Разработка и применение методов оценки качества дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического производства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Орлова, Наталья Владимировна

• Орлова, Наталья Владимировна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Орлова, Наталья Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние степени гликозилирования на биологическую активность белка

1.2. Особенности структуры, физических и биологических свойств эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина

1.3. Дженерики и проблемы воспроизведенных лекарственных препаратов

1.4. Краткая схема технологического процесса

1.5. Методы оценки качетва дарбэпоэтина альфа

1.6. Валидация аналитических методик в процессе биотехнологического производства лекарственных средств

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Разработка методики оценки концентрации дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса производства

2.2.2. Валидация разработанных хроматографических методик количественного определения дарбэпоэтина

2.2.3. Разработка методики оценки степени гликозилирования дарбэпоэтина

2.2.4. Валидация методики установления подлинности дарбэпоэтина с помощью изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом

2.2.5. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса

2.2.6. Стандартизация конечного продукта

2.2.7. Создание стандартного образца предприятия дарбэпоэтина

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4. ВЫВОДЫ

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭПО - эритропоэтин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ОФ ВЭЖХ - обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

КЗЭ - капиллярный зональный электрофорез

ГЛФ - готовая лекарственная форма

RSD - относительное стандартное отклонение

ПААГ - полиакриламидный гель

ИФА - иммуно-ферментный анализ

ПКО - предел количественного определения

BRP - Biological Reference Preparation (биологический стандартный препарат)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и применение методов оценки качества дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического производства»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В современной науке и медицине в последнее время появляется все больше и больше лекарственных средств на основе рекомбинантных белков, направленных на лечения широкого спектра болезней. Создание эффективных и безопасных лекарственных средств с использованием методов генной инженерии на всех этапах фармацевтической разработки обеспечивается проведением аналитического контроля с применением надежных методов исследования. На первых этапах биотехнологического процесса производства биофармацевтической субстанции при получении клона штамма-продуцента и его культивировании используются аналитические методы, позволяющие получить максимально возможную информацию об активном компоненте. На этапах масштабирования и переноса технологии на производственную площадку разрабатываются конкретные методы аналитического контроля показателей качества лекарственного средства. Благодаря оценке качества активного белка на каждом этапе технологического процесса производства, возможно минимизировать затраты при идентификации несоответствия качества полупродуктов на ранних стадиях. Для этого требуется разработка современных и надежных методов оценки качества белка [1]. При разработке научно-обоснованных аналитических методов для оценки качества лекарственного средства руководствуются критериями выбора, основными из которых являются информативность, специфичность, чувствительность, точность, экспрессность, экономичность.

Вопросы контроля качества и стандартизации лекарственных средств особенно актуальны в связи с разработкой более эффективных генно-инженерных средств нового поколения [1].

Несмотря на прогресс в обеспечении безопасности и эффективности гемотрансфузионной терапии, актуальной задачей для клинической медицины остается поиск и внедрение лекарственных средств, альтернативных донорской крови, ее компонентам и препаратам [2].

Одним из таких средств является эритропоэтин (ЭПО), внедренный в клиническую практику в 1985 г [2].

ЭПО - циркулирующий в крови гликопротеидный гормон [3, 4], который стимулирует образование эритроцитов из поздних клеток-предшественников и повышает выход ретикулоцитов из костного мозга [5].

Попытки создания лекарственных препаратов на основе эндогенного ЭПО и лечение такими препаратами проводились, но широкого распространения в клинической практике они так и не получили из-за широкого спектра недостатков в сравнении с рекомбинантным аналогом. В отличие от препаратов на основе нативного белка, препараты на основе рекомбинантного белка получили более широкое распространение, что связано с меньшим риском попадания инфекций в организм человека, меньшей стоимостью препарата, а так же более широкой доступностью [6].

Рекомбинантный ЭПО широко используется для коррекции анемий при различных заболеваниях: хроническая почечная недостаточность (диализные и предиализные пациенты), онкологические заболевания (цитостатическая терапия), трансплантация органов и тканей, СПИД (терапия ВИЧ-инфекции зидовудином), аутодонорство и т.д. [2, 7-11].

ЭПО альфа и бета имеют относительно небольшой период полувыведения, что диктует необходимость вводить их до трех раз в неделю [12-14]. Закономерно, что длительное время усилия клиницистов и фармацевтов были направлены на создание препаратов нового поколения с большим периудом полувыведения, что позволило бы применять более удобные схемы их введения (1 раз в неделю, и даже 1 раз в 2 недели). Такими препаратами стали лекарственные средства, действующим веществом которых является модифицированный ЭПО: сверхгликозилированный (Аранесп, фирма-производитель Amgen), с присоединенным метоксиполиэтиленгликоля (Мирцера, фирма производитель Roche), а также новый препарат Азопоэтин (фирма-производитель Петровакс-Фарма не распространяет информацию о модификации данного белка) и т.д.

Особый интерес для медицинского применения представляет собой сверхгликозилированный ЭПО - дарбэпоэтин альфа, поскольку он по своей структуре и действию наиболее близок к эндогенному ЭПО. Модификация ЭПО заключается в большем количестве углеводных остатков, содержащихся в структуре белка [15, 16], что при попадании в организм человека оказывает менее токсичное влияние на него в отличие от метоксиполиэтиленгликоля, который имеет свойства накапливаться в организме человека.

В настоящее время оригинальным коммерческим препаратом дарбэпоэтина является препарат Аранесп, производства фирмы Агс^еп, США. Существующие для рекомбинантного ЭПО единые требования к стандарту качества, описанные в Европейской фармакопее 8 выпуска, и имеющиеся доступные стандартные образцы неприменимы для дарбэпоэтина. В то же время для него отсутствуют собственные как международные, так и отраслевые нормативно-технические документы. Отсутствие стандарта качества может существенно затруднить оценку лекарственного средства при биотехнологическом производстве и привести к получению продукта ненадлежащего качества.

Кроме того, необходимо систематизировать задачи аналитического контроля по этапам создания лекарственного средства. Такая систематизация может быть проведена по принципу, по которому направление разработки схемы аналитического контроля подчиняется задачам каждого этапа фармацевтической разработки.

Также важной задачей в прикладной метрологии при биотехнологическом производстве является разработка стандартных образцов. При постадийном аналитическом контроле в процессе производства и, особенно при контроле качества готовых лекарственных средств, стандартные образцы являются незаменимым инструментом для аттестации разрабатываемых и применяемых методик анализа. Однако для дарбэпоэтина доступные стандартные образцы отсутствуют.

Таким образом, мониторинг качества наиболее важных параметров на разных стадиях биотехнологического процесса такого востребованного среди

дженериков лекарственного средства как дарбэпоэтина является актуальной задачей, решение которой позволит получать безопасный и эффективный рекомбинантный продукт.

Цель и задачи работы. Целью данной работы является разработка и применение методов оценки качества дарбэпоэтина альфа в процессе биотехнологического производства.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка и характеристика методов аффинной хроматографии и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) при определении концентрации дарбэпоэтина альфа в культуральной жидкости, полупродуктах и продуктах.

2. Разработка методов оценки уровня гликозилирования дарбэпоэтина на различных этапах биотехнологического процесса.

3. Разработка методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина на каждом этапе технологического процесса.

3. Валидация методик оценки качества дарбэпоэтина альфа.

4. Стандартизация конечного рекомбинантного продукта в соответствии с выбранными критериями качества.

5. Разработка стандартного образца предприятия дарбэпоэтина альфа.

Научная новизна. Впервые в РФ разработан методологический подход к

оценке качества готового биомедицинского продукта и полупродуктов на каждом этапе технологического процесса производства субстанции и готовой лекарственной формы (ГЛФ) дарбэпоэтина (от получения клона-продуцента до ГЛФ), включающий применение таких методов как ОФ ВЭЖХ, изоэлектрическое фокусирование с дальнейшим иммуноблотгингом, капиллярный зональный электрофорез (КЗЭ) и установление биологической активности.

Впервые показана целесообразность применения методики ОФ ВЭЖХ для количественного определения дарбэпоэтина альфа на первых стадиях технологического процесса производства, включая культивирование линии клеток продуцента.

Разработаны методики ОФ ВЭЖХ и изоэлектрического фокусирования с последующим иммуноблоттингом, представляющие собой инструмент для контроля качества при идентификации дарбэпоэтина на фоне сложных смесей балластных веществ.

Разработан и охарактеризован по наиболее важным параметрам (молекулярный вес белка, концентрация белка, степень гликозилирования, специфическая активность и т.д.) стандартный образец предприятия дарбэпоэтина, позволяющий осуществлять метрологическое обеспечение контроля качества биотехнологического процесса.

Научная новизна работы подтверждена патентом России № 2523948.

Практическая значимость работы. Разработанные методики представляют собой готовый инструмент для обеспечения оценки качества на фармацевтическом производстве, проведения исследований в медицинских учреждениях, осуществления допинг-контроля, а также фундаментальных и прикладных научно-исследовательских работ.

Новые методики, разработанные для установления критических параметров дарбэпоэтина, были внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на субстанцию и ГЛФ, а также опытно-промышленный регламент на субстанцию (№ 56882590-17-12) и на ГЛФ (№ 56882590-18-13) ООО «Фармапарк».

Работа выполнена в рамках государственного контракта Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2008 в 2011-2013 гг. на базе отдела медицинской биотехнологии ФГУП «ГосНИИгенетика».

Личный вклад соискателя. Разработка методик оценки качества дарбэпоэтина на каждом технологическом этапе производственного процесса получения биофармацевтического продукта проводилась совместно с к.б.н. Мосиной А.Г., к.б.н. Стародубцевой Л.И., а также с лабораторий иммунологии ФГУП ГосНИИгенетика под руководством к.б.н. Юрина В.Л., за что им выражается глубокая благодарность. Автором проведены обоснование методологического подхода к оценке качества дарбэпоэтина, валидация разработанных методик, разработка спецификации на субстанцию и ГЛФ

рекомбинантного дарбэпоэтина, вошедшая в проект фармакопейной статьи предприятия, а также разработка нормативно-технической документации на стандартный образец предприятия.

Апробация результатов. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на международном симпозиуме «Биофарма -2013: от науки к промышленности» (Будва, 2013), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика» и сотрудников ООО «Фармапарк» (Москва, 2014).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК (Биотехнология, Биофармацевтический журнал).

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 99 источник, из них 70 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 23 таблицы, 38 рисунков и 9 страниц приложений.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработанная схема мониторинга качества дарбэпоэтина на всех этапах технологического процесса производства субстанции дарбэпоэтина (включающая изоэлектрическое фокусирование, КЗЭ, ОФ ВЭЖХ и определение биологической активности) обеспечивает получение продукта надлежащего качества.

2. Обоснованные параметры стандартизации дарбэпоэтина (степень гликозилирования, концентрация и биологическая активность) позволяют специфицировать его в соответствии с международными требованиями к биофармацевтическим генно-инженерным продуктам.

3. Установленные критерии валидации (специфичность, линейность, правильность, прецизионность, предел количественного определения (ПКО), диапазон применения, робастность) аналитических методик оценки качества

образцов дарбэпоэтина обеспечивают надлежащий производственный контроль на всех этапах технологического процесса производства лекарственного средства.

4. Обоснованные показатели качества стандартного образца дарбэпоэтина, включающие подтверждение подлинности с помощью КЗЭ, изоэлектрического фокусирования с иммуноблоттингом, масс-спектрометрии, установление биологической активности in vivo, а также определения степени сиалирования, позволяют использовать его для подтверждения соответствия производственных серий субстанции дарбэпоэтина установленным требованиям.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Влияние степени гликозилирования на биологическую активность белка

Гликолизилирование является одной из наиболее важных посттрансляционных модификаций, определяющих структуру и функции большинства белков плазмы человека, в том числе ЭПО [17]. Высокий уровень гликозилирования обеспечивает эффективность его гемопоэтической активности in vivo [18, 19]. В то же время аффинность взаимодействия ЭПО с рецепторами на поверхности клеток-предшественников эритроидного ряда и стимуляция их дифференцировки полностью определяется только полипептидным каркасом молекулы ЭПО. Уровень гликозилирования ЭПО непосредственно влияет на скорость элиминации биологически активного белка из организма и на длительность его гемопоэтического действия, которая, тем не менее, остается крайне непродолжительной для эффективного терапевтического использования гормона при анемиях различного генеза [15, 20].

Кроме того ЭПО, как и другие гликопротеины плазмы, быстро подвергается энзиматической деградации, лишаясь сиаловых кислот, что приводит к короткому времени циркуляции в организме и необходимости частого введения белка для достижения максимального клинического эффекта [21-24]. Известно несколько стратегий повышения стабильности ЭПО in vivo, обусловленных двумя механизмами элиминации (выведения) ЭПО из организма. Это увеличение размеров молекулы ЭПО за счет генно-инженерного введения дополнительных лигандов, что приводит к снижению почечного клиренса [14, 25]. Возможно также введение в молекулу ЭПО дополнительных углеводных цепей, что приводит к увеличению количества сиаловых групп и снижению уровня элиминации ЭПО через экспрессируемые на клетках печени рецепторы для асиалированных белков - ASGR [26].

Один из аспектов гликоинженеринга - это введение N-связанных гликозилированных последовательностей в желаемую позицию в пептидной

последовательности, чтобы произвести белок с большим количеством сиаловых кислот в углеводном остатке, увеличивая тем самым биологическую активность [16].

Как показано при создании коммерческого препарата на основе модифицированного ЭПО «Aranesp» компании Amgen, введение в молекулу ЭПО двух дополнительных сайтов N-гликозилирования увеличивает время выведения гормона из организма в 3-4 раза [27-30]. Для получения дарбэпоэтина альфа использована технология генетической модификации белковой структуры ЭПО. Молекула модифицированного ЭПО (дарбэпоэтин альфа) содержит 5 замен в аминокислотной последовательности, две из которых являются дополнительными сайтами N-гликозилирования. Высокая степень гликозилирования обеспечивает дарбэпоэтину пролонгированную биологическую активность и клинический эффект даже при сниженной в два раза, по сравнению с ЭПО, способности к аффинному взаимодействию со специфическим рецептором [22, 31].

1.2. Особенности структуры, физических и биологических свойств эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина

Рекомбинантные ЭПО первого поколения, ЭПО альфа и бета, по своей химической структуре идентичны нативному ЭПО и представляют собой гликопротеин с молекулярной массой 30,4 кДа. В структуре молекулы ЭПО выделяют единую полипептидную цепочку из 165 аминокислот, имеющую в своем составе 2 дисульфидных мостика и четыре сайта гликозилирования (Рисунок 1) [14, 32, 33]. Молекула ЭПО имеет четыре карбогидратных цепи, три из которых связаны с пептидной цепью через азот аспарагина (N-гликозилирование), а одна - через кислород серина (О-гликозилирование). При этом гликолизильные цепи составляют около 40% от молекулярного веса молекулы [16, 22, 34, 35]. Каждая из трех N-углеводных цепей (Asn 24, 38 и 83) состоит из 2 - 4 ветвей. Для О-углеводных цепей (Ser 126) характерно наличие 1 -2 ветвей. Углеводная цепь может завершаться остатком сиаловой кислоты. Таким

образом, максимальное количество сиаловых кислот в молекуле ЭПО равно 14,

что придает всей молекуле ЭПО отрицательный заряд, лишает ее возможности

связаться с АЗСЯ-рецепторами гепатоцитов и, соответственно, увеличивает

время циркуляции в организме [26].

160

1

Рисунок 1. Структура рекомбинан гною эритропоэтина

Известно, что в результате посттрансляционных модификаций образуется смесь различных изоформ, определяемых по числу свободных сиаловых остатков. Ы-связанные боковые углеводные цепи предсинтезируются различными энзимами и являются доступными для посттрансляционного добавления к полипептиду ЭПО. Каждая изоформа обладает собственной биоактивностью. Наибольшей эритропоэтической активностью обладает изоформа 14 [14, 36, 37]. С другой

стороны, изоформы с меньшим числом остатков сиаловой кислоты имеют большее сродство к рецептору ЭГ10, но более короткий период циркуляции. Очищенные коммерческие препараты ЭПО альфа и бета состоят из смеси изоформ от 9 до 14 (Рисунок 2) [36].

_ - Изоформы (по

ЗМ-связанные углеводы О-связанныи углевод „отчеству

| 1 I 1 содержания

сиаловых кислот)

о = Сиаловые кислоты

Рисунок 2. Изоформы эритропоэтина разной степени сиалирования [22|

Как уже было сказано выше для замедления скорости выведения ЭПО и повышение его активности был применен новый подход - гликоинженеринг [16]. В результате была создана принципиально новая молекула дарбэпоэтина альфа с массой до 37,1 кДа, имеющая 5 участков гликозилирования, а число свободных сиаловых групп доведено до 22 (Рисунок 3) [15, 22, 29, 38].

А)

Рисунок 3. Сравнение структуры молекулы рекомбинан гною человеческого ЭПО (А) и дарбэпоэтина альфа (Б) |15)

Аминокислотная последовательность дарбэпоэтина отличается от таковой у человеческого ЭПО в 5 положениях, что и позволило осуществить присоединение дополнительных ветвей углеводов к аспарагиновым остаткам в положениях 30 и 88 без разрушения общей конформации молекулы (Рисунок 4). Таким образом, дарбэпоэтин отличается от ЭПО высоким содержанием углеводов и сиаловых остатков, более высокой молекулярной массой и увеличенным отрицательным зарядом [39].

165 С j

1с0

W >-<

В

w

150

ц >

й Q

8

Н

Г - -гг.

Q

О Ö

100

х,

40

И Н И

140 «

М У-\

sd Ч

Й

о •о

О

о,.,

п

sJ 58 -' 67

" :-0

Рисунок 4. Аминокислотная последовательность молекулы дарбэпоэтина альфа [15, 40J

рчЭПО

Боковые углеводные цепи

ЗПО-рецептор 1

ЭПО-рецептор

Дополнительные углеводные цепи

Б) Дарбэпоэтин альфа

ЭПО-рецептор 1

ЭПО-рецептор 2

В таблице 1 приведены сравнительные характеристики изучаемых рекомбинантных белков.

Таблица 1. Сравнительная характеристика рекомбинантного

человеческого ЭПО альфа и бета и дарбэпоэтина альфа [12, 22, 29, 41 - 48]

Показатель Эпоэтин-а Эпоэтин-[3 Дарбэпоэтин-а

Содержание углеводородов, % 40 40 52

Число 1М-связанных углеводных цепей 3 3 5

Период полувыведения, часы:

внутривенный путь введения, 4-11 8,8-10,4 18-25,3

подкожный путь введния 19-25,3 24 48,8

Биодоступность (п/к путь), % 30-36 15-50 37

Клиренс (в/в путь введения), мл/час * кг 8,1-8,6 7,9 2,0

Частота введения (количество введений в неделю) 1-3 0,5-3 0,25-1

Таблица наглядно демонстрирует возможность большего пребывания дарбэпоэтина в организме человека относительно ЭПО альфа и бета, что, в свою очередь, приводит к уменьшению частоты введения.

1.3. Дженерики и проблемы воспроизведенных лекарственных препаратов

Доля воспроизведенных лекарственных препаратов на современном фармацевтическом рынке по разным данным составляет от 77% до 88-95% [4951]. В соответствии с определением понятия «воспроизведенный препарат», представленном в действующем Федеральном законе РФ, обязательным условием эквивалентности состава воспроизведенного лекарственного препарата оригинальному является идентичность фармацевтической субстанции и лекарственной формы [52]. Согласно определению Директивы ЕС, воспроизведенный медицинский продукт (generic medical product) - продукт, который имеет тот же, что и препарат сравнения качественный и количественный

состав действующих веществ (active substances) и лекарственную форму, биологические свойства которых подтверждены в исследованиях биоэквивалентности [53]. Для взаимозаменяемых продуктов должна быть представлена дополнительная информация, подтверждающая их терапевтическую эквивалентность и отсутствие отличий по профилю безопасности воспроизведенного препарата (generic) и препарата сравнения [54].

Необходимо отметить, что для иммунобиологических препаратов при установлении их химической эквивалентности необходимо учитывать сложный состав биофармацевтических продуктов, зависимость профиля безопасности от уникальности производственного процесса, определяющего чистоту продукта, конформацию белка, степень гликозилирования [55].

Основными этапами исследований безопасности и эффективности лекарственных средств в настоящее время являются дорегистрационный (доклинические, клинические исследования) и пострегистрационные этапы. Каждый этап чрезвычайно важен для решения вопроса о возможности продолжения исследований лекарственного препарата и применения его в медицинской практике, однако каждый этап имеет свои особенности и ограничения в оценке безопасности [49].

Таким образом, оценка качества, как конечного продукта, так и полупродуктов на каждом этапе технологического процесса производства лекарственного средства является одной из первых и важных стадий подтверждения эффективности и безопасности воспроизводимого препарата.

Данную работу можно рассматривать как часть разработки дорегистрационного этапа проверки эффективности и безопасности с помощью ряда физико-химических и биологических методик для лекарственного средства дарбэпоэтина альфа.

1.4. Краткая схема технологического процесса

Получение ГЛФ - процесс весьма длительный, проходящий в несколько этапов, таких как получение и культивирование клона продуцента, выделение

целевого белка из культуральной жидкости с помощью различных хроматографических методов биотехнологической очистки белка (здесь, как правило, несколько стадий), приготовление субстанции. Из чего следует, что в конце каждого этапа имеется полупродукт, который необходимо охарактеризовать. Таким образом, на каждом этапе следует осуществлять оценку качества полученного белка, который в дальнейшем передается на следующий этап.

Первая стадия - это получение клона продуцента и его культивирование. На данном этапе имеется сложная смесь - культуральная жидкость, которая включает в свой состав огромное количество различных компонентов (целевой белок, клетки, продукты жизнедеятельности клеток, не целевые белки, агрегаты белков, продукты деградации белков и т.д.) [56]. Охарактеризовать целевой белок в такой смеси достаточно сложная проблема. Однако на данном этапе оценка белка по всем параметрам не требуется. Необходимо установить наиболее важные параметры белка, несоответствие которых установленным спецификациям может привести в дальнейшем к получению продукта ненадлежащего качества. В случае с дарбэпоэтином основным параметром является наличие высокосиалированных форм белка и концентрация целевого белка в культуральной жидкости. Контроль концентрации белка позволяет говорить о качестве проведенного процесса культивирования, при этом высокая концентрация белка еще не говорит о качественном процессе культивирования, поскольку в полученной смеси должны присутствовать высокосиалированные форм белка, поскольку именно они и определяют дальнейшую эффективность лекарственного средства [57-60].

Таким образом, для дальнейшего биотехнологического выделения целевого белка из культуральной жидкости необходимо установить минимум информации, а именно количество белка в культуральной жидкости и его изоформенный состав [57].

После стадии культивирования линии клеток продуцента культуральная жидкость, содержащая целевой белок, передается на стадию биотехнологического выделения белка, где в несколько этапов происходит очистка дарбэпоэтина от

компонентов, присутствующих в культуральной жидкости и не представляющих никакой ценности для дальнейшего биомедицинского препарата [57].

Культуральная жидкость представляет собой смесь большого количества белков, липидов, протеаз и других биологических соединений, тогда как концентрация целевого белка в среде невысока [57]. Существует большое количество способов выделения белков, одним из самых популярных методов для выделения целевого белка из культуральной жидкости является аффинная хроматография, которая достаточно широко применялась при выделении близкого родственника дарбэпоэтина - ЭПО [61]. Поскольку принцип метода основан на специфическим взаимодействии белка с антителами к данному белку, то выделение белка проходило с достаточно высокой эффективностью. В аффинной хроматографии в основном применялись мышиные моноклональные антитела к ЭПО. Однако в дальнейшую технологическую схему приходиться вносить большое количество дополнительных этапов очистки полученного раствора белка от моноклональных антител, поскольку попадание таких антител с лекарственным средством в организм человека может привести к серьезным проблемам со здоровьем [62-64]. В связи с этим в последнее время проводилось большое количество разработок технологического процесса без такого затратного шага, как аффинная хроматография.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Орлова, Наталья Владимировна, 2014 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Дегтерев Е.В. Анализ лекарственных средств в исследованиях, производстве и контроле качества / Дегтерев Е.В. // Рос. хим. ж. - 2002. - Т. XLVI - С. 43-51.

2. Жибурт Е.Б., Серебряная Н.Б. Иммуногематологические исследования при переливании крови/ Жибурт Е.Б., Серебряная II.Б. под ред. А.И. Карпищенко.// Медицинская лабораторная диагностика (программы и алгоритмы). Справочник - СПб.: Интермедика - 1997. - С.270-296.

3. Goldwasser Е. Erythropoietin and differentiation of red blood cells./ Goldwasser E. //Feder. Proc. - 1975. - vol.34. - P. 2285-2292.

4. Jelkmann W. Renal erythropoietin: properties and production./ Jelkmann W. // Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. - 1986. - vol. 104. - P. 139-217.

5. Горчакова H.A. Фармакология спорта./ Горчакова H.A., Гудивок Я. С., Гунина Л.М., под общей ред. Олейника С.А, Гуниной Л.М., Сейфуллы Р.Д. -К. Олимп, лит-ра, 2010. - 631 - 640 с.

6. Солдатов А.А. Доказательство подобия рекомбинантных эпоэтинов, зарегестрированных на основе принципов "biosimilars" (физико-химические и биологические свойства). /Солдатов А.А., Авдеева Ж.И., Алпатова Н.А. и др. // Биопрепараты. - 2014. - Т.49 - 11-22 с.

7. Eschbach J.W. Correction of the anemia of end-stage renal disease with recombinant human erythropoietin. Results of a combined phase I and II clinical trial./ Eschbach J.W., Egrie J.C., Downing M.R. et al. // N. Engl. J. Med. - 1987 - P. 73-78.

8. Ермоленко B.M. Эритропоэтин: биологические свойства и применение в клинике. / Ермоленко В.М., Николаев А.Ю. // Тер. архив - 1990 - Т. 62. - С. 141-145.

9. Ермоленко В.М. Влияние лечения рекомбинантным человеческим эритропоэтином на функциональное состояние больных на поддерживающем

гемодиализе. / Ермоленко В.М., Лашутин С.В., Рудаков А.Г. и соавт. // Тер. архив - 1991 - Т. 63.-С. 81-86.

10. Николаев АЛО. Сравнение эффективности различных препаратов рекомбинантного эритропоэтина при лечении почечной анемии. / Николаев А.Ю., Клепиков П.В., Лашутин С.В. // Клиническая фармакология и терапия -1993 - С. 30-33.

11. Pinevich A.J. Anemia. Dialysis and Transplantation / Pinevich A.J., Petersen J. //West J Med. - 1992-vol. 157.-P. 154 - 157.

12. Deicher R. Differentiating factors between erythropoiesis-stimulating agents: a guide to selection for anaemia of chronic kidney disease./ Deicher R., Horl W.H. // Drugs. - 2004 - vol. 64. - P. 499-509.

13. Меркулов В.А. Препараты рекомбинантных эритропоэтинов и их характеристика. / Меркулов В.А, Солдатов А.А., Авдеева Ж.И и соав. // Биопрепараты. - 2013 - Т. 47. - С. 4-11.

14. Шило В.Ю. Новый эритропоэз-стимулирующий препарат Аранесп (дарбэпоэтин альфа) в коррекции анемии почечного генеза. / Шило В.Ю. // Нефрология и диалез. - 2007 - Т.9 - С. 216-223.

15. Elliott S. Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineering. / Elliott S., Lorenzini Т., Asher S. et al. // Nat Biotechnol. - 2003. -vol. 21 - P. 414-421.

16. Sinclair A.M. Glycoengineering: the effect of glycosylation on the properties of therapeutic proteins. / Sinclair A.M., Elliott S. // J Pharm Sci. - 2005 -vol. 94-P. 1626-1635.

17. Walsh G. Post-translational modifications of protein biopharmaceuticals. / Walsh G. // Drug discovery today. - 2010. - vol. 15 - P. 773-780.

18. Lai P.H. Structural characterization of human erythropoietin/ P.H. Lai, R. Everett, F.F. Wang et al. // J.Biol.Chem. - 1986. - vol.261 - P. 3116-3121.

19. Takeuchi M. Relationship between sugar chain structure and biological activityof recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary

cells / Takeuchi M., Inoue N., Stricland T.W. et al. // Proc. Nati. Acad. Sei. USA. -1989.-vol. 86-P. 7819-7822.

20. Gross A.W. Cellular Trafficking and degradation of erythropoietin and novel erythropoiesis stimulating protein (NESP)/ A.W.Gross, H.F.Lodish // J.Biol.Chem. - 2006. - vol.281 - P.2024-2032.

21. Eric G. Stefanich. Evidence for an asialoglycoprotein receptor on nonparenchymal cells for O-linked glycoproteins. / E. G. Stefanich, S. Ren, D. M. Danilenko et al. // J. Pharmacology and Exp. Therapeutics. - 2008. - vol. 327 - P. 308-315.

22. Egrie J.C. Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP). / Egrie J.C. and Browne J.K. // British J. of Cancer. -2001.-vol. 84-P. 3-10.

23. Aminoff D. Role of sialic acid in survival of erythrocytes in the circulation: interaction of neuraminidase-treated and untreated erythrocytes with spleen and liver at the cellular level. / Aminoff D., Bruegge W., Bell W. et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 1977. - vol. 74 - P. 1521-1524.

24. Morell A. The role of sialic acid in determining the survival of glycoproteins in the circulation. / Morell A.G., Gregoriadis G., Scheinberg I.H. et al. //J.Biol. Chem. - 1971. - vol. 246 - P. 1461-1467.

25. Knauft M. Relationship of effective molecular size to systemic clearance in rats of recombinant interleukin-2 chemically modified with water-soluble polymers / Knauft M., Bell D.P., Hirtzer P. et al. // J.Biol.Chem. - 1988. - vol. 263 -P. 15064-15070.

26. Briggs D.W. Hepatic clearance of intact and desialylated erythropoietin. / Briggs D.W., Fisher J.W., George W.J. // American J.Physiology. - 1974. - vol. 227 -P. 1385-1388.

27. Vadhan-Raj S. Assessment of hematologic effects and fatigue in cancer patients with chemotherapy-induced anemia given darbepoetin alfa every two weeks. / Vadhan-Raj S., Mirtsching B., Charu V. et al. // The J. Of Supp. Oncol. - 2003. -vol. 1 -P. 131-138.

28. Egrie G.C. Darbepoetin alfa has a longer circulating half-life and greater in vivo potency than recombinant human erythropoietin. / Egrie G.C., Dwyer E., Browne J.K. et al. // Exp. Hematol. - 2003. - vol. 31 - P. 290-299.

29. Macdougall I.C. Pharmacokinetics of novel erythropoiesis stimulating protein compared with epoetin alfa in dialysis patients. / Macdougall I.C., Gray S.J., Elston O., et al. // Am Soc Nephrol. - 1999. - vol. 87 - P. 2392-2395

30. Mirtsching B. Every-2-week darbepoetin alfa is comparable to rHuEPO in treating chemotherapy-induced anemia. Results of a combined analysis. / Mirtsching В., Charu V., Vadhan-Raj S., et al. // Oncology. - 2002. - vol. 16 - P. 31-36.

31. Elliott S.G., Byrne Т.Е. Glycosylation analogs of erythropoietin // United States Patent № US 7217689 В1. - 2007.

32. European Pharmacopoeia - Edition 8, 2014. P. 1813.

33. Fisher J.W. Erythropoietin: physiology and pharmacology update. / Fisher J.W. // Exp. Biol. Med. - 2003. - vol. 228 - P. 1-14.

34. Brown J.K. Erythropoietin: gene cloning, protein structure, and biological properties. / Brown J.K., Cohen A.M., Egrie J.C., et al. //Cold Spring Harb Symp Quant. Biol. -1986.-vol. 51 - P. 693-702.

35. Egrie J.C. Characterization and biological effects of recombinant human erythropoietin. / Egrie J.C., Strickland T. W., Lane J., et al. // Immunobiology -1986.-vol. 172-P. 213-224.

36. Румянцев А. Г. Эрнтропоэтин в диагностике, профилактике и лечении анемий. / Румянцев А. Г., Морщакова Е.Ф., Павлов А.Д. - Москва, 2003.- 173 с.

37. Santos M.R. Separation of Recombinant Human Erythropoietin (rhEPO) using the European Pharmacopoeia Method on the PA 800 plus Pharmaceutical Analysis System. / Santos M.R. // Beckman Coulter - 2012. - P. 1-8.

38. Delorme E. Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin. // Delorme E., Lorenzini Т., Giffin J. et al. // Biochemistry - 1992. -vol. 31 - P. 9871-9876.

39. Robinson D.M. Darbepoetin alfa: its use in anemia associated with chronic kidney disease. / Robinson D.M., Easthope S.E. // BioDrugs - 2005. - vol. 19 - P. 327-343.

40. Lin F.K. Cloning and expression of the human erythropoietin gene. / Lin F.K., Suggs S., Lin C.H. et al. // Proc Natl Acad Sei USA - 1985. - vol. 82 - P. 7580-7584.

41. Jelkman W. The enigma of the metabolic fate of circulating erythropoietin (Epo) in view of the pharmacokinetics of the recombinant drugs rhEpo and NESP. / Jelkman W. // Eur J Haematol. - 2002. - vol. 69 - P. 265-274.

42. Skibeli V. Sugar profiling proves that human serum erythropoietin differs from recombinant human erythropoietin. / Skibeli V., Nissen-Lie G., Torjesen P. // Blood. - 2001. - vol. 98 - P. 3626-3634.

43. Halstenson C.E. Comparative pharmacokinetics and pharmacodynamics of epoetin alfa and epoetin beta. / Halstenson C.E., Macres M., Katz S.A. et al. // Clin Pharmacol Ther. - 1991. -vol. 50-P. 702-712.

44. Stockenhuber F. Pharmacokinetics and dose response after intravenous and subcutaneous administration of recombinant erythropoietin in patients on regular haemodialysis treatment or continuous ambulatory peritoneal dialysis. / Stockenhuber F., Loibl U., Gottsauner-Wolf M. et al. // Nephron. - 1991. - vol. 59 -P. 399-402.

45. Nimtz M. Structures of sialylated oligosaccharides of human erythropoietin expressed in recombinant BHK-21 cells. / Nimtz M., Martin W., Wray V., et al.// Eur J Biochem. - 1993.-vol. 213-P. 39-56.

46. Macdougall I.C. Novel erythropoiesis stimulating protein. / Macdougall I.C. // Semin. Nephrol. - 2000. - vol. 20 - P. 375-381.

47. Scott S.D. Dose conversion from recombinant human erythropoietin to darbepoetin alfa: recommendations from clinical studies. / Scott S.D. // Pharmacotherapy. - 2002 - vol. 22 - P. 160S-165S.

48. Allon M. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of darbepoetin alfa and epoetin in patients undergoing dialysis / Allon M., Kleinman K., Walczyk M., et al. // Clin Pharmacol Ther. - 2002. - vol. 72 - P.546-555.

49. Терёшкина О.И. Современные аспекты оценки безопасности состава воспроизведенных лекарственных препаратов. / Терёшкина О.И. // Разработка и регистрация лекарственных средств. - 2013. - Т.З - 70-73 с.

50. Давыдова К.С. Оригинальные и воспроизведенные лекарственные средства - реалии современного фармацевтического рынка. / Давыдова К.С. // Ремедиум. -2011.- №2.

51. Тарловская Е.И. Генерики и оригинальные препараты: взгляд практического врача. / Тарловская Е.И. // Российский Медицинский Журнал. -2008.-т. 16- 30-35 С.

52. Федеральный закон от 12.04.10 №61-ФЗ (ред. от 12.03.2014) «Об обращении лекарственных средств».

53. Directive 2001/83/ЕС of the european parliament and of the council of 6 november 2001 on the community code relating to medicinal products for human use: Official journal L - 311. - 2004. - P. 67 - 128.

54. EU guidelines for generics [электронный ресурс] // Generics and Biosimilars initiative. - 2010. - Режим доступа: http-' www.gabionlinc.net Guidelines I I'-giuddines-tor-generics .

55. Лазарева Н.Б. Биоаналоги: актуальные вопросы изучения и экспертизы. / Лазарева Н.Б., Игонин А.А. // Лекарственные средства: прикладная фармакология и персонализированная фармакотерапия .- 201 O.T.I -50-54 С.

56. Morawala P.V., Sunit М., Sudhir J., Ashutosh V., Gopal D., Srinivas I. A process for recovering darbepoietin alfa isoforms // International application published under the patent cooperation treaty № WO 2011/024024 Al. - 2011.

57. Серегин Ю.А., Шукуров P.P., Кряжевских И.С., Хамитов P.A., Сауткина E.H., Орлова H.B. Эукариотическая клетка-хозяин для экспрессии

дарбэпоэтина, вектор экспрессии и способ получения дарбэпоэтина альфа // Патент РФ № 2523948 -2013.

58. Нурбаков А.А. Оптимизация технологии культивирования клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный дарбэпоэтин-альфа, в замкнутом объеме с подпиткой. / Нурбаков А.А., Лобанова Н.В., Савинова И.Н., Шукуров P.P., Орлова Н.В. и др. // Биотехнология. - 2012. - Т. 5 - 55-65 С.

59. Шукуров P.P. Создание стабильной клеточной линии-продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина-альфа на основе клеток СНО. / Шукуров P.P., Лобанова Н.В., Савинова И.Н., Воробьева И.Г., Нурбаков

A.А., Ермолина Л.В., Орлова Н.В. и др. // Биотехнология. - 2013. - Т.2 -46-54 С.

60. Орлова Н.В. Изучение влияния различных добавок в питательную среду на уровень продукции и степень гликозилирования рекомбинантного эритропоэтина человека, секретируемого производственной клеточной линией СНО-Еро-2. / Орлова Н.В., Антонова Л.П., Лобанова Н.В. и соавт. // Биотехнология. - 2013. - Т. 4 - 48-55 С.

61. Аберкромби Д. Аффинная хроматография. Методы: монография / Аберкромби Д., Алленмарк С. и др.; под ред. П. Дина, У. Джонсона, Ф. Мидла. - Москва: изд. Мир, 1988. - 278 с.

62. Riechmann L. Reshaping human antibodies for therapy. / Riechmann L., Clark M., Walmann H. et al. // Nature. - 1988. - vol. 332 - P. 323-327.

63. Ratner B. Allergy, Anaphylaxis and immunotherapy: монография / Ratner

B. - Baltimore: Williams and Wilkins, 1943.

64. Miller R.A. Monoclonal antibody therapeutic trials in seven patients with T-cell lymphoma. / Miller R.A., Oseroff A.R., Stratte P.T. et al. // Blood. - 1983. -vol. 62 - P. 988-995.

65. Lai P.H., Strickland T.W. Erythropoietin purification // United States Patent №4667016.- 1987.

66. Egrie J.C. Novel erythropoiesis stimulating protein (NESP) has a longer serum half-life and greater in vivo biological activity than recombinant human

erythropoietin (rHuEPO). / Egrie J.C., Dwyer E., Lykos M. et al. // Blood. - 1997. -vol.90-P. 243.

67. Elliott S.G. Rational design of novel erythropoiesis stimulating protein (ARANESP™): a super-sialated molecule with increased biological activity. / Elliott S.G., Lorenzini Т., Strickland T. et al. // Blood. - 2000. - vol. 96 - P. 352.

68. Macdougall I.C. Pharmacology of darbepoetin alfa. / Macdougall I.C., Padhi D., Jang G. // Nephrol Dial Transplant. - 2007 - vol. 22 - P. iv2-iv9.

69. Sasu B.J. Comparison of epoetin alfa and darbepoetin alfa biological activity under different administration schedules in normal mice. / Sasu B.J., Hartley C., Schultz H. et. al. // Acta Haematol. - 2005. - vol. 113 - P. 163174.

70. Sinclair A. M. Erythropoiesis stimulating agents: approaches to modulate activity. / Sinclair A. M. // Biologies: Targets and Therapy. - 2013. - vol. 7 - P. 161 -174.

71. Стыскин E.JI. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография / E.J1. Стыскин, Л.Б. Ициксон, Е.В. Брауде. - Москва: Химия, 1986. - 7с.

72. Бёккер Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: методы хроматографии и капиллярного электрофореза / Бёккер Ю. - Москва: Техносфера, 2009. - 17с.

73. Сычев К.С. Практическое руководство по жидкостной хроматографии / К.С. Сычев. - Москва: Техносфера, 2010. - 11 с.

74. Руководство по инструментальным методам исследований при разработке и экспертизе качества лекарственных препаратов: Руководство / Быковский С.Н., Василенко И.А., Харченко М.И., Белова А.Б., Шохин И.Е., Дорина Е.А. - М. Изд-во Перо, 2014. - 188 с.

75. Орлов В.И. Жидкостная хроматография. Теоритические основы / В.И. Орлов, А.А. Аратсков. - Дзержинск: Синтеко, 1997. 28-30с.

76. Хроматографические методы анализа: Методическое пособие для студентов специального курса / Шаповалова Е.Н., Пирогов А.В. - Москва:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 2007 - С.63-69.

77. Reichel С. Handbook of Experimental Pharmacology / Reichel С., Gmeiner G. - Seibersdorf: D. Thieme and P. Hemmersbach, 2010. 251-294 P.

78. Руководство для предприятий фармацевтической промышленности: методические рекомендации / Юргель Н.В. - Москва: спорт и культура, 2007 -14-34 с.

79. Quality assurance of pharmaceuticals: meyting a major public health challenge. The who expert committee on specifications for pharmaceutical preparations / Geneva: WHO, 2013.

80. Validation of analytical procedures: Text and methodology. Q2(R1), ICH -

1994.

81. WHO Expert Committee on Specifications for Pharmaceutical Preparations. Thirty-second Report. Geneva, World Health Organization, 1992 (WHO Technical Report Series, No. 823).

82. The United States Pharmacopoeia 30 - The National Formulary. <1225> «Validation of Compendial Procedures», 2008.

83. Guidance for Industry. Process Validation: General Principles and Practices / FDA, CDER, CBER, CVM. - 2011.

84. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. / Laemmli U.K. // Nature. - 1970. - vol. 227 - P. 680685.

85. Колочева Т.И. Новый набор реагентов для определения эритропоэтина в биологических жидкостях [электронный ресурс] / Колочева Т.Н., Решетников С.С. // Новости Вектор-Бест. - 2008. - Т. 48. - Режим доступа: http://www.vector-best.ru/nvb/n48/st48_4.htm

86. Instruction for use Quantikine© IVD® Human Erythropoietin ELISA R&D Systems Inc. Catalog Number DEP00.

87. Федеральный закон от 26.06.08 № Ю2-ФЗ (ред. от 23.06.2014) "Об обеспечении единства измерений"

88. ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 Государственный стандарт Российской Федерации. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. - М. : Стандартинформ, 2002.

89. Ermer J. Method Validation in Pharmaceutical Analysis: A Guide to Best Practice. / Ermer J., Miller J. - Wiley-VCI I Verlag GmbH & Co. KGaA, 2005. - P. 243 -264.

90. Reviewer Guidance. Validation of Chromatographic Methods. Center for Drug Evaluation and Research (CDER), 1994.

91. Lacunza I. Selection of migration parameters for a highly reliable assignment of bands of isoforms of erythropoietin separated by capillary electrophoresis. / Lacunza I., Lara-Quintanar P., Moya G. et. Al. // Anal. Chem. -2004.-vol. 25 - P. 1569-1579.

92. Boucher S. Qualitative and quantitative assessment of marketed erythropoiesis-stimulating agents by capillary electrophoresis. / Boucher S., Kane A., Girard M. // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. - 2012. - vol. 71 - P. 207-013.

93. Bietlot H. Analysis of recombinant human erythropoietin in drug formulations by high-performance capillary electrophoresis. / Bietlot H., Girard M. // Journal of Chromatography. - 1997.-vol. 759 -P. 177-184.

94. Gimenez E. Analysis of intact erythropoietin and novel erythropoiesis-stimulating protein by capillary electrophoresis-electrosprayion trap mass spectrometry. / Gimenez E., Benavente F., Barbosa J. et al. // Electrophoresis. -2008.-vol. 29-P. 2161-2170.

95. Schiestl M. Acceptable changes in quality attributes of glycosylated biopharmaceuticals. / Schiestl M., Stangler T.,Torella C. // Nature biotechnology. -2011.-vol. 29-P. 310-312.

96. ГОСТ 8.315-97 Государственная система обеспечения единства измерений. Стандартные образцы состава и свойств веществ и материалов. -Минск: Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации, 1997.

97. Andersen, D.C. Recombinant protein expression for therapeutic applications / D.C. Andersen, L. Krummen // Curr. Opin. Biotechnol. - 2002. - Vol. 13,- P. 117-123.

98. Pavlou, A.K. Recombinant protein therapeutics - success rates, market trends and values to 2010 / A.K. Pavlou and J.M. Reichert // Nat. Biotechnol. -2004.-Vol. 22-P. 1513-1519.

99. Wurm, F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells / F.M. Wurm // Nature Biotechnol. - 2004. - Vol. 22 - P. 13931398.