Разработка эукариотического продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина и технологии его культивирования для целей биотехнологического производства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Нурбаков, Альфред Анасович

• Нурбаков, Альфред Анасович
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Нурбаков, Альфред Анасович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................4

ВВЕДЕНИЕ......................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ..........................................10

1.1. Современные подходы к оптимизации технологии производства

генно-инженерных продуктов.................................10

1.2. Получение клеточных линий - продуцентов рекомбинантных белков 15

1.3. Типы культивирования..................................17

1.4. Оптимизация физико-химических параметров культивирования.19

1.5. Оптимизация состава питательной среды.................23

1.6. Режимы культивирования................................32

1.7. Оборудование для культивирования......................35

1.8. Свойства дарбэпоэтина и его применение в медицине.....42

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ..................................46

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ......................................46

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.................................55

2.2.1. Создание эукариотического продуцента дарбэпоэтина...55

2.2.2. Оптимизация культивирования продуцента дарбэпоэтина.59

2.2.3. Процесс масштабирования в биореакторе...............67

2.2.4. Процесс выделения и очистки дарбэпоэтина............75

2.2.5. Получение ГЛФ дарбэпоэтина..........................78

2.2.6. Оценка стабильности и эффективности процесса........79

2.2.7. Технологическая схема процесса суспензионного культивирования

СНО.......................................................801

2.2.8. Экономическая эффективность производства дЭПО.......81

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ....................................82

4. ВЫВОДЫ....................................................84

5. ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ...............85

6. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.... 86

3

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ............92

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................103

4

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

EF - фактор элонгации

СНО - клетки яичников китайского хомячка

CMV - цитомегаловирус человека

DO - растворённый кислород

S/MAR - промоторный элемент

SDS - додецилсульфат натрия

АК - аминокислота

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГЛФ - готовая лекарственная форма

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота дЭПО - дарбэпоэтин

ИФА - иммуноферментный анализ

КЖ - культуральная жидкость

мАТ - моноклональное антитело

ME - международная единица

ПААГ - полиакриламидный гель

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ХПН - хроническая почечная недостаточность

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПО - эритропоэтин

5

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка эукариотического продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина и технологии его культивирования для целей биотехнологического производства»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Препараты на основе эритропоэтина и его аналога дарбэпоэтина широко используются в практике здравоохранения для лечения тяжелых анемий при хронической почечной недостаточности, химиотерапии у онкологических больных и др. Широкое применение эритропоэтина и его аналогов связано с их стимулирующим действием на эритропоэз. Препараты на основе эритропоэтина выпускаются в виде готовых лекарственных форм (ГЛФ) - растворов для внутривенного и подкожного введения.

В России до настоящего момента не существовало технологии производства субстанции рекомбинатного дарбэпоэтина, поэтому ее разработка является актуальной задачей. Дарбэпоэтин - рекомбинантный белок, который производится клетками яичников китайского хомячка (СНО). Технология их промышленного культивирования заключается в следующем: суспензионная клеточная линия продуцента дарбэпоэтина культивируется в биореакторах разного типа в питательной среде специально разработанного состава с добавлением подпитки, содержащей питательные вещества, что обеспечивает высокий выход и качество целевого белка.

В рамках данного исследования была разработана технология производства субстанции дарбэпоэтина. Продуцент целевого белка был создан на основе суспензионных клеток СНО, была разработана высокоэффективная схема его культивирования, а также были изучены биотехнологические аспекты повышения эффективности процесса.

Предложенная схема культивирования клонов-продуцентов на основе платформы СНО-S использует новейшие компоненты питательных сред и позволяет применять ее для других продуктов и оптимизировать уже существующие технологии. При широком использовании клонов-продуцентов на основе суспензионных клеток СНО в современном биотехнологическом производстве разработка такого универсального способа культивирования весьма актуальна.

6

В последние годы существенно ужесточаются требования к лекарственным средствам на основе рекомбинантных белков. Они должны быть произведены по технологии, не использующей компонентов животного происхождения, органических растворителей, иммуноаффинных сорбентов, других токсичных и биологически активных веществ. Рекомбинантный продукт должен пройти полную характеризацию по ключевым физикохимическим и биологическим параметрам, список которых подготавливается отдельно для каждого белка в зависимости от его индивидуальных особенностей. Предлагаемая технология производства дарбэпоэтина является одной из первых в России, которая учитывает эти современные тенденции.

Таким образом, разработка и реализация на практике эффективной и рентабельной технологии производства дарбэпоэтина, соответствующего по параметрам качества и безопасности современным требованиям, является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований -разработать и реализовать на практике технологию промышленного производства дарбэпоэтина, соответствующего современным требованиям качества и безопасности.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Создание клонов-продуцентов дарбэпоэтина на основе суспензионных клеток яичников китайского хомячка С7%); отбор полученных клонов-продуцентов по продуктивности и профилю гликозилирования.

2. Оптимизация состава питательной среды и добавок для повышения продуктивности и качества целевого белка.

3. Разработка опытно-промышленной технологии культивирования клеток-продуцентов дарбэпоэтина в биореакторах различного типа.

4. Исследование качества препарата дарбэпоэтина, полученного с использованием разработанной технологии, в том числе проведение доклинических испытаний.

5. Разработка технологической документации на производство субстанции рекомбинантного дарбэпоэтина и препарата на её основе.

7

Научная новизна. Впервые в России была разработана схема получения и культивирования клонов-продуцентов белка дарбэпоэтина.

При создании генетической конструкции использовался нестандартный подход, при котором рекомбинантная плазмида содержала две одинаковые копии гена дарбэпоэтина и участок связывания с ядерным матриксом S/MAR.

При разработке технологии особое внимание уделялось такому важному показателю эффективности препарата как соотношение гликозилированных форм дарбэпоэтина в целевом продукте. Поскольку биологическая активность дарбэпоэтина напрямую зависит от степени сиалирования его молекулы, целью оптимизации технологического процесса являлось повышение выхода высокосиалированных изоформ. Данная цель была достигнута с помощью периодического добавления в среду культивирования химически определённого компонента, состоящего из липидов, что является новым способом оптимизации гликозилирования.

Технология промышленного культивирования была разработана с учётом перспективных направлений современной биофармацевтики - с использованием биореактора волнового типа, создающего более комфортные условия для эукариотических клеток по сравнению с традиционными биореакторами перемешивающего типа, а также с применением одноразовых контейнеров для культивирования, что позволяет снизить риск контаминации, сократить время обслуживания биореактора и упростить валидацию процесса.

Практическая значимость. Полученные в настоящем исследовании данные расширяют возможности оптимизации биотехнологических процессов производства генно-инженерных лекарственных средств. Разработанная технология станет основой для производства субстанции дарбэпоэтина на технологической площадке ООО «Фармапарк». Разработанная технология использовалась для получения опытных серий препарата, которые успешно доклинические испытания.

8

Личный вклад соискателя состоит в получении, обработке и интерпретации экспериментальных данных, подведении итогов работы, подготовке публикаций. Клоны-продуценты дарбэпоэтина созданы в ходе совместных исследований автора с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк» Воробьёвой И.Г. и Шукуровым Р.Р., а также заведующим лабораторией эукариотических систем экспрессии генов ФГУП «ГосНИИгенетика» Козловым Д.Г. Автором выполнены эксперименты по подбору параметров культивирования, подпиток и добавок, влияющих на продуктивность и степень гликозилирования нарабатываемого белка. Автор осуществлял масштабирование процесса в биореакторах различного типа. Эксперименты по очистке дарбэпоэтина и разработка аналитических методов проводились совместно с сотрудниками департамента экспериментального производства ООО «Фармапарк» Кряжевских И.С., Орловой Н.В., Мосиной А.Г и Антоновой Л.П.

Апробация результатов работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на международной конференции «Биология -наука XXI века» (Москва, 2012), XV европейском конгрессе по биотехнологии (Стамбул, 2012), II международной научно-практической конференции «Биотехнология - перспективы развития» (Уфа, 2012), межлабораторном семинаре сотрудников ФГУП «ГосНИИгенетика».

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 5 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 108 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов. Список использованной литературы включает 143 источника, из них 136 зарубежных авторов.

9

Материалы диссертации содержат 12 таблиц, 21 рисунок, 5 страниц приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Использование суспензионной клеточной линии СТАЗ-Л* и вектора с двумя генами дарбэпоэтина и участком S/MAR обеспечивает получение стабильных клонов, продуцирующих рекомбинантный дарбэпоэтин.

2. Наибольшая продуктивность клеточной линии достигается при использовании химически определенной бессывороточной питательной среды PowerCHO-2CD и подпитки PowerFeed A (Lonza).

3. Соотношение гликозилированных изоформ дарбэпоэтина может быть приведено в соответствие со спецификацией для препарата путем внесения в питательную среду химически определённого липидного компонента Lonza.

4. Основные характеристики разработанной технологии суспензионного культивирования клона-продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина (продуктивность, гликозилирование и активность дарбэпоэтина) остаются стабильными при масштабировании процесса на биореакторе волнового типа в одноразовых мешках объёмом 10 л.

10

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные подходы к оптимизации технологии производства генно-инженерных продуктов

Класс медицинских препаратов, изготовленных из белков, произведенных по рекомбинантной технологии, занимает одно из ведущих мест в мире по объему продаж. Данные препараты успешно применяются для лечения таких тяжелых заболеваний, как рак, ревматоидный артрит, рассеянный склероз, анемии различной этиологии и т.д. (8). Большую долю из выпускаемых рекомбинантных белков составляют гликопротеины (антитела, цитокины, факторы коагуляции, гормоны), синтез которых возможен лишь в клетках млекопитающих (10). Данные клетки имеют неоспоримые достоинства по сравнению с другими клеточными линиями, так как позволяют адекватно осуществлять множество посттрансляционных изменений рекомбинантного протеина, такие как N- и О-гликозилирование, отщепление лидерного пептида во время секреции, и корректное сворачивание молекулы белка (39, 69, 101, 111, 132). Причина более частого применения клеточных линий млекопитающих заключается в повышенной активности производимых протеинов, по сравнению с белками, получаемыми из растений и прокариот. (20, 34, 41, 106). Все вышесказанное делает клетки млекопитающих незаменимыми в современном производстве рекомбинантных белков, представляющем бурно развивающуюся отрасль биотехнологии.

С целью продукции белков, входящих в состав биопрепаратов, применялись различные виды линий клеток: ВИК (из почек карликового хомяка), СОВ (почки африканской зеленой мартышки), 7VBO (мышиная миелома), P<?r. Сб (сетчатка глаза человека), ИЕК293 (почки человеческого зародыша и др. (27, 131). Но чаще всего для производства белков, входящих в состав биофармацевтических препаратов, сейчас применяются клетки

11

яичников китайского хомячка - СЖ) (61, 103). Их особенностью является способность поддерживать амплификацию вводимых рекомбинантных плазмид (74). Важной характеристикой клеток (Ж? является широкая приспособляемость к разнообразным условиям культивирования и высокая генетическая пластичность, что дает возможность с относительной легкостью проводить различные генетические манипуляции. Эти клетки гемизиготны по многим генам, включая гены синтеза аминокислот и полиаминов, преимущественно вследствие инактивации последних (103), что позволяет использовать эти дефекты как селективные маркеры путем добавления метаболитов в культуральную среду. К положительным особенностям клеток СЖ9 можно отнести высокую скорость пролиферации, простоту культивирования и способность к росту при очень высокой клеточной плотности, что является незаменимым для промышленного производства (69). Другое полезное свойство клеток СЖ), объясняющее их предпочтительное использование для продукции разнообразных медицинских биопрепаратов - это их соответствие принципам биологической безопасности, поскольку подавляющее большинство патогенных вирусов человека, включая вирусы иммунодефицита, полиомиелита, гриппа и герпеса, не способно в них размножаться (128).

К настоящему времени линия СЖ? подробно охарактеризована, что заметно облегчает процесс регистрации фармпрепаратов на основе рекомбинантных белков. Хотя существуют небольшие недостатки (различное соотношение гликозилированных изоформ по сравнению с человеческим, присутствие эндогенных вирусов), клетки СЖ) имеют важнейшее значение в фармацевтической промышленности. К данному моменту примерно 2/3 терапевтических продуктов на основе белков медицинского назначения нарабатываются в клеточных линиях на базе СЖ?. В табл. 1 суммированы данные о рекомбинантных препаратах, производимых в клеточных линиях на основе клеток СЖ? за прошедшие 20 лет.

12

Методология культивирования клеток С7Ю для получения рекомбинантных белков медицинского назначения изложена во многих статьях и обзорах (10, 19, 27, 61, 131, 132, 134, 143). Первостепенное значение для развития отечественной биотехнологической промышленности имеют задачи повышения эффективности культивирования клеток млекопитающих, основанные на оптимизации физико-химических параметров процессов и состава применяемых культуральных сред, а также внедрение современных типов биореакторов.

Недостатком клеток СНО, который вытекает из их достоинств, является их раковая, иммортализованная природа. В связи с этим у клеток нарушен контроль за генетическими изменениями, такими как мутации, хромосомные перестройки и даже изменения количества хромосом (130). За 40 лет, прошедшие с момента выделения клеточной линии, эти изменения накопились, и в настоящее время представляют серьезную проблему. Так, в современной клеточной линии CHO-DG44 из 22 исходных гаплоидных хромосом осталось только 20, из которых только 7 являются нормальными (35). В результате стабильность генетических характеристик клонов-продуцентов на основе СНО и их продуктивности является скорее исключением, чем правилом (29). Поэтому достижение высокой стабильности экспрессии является важнейшей задачей, для решения которой предлагаются разные генетические и технологические подходы.

13

Таблица 1. Список важнейших биофармацевтических биопрепаратов, производимых в клетках линии CZ%)

Фармацевтический препарат Действующее вещество Терапия Производитель Год внедрения в производство

Activase тканевый активатор плазминогена острый инфаркт миокарда Genen- tech 1987

Advate фактор свертываемости VIII гемофилия А Baxter 2003

Aldura- zyme ларонидаза Мукополисахаридоз типа 1 Gen- zyme 2006

Aranesp эритропоэтин анемия Amgen 2001

Avastin моноклональные антитела к рецептору фактора роста эндотелия сосудов Метастазирующий рак прямой кишки и рак легких Genen- tech 2004

Avonex интерферон-^ рассеянный склероз Biogen Idee 1996

Benefix фактор свертываемости IX Гемофилия В Wyeth 1997

Campath моноклональные антитела к антигену CD52 хроническая лимфолитическая анемия Gen- zyme, Bayer 2001

Cerezyme Р-глюкоцереброзидаза болезнь Гочера Gen- zyme 1994

Enbrel гибридный рецептор фактора некроза ревматоидный артрит Amgen, Wyeth 1998

14

опухоли-а

Epogen эритропоэтин анемия Amgen 1989

Fabrazyme а-галактозидаза болезнь Фабри (Gen- zyme 2003

Follistim/+ Gonal-F Фолликулостимулиру- ющий гормон бесплодие Serono/ NV Organon 1997

Herceptin херстатин Метастазирующий рак молочной железы Genen- tech 1998

Humira моноклональные антитела к фактору некроза опухоли-а ревматоидный артрит Abbott 2002

Luveris лютеинизирующий гормон бесплодие Serono 2004

Myozyme а-глюкозидаза болезнь Помпа (Gen- zyme 2006

Naglazyme Ы-галактозамин-4-сульфатаза Мукополисаха- ридоз типа 4 Biomarin Pharmaceutical 2005

Orencia гибридный белок иммуноглобулин- CTLA4 ревматоидный артрит Bristol- Myers Squibb 2005

Pulmozym e ДНКаза 1 фиброзный кистоз Genen- tech 1993

Raptiva моноклональные антитела к интегрину- хронический псориаз (Genen- tech 2003

15

aL

Rebif интерферон-^ множественный склероз Serono 2002

ReFacto фактор VIII гемофилия А Wyeth 2000

Rituxan моноклональные антитела к антигену CD520 неходжкинская лимфома Genen-tech, Biogen Idee 1997

Teneclepta se тканевый активатор плазминогена инфаркт миокарда Genen- tech 2000

Vectibix моноклональные антитела к рецептору фактора роста эпидермиса Метастазирующий рак прямой кишки Amgen 2006

Xolair моноклональные антитела к иммуноглобулину Е астма Genen- tech 2003

1.2. Получение клеточных линий - продуцентов рекомбинантных белков

В настоящее время для биосинтеза рекомбинантных белков человека, требующих корректного гликозилирования, обычно применяют клеточные линии СНО, несущие интегрированные в геном гены целевых белков под контролем сильных промоторов клеточного или вирусного происхождения. В число наиболее эффективных входят промоторы CMV - промоторно-энхансерный элемент предранних генов цитомегаловируса человека, EFla -промотор альфа-субъединицы фактора 1 элонгации трансляции (64,94,121) или сконструированный на их основе гибридный промотор CMV-EFla,

16

содержащий коровую область промотора EFla и энхансер промоторно-энхансерной области гена CMV. Показано, что для некоторых трансгенов CMV- EFla обеспечивает более высокий уровень экспрессии по сравнению с CMV(94,119).

С целью оптимизации экспрессии помимо выбора эффективных промоторов разработаны многие другие приемы, ведущие к увеличению биосинтеза целевого белка. Так известно, что экспрессия трансгена в клетках млекопитающих подвержена «эффекту положения», то есть зависит от сайта интеграции трансгена в клеточный геном. В этой связи с целью снижения и преодоления «эффекта положения» в состав конструкций часто включают элементы, известные как элементы SAR (Scaffold Attachment Region) и MAR (Matrix Attachment Region), которые пространственно разграничивают транскрипционные домены хромосом и защищают экспрессию интегрированных трансгенов от инактивирующего влияния фланкирующих областей хроматина (15, 16, 141). Одним из наиболее популярных элементов подобного рода, традиционно используемым для оптимизации экспрессии трансгенов, является S/MAR элемент из 5'-области гена ^-интерферона человека (16, 108). Кроме него, используется также S/MAR элемент из гена бета-глобина человека то есть неизменность экспрессии при длительном культивировании , 5' -нетранслируемая область гена лизоцима курицы (51) и некоторые другие. При их добавлении в состав генетической конструкции возможно повышение уровня экспрессии целевого белка до 10 раз, кроме того, существенно повышается стабильность экспрессии,

Другим оптимизируемым параметром является частота использования синонимических кодонов в гене интереса (58). Многочисленные программы и стратегии такой оптимизации опираются на известную положительную корреляцию между уровнем экспрессии генов интереса и соответствием частот использования кодонов в гене интереса и организме в целом (30,58). При этом с целью оптимизации кодонового состава, изменяют первичную

17

структуру гена интереса. Однако следствием такого изменения бывает не только улучшение кодонового состава гена, но и появление в составе транскриптов этого гена вторичных структур, способствующих улучшению его трансляции (77).

Уровень экспрессии трансгена также обычно зависит от его дозы, то есть от количества копий гена интереса в клетке (геноме) (76, 79). Учет этого обстоятельства имеет особое значение при получении стабильно трансфецированных клеточных линий, когда важно чтобы клеточный геном содержал как можно больше копий гена интереса. В большинстве случаев решения проблемы получения многокопийных продуцентов достигают путем увеличения выборки трансфектантов, отобранных для анализа продуктивности, или путем генетической амплификации интегрированных трансгенов и селекции многокопийного клонального потомства в условиях увеличивающегося селективного давления (76, 132).

Альтернативой или дополнением к этим традиционным подходам может являться использование векторов, заранее содержащих несколько копий (доз) целевого гена. В этом случае можно ожидать, что уже на стадии трансфекции в клетку будет попадать увеличенное количество генов интереса, вследствие чего должна увеличиваться эффективность отбора высокопродуктивных трансфектантов. Подобный подход широко используется при создании стабильных продуцентов на основе клеток дрожжей (126).

1.3. Типы культивирования

Линия С77О изначально была адгезионной и культивировалась будучи прикрепленной к стенкам культуральных сосудов. Сначала клетки С7А9 выращивали в однослойном состоянии во матрасах и роллерах, что не позволяло клеточной культуре расти далее при клеточной плотности 200

18

тыс. в мл (22, 125). К тому же, данный вид культивирования предполагал обязательное наличие в среде сыворотки крови крупного рогатого скота, что не удовлетворяет современным требованиям биологической безопасности при производстве фармпрепаратов. Зафиксированы случаи заражения фармацевтических биопрепаратов вирусами и прионами, содержащимися в сыворотке(36,70).

С пониманием проблем, связанных с культивированием прикреплённых клеточных линий неоднократно были опробованы способы перевода клеток в суспензионное состояние, что увеличило количество клеток, растущих в одном и том же сосуде за счёт использования всего объёма пространства. Сначала адгезионные линии инкубировали в псевдосуспензионном состоянии с применением микроносителей, которыми служили микроскопические частицы из разных материалов (чаще всего для этих целей применяются используется , искусственные полимеры и целлюлоза) (68, 80, 120). Тем самым значительно вырос размер площади культивирования по отношению к общему объему среды. Так, для коммерчески доступных целлюлозных микрочастиц Cytopore клеточная плотность достигает 2 млн. в мл. Концентрация целевого продукта, приведённая к объёму среды, при этом повышается в несколько раз.

С помощью планомерных последовательных исследований по переводу клеток в суспензионное состояние была получена истинно суспензионная линия СЖ?-5* (112, 134). На суспензионные клетки не оказывает влияние поверхность для прикрепления, поэтому они могут расти во всём объёме среды, что существенно увеличивает концентрацию клеток и выход целевого белка, к тому же работать с такой линией гораздо проще. Выращивание клеток в суспензионном состоянии привело к повышению концентрации клеток в культуре, до 10? - 10^ в мл. Помимо этого, суспензионные линии способны к росту в отсутствие сывороток, что в значительной степени определяет безопасность их применения для использования в производстве

19

биофармацевтических препаратов (53, 75). Правда, процесс разделения клеток и культуральной жидкости усложнён по сравнению с адгезионными линиями, поэтому при смене среды приходится применять фильтрацию или центрифугирование. Тем не менее в производственных масштабах данная проблема решается путём применения специализированного оборудования.

Усовершенствование цикла культивирования линий продуцентов является одним из наиболее важных этапов создания промышленной технологии, что приводит в результате в многократному увеличению эффективности культивирования (19, 132). Самые важные цели

усовершенствования методики выращивания клеток это: повышение выхода продукта, увеличение клеточной жизнеспособности, повышение качества целевого продукта. Прогресс в достижении вышеуказанных целей обеспечивается многими факторами, самыми значительными из которых считаются правильный подбор физико-химических показателей процесса культивирования, а также химический состав среды культивирования (142). К основным показателям культивирования, при правильном подборе значительно повышающим выход целевого продукта, относятся кислотность среды, её температура, концентрация кислорода в среде, её осмотические характеристики (122-123).

1.4. Оптимизация физико-химических параметров культивирования

Температура. Для жизнедеятельности клеточной линии СТА? наиболее подходящая температура 37-38°, которая позволяет клеткам делиться очень быстро, при этом продукция белка находится не на самом высоком уровне. Выход температуры за рамки этих пределов может привести к трагическим для клеточной культуры последствиям. В случае перегрева начинается производство белков теплового шока и старт каскада реакций, приводящих к клеточной гибели путём апоптоза и вырождению культуры (25, 138). При

20

снижении температуры ниже вышеуказанного уровня гибели клеток не происходит, замедляется только их рост клеток и обмен веществ. На основании литературных источников, продуктивность клеток находится на пике во время фазы G1 клеточного цикла (59, 66). Весьма долгое время используется следующий приём для увеличения выхода целевого продукта -охлаждение среды культивирования до температуры порядка 30° во время фазы продукции, что приводит к уменьшению апоптотической гибели клеток и блоку цикла деления в фазе G1 (25, 49, 97, 138). Оптимальная температура подыскивается опытным путём для конкретного продуцента, при этом клон следует предварительно подготовить к снижению температуры (81, 116). Поскольку клеточный цикл деления блокируется, рост клеточной линии прекращается, при этом удлиняется время жизни культуры клеток в фазе продукции (от 7 до 15 дней) вследствие длительного пребывания клеток в жизнеспособном состоянии (114). В этом случае общая концентрация целевого белка увеличивается по сравнению с процессом, проводимым при температуре 37-38°С.

Способ повышения продуктивности культивирования, заключающийся в охлаждении клеточной культуры в ходе процесса, весьма часто применяется в производстве (98, 105). На исходном этапе клеточную линию помещают в среду с температурой 37° и позволяют клеточной линии разогнаться до заданной концентрации клеток, необходимой для достаточного производства нужного продукта, после чего охлаждают среду до 30° и продолжают процесс при пониженной температуре. Линия продуцента прекращает деление и клеточный рост и вступает в фазу производства целевого белка. По итогам процесса выходит, что после такого изменения температуры выход белка увеличивается по сравнению с процессом при постоянной температуре 37° несмотря на более высокую клеточную плотность, поскольку при температуре 37° производство белка остается на невысоком уровне.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Нурбаков, Альфред Анасович, 2013 год

7. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Волова, Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова // Новосибирск: Изд-во СО РАН.- 1999.-247 с.

2. Лобанова, Н.В. Современные подходы к оптимизации процессов культивирования эукариотических клеток-продуцентов при производстве биофармацевтических препаратов / Н.В. Лобанова, А.А. Нурбаков, Е.Н. Сауткина // Биотехнология. - 2013. - №1. - С. 8-25.

3. Лобанова, Н.В. Оптимизация профиля гликозилирования рекомбинантного интерферона-бета-1а при культивировании клеток СНО в биореакторе волнового типа / Н.В. Лобанова А.А. Нурбаков, В.И. Аксенова // Биотехнология. - 2013. - №2. - С. 55-66.

4. Нурбаков, А.А. Оптимизация технологии культивирования клеток СНО, экспрессирующих рекомбинантный дарбэпоэтин-альфа, в замкнутом объеме / А.А. Нурбаков, Н.В. Лобанова, И.Н. Савинова // Биотехнология. - 2012. -N. 5.-Р. 55-65.

5. Серегин, Ю.А. Влияние метилирования CpG-островков в составе генов, кодирующих эритропоэтин и его аналог, на уровень экспрессии в клетках СНО / Ю.А. Серегин, Р.Р. Шукуров, Н.В. Лобанова // Естественные и технические науки. - 2013. - С. 98-102.

6. Шукуров, Р.Р. Оптимизация генетических конструкций для экспрессии дарбэпоэтина в клетках млекопитающих / Р.Р. Шукуров, К.Ю. Казаченко, Д. Г. Козлов // Биотехнология. - 2013. - №2. - С. 34-45.

7. Шукуров, Р.Р. Создание стабильной клеточной линии-продуцента рекомбинантного дарбэпоэтина-альфа на основе клеток СНО / Р.Р. Шукуров, Н.В. Лобанова, И.Н. Савинова // Биотехнология. - 2013. - №2. - С. 46-54.

8. Aggarwal, S. What's fueling the biotech engine-2007 / S. Aggarwal // Nat. Biotechnol.-2008.-Vol. 26.-N. 11.-P. 1227-1233.

88

9. Altamirano, C. Specific nutrient supplementation of defined serum-free medium for the improvement of C/70 cells growth and t-PA production /

C. Altamirano, A. Illanes, R. Canessa et al. // Electronic J. Biotechnol. - 2006. -Vol. 9.-N. l.-P. 61-67.

10. Andersen, D.C. Recombinant protein expression for therapeutic applications / D.C. Andersen, L. Krummen // Curr. Opin. Biotechnol. - 2002. - Vol. 13. -

P.117-123.

11. Behme, S. Production facilities / S. Behme // Manufacturing of pharmaceutical proteins. - Weinheim: Wiley VCH. - 2009. - P. 227-275.

12. Bell, S.L. Genetic engineering of hybridoma glutamine metabolism / S.L. Bell, C. Bebbington, M.F. Scott // Enzyme Microb Technol. - 1995. - Vol. 2. - N.

17.-P. 98-106.

13. Birch, J.R. Suspension culture of mammalian cells / J. Birch, R. Arathoon // Bioprocess Technol. - 1990. - Vol. 10. -P. 251-270.

14. Birch, J. R. Antibody production / J.R. Birch, A.J. Racher // Adv. Drug Deliv. Rev. - 2006 - Vol. 58. - P. 671-685.

15. Bode, J. Transcriptional augmentation: modulation of gene expression by scaffold/matrix-attached regions (S/MAR elements) / J. Bode, C. Benham, A. Knopp // Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. - 2000. - T. 10. - P. 73-90.

16. Bode, J. Scaffold/matrix-attached regions: structural properties creating transcriptionally active loci / J. Bode, T. Schlake, M. Rios-Ramirez // Int. Rev. Cytol. - 1995. - Vol. 162A. - P. 389-454.

17. Bollati-Fogolin, M. Temperature reduction in cultures of hGM-CSF-expressing С7Ю cells: effect on productivity and product quality / M. Bollati-Fogolin, G. Fomo, M. Nimtz et al. // Biotechnol. Prog. - 2005. - Vol. 21. - P. 1721.

18. Brown, C. R. Chemical chaperones correct the mutant phenotype of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein / C.R.

89

Brown, L.Q. Hong-Brown, J. Biwersi // Cell Stress Chaperones. - 1996. - Vol. 2. -14.l.-P. 117-125.

19. Butler, M. Animal cell cultures: recent achievements and perspectives in the production of biopharmaceuticals / M .Butler // Appl. Microbiol. Biotechnol. -2005.-Vol. 68-P. 283-291.

20. Byrne, B. Sialic acids: carbohydrate moieties that influence the biological and physical properties of biopharmaceutical proteins and living cells / B. Byrne, G.G. Donohoe, R. O'Kennedy // Drug Discov. Today. - 2007. - Vol. 12. - N. 7/8. -P.319-326.

21. Candido, E.P. Sodium butyrate inhibits histone deacetylation in cultured cells / E.P. Candido, R. Reeves, J.R. Davie // Cell. - 1978. - Vol. 14. - P. 105113.

22. Carcagno, C. Method for the massive culture of cells producing recombinant human erythropoietin / C. Carcagno, M. Criscuolo, C. Melo et al. // US Patent.-2000.-WP200027997.

23. Carrera, F. Extended dosing intervals with erythropoiesis-stimulating agents in chronic kidney disease: a review of clinical data / F. Carrera, A. Disney, M. Molina // Nephrol. Dial. Transplant. - 2007 - Vol. 4 - N. 22. - P. 19-30.

24. Chartrain, M. Development and production of commercial therapeutic monoclonal antibodies in mammalian cell expression systems: an overview of the current upstream technologies / M. Chartrain, L. Chu // Curr. Pharm. Biotechnol. -2008. - Vol. 9. - P. 447^167.

25. Chen, Z. Temperature shift as a process optimization step for the production of pro-urokinase by a recombinant Chinese hamster ovary cell line in high-density perfusion culture / Z. Chen // J. Biosci. Bioeng. - 2004. - Vol. 97. - P. 239-243.

26. Christie, A. The adaptation of BHK cells to a non-ammoniagenic glutamate-based culture medium / A. Christie, M. Butler // Biotechnol. Bioeng. - 1999. -Vol. 64.-N.3.-P. 298-309.

90

27. Chu, L. Industrial choices for protein production by large-scale cell culture /

L. Chu, D.K. Robinson // Curr. Opin. Biotechnol. - 2001. - Vol. 12. - P. 180-187.

28. Chun, B.-H. Enhanced production of recombinant b-domain deleted factor VIII from Chinese hamster ovary cells by propionic and butyric acids / B.-H. Chun // Biotech. Lett. - 2003. - Vol. 25. - P. 315-319.

29. Chusainow, J. A study of monoclonal antibody-producing CHO cell lines: what makes a stable high producer? / J. Chusainow, Y.S. Yang, J.H. Yeo // Biotechnol. Bioeng. - 2009. - Vol. 4. - T. 102. - P. 1182-1196.

30. Comeron J.M. An evaluation of measures of synonymous codon usage bias / J.M. Comeron, M. Aguade // J. Mol. Evol. - 1998. - Vol. 47. - P. 268-274.

31. Crowell, C.K. Amino acid and manganese supplementation modulates the glycosylation state of erythropoietin in a C/7O culture system / C.K. Crowell, G.E. Grampp, G.N. Rogers et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2007. - Vol. 96. - P. 538-549.

32. Davis, J.M. Characterization of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells / J.M. Davis, T. Arakawa, T.W. Strickland // Biochemistry. - 1987. - Vol. 26. - P. 2633-2638.

33. De Jesus, M. Manufacturing recombinant proteins in kg-ton quantities using animal cells in bioreactors / M. De Jesus, F.M. Wurm // Eur. J. Pharmaceutics and Biopharmaceutics.-2011. - Vol. 78. -P. 184—188.

34. Delorme, E. Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin / E. Delorme, T. Lorenzini, J. Giffin et al. // Biochemistry. - 1992. -Vol. 31.-P. 9871-9876.

35. Derouazi, M. Genetic characterization of CHO production host DG44 and derivative recombinant cell lines / M. Derouazi, D. Martinet, N. Besuchet Schmutz // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2006. - Vol. 4. - N. 340. - P. 1069-77.

36. Derouazi, M. Serum-free large-scale transient transfection of cells //

M. Derouazi, P. Girard et al., F.van Tilborgh // Biotechnol. Bioeng. - 2004. - Vol. 87.-N. 4.-P. 537-545.

91

37. Devasahayam, M. Factors affecting the expression of recombinant glycoproteins / M. Devasahayam // Indian J. Med. Res. - 2007. - Vol. 126. -P.22-27.

38. Domer, A.J. Increased synthesis of secreted proteins induces expression of glucose-regulated proteins in butyrate-treated Chinese hamster ovary cells / A.J. Domer, L.C. Wasley, R.J. Kaufman // J. Biol. Chem. - 1989. - Vol. 264. - P. 20602-20607.

39. Durocher, Y. Expression systems for therapeutic glycoprotein production / Y. Durocher and M. Butler // Curr. Opin. Biotechnol. - 2009. - Vol. 20. -P.700-707.

40. Egrie, J.C. Development and characterization of novel erythropoiesis stimulating protein (NESP) / J.C. Egrie, J.K. // Nephrol. Dial. Transplant. - 2001. -Vol.-N. 16.-P. 3-13.

41. Egrie, J.C. The role of carbohydrate on the biological activity of erythropoietin / J.C. Egrie, J.R. Grant, D.K. Gillies et al. // Glycoconjugate J. -1993.-Vol. 10.-P. 263.

42. Eibl, R. Bag bioreactor based on wave-induced motion: characteristics and applications / R. Eibl, S.Wemer, D. Eibl // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. -2010.-Vol. 115.-P. 55-87.

43. Fagain, C.O. Use of stabilizing additives / C.O. Fagain // Stabilizing Protein Function. - New York : Springer, 1997. - P. 70-79.

44. Fike, R. Nutrient supplementation strategies for biopharmaceutical production, Part 1: Feeding for optimal recombinant protein production / R. Fike // BioProcess Int. -2009. - Vol. 7. -N. 10. -P. 44-51.

45. Fike, R. Nutrient supplementation strategies for biopharmaceutical production, Part 2: Feeding for optimal recombinant protein production / R. Fike // BioProcess Int. - 2009. - Vol. 7. - N. 11. - P. 46-52.

92

46. Fiore, M. Dimethyl sulfoxide restores contact inhibition-induced growth arrest and inhibits cell density dependent apoptosis in hamster cells / M. Fiore and

F. Degrassi//Exp. Cell Res.-1999.-Vol. 251.-N. l.-P. 102-110.

47. Foulon A. Using disposables in an antibody production process: a costeffectiveness study of technology transfer between two production sites / A. Foulon, F. Trach, A. Pralong // BioProcess Int. - 2008. - Vol. 3. - N. 6. - P. 12-

18.

48. Franco, R. Influence of osmolarity and pH increase to achieve a reduction of monoclonal antibodies aggregates in a production process / R. Franco, G. Daniela, M. Fabrizio et al. // Cytotechnology. - 1999. - Vol. 29. - P. 11-25.

49. Furukawa K. Effect of culture temperature on a recombinant СҒЮ cell line producing a C-terminal a'-amidating enzyme / K. Furukawa and K. Ohsuye // Cytotechnology. - 1998. - Vol. 26. - P. 153-164.

50. Ge, X. Validation of an optical sensor-based high-throughput bioreactor system for mammalian cell culture / X. Ge, M. Hanson, H. Shen // Journal of Biotechnology. - 2006. - Vol. 3. - N. 122. - P. 293-306.

51. Girod, P.A. Use of the chicken lysozyme 5' matrix attachment region to generate high producer CHO cell lines / P.A. Girod, M. Zahn-Zabal, N. Mermod // Biotechnol. Bioeng. - 2005. - Vol. 1. - N. 91. - P. 1-11.

52. Glacken, M.W. Reduction of waste product excretion via nutrient control: Possible strategies for maximizing product and cell yields on serum in cultures of mammalian cells / M.W. Glacken, R.J. Fleischaker, A.J. Sinskey // Biotechnol. Bioeng. - 1986. - Vol. 28. - N. 9. - P. 1376-1389.

53. Glassy, M.C. Serum-free media in hybridoma culture and monoclonal antibody production / M.C. Glassy, Tharakan J.P., Chau P.C. // Biotechnol. Bioeng. - 1998 - Vol. 32. -P. 1015-1028.

54. Goldman, M.H. Monitoring recombinant human interferon-gamma N-glycosylation during perfused fluidized-bed and stirred-tank batch culture of C77G

93

cells / M.H. Goldman, D.C. James, M. Rendall et al. // Biotechnol. Bioeng. - 1998. -Vol. 60.-P. 596-607.

55. Gorfien, S.F. Recombinant protein production by C7YO cells cultured in a chemically defined medium / S.F. Gorfien // Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects. - 1998. - Vol. 9. - P. 247-252.

56. Gorfien, S.F. Optimized nutrient additives for fed-batch cultures / S.F. Gorfien, W. Paul, D. Judd // BioPharm International. - 2003. - P. 34-40.

57. Gramer, M.J. Glycosidase activities in Chinese hamster ovary cell lysate and cell culture supernatant / M.J. Gramer and C.F. Goochee // Biotechnol. Prog. -1993.-Vol. 9.-P. 366-373.

58. Grote, A. JCat: a novel tool to adapt codon usage of a target gene to its potential expression host / A. Grote, K. Hiller, M. Scheer // Nucleic Acids Res. -2005.-Vol. 33.-P. 526-531.

59. Gu, M.B. Analysis of foreign protein overproduction in recombinant Cf/O cells. Effect of growth kinetics and cell cycle traverse / M.B. Gu, P. Todd, D.S. Kompala // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1994. - Vol. 2. - N. 721. - P. 194-207.

60. Gurtovenko, A. Modulating the structure and properties of cell membranes: the molecular mechanism of action of dimethyl sulfoxide / A. Gurtovenko and J. Anwar//J. Phys. Chem.-2007.-Vol. lll.-P. 10453-10460.

61. Hacker, D.L. 25 years of recombinant proteins from reactor-grown cells: where do we go from here? / D.L. Hacker, M. De Jesus, F.M. Wurm // Biotechnol. Adv. - 2009. - Vol. 27. - N. 6. - P. 1023-1027.

62. Haldankar, R. Serum-free suspension large-scale transfection of C7%) cells in wave bioreactors / R. Haldankar // Molecular Biotechnology. - 2006. - Vol. 34. -N. 2.-P. 191-199.

63. Han, Y.K. Enhanced interferon- p production by C77(9 cells through elevated osmolality and reduced culture temperature / Y.K. Han, T.Y. Koo,

G.M. Lee // Biotechnol. Prog. - 2009. - Vol. 25. - N. 5. - P. 1440-1447.

94

64. Hansen, I.A. Systematic Comparison of Constitutive Promoters and the Doxycycline-Inducible Promoter / I.A. Hansen, J.Y. Qin, L. Zhang // PLoS One. -2010.-Vol. 5.-P. 10611.

65. Hassell, T. Growth inhibition in animal cell culture: the effect of lactate and ammonia / T. Hassell, S. Gleave, M. Butler // Appl. Biochem. Biotechnol. - 1991. -Vol. 30.-P. 29-41.

66. Hendrick, V. Increased productivity of recombinant tissular plasminogen activator (t-PA) by butyrate and shift of temperature: a cell cycle phases analysis / V. Hendrick, P. Winnepenninckx, C. Abdelkafi et al. // Cytotechnology. - 2001. -Vol. 36.-N. 1-3.-P. 71-83.

67. Hossler, P. Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture / P. Hossler, S.F. Khattak, Z.J. Li // Glycobiology. - 2009. - Vol. 19. -

N. 9.-P. 936-949.

68. Hu, X. Pilot production of u-PA with porous microcarrier cell culture / X. Hu, C. Xiao, Z. Huang et al. // Cytotechnology. - 2000. - Vol. 33. - P. 13-19.

69. Jayapal, K.P. Recombinant protein therapeutics from C77O cells - 20 years and counting / K.P. Jayapal, K.F. Wlaschin, W.S. Hu // SBE Special Section. -2007.-P. 40^7.

70. Jayme, D.W. Media formulation options and manufacturing process controls to safeguard against introduction of animal origin contaminants in animal cell / D.W. Jayme and S.R. Smith // Cytotechnology. - 2000. - Vol. 33. - P. 27-36.

71. Jeon, M. Correlation between enhancing effect of sodium butyrate on specific productivity and mRNA transcription level in recombinant Chinese hamster ovary cells producing antibody / M. Jeon and G.M. Lee // J. Microbiol. Biotechnol.-2007.-Vol. 17.-P. 1036-1040.

72. Jiang, Z. Sodium butyrate stimulates monoclonal antibody over-expression in СЯО cells by improving gene accessibility / Z. Jiang and S. Sharfstein // Biotechnol. Bioeng. - 2008. - V. 100. - P. 189-194.

95

73. Kaneko, Y. Changes in the quality of antibodies produced by Chinese hamster ovary cells during the death phase of cell culture / Y. Kaneko, R. Sato,

H. Aoyagi // J. Biosci. Bioeng. - 2010. - Vol. 3. - P. 281-287.

74. Kaufman, R.J. Selection and amplification of heterologous genes in mammamlian cells / R.J. Kaufman // Methods Enzymol. - 1990. - Vol. 185. -P.537-566.

75. Keen, M.J. Development of a serum-free culture medium for the large scale production of recombinant protein from a Chinese hamster ovary cell line / M.J. Keen and N.T. Rapson // Cytotechnology. - 1995. - Vol. 17. - P. 153-163.

76. Kellems, R.E. Gene amplification in mammalian cells: strategies for protein production / R.E. Kellems // Curr. Opin. Biotechnol. - 1991. - Vol. 2. - P. 723-729.

77. Kim, C.H. Codon optimization for high-level expression of human erythropoietin (EPO) in mammalian cells / C.H. Kim, Y. Oh, Т.Н. Lee // Gene. -1997.-Vol. 199.-P. 293-301.

78. Kim, D.Y. Effects of supplementation of various medium components on Chinese hamster ovary cell cultures producing recombinant antibody / D.Y. Kim, J.C. Lee, H.N. Chang et al. // Cytotechnology. - 2005. - Vol. 47. - P. 37^19.

79. Kingston, R.E. Amplification using CHO cell expression vectors / R.E. Kingston, R.J. Kaufman, C.R. Bebbington // Curr. Protoc. Mol. Biol. - 2002. - Vol. 16.-P. 16-23.

80. Kong, D. Long-term stable production of monocyte-colony inhibition factor (M-CIF) from C77O microcarrier perfusion cultures / D. Kong, R. Gentz, J. Zhang//Cytotechnology. - 1998. - Vol. 26. -P. 131-138.

81. Kou, T.-C. Detailed understanding of enhanced specific productivity in Chinese hamster ovary cells at low culture temperature / T.-C. Kou, L. Fan, Y. Zhou et al. // Cytotechnology. - 2009. - Vol. 59. - P. 81-91.

82. Kumar, N. Proliferation control strategies to improve productivity and survival during CHO based production culture. A summary of recent methods employed and the effects of proliferation control in product secreting CAR? cell

96

lines / N. Kumar, P. Gammell, M. Clynes // NICB Special Issue Cytotechnology. -2007.-Vol. 53.-P. 33-46.

83. Kunas, K.T. Damage mechanisms of suspended animal cells in agitated bioreactors with and bithout bubble entrainment / K.T. Kunas // Biotechnol. Bioeng. - 1990. - Vol. 36. - P. 476^83.

84. Kunkel J.P. Comparisons of the glycosylation of a monoclonal antibody produced under nominally identical cell culture conditions in two different bioreactors / J.P. Kunkel, D.C.H. Jan, M. Butler et al. // Biotechnol. Prog. - 2000. -Vol. 16.-P. 462-^70.

85. Kuwae, S. Development of a fed-batch culture process for enhanced production of recombinant human antithrombin by Chinese Hamster Ovary cells, Ohda N., Tamashima H., Miki H., Kobayashi K. // J. Biosci. Bioeng. - 2005. -Vol. 100.-N. 5.-P. 502-510.

86. Lee, D.Y. A positive role for histone acetylation in transcription factor access to nucleosomal DNA / D.Y. Lee, J.J. Hayes, D. Pruss // Cell. - 1993. - Vol. l.-N. 72.-P. 73-84.

87. Lim, J.A.C. Process economy of disposable manufacturing: process models to minimize upfront investment / J.A.C. Lim, A. Sinclair // Am. Pharm. Rev. -2007.-Vol. 10.-P. 114-121.

88. Ling, W.L. Improvement of monoclonal antibody production in hybridoma cells by dimethyl sulfoxide / W.L. Ling, L. Deng, J. Lepore et al. // Biotechnol. Prog.-2003.-Vol. 19.-N. l.-P. 158-162.

89. Liu, C. Development of a shaking bioreactor system for animal cell cultures / C. Liu and L. Hong // Biochem. Eng. J. - 2001. - Vol. 7. - N. 2. - P. 112-121.

90. Liu, C.H. Promotion of recombinant macrophage colony stimulating factor production by dimethylsulfoxide addition in Chinese hamster ovary cells / C.H. Liu and L.H. Chen // J. Biosci. Bioeng. - 2007. - Vol. 103. - N. l.-P. 4549.

97

91. Liu, C.H. Enhanced expression of various genes in recombinant Chinese hamster ovary cells in presence of dimethylsulfoxide / C.H. Liu, I.M. Chu, S.M. Hwang // Biotechnol. Lett. - 2001. - Vol. 23. - P. 1641-1655.

92. Liu, C.-H. Pentanoic Acid, a Novel Protein Synthesis Stimulant for Chinese Hamster Ovary (CHO) Cells / C.-H. Liu // J. Biosci. Bioeng. - 2001. - Vol. 91. -P.71-75.

93. Macdougall, I.C. Darbepoetin alfa: A new therapeutic agent for renal anemia / I.C. Macdougall // Kidney International. - 2002. - Vol. 80. - N. 61. - P. 55-61.

94. Magnusson, T. Sustained, high transgene expression in liver with plasmid vectors using optimized promoter-enhancer combinations / T. Magnusson, R. Haase, M. Schleef et al. // J. Gene Med. - 2011. - Vol. 13. - P. 382-391.

95. Mauter, M. Environmental life-cycle assessment of disposable bioreactors / M. Mauter // BioProcess Int. - 2009. - Vol. 4. - N. 7. - P. 18-28.

96. Mendonca, R.Z. Metabolic active-high density Vero cell cultures on microcarriers following apoptosis prevention by galactose/glutamine feeding /

R. Z. Mendoca, S.J. Arrozio, M.M. Antoniazzi et al. // J. Biotechnol. - 2002. -Vol. 97.-N. l.-P. 13-22.

97. Moore A. Effects of temperature shift on cell cycle, apoptosis and nucleotide pools in C77O cell batch cultures / A. Moore, J. Mercer, G. Dutina et al. // Cytotechnology. - 1997. - Vol. 23. - P. 47-54.

98. Nam, J.H. The effects of microcarrier culture on recombinant C7%) cells under biphasic hypothermic culture conditions / J.H. Nam, M. Ermonval,

S. T. Sharfstein // Cytotechnology. - 2009. - Vol. 59. - P. 81-91.

99. Namdev, P.K. Assessing a disposable bioreactor for attachment dependent cell cultures / P.K. Namdev, P. Lio // BioPharm. Int. - 2000. - Vol. 13. - P. 44—50.

100. Ozturk, S.S. Effect of medium osmolarity on hybridoma growth, metabolism, and antibody production / S.S. Ozturk and B.O. Palsson // Biotechnol. Bioeng. - 1991. - Vol. 37. - P. 989-993.

98

101. Pavlou, A.K. Recombinant protein therapeutics - success rates, market trends and values to 2010 / A.K. Pavlou and J.M. Reichert // Nat. Biotechnol. -2004.-Vol. 22-P. 1513-1519.

102. Potapenko, I.O. Glycan gene expression signatures in normal and malignant breast tissue; possible role in diagnosis and progression /

I.O. Potapenko, V.D. Haakensena, T. Ludersc et al. // Mol. Oncol. - 2010. -Vol. 4.-N. 2.-P. 98-118.

103. Puck, T.T. Development of the Chinese hamster ovary (C7R?) cell / T.T. Puck // Molecular Cell Genetics. - New York: John Wiley & Sons. - 1985. -P.37-64.

104. Restelli, V. The effect of dissolved oxygen on the production and the glycosylation profile of recombinant human erythropoietin produced from CHO cells / V. Restelli, M.-D. Wang, N. Huzel et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2006. -Vol. 94.-N. 3.-P. 481-494.

105. Rodriguez, J. Enhanced production of monomeric interferon-P by C77O cells through the control of culture conditions / J. Rodriguez, M. Spearman, N. Huzel et al. // Biotechnol. Prog. - 2005. - Vol. 21. - P. 22-30.

106. Runkel, L. Structural and functional differences between glycosylated and non-glycosylated forms of human interferon-beta (IFN-beta) / L. Runkel, W. Meier, R.B. Pepinsky et al. // Pharm. Res. - 1998. - Vol. 15. - P. 641-649.

107. Sasaki, H. Site-specific glycosylation of human recombinant erythropoietin: Analysis of glycopeptides or peptides at each glycosylation site by fast atom bombardment / H. Sasaki, N. Ochi, A. Dell et al. // Biochemistry. -1988.-Vol. 27.-P. 8618-86.

108. Schubeler, D. Scaffold/matrix-attached regions act upon transcription in a context-dependent manner / D. Schubeler, C. Mielke, K. Maass et al. // Biochemistry. - 1996. - Vol. 35. - P. 11160-11169.

109. Sealy, L. The effect of sodium butyrate on histone modification / L. Sealy, R. Chalkley//Cell.- 1978.-Vol. 14.-P. 115-121.

99

110. Senger, R.S. Effect of shear stress on intrinsic С7Д9 culture state and glycosylation of recombinant tissue-type plasminogen activator protein / R.S. Senger and M.N. Karim // Biotechnol. Prog. - 2003. - Vol. 19. - N. 4. -P.1199-1209.

111. Sevastsyanovich, Y. Recombinant protein production: a comparative view on host physiology / Y. Sevastsyanovich, A. Sara, J. Cole // New Biotechnol. -V. 2009. - Vol. 25. - P. 175-180.

112. Sinacore, M.S. C77D DUKY cell lineages preadapted to growth in serum-free suspension culture enable rapid development of cell culture processes for the manufacture of recombinant proteins / M.S. Sinacore, T.S. Charlebois, S. Harrison et al. // Oakes Biotechnol. Bioeng. - 1996. - Vol. 52. - P. 518-528.

113. Singh, V. Disposable bioreactor for cell culture using wave-induced agitation / V. Singh // Cytotechnology. - 1999. - Vol. 30. - P. 149-158.

114. Spearman, M. Effect of culture conditions on glycosylation of recombinant Р-Interferon in cells / M. Spearman, J. Rodriguez, N. Huzel et al. // Cell Technology for Cell Products [ed. R. Smith]. - Dordrecht: Springer. - 2007. -P.71-85.

115. Sun, X. Effects of lactate on growth, metabolism and EPO expression of recombinant C7%) cells / X. Sun and Y. Zhang // Chin. J. Chem. Eng. - 2002. -Vol. 53.-P. 1034-39.

116. Sunley, К. C77O cells adapted to hypothermic growth produce high yields of recombinant 0-interferon / K. Sunley, T. Tharmalingam, M. Butler // Biotechnol. Prog. - 2008. - Vol. 24. - P. 898-906.

117. Takeuchi, M. Relationship between sugar chain structure and biological activity of recombinant human erythropoietin produced in Chinese hamster ovary cells / M. Takeuchi, N. Inoue, T.W. Strickland et al. // Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. - 1989. - Vol. 86. - P. 7819-22.

100

118. Tang, Y.J. Perfusion culture of hybridoma cells for hyperproduction of IgG(2a) monoclonal antibody in a wave bioreactor-perfusion culture system / Y.J. Tang // Biotechnol. Pro. - 2007. - Vol. 23. - P. 255-264.

119. Teschendorf, C. Comparison of the EF-1 alpha and the CMV promoter for engineering stable tumor cell lines using recombinant adeno-associated virus / C. Teschendorf, K.H. Warrington, D.W. Siemann // Anticancer Res. - 2002. - Vol. 22. - P. 3325-3330.

120. Tharmalingam, T. High yields of monomeric recombinant b-interferon from macroporous microcarrier cultures under hypothermic conditions / T. Tharmalingam, K. Sunley, M. Butler // Biotechnol. Prog. - 2008. - Vol. 24. -P.832-838.

121. Tokushige, K. Comparison between cytomegalovirus promoter and elongation factor-1 alpha promoter-driven constructs in the establishment of cell lines expressing hepatitis C virus core protein / K. Tokushige, D. Moradpour, T. Wakita et al. // J. Virol. Methods. - 1997. - Vol. 64. - P. 73-80.

122. Trummer, E. Process parameter shifting: part I. Effect of DOT, pH, and temperature on the performance of Epo-Fc expressing C/70 cells cultivated in controlled batch bioreactors / E. Trummer, K. Fauland, S. Seidinger et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2006. - Vol. 94. - P. 1033-1044.

123. Trummer, E. Process parameter shifting: part II. Biphasic cultivation - a tool for enhancing the volumetric productivity of batch processes using Epo-Fc expressing C/fO cells / E. Trummer, K. Fauland, S. Seidinger et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2006. - Vol. 94. - P. 1045-1052.

124. Tsao, E.I. Optimization of a Roller Bottle Process for the Production of Recombinant Erythropoietin / E.I. Tsao // Ann. NY Acad. Sci. - 1992. - Vol. 665. -P.127-136.

125. Unger, D.R. Computational and experimental investigation of flow and fluid mixing in the roller bottle bioreactor / D.R. Unger, F.J. Muzzio, J.G. Aunins et al. // Biotechnol. Bioeng. - 2000. - Vol. 70. - P. 117-130.

101

126. Vassileva, A. Effect of copy number on the expression levels of hepatitis В surface antigen in the methylotrophic yeast Pichia pastoris / A. Vassileva, D.A. Chugh, S. Swaminathan et al. // Protein Expr. Purif. - 2001. - Vol. 21. - P. 71-80.

127. Whitford, W.G. Fed-batch mammalian cell culture in bioproduction / W.G. Whitford // BioProcess Inti. - 2006. - Vol. 4. - N. 4. - P. 30^4.

128. Wiebe, M.E. A multifaceted approach to assure that recombinant tPA is free of adventitious virus / M.E. Wiebe // Advances in animal cell biology and technology. - London: Butterworth-Heinemann. - 1989. - P. 68-71.

129. Wlaschin, K.F. Engineering cell metabolism for high-density cell culture via manipulation of sugar transport / K.F. Wlaschin and W.S. Hu // J. Biotechnol. -2007.-Vol. 131.-N. 2.-P. 168-176.

130. Worton, R.G. Chromosome stability in CHO cells / R.G. Worton, C.C. Ho, C. Duff// Somatic Cell Genet. - 1977. - Vol. 1. - N. 3. - P. 27-45.

131. Wurm, F. Large-scale transient expression in mammalian cells for recombinant protein production / F. Wurm and A. Bernard // Curr. Opin. Biotechnol. - 1999. - Vol. 10. -P. 156-159.

132. Wurm, F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells / F.M. Wurm // Nature Biotechnol. - 2004. - Vol. 22 - P. 13931398.

133. Xie, L. Integrated approaches to the design of media and feeding strategies for fed-batch cultures of animal cells / L. Xie and D.I. Wang // Trends Biotechnol. - 1997.-Vol. 15.-N.3.-P. 109-113.

134. Xie, L. Protein production by large-scale mammalian cell culture / / L. Xie, W. Zhou, D. Robinson // Gene transfer and expression in mammalian cells [ed. S.C. Makrides]. - Asterdam: Elsevier Science. - 2003. - P. 605-623.

135. Yang, M. Effect of ammonia on the glycosylation of human recombinant erythropoietin in culture / M. Yang and M. Butler // Biotechnol. Prog. - 2000. -Vol. 16.-P. 751-759.

102

136. Yi, X. Effects of osmotic pressure on recombinant BHK cell growth and von willebrand factor (vWF) expression / X. Yi, S. Xiangming, Z. Yuanxing // Process Biochem. - 2004. - Vol. 39. - P. 1817-1823.

137. Yoon S.K., Choi S.L., Song J.Y., Lee G.M. Effect of culture pH on erythropoietin production by Chinese hamster ovary cells grown in suspension at 32.5 and 37.0 degrees C // Biotechnol. Bioeng. - 2005. - V. 5. - N. 89. - P. 345356.

138. Yoon, S.K. Effect of culture temperature on folliclestimulating hormone production by Chinese hamster ovary cells in a perfusion bioreactor / S.K. Yoon, Y.-H. Ahn, M.H. Jeong // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - Vol. 76. - P. 8389.

139. Yoon, S.K. Application of sodium propionate to the suspension culture of Chinese hamster ovary cells for enhanced production of follicle-stimulating hormone / S.K. Yoon and Y.-H. Ahn // Biotechnology and Bioprocess Engineering. - 2007. - Vol. 12. - N. 5. - P. 497-501.

140. Yoshida, H. Chemical chaperones reduce aggregate formation and cell death caused by the truncated Machado-Joseph disease gene product with an expanded polyglutamine stretch / H. Yoshida, T. Yoshizawa, F. Shibasaki et al. // Neurobiol. Dis. - 2002. - Vol. 10. - N. 2. - P. 88-99.

141. Zahn-Zabal, M. Development of stable cell lines for production or regulated expression using matrix attachment regions / M. Zahn-Zabal, M. Kobr, P.A. Girod // J. Biotechnol. - 2001. - Vol. 87. - P. 29-42.

142. Zang, M. Production of recombinant proteins in Chinese hamster ovary cells using a protein-free cell culture medium / M. Zang, H. Trautmann, C. Gandor et al. // Biotechnology. - 1995. - Vol. 13. - P. 389-392

143. Zhang, Y. Approaches to optimizing animal cell culture process: substrate metabolism regulation and protein expression improvement / Y. Zhang // Adv. Biochem. Engin. Biotechnol. - 2009. - Vol. 113. - P. 177-215.

103

ПРИЛОЖЕНИЯ

104

№ ИЗ

Всероссийская Коллекция Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика

S Рзссий. Mcsw H3SMS t-sM Д9режмой tWMb 1. ФГ/ГГкНИИГежтжа - ВКПМ

Җ [OSQ Л5121С: фам: (СИ) Эл. <W* м.

<!һЧ)маНК!)М-ПУ<<

л V/_____20)2 t

НАЦИОНАЛЬНОЕ П АТЕНТНОЕ ДЕПОНИРОВАНИЕ

СПРАВКА О ДЕПОНИРОВАНИИ

Всероссийская Коллекция i [роммшлеиных Микрооргапи чмов (ВКИМ)

ФГУП ! осННИгенстика приняла на национальное патентное депо пира какие культуру клеточной линии:

CHO-CMV/rEFbdEPO

Дата депонировании: 23 октября 2012 года.

Депозитор: Общество с ограниченной ответственностью «Фармапарк»

Продукт, продуцируемый штаммом (область применения штамма): Дырбэпоэтин.

РЕГИСТРАЦИОННЫЙ НОМЕР ВКПМ: Н-133

Директор ВКПМ д.б.н., проф.

S.".

Синеокий (11.

105

о о CL)

Q О

са

(П с

о

м о

Выравнивание 3 нуклеотидных последовательностей

дарбэпоэтина, использованных в экспрессионных векторах

106

ФЕДЕРАЛЬНОМ ftX УДА М Т ВЕННОЕ ЫОДЖЕГИОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

<4{м'^м№-исе.чмс№ашлмкнй инсщ-Q f фжрмжкмагим ммшн Н.В. Ажмус#м"

Распиской акму^н мсдмийМ^!Ш нжук

^^тм:РЖДАю^

. Дмреиор

ФГЬ\ ^ННИ нмскя ВЛ Ззк^ссмы РАМН

* аюоз^кРАНиРАМН

- ,'-^Д'-^ С суждения

ОТЧЕ! О НА^ ЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ

- СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ИММ^НОТОКСЙЧНОСТИ И

АЛЛЕРГИ ТИРУЮЩИХ СВОЙСТВ ДВУХ ПРЕПАРАТОВ

ДАРБЗПОЭТИНА^'

Р%ксиюдм:с.А р^&отм

4.i?H-Mspp РАМН, преф Дщ<цеа АЛ

АЬжкаи 2013

107

ОТЧЕТ

Изучение острой токсичности препарата Дарбэпоэтин альфа (ООО кФармапарка) в сравнении с зарегистрированным в РФ препаратом Аранесп^ (Амджен Европа Б.В., Нидерланды^ при их однократном подкожном введении крысам Sprague-Dawtey

Заказчик:

ООО ^ФАРМАПАРК^

Исследсватальсаса учреждение:

Филиал фурильного Йяджатжм

муж Института 6tw3p<w<H4*cxc3 хим нм ж академижж

М М Шемякина и К? A Российской академа иеух

МйЖ т Пуҗимз Мсскжжж обл, протж Науки б

Помар исследования 29Й13

Зав^ую^м^ лаб&рат&ржей биологичмюнх испмтаний ФИБХ РАН:

д б и, профмс^А' WМуржмав Дата*

РукФвсдитжлж мсзйфдаванмя;

<3

Дзтз

Лсбамов-

108

i } h

И

'^2 '

\ ]Й PA^l '

' < )t* tiircR'O^

' 3\t)t?IHbj-n*-*<.p"ST^b)!l< Г<1СМ1%'фл^1,.ПЧ)

: и

f \t

\

D }f?

It hi'^r

ui ,: UiG iK t } b'ttSi .

lift :\}'ь ;!!")[.!P\

<'*1<! f*yt<4^^!<

!L* ьи u ^<*^

?* y/

i y^'1 u,

1Ы