Разработка и валидация методов контроля качества экулизумаба в процессе биотехнологического производства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Аскретков Александр Дмитриевич

• Аскретков Александр Дмитриевич
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Аскретков Александр Дмитриевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Орфанные заболевания

1.2 Система комплемента и патологический механизм активации

1.3. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия

1.4. Миастения гравис

1.5. Атипичный гемолитико-уремический синдром

1.6. SARS-CoV-2

1.7 Характеристика рМАТ Экулизумаб

1.8 Влияние профиля заряженных форм и гликозилирования рМАТ на их фармакокинетические параметры и активность

1.8.1 Профиль заряженных форм

1.8.2 Профиль гликозилирования

1.9 Контроль качества моноклональных антител

1.9.1 Полисорбат

1.9.2 Профиль заряженных форм

1.9.3 Профиль гликозилирования

1.9.4 Контроль аминокислот в КЖ

1.9.5 Содержание белка в КЖ

Выводы к главе

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Исходные реактивы и оборудование

2.2 Хроматографические методики

2.3. Методика количественного определения аминокислотного состава культуральной жидкости

2.3.1 Дериватизация аминокислот в стандартном образце и КЖ

2.3.2 Исходная ВЭЖХ методика

2.3.3 Разработка методики

2.3.4 Разработанная методика

2.3.5 Валидация методики

2.4 Разработка методики количественного определения рМАТ экулизумаб в культуральной жидкости

2.4.1 Эксклюзионная хроматография

2.4.2 Аффинная хроматография

2.4.3 Валидация методики

2.5 Методика контроля гликанового профиля рМАТ Экулизумаб

2.5.1 Очистка ЭКЗБ из КЖ

2.5.2 Дегликозилирование

2.5.3 Очистка гликанов после дегликозилирования

2.5.4 Дериватизация

2.5.5 Очистка дериватов гликанов

2.5.6 ВЭЖХ

2.5.7 Разработанная методика

2.5.8 Валидация методики

2.6 Методика контроля содержания полисорбата 80 в полупродуктах и субстанции рМАТ Экулизумаб

2.6.1 Методика определения ПС80 методом спектрофотометрии

2.6.2 ОФ ВЭЖХ ПС80 без гидролиза

2.6.3 Разработка методики определения ПС80

2.6.4 Разработанная методика

2.6.5 Валидация методики

2.7 Методика оценки содержания заряженных форм экулизумаба в культуральной жидкости, полупродуктах и субстанции

2.7.1 Исходная методика кИЭФ

2.7.2 Разработка методики

2.7.3 Очистка ЭКЗБ из КЖ

2.7.4 Разработанная методика

2.7.5 Валидация методики

2.8 Проведение испытаний стабильности субстанции эуклизумаб.

79

Глава 3. Разработка хроматографических методик

3.1 Методика количественного определения аминокислотного состава культуральной жидкости

3.2 Разработка методики количественного определения рМАТ экулизумаб в культуральной жидкости

3.2.1 Эксклюзионная хроматография

3.2.2 Аффинная хроматография

3.3 Разработка методики контроля гликанового профиля рМАТ экулизумаб

3.3.1 Очистка ЭКЗБ из КЖ

3.3.2 Дегликозилирование

3.3.3 Очистка и дериватизация

3.3.4 Очистка дериватов гликанов

3.3.5 ВЭЖХ

3.3.6 Валидация

3.4 Разработка методики контроля содержания полисорбата 80 в полупродуктах и субстанции рМАТ Экулизумаб

3.4.1 Методика определения ПС80 методом спектрофотометрии

3.4.2 ОФ ВЭЖХ

3.4.3 Пробоподготовка

3.4.4 Валидация

4. Разработка методики оценки содержания заряженных форм

экулизумаба методом капиллярного изоэлектрического фокусирования

4.1 Разработка методики

4.2 Пробоподготовка КЖ

4.3 Валидация

5. Составление проекта НД на субстанцию экулизумаб и

исследование стабильности

5.1 Составление проекта НД на субстанцию экулизумаб

5.2 Исследование стабильности субстанции экулизумаб

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ

ОБОЗНАЧЕНИЙ

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Заключение о возможности открытого

опубликования

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Проект НД на субстанцию

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Акт внедрения в учебный процесс ФГБОУ ВО

«МИРЭА-Российский технологический университет»

ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Акт внедрения в учебный процесс ФГБВОУ ВО

военно-медицинской академии имени С.М. Кирова»

ПРИЛОЖЕНИЕ 5 Акт внедрения в процесс контроля качества

субстанции экулизумаб ООО «Фармапарк»

ПРИЛОЖЕНИЕ 6 Акт внедрения в процесс контроля качества

субстанции экулизумаб АО «ИФТ»

ПРИЛОЖЕНИЕ 7 Результаты оценки стабильности субстанции

экулизумаб в условиях естественного хранения

ПРИЛОЖЕНИЕ 8 Результаты оценки стабильности субстанции экулизумаб в условиях ускоренного хранения

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка и валидация методов контроля качества экулизумаба в процессе биотехнологического производства»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В современной медицине и фармации наблюдается быстрый рост количества лекарственных средств на основе рекомбинантных белков. Значительную группу биотехнологических препаратов занимают рекомбинантные моноклональные антитела (рМАТ). Их огромная популярность связана с их высокой специфичностью к целевой мишени, эффективностью и минимальным воздействием на остальные системы организма. Около 50 % препаратов рМАТ применяются в онкологии, где они показали высокую эффективность в сравнении с химиотерапией, около 37 % используются в иммунологии и трансплантологии, 11 % - в терапии инфекционных заболеваний и 2 % в лечении сердечно-сосудистых патологий [1-2]. рМАТ создали возможность для терапии орфанных (редких) заболеваний, например, такого как Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ), Миастения Гравис (МГ), Атипичный гемолитико-уремический синдром (аГУС). По статистике, распространенность данных заболеваний составляет в среднем от 5 до 80 случаев на 1 миллион человек [3-4]. Для данных заболеваний прогноз условно неблагоприятный [5], медиана выживаемости пациентов с ПНГ от диагностики заболевания составляла 10 лет [6-7] за десятилетний период, аГУС - до 5 лет. Терапия данных заболеваний сводилась к устранению симптоматики ввиду отсутствия специфического лечения, что, однако, не останавливало прогрессирование заболевания. В 2007 году был одобрен первый лекарственный препарат (ЛП) для терапии ПНГ на основе рМАТ Солирис® (МНН - Экулизумаб) [8], позже был одобрен для терапии аГУС в 2011 г. и МГ - в 2017 г. Данный препарат способствовал значительному удлинению жизни пациентов и улучшению ее качества. Однако очень высокая стоимость лечения оригинальным препаратом (около 400 тыс. долларов США в год на одного пациента) и биоподобным препаратом требует еще создания ряда биоподобных препаратов экулизумаба, что позволит существенно снизить стоимость лечения и увеличит доступность

для пациента. Экулизумаб также продемонстрировал улучшение дыхательной функции тяжелобольных пациентов с SARS-CoV-2, увеличив выживаемость.

Согласно государственным программам «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности РФ на период до 2020 года и дальнейшую перспективу» [9], «Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2030 года» [10] и перечня высокотехнологичной продукции, работ и услуг с учетом приоритетных направлений модернизации российской экономики [11], приоритет устанавливается в области формирования высокопроизводительного экспортно-ориентированного сектора на основе современных технологий химического и биологического синтеза, производства качественной, эффективной и безопасной фармацевтической продукции, формировании научного, технологического и производственного потенциала фармацевтической промышленности, а также обеспечении населения жизненно необходимыми и важнейшими лекарственными препаратами, что ставит перед отечественной фармацевтической промышленностью и наукой задачу увеличения производственных мощностей для обеспечения внутреннего рынка и экспорта продукции, оптимизации технологического процесса с целью снижения затрат и, соответственно, стоимости лекарственных средств (ЛС) и надлежащего обеспечения качества.

Создание биоаналогового лекарственного средства представляет собой достаточно сложную задачу, ввиду многообразия биохимических путей синтеза и процессинга рМАТ, происходящих в живой клетке - продуценте белка, и невозможности их полного контроля, воздействии на продуцируемое антитело стресс-факторов в культуральной жидкости (КЖ). Полученное рМАТ, в том числе экулизумаб, имеет гетерогенную структуру, что требует с самого начала жизненного цикла биотехнологического производства рМАТ применения целого спектра методов контроля как количества, так и качества производимого белка. На дальнейших этапах жизненного цикла

биотехнологического производства рМАТ - разработке технологии очистки, масштабировании, создании ГЛФ и оценке стабильности, широкое применение комплекса методов способно уменьшить затраты на очистку белка, а также предупредить выпуск продукции неудовлетворительного качества.

Таким образом, необходимость разработки методик контроля качества экулизумаба на каждой стадии биотехнологического производства, является, несомненно, важной и актуальной задачей, которая способна значительно снизить затраты как на разработку процессов производства, так и дальнейшую оптимизацию, и вывод на рынок ЛС. Что позволит получить эффективный, безопасный и более доступный продукт.

Степень разработанности темы

Методики контроля качества препаратов рМАТ описаны в научных исследованиях, частично в ГФ РФ [12], а также в Европейской фармакопее [13] и фармакопее США [14], однако ввиду уникальности каждого антитела и его биологической мишени [15], требуется значительная оптимизация методик контроля качества или разработка новых, что в ряде случаев вызывает ряд проблем, зависящих от самого белка [16-17].

На данный момент в научной литературе не описаны методики контроля качества рМАТ экулизумаб, например, капиллярное изоэлектрическое фокусирование, количественное определение. Ввиду, нехарактерной для антител, низкой изоэлектрической точки экулизумаба (р1- 6,0), а также присутствия фрагментов от разных подклассов требует усовершенствования методик.

Методики определения профиля гликозилирования, представленные в научной литературе, обладают одним или несколькими недостатками: использование дорогостоящих коммерческих наборов; трудоемкость и продолжительность анализа; использование дорогостоящих флуоресцентных меток; использование труднодоступного оборудования - масс-спектрометры,

данные недостатки делают затруднительным проведение рутинных анализов, что требует разработки новой методики.

Методики контроля содержания полисорбата 80 также обладают рядом недостатков: трудоемкость и продолжительность анализа; потребность в больших количествах образца; высокая стоимость анализа; использование специфического малодоступного оборудования; делают актуальным разработку новой.

Воспроизведение методик анализа аминокислот из научной литературы не дало удовлетворительного разрешения и чувствительности при анализе 20 протеиногенных аминокислот, аммония, цистина и добавки аланил-глутамина в культуральной жидкости экулизумаба, что также требовало разработки новой методики, удовлетворяющей всем поставленным требованиям.

В рамках разработки методик контроля качества экулизумаба, требуются дополнительные изыскания в области методик контроля качества технологического процесса, а также контроля качества субстанции Экулизумаб.

Вышеизложенные факты предопределили выбор темы работы, цели и задачи исследования.

Цель работы. Целью настоящего исследования является разработка методик контроля параметров процесса биотехнологического производства рМАТ экулизумаб, а также показателей качества субстанции и их валидация. Для выполнения цели были поставлены следующие задачи.

Задачи исследования:

- Разработать методику анализа аминокислот в культуральной жидкости в процессе культивирования продуцента рМАТ экулизумаб с применением метода многокритериальной оптимизации и провести валидацию.

- Разработать методику количественного определения рМАТ экулизумаб в культуральной жидкости и провести валидацию.

- Разработать методику контроля профиля гликозилирования рМАТ экулизумаб в культуральной жидкости и субстанции с применением метода многокритериальной оптимизации и провести валидацию.

- Разработать методику оценки содержания заряженных форм (изоформ) рМАТ экулизумаб в культуральной жидкости, полупродуктах производства и субстанции с применением метода многокритериальной оптимизации и провести валидацию.

- Разработать методику контроля содержания полисорбата 80 в полупродуктах и субстанции рМАТ экулизумаб с применением метода многокритериальной оптимизации и провести валидацию.

- Провести стандартизацию субстанции рМАТ экулизумаб, а также провести оценку стабильности субстанции в течение всего срока хранения.

Научная новизна

• Разработана новая методика контроля аминокислотного состава культуральной жидкости. Методика позволила одновременно осуществлять детектирование и количественную оценку 23 аналитов (20 протеиногенных аминокислот, аммоний, цистин и аланил-глутамин). Проведена валидация методики.

• Разработана хроматографическая методика количественного определения рМАТ Экулизумаб в КЖ и проведена её валидация.

• Разработана методика определения заряженных форм рМАТ Экулизумаб в КЖ, полупродуктах и субстанции и проведена её валидация.

• Разработана экспрессная методика определения полисорбата 80 в субстанции, основанная на гидролитическом расщеплении и детектировании высвободившейся олеиновой кислоты, проведена её валидация.

• Разработан проект НД на субстанцию рМАТ Экулизумаб, а также проведена оценка стабильности субстанции экулизумаб.

Теоретическая и практическая значимость работы

• Разработанная методика количественного определения рМАТ экулизумаб включена СОП по количественному определению экулизумаба в культуральной жидкости и полупродуктах, который используется в технологических картах ТК-ЭКЗБ-002-08 (ООО «Фармапарк») (ссылка на СОП).

• Мониторинг аминокислотного состава позволил осуществить оптимизацию технологии культивирования, что привело к увеличению продукции белка на 35 %.

• Изучение условий хранения КЖ с использованием методики определения заряженных форм позволило осуществить выбор наиболее оптимальных условий и сроков хранения

• Разработанные методики были использованы при проведении сравнительного исследования физико-химического и биологического подобия, воспроизведенного ЛС экулизумаб с оригинальным препаратом Солирис®, результаты которого положительно оценены Комиссией при Министерстве здравоохранения РФ и препарат был допущен для проведения клинических исследований (РКИ №361 (03.07.2019)

• Разработанные методики контроля качества включены в проект НД на фармацевтическую субстанцию экулизумаб (ООО «Фармапарк», Москва) (ПРИЛОЖЕНИЕ 2).

• Основные положения и результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедры Биотехнологии и промышленной фармации ФГБОУ ВО «МИРЭА - Российский технологический университет», направление (акт внедрения от 11.11.21). (Приложение 3), а также в учебный процесс ФГБВОУ ВО военно-медицинской академии имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (акт внедрения от 13.11.21) (Приложение 4).

• Результаты диссертационного исследования внедрены в процесс контроля качества субстанции экулизумаб ООО «Фармапарк» (акт внедрения

от 12.11.21) (Приложение 5), а также АО «ИФТ» (акт внедрения от 27.10.21) (Приложение 6).

Методология и методы исследования

Методологической основной диссертационного исследования являются основные теоретические и практические принципы высокоэффективной жидкостной хроматографии, капиллярного электрофореза, методов пробоподготовки образцов в зависимости от их химической природы, а также валидационных требований регламентирующих документов. Применение данных принципов, наряду с разработкой и оптимизацией методик с применением многофакторного анализа многокритериальной оптимизации легли в основу новых методик контроля качества воспроизведенного ЛС экулизумаб. Методология данного исследования была построена на актуальных требованиях государственной фармакопеи Российской Федерации XIV издания, а также фармакопеи Евразийского экономического союза (ЕАЭС).

Положения, выносимые на защиту.

1. Результаты экспериментальных исследований разработки методов качества для всех этапов технологического процесса производства субстанции рМАТ Экулизумаб:

- капиллярное изоэлектрическое фокусирование;

- количественное определение белка;

-количественное определение полисорбата 80;

- анализ профиля гликозилирования в КЖ, полупродуктах и готовом продукте.

2. Результаты экспериментальных исследований разработки методики контроля содержания аминокислот в КЖ при культивировании продуцента

3. Валидация аналитических методик.

4. Стандартизация субстанции рМАТ Экулизумаб, а также оценка стабильности субстанции согласно требованиям Фармакопеи ЕАЭС, Государственной Фармакопеи Российской Федерации XIV издания к биофармацевтическим генно-инженерным продуктам. Установление срока годности и условий хранения.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Основные положения диссертации обсуждались на Научно-практической конференции ученых России и Хорватии (Москва, 2019), VI международной конференции молодых ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов «OPENBIO-2019» (Новосибирск, 2019), II Международной научно-практической конференции «Гармонизация подходов к фармацевтической разработке» (Москва, 2019), II международном симпозиуме «Innоvatiоns in life stieres» (Белгород, 2020), VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Перспективы внедрения инновационных технологий в медицине и фармации» (Орехово-Зуево, 2021).

Достоверность полученных результатов и выводах основана на достаточном объеме полученных данных их статистической обработкой с использованием программ Microsoft Excel 2016 и Minitab 19, STATISTIKA 10, полученные результаты также подтверждаются валидацией аналитических методик. Данные, полученные при проведении исследований представлены в таблицах и на рисунках в диссертации.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, в том числе 6 статей в изданиях, рекомендованных ВАК (Биотехнология, Журнал аналитической химии, Тонкие химические технологии, Химико-Фармацевтический журнал).

Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии со Стратегией научно - технологического развития Российской Федерации, Федеральной целевой программой «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности РФ на период до 2020 года и дальнейшую перспективу», в то же время работа учитывает задачи «Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2030 года».

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 169 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы (глава I), описания объектов и методов исследования (Глава II), обсуждение результатов собственных исследований (Глава III, IV, V), заключения, списка использованной литературы, который включает 171 источник, из них 151 зарубежных авторов. Материалы диссертации содержат 31 таблицу, 34 рисунка и 8 приложений.

Личный вклад автора

Экспериментальные результаты, приведенные в тексте диссертации получены и обработаны самим автором. Лично автором было выполнено более 80 % экспериментальных и теоретических исследований при разработке методик контроля технологического процесса производства, а также методик контроля качества субстанции экулизумаб, обзор и анализ литературы, написание публикаций по теме диссертации и внедрение результатов исследования. Работы выполнена совместно с коллективом кафедры Биотехнологии и промышленной фармации ФГБОУ ВО МИРЭА, а также ООО «Фармапарк».

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Орфанные заболевания

Орфанные заболевания (ОЗ) представляют собой редкие патологии распространенность которых составляет не более 10 случаев на 100000 человек [18-20]. Несмотря на низкую распространенность, огромное количество нозологий (около 6000) приводит к количеству больных в 6-8 % от всего населения земли [1,21,22]. Этиология многих ОЗ заключается во врожденных, либо приобретенных генетических изменениях, что, как правило, делает данные заболевания неизлечимыми и требующими пожизненной поддерживающей терапии. Терапия ОЗ представляет собой проблемную область, что вызвано рядом факторов [23]:

- трудности со своевременной постановкой правильного диагноза; -отсутствие адекватного диспансерного контроля;

-малочисленность исследований и отсутствие отработанных методов лечения;

-отсутствие лекарственных препаратов для терапии или их высокая стоимость.

Отдельно стоит выделить проблему разработки лекарственных препаратов для ОЗ. Так как распространенность ОЗ чрезвычайна низка, фармацевтические компании либо не заинтересованы в разработке ЛС для их терапии, ввиду отсутствия коммерческой выгоды, либо созданное ЛС имеет высокую стоимость и малодоступно для пациентов без финансовой помощи государства [24]. Для стимулирования фармацевтических производителей к разработке и производству ЛС направленных на терапию ОЗ во многих государствах созданы льготные условия для производителей данного класса препаратов, что должно стимулировать их создание и производство. Например, в США в 1983 году был выпущен акт «US Orphan Drug Act», в Европейском союзе - постановление «Regulation 141/2000 on orphan medicinal

products», которые должны обеспечить более выгодные условия для фармацевтических производитилей в сфере ОЗ.

В Российской Федерации, в соответствии с федеральным законом от 12 апреля 2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», при условии признания лекарственного препарата для терапии ОЗ, производителям оригинальных и воспроизведенных ЛС направленных предоставляются льготы в виде ускорения процедуры регистрации, а также уменьшению требований к клинической документации [25].

1.2 Система комплемента и патологический механизм активации

Главным механизмом патологии ПНГ, МГ и аГУС, который приводит к различным поражениям органов является нарушение регуляции системы комплемента. Система комплемента представляет собой обширный набор протеолитических белков постоянно присутствующих в кровяном русле и является важной части гуморальной защиты организма от патогенов. Она важна как для врожденного, так и для приобретенного иммунитета. Ключевую роль в ней играет гидролитическое расщепление компонента С3 С3-конвертазой на два фрагмента (рисунок 1.1), которые ответственны за дальнейший каскад реакций, образование мембран-атакующего комплекса (МАК) и лизис клеток. По способу активации С3 различают лектиновый, классический (антителопосредованный) и альтернативный пути [26].

Рисунок 1.1. Система комплемента, пути активации и каскад иммунохимических реакций

Только для классического пути характерен проксимальный этап активации, в ходе которого на комплексе антиген-антитело собирается компонент С1, состоящий из субъединиц СЦ, двух Ог и двух C1s. Собранный комплекс расщепляет компоненты С2 и С4 на субъединицы С2а, С2Ь и C4b, C4a, соответственно. Соединение С2а и С4Ь приводит к образованию С3-конвертазы [27,28].

Терминальный этап активации комплемента характерен для всех трех путей и заключается в расщеплении компонента С3 на фрагменты С3а и С3Ь. С3Ь, сорбированный на поверхности клетки, осуществляет расщепление фактора С5 на С5а и С5Ь, с последнего, при участии компонентов С6, С7, С8, С9 начинается сборка МАК, который приводит к образованию трансмембранных каналов и лизису клетки.

1.3. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия

Пароксизмальная ночная гемоглобинурия (ПНГ) является одним из ОЗ [29] и представляет собой приобретенное неопухолевое заболевание системы кроветворения. ПНГ считается ультра-редким заболеванием, по статистике,

заболеваемость составляет около 1 человека на 1 миллион человек в год [30], а распространенность заболевания - 16 на 1 миллион человек [31,32]. При ПНГ происходит лизис красных кровяных клеток системой комплемента организма и, как следствие, проявление симптомов анемии, тромбозов и костномозговой недостаточности [33]. Помимо основных симптомов часто встречаются почечная недостаточность, легочная гипертензия, боли в грудной клетке и животе, выраженная общая слабость, дисфагия, эректильная дисфункция [34,35]. Данные симптомы значительно ухудшают качество жизни больных. Течение ПНГ непредсказуемо и сильно варьируется по тяжести симптомов. Так у ряда пациентов продолжительность жизни с ПНГ составляет более 30 лет, в то время как у других вскоре после постановки диагноза возникают угрожающие жизни состояния, в большинстве случаев связанные с тромботическими осложнениями [36,37]. Исследования показывают, что в течение первых 5 лет после установления диагноза смертность составляет -35 %, а в течение 10 лет около 50 % [38,39].

При ПНГ наблюдается соматическая мутация в гене РЮ-А, который кодирует субъединицу А фермента фосфатидилинозитол-Ы-ацетилглюкозаминтрансферазы, расположенной в Х-хромосоме. Данный фермент осуществляет синтез гликозилфосфатидилинозитола ^Р1), который необходим для соединения ряда белков через GPI-якорь с клеточной мембраной. В случае с ПНГ наиболее критичным является отсутствие белков - СD55 и CD59, в норме презентованных на поверхности эритроцитов и других форменных элементов крови. Функции CD55 и CD59 сводятся к защите клеток организма от собственной иммунной системы, так CD55 (фактор ускорения распада комплемента) связывается с фрагментами С4Ь и С3Ь на поверхности клетки, тем самым ингибируя сборку комплекса С2аС4Ь и дальнейший каскад системы комплемента, CD59 предотвращает полимеризацию компонента С9 [33,40], чем препятствует образованию трансмембранного канала и гибели клетки (рисунок 1). Отсутствие у больных ПНГ на поверхности красных

кровяных клеток белков CD55 и CD59 делает клетки не защищенными от действия системы комплемента, что приводит к их лизису [41].

В зависимости от симптоматики заболевания, размера клона гематопоэтических стволовых клеток с дефектным геном РЮ-А и других сопутствующих заболеваний терапия ПНГ может быть построена в нескольких направлениях, основными из которых являются:

- трансплантация костного мозга;

- устранение негативной симптоматики.

- терапия ингибиторами системы комплемента;

Трансплантация костного мозга

Трансплантация костного мозга является единственным действующим способом излечения ПНГ, однако значительная частота осложнений и летальных исходов сильно ограничивают данную практику [5,42,43]. Так при пересадке 48 реципиентам костного мозга со средним возрастом 28 лет от доноров с идентичным комплексом гистосовместиости, выживаемость в течение 2 лет после операции составила 56 % [44]. Европейская группа трансплантации крови и костного мозга сообщало об общей выживаемости реципиентов костного мозга на уровне 70 % (54 % для больных с ПНГ) в течение 5 лет с медианным возрастом 30 лет. Наиболее частыми осложнениями являлась острая или хроническая реакция «трансплантат против хозяина» в 15 и 20 % случаев, соответственно, у половины пациентов с ПНГ возникала веноокклюзионная болезнь печени [5,42,45]. Помимо высокой смертности, частоты и тяжести побочных эффектов, поиск донора в связи с огромным разнообразием комплексов гистосовместимости представляет трудную задачу. При удачной трансплантации нет гарантий, что РЮ-А дефектный клон гемопоэтических стволовых клеток не будет экспансировать [46].

Таким образом, трансплантация костного мозга для больных с ПНГ осуществляется только в крайних случаях при состояниях, угрожающих

жизни, таких как цитопения, либо при резистентности к другим стратегиям лечения [5,42].

Гемотрансфузии

До выведения на рынок ЭКЗБ, единственным способом восполнения эритроцитарной массы являлась трансфузия отмытых или размороженных эритроцитов [47], при снижении содержания уровня эритроцитов в крови. При этом имелась постоянная зависимость больных от регулярных гемотрасфузий. Введение терапии ЭКЗБ позволило значительно снизить число гемотрансфузий, либо убрать их полностью [48].

Терапия моноклональными антителами

В 2007 году первое рМАТ - ЭКЗБ (торговое наименование Солирис®) для терапии ПНГ было одобрено Food and Drug Administration (FDA), а также European Medicines Agency (EMA). В ноябре 2011 года Солирис® был одобрен Российскими регуляторными органами и поступил на рынок РФ. Вскоре после выхода на рынок, ЭКЗБ стал основной составляющей терапии классической ПНГ с выраженными гемолизом, что привело к уменьшению гемолиза, тромботических нарушений и потребности в трансфузиях эритроцитарной массы[49]. Помимо этого, наблюдалось устранение вторичных симптомов -легочной гипертензии, одышки, слабости [5,42,50,51] и общее улучшение физического состояния и функции почек [52]. Общая продолжительность жизни для больных ПНГ, получающих лечение ЭКЗБ, достигла значений характерных для общей популяции [53-55]. Несмотря на то, что терапия данным препаратом не приводит к излечению заболевания, безопасность и хорошая переносимость ЭКЗБ позволяет использовать его в течение длительного времени [8]. На данный момент показаниями для терапии ЭКЗБ являются связанные с ПНГ тромботические осложнения, гемолиз и, как следствие, множественные нарушения функционирования систем организма, а также беременность. По десятилетней статистике использования препарата [8], терапия ЭКЗБ сопровождается минимумом побочных эффектов. Наиболее

распространенными побочныит эффектами являются пониженный уровень гемоглобина (в 16,1 % случаев), головная боль (в 7,6 % случаев), лихорадка (7,2 %) и слабость (5,5 %). При применении ЭКЗБ не наблюдалось смертельных исходов непосредственно от введения препарата, смертельные случаи (8 случаев) являлись следствием осложнений при менингококковой инфекции (всего 66 случаев) [8,56]. На данный момент на рынке Российской Федерации препараты ЭКЗБ доступны от компании АО «Генериум» под торговым наименованием Элизария®. Высокая стоимость оригинального и воспроизведенного препарата, а также необходимость в импортозамещении требует создания производства нескольких биоподобных препаратов на территории РФ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Аскретков Александр Дмитриевич, 2022 год

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Олефир, Ю.В., Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Солдатов А.А., Мовсесянц А.А. Современные биологические/биотехнологические лекарственные препараты. Актуальные вопросы разработки и перспективы использования/ Ю.В. Олефир, Н.В. Медуницын, Ж.И. Авдеева, А.А. Солдатов, А.А. Мовсесянц// БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. -2016. -Т. 16. -№2, - С. 67-77.

2. Lu, R.M. Development of therapeutic antibodies for the treatment of diseases/ R.M. Lu, Y.C. Hwang, I.J. Liu, C.C. Lee, H.Z. Tsai, H.J. Li, H.C. Wu// J Biomed Sci. -2020. - V.27. -N1.

3. Myasthenia Gravis [Электронный ресурс]. URL: https://rarediseases. org/rare-diseases/myasthenia-gravis/ (дата обращения 08.12.2020).

4. Yan, K. Epidemiology of Atypical Hemolytic Uremic Syndrome: A Systematic Literature Review/ K. Yan, K. Desai, L. Gullapalli, E. Druyts, C. Balijepalli// Clin Epidemiol. -2020. -V.12. -P. 295-305.

5. Кулагин, А.Д. Национальные клинические рекомендации по диагностике и лечению пароксизмальной ночной гемоглобинурии/ А.Д. Кулагин, И.А. Лисуков, В.В. Птушкин, В.Р. Шилова, Н.В. Цветаева, Е.А. Михайлова// Онкогематология. -2014. -Т.9. -N2. -C 20-28.

6. Гасымлы, Э.Д. Клинико-генетические и эпидемиологические особенности миастении (на примере красноярского края): дис...канд.мед.нуак:14.01.11/ Гасымлы Эльтадж Джамил кызы - Томск, 2020. - 154 с.

7. Хатхе Ю.А., Заболотских Н.В., Терпелец С.А. Эпидемиологические и популяционные аспекты миастении в Краснодарском крае/ Ю.А. Хатхе, Н.В. Заболотских, С.А. Терпелец // Нервно-мышечные болезни. -2018. -Т.8. -N1. -С. 28-33.

8. Parker, C. Diagnosis and management of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria/ C. Parker, M. Omine, S. Richards, J. Nishimura, M. Bessler, R. Ware, P. Hillmen, L. Luzzatto, N. Young, T. Kinoshita, W. Rosse, G. Socie// Blood. -2005. -V.106. -N 12. -P. 3699-3709.

9. Приказ Министерства промышленности и торговли РФ от 23 октября 2009 г. N 965 "Об утверждении Стратегии развития фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до 2020 года " [Электронный ресурс]. URL: https://base.garant.ru/4189282/ (дата обращения 08.12.2020).

10. Постановление Правительства РФ от 31.03.2020 N 396 "О внесении изменений в государственную программу Российской Федерации Развитие фармацевтической и медицинской промышленности" [Электронный ресурс]. URL: https://base.garant.ru/73865426/ (дата обращения 08.12.2020).

11. Приказ от 16 сентября 2020 года N 3092 "Об утверждении Перечня высокотехнологичной продукции, работ и услуг с учетом приоритетных направлений модернизации российской экономики [Электронный ресурс]. URL: https://docs.cntd.ru/document/566064051 (дата обращения 08.12.2020).

12. Государственная фармакопея Российской Федерации XIV издания [Электронный русерс]. URL: https://femb.ru/record/pharmacopea14 (дата обращения 10.12.2020)

13. European Pharmacopoeia (Ph. Eur.) 10th Edition, EDQM, 2022.

14. United States Pharmacopeia National Formulary. Version 38, USP, 2015.

15. Beck, A. Macro- and Micro-Heterogeneity of Natural and Recombinant IgG Antibodies / A. Beck, H. Liu //Antibodies (Basel). -2019. -V8. -N18.

16. HPLC for Characterization and Quality Control of Therapeutic Monoclonal Antibodies [Электронный источник] / https://www.chromatographyonline.com/view/hplc-characterization-and-quality-control-therapeutic-monoclonal-antibodies (дата обращения 10.12.2021)

17. Monoclonal Antibodies - Quality Control and Quantification through Mass Spectrometry [Электронный источник] / http s : //www. labome. com/m ethod/Monocl onal -Antib odies-Quality-Control-and-Quantification-through-Mass-Spectrometry.html (дата обращения 10.12.2021)

18. Федеральный закон от 21.11.2011 N 323-ф3 (ред. от 27.12.2018) "Об основах охраны здоровья граждан в Российской Федерации", статья 44 [Электронный источник] /http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_121895/ (дата обращения 10.12.2021)

19. Communication from the commission to the european parliament, the council, the european economic and social committee and the committee of the regions [Электронный источник] / https://ec.europa.eu/health/ph threats/non com/docs/rare com en.pdf (дата обращения 10.12.2021)

20. Auvin, S. The Problem of Rarity: Estimation of Prevalence in Rare Disease/ S. Auvin, J. Irwin, P. Abi-Aad, A. Battersby// Value in Health. -2018. -V.21. -N 5. -P. 501-507.

21. Перечень редких (орфанных) заболеваний [Электронный источник] / https://minzdrav.gov.ru/documents/8048-perechen-redkih-orfannyh-zabolevaniy (дата обращения 10.12.2021)

22. Кравчук, Ж.П. Орфанные заболевания: определение, проблемы, перспективы/ Ж.П. Кравчук, О.А. Румянцева // Проблемы здоровья и экологии. -2013. -Т38. -№4. -С. 7-11.

23. Волкова, Н.С. Редкие (орфанные) заболевания: правовое регулирование в России и за рубежом / Н.С. Волкова, Э. Аксу// Журнал зарубежного законодательства и сравнительного правоведения. -2018. -№4. -Т.71. -С. 154-160.

24. Федеральный закон "Об обращении лекарственных средств" от 12.04.2010 N 61-ФЗ [Электронный источник] / http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_99350/ (дата обращения 10.12.2021)

25. Bektas, M. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: role of the complement system, pathogenesis, and pathophysiology/ M. Bektas, C. Copley-Merriman, S. Khan, S.P. Sarda, J.M. Shammo// J Manag Care Spec Pharm. -2020. V.26 (12-b Suppl): -S3-S8.

26. Wijnsma, K.L. Eculizumab in atypical hemolytic uremic syndrome: strategies toward restrictive use/ K.L. Wijnsma, C. Duineveld, J. Wetzels, N. Van de Kar // Pediatric nephrology (Berlin, Germany). -2019. -V.34. -N11. -P. 2261-2277.

27. Merle, N.S. Complement system part I - molecular mechanisms of activation and regulation/ N.S. Merle, S.E. Church, V. Fremeaux-Bacchi, L.T. Roumenina// Front. Immunol. -

2015. -V.6. Article 262.

28. Noris, M. Overview of complement activation and regulation/ M. Noris, G. Remuzzi // Semin Nephrol. -2013. -V.33. -N6. -P. 479-492.

29. England, J.T. Frequency of and reasons for paroxysmal nocturnal haemoglobinuria screening in patients with unexplained anaemia/ J.T. England, B. Dalal, H.A. Leitch// J Clin Pathol. -2018. -V.71. -N4. -P. 364-367.

30. Gulbis, B. Epidemiology of rare anaemias in Europe/ B. Gulbis, A. Eleftheriou, M. Angastiniotis, S. Ball, J. Surralles, M. Castella, H. Heimpel, A. Hill, J.L. Corrons// Adv Exp Med Biol. - 2010. -V. 686. -P.375-396.

31. Rother, R.P., Discovery and development of the complement inhibitor eculizumab for the treatment of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria/ R.P. Rother, S.A. Rollins, C.F. Mojcik, R.A. Brodsky, L. Bell// Nat Biotechnol. -2007. -V.25. -N11. -P. 1256-1264.

32. Новичкова, Г.А. Пароксизмальная ночная гемоглобинурия у детей (обзор литературы)/ Г.А. Новичкова, У.Н. Петрова, И.И. Калинина, А.А. Масчан//Гематология. -

2016. -Т.122. -№ 5. -С 15-20.

33. Rokosh, R.S., Ranganath N, Yau P, Rockman C, Sadek M, Berland T, Jacobowitz G, Berger J, Maldonado TS. High Prevalence and Mortality Associated with Upper Extremity Deep Venous Thrombosis in Hospitalized Patients at a Tertiary Care Center / R.S. Rokosh, N. Ranganath, P. Yau, C. Rockman, M. Sadek, T. Berland, G. Jacobowitz, J. Berger, T.S. Maldonado// Ann Vasc Surg. -2020. -V.65. -P.55-65.

34. Hill, A. Recent developments in the understanding and management of paroxysmal nocturnal haemoglobinuria/ A. Hill, S.J. Richards, P. Hillmen // Br J Haematol. -2007. -V.137. -P.181-192.

35. Barcellini, W. Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (Pnh): Brain Mri Ischemic Lesions In Neurologically Asymtomatic Patients/ W. Barcellini, E. Scola, S. Lanfranconi, M. Grottaroli, F. Binda, B. Fattizzo, A. Zaninoni, G. Valcamonica, C.M. Cinnante, C. Boschetti, M. Buoli, C.A. Altamura, N. Bresolin, F. Triulzi, A. Zanella, A. Cortelezzi// Sci Rep. -2018. -V.118. -N1. 476.

36. Hill, A., Kelly R. J., Hillmen P. Thrombosis in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria / A. Hill, R.J. Kelly, P. Hillmen // Blood. -2013. -V.121. -N25. -P. 4985-4996.

37. Jang, J.H. Predictive Factors of Mortality in Population of Patients with Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH): Results from a Korean PNH Registry/ J.H. Jang, J.S. Kim, S.S. Yoon, J.H. Lee, Y.K. Kim, D.Y. Jo, J. Chung, S.K. Sohn, J.W. Lee// Journal of Korean medical science. -2016. -V.31. -N2. -P. 214-221.

38. Hillmen, P., Lewis, S. M., Bessler, M., Luzzatto, L., & Dacie, J. V. (1995). Natural History of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria/ P. Hillmen, S.M. Lewis, M. Bessler, L. Luzzatto, J.V. Dacie// New England Journal of Medicine. -1995. -V.333. -N19. -P 1253-1258.

39. Ruiz-Delgado, G.J. Abnormalities in the expression of CD55 andCD59 surface molecules on peripheral bloodcells are not specific to paroxysmal nocturnalhemoglobinuria/ G.J. Ruiz-Delgado, E. Va'zquez-Garza, N. Me'ndez-Rami'rez, D. Go'mez-Almaguer // Hematology. -2009. -V.14. -N1. -P.33 -37.

40. Moriyama, M. A patient with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria being treated with eculizumab who underwent laparoscopic cholecystectomy: report of a case/ M. Moriyama, T. Nagata, I. Yoshioka, I. Hashimoto, K. Matsui, T. Okumura, K. Tsukada//. Surgical Case Reports. -2015. V.1. -N1. 57.

41. Brodsky, R.A. How I treat paroxysmal nocturnal hemoglobinuria / R.A. Brodsky //Blood. -2009. -V.113. -N26. -P. 6522-6527.

42. Santarone, S. Hematopoietic stem celltransplantation for paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: long-term results of a retrospective study on behalf of the Gruppo Italiano Trapianto Midollo Osseo (GITMO)/ S. Santarone, A. Bacigalupo, A.M. Risitano, E. Tagliaferri, E. Di Bartolomeo, A.P. Iori, A. Rambaldi, E. Angelucci, A. Spagnoli, F. Papineschi, S. Tamiazzo, M. Di Nicola, P. Di Bartolomeo// Haematologica. -2010. -V.95. -P.983-988.

43. Saso, R. Bone marrow transplants for paroxysmal nocturnal haemoglobinuria/ R. Saso, J. Marsh, L. Cevreska, J. Szer, R.P. Gale, P.A. Rowlings, J.R. Passweg, M.L. Nugent, L. Luzzatto, M M. Horowitz, E C. Gordon-Smith// Br J Haematol. -1999. -V104. -P.392-396.

44. Armitage, J. O. Bone marrow transplantation/ J.O. Armitage // N Engl J Med. --1994. -V.330. -P. 827-838.

45. Benavides Lopez, E. PNH clonalexpansion following bone marrow transplant case report/ E. Benavides Lopez // Haematologica. -2011. -V. 96. 524.

46. Гусева С.А., Дубкова А.Г., Вознюк В.П. Анемии: принципы диагностики и лечения. 1999 Киев: Киевской медицинской академии последипломного образования им. П. Л. Шупика МЗО. Украины. - 135 с.

47. Olutogun, T. Complement-mediated haemolysis and the role of blood transfusionin paroxysmal nocturnal haemoglobinuria/ T. Olutogun, I. Cutini, R. Notaro, L. Luzzatto // Blood Transfus. -2015.-V.13. -P.363-369.

48. Hillmen, P. Effect of eculizumab on hemolysis and transfusion requirements in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria/ P. Hillmen, C. Hall, J.C. Marsh// N Engl J Med. -2004. -V.350. -N6. -P.552-529.

49. Ueda, Y. Effects of eculizumab treatment on quality of life in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria in Japan/ Y. Ueda, N. Obara, Y. Yonemura// Int J Hematol. -2018. -V.107. -N6. -P.656-665.

50. . Loschi, M. Impact of eculizumab treatment on paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: a treatment versus no-treatment study/ M. Loschi, R. Porcher, F. Barraco // Am J Hematol. -2016. -V.91. -N4. -P.366-370.

51. Socie, G. Eculizumab in paroxysmal nocturnal haemoglobinuria and atypical haemolytic uraemic syndrome: 10-year pharmacovigilance analysis/ G. Socie, M.P. Caby-Tosi, J.L. Marantz// Br J Haematol. -2019. -V.185. -N2. -P.297-310.

52. Hillmen, P. Long-term safety and efficacy of sustained eculizumab treatment in patients with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria/ P. Hillmen, P. Muus, A. Roth// Br J Haematol. -2013. -V.162. -N1. -P.62-73.

53. Kelly, R.J. Long-term treatment with eculizumab in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: sustained efficacy and improved survival/ R.J. Kelly, A. Hill, L.M. Arnold // Blood. -2011. -V.117. -N25. -P.6786-6792.

54. Brodsky, R,A, Multicenter phase 3 study of the complement inhibitor eculizumab for the treatment of patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria/ R.A. Brodsky, N.S. Young, E. Antonioli // Blood. -2008. -V.111. -N4. -P.1840-1847.

55. Debureaux P-E. Hematological Response to Eculizumab in Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria: Application of a Novel Classification to Identify Unmet Clinical Needs and Future Clinical Goals/ P-E. Debureaux, F. Cacace, B.G.P. Silva// Blood. -2019. -V.134. -S1. -P.3517-3521.

56. Reher, D. Rare case of septic shock due to Neisseria meningitidis serogroup B infection despite prior vaccination in a young adult with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria receiving eculizumab/ D. Reher, V. Fuhrmann, S. Kluge// Vaccine. -2018. -V.36. -N19. -P. 2507-2509.

57. FDA approves therapy for pediatric patients with serious rare blood disease [Электронный источник] / https://www.fda.gov/drugs/news-events-human-drugs/fda-approves-therapy-pediatric-patients-serious-rare-blood-disease (дата обращения 10.01.2022)

58. Sheridan, D. Design and preclinical characterization of ALXN1210: A novel anti-C5 antibody with extended duration of action / D. Sheridan, Z.X. Yu, Y. Zhang // PLoS One. -2018. -V.13. -N4. e0195909.

59. Roth, A. Ravulizumab (ALXN1210) in patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: results of 2 phase 1b/2 studies/ A. Roth, S.T. Rottinghaus, A. Hill // Blood Adv. -2018. -V.2. -N17. -P.2176-2185.

60. Datta-Mannan, A. Engineered FcRn Binding Fusion Peptides Significantly Enhance the Half-Life of a Fab Domain in Cynomolgus Monkeys/ A. Datta-Mannan, J. Boyles, L. Huang// Biotechnol J. -2019. -V.14. -N3. e1800007.

61. Lee, J.W. Ravulizumab (ALXN1210) vs eculizumab in adult patients with PNH naive to complement inhibitors: the 301 study/ J.W. Lee, F. Sicre de Fontbrune, L. Wong Lee Lee// Blood. -2019. -V.133. -N6. -P.530-539.

62. Dhillon, S. Eculizumab: A Review in Generalized Myasthenia Gravis/ S. Dhillon // Drugs. -2018. -V.78. -P. 367-376.

63. Boldingh, M.I. An up-date on health-related quality of life in myasthenia gravis: results from population-based cohorts/ M.I. Boldingh, L. Dekker, A.H. Maniaol// Health Qual Life Outcomes. -2015. -V.13. 115.

64. Фомина, Н.В. Трудности диагностики атипичного гемолитико-уремического синдрома/ Н.В. Фомина, Л.Д. Чеснокова, О.А. Кондерова// Сибирский научный медицинский журнал. -2019. -Т.39. -N6. -C. 92-97.

65. Yoshida, Y. Pathogenesis of Atypical Hemolytic Uremic Syndrome/ Y. Yoshida, H. Kato, Y. Ikeda, M. Nangaku // J Atheroscler Thromb. -2019. -V.26. -N2. -P.99-110.

66. Loirat, C. Atypical hemolytic uremic syndrome / C. Loirat, V. Fremeaux-Bacchi// Orphanet J. Rare Dis. -2011. -V.6. 60.

67. Kobbe, R. Case report - atypical hemolytic uremic syndrome triggered by influenza B/ R. Kobbe, R. Schild, M. Christner // BMC Nephrol. -2017. -V.18. -N1. -P.1-4.

68. Wijnsma, K.L. Eculizumab in atypical hemolytic uremic syndrome: strategies toward restrictive use/ K.L. Wijnsma, C. Duineveld, J.F.M. Wetzels, N.C.A.J. van de Kar// Pediatr Nephrol. -2019. -V.34. -N11. -P. 2261-2277.

69. Nga, H.S. Thrombotic microangiopathy after kidney transplantation: Analysis of the Brazilian Atypical Hemolytic Uremic Syndrome cohort/ H.S. Nga, L.P.M. Palma, M. Ernandes Neto// PLoS One. -2021. -V.16. -N11. e0258319

70. Loirat, C. An international consensus approach to the management of atypical hemolytic uremic syndrome in children/ C. Loirat, F. Fakhouri, G. Ariceta// Pediatric Nephrology. -2015. -V.31. -N1. -P. 15-39.

71. Kavanagh, D. Atypical hemolytic uremic syndrome/ D. Kavanagh, T.H. Goodship// Current Opinion in Hematology. -2010. -V.17. -N5. -P. 432-438.

72. Avila Bernabeu, A.I. Atypical Hemolytic Uremic Syndrome: New Challenges in the Complement Blockage Era /A.I. Avila Bernabeu, T. Cavero Escribano, M. Cao Vilarino// Nephron. -2020. -V.144. -P. 537-549.

73. Coronavirus (COVID-19) [Электронный источник] / https://www.santepubliquefrance.fr/dossiers/coronavirus-covid-19 (дата обращения 10.01.2022)

74. Guan, W.J. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China/ W.J. Guan, Z.Y. Ni, Y. Hu // N Engl J Med. -2020. -V.382. -P.1708-1720.

75. Huang, C. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China/ C. Huang, Y. Wang, X. Li // Lancet. -2020. -V.395. -P.497-506.

76. Wang, R. The role of C5a in acute lung injury induced by highly pathogenic viral infections/ R. Wang, H. Xiao, R. Guo// Emerg Microbes Infect 2015;4:e28.

77. Кудлай, Д.А. Природа моноклонального антитела экулизумаб и его потенциал в отношении коронавирусной инфекции COVID-19/ Д.А. Кудлай, Б.А. Бакиров, В.Н. Павлов // Тромбоз, гемостаз и реология. -2020. -N2. -C. 27-32.

78. Pang, R.T. Serum proteomic fingerprints of adult patients with severe acute respiratory syndrome / R.T. Pang, T.C. Poon, K.C. Chan// Clin Chem. -2006. -V.52. -P.421-429.

79. Magro, C. Complement associated microvascular injury and thrombosis in the pathogenesis of severe COVID-19 infection: a report of five cases/ C. Magro, J.J. Mulvey, D. Berlin // Transl Res. -2020. -V.220. -P. 1-13.

80. SOLIRIS® (Eculizumab) Treatment of Participants With COVID-19 [Электронный источник] / URL https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04355494 (дата обращения 10.01.2022)

81. Diurno, F. Eculizumab treatment in patients with COVID-19: preliminary results from real life ASL Napoli 2 Nord experience/ F. Diurno, F.G. Numis, G. Porta// Eur Rev Med Pharmacol Sci. -2020. -V.24. -N7. -P.4040-4047.

82. Review cover Sheet Soliris (Eculizumab) [Электронный источник] / URL (https://www.accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/nda/2007/125166s0000_ChemR.pdf (дата обращения 10.01.2022)

83. SCIENTIFIC DISCUSSION [Электронный источник] / URL https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-discussion/soliris-epar-scientific-discussion_en.pdf (дата обращения 10.01.2022)

84. Fonseca, M.H.G. Boosting half-life and effector functions of therapeutic antibodies by Fc-engineering: An interaction-function review/ M.H.G. Fonseca, G.P. Furtado, M.R.L Bezerra // Int J Biol Macromol. -2018. -V.119. -P.306-311.

85. An, Z. IgG2m4, an engineered antibody isotype with reduced Fc function/Z. An, G. Forrest, R. Moore // MAbs. -2009. -V.1. -N6. -P.572-579.

86. Booth, B.J. Extending human IgG half-life using structure-guided design/ B.J. Booth, B. Ramakrishnan, K. Narayan // MAbs. -2018. -V.10. -N7. -P.1098-1110.

87. Ryman, J.T. Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies/ J.T. Ryman, B. Meibohm // CPT Pharmacometrics Syst Pharmacol. -2017. -V.6.-N9. -P.576-588.

88. Ovacik, M. Tutorial on Monoclonal Antibody Pharmacokinetics and Its Considerations in Early Development/ M. Ovacik, K. Lin // Clin Transl Sci. -2018. -V.11. -N6. -P.540-552.

89. Eigenmann, M.J. Quantification of IgG monoclonal antibody clearance in tissues/ M.J. Eigenmann, L. Fronton, HP. Grimm // MAbs. -2017. -V.9.-N6.-P.1007-1015.

90. Bumbaca, D. Physiochemical and biochemical factors influencing the pharmacokinetics of antibody therapeutics/ D. Bumbaca, C.A. Boswell, P.J. Fielder, L.A. Khawli // AAPS J. -2012. -V.14. -N3. -P.554-558.

91. Boswell, C.A. Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics/ C.A. Boswell, D.B. Tesar, K. Mukhyala// Bioconjug.Chem. -2010. -V.21. -P.2153-2163.

92. Kobayashi, H. The pharmacokinetic characteristics of glycolated humanized anti-Tac Fabs are determined by their isoelectric points/ H. Kobayashi, N. Le, I.S. Kim //Cancer Res. -1999. -V.59. -P. 422-430.

93. Leblanc, Y. Charge variants characterization of a monoclonal antibody by ion exchange chromatography coupled on-line to native mass spectrometry: Case study after a long-term storage at +5°C./ Y. Leblanc, C. Ramon, N. Bihoreau, G. Chevreux. // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. -2017. -V.1048. -P.130-139.

94. Vlasak, J.. Ionescu, Heterogeneity of monoclonal antibodies revealed by charge-sensitive methods/ J. Vlasak, R. Ionescu// Curr. Pharm. Biotechnol. -2008. -V. 9. -P. 468-481.

95. Yuan, J.J. Isolation and characterization of charge variants of infliximab biosimilar HS626/ J.J. Yuan, D. Gao, F. Hu // J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. -2021. -V.1162. 122485.

96. Pan, H. Methionine oxidation in human IgG2 Fc decreases binding affinities to protein A and FcRn/ H. Pan, K. Chen, L. Chu // Protein Sci. -2009. -V.18. -N2. -P.424-433.

97. Vlasak, J. Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody/ J. Vlasak, M.C. Bussat, S. Wang// Anal Biochem. -2009. -V.392. -N2.-P.145-154.

98. Boune, S. Principles of N-Linked Glycosylation Variations of IgG-Based Therapeutics: Pharmacokinetic and Functional Considerations/ S. Boune, P. Hu, A.L. Epstein, L.A. Khawli// Antibodies (Basel). -2020. -V.9. -N2. -P.22.

99. Maruthamuthu, M. K. Process Analytical Technologies and Data Analytics for the Manufacture of Monoclonal Antibodies / M.K. Maruthamuthu, S.R. Rudge, A.M. Ardekani// Trends in biotechnology. -2020. -V.38. -N1. -P.1169-1186.

100. Liu, L. Antibody glycosylation and its impact on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins/ L. Liu // J. Pharm. Sci. -2015. -V. 104. -P. 1866-1884.

101. Wang, Z. Antibody glycosylation: impact on antibody drug characteristics and quality control/ Z. Wang, J. Zhu, H. Lu // Appl Microbiol Biotechnol. -2020. -V.104. -N5. -P.1905-1914.

102. Ghaderi, D., Zhang, M., Hurtado-Ziola, N., & Varki, A. Production platforms for biotherapeutic glycoproteins. Occurrence, impact, and challenges of non-human sialylation/ D. Ghaderi, M. Zhang, N. Hurtado-Ziola, A. Varki // Biotechnology and Genetic Engineering Reviews. -2012. -V.28. -N1. -P.147-176.

103. Dumont, J. Human cell lines for biopharmaceutical manufacturing: history, status, and future perspectives/ J. Dumont, D. Euwart, B. Mei // Crit Rev Biotechnol. -2016. -V.36. -N6. -P.1110-1122.

104. Wang, X. IgG Fc engineering to modulate antibody effector functions/ X. Wang, M. Mathieu, R.J. Brezski // Protein & cell. -2018. -V. 9. -N1. -P. 63-73.

105. Torkashvand, F. Main Quality Attributes of Monoclonal Antibodies and Effect of Cell Culture Components/ F. Torkashvand, B. Vaziri // Iran Biomed J. -2017. -V.21. -N3. -P. 131141.

106. Guideline on development, production, characterization and specification for monoclonal antibodies and related products [Электронный источник] / URL https://www.ema.europa.eu/en/documents/scientific-guideline/guideline-development-production-characterisation-specification-monoclonal-antibodies-related_en.pdf (дата обращения 10.01.2022)

107. ICH Q6B Specifications: test procedures and acceptance criteria for biotechnological/biological products. [Электронный источник] / URL https://www.ema.europa.eu/en/ich-q6b-specifications-test-procedures-acceptance-criteria-biotechnologicalbiological-products (дата обращения 10.01.2022)

108. Bracewell, D.G. The future of host cell protein (HCP) identification during process development and manufacturing linked to a risk-based management for their control/ D.G. Bracewell, R. Francis, C.M. Smales// Biotechnology and bioengineering. -2015. -V. 112. -N9. -P. 1727-1737.

109. Reiter, K. Host cell protein quantification of an optimized purification method by mass spectrometry/ K. Reiter, M. Suzuki, L.R. Olano, D.L. Narum // Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. -2019. -V.174. -P. 650-654.

110. Zheng, W. Development and Validation of Quantitative Real-Time PCR for the Detection of Residual CHO Host Cell DNA and Optimization of Sample Pretreatment Method in Biopharmaceutical Products / W. Zheng, L. Jiang, Q. Lei// Biol Proced Online. -2019. -V. 21. 17.

111. Wang, X. Molecular and functional analysis of monoclonal antibodies in support of biologics development/ X. Wang, Z. An, W. Luo, N. Xia, Q. Zhao. // Protein Cell. -2018. -V.9. -N1. -P.74-85.

112. Carter-Franklin, J.N. Fragments of protein A eluted during protein A affinity chromatography/ J.N. Carter-Franklin, C. Victa, P. McDonald, R. Fahrner // J Chromatogr A. -2007. -V.1163. -N1-2. -P.105-111.

113. Pinholt, C. The importance of interfaces in protein drug delivery - why is protein adsorption of interest in pharmaceutical formulations? / C. Pinholt, R.A. Hartvig, N.J. Medlicott, L. Jorgensen // Expert Opin Drug Deliv. -2011. -V.8. -N7. -P.949-964.

114. Li, J. Interfacial Stress in the Development of Biologics: Fundamental Understanding, Current Practice, and Future Perspective/ J. Li, M.E. Krause, X. Chen // AAPS J. -2019. -V.21. -N3. 44.

115. Martos, A. Trends on Analytical Characterization of Polysorbates and Their Degradation Products in Biopharmaceutical Formulations/ A. Martos, W. Koch, W. Jiskoot // J Pharm Sci. -2017. -V. 106. -N7. -P.1722-1735.

116. Kamerzell, T.J. Protein-excipient interactions: mechanisms and biophysical characterization applied to protein formulation development/ T.J. Kamerzell, R. Esfandiary, S.B. Joshi // Adv Drug Deliv Rev. -2011. -V.63. -N13. -P.1118-1159.

117. Grabarek, A.D. What Makes Polysorbate Functional? Impact of Polysorbate 80 Grade and Quality on IgG Stability During Mechanical Stress/ A.D. Grabarek, U. Bozic, J. Rousel // J Pharm Sci. -2020, -V. 109. -N1. -P.871-880.

118. Lippold, S. Impact of mono- and poly-ester fractions on polysorbate quantitation using mixed-mode HPLC-CAD/ELSD and the fluorescence micelle assay/ S. Lippold , S.H.S. Koshari, R. Kopf // J Pharm Biomed Anal. -2017. -V.132. -P.24-34.

119. Strobel, A.B. Predicting Leachables Solubilization in Polysorbate 80 Solutions by a Linear Solvation Energy Relationship (LSER)/ A.B.Strobel, T. Egert, P. Langguth // Pharm Res. -2021. -V.38. -N9. -P.1549-1561.

120. Kim, J. Quantitation of low concentrations of polysorbates in high protein concentration formulations by solid phase extraction and cobalt-thiocyanate derivatization/ J. Kim, J. Qiu // Anal. Chim. Acta. -2014. -V.806. -P.144-151.

121. Savjani, N. Use of ferric thiocyanate derivatization for quantification of polysorbate 80 in high concentration protein formulations/ N. Savjani, E. Babcock, H.K. Khor, A. Raghani// Talanta. -2014. -V.130. -P.542-546.

122. Seregin, A.S. Quantification of polysorbate 80 in biopharmaceutical formulations implementing an optimized colorimetric approach / A.S. Seregin, N.V. Orlova, A.D. Askretkov // Tonk. Khim. Tekhnol. = Fine Chem. Technol. -2020. -V.15. -N3. -P.70-77.

123. Askretkov, A.D. Determination of polysorbates by spectrophotometry in drugs based on recombinant proteins/ A.D. Askretkov, P.M. Isaykina, S.A. Cherepushkin, N.V. Orlova // Drug development & registration. 2017. -N3. -P.124-129.

124. Dwivedi, M. Acidic and alkaline hydrolysis of polysorbates under aqueous conditions: Towards understanding polysorbate degradation in biopharmaceutical formulations/ M. Dwivedi, J. Buske, F. Haemmerling // Eur. J. Pharm. Sci. -2020. -V. 144. 105211.

125. Kishore, R.S. Degradation of polysorbates 20 and 80: studies on thermal autoxidation and hydrolysis/ R.S. Kishore, A. Pappenberger, IB. Dauphin // J Pharm Sci. -2011. -V.100. -N2. -P.721-731.

126. Analysis of Tween 80 by high-performance liquid chromatography with diode array detection [Электронный источник] / URL https://lcms.cz/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/5991_9188_EN_Tween80_application_6f677174cd/59919188EN_Tween80_applicatio n.pdf (дата обращения 10.01.2022)

127. Schilling, K. Influence of charged aerosol detector instrument settings on the ultra-highperformance liquid chromatography analysis of fatty acids in polysorbate 80/K. Schilling, R. Pawellek, K. Lovejoy // J Chromatogr A. -2018. -V.1576. -P.58-66.

128. Ilko, D. Fatty acid composition analysis in polysorbate 80 with high performance liquid chromatography coupled to charged aerosol detection/ D. Ilko, A. Braun, O. Germershaus// Eur. J. Pharm. Biopharm. -2015. -V.94. -P. 569-574.

129. Mondal, B. Development of a simple high-performance liquid chromatography (HPLC)/evaporative light scattering detector (ELSD) method todetermine Polysorbate 80 in a pharmaceutical formulation/ B. Mondal, M. Kote, C. Lunagariya, M. Patel// Saudi Pharma. J. -2020. -V.28. -P.325-328.

130. Shende, N. Evaluation of a sensitive GC-MS method to detect polysorbate 80 in vaccine preparation/ N. Shende, A. Karale, S. Bhagade// J Pharm Biomed Anal. -2020. -V.183.113126.

131. Development of a gas chromatography method for determination of polysorbate 80 content in monoclonal antibody preparations [Электронный источник] / URL: https://www.researchgate.net/publication/303765510_Development_of_a_gas_chromatography_ method_for_determination_of_polysorbate_80_content_in_monoclonal_antibody_preparations/c itation/download (дата обращения 10.01.2022)

132. Wei, Z. Universal method for the determination of nonionic surfactant content in the presence of protein/ Z. Wei, S. Bilbulian, J. Li // J Sep Sci. -2015. -V.38. -N8. -P.1318-1325.

133. Tomlinson, A. Polysorbate 20 Degradation in Biopharmaceutical Formulations: Quantification of Free Fatty Acids, Characterization of Particulates, and Insights into the Degradation Mechanism/ A. Tomlinson, B. Demeule, B. Lin, S. Yadav // Mol. Pharmaceutics. -2015. -V.12. -P. 3805-3815.

134. Liu, H. Characterization of Polysorbate 80 by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry to Understand Its Susceptibility to Degradation and Its Oxidative Degradation Pathway/ H. Liu, Y. Jin, R. Menon // J Pharm Sci. -2022. -V.111. -N2. -P.323-334.

135. Oszi, Z. Quantitative determination of polysorbate 20 in nasal pharmaceutical preparations by high-performance liquid chromatography/ Z. Oszi, G. Petho// J Pharm Biomed Anal. -1998. -V.18. -N4-5. -P. 715-720.

136. Adamo, M. A simple reversed phase high-performance liquid chromatography method for polysorbate 80 quantitation in monoclonal antibody drug products / M. Adamo, L.W. Jr Dick, D. Qiu// J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. -2010. -V.878. -N21. -P.1865-1870.

137. Degterev, M.B. A development of high-throughput HPLC method for the polysorbate 80 quantitation in protein therapeutic products / M.B. Degterev, R.A. Badaukayte, R.R Shukurov// J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. -2019. -V.1133.121847.

138. Патент W02019117750, 20.06.2019. Дегтерев М.Б. Способ измерения количества полисорбата-80 с применением щелочного гидролиза образца с последующей ВЭЖХ

139. Гроховский, В.И. Определение полисорбатов в биотехнологических препаратах/ B.B. Гроховский, А.А. Бендрышев, С.В. Швец// Разработка и регистрация лекарственных средств. -2017. -Т.2. -N19. -C 160-165.

140. Hu, M. High-performance liquid chromatographic determination of polysorbate 80 in pharmaceutical suspensions/ M. Hu, M. Niculescu, X.M. Zhang, A. Hui // J. Chromatogr. A. -2003. -V.984. -P. 233-236.

141. Sissolak, B. Impact of mammalian cell culture conditions on monoclonal antibody charge heterogeneity: an accessory monitoring tool for process development/ B. Sissolak, N. Lingg, W. Sommeregger// J Ind Microbiol Biotechnol. -2019. -V.46. -P. 1167-1178.

142. Füssl, F. Charge Variant Analysis of Monoclonal Antibodies Using Direct Coupled pH Gradient Cation Exchange Chromatography to High-Resolution Native Mass Spectrometry/ F. Füssl, K. Cook, K. Scheffler // Anal Chem. -2018. -V.90. -N7. -P.4669-4676.

143. Hosken, B. D. Isolation and Characterization of Monoclonal Antibody Charge Variants by Free Flow Isoelectric Focusing/ B.D. Hosken, C. Li, B. Mullappally// Analytical Chemistry. -2016. -V.88. -N11. -P. 5662-5669.

144. Turner, A. Qualification of NISTmAb charge heterogeneity control assays/ A. Turner, J.E. Schiel // Analytical and Bioanalytical Chemistry. -2018. -V. 410. -N8. -P. 2079-2093.

145. Carillo, S. Comparing different domains of analysis for the characterisation of N-glycans on monoclonal antibodies/ S. Carillo, R. Pérez-Robles, C. Jakes // J Pharm Anal. -2020. -V.10. -N1. -P.23-34.

146. Szabo, Z. In-depth analyses of native N-linked glycans facilitated by high-performance anion exchange chromatography-pulsed amperometric detection coupled to mass spectrometry/ Z. Szabo, J. Thayer, Y. Agroskin // Anal Bioanal Chem. -2017. -V.409. -P.3089-3101 (2017).

147. Zhang, L. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins/ L. Zhang, S. Luo, B. Zhang // MAbs. -2016. -V.8. -N2. -P.205-215.

148. Melmer, M. HILIC analysis of fluorescence-labeled N-glycans from recombinant biopharmaceuticals/ M. Melmer, T. Stangler, M. Schiefermeier// Anal Bioanal Chem. -2010. -V.398. -N2. -P.905-914.

149. Kotsias, M. Method comparison for N-glycan profiling: Towards the standardization of glycoanalytical technologies for cell line analysis/ M. Kotsias, A. Blanas, S.J. van Vliet// PLoS One. -2019. -V.14. -N10. e0223270.

150. Xing, Z.Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production/ Z. Xing, B. Kenty, I. Koyrakh // Process Biochem. -2011. -V. 46. -N7. -P.1423-1429.

151. Wurm, F.M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells/ F.M. Wurm // Nat. Biotechnol. -2004. -V.22. -N11. -P. 1393-1398.

152. Kishishita, S. Optimization of chemically defined feed media for monoclonal antibody production in Chinese hamster ovary cells/ S. Kishishita, S. Katayama, K. Kodaira // J Biosci Bioeng. -2015. -V.120. -N1. -P.78-84.

153. Altamirano, C. Analysis of CHO cells metabolic redistribution in a glutamate-based defined medium in continuous culture /C. Altamirano., A. Illanes, A. Casablancas // Biotechnol. Prog. -2001. -V. 17. -N6. -P.1032-1041.

154. Denoroy, L. Analysis of Amino Acids and Related Compounds by Capillary Electrophoresis/ L. Denoroy, S. Parrot // Separation & Purification Reviews. -2016. -V.46. -N2. -P. 108-151.

155. Behjousiar, A. In situ monitoring of intracellular glucose and glutamine in CHO cell culture/ A. Behjousiar, C. Kontoravdi, K.M. Polizzi // PLoS One. -2012. -V. 7. -N4. Article e34512.

156. Frahm, B. Improving bioreactor cultivation conditions for sensitive cell lines by dynamic membrane aeration/ B. Frahm, H. Brod, U. Langer // Cytotechnology. -2009. -V.59, -N1.-P. 1730.

157. Genzela, Y. Amino acid analysis in mammalian cell culture media containing serum and high glucose concentrations by anion exchange chromatography and integrated pulsed amperometric detection/ Y. Genzela, S. Koniga, U. Reichla // Anal. Biochem. -2004. -V335. -N 1. P. 119-125.

158. Hanko, V. P. Determination of amino acids in cell culture and fermentation broth media using anion-exchange chromatography with integrated pulsed amperometric detection/ V.P. Hanko, A. Heckenberg, J.S. Rohrer // Journal of biomolecular techniques. -2004. -V.15. -N4. -P. 317-324.

159. Macchi F.D., Shen F.J., Keck R.G., Harris R.J. Amino acid analysis, using postcolumn ninhydrin detection, in a biotechnology laboratory / Amino Acid Analysis Protocols. Methods in Molecular Biology / Eds. Alterman M.A., Hunziker P. London: Springer, 2012. 455 p.

160. Fan Y., Del Vall J., Muller C. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation / Y. Fan, J. Del Vall., C. Muller // Biotechnol. Bioeng. -2015. -V.112. -N3. P. 521-.535.

161. Zhang, M. Optimization of a Precolumn OPA Derivatization HPLC Assay for Monitoring of l-Asparagine Depletion in Serum during l-Asparaginase Therapy/ M. Zhang, Y. Zhang, S. Ren // J Chromatogr Sci. -2018. -V.56. -N9. -P.794-801

162. Dietzen, D.J. Rapid comprehensive amino acid analysis by liquid chromatography/tandem mass spectrometry: comparison to cation exchange with post-column ninhydrin detection/ D.J. Dietzen, A.L. Weindel, M.O. Carayannopoulos// Rapid Commun Mass Spectrom. -2008. -V.22. -N22. -P.3481-3488.

163. Schwarza E.L., Robertsa W.L., Pasqualia M. Analysis of plasma amino acids by HPLC with photodiode array and fluorescence detection / E.L. Schwarza., W.L. Robertsa, M. Pasqualia// Clin. Chim. Acta. -2005. -V.354. -N1-2. -P. 83-90.

164. Callejon, R.M. HPLC determination of amino acids with AQC derivatization in vinegars along submerged and surface acetications and its relation to the microbiota / R.M. Callejon, W. Tesfaye, M.J. Torija// Eur. Food Res. Technol. -2008. -V. 227. -N 1. -P. 93-102.

165. Hernandez-Orte, P. Amino acid determination in grape juices and wines by HPLC using a modification of the 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) method / P. Hernandez-Orte, M.J. Ibarz, J. Cacho, V. Ferreira // Chromatographia. -2003. -V. 58. -N 1-2. -P. 29-35.

166. Dahl-Lassen, R. High-throughput analysis of amino acids in plant materials by single quadrupole mass spectrometry / R. Dahl-Lassen., J. van Hecke, H. J0rgensen // Plant Methods. -2018. -V. 14. -№ 8.

167. Zeng, F. Determination of 21 free amino acids in fruit juices by HPLC using a modification of the 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl carbamate (AQC) method. / F. Zeng, J. Ou, Y. Huang //Food Anal. Methods. -2015. -V. 8. -N 2. P. 428-437.

168. Brooks, J.W. Achieving Optimal mAb Titer and Quality Through Cell Culture Media and Supplement Optimization/ J.W. Brooks, T. O'Brien, N.S. Dosanjh, E. Gramiccioni // BioPharm International. -2016. -V.29. -N11.-P. 24-28.

169. Ambrogelly, A. Characterization of antibody variants during process development: the tale of incomplete processing of N-terminal secretion peptide/ A. Ambrogelly, Y.H. Liu, H. Li // MAbs. -2012. -V.4. -N6. -P.701-709.

170. Domínguez, M. Quantitation of monoclonal antibody by capture ELISA based on initial enzyme activity rate/ M. Domínguez, I. Moreno, A. Toraño // Journal of immunological methods. -2019. -V.474. N112645.

171. Regl, C., Wohlschlager, T., Esser-Skala, W. Dilute-and-shoot analysis of therapeutic monoclonal antibody variants in fermentation broth: a method capability study/ C. Regl, T. Wohlschlager, W. Esser-Skala // mAbs. -2019. -V.11. -N3. -P. 569-582.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. Заключение о возможности открытого

опубликования

Экспертная комиссия ООО «Фармапарк» в составе:

Председатель комиссии: Сорокина Татьяна Сергеевна Заместитель директора но науке ООО «ФАРМАПАРК»

Члены комиссии:

Орлова Наталья Владимировна, к.б.н. - Начал!,ник сектора контроля качества департамента экспериментального производства ООО «ФАРМА11АРК» Лобанова Наталья Валентиновна, к.б.н. - Начальник сектора культивирования департамента экспериментального 11 роизвидства ООО «ФАРМАПАРК» в период с «01» марта 2022 но «10» марта 2022 провела экспертизу материалов Диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук на тему «Разработка и вадидация методов контроля качества экулизумаба в процессе биотехнологического производства» Аскреткова Александра Дмитриевича па предмет отсутствия (наличия) в них сведений, составляющих государственную тайну, материалов «Для служебного пользования», коммерческой тайны и возможности (невозможности) их открытого опубликования. Руководствуясь Законом Российской Федерации «О государственной тайне», Перечнем сведений, отнесенных к государственной тайне, утвержденным Указом Президента РФ от 30,11.1995 № 1203. а также Перечнем сведений, подлежащих засекречиванию. Министерства образования и

УТВЕРЖДАЮ

Директор по науке

ЗАКЛЮЧЕНИЕ о возможности открытого опубликования

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Проект НД на субстанцию

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Номер реестровой записи №_

Дата внесения в государственный реесгр лекарственных средств «_»__20_г.

ООО «ФАРМАПАРК», Россия 117246, г. Москва, Научный проезд, д. 8, стр. 1

(наименование юридического лица, на имя которого выдано решение о внесении фармацевтической субстанции в государственный реестр лекарственных средств, адрес)

НОРМАТИВНАЯ ДОКУМЕНТАЦИЯ

Экулизумаб

(тор гон о с наименование фармацевтической субстанции)

Экулизумаб

(международное непатентованное или группировочиое, или химическое наименование)

Субстанция-раствор

(физическое состояние субстанции)

ПРОИЗВОДИТЕЛЬ

ООО «ФАРМАПАРК», РОССИЯ

ФАСОВЩИК (ПЕРВИЧНАЯ УПАКОВКА) ООО «ФАРМАПАРК», РОССИЯ

УПАКОВЩИК (ВТОРИЧНАЯ (ПОТРЕБИТЕЛЬСКАЯ) УПАКОВКА) ООО «ФАРМАПАРК», РОССИЯ

ВЫПУСКАЮЩИЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ООО «ФАРМАПАРК», РОССИЯ

С. 2

СПЕЦИФИКАЦИЯ

Экулизумаб, Субстанция-раствор ООО «ФАРМАГ1АРК», Россия

Показатели Методы Нормы

Описание Визуальный Бесцветная, прозрачная или оп алее пирующая жидкость

Подлинность 11ептидное картирован^ Профиль хроматограммы испытуемого раствора должен соответствовать профилю хроматограммы стандартного раствора

Капиллярное изоэл ектри ческое фокусирование На электрофореграмме испытуемого раствора должны обнаруживаться: - один основной пик и группа предпиков (щелочные изоформы), суммарное относительное содержание которых не менее 50,0 %;

Иммуноферментный анализ Субстанция должна обладать специфической активностью

Прозрачность ГФ РФ. визуальный Субстанция должна иметь степень опалесцснцип не более эталона сравнения IV

Цветность ГФ РФ, визуальный Субстанция должна быть бесцветной по сравнению с водой

рН ГФ РФ. потенциометр и чес кий От 4,8 до 5,5

Чистота Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии натрия до децилсул ьфата в восстанавливающих условиях Суммарная интенсивность всех дополнительных полос не более 1,5 %

с. з

Показатели Методы Нормы

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии натрия додецилеульфатав невоестанавливаюишх условиях Интенсивность полосы агрегатов не более 1.5 %: Суммарная интенсивность всех дополнительных окрашенных полос не более 5,0 %.

ВЭЖХ, гель-фильтрация Относительное содержание мономера Экулизумаба не менее 95,0 %

Капиллярное изоэлектрическое фокусирование На электрофорсграм.че испытуемого раствора в диапазоне р! 5,5 - 7,0 не обнаруживаются посторонние пики, за икслючением пиков р! маркеров, а также Экулизумаба (pi 5,5 - 6,5)

ГликановьШ профиль Нормаль но-фазовая ВЭЖХ На хроматограммс испытуемого раствора должны наблюдаться пики гликанов с относительным с одержан ием: G0-N от 0,0 до 5,0 %; G0F-N от 0,0 до 11,0%; G0 от 0,0 до 11,0%; G0F от 40,0 до 85,0 %; Мап5 от 0,0 до 14,0 %; GIF от 4,0 до 35,0%; G2F от 0,0 до 10,0%.

Остаточные белки клетки-хбзяина ИМИуноферментныи анализ Не более 100 нг/мг белка

Остаточная ДНК штам м а-проду цента ПЦР в реальном времени Не более 0,3:3 пг/мг белка

Остаточный белок А Иммуноферментный анализ Не более 10 пг/мг белка

Стерильность ГФ РФ, метод мембранной фильтрации Субстанция должна быть стерильной

¡Бактериальные Эндотоксины ГФ РФ. качественный анализ (метод А) 11е более 0.08 ЕЭ/мг белка

Аномальная токсичность ГФ РФ, биологический Субстанция должна быть нетоксичной

Белок ГФ РФ. с п е ктроф ото метрический Не менее 10,5 мг/мл

С. 4

Показатели Методы Нормы

Полнсорбат НО Обращенно-фазовая ВЭЖХ От 0,15до 0,30 мг/мл

Специфическая активность Иммуноферментный анализ От 150 ООО до 200 000 ЕС/мг белка

Упаковка В стерильных контейнерах из полиэтилентерефтапатгликоля с резьбовым колпачком из полиэтилена высоко)! плотности; • по 100 мл в контейнерах вместимостью 125 мл На контейнер наклеивают этикетку самоклеящуюся нз полиэстера или бумаги этикеточно п.

Маркировка В соответствии с НД

Транспортированпс При температуре от 2 до 8 "С

Хранение При температуре от 2 до К "С

Срок годности 6 месяцев

ПРИЛОЖЕНИЕ 3 Акт внедрения в учебный процесс ФГБОУ ВО «МИРЭА-Российский технологический университет»

ПРИЛОЖЕНИЕ 4 Акт внедрения в учебный процесс ФГБВОУ ВО военно-медицинской академии имени С.М. Кирова»

АКТ ВНЕДРЕНИЯ

результатов диссертационного исследования Аскреткова Александра Дмитриевича в учебный процесс Военно-медицинской академии имени С.М. Кирова

Комиссия Воснно-медицинской академии имени С.М. Кирова в составе: председателя заведующего кафедрой фармации, доктора фармацевтических наук, профессора МИРОШНИЧЕНКО Ю.В., и членов: профессора кафедры организации обеспечения медицинским имуществом войск (сил), доктора фармацевтических наук, профессора УМАРОВА С.З. доцента кафедры фармации кандидата фармацевтических наук, доцента El 1ИКЕЕВО! [ P.A., доцента кафедры фармации, кандидата фармацевтических наук КЛИМКИНОИ Е.А., составила настоящий аю в том, что результаты диссертационного исследования по разработке и валцдации методов контроля качества экулизумаба в процессе биотехнологнческого производства, выполненного аспирантом кафедры Биотехнологии и промышленной фармации РТУ МИРЭА Аскретковым А.Д.. используются при разработке учебно-методических материалов для обеспечения учебного процесса и проведении лекций, семинаров, практических занятий с курсантами и студентами, обучающимися специальности «Фармация» в рамках дисциплин «Биотехнология».

Объектом внедрения является методика контроля гликанового профиля, предназначенная дня анализа профиля гликозилирования moiюклопальных антител (в т.ч. в лекарственном препарате экулизумаб). Суть методики приведена ниже.

Очистка и дег л и коз ! LT и ро ва ш te из культура ль ной жидкости: центрифужную колонку Protein A HP Spinirap (Cytiva) центрифугируют при 6000 об/мин в течение'10 секунд, промывают 500 мкл фосфатным буферным раствором и наносят объем культуральной жидкости, содержащий 100 мкг экулизумаба, после инкубирования в течение 2 минут, колонку центрифугируют, промывают дважды по 500 мкл фосфатным буферным раствором, затем прибавляют 60 мкл однократного буферного раствора для деглюгозилирования и инкубировуют при 65 °С в течение 10 минут, прибавляют 1 мкл герм оста бил ь ной N-г.] и коз и лазы, суспензию перемешивают па вибромешалкс и инкубируют при 50 °С в течение 20 минут, после чего центрифугируют. К элюату прибавляют 150 мкл этанола, перемешивают и центрифугирую! при 10000 об/мин в течение 5 минуту

Очистка и дегликозилирован ие экулизумаба из субстанции: к 10 мкл образца белка (содержание 10 мг/мл) прибавляют 2.4 мкл 5Х буферного раствора для дегликозилирования (поставляется в наборе с быстрой N-г.гикозидазой) и I мкл N-гликозидазы. Смесь

УТВЕРЖДАЮ

«

» ноября 202 ! I.

г. Санкт-Пстсрбур!

перемешивают и инкубируют при 50 °С в течение 20 минут. 1 [риоавляют 40 мкл этанола, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 5 минут.

Профподготовка образцов: супернатант отбирают в чистую пробирку и упаривают на вакуумном коннентпатпп^ RVP 9-tR uri пп» —------лл о,- ________^_______ .

дер и наги з иру ю ] не го реагента (0,36 М 2-аминобензамид, I М пиколинборан в смеси уксусная кислота/диметилсульфоксид 3/7 у/у), перемешивают для солюбилизации гликанов и инкубируют при 65 °С в течение 60 минут. HLB картриджи кондиционируют I мл ацетонитрила с последующей промывкой одной порцией 95 % ацетонитрила по I мл. Раствор гликанов от дериватизации смешивают с 15 мкл 50 % ацетонитрила и вносят в колонки, содержащие I мл 95 % ацетонитрила. с последующим медленным пропусканием раствора через сорбент. Далее колонки промывают двумя порциями 95 % ацетонитрила по I мл. Элюирование глнканов осуществляют 2 х 0.25 мл 50 % ацетонитрила. К 100 мкл элюата прибавляют 150 мкл ацетонитрила и помещают в виалы для ВЭЖХ.

Анализ осуществляли на колонке Accucore 150 Amide HILIC с геометрическими размерами 250*2,1 мм. с диаметром частиц 2.6 мкм и размером пор 150 Л (Thermo Fisher Scientific, США), при температуре 30 °С, постоянной скорости потока элюента 0 5 ял/мин и Флуоримстрическом детектировании (Яйх=320нм. >.ет-420 нм) по программе градиентного элюирования приведенной в таблице (элюент А - ацетон трил, элюент Б 20 мМ аммония формиат pi I 4,4). Объем инжекции образца составляет 20 мкл.

Предложенная методика контроля гликанового профиля, предназначенная для анализа профиля гликозилировання моноклональных антител и программа градиентного элюирования внедрены в материалы рабочей программы дисциплины «Биотехнология» для обучения курсантов и студентов 5-го курса, что повышает качество профессиональной подготовки слушателей академии по вопросам производства и контроля качества биологических препаратов.

И т ер

Программа градиентного элюирования

разработанной методики

Доктор фармацевтических па;

Доктор фармацевтических наук, профессор Кандидат фармацевтических наук, доцент Кандидат фармацевтических наук, доне fit

ПРИЛОЖЕНИЕ 5 Акт внедрения в процесс контроля качества субстанции экулизумаб ООО «Фармапарк»

УТВЕРЖДАЮ

Генеральный директор

Акт внедрения

Об использовании результатов диссертационной работы аспиранта ФГЬОУ ВО «Российский технологический университет - МИРЭА» А с кротко на Александра Дмитриевича на тему «Разработка и валидация методов контроля качества экулизумаба в процессе биотехнологического производства» по специальности 3.4.2- Фармацевтическая химия, фармакогнозия. Комиссия it составе:

Председатель комиссии - Серёгин Юрий Александрович, к.б.н. Директор но науке ООО «ФАРМАПАРК» Члены комиссии:

Сорокина Татьяна Сергеевна Заместитель директора по пауке ООО «ФАРМАПАРК»

Орлова Наталья Владимировна, к.б.н. — Начальник сектора контроля качества департамента 'экспериментального произнодстна ООО «ФАРМАПАРК» Воронина Екатерина Владимировна, к.б.н. — Начальник сектора

Ш Ш1ШШ рова1 [ия_департамента экспериментального производства (ХК )

«ФАРМАПАРК»

составили настоящий акт о том, что материалы кандидатской диссертации Аскреткова Александра Дмитриевича на тему «Разработка и валидация методов контроля качества экулизумаба в процессе б иотехн ол о г и чеекого производства»

используются в деятельности ООО «ФАРМАГ1АРК» при производстве п контроле качества субстанции рекомбинантного моноклинального антитела зкулнзумаб.

11редседатель комиссии: Директор по науке

ООО «ФАРМА11АРК». к.б.п.

Члены комиссии: Заместитель директора по науке

' 1ачальнпк сектора контроля качества

Сорокина Т.С.

де нартамепта экспериментталыюго и ро из вод с г на ООО «ФЛРМЛПАРК». к.б. 11.

Орлова ! 1.В.

Начальник сектора культивирования

департамента экспериментального производства

ООО ФЛРМЛПАРК. к.б.п.

оронина Е.В

'/ Ч'-у^Гумцп^ (Л .

ПРИЛОЖЕНИЕ 6 Акт внедрения в процесс контроля качества субстанции экулизумаб АО «ИФТ»

ПРИЛОЖЕНИЕ 7 Результаты оценки стабильности

субстанции экулизумаб в условиях естественного хранения

Показатель Спецификация Точка, мес

0 3 6 9 12 18 24

Серия № 1

Профиль заряженных форм Основная форма + щелочные формы > 50 76,7 76,4 75,8 76,1 75,7 73,9 73,3

Кислые формы < 50 23,3 23,6 24,2 23,9 24,3 26,1 26,7

Полисорбат 80 От 0,15 до 0, 30 мг/мл 0,22 0,22 0,22 0,21 0,20 0,20 0,20

Гликановый профиль G0-N от 0,0 до 5 % 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

G0F-N от 0,0 до 11 % 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

G0 от 0,0 до 11 % 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

G0F от 40,0 до 85 % 76,0 75,6 78,9 71,9 76,6 78,9 75,5

Мап5 от 0,0 до 14,0 %; 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2

G1F от 4,0 до 35,0 %; 14,6 14,7 13,7 15,2 15,2 13,6 15,1

G2F от 0,0 до 10,0 %. 1,7 1,7 1,7 1,7 1,6 1,7 1,7

Серия № 2

Профиль заряженных форм Основная форма + щелочные формы > 50 74,7 74,9 74 74,1 73,7 72,3 70,6

Кислые формы < 50 25,3 25,1 26 25,9 26,3 27,7 29,4

Полисорбат 80 От 0,15 до 0, 3 мг/мл 0,23 0,22 0,22 0,22 0,22 0,21 0,19

Гликановый профиль G0-N от 0,0 до 5 % 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

G0F-N от 0,0 до 11 % 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

G0 от 0,0 до 11 % 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

G0F от 40,0 до 85 % 74,2 73,9 75,8 76,2 74,6 72,9 73,8

Мап5 от 0,0 до 14,0 %; 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,3 1,4

G1F от 4,0 до 35,0 %; 13,1 13,8 13,3 14,0 12,6 13,3 13,3

G2F от 0,0 до 10,0 %. 1,5 1,5 1,5 1,4 1,4 1,5 1,6

Серия № 3

Профиль заряженных форм Основная форма + щелочные формы > 50 76,6 76,1 76,3 75,5 75,7 74,2 73,3

Кислые формы < 50 23,4 23,9 23,7 24,5 24,3 25,8 26,7

Полисорбат 80 От 0,15 до 0,30 мг/мл 0,21 0,21 0,21 0,21 0,20 0,20 0,20

Гликановый профиль G0-N от 0,0 до 5 % 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

G0F-N от 0,0 до 11 % 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

G0 от 0,0 до 11 % 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

G0F от 40,0 до 85 % 71,2 70,6 69,7 74,3 69,9 74,0 72,1

Мап5 от 0,0 до 14,0 %; 1,5 1,6 1,4 1,6 1,5 1,5 1,5

G1F от 4,0 до 35,0 %; 10,7 11,0 10,7 11,4 10,9 11,1 10,6

G2F от 0,0 до 10,0 %. 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,2 1,0

ПРИЛОЖЕНИЕ 8 Результаты оценки стабильности

субстанции экулизумаб в условиях ускоренного хранения

Показатель Спецификация Точка, мес

0 1 3 6 9 12 18

Серия № 1

Основная

Профиль заряженных форм форма + щелочные формы > 50 76,7 75,1 73,3 71,8 69,9 68 62,0

Кислые формы < 50 23,3 24,9 26,7 28,2 30,1 32 38,0

Полисорбат 80 От 0,15 до 0, 30 мг/мл 0,22 0,22 0,21 0,21 0,20 0,19 0,19

G0-N от 0,0 до 5 % 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

G0F-N от 0,0 до 11 % 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Гликановый профиль G0 от 0,0 до 11 % 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

G0F от 40,0 до 85 % 76,0 74,9 74,2 75,5 78,0 73,9 78,3

Мап5 от 0,0 до 14,0 %; 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2 1,2

G1F от 4,0 до 35,0 %; 14,6 15,0 14,5 14,5 14,7 14,7 14,7

G2F от 0,0 до 10,0 %. 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7

Серия № 2

Основная

Профиль заряженных форм форма + щелочные формы > 50 74,7 73,9 72 69,6 67,7 64,3 60,2

Кислые формы < 50 25,3 26,1 28 30,4 32,3 35,7 39,8

Полисорбат 80 От 0,15 до 0,30 мг/мл 0,23 0,23 0,22 0,21 0,21 0,21 0,21

G0-N от 0,0 до 5 % 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

G0F-N от 0,0 до 11 % 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Гликановый профиль G0 от 0,0 до 11 % 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

G0F от 40,0 до 85 % 74,2 73,2 71,5 74,0 75,9 76,1 73,1

Мап5 от 0,0 до 14,0 %; 1,4 1,5 1,5 1,3 1,4 1,4 1,4

G1F от 4,0 до 35,0 %; 13,1 12,8 13,5 13,0 12,9 13,6 13,7

G2F от 0,0 до 10,0 %. 1,5 1,5 1,5 1,4 1,5 1,5 1,5

Серия № 3

Основная

Профиль заряженных форм форма + щелочные формы > 50 76,6 73,8 71,5 70,7 68,9 66,8 62,9

Кислые формы < 50 23,4 26,2 28,5 29,3 31,1 33,2 37,1

Полисорбат 80 От 0,15 до 0, 30 мг/мл 0,21 0,21 0,20 0,20 0,20 0,19 0,19

G0-N от 0,0 до 5 % 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

G0F-N от 0,0 до 11 % 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3 0,3

Гликановый профиль G0 от 0,0 до 11 % 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4 0,4

G0F от 40,0 до 85 % 71,2 72,1 68,0 68,9 70,3 69,8 73,1

Мап5 от 0,0 до 14,0 %; 1,5 1,6 1,4 1,5 1,5 1,6 1,6

G1F от 4,0 до 35,0 %; 10,7 10,7 10,8 11,0 10,9 10,8 11,0

G2F от 0,0 до 10,0 %. 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1 1,1