.

95. Roosild TP, Greenwald J, Vega M, Castronovo S, Riek R, Choe S. NMR structure of Mistic, a membrane-integrating protein for membrane protein expression. Science 2005 Feb 25;307(5713):1317-21.

96. Kefala G, Kwiatkowski W, Esquivies L, Maslennikov I, Choe S. Application of Mistic to improving the expression and membrane integration of histidine kinase receptors from Escherichia coli. J Struct Funct Genomics 2007 Dec;8(4): 167-72.

97. Krueger-Koplin RD, Sorgen PL, Krueger-Koplin ST, Rivera-Torres IO, Cahill SM, Hicks DB, Grinius L, Krulwich TA, Girvin ME. An evaluation of detergents for NMR structural studies of membrane proteins. J Biomol NMR 2004 Jan;28(l):43-57.

98. Барсуков JI.И. Как собрать мембрану (солюбилизация и реконструкция мембран). СОЖ2004 1:10-6.

99. Gage SD, Kobertz WR. KCNE3 truncation mutants reveal a bipartite modulation of KCNQ1 K+ channels. J Gen Physiol 2004 Dec; 124(6):759-71.