Получение и биохимическая характеристика рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Монахова Варвара Сергеевна

• Монахова Варвара Сергеевна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Монахова Варвара Сергеевна

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Степень разработанности темы

1.3. Цель и задачи исследования

1.4. Научная новизна

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы

1.6. Методология и методы исследования

1.7. Положения, выносимые на защиту

1.8. Апробация результатов работы

1.9. Личный вклад соискателя

1.10. Публикации

1.11. Объем и структура диссертации

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Фолликулостимулирующий гормон

2.1.1. Структура генов ФСГ

2.1.2. Строение ФСГ и его пост-трансляционные модификации

2.1.3. Секреция ФСГ

2.1.4. Рецептор ФСГ и передача сигнала

2.1.5. Биологическая роль ФСГ

2.1.6. Препараты ФСГ

2.2. Гликозилирование ФСГ

2.2.1. Строение гликанов и биосинтез гликопротеинов в клетках млекопитающих

2.2.2. Особенности гликозилирования ФСГ

2.2.3. Роль гликанов в составе ФСГ

2.3. Получение рекомбинантных белков в клеточных линиях млекопитающих

2.4. Получение рчФСГ в клеточных линиях на основе СНО

2.5. Методы анализа гликозилированных белков

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Получение клонов клеток-продуцентов рчФСГ

3.1.1. Создание экспрессионных конструкций

3.1.2. Культивирование клеток СНО

3.1.3. Трансфекция культуры клеток НЕК-293

3.1.4. Трансфекция культур клеток СНО

3.1.5. Получение пулов клеток СНО, продуцирующих рчФСГ

3.1.6. Получение клонов-продуцентов рчФСГ

3.1.7. Культивирование клеток клонов-продуцентов рчФСГ с подпитками в малом объеме

3.1.8. Культивирование клеток клона-продуцента рчФСГ в биореакторе волнового типа

3.1.9. Анализ экзометаболитов клеток клона-продуцента рчФСГ при культивировании с подпиткой с помощью ГХ-МС

3.2. Хроматогафическая очистка рчФСГ

3.3. Методы биохимического анализа рчФСГ

3.3.1. Диск-электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия

3.3.2. Определение концентрации рчФСГ с помощью ИФА

3.3.3. Вестерн блот для определения рчФСГ

3.3.4. Капиллярный зонный электрофорез

3.3.5. Капиллярное изоэлектрическое фокусирование

3.3.6. Лектиноферментный анализ

3.3.7. Оценка биологической активности рчФСГ

3.4. Статистическая обработка результатов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Разработка метода культивирования клона-продуцента рчФСГ

4.1.1. Дизайн экспрессионных конструкций

4.1.2. Получение клонов-продуцентов рчФСГ на основе клеточной линии СНО-ОХБ11

4.1.3. Получение клонов-продуцентов рчФСГ на основе клеточной линии СНО-К1

4.1.4. Сравнение клонов-продуцентов рчФСГ на основе клеточных линий СНО-К1 и СНО-DXBll

4.1.5. Подбор условий культивирования клона-продуцента рчФСГ CHO-FSH 91 в малом объеме

4. 1.6. Масштабирование процесса культивирования клона CHO-FSH91

4.1.7. Очистка рчФСГ из культуральной жидкости

4.2. Изучение биохимических свойств рчФСГ

4.2.1. Разделение изоформ рчФСГ с помощью капиллярного изоэлектрического фокусирования

4.2.2. Подбор оптимальных условий разделения изоформ рчФСГ с помощью капиллярного зонного электрофореза

4.2.3. Применение лектиноферментного анализа для оценки гликозилирования рчФСГ

4.2.4. Результаты исследования биологической активности рчФСГ in vitro с использованием клеточной линии CHO-FSHR

4.2.5. Результаты исследования биологической активности рчФСГ in vivo

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и биохимическая характеристика рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека»

1.1. Актуальность проблемы

Высокой биологической активностью и специфичностью действия белков обусловлено их широкое применение в качестве лекарственных препаратов. В течение продолжительного времени единственным масштабным способом их получения для использования в медицинской практике была экстракция из тканей, органов или биологических жидкостей. Но начиная с 1978 года, когда впервые был получен рекомбинантный инсулин, для синтеза белковых препаратов стали использовать методы генной инженерии. В настоящее время большинство используемых в медицине белков человека синтезированы генно-инженерным способом - гормон роста, гормоны репродуктивной системы, поджелудочной железы, факторы свертываемости крови.

На данный момент в России и в мире есть высокая потребность в доступных рекомбинатных гонадотропных гормонах для применения во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ). Важнейшим требованием к ним является их соответствие природным гормонам или уже полученным генно-инженерным путем препаратам-биоаналогам, эффективность и безопасность которых уже клинически доказана.

Ключевым препаратом для нужд ВРТ является фолликулостимулирующий гормон (ФСГ) - гормон-гликопротеин передней доли гипофиза, который представляет собой гетеродимер, состоящий из двух субъединиц а и р. На каждой из субъединиц находится по два сайта К-гликозилирования, и физиологическая активность гормона в значительной степени зависит от степени и характера гликозилирования каждого из сайтов.

Данная работа посвящена разработке технологии получения и характеристике рекомбинантного ФСГ человека для использования в качестве лекарственного препарата.

Чтобы добиться структурно-функционального сходства получаемого белка с природным используют культуры клеток млекопитающих, в частности клеток яичников китайского хомячка (CHO - Chinese hamster ovary cells), в сочетании с различными экспрессионными векторами [63,82,116]. Выбор оптимальной системы экспрессии - родительской клеточной линии и экспрессионного вектора - ключевая задача при разработке технологии биосинтеза рекомбинантных белков.

После создания продуцента следующей важнейшей задачей становится подбор оптимальных условий биосинтеза белка, при которых удается обеспечить одновременно высокую продукцию и соответсвующие биологические и физико-химические свойства белка. Специфической для гликопротеинов является проблема разработки быстрых, надежных и воспроизводимых методов анализа гетерогенности и состава гликанов, которые позволят ускорить процесс мониторинга характеристик белка на всех стадиях биотехнологического процесса.

1.2. Степень разработанности темы

Процесс получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека (рчФСГ) совершенствовался на всех стадиях - от получения экспрессионных векторов до разработки методов анализа - и продолжает совершенствоваться в связи с развитием рекомбинантных технологий.

Первоначально экспрессионные векторы содержали полноценные последовательности а- и Р-субъединиц рчФСГ, включая кодирующие и некодирующие области [36,132]. В настоящее время существует возможность оптимизировать генетические конструкции - использовать регуляторные элементы для контроля экспрессии, подбирать гены селективных маркеров, обеспечивать индукцию экспрессии целевых генов [7,117].

Для получения рчФСГ ранее использовали клеточные линии мыши, что приводило к потенциальной иммуногенности получаемого белка [39]. В

дальнейшем применение клеточных линий СНО позволило решить эту проблему. Использование этих клеточных линий обеспечивает высокий выход продукта и сходные с человеческими пост-трансляционные модификации белков. Для получения рчФСГ использовали адгезионные клеточные линии СНО, культивируемые в среде с сывороткой крови животных, и линии, адаптированные к бессывороточным условиям после получения отдельных клонов-продуцентов. В настоящем исследовании применяли адаптированные к бессывороточным условиям культивирования суспензионные родительские клеточные линии СНО, что позволило исключить этап адаптации клеток к культивированию без сыворотки крови и к перемешиванию.

Методы физико-химического анализа, используемые для характеристики рчФСГ, также разнообразны. Для оценки состава гликозилированных изоформ (профиля гликозилирования) белка используют изоэлектрическое фокусирование [35], высокоэффективную жидкостную хроматогафию [65], масс-спектрометрию [26,70]. Традиционно используемые методы анализа зачастую требуют длительных этапов пробоподготовки и в некоторых случаях - особо дорогостоящего оборудования. В данном исследовании разработаны простые в исполнении методы анализа полноразмерного рчФСГ, не требующие дополнительных этапов модификации образца.

1.3. Цель и задачи исследования

Цель исследования заключалась в создании технологии получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека и изучении его биохимических характеристик.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Исследовать возможность создания клонов-продуцентов, стабильно экспрессирующих рчФСГ, с использованием клеточных линий СНО.

2. Разработать метод получения рчФСГ из культуральной жидкости, обеспечивающий получение максимального количества биологически активного белка.

3. Разработать методы анализа профиля гликозилирования полученного полноразмерного рчФСГ с помощью капиллярного электрофореза и лектиноферментного анализа.

4. Изучить биохимические характеристики полученного рчФСГ и сравнить их с характеристиками коммерческого препарата рчФСГ «Гонал-Ф».

1.4. Научная новизна

Получен оригинальный продуцент рчФСГ на основе клеточной линии СНО-К1. Высокая удельная и волюметрическая продуктивность клона-продуцента была достигнута путем оптимизации кодонного состава гена ФСГ человека в составе экспрессионного плазмидного вектора и подбора условий культивирования клона-продуцента.

Впервые был разработан способ культивирования клеточной линии-продуцента рчФСГ на основе адаптированной к культивированию в бессывороточных суспензионных условиях клеточной линии СНО-К1, который позволяет получить до 75 мг рчФСГ на литр культуральной жидкости. При этом получаемый рчФСГ обладает профилем гликозилирования, воспроизводимым в последующих культивированиях.

Впервые были разработаны и успешно внедрены физико-химические методы анализа рчФСГ на основе капиллярного электрофореза и лектиноферментного анализа, позволяющие оценить гетерогенность изоформ полноразмерного гормона.

1.5. Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы заключается во всестороннем изучении состава гликозилированных изоформ рчФСГ с помощью капиллярного электрофореза и лектиноферментного анализа. Разработанные методы могут быть использованы для характеристики препаратов ФСГ, выделенных из различных источников, с целью определения их структурно-функциональных особенностей.

Практическая ценность работы состоит в разработке технологии получения рчФСГ, имеющего аналогичные биохимические характеристики с оригинальным импортным препаратом рчФСГ «Гонал-Ф» производства Merck Serano (Италия). Учитывая, что срок действия большинства патентов на этот препарат уже истек, данная технология может быть использована в создании доступного отечественного лекарственного препарата на основе рчФСГ.

1.6. Методология и методы исследования

В работе был использован широкий спектр методов: молекулярно-генетические (получение экспрессионных плазмидных векторов, трансформация бактериальных клеток и трансфекция клеток эукариот), культуральные (оценка жизнеспособности клеток в культуре, клонирование, культивирование клонов-продуцентов в условиях CO2-инкубатора и биореактора, оптимизация условий культивирования клонов-продуцентов), физико-химические методы анализа белков (иммуноферментный анализ, электрофорез белков в полиакриламидном геле, вестерн блоттинг, лектиноферментный анализ, капиллярный зонный электрофорез, капиллярное изоэлектрическое фокусирование), методы оценки биологической активности in vitro (определение биологической активности препаратов рчФСГ с использованием клеточной линии, содержащей рецептор ФСГ человека) и in vivo (анализ способности препаратов рчФСГ оказывать влияние на рост фолликулов неполовозрелых крыс при подкожном введении).

1.7. Положения, выносимые на защиту

1. Создана серия клонов-продуцентов рчФСГ на основе клеточных линий СНО-К1 и CHO-DXB11, культивируемых суспензионно в бессывороточных средах. Установлено, что клон CHO-FSH91 обладает волюметрической продуктивностью до 75 мг/л.

2. Разработан метод анализа рчФСГ на основе капиллярного зонного электрофореза с использованием трицинового буфера, которая позволяет выявлять отдельные сиалированные изоформы рчФСГ.

3. Разработана технология получения рчФСГ от клона-продуцента CHO-FSH91, позволяющая получать до 198 мг очищенного рчФСГ от одного культивирования в объёме 5 литров (патент РФ № 2697273).

4. Биологическая активность и физико-химические свойства полученного рчФСГ соответствуют свойствам коммерческого препарата рчФСГ «Гонал-Ф».

1.8. Апробация результатов работы

Результаты работы представлены и обсуждены на конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2015), на Международном конгрессе «Biologics&Biosimilars» (Берлин, 2016), на Первой научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты биотехнологии и иммунофармакологии» (Санкт-Петербург, 2017), на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 120-летию филиала АО «НПО «Микроген» (Пермь, 2018), на IV Научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты биотехнологии и иммунофармакологии» (Сочи, 2018), на XXV Международном симпозиуме «International Symposium of glycoconjugates» (Милан, 2019), на Научно-практической конференции OpenBio-2019 (Кольцово, 2019).

1.9. Личный вклад соискателя

Личный вклад автора состоит в участии в проведении всех этапов работ: в планировании и организации экспериментов, их проведении, подборе и оптимизации условий культивирования клонов-продуцентов, подборе и оптимизации аналитических методов, теоретическом анализе и статистической обработке экспериментальных данных, подготовке к публикации статей и патента.

Ряд исследований проведен совместно с коллегами из ФГУП «Гос.НИИ ОЧБ» ФМБА России Кудлинг Т.В., Карасевым М.М. и Гинановой В.Р. (генная инженерия), Пигаревой Н.В. (получение клеток-продуцентов рчФСГ) и Захаровым М.С. (определение биологической активности рчФСГ in vivo). Работы по выделению и очистке рчФСГ из культуральной жидкости проводились совместно с сотрудником ФГБУ «НИИ гриппа им. А.А. Смородинцева» Шалджяном А.А. Соискатель приносит коллегам свою искреннюю благодарность.

1.10. Публикации

По теме диссертации опубликованы 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ, и получен 1 патент:

1. Монахова В.С., Сушкин М.Е., Симбирцев А.С. 2019. Метод капиллярного зонного электрофореза для анализа гликозилированного рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона. Биотехнология. 35 (4): 5564

2. Монахова В.С., Пигарева Н.В. Симбирцев А.С. 2020. Выбор клеточной линии для получения штамма-продуцента рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 23 (3): 3-7

3. Патент РФ № 2019105063, 22.02.2019. Монахова В.С., Климов Н.А., Кудлинг Т.В., Пигарева Н.В., Карасев М.М., Шалджян А.А., Симбирцев А.С. Способ получения рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона человека, клеточная линия-продуцент и плазмидные экспрессионные векторы // Патент России № 2697273, 2019. Бюл. 23

1.11. Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирована 36 рисунками, 15 таблицами и 3 приложениями. Список литературы содержит 172 литературных источников.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Фолликулостимулирующий гормон

2.1.1. Структура генов ФСГ

Фолликулостимулирующий гормон по своей химической природе относится к сложным белкам (суперсемейство цистеинового узла, семейство гормонов-гликопротеинов), по биологической природе - к тропным гормонам (влияющим на синтез других гормонов), регулирующим репродуктивную функцию, по механизму действия - к гормонам, взаимодействующим с мембранными рецепторами (без проникновения в клетку).

Белок был обнаружен в гипофизе и биологических жидкостях и охарактеризован учеными Б. Зондеком и С. Феволдом в конце 1920-х - начале 1930-х годов [98,99]. Гормон имеет строение, сходное с другими гормонами-гликопротеинами - лютеинезирующим гормоном, хорионическим гонадотропином и тиреотропным гормоном. Продукция ФСГ в организме женских особей млекопитающих необходима для обеспечения фертильности, в организме мужских - в зависимости от биологического вида [77,96].

ФСГ представляет собой гетеродимер, состоящий из двух нековалентно связанных субъединиц - а и р. Нуклеотидная последовательность гена а-субъединицы является общей для гормонов-гликопротеинов, ген локализован в хромосоме 6q14.3 и имеет 5 экзонов [43]. Экспрессия гена происходит в трофобластах, гонадотрофах и тиреотрофах. Нуклеотидная последовательность гена Р-субъединицы уникальна для каждого гормона семейства. В случае ФСГ ген локализуется в хромосоме 1 ^14.1, имеет длину 4262 нуклеотида и 3 экзона [110]. ГенР-субъединицы Е8ИБ экспрессируется в гонадотропных клетках гипофиза. Экспрессия регулируется в основном гонадотропин-рилизинг фактором, ингибином и активином [46,48]. Последовательность Е8ИБ характеризуется

низкой генетической вариабельностью. Большинство полиморфизмов, обнаруженных в последовательности гена, расположены в некодирующих областях [146].

2.1.2. Строение ФСГ и его пост-трансляционные модификации

Молекулярная масса ФСГ составляет 34 кДа. Длина последовательности а-субъединицы - 92 а.о., Р-субъединицы - 111 а.о. [27, 68] (Рисунок 1). Аминокислотная последовательность а-субъединицы идентична для всех гормонов-гликопротеинов, Р-субъединицы - специфична для каждого гормона семейства. Однако отмечено и наличие гомологичных участков последовательностей, ответственных за образование цистеиновых узлов и за взаимодействие с а-субъединицей [143].

При изучении кристаллической структуры ФСГ были обнаружены внутримолекулярные дисульфидные связи (С7-31, С10-60, С28-82, С32-84, С59-87 в а-субъединице и С3-51, С17-66, С20-104, С28-82, С32-84, С87-94 в р-субъединице), которые соединяют удаленные друг от друга участки отдельных субъединиц. Сегменты, образованные перекрестными Б-Б-связями, формируют структуры называемые «цистеиновыми узлами». Эти «узлы», в свою очередь, образовывают стабильную конформацию, состоящую из петель - Ь1, Ь2 и Ь3. Петли Ь1 и Ь3 имеют форму жесткой шпильки, петля Ь2 подвижна и располагается с противоположной стороны от центра молекулы (Рисунок 1). В гетеродимере а- и Р-субъединицы расположены симметрично. Полная молекула ФСГ компактна и характеризуется высоким значением отношения площади к объему молекулы [57]. С-концевой участок Р-субъединицы выходит за пределы центральной части молекулы, которая скреплена «цистеиновыми узлами», и формирует еще одну петлю, которую называют «ремнем безопасности» [46] или «цистеиновым лассо» [61]. С-концевой участок Р-субъединицы оборачивается вокруг антипараллельных а-спиралей, формирующих Ь2-петлю а-субъединицы, и

стабилизируется за счет внутримолекулярных дисульфидных связей Р-субъединицы [21].

Рисунок 1. Строение субъединиц фолликулостимулирующего гормона [27]. А - аминокислотная последовательность и структура а-субъединицы ФСГ. Б - аминокислотная последовательность и структура в-субъединицы ФСГ.

Олигосахаридные цепочки, ^гликаны, составляют до 35% массы молекулы. Каждая из субъединиц ФСГ содержит по два сайта N гликозилирования [29]. ^гликаны присоединяются к консенсусной аминокислотной последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X-любая аминокислота, в позициях 52 и 78 на а-субъединице и в позициях 7 и 24 на Р -цепи. К а-цепи всегда присоединены ^гликаны, что характерно для всех членов семейства гликопротеинов [144]. ^гликаны Р-субъединицы могут отсутствовать на одном

или обоих потенциальных сайтах гликозилирования, определяя макрогетерогенность молекулы. Разнообразие структур гликанов, т.н. микрогетерогенность, определяется моносахаридами, входящими в их состав.

2.1.3. Секреция ФСГ

Основным регулятором секреторной активности ФСГ является гонадотропин-рилизинг-гормон (ГнРГ) или гонадолиберилин - нейропептид, вырабатываемый в гипоталамусе. ГнРГ секретируется в пульсируюещем или волновом ритме, причем пульсирующий режим превалирует. Пульсирующий режим представляет собой периодическое высвобождение ГнРГ с частотой 60-90 минут [5,6]. При снижении частоты пульсации ГнРГ снжается секреция лютеинизирующего гормона (ЛГ), но существенно повышается секреция ФСГ [73]. ГнРГ связывается с рецептором, сопряженным с G-белком, на поверхности гонадотропов, активируя Gq/11, который, в свою очередь, активирует фермент фосфолипазу С. Под действием этого фермента образуется инозитол-1,4,5-трифосфат и диацилглицерол. Повышение уровня этих внутриклеточных мессенджеров активирует протеинкиназу С и увеличивает уровень внутриклеточного кальция. Протеинкиназа С регулирует экспрессию Р-субъединицы ФСГ, тогда как секреция ФСГ регулируется внутриклеточным кальцием [103]. Длительная экспозиция гонадотрофов с большими дозами ГнРГ и аналогами-агонистами вызывает десенситизацию рецепторов ГнРГ и подавляет синтез гонадотропинов. Подавление функций ГнРГ-продуцирующих нейронов используют в клинической практике для ингибирования синтеза эндогенных гонадотропинов во вспомогательных репродуктивных технологиях (ВРТ). Выработка ФСГ также регулируется стероидными гормонами по принципу положительной и отрицательной обратной связи в гипоталамо-гипофизарно-гонадной (ГГГ) оси [167]. На секрецию гормона также влияют такие молекулы, как гонадотропин-регулирующий гормон, фоллистатин, активины и ингибины [103, 141].

2.1.4. Рецептор ФСГ и передача сигнала

Рецептор гормона относится к суперсемейству рецепторов, связанных с G-белками (GPCR) и семейству родопсин-подобных рецепторов (семейство А). FSHR состоит из трех доменов: внеклеточного (гидрофильная ^концевая часть), трансмембранного (содержит потенциальные сайты фосфорилирования) и внутриклеточного (Рисунок 2).

Рисунок 2. Строение рецептора фолликулостимулирующего гормона [142].

С помошью аланинового скрининга были определены замены в последовательности генов ФСГ, ответственные за связывание белка с рецептором. Замена сегмента LVY 37-39 в Р-субъединице ФСГ на остатки аланина вызывает 20-кратное снижение связывания с рецептором и полностью подавляет способность мутантного гормона активировать рецептор ФСГ [154]. Значение константы диссоциации, которое для нормального ФСГ составляет 0,3 нМ, в случае мутантной формы его Р-субъединицы (AAA 37-39) повышается до 7 нМ. Замены соседних сегментов, TRDL 34-37 и RPKI 44-47, на сегменты AAAA 34-

37 и АРАА 44-47 также ослабляют аффинность связывания с рецептором ФСГ -значения ГО 50 в этом случае повышаются до 1.1 и 1.9 нМ, соответственно. В связывании с рецепторами также принимает участие С-концевой сегмент 88-92 а-субъединицы ФСГ [12, 37, 165].

Связывание ФСГ с его рецептором приводит к активации как минимум трех внутриклеточных сигнальных каскадов, что обусловлено их функциональным взаимодействием с двумя типами G-белков, Gs и Gq/11, а также с Р-аррестинами [6, 147]. Активация Gs-белков приводит к активации фермента аденилатциклазы, что ведет к повышению внутриклеточного уровня цАМФ и активации цАМФ-зависимых транскрипционных факторов. Этот путь играет исключительно важную роль в регуляции стероидогенеза [139]. Активация Gq/11-белков приводит к стимуляции активности фосфолипазы С, что приводит к повышению уровня внутриклеточного кальция и активации кальций-зависимых путей. При взаимодействии активированных рецепторов с регуляторными белками Р-аррестинами (этот путь независим от G-белков) происходит стимуляция митоген-активируемых протеинкиназ, запуск механизмов эндоцитоза и рециклизации лиганд-рецепторных комплексов [102, 134].

2.1.5. Биологическая роль ФСГ

ФСГ в женском организме стимулирует рост фолликулов и усиливает секрецию эстрогенов, вызываемую ЛГ. Гормон играет ключевую роль в начальной фазе менструального цикла, фолликулиновой, в процессе которой вырабатываются гормоны ЛГ и ФСГ. В ответ на ЛГ клетки теки производят андрогены, а ФСГ оказывает пролиферативный эффект на клетки гранулезы и влияет на выработку в этих клетках фермента ароматазы, который отвечает за превращение андрогенов в эстрадиол [34]. Таким образом, реализуется обратная связь ГГГ оси и снижается уровень продукции гонадотропных гормонов в гипофизе (Рисунок 3). ФСГ также стимулирует повышение количества

рецепторов к ЛГ на клетках теки и клетках гранулезы. Только те фолликулы, которые имеют достаточное количество рецепторов к ЛГ на клетках гранулезы, при снижающейся концентрации ФСГ вступают в стадию фолликулогенеза, остальные не созревают и претерпевают обратное развитие. Фолликул, достигший зрелости и секретирующий эстроген, называется граафовым фолликулом. Под действием возрастающего уровня ФСГ и ЛГ завершается его созревание и происходит овуляция. После овуляции роль ФСГ незначительна - процесс образования желтого тела и поддержание состояния эндометрия находятся под контролем ЛГ. После гибели желтого тела, которая предшествует менструации, эффекты отрицательной обратной связи эстрадиола на секрецию ФСГ резко прекращаются, поэтому концентрация ФСГ в период менструации относительно высока. Это повышение стимулирует рост антральных фолликулов, развитие вторичных фолликулов, пролиферацию и дифференцировку гранулезных клеток.

Рисунок 3. Женская гипоталамо-гипофизарно-гонадная ось [129].

У мужчин ФСГ связывается с рецепторами на поверхности клеток Сертоли, расположенных в семенниках. Гормон индуцирует в них синтез андроген-связывающего белка, участвующего в транспорте тестостерона к придаткам яичка, благодаря чему достигается высокая локальная концентрация тестостерона, необходимая для сперматогенеза. Продукция ФСГ в мужском организме, также как и в женском, регулируется по принципу обратной связи тестостероном - чем выше его уровень, тем ниже уровень ФСГ.

2.1.6. Препараты ФСГ

Основная область применения препаратов ФСГ - лечение женского бесплодия путем индукции суперовуляции при экстрокорпоральном оплодотворении. Помимо этого, их используют для восполнения дефицита ФСГ у мужчин при гипогонадизме. В настоящее время в клинических целях применяют препараты двух типов - выделенные из мочи менопаузальных женщин и полученные с помощью рекомбинантных технологий [118].

Первый препарат менопаузального гонадотропина (МГЧ), содержащий ЛГ и ФСГ, был зарегистрирован компанией Serono в Италии в 1950 году. Препарат не содержал стандартизованного количественного соотношения гормонов и имел другие белковые примеси [67]. Первый международный стандарт был получен в 1959 году, в этом же году начались его клинические испытания и через три года был описан первый случай беременности с использованием МГЧ [153]. Следующим этапом являлось получение высокоочищенных препаратов ФСГ. Использование поликлональных антител к ФСГ позволило получить препараты, не содержащие ЛГ, но по-прежнему содержащие некоторое количество мочевых белков [100]. С появлением моноклональных антител к ФСГ были получены высокоочищенные продукты, например, урофоллитропин «Бравелле» (Ferring, Германия), содержащие менее 0,1 МЕ ЛГ и менее 5% мочевых белков. Несмотря на это, в связи с особенностью источника получаемого белка необходимость

большого количества доноров и вариабельность партий оставались проблемами на фоне постоянно растущей потребности в препаратах. Решением явилось получение ФСГ с помощью рекомбинантных технологий.

На рынке представлены три оригинальных препарата рчФСГ -фоллитропин альфа, фоллитропин бета и фоллитропин дельта. Первые два препарата получают в клетках линии китайского хомяка, фоллитропин дельта получают в фетальных клетках сетчатки человека. На различных этапах разработки и регистрации находятся препарат фоллитропин эпсилон, полученный в меилоидных клетках человека, и гипергликозилированные препараты ФСГ длительного действия.

Препараты фоллитропин альфа и бета получили лицензию на распространение в Европе и США в конце 1990-х - начале 2000-х годов. Позднее в Европе были получены препараты-биоаналоги: препарат «Овалип» - в 2013 году производства компании Teva (Нидерланды) и «Бемфола» - в 2014 году производства компании Gedeon Richter (Венгрия) [30, 132]. Несмотря на то, что препараты получают в клетках СНО, технологии биологического синтеза значительно отличаются. В случае фоллитропина альфа клетки СНО трансфицированы двумя плазмидами, каждая из которых содержит одну из субъединиц - а или ß, в случае фоллитропина бета - используется одна плазмида, содержащая обе нуклеотидные последовательности (НП). Схемы очистки препаратов также различны. Препарат фоллитропина альфа очищают хроматографически в 5 этапов, причём основным этапом является иммуноаффинная хроматография. Фоллитропин бета также очищают хроматографически, но в 4 этапа - с помощью анионнообменной, катионнообменной, гидрофобной и эксклюзионной хроматографии [122]. Фоллитропин дельта, полученный в клетках линии Per.C6, был зарегистрирован в 2016 году [56]. Особенностью данного препарата является наличие а-2,6-сиалированных гликанов, помимо а-2,3-сиалированных (у клеточных линий СНО

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Монахова Варвара Сергеевна, 2021 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алиев Т. К. Влияние различных компонентов среды культивирования на продукцию рекомбинантных антител в СНО клетках

2. в условиях стабильной и транзиентной экспрессии / Т. К. Алиев, В. А. Топорова, В. В. Аргентова // Современные проблемы науки и образования. -2012. - №5

3. Вахитов Т.Я. Принципы метаболической регуляции и коммуникации у бактерий / Т.Я. Вахитов. - URSS, 2019. - 500 с.

4. Ищенко А.М., Кудлинг Т.В., Петров А.В., Пигарева Н.В., Протасов Е.А., Симбирцев А.С. Синтетическая ДНК, кодирующая интерлейкин-7 человека, содержащий ее экспрессионный вектор (варианты), штамм-продуцент интерлейкина-7 человека и способ получения интерлейкина-7 человека. Патент России №2615447. 2017. Бюл. №10.

5. Петров А.В., Карасев М.М., Кудлинг Т.В., Пигарева Н.В., Сергеева В.Е., Трофимов А.В., Ищенко А.М., Горбунов А.А., Вахрушев А.В., Симбирцев А.С. Синтетическая ДНК, кодирующая антимюллеров гормон человека, содержащий ее экспрессионный вектор pTVK4pu/MISOPT и штамм клеток яичников китайского хомячка CHO-MIS - продуцент рекомбинантного антимюллерового гормона человека. Патент России №2616273. 2017. Бюл. №11.

6. Шпаков А.О. Гонадотропины - от теории к клинической практике. -Политех-пресс. - 2018.

7. Шпаков А.О. Структурно-функциональная организация рецепторов полипептидных гормонов, содержащих LRR-повторы, и их взаимодействие с гетеромерными G-белками /А.О. Шпаков // Цитология -2009. - Т.51 - №8-стр.638-649.

8. Шукуров Р.Р. Оптимизация генетических конструкций для экспрессии гена дарбэпоэтина в клетках млекопитающих/ Р.Р. Шукуров, К.Ю. Казаченко,

Д.Г. Козлов, А.А. Нурбаков, Е.Н. Сауткина, Р.А. Хамитов, Ю.А. Серегин // Биотехнология - 2013. - №2 - стр.34-45.

9. Abd-Elaziz K. A new fully human recombinant FSH (follitropin epsilon): two phase I randomized placebo and comparator-controlled pharmacokinetic and pharmacodynamic trials / K. Abd-Elaziz, I. Duijkers, L. Stockl, B. Dietrich, C. Klipping, K. Eckert// Hum Reprod. - 2017. - V.32 - p. 1639-47.

10. Ahn S. Characterization of Recombinant Human Erythropoietin Isoforms by Capillary Isoelectric Focusing with Hydroxypropyl Cellulose-Coated Capillaries/ S. Ahn, B. Kim, R.X. Han, H.D. Yu // Chromatographia - 2017. -V. 80 - p.983-98.

11.Alahmad Y. CZE for glycoform profiling and quality assessment of recombinant human interleukin-7 / Y. Alahmad, N.T.Tran, J. Duboeuf, A. Grégoire, I. Rancé, M. Taverna // Electrophresis - 2009. - V.30 - №13 - p. 2347-2354.

12. Anil K.U. Sequence analysis of capsid coding region of foot-and-mouth disease virus type A vaccine strain during serial passages in BHK-21 adherent and suspension cells / K.U.Anil, B.P.Sreenivasa, J.K.Mohapatra, M.Hosamani, R. Kumar, R.Venkataramanan // Biologicals - 2012. - V.40 - № 6 - p.426-430.

13. Arnold C. J. The human follitropin a-subunit C terminus collaborates with a a-subunit cystine noose and an a-subunit loop to assemble a receptor-binding domain competent for signal transduction / C.J. Arnold, C. Liu, B. Lindau-Shepard, M.L. Losavio, M.T. Patrascu, J.A. Dias // Biochem. - 1998. - V. 37 -№7 - p.1762—1768.

14. Baenziger J.U. Pituitary glycoprotein hormone oligosaccharides: structure, synthesis and function of the asparagine-linked oligosaccharides on lutropin, follitropin and thyrotropin / J.U.Baenziger, E.D. Green // Biochim Biophys Acta. - 1988. - V.947 - №2 - p.287-306.

15. Beck A. Glycosylation engineering of biopharmaceuticals. Methods and protocols / A. Beck, Humana Press, 2013. - p. 355.

16.Bemfola. Assessment report. Режим доступа: https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/bemfola-epar-public-assessment-report en.pdf. Дата обращения: 01.05.2020.

17. Bergandi L. Human recombinant FSH and its biosimilars: clinical efficacy, safety and cost-effectiveness in controlled ovarian stimulation for in vitro sterilization / L. Bergandi, S. Canosa, A.R. Carosso, C. Paschero, G. Gennarelli, F. Silvagno, C. Benedetto, A. Revelli // Pharmaceuticals. - 2015. - V.13 - №136 - p.10-24.

18. Betts Z. Ubiquitous Chromatin Opening Elements (UCOEs) effect on transgene position and expression stability in CHO cells following methotrexate (MTX) amplification / Z. Betts, A.J. Dickson // Biotechnol J. - 2016.- V.11 - №4 -p.554-641.

19. Birken S. Isolation and characterization of human pituitary chorionic gonadotropin/ S. Birken, Y. Maydelman, M.A. Gawinowicz, A. Pound, Y. Liu, A.S. Hartree // Endocrinology - 1996. - V.137 - №4 - p. 1402-1411.

20. Bischoff R. Analysis of recombinant proteins by isoelectric focusing in immobilized pH gradients / R. Bischoff, D. Roecklin, C. Roitsch // Electrophoresis. - 1992. - V.13 - №4 - p.214-9.

21. Bishop L.A. Both of the ß-subunit carbohydrate residues of follicle-stimulating hormone determine the metabolic clearance rate and in vivo potency /L.A. Bishop, T.V. Nguyen, P.R. Schofield // Endocrinology - 1995. - V.136 - №6 -p.2635-2640.

22. Bishop L.A. Specific roles for the asparagine-linked carbohydrate residues of recombinant human follicle stimulating hormone in receptor binding and signal transduction / L.A. Bishop, D.M. Robertson, N. Cahir, P.R. Schofield // J Mol Endocrinol. - 1994. - V.8 - №6 - p.722-731.

23. Bloemkolk J.W. Effect of temperature on hybridoma cell cycle and MAb production / J.W. Bloemkolk, M.R. Gray, F. Merchant, T.R. Mosmann // Biotechnol Bioeng. - 1992. - V. 40 - №3 - p.427-31.

24. Bousfield G.R. All-or-none N-glycosylation in primate follicle-stimulating hormone beta-subunits/ G.R. Bousfield, V.Y. Butnev, W.J. Walton, V.T. Nguyen, J. Huneidi, V. Singh, V.S. Kolli, D.J. Harvey, N.E. Rance // Mol. Cell. Endocrinol. - 2007. - V. 260-262. - p.40-48.

25. Bousfield G.R. Carbohydrate analysis of glycoprotein hormones / G.R. Bousfield, V.L. Baker, R.R. Gotschall, V.Y. Butnev // Methods. - 2000. - V.21 -№1 - p.15-39.

26. Bousfield G.R. Chromatofocusing fails to separate hFSH isoforms on the basis of glycan structure/ G.R. Bousfield, V.Y. Butnev, J.M. Bidart, D. Dalpathado, J. Irungu,H. Desaire // Biochemistry - 2008. - V.47 - №6 - p.1708-20.

27. Bousfield G.R. Comparison of Follicle-Stimulating Hormone Glycosylation Microheterogenity by Quantitative Negative Mode Nano-Electrospray Mass Spectrometry of Peptide-N Glycanase-Released Oligosaccharides / G.R Bousfield, V.Y. Butnev, W.K. White, A.S. Hall, D.J. Harvey. // J Glycomics Lipidomics. - 2015.- V.5 - №1 - p. 129.

28. Bousfield G.R. Follicle-Stimulating Hormone Glycobiology/ G.R. Bousfield, D.J. Harvey // Endocrinology - 2019. - V.160 - №6 - p. 1515-1535.

29. Bousfield G.R. In Vivo and In Vitro Impact of Carbohydrate Variation on Human Follicle-Stimulating Hormone Function / G.R. Bousfield, J.V. May, J.S.Davis, J.A.Dias, T.R. Kumar // Front Endocrinol. - 2018. - V.9 - p.216.

30. Bousfield G.R. Structural features of mammalian gonadotropins / G.R.Bousfield, V.Y.Butnev, R.Russell, G.Van, L.Baker, W.T.Moore // Molecular and Cellular Endocrinology - 1996. - V.125 - №1-2 - p.3-19.

31. Bruno L. The Development of Gonadotropins for Clinical Use in the Treatment of Infertility / L. Bruno, B. Wilma, L. Salvatore, A. Veronica, D'H. Thomas, S. K. Sunkara // Frontiers in Endocrinology. - 2019. - V.10 - p.429.

32. Butnev V.Y. Production, purification, and characterization of recombinant hFSH glycoforms for functional studies / V.Y. Butnev, V.Y. Butnev, J.V. May, B.

Shuai, P. Tran, W.K. White, A. Brown, A. Smalter Hall, D.J. Harvey, G.R. Bousfield // Mol Cell Endocrinol. - 2015. - V. 405 - p.41-52.

33. Campbell M.P. GlycoBase and autoGU: tools for HPLC-based glycan analysis / M.P. Campbell, L. Royle, C.M. Radcliffe, R.A. Dwek, P.M. Rudd // Bioinformatics. - 2008. - V.24 - №9 - p.1214-6.

34. Cao L. Intact glycopeptide characterization using mass spectrometry / L.Cao,Y. Qu, Z. Zhang, Z.Wang, I. Prykova, S. Wu // Expert Rev Proteomics - 2016. - V. 13 - №5 - p.513-522.

35. Casarini L. Beta-arrestins regulate gonadotropin receptor-mediated cell proliferation and apoptosis by controlling different FSHR or LHCGR intracellular signaling in the hGL5 cell line / L.Casarini, E. Reiter, M.Simoni // Molecular and cellular endocrinology - V.437 - p.11-21.

36. Cerpa-Poljak A. Isoelectric charge of recombinant human follicle-stimulating hormone isoforms determines receptor affinity and in vitro bioactivity / A. Cerpa-Poljak, L.A. Bishop, Y.J. Hort, C.K. Chin, R. DeKroon, S. M. Mahler, G.M. Smith, M.C. Stuart, P.R. Schofield. // Endocrinology - 1993. - V.132 - №1 -p.351-356.

37. Chappel S. Expression of human gonadotropins by rDNA methods / S. Chappel, C. Kelton, N. Nugent // Hormones in Gynecological endocrinology. - 1992 -p.179-184.

38. Chen F. The carboxy-terminal region of the glycoprotein hormone a-subunit: contributions to receptor binding and signaling in human chorionic gonadotropins /F. Chen, Y. Wang, D. Puett// Mol. Endocrinol. - 1992.- V. 6 - №6 - p.914—919.

39. Cherkaoui S. Tracking of antibody reduction fragments by capillary gel electrophoresis during the coupling to microparticles surface / S.Cherkaoui, T.Bettinger, M.Hauwel, S.Navetat, E.Allemann, M.Schneider // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis - 2010. - V.53 - № 2 - p. 172-178.

40. Chin C.K. Biological activity and metabolic clearance of recombinant human follicle stimulating hormone produced in Sp2/0 myeloma cells / C.K.Chin, P.R.

Schofield, D.M. Robertson, P.R. Gray, W. Chotigeat, S.M. Mahler // Cytotechnology. - 1996. - V.21 - p.171-182.

41.Choi D. Erythropoietin: physico- and biochemical analysis / D. Choi, M. Kim, J.

Park // Journal of Chromatography B. - 1996. - V.687 -№1, p.189-199.

42.Chong W.P.K. Metabolomics profiling of extracellular metabolites in recombinant Chinese Hamster Ovary fed-batch culture / W.P.K. Chong, L. T. Gohn, S.G. Reddy, F. N.K. Yusufi, D.Y. Lee, N.S.C. Wong, C.K. Heng, M.G.S. Yap, Y.S. Ho // Rapid communications in mass spectrometry - 2009. - V.23 -№23 - p.3763-3771.

43. Cole L.A. HCG structure: a logical perspective / L.A. Cole // Asia Pacific J Reprod. - 2012. - V.1 - №4 - p.287-292.

44. Corless C.L. Gonadotropin a Subunit / C. L. Corless, M. Bielinska, T. V. Ramabhadrans, S. Daniels-McQueen, T. Otani, B. A. Reitzg, D. C. Tiemeierg, I. Boime // The Journal of Biological Chemistry - 1987. - V. 262. - №29 -p.14197-14203.

45. Damian-Matsumura P. Oestrogens regulate pituitary alpha2,3- sialyltransferase messenger ribonucleic acid levels in the female rat / P. Damian-Matsumura, V. Zaga,A. Maldonado, C. Sanchez-Hernandez,C. Timossi,A. Ulloa-Aguirre // J. Mol. Endocrinol. - 1999. - V. 23 - №2 - p.153-165.

46. Dangi A.K. Cell Line Techniques and Gene Editing Tools for Antibody Production: A Review / A.K. Dangi, R. Sinha,S. Dwivedi, S.K. Gupta, P. Shukla // Frontiers in Pharmacology - 2018 - V.9 - p.630.

47. Das N. Molecular Regulation of Follicle-Stimulating Hormone Synthesis, Secretion and Action/ N. Das a and T.R. Kumar // J Mol Endocrinol. - 2018. -V. 60 - №3 - p.131-155.

48. Davis J.M. Characterization of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells / J.M. Davis, T. Arakawa, T.W. Strickland, D.A. Yphantis // Biochemistry - 1987. - V.26 - №9 - p.2633-2638.

49. Davis J.S. Naturally Occurring Follicle-Stimulating Hormone Glycosylation Variants/ J.S. Davis, T.R. Kumar, J.V. May, G.R. Bousfield // J Glycomics Lipidomics - 2014 - V. 4 - №1 - p.117.

50.Daya S. Recombinant versus urinary follicle stimulating hormone for ovarian stimulation in assisted reproduction / S. Daya, J. Gunby // Human Reproduction.

- 1999. - V.14 - № 9 - p.2207-2215.

51. Daya S. Updated meta-analysis of recombinant follicle-stimulating hormone (FSH) versus urinary FSH for ovarian stimulation in assisted reproduction / S. Daya // Fertil. Steril. - 2002. - V. 77. - p. 711-714.

52. De Jong C.A. Separation of Recombinant Therapeutic Proteins Using Capillary Gel Electrophoresis and Capillary Isoelectric Focusing / C.A. De Jong, J. Risley, A.K. Lee, S.S. Zhao, D.D. Chen // Methods Mol Biol. - 2016. - V.1466 - p.137-49.

53.Dean J. Metabolic analysis of antibody producing CHO cells in fed-batch production / J. Dean, P. Reddy // Biotechnol Bioeng. - 2013. - V.110 - №6 -p.1735-47.

54. Dempski R.E. Oligosaccharyl transferase: Gatekeeper to the secretory pathway / R.E. Dempski, B. Imperiali // Current Opinion in Chemical Biology - 2002 - V.6

- №6 - p.844-50.

55. Erythropoetin. Ph. Eur. 5th edition. 1316.

56. Etzler M.E. Essentials of Glycobiology / M.E. Etzler, R.D. Cummings, Esko, J.D., Freeze, H.H. Stanley, P. Bertozzi, C.R. Hart, G.W. Varki // Cold Spring Harbour laboratory press. - 2009.

57. European Medicines Agency. Rekovelle: Follitropin Delta. (2017). Режим достvпа:http://www.ema. europa. eu/ema/index. isp?curl=pages/medicines/human/ medicines/003994/human med 002044.isp&mid=WC0b01ac058001d124. Дата обращения 01.05.2020.

58. Fan Q.R. Structure of human follicle-stimulating hormone in complex with its receptor/ Q.R. Fan, W.A. Hendrickson // Nature - 2005. - V.433 -№7023 -p.269-277.

59. Fan Y. A multi-pronged investigation into the effect of glucose starvation and culture duration on fed-batch CHO cell culture / Y. Fan, I. Del Val Jimenez, C. Müller, A.M. Lund, J.W. Sen, S.K. Rasmussen, C. Kontoravdi, D. Baycin-Hizal, M.J. Betenbaugh, D. Weilguny, M.R. Andersen // Biotechnol Bioeng. - 2015. -V.112 - №10 - p.2172-84.

60. Fawzi K.A. N-acetylglucosaminyltransferases and nucleotide sugar transporters form multi-enzyme-multi-transporter assemblies in golgi membranes in vivo / K.-A. Fawzi, P. Sosicka, M. E. Conde, A. Hassinen, T. Glumoff, M. Olczak, S. Kellokumpu // Cellular and Molecular Life Sciences - 2019 - V. 76, p.1821-1832.

61.Flack M.R. Increased biological activity due to basic isoforms in recombinant human follicle-stimulating hormone produced in a human cell line / M.R. Flack, A.P. Bennet, J. Froehlich, J.N. Anasti, B.C. Nisula // The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism - 1994. - V.79 - №3 - p.756-760.

62. Flack M.R. Site-directed mutagenesis defines the individual roles of the glycosylation sites on follicle-stimulating hormone/ M.R. Flack, J. Froehlich, A.P. Bennet, J. Anasti, B.C. Nisula BC // J Biol Chem. - 1994. - V. 269 - №19 -p.14015-14020.

63.Follitrropin. Ph. Eur. 8th edition. 2284.

64. Fuenmayor J. Cell line and plasmid influence on the effciency of HEK293 cells transient transfection for the production of VLP-based vaccines / J. Fuenmayor, S.G. Granados, F. Godia, L. Cervera // New Biotechnology - 2016. - V. 33 - p. 32-33.

65. Gebert S.A. Expression of FSH in CHO cells I. Comparison of promoter types and effects on their respective inducers / C.A. Gebert and P.P. Gray // Cytotechnology - 1994. - V.10 - №14 - p.39-45.

66. Gervais A. Glycosylation of human recombinant gonadotrophins: characterization and batch-to-batch consistency / A. Gervais, Y.-A. Hammel, S. Pelloux, P. Lepage, G. Baer, N. Carte, O. Sorokine, J.-M. Strub, R. Koerner, E. Leize, A.V. Dorsselaer // Glycobiology - 2003. - V.13 - №3 - p.179-189.

67. Gohlke M. Separation of N-glycans by HPLC / M. Gohlke, V. Blanchard // Methods Mol Biol. - 2008. - V.446 - p.239-54.

68. Gonadotropins preparations: past, present and future. - Fertility and sterility. -2008. - V.9- Sup.3. Educational bulletin

69. Gonadotropins: chemistry and biosynthesis. / G.R. Bousfield, L. Jia, D.N Ward // In: Neill, JD., editor. Knobil and Neill: Physiology of Reproduction. San Diego: Elsevier. - 2006. - p. 1581-634.

70. Gornik O. Enzyme linked lectin assay (ELLA) for direct analysis of transferrin sialylation in serum samples / O. Gornik, G. Lauc // Clin Biochem. - 2007. -V.40 - №9-10 - p.718-23.

71. Grass J. Analysis of recombinant human follicle-stimulating hormone (FSH) by mass spectrometric approaches / J. Grass, M. Pabst, M. Chang, M. Wozny, F. Altmann // Anal Bioanal Chem. - 2011. - V.400 - №8 - p.2427-38.

72. Grav L.M. Application of CRISPR/Cas9 Genome Editing to Improve Recombinant Protein Production in CHO Cells / L.M. Grav, K.J. la Cour Karottki, J.S. Lee, H.F. Kildegaard // Methods Mol Biol. - 2017 - №1603 -p.101-118.

73. Grote A. JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host / A. Grote, K. Hiller, M. Scheer, R. Munch, B. Nortemann, D.C. Hempel, D. Jahn // Nucl. Acid. Res. - 2005. - V.33 - p.526-531.

74. Haisenleder D.J. Influence of gonadotropin-releasing hormone pulse amplitude, frequency, and treatment duration on the regulation of luteinizing hormone (LH) subunit messenger ribonucleic acids and LH secretion / D.J. Haisenleder, J.A.Katt, G.Ortolano, M.R. Ael-Gewel, J.A. Duncan, C. Dee, J.C. Marshall // Molecular Endocrinology - 1988- № 2 - p.338-343.

75. Hansen J.E. O-GLYCBASE: A revised database of O-glycosylated proteins / J.E. Hansen, O. Lund, J.O. Nielsen, S. Brunak // Nucleic Acids Res. - 1996 - V.24 -p.248-252.

76. Haselberg R. Low-Flow Sheathless Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry for Sensitive Glycoform Profiling of Intact Pharmaceutical Proteins / R. Haselberg, J.G. de Jong, W.G. Somsen // Analytical Chemistry - 2013. - V. 85 - p.2289-2296.

77. Henk J.O. Recombinant follicle-stimulating hormone: gold standard or not? / J.O. Henk // Reproductive BioMedicine Online - V.11 - №5 - p.536-539.

78. Huhtaniemi I. A short evolutionary history of FSH-stimulated spermatogenesis /I. Huhtaniemi // Hormones. - 2015. - V. 14 - №4 - p.468-478.

79. Jensen P.H. Structural analysis of N- and O-glycans released from glycoproteins / P.H. Jensen, N.G. Karlsson, D.K. Nicolle, H. Packer // Nature Protocols - 2012. -V.7 - p.1299-1310.

80. Jiang C. Hypoglycosylated hFSH Has Greater Bioactivity Than Fully Glycosylated Recombinant hFSH in Human Granulosa Cells / C. Jiang, X. Hou, C. Wang, J.V. May, V.Y. Butnev, G.R. Bousfield, J.S. Davis // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism - 2015. - V.100 - №6 - p.852-860.

81.Jiang J. Site-specific qualitative and quantitative analysis of N- and O-glycoforms in recombinant human erythropoietin / J. Jiang, F. Tian, Y. Cai, X. Qian, C.E. Costello, W. Ying // Anal Bioanal Chem. - 2014. - V. 406 - №25 - p.6265-6274.

82. Keene J.L. Expression of Biologically Active Human Follitropin in Chinese Hamster Ovary Cell / J.L. Keene, M.M. Matzuk, T. Otani, B.C.J.M. Fauser, A.B. Galway, A. J. W. Hsueh, I. Boime // The Journal of biological chemistry - 1989. - V.264 - №9 - p. 4769 - 4775.

83. Khan K.H. Gene Expression in Mammalian Cells and its Applications / K.H. Khan // Adv Pharm Bull. - 2013 - V. 3 - №2 - p.257-63.

84.Khattak S.F. Feed development for fed-batch CHO production process by semisteady state analysis / S.F. Khattak, Z. Xing, B. Kenty, I. Koyrakh, Z.J. Li // Biotechnol Prog. - 2010. - V.26 - №3 - p.797-804.

85. Kim D.J. Highly expressed recombinant human follicle-stimulating hormone from Chinese hamster ovary cells grown in serum-free medium and its effect on induction of folliculogenesis and ovulation / D.J. Kim, S.H. Seok, M.W. Baek, H.Y. Lee, J.H. Juhn, S. Lee, M. Yun, J.H. Park // Fertil Steril. - 2010. V. 93 - №8 - p.2652-60.

86. Kim H.J. Antibody-based enzyme-linked lectin assay (ABELLA) for the sialylated recombinant human erythropoietin present in culture supernatant / H.J. Kim, S.J. Lee, H.J. Kim // J Pharm Biomed Anal. - 2008. - V.48 -№3 - p.716-21.

87. Kim J.Y. CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: current state and further potential / J.Y. Kim, Y. Kim, G.M. Lee // Appl Microbiol Biotechnol. - 2012. - V. 93 - p.917-930.

88. King C. Characterization of recombinant monoclonal antibody variants detected by hydrophobic interaction chromatography and imaged capillary isoelectric focusing electrophoresis / C.King, R.Patel, G.Ponniah, C.Nowak, A.Neill, Z.Gu, H.Liu // Journal of Chromatography B - 2018. - V.1085 - p.96-103.

89. Klaver E. Selective inhibition of N-linked glycosylation impairs receptor tyrosine kinase processing / E. Klaver,P. Zhao, M. May,H. Flanagan-Steet, H.H. Freeze, R. Gilmore, L. Wells, J. Contessa, R. Steet // Dis Model Mech. - 2019. -V.12 - №6.

90. Kojima A. Stable High-Producer Cell Clone Expressing Virus-Like Particles of the Japanese Encephalitis Virus E Protein for a Second-Generation Subunit Vaccine / A. Kojima, A.Yasuda, H. Asanuma,T. Ishikawa, A. Takamizawa, K.Yasui,T. Kurata // J Virol. 2003 Aug; 77(16): 8745-8755.

91. Kornfeld R. Glycoprotein analysis using enzymatic digestion and MALDI-TOF MS / R. Kornfeld, J.W. Kenny, S.R. Weinberger, Y. Yang, R. Orlando //

Proceedings of SPIE, the International Society for Optical Engineering - 1996. -V.2680 - p.397-405.

92. Korrel S.A. Identification of a tetrasialylated monofucosylated tetraantennary N-linked carbohydrate chain in human platelet glycocalicin / S.A. Korrel, K.J. Clemetson, H. van Halbeek, J.P. Kamerling, J.J. Sixma, J.F. Vliegenthart // FEBS Lett. - 1988. - V. 228 - №2 - p.321-326.

93. Kumar N. Differential protein expression following low temperature culture of suspension CHO-K1 cells / N. Kumar, P. Gammell, P. Meleady, M. Henry, M. Clynes // BMC Biotechnology - 2008. - V.8.

94. Latash W.D. The development of recombinant follicle stimulating hormone (rFSH) for use in the treatment of infertility: new solutions to old challenges / W.D. Latash, C. K. Vishvanath, S. Klipstein // Reviews in Gynaecological Practice - 2004. - V.4 - p. 203-210.

95. Ley D. Reprogramming AA catabolism in CHO cells with CRISPR/Cas9 genome editing improves cell growth and reduces byproduct secretion / D. Ley, S.Pereir, L. E. Pedersen, J. Arnsdorf, H. Hefzi, A. M. Davy, T. K. Ha, T. Wulff, H. F. Kildegaard, M. R. Andersen // Metabolic Engineering - 2019. - V.56 -p.120-129.

96. Li F. Cell culture processes for monoclonal antibody production / F. Li, N. Vijayasankaran, A. Shen, R. Kiss, A. Amanullah // MAbs - 2010. - V. 2 - №5 -p. 466-477.

97. Lizneva D. FSH Beyond Fertility / D. Lizneva, A. Rahimova, S.M. Kim, I. Atabiekov, S. Javaid, B. Alamoush, C. Taneja, A. Khan, L. Sun, R. Azziz, T. Yuen, M. Zaidi // Front Endocrinol. - 2019. T.19 - №10 - p.136.

98. Loumaye E. Recombinant follicle stimulating hormone: development of the first biotechnology product for the treatment of infertility / E.Loumaye, M. Dreano, A. Galazka, C. Howles, L. Ham, A. Munafo, A. Eshkol, E. Giudice, E. Luca, A. Sirna, F. Antonetti, C. Giartosio, L. Scaglia, C. Kelton, R. Campbell, S. Chappel,

B. Duthu, S. Cymbalista, P. Lepage // Human Reproduction Update. - 1998. - V. 4 - p.862-881.

99. Lunenfeld B. Gonadotropin stimulation: past, present and future / B. Lunenfeld // Reprod Med Biol. - 2011. - V.13 - №11 - p. 11-25.

100. Lunenfeld B. Historical perspectives in gonadotrophin therapy / B. Lunenfeld // Human Reproduction Update - 2004. - V. 10 - № 6 - p.453-467.

101. Lunenfeld B. L'induction de l'ovulation dans les amenorrees hypophysaires par un traitement combini de gonadotrophines unnaires minopausiques et de gonadotrophines chononiques / , B. Lunenfeld, S. Sukmovici, E. Rabau, A. Eshkol // CR Soc FT Gynecol. - 1962 - V.5 - p. 1-6.

102. Matzuk M.M. Site specificity of the chorionic gonadotropin N-linked oligosaccharides in signal transduction / M.M. Matzuk, J.L. Keene, I. Boime // J Biol Chem. - 1989. - V. 264 - №5 - p.2409-2414.

103. McArdle C.A. Signaling, cyclingand desensitization of gonadotropin-releasing hormone receptors / C.A. McArdle, J. Franklin, L. Green, J.N. Hislop // J.Endocrinol. 2002. - V. 173. - p. 1-11.

104. McNeilly A.S. The control of FSH secretion / A.S. McNeilly // Acta Endocrinologica Supplementum - 1988 - №288 - p.31-34.

105. Merck Sharp Dohme Limited. Elonva. (2019) Режим доступа: https: //www. ema. europa. eu/en/medicines/human/EPAR/elonva. Дата обращения 01.05.2020.

106. Morbeck D.E. Analysis of the microheterogeneity of the glycoprotein chorionic gonadotropin with high-performance capillary electrophoresis / D.E. Morbeck, B.J. Madden, D.J. McCormick // Journal of Chromatography A - 1994. - V.680 - №1 - p. 217-224.

107. Mulders J.W. Prediction of the in vivo biological activity of human recombinant follicle stimulating hormone using quantitative isoelectric focusing / J.W.

Mulders, M. Derksen, A. Swolfs, F. Maris // Biologicals - 1997. - V.25 - №3 -p.269-81.

108. Mulders J.W.M. Prediction on the in-vivo biological activity of human recombinant follicle-stimulating hormone using quantative isoelectric focusing. Optimization of the model / J.W.M Mulders, H. Wijn, F. Theunissen, P. Machielsen, P. Janssen // Pharm. Pharmacol. Commun. - 1999. - V.5 - p.51-55.

109. Mulukulta B.C. On metabolic shift to lactate consumption in fed-batch culture of mammalian cells. / Mulukulta B.C., Gramer M., Hu W.S // Metabolic engineering. - 2012. - Vol. 14 - №2

110. Na K.H. Purification and Characterization of Recombinant Human Follicle Stimulating Hormone Produced by Chinese Hamster Ovary Cells / Na K.H., Kim S.-C., Seo K.S., S.-H. Lee, W.B. Kim, K.C. Lee // J. Microbiol. Biotechnol. -2005. - V.15 - №2 - p. 395-402.

111. Nagirinaja L. Genomics and genetics of gonadotropin beta-subunit genes: Unique FSHB and duplicated LHB/CGB loci / L. Nagirnaja, K. Rull, L. Uusküla, P. Hallast, M. Grigorova, M. Laan // Molecular and Cellular Endocrinology -2010. - V.329 - p.4-16.

112. Neusüß C. Glycoform characterization of intact erythropoietin by capillary electrophoresis-electrospray-time of flight-mass spectrometry / C. Neusüß, U. Demelbauer, M. Pelzing // Electrophoresis - 2005. - V. 26 - p.1442-1450.

113. Neville J.J. Ubiquitous Chromatin-opening Elements (UCOEs): Applications in biomanufacturing and gene therapy / J.J.Neville, J.Orlando, K.Mann, B.McCloskey, M.N. Antoniou // Biotechnology Advances - V. 35 - № 5 - p. 557-564.

114. Oguchi S. pH Condition in temperature shift cultivation enhances cell longevity and specific hMab productivity in CHO culture / S. Oguchi, H. Saito, M. Tsukahara, H. Tsumura // Cytotechnology. - 2006. -V.52 - №3 - p.199-207.

115.Olijve W. Molecular biology and biochemistry of human recombinant follicle stimulating hormone (Puregon) / W. Olijve, W. de Boer,J.W. Mulders, P.M. van Wezenbeek // Mol Hum Reprod. - 1996. - V.2 №5 - p.371-82.

116. Orvieto R. Biosimilar FSH preparations - are they identical twins or just siblings? / R. Orvieto, D.B. Seifer / Reprod Biol Endocrinol. - 2016. - V. 14 -№59 - p.1-6.

117. Orlova N.A. High-level expression of biologically active human follicle stimulating hormone in the Chinese hamster ovary cell line by a pair of tricistronic and monocistronic vectors / N. A. Orlova , S.V. Kovnir , Y.A. Khodak, M.A. Polzikov, V.A. Nikitina, K.G. Skryabin, I.I. Vorobiev // PLoS One - 2019. -V.14 - №7.

118. Ou K.-C. Optimization protein productivity of human interleukin-2 through codon usage, gene copy number and intracellular tRNA concentration in CHO cells / K.-C. Ou, C.-Y. Wang, K.-T. Liu, Y.-L. Chen, Y.-C.Chen, M.-D. Lai, M.-C. Yen // Communications - 2014. - V. 454 - №2 - p. 347-352.

119. Palagiano A. FSH: urinary and recombinant / A. Palagiano, E. Nesti , L. Pace // Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. - 2004. - V.115 - p.30-3.

120. Phillips D.J. Serum gonadotropin isoforms become more basic after an exogenous challenge of gonadotropin-releasing hormone in children undergoing pubertal development / D.J. Phillips, L. Wide // J. Clin. Endocrinol. Metab. -1994. - v. 79. -p. 814-819.

121. Pouwer A.W. Long-acting FSH versus daily FSH for women undergoing assisted reproduction / A.W. Pouwer, C. Farquhar, J.A. Kremer // Cochrane Database Syst Rev. - 2012 - V.13 - №6.

122. Rai S. Correlation of follicle-stimulating hormone receptor gene Asn 680 Ser (rs6166) polymorphism with female infertility/ S. Rai, Ashish, P. Kumari, A. Singh, R. Singh // J Family Med Prim Care - 2019. - V. 8 (10) - p.3356-3361.

123. Ribela M.T.S.P. Synthesis and chromatographic purification of recombinant human pituitary hormones / M.T.C.P. Ribela, P.W. Gout, P. Bartolini // Journal of Chromatography B - 2003. - V.790 - p. 285-316.

124. Ricetti L. Glycosylation pattern and in vivo bioactivity of reference follitropin alfa and biosimilars / L. Riccetti, S. Sperduti, C. Lazzaretti, D. Klett, F.D. Pascali, E. Paradiso, S. Limoncella, F. Poti,S.Tagliavmi, T. Trenti, E. Galano, A. Palmese, A. Satwekar, J. Daolio, A. Nicoli, M. T.Villani, L. Aguzzoli, E. Reiter, M. Simoni, L. Casarini // Frontiers in endocrinology - 2019. - V.10 -p.1-13.

125. Righetti P.G. The proteome revised: theory and practice of all relevant electrophroretic steps/ P.G. Righetti, A.V. Stoyanov, M.Y. Zhukov // Journal of chromatography - 2001. - V.63 - p.262.

126. Rinis N. Editing N-Glycan Site Occupancy with Small-Molecule Oligosaccharyltransferase Inhibitors / N. Rinis, J.E. Golden,C.D. Marceau, J.E. Carette, M.C. Van Zandt, R. Gilmore, J.N. Contessa // Cell Chem Biol. - 2018. -V.25 - №10 - p. 1231-1241.

127. Roseman D.S. Quantitative capillary zone electrophoresis method for the precise determinationof charge differences arising from the manufacture of heparan-N-sulfatase / D.S. Roseman, R. Weinberger // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis - 2013. - V. 85 - p. 67-73.

128. Roth K. E. Scanning-alanine mutagenesis of long loop residues 33—53 in follicle stimulating hormone a subunit / K.E. Roth, J.A. Dias// Mol. Cell. Endocrinol. - 1995- V. 109 - №2 - p.143—149.

129. Royle L. Detailed structural analysis of N-glycans released from glycoproteins in SDS-PAGE gel bands using HPLC combined with exoglycosidase array digestions / L. Royle, C.M. Radcliffe, R.A. Dwek, P.M. Rudd // Methods Mol Biol. - 2006. - V.347 - p.125-43.

130. Santi D. Follicle-stimulating hormone / D.Santi, L.Casarini, G.R. Marshall, M.Simoni // Encyclopedia of endocrine diseases. - V.2 - p.149-156.

131. Sears P. Enzyme action in glycoprotein synthesis / P. Sears, C.H. Wong // Cell Mol Life Sci. - 1998 - V.54 - №3 - p.223-52.

132. Sellick C.A. Metabolite profiling of recombinant CHO cells: designing tailored feeding regimes that enhance recombinant antibody production / C.A. Sellick, A.S. Croxford, A.R. Maqsood, G. Stephens, H.V. Westerhoff, R. Goodacre, A.J. Dickson // Biotechnol Bioeng. - 2011. - V.108 - №12 p.3025-31.

133. Shoham Z. Recombinant technique and gonadotropins production: new era in reproductive medicine / Z. Shoham, V. Insler // Fertility and sterility - 1998. -V.69 - №3 - p.3-15.

134. Smith P.L. A pituitary N-acetylgalactosamine transferase that specifically recognizes glycoprotein hormones / P.L. Smith, J.U. Baenziger // Science. -1988. - V.242 - №4880 - p.930-3.

135. Stewart A.J. Retention and silencing of prepro-GnRH-II and type II GnRH receptor genes in mammals / A.J. Stewart, A.A. Katz, R.P. Millar, K. Morgan // Neuroendocrinology. 2009. - V. 90. - p. 416-432.

136. Storring P.L. Physicochemical methods for predicting the biological potency of recombinant follicle stimulating hormone: an international collaborative study of isoelectric focusing and capillary zone electrophoresis / P.L. Storring, R.E.G. Das, J.W.M. Mulders, M. Halder // Biologicals - 2002. - V. 30 - №3 - p.217-234.

137. Sunley K. CHO Cells Adapted to Hypothermic Growth Produce High Yields of Recombinant b-Interferon / K. Sunley, T. Tharmalingam, M. Butler // Biotechnol. Prog. - 2008 - V.24 - p.898-906.

138. Sureshkumar G.K. Temperature shift:The influence of temperature on a mouse-mouse hybridoma growth and monoclonal antibody production / G.K. Sureshkumar, R. Mutharasan // Biotechnol Bioeng. - 1991. - V.37 - №3 - p. 292295.

139. Tae J.E. Enhanced sialylation of recombinant erythropoietin in CHO cells by human glycosyltransferase expression / J.E. Tae, O. Choi, H.R. Lim, Y.D.

Son, H.J. Kim, J.H. Kim // J. Microbiol. Biotechnol. - 2008. - V.18 - №12 -p.1945-1952.

140. Taieb J. FSH and its second messenger cAMP stimulate the transcription of human anti-Müüerian hormone in cultured granulosa cells / J. Taieb, M. Grynberg, A. Pierre, N. Arouche, P. Massart, C. Belville, L. Hesters, R. Frydman, S. Catteau-Jonard, R. Fanchin, J.Y. Picard, N. Josso, R.A. Rey, N. Clemente // Mol Endocrinol. - 2011 - V.25 - №4 - p.645-55.

141. Tammam S. A single-use process for production of recombinant human follicle-stimulating hormone / S. Tammam, M. Hany, A. Samy, S. Koch, F. Mueller, R. Schilling, J. Rohde // Bioprocess International. - 2016. - V.14 - №3 -p.8-15.

142. Thackray V.G. Androgens, progestins, and glucocorticoids induce follicle-stimulating hormone beta-subunit gene expression at the level of the gonadotrope. / V.G. Thackray, S.M. McGillivray, P.L. Mellon // Molecular Endocrinology -2006- № 20 - p. 2062-2079.

143. Thompson R. Optimization of the enzyme-linked lectin assay for enhanced glycoprotein and glycoconjugate analysis / R. Thompson, A. Creavin, M. O'Connell, B. O'Connor, P. Clarke // Anal Biochem. - 2011. - V.413 - №2 -p.114-22.

144. Ulloa-Agguire A. Role of glycosylation in function of follicle-stimulating hormone/A. Ulloa-Agguire, C. Timossi, P. Damian-Matsumura, J.A. Dias // Endocrine - 1999. - V.11 - №3 - p.205-215.

145. Ulloa-Agguire A. Structure-functional relationship of follicle stimulating hormone and its receptor / A. Ulloa-Agguire, C. Timossi // Human Reproduction Update - 1998. - V. 4 - №3 - p.260-283.

146. Ulloa-Aguirre A. Biological characterization of the isoforms of urinary human follicle-stimulating hormone contained in a purified commercial preparation / A.Ulloa-Aguirre, P. Damián-Matsumura, M. Jiménez, E. Zambrano, V. Díaz-Sánchez // Hum Reprod. - 1992. V.7 - №10 - p.1371-8.

147. Ulloa-Aguirre A. Multiple facets of follicle-stimulating hormone receptor function / A. Ulloa-Aguirre,T. Zarin, A.M. Pasapera, P. C.-Gonzalez, J.A. Dias // Endocr. - 2007 - №32 - p.251-263.

148. Ulloa-Aguirre A. Trafficking of the follitropin receptor / A. Ulloa-Aguirre, J.A. Dias, G. Bousfield, I. Huhtaniemi, E. Reiter // Methods Enzymol. - 2013 -№521 - p. 17—45.

149. Urofollitropin. Ph. Eur. 8th edition. 3509.

150. Walsh G. Post-translational modification of protein biopharmaceuticals / G. Walsh // Wiley-blackwell. - 2009.

151. Walton W.J. Characterization of human follicle-stimulating hormone isoforms reveals a non-glycosylated ß-subunit In addition to the conventional glycosylated ß-subunit/ W.J. Walton, V.T. Nguyen, V.Y. Butnev, V. Singh, W.T. Moore, G.R. Bousfield // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2001. - V. 86. - p. 36753685.

152. Watson E. Capillary electrophoretic separation of human recombinant erythropoietin (r-HuEPO) glycoforms / E. Watson, F. Yao // Anal Biochem. -1993. - V. 210 - №2 - p.389-393.

153. Weidemann R. Low temperature cultivation--a step towards process optimization / R. Weidemann, A. Ludwig, G. Kretzmer // Cytotechnology - 1994. - V.15 - №1-3 - p.111-116.

154. Weijer B.H.M. Compositional analyses of a human menopausal gonadotrophin preparation extracted from urine (menotropin). Identification of some of its major impurities / B.H.M. Weijer, J.W.M. Mulders, E.S. Bos, P.D.E.M. Verhaert, H.W. Hooven // RBMO - 2003. - V.7 - №32 - p. 547-557.

155. Weiss J. Hypogonadism caused by a single amino acid substitution in the beta subunit of luteinizing hormone / J. Weiss, L. Axelrod, R.W. Whitcomb, P.E. Harris, W.F. Crowley, J.L. Jameson // N. Engl. J. Med. - 1992 - V. 326 - № 3-p.79—183.

156. Weisshaar G. NMR investigations of the N-linked oligosaccharides at individual glycosylation sites of human lutropin / G. Weisshaar, J. Hiyama, A.G.

C. Renwick, M. Nimtz // Eur. J. Biochem. - 1991. - V. 195 - p.257-268.

157. Wely M. Recombinant FSH in alternative doses or versus urinary gonadotrophins for ovulation induction in subfertility associated with polycystic ovary syndrome: a systematic review based on a Cochrane review / M. Wely, N. Bayram N., F. Veen // Hum. Reprod. -2003. - V. 18. - p. 1143-1149.

158. Wide L. Influence of the assay method used on the selection of the most active forms of FSH from the human pituitary/ L. Wide, B. Hobson // ActaEndocrinol. (Copenh). - 1986. - V. 113. - p.17-22.

159. Wilhelmsen T.W. Stability study of somatropin by capillary zone electrophoresis / T. W.Wilhelmsen, V.Skibeli, F.C.Arntzen // Procedia Chemistry - 2010. - V.2 - № 1 - p.34-45.

160. Wilson N. Introductory glycosylation analysis using SDS-PAGE and peptide mass fingerprinting / N. Wilson, R. Simpson, C. Cooper-Liddell // Methods Mol Biol. - 2009. - V.534 - p.205-12.

161. Wu J. Analysis of glycan variation on glycoproteins from serum by the reverse lectin-based ELISA assay / J. Wu, J. Zhu, H. Yin, R.J. Buckanovich,

D.M. Lubman // Journal of protein research - 2014. - №13 - p.2197-2204.

162. Wurm F.M. CHO Quasispecies—Implications for Manufacturing Processes / F.M. Wurm // Processes - 2013. - V. 1 - №3 - p.296-311.

163. Wurm F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells / F.M. Wurm // Nat Biotechnol. -2004 - № 22 - p.1393-1398.

164. Xu J. Systematic development of temperature shift strategies for Chinese hamster ovary cells based on short duration cultures and kinetic modeling / J. Xu, P.Tang, A.Yongky, B. Drew, M.C. Borys, S.Liu, Z.J. Lia // MAbs - 2019. -V.11 - №1 - p.191-204.

165. Yeo J.H.M. Optimized Selection Marker and CHO Host Cell Combinations for Generating High Monoclonal Antibody Producing Cell Lines /

J.H.M. Yeo, S.C.L. Ho, M. Mariati, E. Koh, S.J. Tay, S. Woen, P. Zhang, Y. Yang // Biotechnology Journal - 2017. - V.12 -№12.

166. Yoo J. COOH-terminal amino acids of the a subunit play common and different roles in human choriogonadotropin and follitropin / J. Yoo, H. Zeng, I. Ji, W.J. Murdoch, T.H. Ji // J. Biol. Chem. - 1993 - V.268 - № 18 - p.13 034— 13 042.

167. Yoon S.K. Effect of culture temperature on follicle-stimulating hormone production by Chinese hamster ovary cells in prefusion reactor / S.K. Yoon, Y.-H. Ahn, M.H. Jeong // Appl Microbiol Biotechnol. - 2007. - V.76 - p.83-89.

168. Zafeiriou S. The role of gonadotropins in follicular development and their use in ovulation induction protocols for assisted reproduction. / S. Zafeiriou, D. Loutradis, S. Michalas // European Journal of Contraception and Reproductive Health Care - 2000. - №5 - p.157-167.

169. Zhang L. Capillary zone electrophoresis method for a highly glycosylated and sialylated recombinant protein: development, characterization and application for process development / L. Zhang, K. Lawson, B. Yeung, J. Wypych // Anal Chem. - 2015. V.87 - №1 - p.470-6.

170. Zhang L. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins / L. Zhang, S. Luo, B. Zhang // MAbs - 2016. - V. 8 - №2 - p. 205-215.

171. Zhang L. The use of lectin microarray for assessing glycosylation of therapeutic proteins / L. Zhang, S. Luo, B. Zhang // MAbs - 2016 - V.8 - №3 - p.524-35.

172. Zhu Z. Protein Separation by Capillary Gel Electrophoresis: A Review / Z.Zhu, J.J. Lu, S. Liu // Anal Chim Acta. - 2012. - V.709 -p. 21-31.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Выравнивание нуклеотидной последовательности гена а-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (GLHA_human) относительно рассчитанной после оптимизации по кодонному составу для экспрессии в

клетках CHO (GLHA_hamster)

GLHA_human ATGGATTATTACAGGAAATATGCTGCGATATTTCTTGTAACTCTTTCAGTATTCTTGCAT 60

GLHA_hamster ATGGATTACTATAGGAAGTATGCAGCCATTTTCCTCGTTACCCTCTCCGTCTTCCTCCAC 60

******** ** ***** ***** ** ** ** ** ** ** ** ** ** *** * **

GLHA_human GTTTTGCATTCCGCACCAGATGTGCAGGACTGCCCTGAATGTACGCTCCAGGAAAATCCT 12 0

GLHA_hamster GTTCTCCACTCAGCTCCAGACGTACAGGATTGTCCAGAATGTACCTTGCAGGAGAATCCC 12 0

*** * ** ** ** ***** ** ***** ** ** ******** * ***** *****

GLHA_human TTCTTTAGCCAACCAGGTGCTCCCATATTGCAGTGTATGGGTTGTTGTTTTTCTCGCGCA 18 0

GLHA_hamster TTCTTTTCACAGCCCGGTGCTCCAATCCTTCAGTGCATGGGATGTTGCTTCTCCCGTGCT 18 0

****** ** ** ******** ** * ***** ***** ***** ** ** ** **

GLHA_human TACCCTACGCCGTTGCGGAGTAAGAAAACTATGCTGGTGCAGAAAAATGTCACCTCAGAA 2 4 0

GLHA_hamster TACCCAACACCTCTTCGGAGCAAAAAGACAATGCTCGTTCAGAAAAATGTTACCTCAGAA 24 0

***** ** ** * ***** ** ** ** ***** ** *********** *********

GLHA_human TCCACTTGCTGTGTAGCAAAAAGCTATAACCGGGTAACGGTGATGGGGGGGTTCAAGGTG 3 0 0

GLHA_hamster AGCACATGTTGCGTCGCTAAGAGCTACAATAGAGTGACCGTGATGGGGGGCTTCAAAGTA 3 0 0

*** ** ** ** ** ** ***** ** * ** ** *********** ***** **

GLHA_human GAAAACCATACAGCTTGCCACTGCAGCACCTGCTATTATCATAAGTCT 34 8

GLHA_hamster GAGAATCATACAGCATGTCACTGTAGTACTTGTTACTACCACAAAAGT 34 8

** ** ******** ** ***** ** ** ** ** ** ** ** *

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Выравнивание нуклеотидной последовательности гена р-субъединицы фолликулостимулирующего гормона человека (FSHB_human) относительно рассчитанной после оптимизации по кодонному составу для экспрессии в

клетках СНО (FSHB_hamster)

FSHB_human FSHB hamster

ATGAAAACTCTTCAGTTTTTCTTCCTGTTTTGTTGCTGGAAGGCTATATGCTGTAACTCC

ATGAAGACCTTGCAGTTCTTCTTCCTGTTTTGTTGCTGGAAGGCCATCTGCTGCAATTCC

***** ** * ***** ************************** ** ***** ** ***

60 60

FSHB_human FSHB hamster

TGTGAACTTACAAATATAACTATAGCGATAGAAAAAGAAGAATGCAGATTTTGCATATCT

TGCGAGCTTACAAATATAACCATCGCTATAGAGAAGGAGGAGTGTAGATTTTGTATCTCA

** ** ************** ** ** ***** ** ** ** ** ******** ** **

120 120

FSHB_human FSHB hamster

FSHB_human FSHB hamster

FSHB_human FSHB hamster

FSHB_human FSHB hamster

ATCAACACAACGTGGTGCGCCGGGTATTGTTACACCCGAGACCTTGTGTATAAGGACCCT

ATAAATACTACTTGGTGCGCTGGGTACTGTTATACACGCGATCTTGTCTATAAAGACCCT ** ** ** ** ******** ***** ***** ** ** ** ***** ***** ******

GCCCGGCCTAAGATCCAAAAGACTTGCACCTTTAAGGAGCTTGTGTACGAGACCGTGAGG

GCACGTCCAAAGATTCAAAAAACTTGCACTTTCAAAGAACTTGTTTACGAGACCGTAAGA ** ** ** ***** ***** ******** ** ** ** ***** *********** **

GTTCCGGGCTGCGCGCACCATGCGGATTCCCTCTATACGTACCCTGTTGCCACCCAATGC

GTGCCAGGCTGCGCACATCATGCAGACTCCTTGTACACTTATCCCGTAGCCACACAGTGC ** ** ******** ** ***** ** *** * ** ** ** ** ** ***** ** ***

CATTGTGGGAAATGTGACAGTGACTCAACAGATTGTACCGTACGCGGCCTCGGCCCATCA

CACTGTGGCAAGTGCGACAGTGATTCTACTGATTGTACTGTACGCGGCCTTGGGCCCTCA

** ***** ** ** ******** ** ** ******** *********** ** ** ***

180 180

240 240

300 300

360 360

FSHB_human FSHB hamster

TACTGTAGTTTTGGTGAGATGAAAGAG 387

TATTGCAGCTTCGGCGAAATGAAGGAA 387

** ** ** ** ** ** ***** **

ПРИЛОЖЕНИЕ 3

шйсжаш фвдврмцши

,•) ЙЙЙЙЙЙ

НА ИЗОБРЕТЕНИЕ

№ 2697273

Способ получения рекомбинантного фолликулоетимулирующего гормона человека, клеточная линия - продуцент и плазмидные экспрессионные векторы

Патентообладатель: Шаталин Дмитрий Александрович (Я1/) Авторы: Монахова Варвара Сергеевна (Я11), Климов Николай Анатольевич (Я11), Кудлинг Татьяна Викторовна (1111), Пигарева Наталья Васильевна (ЯП), Карасев Максим Михайлович (Яи), Шалджян Арам Арутюнович (Яи), Симбирцев Андрей Семенович (IIV)

Заявка № 2019105063

Приоритет изобретения 22 февраля 2019 г. Дата государственной регистрации в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 13 августа 2019 г. Срок действия исключительного права на изобретение истекает 22 февраля 2039 г.

Руководитель Федеральной службы по интеллектуальной собственности

Г. П. Ивлиев

й й й 85

Й

й й й й а й й й й й й й а а й а а й й й й ж й Й

й Й Й й

й $