Исследование антихламидийной активности пептидогликан-распознающих белков человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бобровский Павел Александрович

• Бобровский Павел Александрович
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Бобровский Павел Александрович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования и степень разработанности

Цель работы

Задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Личный вклад автора

Степень достоверности и апробация результатов

Сведения о публикациях по теме диссертации

Структура и объем диссертации

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Иммунитет

1.2. Пептидогликан

1.2.1. Пептидогликан Chlamydia trachomatis

1.2.2. Системы распознавания пептидогликана у человека

1.3. Липополисахариды

1.3.1. Липополисахариды C. trachomatis

1.3.2. Системы распознавания ЛПС у человека

1.4. Особенности жизненного цикла C. trachomatis

1.5. Пептидогликан-распознающие белки

1.5.1. Ткани, синтезирующие пептидогликан-распознающие белки

1.5.2. Строение и функции пептидогликан-распознающих белков

1.5.3. Амидазная и бактерицидная активности PGLYRP

1.5.4. Двухкомпонентные бактериальные системы ответа на стресс

1.5.5. Модель механизма действия пептидогликан-распознающих белков

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы исследования

2.1.1. Штаммы и плазмиды

2.1.2. Микробиологические среды

2.1.3. Растворы для выделения ДНК

2.1.4. Растворы для приготовления компетентных клеток

2.1.5. Буферные растворы

2.1.6. Хроматографические сорбенты, буферные растворы

2.1.7. Реактивы для полимеразной цепной реакции

2.1.8. Реактивы для проведения электрофореза в агарозном геле

2.1.9. Реактивы для проведения электрофореза в акриламидном геле и вестерн-блот гибридизации

2.2. Методы

2.2.1. Выделение РНК

2.2.2. Реакция обратной транскрипции

2.2.3. Получение кРНК библиотеки и транскриптомное профилирование

2.2.4. Препаративное и аналитическое разделение ДНК

2.2.5. Гидролиз ДНК

2.2.6. Лигирование ДНК

2.2.7. Осаждение ДНК с гликогеном

2.2.8. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса

2.2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

2.2.10. Сайт-направленный мутагенез

2.2.11. ПЦР в режиме реального времени

2.2.12. Приготовление компетентных клеток

2.2.13. Химическая трансформация клеток E. coli

2.2.14. Фракционирование E. coli

2.2.15. Денатурирующий электрофорез в ПААГ по Леммли

2.2.16. Вестерн-блот гибридизация

2.2.17. Определение концентрации белка

2.2.18. Выделение рекомбинантных белков с помощью металл-хелатной аффинной хроматографии

2.2.19. Масс-спектрометрический MALDI-TOF анализ рекомбинантных белков

2.2.20. Первичное клонирование структурных частей генов pglyrpl, pglyrp2, pglyrp3, pglyrp4

2.2.21. Анализ антибактериальной активности PGLYRP

2.2.22. Определение МИК PGLYRP для E. coli и B. subtilis

2.2.23. Адсорбция PGLYRP к C. trachomatis

2.2.24. Культивирование эукариотических клеток

2.2.25. Заражение клеток линии HeLa C. trachomatis

2.2.26. Трансфекция клеток

2.2.27. Получение линии клеток HeLa - продуцентов PGLYRP

2.2.28. Определение минимальной ингибирующей концентрации PGLYRP для C. trachomatis

2.2.29. Определение титра дочерних элементарных телец C. trachomatis

2.2.30. Анализ активации экспрессии генов двухкомпонентной системы хламидий

2.2.31. Трансдукция клеток линии HeLa

2.2.32. Получение трансдуцированных линий с активированной экспрессией PGLYRP

2.2.33. Анализ изображений

2.2.34. Анализ данных ПЦР в режиме реального времени

2.2.35. Биоинформатический анализ транскриптомного профилирования

2.2.36. Статистический анализ данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Получение рекомбинантного PGLYRP1 в клетках E. coli

3.2. Выделение рекомбинантных PGLYRP

3.3. Оценка антибактериальной активности PGLYRP, полученных в клетках E. coli

3.4. Конструирование плазмидных векторов для получения PGLYRP в культуре клеток человека и оценка уровня накопления рекомбинантных белков

3.5. Оценка антибактериальной активности рекомбинантных PGLYRP, полученных в стабильных линиях-продуцентах

3.6. Оценка антихламидийной активности PGLYRP, полученных в стабильных линиях-продуцентах

3.7. Выделение рекомбинантных PGLYRP полученных в клетках линии Expi293F в виде слитых белков c лёгкой цепью IgG

3.8. Определение минимальных ингибирующих концентраций PGLYRP по отношению к E. coli и В. subtilis

3.9. Определение МИК PGLYRP по отношению к C. trachomatis

3.10. Определение титра дочерних элементарных телец C. trachomatis после взаимодействия с PGLYRP

3.11. Определение связывания PGLYRP с элементарными тельцам C. trachomatis

3.12. Анализ активации генов двухкомпонентной системы C. trachomatis после взаимодействия с PGLYRP

3.13. Транскриптомное профилирование клеточных линий HeLa-PGLYRP1 и HeLa-PGLYRP1m в ответ на заражение C. trachomatis

3.14. Аннотация дифференциально экспрессирующихся генов в терминах генной онтологии (GO)

3.15. Транскрипционная активация генов собственных pglyrp в клетках линии HeLa с использованием технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 SAM

3.15.1. Конструирование плазмидных векторов для активации экспрессии генов PGLYRP

3.15.2. CRISPR/Cas9 SAM опосредованная активация экспрессии генов pglyrp в клетках линии HeLa

3.15.3. Антихламидийная активность нативных PGLYRP

4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Получение рекомбинантных PGLYRP в клетках E. coli

4.2. Получение рекомбинантных PGLYRP в линиях клетках человека

4.3. Определение антибактериальной активности PGLYRP

4.4. Определение связывания PGLYRP с элементарными тельцами C. trachomatis

4.5. Определение титра дочерних элементарных телец C. trachomatis после взаимодействия с PGLYRP

4.6. Анализ активации экспрессии генов двухкомпонентной системы C. trachomatis ctcB-ctcC после взаимодействия с PGLYRP

4.7. Транскрипционное профилирование клеточных линий HeLa-PGLYRP1 и HeLa-PGLYRPlm в ответ на заражение C. trachomatis

4.8. Транскрипционная активация генов собственных pglyrp в клетках линии HeLa с использованием технологии редактирования генома CRISPR/Cas9 SAM

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования и степень разработанности

Одной из глобальных проблем здравоохранения является снижение эффективности антимикробных препаратов. Распространение лекарственной устойчивости среди патогенных микроорганизмов снижает эффективность терапии инфекционных заболеваний и угрожает проведению различных терапевтических процедур, связанных с риском инфекционных осложнений (хирургические операции, химиотерапия, трансплантология) [1]. Устойчивость бактерий одновременно к нескольким классам антибиотиков приводит к появлению множественной лекарственной устойчивости (МЛУ), широкой лекарственной устойчивости (ШЛУ), а также возникновению микроорганизмов с чрезвычайно высокой устойчивостью, или появлению панрезистивных бактерий [2]. На фоне глобальной проблемы антибиотикорезистентности микроорганизмов становится актуальным поиск новых веществ с высокой антибактериальной активностью [3]. Многообещающими кандидатами на роль прототипов новых высокоэффективных препаратов, направленных на противодействие патогенным бактериями, являются белки врождённой иммунной системы. Одними из них являются пептидогликан-распознающие белки. Их изучение началось с того, что в 1996 году у тутового шелкопряда был описан новый белок врождённой иммунной системы, обладающий бактерицидной активностью, названный позднее пептидогликан-распознающим белком [4]. Затем, его гомологи были найдены у многих организмов, в том числе и у млекопитающих [5].

Пептидогликан-распознающие белки (peptidoglycan recognition proteins, PGLYRP или PGRP) являются важными компонентами врождённого иммунитета, функционирующими в качестве первого барьера иммунной защиты организма. Эти белки способны узнавать пептидогликан и липополисахариды клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий [6]. В геноме человека найдено четыре гена, кодирующих пептидогликан-распознающие белки. Продукты экспрессии данных генов (белки PGLYRP1, PGLYRP2, PGLYRP3, PGLYRP4) обладают антибактериальной активностью, а PGLYRP2 также способен гидролизовать пептидогликан клеточной стенки бактерии [6]. Характерной особенностью пептидогликан-распознающих белков является наличие карбокситерминального пептидогликан-связывающего домена (PGRP-домена) [7]. В 2011 году был описан принципиально новый механизм действия данных белков [8]. Пептидогликан-распознающий белок для гибели патогенного микроорганизма использует защитный механизм самих бактерий. В момент отделения дочерней клетки от материнской, PGRP-домен связывается с открытым участком пептидогликана и активирует бактериальную двухкомпонентную защитную систему ответа на стресс, которая предназначена для распознавания и уничтожения экспортируемых

бактериальной клеткой белков с неправильной третичной структурой. Присоединившийся PGRP-домен, распознается данной системой защиты как дефект белкового транспорта и, в результате активированного самой же бактерией каскада реакций, она погибает [8]. Антибактериальная активность пептидогликан-распознающих белков была показана для многих грамположительных и грамотрицательных бактерий [6]. Однако, для некоторых бактерий, таких как Chlamydia trachomatis, клеточные стенки которых содержат очень мало пептидогликана, несмотря на наличие в геноме генов, кодирующих почти полный путь его метаболизма (пептидогликановый парадокс) [9,10] антибактериальная активность PGLYRP не исследовалась. Кроме того, для C. trachomatis также характерен так называемый липополисахаридный парадокс, так как эта бактерия, несмотря на наличие липополисахаридов, уклоняется от провоспалительных иммунных реакций [11]. В отличие от E. coli, при развитии хламидийной инфекции, в организме не развивается выраженная воспалительная реакция. По данным за 2020, год, C. trachomatis всё ещё является основной причиной бактериальных инфекций, передаваемых половым путём в развитых и неразвитых странах, и поэтому представляет собой глобальную проблему для общественного здравоохранения [12,13]. Несмотря на то, что антибиотикорезистентность у C. trachomatis является чрезвычайно редким явлением, в некоторых случаях описывалась неэффективность терапии заболеваний, вызванных штаммами C. trachomatis с МЛУ, в том числе и в России [14]. Некачественная терапия хламидийной инфекции увеличивает риск перехода инфекции в персистирующую форму, приводящей к хроническому течению заболевания, и, как следствие, развитию бесплодия, внематочной беременности у женщин, а также к эпидидимиту, простатиту, и уретриту у мужчин [12]. На основании этого представляется актуальным исследовать активные рекомбинантные пептидогликан-распознающие белки человека по отношению к микроорганизмам с невыраженным слоем пептидогликана, являющихся возбудителями социально-значимых инфекций.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование антихламидийной активности пептидогликан-распознающих белков человека»

Цель работы

Изучение антибактериальной активности рекомбинантных пептидогликан-распознающих белков человека по отношению к Chlamydia trachomatis.

Задачи исследования

1. Получить рекомбинантные пептидогликан-распознающие белки человека.

2. Определить антимикробную активность рекомбинантных PGLYRP по отношению к внутриклеточному патогену Chlamydia trachomatis.

3. Оценить вовлеченность генов двухкомпонентной системы ответа на стресс хламидий CtcB-CtcC в механизм действия пептидогликан-распознающих белков человека.

4. Активировать с помощью технологии геномного редактирования экспрессию собственных генов pglyrp в линии клеток человека и оценить развитие хламидийной инфекции в этих клетках.

Научная новизна

В настоящей работе впервые исследована активность пептидогликан-распознающих белков человека в отношении внутриклеточной бактерии Chlamydia trachomatis. Активность PGLYRP показана как для рекомбинантных белков, полученных в гомологичной системе экспрессии, так и для нативных белков, экспрессия генов которых была стимулирована системой редактирования генома CRISPR/Cas9 SAM. Были получены клетки почки эмбриона человека Expi293, продуцирующие секретируемые пептидогликан-распознающие белки человека в питательную среду с выходом 50 мг/л. Впервые были получены лентивирусные векторы, кодирующие компоненты системы синергичных медиаторов активации CRISPR/Cas9 SAM, необходимые для активации экспрессии собственных генов пептидогликан-распознающих белков человека в культуре клеток.

Впервые продемонстрирована активация экспрессии генов двухкомпонентной системы CtcB-CtcC C. trachomatis при взаимодействии хламидийных элементарных телец с рекомбинантными пептидогликан-распознающими белками человека. Показано, что PGLYRP прикрепляются к элементарным тельцам C. trachomatis и взаимодействие элементарных телец хламидий с PGLYRP подавляет образование инфекционных дочерних элементарных телец.

Теоретическая и практическая значимость

Данная работа показывает принципиальную возможность использования компонентов врождённого иммунитета человека, а именно пептидогликан-распознающих белков, в качестве антихламидийных агентов. Оказалось, что несмотря на внутриклеточную локализацию, отсутствие выраженного слоя пептидогликана и двухфазный жизненный цикл, хламидии также подвержены действию PGLYRP. Использование компонентов врождённого иммунитета можно рассматривать не только в качестве применения рекомбинантного белка как потенциального антимикробного агента, но и как платформу для разработки синтетических аналогов природных антибактериальных белков, например, миметиков PGRP-домена.

Методология и методы исследования

В настоящей работе использованы современные методы молекулярной биологии, такие как выделение, амплификация, рестрикция и другие манипуляции с ДНК или РНК, методы молекулярного клонирования, работа с рекомбинантными белками, современные методы

протеомного, транскриптомного и биоинформатического анализа. Помимо этого, в работе используются классические бактериологические методы (культивирование клеток Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis, Chlamydia trachomatis, трансформация бактериальных клеток, определение минимальных ингибирующих концентраций) и методы работы с культурами клеток (трансфекция, трансдукция), микроскопия.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Продемонстрирована антимикробная активность рекомбинантных пептидогликан-распознающих белков человека в отношении C. trachomatis. Для рекомбинантных белков PGLYRP1, PGLYRP2, PGLYRP4 определены минимальные ингибирующие концентрации.

2. Показано связывание элементарных телец хламидий с пептидогликан-распознающими белками человека. Показано, что рекомбинантные PGLYRP ингибируют образование инфекционного потомства C. trachomatis.

3. В результате взаимодействия элементарных телец C. trachomatis c PGLYRP показана активация экспрессии генов двухкомпонентной системы ответа на стресс CtcB-CtcC, играющей ключевую роль в механизме действия пептидогликан-распознающих белков на других бактерий.

4. Показано, что с помощью системы синергичных медиаторов активации (CRISPR/Cas9 SAM) можно увеличивать уровень экспрессии собственных генов pglyrp. Это способствует проявлению антихламидийной активности в культуре клеток, в которых активирована экспрессия генов собственных пептидогликан-распознающих белков.

Личный вклад автора

Автором был выполнен поиск и анализ современной научной литературы по теме исследования, проведено планирование экспериментов. Автором были выполнены работы в области получения генетических конструкций, работы с ДНК, РНК, были выполнены все микробиологические и культуральные работы, а также все эксперименты с рекомбинантными белками. Автором был разработан алгоритм автоматического подсчёта хламидийных включений, а также был проведён анализ и интерпретация всех полученных результатов. Автором были подготовлены к публикации и опубликованы три работы, содержащие результаты исследований. Работа была выполнена в лаборатории генной инженерии ФГБУ ФНКЦ ФХМ им. Ю. М. Лопухина ФМБА России в период с 2015 по 2021 год.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов обеспечена контролем основных этапов исследования (секвенирование последовательностей, идентификация рекомбинантных белков с применением масс-спектрометрии). Достоверность результатов по определению антибактериальной активности белков и ПЦР в режиме реального времени обеспечивали использованием контролей и применением статистических методов сравнения выборок.

Результаты исследования были представлены и обсуждены на российских и международных конференциях: Конференция молодых учёных "Молекулярная медицина и постгеномная биология" НИИ ФХМ (Москва, 2013), XX международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2013, (Москва, 2013), VIII международная (XVII всероссийская) Пироговская научная медицинская конференции студентов и молодых учёных (Москва, 2013), Школа «Геномика и системная биология», (Звенигород, 2014), Научная конференция молодых учёных ФГБУН НИИ ФХМ ФМБА России (Москва, 2014), III ICAR 2015 (Мадрид, 2015), Научная конференция молодых учёных по медицинской биологии ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА (Москва, 2016), 43rd FEBS Congress (Прага, 2018), Итоговая научно-практическая конференция ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России (Москва, 2020), Конференция молодых учёных ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России (Москва, 2021).

Сведения о публикациях по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них одна статья в зарубежном журнале и две статьи в журналах из перечня рецензируемых научных журналов ВАК Минобрнауки РФ, 11 тезисов в материалах российских и международных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 135 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов, заключения, списка сокращений и условных обозначений, благодарностей и списка литературы. Диссертационная работа содержит 9 таблиц и 54 рисунка. Библиографический указатель включает 197 литературных источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В середине двадцатого столетия в медицинской практике начали использовать антибиотики для борьбы с бактериальными инфекциями, и они быстро получили широкое распространение. Несмотря на ошеломляющий терапевтический эффект, улучшения продолжительности и качества жизни человека, а также повышение выживаемости, у ряда бактерий появились штаммы, устойчивые к данным препаратам. С течением времени, проблема развития резистентности к антибиотикам у патогенных бактерий усугубляется. Глобальная проблема антибиотикорезистентности микроорганизмов делает актуальным поиск новых веществ, обладающих бактерицидными свойствами. В процессе поиска учёные все чаще обращают своё внимание на природную систему защиты от инфекций - иммунитет.

1.1. Иммунитет

Иммунитет - совокупность реакций организма, защищающих его от инфекционных и неинфекционных агентов, а также веществ, обладающим антигенными свойствами. Иммунитет свойственен почти всем многоклеточным организмам и обеспечивается комплексом клеточных и гуморальных, специфических и неспецифических защитных реакций, благодаря которым поддерживается постоянство внутренней среды организма [15]. Помимо этого, иммунитет также характерен и для бактериальных клеток - система СЯКРЯ (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами) обеспечивает адаптивный иммунитет за счёт связывания компонентов системы с нуклеиновым кислотами чужеродных организмов и последующего их разрешения [16]. Также для защиты бактериальные клетки широко используют систему рестрикции-модификации, что позволяет разрушать попавшую в клетку чужеродную ДНК [17].

Различают два вида иммунитета: приобретённый и врождённый. Приобретённый иммунитет возникает в результате взаимодействия организма с антигенами инфекционных агентов после перенесённой инфекционной болезни, после вакцинации или с аллергенами и не передаётся по наследству. Одна из особенностей приобретённого иммунитета - строгая специфичность: он вырабатывается лишь к определённому микроорганизму (антигену), попавшему или введённому в организм. Приобретённый иммунитет обусловлен работой Т- и В-лимфоцитов. Врождённый иммунитет (видовой, наследственный, естественный, конституциональный иммунитет) передаётся по наследству, как и другие генетические признаки. Компонентами врождённого иммунитета являются фагоциты и гранулоциты, а также белковые молекулы, которые распознают различные элементы патогенных организмов: тейхоевые кислоты, пептидогликан, липополисахариды, неметилированную ДНК. Одним из компонентов врождённого иммунитета являются пептидогликан-распознающие белки человека, распознающие пептидогликан и липополисахариды клеточных стенок бактерий [3].

1.2. Пептидогликан

Пептидогликан - элемент клеточной стенки практически всех бактерий, не встречается в эукариотических клетках и является мишенью для некоторых компонентов врождённого иммунитета [18]. Пептидогликан - гетерополимер N-ацетилглюкозамина (GlcNAc) и N-ацетилмурамовой кислоты (MurNAc), связанный через лактатные остатки N-ацетилмурамовой кислоты короткими пептидными цепочками. Полисахаридная часть пептидогликана консервативна практически у всех бактерий, кроме некоторых исключений, например, связанных с О-ацетилированием, обеспечивающим устойчивость к лизоциму у Staphylococcus aureus [19,20]. Выделяют два типа пептидогликана: DAP-тип, который встречается у грамотрицательных бактерий и грамположительных бацилл, а также Lys-тип, встречающийся у остальных грамположительных бактерий. Пептиды пептидогликанов DAP-типа обычно соединены напрямую (Рисунок 1, Б), причём в качестве третьей аминокислоты выступает мезо-диаминопимелиновая кислота (m-DAP) (Рисунок 1, В), в то время как пептиды пептидогликанов Lys-типа соединены через мостик (Рисунок 1, А), состав и длина которого зависит от вида бактерии [21].

Рисунок 1. Структура пептидогликанов бактерий. А) Пептидогликан Lys-типа: в качестве третьей аминокислоты L-лизин. Два пептида соединены через пентаглициновый мостик (Gly)5, Б) Пептидогликан DAP-типа: мезо-диаминопимелиновая кислота (m-DAP) в качестве третьей аминокислоты. Два пептида соединены напрямую mDAP-D-Ala; В) Структура мезо-диаминопимелиновой кислоты (m-DAP) [21].

Синтез пептидогликана представляет собой достаточно сложную цепь реакций [22]. Схема биосинтеза пептидогликана представлена на рисунке 2. За счёт гидролиза пирофосфатной связи из №цетилглюкозамин-1-фосфата и уридинтрифосфата (UTP) образуется уридиндифосфат-Ы-ацетилглюкозамин (UDP-GlcNAc). Далее, из фосфоенолпирувата и

уридиндифосфат-Ы-ацетилглюкозамина образуется UDP-N-ацетилмурамовая кислота (UDP-MurNAc). Пептидная цепь начинает расти с образования пептидной связи между карбоксильной группой MurNAc (описанного выше комплекса) и остатком L-аланина. Далее, в случае синтеза пептидогликана по Lys- типу присоединяются D-глутамат, и дипептид D-аланил-О-аланин. Этот комплекс переносится на гидрофобный переносчик, состоящий из 11 изопреновых единиц. Далее, УДФ-GlcNAc образует 1,4 Р-гликозидную связь с C4 MurNAc и в это же время на 8-аминогруппе остатка лизина встраивается пентаглициновый мостик, после чего весь комплекс переносится липидным переносчиком (Рисунок 2) на наружную сторону мембраны к растущей цепи пептидогликана. Атом Ci MurNAc находится в активированном состоянии пока он связан с переносчиком. Он вступает в реакцию с С4 GlcNAc растущей цепи, образуя 1,4 Р-гликозидную связь. Формирование поперечных сшивок происходит за счёт реакции транспептидирования, в ходе которой аминогруппа одного пентаглицинового мостика атакует пептидную связь между дипептидом D-аланил-О-аланина, при этом образуется связь между глицином и аланином. В случае синтеза по DAP-типу, пентаглициновый мостик не синтезируется, и мезо-DAP кислота связывается с одним D-аланином из дипептида [23].

А

Клеточная стенка

Carboxypeptldase

яра

L-Ala

1ШЯ

L-Ala

ES

L-Ala D-iGlu

NH2-(CB)„-DAA D-iGlu D-Àla-fCBtn-OAA D-Âla

D-Ala

IBS1 D-Ala D-Ala

D-iGlu L-Ala Transpeptidase D-Ala Transglycosylase D'Ala

NH2-<CB)„-DAA D-iGlu .4- MH2-(CB)n - DAA <0 NH2-(CB)„ - DAA

D-Ala-(CB)„-DAA D-iGlu D-iGlu

D-Ala L-Ala L-Àla

D-Âla Hil-G^-S-liKSj IlitufNAc-GtcNAcl

y C55-P Щ C55-PP -4- C55-PP «

: - > Мембрана , v^y,,--

C55 C55-PP C55-PP C55-PP '

iMurtWi

L-Ala

D-iGlu (i,pni i) Nt^-DAA

D-Âla _

D-Âla

Цитоплазма

C55-PP L-Ala

DHGIU (ipdii) Hj-DAA ^ D-Ala

C55-PP • IMurNAc-GIcNftc

D-Ala

tRNA-CB

L-Ala D-iGlu H2-(CB)n-DAA D-Âla D-Âla

UMP UTP lUDP-GIcNAcl ■ tolcNAci

UPP^urNActL-Ala-D-iGlu-PAA-D-Ala-D-Ala (Park 's Nucleotide)

D-Ala-D-Ala ~À

S

2 О-Ala UDPWutNActL-Ala-D-iGlu- DAA ^ 4 L-Lys Of m-Dpm

I .Д1я

UDPfClcNAclenolpvnivale

jL

иортата

^__L-Ala

UDP®rRA0}L-Ala

UDP-IMulNActL-Ala-D-iGlu

( I"'

"OjP—О—CHj—CH=C—CHj—\CH2—CH—С—CH2

ch,

t

-СН,—CH=C-CHj

Рисунок 2. Схема биосинтеза пептидогликана. А) основные компоненты, участвующие в биосинтезе пептидогликана; Б) структура липидного переносчика, состоящего из 11 изопреновых единиц [24]

У грамположительных бактерий примерно половина массы клеточной стенки приходится на пептидогликановый слой. У грамотрицательных бактерий, между цитоплазматической мембраной и наружной мембраной, содержащей липополисахариды находится сравнительно тонкий слой пептидогликана. Пептидогликан образует большую макромолекулу, окружающую всю клетку. Две основные функции пептидогликана - это поддержание формы клетки и противодействие высокому осмотическому давлению бактериальных протопластов (грамположительные бактерии, полностью лишённые пептидогликана) и сферопластов (чаще грамотрицательные бактерии с частично разрушенной клеточной стенкой). Когда целостность пептидогликана нарушена, бактерии подвергаются осмотическому лизису. По этой причине, часть антибиотиков, применяемых в клинической практике, подавляют синтез бактериальной клеточной стенки. Пептидогликан также участвует в регуляции клеточного деления и является крепёжной конструкцией для тейхоевых кислот клеточной стенки, белков и полисахаридов, которые ковалентно связаны с пептидогликаном. Фрагменты пептидогликана могут функционировать в качестве сигналов в межклеточных взаимодействиях [25].

1.2.1. Пептидогликан Chlamydia trachomatis

Не все бактерии имеют выраженный слой пептидогликана. К их числу относят хламидий, являющихся грамотрицательными внутриклеточными бактериями. Человека инфицируют в основном Chlamydia trachomatis и Chlamydia pneumoniae, вызывая трахому, урогенитальные инфекции или венерическую лимфогранулёму. Несмотря на то, что хламидий относят к грамотрицательным бактериям, их клеточная стенка отличается от клеточной стенки других бактерий. Долгое время считалось, что хламидии не содержат пептидогликан в достаточном количестве для его обнаружения [10], несмотря на то, что геном хламидий кодирует почти полный набор ферментов, встречающихся у E. coli, участвующих в биосинтезе пептидогликана [26]. Помимо этого, была показана и чувствительность к антибиотикам, мишенью действия которых является пептидогликан [27-29], что привело к появлению термина «пептидогликановый парадокс», заключающийся в чувствительности хламидий к антибиотикам пенициллинового ряда в отсутствие детектируемого пептидогликана. Отличия от E. coli заключаются в отсутствии генов, кодирующих глутамат-изомеразу Muri и аланинизомеразу Alr, а также то, что два фермента (L-аланин-лигаза (MurC) и D-аланил-Б-аланин-лигаза (Ddl)) синтезируются в виде слитого белка (Рисунок 3). Белок Muri переводит L-глутамат в D-глутамат, а Alr участвует в изомеризации L-аланина в D-аланин, который затем присоединяется к

синтезирующемуся комплексу в виде дипептида D-аланил-D-аланина. Слитой фермент МигС-Ddl участвует в присоединении D-аланил-D-аланина к UDP-MurNAc (МигС) у хламидий [10]. До сих пор неизвестно что является источником D-аминокислот у хламидий и обладает ли слитой белок MurC-Ddl функцией изомеразы [30].

Рисунок 3. Схема биосинтеза пептидогликана у E. coli и C. trachomatis. В прямоугольниках представлены ферменты, участвующие в биосинтезе пептидогликана. Темно-серые прямоугольники - те ферменты, которые отсутствуют у хламидии. Светло-серыми прямоугольниками указаны ферменты, которые у хламидии синтезируются в виде слитого белка

[30].

В 2014 году пептидогликан у C. trachomatis был обнаружен с использованием меченных модифицированных зондов D-Ala-D-Ala с применением технологи клик-химии [31]. Перед этим, несколько групп исследователей, изучив профиль транскрипции генов хламидий на разных этапах жизненного цикла, показали, что гены биосинтеза пептидогликана активируются в момент перехода из формы элементарных телец в форму ретикулярных телец [32-34], что может говорить о потребности в пептидогликане ретикулярных телец при клеточном делении. Авторы показали включение меченых зондов в пептидогликановую цепь уже через 8 часов после заражения культуры клеток [31].

1.2.2. Системы распознавания пептидогликана у человека

Пептидогликан или его фрагменты распознаются организмом человека и индуцируют воспаление, нагноение, лихорадку, артрит, сонливость, снижение аппетита, артериальную гипотензию, лейкоцитоз, тромбоцитопению, а также усиленный иммунный ответ [18,35,36]. Сочетание пептидогликана и липотейхоевых кислот вызывает шок и полиорганную недостаточность [37]. Большинство из этих эффектов индуцировано стимуляцией секреции цитокинов и хемокинов [38-41].

У высших млекопитающих описано три типа систем, распознающих пептидогликан: системы внеклеточного и внутриклеточного распознавания пептидогликана, а также система, состоящая из растворимых молекул, распознающих пептидогликан. За внеклеточное распознавание пептидогликана отвечает связанный с мембраной гликозилфосфатидилинозитол-связанный белок (CD14) [42], а также Toll-подобный рецептор-2 (TLR2) [43]. Молекулы CD14 и TLR2 преимущественно представлены на поверхности моноцитов, дендритных клеток и макрофагов. Их активация приводит к секреции провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли, интерлейкины IL-1, IL-6 и IL-8) [38,41]. Данная провоспалительная система помогает сдержать развитие инфекции до появления адаптивного иммунного ответа. Активация Toll-подобных рецепторов на антиген-презентирующих клетках (В-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки) так же необходима для инициации адаптивного ответа иммунной системы за счёт индукции созревания антиген-презентирующих клеток, секреции цитокинов и синтезу ко-стимулирующих молекул, необходимых для презентации антигена и активации Т-хелперов. CD1 и TLR2 распознают много разных бактериальных компонентов, в том числе и пептидогликан [42,44,45].

К системе внутриклеточного распознавания относят два белка, относящихся к семейству NOD-подобных рецепторов: Nodi и Nod2. Nodi чувствителен к грамотрицательным бактериям и некоторым грамположительным, распознавая фрагменты пептидогликана, содержащие мезо-DAP кислоты. Минимальный фрагмент пептидогликана, распознаваемый рецептором Nodi - L-аланил-й-глутамат-DAP [46,47].

Для Nod2 минимальный участок пептидогликана представляет собой дипептид: MurNAc-L-аланил-D-изоглютамин (MDP) [47-49]. Так как MDP представлен в составе пептидогликана всех пептидогликансодержащих бактерий, Nod2 чувствителен ко всем этим бактериям. До сих пор неясен механизм взаимодействия Nod с пептидогликаном: или Nodi -2 связывают пептидогликан, или они взаимодействуют только с распознаваемыми фрагментами. Некоторые бактерии (Salmonella, Shigella и Listeria) секретируют растворимые фрагменты пептидогликана, которые не распознаются Nod-рецепторами, что позволяет им избегать ответа иммунной системы

[25]. Так же, до сих пор не ясно как именно бактерии и внеклеточные фрагменты пептидогликана достигают цитоплазматических Nod-рецепторов. Nodi синтезируется во многих клетках, в то время как Nod2 синтезируется преимущественно в моноцитах, макрофагах и дендритных клетках [50]. Nodi и Nod2 опосредованно активируют ядерный фактор NF-kB через серин-треонин киназу [50]. Эта активация не зависит от TLR и представляет собой второй провоспалительный путь, который работает синергично с описанным выше [51,52].

К системам распознавания пептидогликана, состоящей из растворимых молекул, относят пептидогликан-распознающие белки (бактерицидные (PGLYRPi, PGLYRP2, PGLYRP3, PGLYRP4) и с амидазной активностью (PGLYRP2)), растворимые CDi4, а также лектины С-типа, специфичные к N-ацетилглюкозамину и N-ацетилмурамовой кислоте, которые активируют комплемент и модулируют ответ организма по отношению к пептидогликану [53,54]. Так же, к этой системе относятся бактерицидные HIP/PAP белки, секретируемые клетками Пеннета [55] и лизоцим (мурамидаза), присутствующий в слёзной жидкости, слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, слюне. Лизоцим гидролизует (!^)-гликозидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и N-ацетилглюкозамином. Как было сказано выше, О-ацетилирование делает пептидогликан устойчивым к лизоциму [19,20]. Показано, что лизоцим так же обладает антибактериальной активностью, независящей от пептидогликан-гидролизующей активности [55,56].

1.3. Липополисахариды

Липополисахариды (ЛПС) - важный компонент наружной мембраны грамотрицательных бактерий. Наружная мембрана грамотрицательных бактерий представлена асимметричным двойным слоем с ЛПС снаружи и фосфолипидом внутри. ЛПС состоит из трёх компонентов: липид А - гидрофобный домен, который является эндотоксином и основным фактором вирулентности, О-антиген - повторяющийся гидрофильный дистальный олигосахарид, а также полисахарид гидрофильного ядра (Рисунок 4).

Glu -Hep Glu

O-Antigen

Glu-Gal P-Hep- Hep PEtN-Hep KDO

KDO-KDO-PEtN

о и

о

P , _ n

O" l4OH O"

o

II

p.

Рисунок 4. Структура ЛПС E. coli. ЛПС состоит из трёх компонентов - липид А, О-антиген и центральный (коровый) олигосахарид. Липид А — дисахарид с несколькими соединёнными цепями гидроксимиристиновой жирной кислоты, который фиксирует молекулу ЛПС в бактериальной мембране. Центральный олигосахарид состоит из кетодезоксиоктулозоната (Kdo) и гептозы (Hep) и соединяет липид А с О-антигеном. О-антиген - полисахаридные цепи, которые соединены с центральным олигосахаридом. Экспонирован в окружающую среду [57].

Из трёх компонентов липид А является наиболее иммуногенным компонентом ЛПС, способным вызывать лихорадку, диарею, и септический (эндотоксический) шок [58]. Структура липида А различается у разных штаммов, видов и подвидов бактерий [59]. В отличие от липида А, О-антигены являются наиболее вариабельной частью молекулы ЛПС. Эта вариабельность придаёт молекуле ЛПС антигенную специфичность. Размер или состав О-антигена может надёжно указывать на потенциал вирулентности бактериального штамма. Модификации О-антигена, вероятно, играют существенную роль в инфекционном процессе: они дают возможность колонизировать организм и обходить защитные механизмы [58].

1.3.1. Липополисахариды C. trachomatis

Инфекции, вызываемые C. trachomatis, могут приводить к тяжёлым последствиям, таким как воспалительные заболевания органов малого таза, бесплодие и внематочная беременность [60]. Тяжесть течения обусловлена, в том числе и из-за бессимптомного течения инфекции на начальных этапах развития. Причина высокой частоты бессимптомной инфекции связана с патогенной стратегией уклонения от провоспалительных иммунных реакций, несмотря на то что внешняя мембрана C. trachomatis содержит липополисахариды. Структура ЛПС C. trachomatis

имеет ряд отличий от ЛПС E. coli, позволяющих не вызывать сильный иммунный ответ организма. Липид А хламидий содержит 5 жирных кислот, а не шесть (Рисунок 5). Многие исследования показали, что структура ЛПС, в котором липид А содержит меньше 6 цепей жирных кислот, слабее индуцирует провоспалительный путь TLR4 [61,62]. При этом переход к форме, содержащей 6 цепей также невозможен: у хламидий отсутствует ген lpxM, кодирующий ацилтрансферазу, катализирующую вторичное ацилирование R-3-гидроксиацильной цепи в положении 3' Кёо3-липида IVA (Рисунок 5, А), помимо этого, три цепи жирных кислот в ЛПС хламидий состоят из 18-20 атомов углерода, в отличие от более коротких, встречающихся у E. coli, что так же способствует более низкому иммунному ответу со стороны компонентов врождённого иммунитета [62].

Рисунок 5. Отличия ЛПС C. trachomatis и E. coli. ЛПС C. trachomatis (А) содержит 5 цепей жирных кислот, при этом 3 из них состоят из 18-20 атомов углерода (выделены красным) [11].

В экспериментальных моделях септического шока, путём введения мышам ЛПС, была продемонстрирована выживаемость 95% мышей при введении хламидийных ЛПС в дозе 1 мг/кг, в то время как при введении ЛПС E. coli, летальность наблюдалась при дозе 0,01 мг/кг [11]. Неспособность ЛПС C. trachomatis запускать воспалительные реакции врождённой иммунной системы связана с его уникальной структурой жирных кислот. Эволюционная модификация структуры ЛПС, вероятно, развилась как патогенная стратегия подавления врождённых механизмов защиты организма, что позволяет объяснить высокую заболеваемость бессимптомной хламидийной урогенитальной инфекцией.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бобровский Павел Александрович, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Rossolini G.M. et al. Update on the antibiotic resistance crisis. // Curr Opin Pharmacol. England, 2014. Vol. 18. P. 56-60.

2. Magiorakos A.-P. et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. // Clin Microbiol Infect. England, 2012. Vol. 18, № 3. P. 268-281.

3. Oyston P.C.F. et al. Novel peptide therapeutics for treatment of infections. // J Med Microbiol. England, 2009. Vol. 58, № Pt 8. P. 977-987.

4. Yoshida H., Kinoshita K., Ashida M. Purification of a peptidoglycan recognition protein from hemolymph of the silkworm, Bombyx mori. // J Biol Chem. United States, 1996. Vol. 271, № 23. P. 13854-13860.

5. Kang D. et al. A peptidoglycan recognition protein in innate immunity conserved from insects to humans. // Proc Natl Acad Sci U S A. United States, 1998. Vol. 95, № 17. P. 10078-10082.

6. Lu X. et al. Peptidoglycan recognition proteins are a new class of human bactericidal proteins. // J Biol Chem. United States, 2006. Vol. 281, № 9. P. 5895-5907.

7. Dziarski R., Gupta D. Review: Mammalian peptidoglycan recognition proteins (PGRPs) in innate immunity. // Innate Immun. United States, 2010. Vol. 16, № 3. P. 168-174.

8. Kashyap D.R. et al. Peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by activating protein-sensing two-component systems. // Nat Med. 2011. Vol. 17, № 6. P. 676-683.

9. Chopra I. et al. Antibiotics, peptidoglycan synthesis and genomics: the chlamydial anomaly revisited. // Microbiology (Reading). England, 1998. Vol. 144 ( Pt 1. P. 2673-2678.

10. McCoy A.J., Sandlin R.C., Maurelli A.T. In vitro and in vivo functional activity of Chlamydia MurA, a UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase involved in peptidoglycan synthesis and fosfomycin resistance. // J Bacteriol. 2003. Vol. 185, № 4. P. 1218-1228.

11. Yang C. et al. Chlamydia trachomatis Lipopolysaccharide Evades the Canonical and Noncanonical Inflammatory Pathways To Subvert Innate Immunity. // mBio. 2019. Vol. 10, № 2.

12. Mohseni M., Sung S., Takov V. Chlamydia. Treasure Island (FL), 2021.

13. Nkwabong E. What are the most common sexually transmitted bacteria in women with cervico-vaginitis nowadays? // Indian J Sex Transm Dis AIDS. 2020. Vol. 41, № 1. P. 39-42.

14. Шипицина Е.В. с соавт. Устойчивость Chlamydia trachomatis к антибиотикам: методологические аспекты и клиническое значение // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2004. Vol. 6, № 1. P. 54-64.

15. Nicholson LB. The immune system. // Essays Biochem. 2016. Vol. 60, № 3. P. 275-301.

16. Barrangou R. CRISPR-Cas systems and RNA-guided interference // Wiley Interdiscip Rev RNA. Wiley Interdiscip Rev RNA, 2013. Vol. 4, № 3. P. 267-278.

17. Wilson G.G. Organization of restriction-modification systems // Nucleic Acids Res. Nucleic Acids Res, 1991. Vol. 19, № 10. P. 2539-2566.

18. Stewart-Tull D.E. The immunological activities of bacterial peptidoglycans. // Annu Rev Microbiol. United States, 1980. Vol. 34. P. 311-340.

19. Bera A. et al. Why are pathogenic staphylococci so lysozyme resistant? The peptidoglycan O-acetyltransferase OatA is the major determinant for lysozyme resistance of Staphylococcus aureus. // Mol Microbiol. England, 2005. Vol. 55, № 3. P. 778-787.

20. Shimada T. et al. Staphylococcus aureus evades lysozyme-based peptidoglycan digestion that links phagocytosis, inflammasome activation, and IL-1beta secretion. // Cell Host Microbe. 2010. Vol. 7, № 1. P. 38-49.

21. Dziarski R. Peptidoglycan recognition proteins (PGRPs). // Mol Immunol. England, 2004. Vol. 40, № 12. P. 877-886.

22. Merser C., Sinay P., Adam A. Total synthesis and adjuvant activity of bacterial peptidoglycan derivatives. // Biochem Biophys Res Commun. United States, 1975. Vol. 66, № 4. P. 1316-1322.

23. Uehara A. et al. Meso-diaminopimelic acid and meso-lanthionine, amino acids specific to bacterial peptidoglycans, activate human epithelial cells through NOD1. // J Immunol. United States, 2006. Vol. 177, № 3. P. 1796-1804.

24. Ton-That H., Marraffini L.A., Schneewind O. Protein sorting to the cell wall envelope of Gram-positive bacteria. // Biochim Biophys Acta. Netherlands, 2004. Vol. 1694, № 1-3. P. 269-278.

25. Cloud-Hansen K.A. et al. Breaching the great wall: peptidoglycan and microbial interactions. // Nature reviews. Microbiology. England, 2006. Vol. 4, № 9. P. 710-716.

26. Stephens R.S. et al. Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis. // Science. United States, 1998. Vol. 282, № 5389. P. 754-759.

27. Moulder J.W., Novosel D.L., Officer J.E. Inhibition of the growth of agents of the psittacosis group by D-cycloserine and its specific reversal by D-alanine. // J Bacteriol. 1963. Vol. 85, № 3. P. 707711.

28. Tamura A., Manire G.P. Effect of penicillin on the multiplication of meningopneumonitis organisms (Chlamydia psittaci). // J Bacteriol. 1968. Vol. 96, № 4. P. 875-880.

29. Moulder J.W. Why is Chlamydia sensitive to penicillin in the absence of peptidoglycan? // Infect Agents Dis. United States, 1993. Vol. 2, № 2. P. 87-99.

30. McCoy A.J., Maurelli A.T. Characterization of Chlamydia MurC-Ddl, a fusion protein exhibiting D-alanyl-D-alanine ligase activity involved in peptidoglycan synthesis and D-cycloserine sensitivity. // Mol Microbiol. England, 2005. Vol. 57, № 1. P. 41-52.

31. Liechti G.W. et al. A new metabolic cell-wall labelling method reveals peptidoglycan in Chlamydia trachomatis. // Nature. England, 2014. Vol. 506, № 7489. P. 507-510.

32. Albrecht M. et al. Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. // Nucleic Acids Res. 2010. Vol. 38, № 3. P. 868-877.

33. Belland R.J. et al. Genomic transcriptional profiling of the developmental cycle of Chlamydia trachomatis. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2003. Vol. 100, № 14. P. 8478-8483.

34. Omsland A. et al. Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. Vol. 109, № 48. P. 19781-19785.

35. Bahr G.M. et al. Detection of antibodies to muramyl dipeptide, the adjuvant moiety of streptococcal cell wall, in patients with rheumatic fever. // J Infect Dis. United States, 1986. Vol. 154, № 6. P. 1012-1017.

36. Heymer B. et al. Detection of antibodies to bacterial cell wall peptidoglycan in human sera. // J Immunol. United States, 1976. Vol. 117, № 1. P. 23-26.

37. de Kimpe S.J. et al. The cell wall components peptidoglycan and lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus act in synergy to cause shock and multiple organ failure. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. Vol. 92, № 22. P. 10359-10363.

38. Lee S.-A. et al. Peptidoglycan enhances secretion of monocyte chemoattractants via multiple signaling pathways. // Biochem Biophys Res Commun. United States, 2011. Vol. 408, № 1. P. 132-138.

39. Olaru F., Jensen L.E. Staphylococcus aureus stimulates neutrophil targeting chemokine expression in keratinocytes through an autocrine IL-1alpha signaling loop. // J Invest Dermatol. 2010. Vol. 130, № 7. P. 1866-1876.

40. Saha S. et al. PGLYRP-2 and Nod2 are both required for peptidoglycan-induced arthritis and local inflammation. // Cell Host Microbe. 2009. Vol. 5, № 2. P. 137-150.

41. Enoksson M. et al. Human cord blood-derived mast cells are activated by the Nod1 agonist M-TriDAP to release pro-inflammatory cytokines and chemokines. // J Innate Immun. Switzerland, 2011. Vol. 3, № 2. P. 142-149.

42. Dziarski R., Tapping R.I., Tobias P.S. Binding of bacterial peptidoglycan to CD14. // J Biol Chem. United States, 1998. Vol. 273, № 15. P. 8680-8690.

43. Schwandner R. et al. Peptidoglycan- and lipoteichoic acid-induced cell activation is mediated by toll-like receptor 2. // J Biol Chem. United States, 1999. Vol. 274, № 25. P. 17406-17409.

44. Iwaki D. et al. The extracellular toll-like receptor 2 domain directly binds peptidoglycan derived from Staphylococcus aureus. // J Biol Chem. United States, 2002. Vol. 277, № 27. P. 2431524320.

45. Mitsuzawa H. et al. Extracellular Toll-like receptor 2 region containing Ser40-Ile64 but not Cys30-Ser39 is critical for the recognition of Staphylococcus aureus peptidoglycan. // J Biol Chem. United States, 2001. Vol. 276, № 44. P. 41350-41356.

46. Chamaillard M. et al. An essential role for NOD1 in host recognition of bacterial peptidoglycan containing diaminopimelic acid. // Nat Immunol. United States, 2003. Vol. 4, № 7. P. 702-707.

47. Girardin S.E. et al. Peptidoglycan molecular requirements allowing detection by Nodi and Nod2. // J Biol Chem. United States, 2003. Vol. 278, № 43. P. 41702-41708.

48. Girardin S.E. et al. Nod2 is a general sensor of peptidoglycan through muramyl dipeptide (MDP) detection. // J Biol Chem. United States, 2003. Vol. 278, № 11. P. 8869-8872.

49. Inohara N. et al. Host recognition of bacterial muramyl dipeptide mediated through NOD2. Implications for Crohn's disease. // J Biol Chem. United States, 2003. Vol. 278, № 8. P. 5509-5512.

50. Strober W. et al. Signalling pathways and molecular interactions of NOD1 and NOD2. // Nat Rev Immunol. England, 2006. Vol. 6, № 1. P. 9-20.

51. Miceli-Richard C. et al. CARD15 mutations in Blau syndrome. // Nat Genet. United States, 2001. Vol. 29, № 1. P. 19-20.

52. Hugot J.P. et al. Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn's disease. // Nature. England, 2001. Vol. 411, № 6837. P. 599-603.

53. Ma Y.G. et al. Human mannose-binding lectin and L-ficolin function as specific pattern recognition proteins in the lectin activation pathway of complement. // J Biol Chem. United States, 2004. Vol. 279, № 24. P. 25307-25312.

54. Nadesalingam J. et al. Mannose-binding lectin recognizes peptidoglycan via the N-acetyl glucosamine moiety, and inhibits ligand-induced proinflammatory effect and promotes chemokine production by macrophages. // J Immunol. United States, 2005. Vol. 175, № 3. P. 1785-1794.

55. Cash H.L. et al. Symbiotic bacteria direct expression of an intestinal bactericidal lectin. // Science. 2006. Vol. 313, № 5790. P. 1126-1130.

56. Ibrahim H.R., Matsuzaki T., Aoki T. Genetic evidence that antibacterial activity of lysozyme is independent of its catalytic function. // FEBS Lett. England, 2001. Vol. 506, № 1. P. 27-32.

57. Ruiz N., Kahne D., Silhavy T.J. Transport of lipopolysaccharide across the cell envelope: the long road of discovery // Nature Reviews Microbiology 2009 7:9. Nature Publishing Group, 2009. Vol. 7, № 9. P. 677-683.

58. Farhana A., Khan Y.S. Biochemistry, Lipopolysaccharide // StatPearls. StatPearls Publishing,

2022.

59. Steimle A., Autenrieth I.B., Frick J.S. Structure and function: Lipid A modifications in commensals and pathogens // Int J Med Microbiol. Int J Med Microbiol, 2016. Vol. 306, № 5. P. 290301.

60. Wiesenfeld H.C. et al. Comparison of acute and subclinical pelvic inflammatory disease // Sex Transm Dis. Sex Transm Dis, 2005. Vol. 32, № 7. P. 400-405.

61. Needham B.D., Trent M.S. Fortifying the barrier: the impact of lipid A remodelling on bacterial pathogenesis // Nature Reviews Microbiology 2013 11:7. Nature Publishing Group, 2013. Vol.

11, № 7. P. 467-481.

62. Xiao X., Sankaranarayanan K., Khosla C. Biosynthesis and structure-activity relationships of the lipid a family of glycolipids // Curr Opin Chem Biol. Elsevier Current Trends, 2017. Vol. 40. P. 127-137.

63. Liu Y. et al. TLR2 and TLR4 in Autoimmune Diseases: a Comprehensive Review // Clin Rev Allergy Immunol. Humana Press Inc., 2014. Vol. 47, № 2. P. 136-147.

64. Shi J. et al. Inflammatory caspases are innate immune receptors for intracellular LPS // Nature 2014 514:7521. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 514, № 7521. P. 187-192.

65. Vanaja S.K. et al. Bacterial Outer Membrane Vesicles Mediate Cytosolic Localization of LPS and Caspase-11 Activation // Cell. Cell Press, 2016. Vol. 165, № 5. P. 1106-1119.

66. Dziarski R., Gupta D. Mammalian PGRPs: novel antibacterial proteins. // Cell Microbiol. England, 2006. Vol. 8, № 7. P. 1059-1069.

67. Malhotra M. et al. Genital Chlamydia trachomatis: an update. // Indian J Med Res. 2013. Vol. 138, № 3. P. 303-316.

68. de Vrieze N.H.N., de Vries H.J.C. Lymphogranuloma venereum among men who have sex with men. An epidemiological and clinical review. // Expert Rev Anti Infect Ther. England, 2014. Vol.

12, № 6. P. 697-704.

69. Kavanagh K. et al. Estimation of the risk of tubal factor infertility associated with genital chlamydial infection in women: a statistical modelling study. // Int J Epidemiol. England, 2013. Vol. 42, № 2. P. 493-503.

70. Karaer A. et al. Serological investigation of the role of selected sexually transmitted infections in the aetiology of ectopic pregnancy. // Eur J Contracept Reprod Health Care. England, 2013. Vol. 18, № 1. P. 68-74.

71. Bastidas R.J. et al. Chlamydial intracellular survival strategies. // Cold Spring Harb Perspect Med. 2013. Vol. 3, № 5. P. a010256.

72. Omsland A. et al. Chlamydial metabolism revisited: interspecies metabolic variability and developmental stage-specific physiologic activities. // FEMS Microbiol Rev. 2014. Vol. 38, № 4. P. 779-801.

73. Saka H.A. et al. Quantitative proteomics reveals metabolic and pathogenic properties of Chlamydia trachomatis developmental forms. // Mol Microbiol. 2011. Vol. 82, № 5. P. 1185-1203.

74. Mehlitz A., Rudel T. Modulation of host signaling and cellular responses by Chlamydia. // Cell Commun Signal. 2013. Vol. 11. P. 90.

75. Elwell C.A., Engel J.N. Lipid acquisition by intracellular Chlamydiae. // Cell Microbiol. 2012. Vol. 14, № 7. P. 1010-1018.

76. Elwell C., Mirrashidi K., Engel J. Chlamydia cell biology and pathogenesis. // Nat Rev Microbiol. 2016. Vol. 14, № 6. P. 385-400.

77. Tydell C.C. et al. Bovine peptidoglycan recognition protein-S: antimicrobial activity, localization, secretion, and binding properties. // J Immunol. United States, 2006. Vol. 176, № 2. P. 1154-1162.

78. Liu C. et al. Peptidoglycan recognition proteins: a novel family of four human innate immunity pattern recognition molecules. // J Biol Chem. United States, 2001. Vol. 276, № 37. P. 3468634694.

79. Kappeler S.R. et al. Expression of the peptidoglycan recognition protein, PGRP, in the lactating mammary gland. // J Dairy Sci. United States, 2004. Vol. 87, № 8. P. 2660-2668.

80. Cho J.H. et al. Human peptidoglycan recognition protein S is an effector of neutrophil-mediated innate immunity. // Blood. 2005. Vol. 106, № 7. P. 2551-2558.

81. Dziarski R. et al. Defect in neutrophil killing and increased susceptibility to infection with nonpathogenic gram-positive bacteria in peptidoglycan recognition protein-S (PGRP-S)-deficient mice. // Blood. United States, 2003. Vol. 102, № 2. P. 689-697.

82. Liu C. et al. Mammalian peptidoglycan recognition protein binds peptidoglycan with high affinity, is expressed in neutrophils, and inhibits bacterial growth. // J Biol Chem. United States, 2000. Vol. 275, № 32. P. 24490-24499.

83. Xu M., Wang Z., Locksley R.M. Innate immune responses in peptidoglycan recognition protein L-deficient mice. // Mol Cell Biol. 2004. Vol. 24, № 18. P. 7949-7957.

84. Zhang Y. et al. Identification of serum N-acetylmuramoyl-l-alanine amidase as liver peptidoglycan recognition protein 2. // Biochim Biophys Acta. Netherlands, 2005. Vol. 1752, № 1. P. 34-46.

85. Lo D. et al. Peptidoglycan recognition protein expression in mouse Peyer's Patch follicle associated epithelium suggests functional specialization. // Cell Immunol. Netherlands, 2003. Vol. 224, № 1. P. 8-16.

86. Wang H. et al. Peptidoglycan recognition protein 2 (N-acetylmuramoyl-L-Ala amidase) is induced in keratinocytes by bacteria through the p38 kinase pathway. // Infect Immun. 2005. Vol. 73, № 11. P. 7216-7225.

87. Li X. et al. Differential expression of peptidoglycan recognition protein 2 in the skin and liver requires different transcription factors. // J Biol Chem. United States, 2006. Vol. 281, № 30. P. 2073820748.

88. Royet J., Dziarski R. Peptidoglycan recognition proteins: pleiotropic sensors and effectors of antimicrobial defences. // Nat Rev Microbiol. England, 2007. Vol. 5, № 4. P. 264-277.

89. Uehara A. et al. Chemically synthesized pathogen-associated molecular patterns increase the expression of peptidoglycan recognition proteins via toll-like receptors, NOD1 and NOD2 in human oral epithelial cells. // Cell Microbiol. England, 2005. Vol. 7, № 5. P. 675-686.

90. Sun C. et al. Peptidoglycan recognition proteins Pglyrp3 and Pglyrp4 are encoded from the epidermal differentiation complex and are candidate genes for the Psors4 locus on chromosome 1q21. // Hum Genet. Germany, 2006. Vol. 119, № 1-2. P. 113-125.

91. Rohatgi A. et al. The association between peptidoglycan recognition protein-1 and coronary and peripheral atherosclerosis: Observations from the Dallas Heart Study. // Atherosclerosis. Ireland, 2009. Vol. 203, № 2. P. 569-575.

92. Dukhanina E.A. et al. Opposite roles of metastasin (S100A4) in two potentially tumoricidal mechanisms involving human lymphocyte protein Tag7 and Hsp70. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2009. Vol. 106, № 33. P. 13963-13967.

93. Royet J., Gupta D., Dziarski R. Peptidoglycan recognition proteins: modulators of the microbiome and inflammation. // Nat Rev Immunol. England, 2011. Vol. 11, № 12. P. 837-851.

94. Dziarski R., Gupta D. The peptidoglycan recognition proteins (PGRPs). // Genome Biol. 2006. Vol. 7, № 8. P. 232.

95. Guan R. et al. Crystal structure of human peptidoglycan recognition protein S (PGRP-S) at 1.70 A resolution. // J Mol Biol. England, 2005. Vol. 347, № 4. P. 683-691.

96. Kim M.-S., Byun M., Oh B.-H. Crystal structure of peptidoglycan recognition protein LB from Drosophila melanogaster. // Nat Immunol. United States, 2003. Vol. 4, № 8. P. 787-793.

97. Guan R. et al. Crystal structure of the C-terminal peptidoglycan-binding domain of human peptidoglycan recognition protein Ialpha. // J Biol Chem. United States, 2004. Vol. 279, № 30. P. 3187331882.

98. Wang Z.-M. et al. Human peptidoglycan recognition protein-L is an N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase. // J Biol Chem. United States, 2003. Vol. 278, № 49. P. 49044-49052.

99. Gelius E. et al. A mammalian peptidoglycan recognition protein with N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase activity. // Biochem Biophys Res Commun. United States, 2003. Vol. 306, № 4. P. 988994.

100. Dziarski R., Kashyap D.R., Gupta D. Mammalian peptidoglycan recognition proteins kill bacteria by activating two-component systems and modulate microbiome and inflammation. // Microb Drug Resist. United States, 2012. Vol. 18, № 3. P. 280-285.

101. Cho S. et al. Structural insights into the bactericidal mechanism of human peptidoglycan recognition proteins. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2007. Vol. 104, № 21. P. 8761-8766.

102. Fukushima T. et al. A new D,L-endopeptidase gene product, YojL (renamed CwlS), plays a role in cell separation with LytE and LytF in Bacillus subtilis. // J Bacteriol. 2006. Vol. 188, № 15. P. 5541-5550.

103. Yamamoto H., Kurosawa S., Sekiguchi J. Localization of the vegetative cell wall hydrolases LytC, LytE, and LytF on the Bacillus subtilis cell surface and stability of these enzymes to cell wall-bound or extracellular proteases. // J Bacteriol. 2003. Vol. 185, № 22. P. 6666-6677.

104. Hurdle J.G. et al. Targeting bacterial membrane function: an underexploited mechanism for treating persistent infections. // Nat Rev Microbiol. 2011. Vol. 9, № 1. P. 62-75.

105. Dimroth P., Kaim G., Matthey U. Crucial role of the membrane potential for ATP synthesis by F(1)F(o) ATP synthases. // J Exp Biol. England, 2000. Vol. 203, № Pt 1. P. 51-59.

106. Kohanski M.A. et al. A common mechanism of cellular death induced by bactericidal antibiotics. // Cell. United States, 2007. Vol. 130, № 5. P. 797-810.

107. Kohanski M.A., Dwyer D.J., Collins J.J. How antibiotics kill bacteria: from targets to networks. // Nat Rev Microbiol. 2010. Vol. 8, № 6. P. 423-435.

108. Kohanski M.A. et al. Mistranslation of membrane proteins and two-component system activation trigger antibiotic-mediated cell death. // Cell. 2008. Vol. 135, № 4. P. 679-690.

109. Danese P.N. et al. The Cpx two-component signal transduction pathway of Escherichia coli regulates transcription of the gene specifying the stress-inducible periplasmic protease, DegP. // Genes Dev. United States, 1995. Vol. 9, № 4. P. 387-398.

110. MacRitchie D.M. et al. Two-component signaling and gram negative envelope stress response systems. // Adv Exp Med Biol. United States, 2008. Vol. 631. P. 80-110.

111. Fleischer R. et al. Purification, reconstitution, and characterization of the CpxRAP envelope stress system of Escherichia coli. // J Biol Chem. United States, 2007. Vol. 282, № 12. P. 8583-8593.

112. Raivio T.L., Silhavy T.J. Transduction of envelope stress in Escherichia coli by the Cpx two-component system. // J Bacteriol. 1997. Vol. 179, № 24. P. 7724-7733.

113. Noone D. et al. Signal perception by the secretion stress-responsive CssRS two-component system in Bacillus subtilis. // J Bacteriol. 2012. Vol. 194, № 7. P. 1800-1814.

114. Koo I.C., Stephens R.S. A developmentally regulated two-component signal transduction system in Chlamydia. // J Biol Chem. United States, 2003. Vol. 278, № 19. P. 17314-17319.

115. Klose K.E. et al. The major dimerization determinants of the nitrogen regulatory protein NTRC from enteric bacteria lie in its carboxy-terminal domain. // J Mol Biol. England, 1994. Vol. 241, № 2. P. 233-245.

116. Fehlner-Gardiner C. et al. Molecular basis defining human Chlamydia trachomatis tissue tropism. A possible role for tryptophan synthase. // J Biol Chem. United States, 2002. Vol. 277, № 30. P.26893-26903.

117. Westers H. et al. The CssRS two-component regulatory system controls a general secretion stress response in Bacillus subtilis. // FEBS J. England, 2006. Vol. 273, № 16. P. 3816-3827.

118. Hyyrylainen H.L. et al. A novel two-component regulatory system in Bacillus subtilis for the survival of severe secretion stress. // Mol Microbiol. England, 2001. Vol. 41, № 5. P. 1159-1172.

119. Darmon E. et al. A novel class of heat and secretion stress-responsive genes is controlled by the autoregulated CssRS two-component system of Bacillus subtilis. // J Bacteriol. 2002. Vol. 184, № 20. P. 5661-5671.

120. Deckers-Hebestreit G., Altendorf K. The F0F1-type ATP synthases of bacteria: structure and function of the F0 complex. // Annu Rev Microbiol. United States, 1996. Vol. 50. P. 791-824.

121. Dziarski R., Gupta D. How innate immunity proteins kill bacteria and why they are not prone to resistance. // Curr Genet. United States, 2018. Vol. 64, № 1. P. 125-129.

122. Reddick L.E., Alto N.M. Bacteria fighting back: how pathogens target and subvert the host innate immune system. // Mol Cell. 2014. Vol. 54, № 2. P. 321-328.

123. Paciello I. et al. Intracellular Shigella remodels its LPS to dampen the innate immune recognition and evade inflammasome activation. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2013. Vol. 110, № 46. P. E4345-54.

124. Konermann S. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex // Nature. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 517, № 7536. P. 583-588.

125. Dull T. et al. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system // J Virol. J Virol, 1998. Vol. 72, № 11. P. 8463-8471.

126. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. 2222 p.

127. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. England, 1970. Vol. 227, № 5259. P. 680-685.

128. MatrixScience. Maccot search engine [Electronic resource] // Matrix Science Inc USA, Boston. 2013. URL: http://www.matrixscience.com/daemon.html.

129. Yamada S. et al. Expression profiling and differential screening between hepatoblastomas and the corresponding normal livers: identification of high expression of the PLK1 oncogene as a poor-prognostic indicator of hepatoblastomas. // Oncogene. England, 2004. Vol. 23, № 35. P. 5901-5911.

130. Wiegand I., Hilpert K., Hancock R.E.W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. // Nat Protoc. England, 2008. Vol. 3, № 2. P. 163-175.

131. Malay S. et al. In vitro activities of BMS-284756 against Chlamydia trachomatis and recent clinical isolates of Chlamydia pneumoniae. // Antimicrob Agents Chemother. 2002. Vol. 46, № 2. P. 517-518.

132. Scidmore M.A. Cultivation and Laboratory Maintenance of Chlamydia trachomatis. // Curr Protoc Microbiol. United States, 2005. Vol. Chapter 11. P. Unit 11A.1.

133. McQuin C. et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. // PLoS Biol. 2018. Vol. 16, № 7. P. e2005970.

134. Rao X. et al. An improvement of the 2~(-delta delta CT) method for quantitative real-time polymerase chain reaction data analysis. // Biostat Bioinforma Biomath. 2013. Vol. 3, № 3. P. 71-85.

135. R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing [Electronic resource]. 2009. URL: https://www.r-project.org/.

136. Haynes W. Benjamini--Hochberg Method // Encyclopedia of Systems Biology / ed. Dubitzky W. et al. New York, NY: Springer New York, 2013. P. 78.

137. Wickham H. ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis. Springer-Verlag New York,

2016.

138. Neuwirth E. RColorBrewer: ColorBrewer Palettes [Electronic resource]. 2014. URL: https://cran.r-project.org/web/packages/RColorBrewer/index.html.

139. Bioinformatics & Evolutionary Genomics. Calculate and draw custom Venn diagrams [Electronic resource]. URL: http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/.

140. Liao Y. et al. WebGestalt 2019: gene set analysis toolkit with revamped UIs and APIs. // Nucleic Acids Res. 2019. Vol. 47, № W1. P. W199-W205.

141. Invitrogen. User manual: pBAD/His A, B, and C, pBAD/Myc-His A, B, and C [Electronic resource]. 2010. URL: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pbad_man.pdf.

142. Invitrogen. pBAD/gIII A, B, and C Vectors for Regulated, Secreted Expression of Recombinant Proteins Containing C-Terminal 6xHis Tags in E. coli [Electronic resource]. 2012. URL: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/pbadgiii_man.pdf.

143. Novagen. pET-15b Vector [Electronic resource]. 1998. URL: https://depts.washington.edu/bakerpg/plasmid_maps/pet15bm.pdf.

144. Novagen. pET-32a-c(+) Vectors [Electronic resource]. URL: https://www.helmholtz-muenchen.de/fileadmin/PEPF/pET_vectors/pET-32a-c_map.pdf.

145. Schneider C.A., Rasband W.S., Eliceiri K.W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. // Nat Methods. 2012. Vol. 9, № 7. P. 671-675.

146. RStudio Team. RStudio: Integrated Development Environment for R. Boston, MA, 2020.

147. Haeussler M. et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. // Genome Biol. 2016. Vol. 17, № 1. P. 148.

148. Concordet J.-P., Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. // Nucleic Acids Res. 2018. Vol. 46, № W1. P. W242-W245.

149. Rather I.A. et al. Self-medication and antibiotic resistance: Crisis, current challenges, and prevention. // Saudi J Biol Sci. 2017. Vol. 24, № 4. P. 808-812.

150. Al-Homaidan H.T., Barrimah I.E. Physicians' knowledge, expectations, and practice regarding antibiotic use in primary health care. // Int J Health Sci (Qassim). 2018. Vol. 12, № 3. P. 1824.

151. Sun D. et al. Editorial: Horizontal Gene Transfer Mediated Bacterial Antibiotic Resistance. // Frontiers in microbiology. 2019. Vol. 10. P. 1933.

152. Status Report on Antimicrobial Resistance [Electronic resource]. URL: https://www.fao.org/publications/card/ru/c/50d945ae-288c-4462-b4e7-a7e640fcfc1a/ (accessed: 14.06.2022).

153. da Costa P.M., Loureiro L., Matos A.J.F. Transfer of multidrug-resistant bacteria between intermingled ecological niches: The interface between humans, animals and the environment // Int J Environ Res Public Health. MDPI, 2013. Vol. 10, № 1. P. 278-294.

154. Chang Q. et al. Antibiotics in agriculture and the risk to human health: How worried should we be? // Evol Appl. Wiley-Blackwell, 2015. Vol. 8, № 3. P. 240-247.

155. Global action plan on antimicrobial resistance [Electronic resource]. URL: https://www.who.int/publicationsMtem/9789241509763 (accessed: 14.06.2022).

156. Turvey S.E., Broide D.H. Innate immunity. // J Allergy Clin Immunol. 2010. Vol. 125, № 2 Suppl 2. P. S24-32.

157. Morre S.A. et al. The natural course of asymptomatic Chlamydia trachomatis infections: 45% clearance and no development of clinical PID after one-year follow-up. // Int J STD AIDS. England, 2002. Vol. 13 Suppl 2. P. 12-18.

158. Debonnet C. et al. [Update of Chlamydia trachomatis infection]. // Gynecol Obstet Fertil Senol. France, 2021. Vol. 49, № 7-8. P. 608-616.

159. Vivoda M. et al. [Biology and intracellular life of chlamydia]. // Med Pregl. Serbia, 2011. Vol. 64, № 11-12. P. 561-564.

160. Choi J.H., Lee S.Y. Secretory and extracellular production of recombinant proteins using Escherichia coli. // Appl Microbiol Biotechnol. Germany, 2004. Vol. 64, № 5. P. 625-635.

161. Carrio M.M., Villaverde A. Construction and deconstruction of bacterial inclusion bodies. // J Biotechnol. Netherlands, 2002. Vol. 96, № 1. P. 3-12.

162. LaVallie E.R. et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. // Biotechnology (N Y). United States, 1993. Vol. 11, № 2. P. 187-193.

163. Riggs P. Expression and purification of maltose-binding protein fusions. // Curr Protoc Mol Biol. United States, 2001. Vol. Chapter 16. P. Unit16.6.

164. Yamaguchi H., Miyazaki M. Refolding Techniques for Recovering Biologically Active Recombinant Proteins from Inclusion Bodies // Biomolecules. Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2014. Vol. 4, № 1. P. 235.

165. Andrews J.M. Determination of minimum inhibitory concentrations // J Antimicrob Chemother. J Antimicrob Chemother, 2001. Vol. 48 Suppl 1, № SUPPL. 1. P. 5-16.

166. Rawre J., Juyal D., Dhawan B. Molecular typing of Chlamydia trachomatis: An overview. // Indian J Med Microbiol. United States, 2017. Vol. 35, № 1. P. 17-26.

167. Dong X. et al. Chlamydial-Secreted Protease Chlamydia High Temperature Requirement Protein A (cHtrA) Degrades Human Cathelicidin LL-37 and Suppresses Its Anti-Chlamydial Activity. // Med Sci Monit. 2020. Vol. 26. P. e923909.

168. Donati M. et al. Activity of cathelicidin peptides against Chlamydia spp. // Antimicrob Agents Chemother. 2005. Vol. 49, № 3. P. 1201-1202.

169. Tang L. et al. Chlamydia-secreted protease CPAF degrades host antimicrobial peptides. // Microbes Infect. France, 2015. Vol. 17, № 6. P. 402-408.

170. Lazarev V.N. et al. Antimicrobial peptide from spider venom inhibits Chlamydia trachomatis infection at an early stage // Arch Microbiol. Arch Microbiol, 2013. Vol. 195, № 3. P. 173179.

171. Grafskaia E.N. et al. Discovery of novel antimicrobial peptides: A transcriptomic study of the sea anemone Cnidopus japonicus // J Bioinform Comput Biol. J Bioinform Comput Biol, 2018. Vol. 16, № 2.

172. Grafskaia E. et al. The Hirudo Medicinalis Microbiome Is a Source of New Antimicrobial Peptides // Int J Mol Sci. Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2020. Vol. 21, № 19. P. 1 -14.

173. Grafskaia E.N. et al. Medicinal leech antimicrobial peptides lacking toxicity represent a promising alternative strategy to combat antibiotic-resistant pathogens // Eur J Med Chem. Eur J Med Chem, 2019. Vol. 180. P. 143-153.

174. Hearn S.A., McNabb G.L. Immunoelectron microscopic localization of chlamydial lipopolysaccharide (LPS) in McCoy cells inoculated with Chlamydia trachomatis. // J Histochem Cytochem. United States, 1991. Vol. 39, № 8. P. 1067-1075.

175. Muñoz K.J. et al. The Small Molecule H89 Inhibits Chlamydia Inclusion Growth and Production of Infectious Progeny. // Infect Immun. 2021. Vol. 89, № 7. P. e0072920.

176. Bavoil P., Ohlin A., Schachter J. Role of disulfide bonding in outer membrane structure and permeability in Chlamydia trachomatis. // Infect Immun. 1984. Vol. 44, № 2. P. 479-485.

177. de Wulf P., Kwon O., Lin E.C. The CpxRA signal transduction system of Escherichia coli: growth-related autoactivation and control of unanticipated target operons. // J Bacteriol. 1999. Vol. 181, № 21. P. 6772-6778.

178. Lim J.-H. et al. Structural basis for preferential recognition of diaminopimelic acid-type peptidoglycan by a subset of peptidoglycan recognition proteins. // J Biol Chem. United States, 2006. Vol. 281, № 12. P. 8286-8295.

179. Lyons J.M. et al. Differences in growth characteristics and elementary body associated cytotoxicity between Chlamydia trachomatis oculogenital serovars D and H and Chlamydia muridarum. // J Clin Pathol. 2005. Vol. 58, № 4. P. 397-401.

180. Stephens A.J., Aubuchon M., Schust D.J. Antichlamydial antibodies, human fertility, and pregnancy wastage. // Infect Dis Obstet Gynecol. Egypt, 2011. Vol. 2011. P. 525182.

181. Scidmore M.A. Recent advances in Chlamydia subversion of host cytoskeletal and membrane trafficking pathways. // Microbes Infect. France, 2011. Vol. 13, № 6. P. 527-535.

182. Grieshaber S.S. et al. Chlamydia trachomatis causes centrosomal defects resulting in chromosomal segregation abnormalities. // Traffic. England, 2006. Vol. 7, № 8. P. 940-949.

183. Hasegawa A. et al. Host complement regulatory protein CD59 is transported to the chlamydial inclusion by a Golgi apparatus-independent pathway. // Infect Immun. 2009. Vol. 77, № 4. P.1285-1292.

184. Versteeg B. et al. An Organotypic Reconstructed Human Urethra to Study Chlamydia trachomatis Infection. // Tissue Eng Part A. United States, 2018. Vol. 24, № 21-22. P. 1663-1671.

185. Gupta V. et al. Production of Recombinant Pharmaceutical Proteins // Basic and Applied Aspects of Biotechnology. Springer, Singapore, 2017. P. 77-101.

186. Deller M.C., Kong L., Rupp B. Protein stability: a crystallographer's perspective. // Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. 2016. Vol. 72, № Pt 2. P. 72-95.

187. Muheem A. et al. A review on the strategies for oral delivery of proteins and peptides and their clinical perspectives. // Saudi Pharm J. 2016. Vol. 24, № 4. P. 413-428.

188. Heymich M.-L., Srirangan S., Pischetsrieder M. Stability and Activity of the Antimicrobial Peptide Leg1 in Solution and on Meat and Its Optimized Generation from Chickpea Storage Protein. // Foods. 2021. Vol. 10, № 6.

189. Lei J. et al. The antimicrobial peptides and their potential clinical applications. // Am J Transl Res. 2019. Vol. 11, № 7. P. 3919-3931.

190. O'Neill L.A.J., Bryant C.E., Doyle S.L. Therapeutic targeting of Toll-like receptors for infectious and inflammatory diseases and cancer. // Pharmacol Rev. 2009. Vol. 61, № 2. P. 177-197.

191. Chandler L.C. et al. Immunomodulatory Effects of Hydroxychloroquine and Chloroquine in Viral Infections and Their Potential Application in Retinal Gene Therapy. // Int J Mol Sci. 2020. Vol. 21, № 14.

192. Bergmann B. et al. Pre-treatment with IL2 gene therapy alleviates Staphylococcus aureus arthritis in mice. // BMC Infect Dis. 2020. Vol. 20, № 1. P. 185.

193. Shirley J.L. et al. Immune Responses to Viral Gene Therapy Vectors. // Mol Ther. 2020. Vol. 28, № 3. P. 709-722.

194. Verma R. et al. A CRISPR/Cas9 based polymeric nanoparticles to treat/inhibit microbial infections. // Semin Cell Dev Biol. England, 2019. Vol. 96. P. 44-52.

195. Abe T. et al. Baculovirus induces type I interferon production through toll-like receptor-dependent and -independent pathways in a cell-type-specific manner. // J Virol. 2009. Vol. 83, № 15. P. 7629-7640.

196. Konermann S. et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. // Nature. 2015. Vol. 517, № 7536. P. 583-588.

197. Sakuma T., Barry M.A., Ikeda Y. Lentiviral vectors: basic to translational. // Biochem J. England, 2012. Vol. 443, № 3. P. 603-618.