Разработка высокочувствительной методики качественного определения гибридного белка эритропоэтина, слитого с Fc - частью иммуноглобулина G человека (ЭПО-Fc), в образцах сыворотки крови с целью антидопингового контроля тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.02, кандидат наук Постников, Павел Викторович

• Постников, Павел Викторович
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Постников, Павел Викторович

СОДЕРЖАНИЕ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

1 Аналитический обзор литературных данных

1.1 Гибридные Бе-белки с терапевтической активностью

1.2 Строение, получение и свойства ЭПО-Бе

1.3 Механизм связывания Бе-гибридов с БеКп-рецептором

1.4 Механизм БеКд-опосредованного рециклирования и трансцитоза и Бе-содержащих белков

1.5 Сайты взаимодействия молекул IgG с СЦ компонентом системы комплемента и FcyR-рецепторами

1.6 Регуляция ^О-БеКл взаимодействия и направленная Бе-инженерия

1.7 Методы идентификации гибридных белков ЭПО-Бе в современном допинг-контроле

1.7.1 Полиакриламидный гель-электрофорез в присутствии

додецилсульфата (БОБ-РАОЕ) и лаурилсаркозината ^АЯ-РАОЕ) натрия

1.7.2 Полиакриламидный гель-электрофорез с изоэлектрическим фокусированием (1ЕЕ-РАОЕ)

1.7.3 20 - электрофорез ЭПО-Ее

1.7.4 Связывание ЭПО-Ее белками А и G, иммобилизованными на магнитных частицах с последующим количественным определением Ее-гибрида в элюате методом ИФА

2 Материалы и методы

2.1 Основное/вспомогательное оборудование, материалы, реагенты для

идентификации запрещенного эритропоэз-стимулирующего агента - ЭПО-Fc методами IEF/SDS/SAR-PAGE

2.1.1 Средства измерений

2.1.2 Испытательные средства

2.1.3 Вспомогательное оборудование

2.1.4 Химические реактивы и материалы

2.1.4.1 Исследуемые соединения

2.1.4.2 Реактивы

2.1.4.3 Материалы

2.2 Приготовление растворов и буферов

2.3 Формирование полиакриламидного геля

2.4 Приготовление образцов контроля качества

2.4.1 Отрицательный контрольный образец сыворотки (бланк)

2.4.2 Положительный контрольный образец сыворотки

2.4.3 Положительный контроль - а-, fí-рЭПО

2.4.4 Положительный контроль - Аранесп (Дарбепоэтин-альфа, NESP)

2.4.5 Положительный контроль - CERA (Mircera, метокси-полиэтиленгликольэпоэтин-бета)

2.4.6 Положительный контроль - ЭПО-Fc

2.5 Методы

2.5.1 Иммуноаффинная очистка ЭПО-Fc

2.5.2 Изоэлектрическое фокусирование EPO-Fc

2.5.3 SDS/SAR-PAGE электрофорез EPO-Fc

2.5.4 Двойной Вестерн блотинг и визуализация

2.5.5 Определение различий в электрофоретической подвижности ЭПО-Fc до и после обработки IdeS-протеазой по сравнению с белками сыворотки крови методом SDS-PAGE

2.5.6 Подбор оптимального фермента для гидролиза ЭПО-Ее

2.5.7 Идентификация ЭПО^с в образцах сыворотки крови и подбор оптимальных условий гидролиза IdeS-протеазой

2.5.8 Триптическое расщепление ЭПО-Ее в растворе

2.5.9 Выделение Ее-части из раствора, содержащего продукты гидролиза ЭПО-Ее Мв8-протеазой

2.5.10 Сверхэффективная жидкостная хроматография - тандемная масс-спектрометрия высокого разрешения Ее-части молекулы ЭПО-Ее

3 Результаты и обсуждение

3.1 Выбор фермента для гидролиза ЭПО-Бе

3.2 Анализ возможных причин неудовлетворительного изоэлектрического разделения ЭПО-Бе

3.3 Характеризация электрофоретических профилей ЭПО-Бе после ИеБ-гидролиза методами КБ/БОБ/БАК-РАОЕ

3.4 Определение оптимальных условий гидролиза ЭПО-Бе

3.5 Методика идентификации ЭПО-Бе методом 1ЕБ-РАОЕ с последующим двойным Вестерн блоттингом и хемилюминесцентной детекцией сигнала (полный текст)

3.5.1 Пробоподготовка образцов сыворотки крови

3.5.2 Гидролиз в присутствии Ыв$> протеазы

3.5.3 Формирование полиакриламидного геля с градиентом рН 2-6

3.5.4 Проведение испытания

3.5.5 Интерпретация и представление данных

3.6 Валидация основных метрологических характеристик качественного определения ЭПО^ в образцах сыворотки крови

3.6.1 Специфичность определения

3.5.2 Предел обнаружения

3.5.3 Влияние матрицы на изоэлектрическое разделение ЭПО-Ее

3.5.4 Степень извлечения

3.5.5 Стабильность при хранении образцов

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ В тексте диссертации приняты следующие обозначения и сокращения:

- БСА - бычий сывороточный альбумин;

- ВАДА - Всемирное антидопинговое агентство;

- ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

- ДТТ - D, L-дитиотреитол;

- ИФА - иммуноферментный анализ;

- КОЕэ - эритроидная колониеобразующая единица;

- МЕ - международная единица;

- МОПС - 3-морфолинпропансульфоновая кислота;

- ОМ - обезжиренное сухое молоко;

- ПААГ - полиакриламидный гель;

- ПАВ - поверхностно-активное вещество;

- ПФ - подвижная фаза;

- рЭПО - рекомбинантный эритропоэтин;

- СВЭЖХ-МСВР - сверэффективная жидкостная хроматография-масс-спектрометрия высокого разрешения;

- СП - сигнальный пептид;

- ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин;

- ФБ - фосфатный буфер;

- ЭПО - эритропоэтин;

- ЭПО-р - рецептор к эритропоэтину;

- ЭСА - эритропоэз-стимулирующие агенты;

- эЭПО - эндогенный эритропоэтин;

- ADCC (Antibody-depend cell-mediated cytotoxity) - антителозависимая клеточная цитотоксичность;

- Ala (Alanine) - аланин, аминокислота;

- Asn (Asparagine) - аспарагин, аминокислота;

- Arg (Arginine) - аргинин, аминокислота;

- Asp (Aspartic acid) - аспарагиновая кислота, аминокислота;

- ВНК клетки (Baby hamster kidney) - клетки почек детенышей хомячка;

- @2m - в2-микроглобулин;

- BRP (Biological reference preparation) - стандартный биологический образец рекомбинантного эритропоэтина Европейской Фармакопеи (эквимолярная смесь эпоэтинов а- и в-);

- CDC (Complement-dependent cytotoxity) - комплемент-зависимая цитотоксичность;

- CERA (Continious erythropoietin receptor activator, Mircera™) - активатор рецепторов эритропоэтина пролонгированного действия, препарат рекомбинантного эритропоэтина;

- CHAPS (3-[(3-cholamido-propyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate) -детергент, препятствующий агрегации биологических макромолекул;

- CHO-клетки (Chinese hamster ovary cells) - клетки яичника китайского хомячка;

- CpB (Carboxypeptidase B) - карбоксипептидаза B;

- CTLA4 (Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen) - цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный белок 4;

- Cys (Cysteine) - цистеин, аминокислота;

- EMA (European medicine agency) - Европейское медицинское агентство;

- EGFR (Receptor of epidermal growth factor) - рецептор эпидермального фактора роста;

- FDA (Food and Drug Administration) - Агентство США по надзору в сфере медицинских препаратов и пищевых продуктов;

- Fc (Fragment crystallizable) - кристаллизуемый константный фрагмент иммуноглобулина;

- FSH (Follicle stimulating hormone) - фолликул-стимулирующий гормон;

- Gly (Glycine) - глицин, аминокислота;

- GLP-1 (Glucagon-like peptide-1) - глюкагоноподобный пептид;

- Glu (Glutamic acid) - глутаминовая кислота, аминокислота;

7

- GlcNAc - ^-ацетилглюкозамин;

- JAK2 (Janus kinase 2) - специфическая тирозинкиназа (янус-киназа 2);

- hGH (Human growth hormone) - человеческий гормон роста;

- His (Histidine) - гистидин, аминокислота;

- IEF-PAGE (Isoelectric focusing polyacrylamide gel electrophoresis) -полиакриламидный гель-электрофорез c изоэлектрическим фокусированием;

- IgG - иммуноглобулин G;

- IGF-1 (Insulin-like growth factor) - инсулиноподобный фактор роста;

- IL-2 (Interleukin) - интерлейкин-2;

- Ile (Isoleucine) - изолейцин, аминокислота;

- IPG (Immobilized pH gradient) - иммобилизованный градиент рН;

- ISL (International Standart for Laboratories) - Международный стандарт для лабораторий;

- Leu (Leucine) - лейцин, аминокислота;

- LFA (Lymphocyte Function-Associated antigen) - антиген, ассоциированный с функцией лимфоцитов;

- Lys (Lysine) - лизин, аминокислота;

- Met (Methionine) - метионин, аминокислота;

- MHC (Main histocompatibility complex) - главный комплекс гистосовместимости;

- NESP (Novel erythropoiesis-stimulating protein) - новый эритропозэ-стимулирующий белок, препарат рекомбинантного эритропоэтина;

- Phe (Phenylalanine) - фенилаланин, аминокислота;

- pI (Isoelectric point) - изоэлектрическая точка белка;

- Pro (Proline) - пролин, аминокислота;

- PVDF (Polyvinilydendifluoride) - поливинилидендифторид;

- RT (Room temperature) - комнатная температура;

- SAR (Sarcosyl) - лаурилсаркозинат натрия;

- SAR-PAGE (Sodium lauroylsarcosinate Polyacrylamide gel electrophoresis) -полиакриламидный гель-электрофорез в присутствии лаурилсаркозината натрия;

- SDS (Sodium dodecylsulphate) - додецилсульфат натрия;

- SDS-PAGE (Sodium dodecylsulfate Polyacrylamide gel electrophoresis) -полиакриламидный гель-электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия;

- Ser (Serine) - серин, аминокислота;

- STAT-5 (Signal transducer and activator of transcription) - сигнальный белок-трансдуктор и активатор транскрипции;

- Thr (Threonine) - треонин, аминокислота;

- TNF-a (Tumor necrosis factor) - фактор некроза опухолей a;

- TPO -тромбопоэтин;

- Trp (Tryptophan) - триптофан, аминокислота;

- Tyr (Tyrosine) - тирозин, аминокислота;

- u/b EPO (urine/blood erythropoietin) - мочевой/сывороточный эндогенный ЭПО;

- UniProt - компьютерная база аминокислотных последовательностей белков;

- Val (Valine) - валин, аминокислота;

- VEGF (Vascular endothelial growth factor) - фактор роста эндотелия сосудов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка высокочувствительной методики качественного определения гибридного белка эритропоэтина, слитого с Fc - частью иммуноглобулина G человека (ЭПО-Fc), в образцах сыворотки крови с целью антидопингового контроля»

ВВЕДЕНИЕ

Современный этап развития спорта высших достижений

характеризуется динамикой роста спортивных рекордов, которые подчас

превышают естественные возможности человека. Физические и психические

нагрузки спортсменов практически исчерпали адаптационные способности

организма, а применение новых схем и методов тренировок не решает

проблему. Поэтому изыскиваются иные способы улучшения физических

характеристик тела и увеличения работоспособности, а именно, за счет

употребления допинговых средств. Допинговые скандалы как в России, так и

зарубежом, все чаще сотрясают мир спорта и попирают основные принципы

честной равной борьбы. Ежегодно запрещенный список Всемирного

антидопингового агентства (ВАДА) пополняется все новыми и новыми

веществами. К одному из наиболее «скандально» известных в последние

годы видов допинга относятся стимуляторы кроветворения - эритропоэтины

(ЭПО). Увеличение концентрации гемоглобина в крови в результате их

приема приводит к улучшению переноса кислорода к органам и тканям

человеческого организма, выраженной стимуляции обменных процессов и

выносливости, что является причиной его использования в качестве допинга.

Активная разработка препаратов на основе ЭПО началась в 1989 г., когда

впервые был одобрен к применению в клинической практике

рекомбинантный альфа-ЭПО (Eprex™, EpogenTM). Первый метод прямого

определения ЭПО в моче появился в 2000 году, что позволило различать

эндогенный и экзогенный эритропоэтин по профилям изоформ,

определяемых посредством изоэлектрического фокусирования в

полиакриламидном геле (IEF-PAGE) с последующим двойным

иммуноблоттингом. Впоследствии, с развитием новейших технологий в

области молекулярной биологии и биотехнологии на фармацевтическом

рынке стали появляться новые эритропоэз-стимулирующие агенты (ЭСА) с

увеличенным периодом полувыведения. Так, в 2001 году поступил в

открытую продажу препарат рЭПО дарбэпоэтин-альфа (Aranesp™, NESP), с в

10

3 раза превышающей длительностью действия, чем у эпоэтинов-альфа, за счет создания дополнительных сайтов гликозилирования в структуре молекулы. В 2007 г. был одобрен для клинического применения препарат Мирцера (Mircera™, метоксиполиэтиленгликоль-эпоэтин бета) - активатор рецепторов эритропоэтина длительного действия. Обладая периодом полувыведения около недели и благодаря присутствию полимерной молекулы полиэтиленгликоля в структуре Мирцера, этот стимулятор кроветворения быстро стал популярным как для лечения анемий, так и в качестве допинга среди спортсменов. Создание таких ЭСА повлекли за собой и развитие дополнительных методов их обнаружения в антидопинговой практике. Значительно повысилась эффективность определения рекомбинантных препаратов на основе ЭПО с внедрением для скрининга и подтверждающих анализов методов гель-электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата (SDS-PAGE) и лаурилсаркозината (SAR-PAGE) натрия. Применение этих методов оказалось особенно успешным для выявления фактов злоупотребления препаратами рЭПО, смесей эндогенного и экзогенного ЭПО, DynepoTM, NESP, Мирцера.

В последние годы с активной разработкой гибридомных технологий

продление времени полувыведения препаратов из организма стало

возможным за счет ЭПО-димеризации или путем совмещения молекулы

ЭПО с другими долгоживущими белками сыворотки крови, например, с

иммуноглобулинами. Таким продуктом инновационных технологий является

получивший в последнее время небывалую известность и широкое

распространение в спорте высших достижений, гибридный белок ЭПО,

слитый с Fc-частью иммуноглобулина G человека - ЭПО-Fc. Fc-гибриды

обладают рядом улучшенных биологических и фармакокинетических

характеристик и наряду с пролонгированным действием их основным

преимуществом является удобная форма приема посредством ингаляций

через легкие. Препарат пока не коммерциализирован и нет никакой

информации о его клинических испытаниях фазы II и III, однако уже

11

доступен на «черном» рынке и для исследовательских целей. Несмотря на это, гибридный ЭПО-Fc запрещен для употребления спортсменами как в соревновательный, так и во внесоревновательный периоды с 2012 года в соответствии со статьей S2 «Пептидные гормоны, факторы роста и связанные с ними вещества» Запрещенного списка ВАДА 2016 года. Все современные методы обнаружения эритропоэз-стимулирующих агентов, перечисленные выше и используемые в настоящий момент в антидопинговой практике, не способны достоверно идентифицировать присутствие данного вещества в образцах биологических жидкостей спортсменов. Поэтому необходима срочная модернизация или создание нового высокочувствительного метода обнаружения для детекции ЭПО-Fc гибридов. Диссертационное исследование посвящено разработке такого метода определения ЭПО-Fc в образцах сыворотки крови спортсменов, основанного на ферментативном удалении Fc-фрагмента молекулы с последующим определением продукта гидролиза, димерного фрагмента ЭПО, конъюгированного с шарнирной областью IgG, методом изоэлектрического фокусирования с двойным Вестерн блоттингом и хемилюминесцентной детекцией. В рамках исследований будет подобран оптимальный фермент для гидролиза ЭПО-Fc, изучены факторы, влияющие на электрофоретические характеристики продукта гидролиза, подобраны оптимальные условия гидролиза и проведена валидация метрологических параметров новой методики. Работа позволит предовратить использование веществ данного вида спортсменами в качестве допинговых средств и пополнить методологическую базу Федерального государственного бюджетного учреждения «Антидопинговый центр» в процессе подготовки к чемпионату мира по футболу FIFA 2018 года.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ 1 Аналитический обзор литературных данных 1.1 Гибридные Fc-белки с терапевтической активностью Первый гибридный белок CD4-Fc получен в 1989 году на основе внеклеточной части рецептора CD4 и Fc-фрагмента IgG [1] для терапии ВИЧ-инфекции путем препятствия проникновению вируса иммунодефицита человека в цитотоксические Т-клетки. С тех пор белки-гибриды нашли широкое применение в медицине для лечения большого спектра различных инфекционных и сердечно-сосудистых заболеваний [2], аутоиммунных расстройств [3], в процессе противоопухолевой терапии [4], при трансплантации органов [5,6]. Ряд гибридных препаратов вызывает интерес среди спортсменов для увеличения конкурентных преимуществ на соревнованиях и являются допингом [7,8]. Ингибиторы миостатина могут использоваться для увеличения мышечной массы в силовых видах спорта, дулаглютид инсулиноподобного действия влияет на энергетический обмен организма, ЭПО-Fc стимулирует эритропоэз, повышая кислородную емкость крови и, как следствие, выносливость спортсменов.

По состоянию на май 2015 года около 350 препаратов на основе антител, включая гибридные белки, находятся в стадии клинических испытаний, 27 из которых составляют Fc-гибриды, а 11 уже одобрены FDA (Food and Drug Administration of USA) или EMA (European Medicines Agency) для клинического применения (Таблица 1) [9]. Объем ежегодных продаж таких препаратов только в США оценивается в 18,5 млрд. долл. [2], что составляет более трети всех терапевтических белков, проданных в мире. Данные препараты характеризуются высоким процентом успешности внедрения. От разработки до готового продукта доходит более 50% разрабатываемых препаратов [10]. Таким образом, терапевтические антитела представляют собой самую быстроразвивающуюся категорию терапевтических средств [6,11,12].

Гибридные Fc-белки состоят из целых молекул терапевтических белков, таких как биологически активные гормоны, цитокины, растворимые рецепторы или их пептидных фрагментов, и Fc-фрагмента иммуноглобулина человека [13-16] (Рисунок 1).

Рисунок 1 - Общая структура гибридных Fc-белков

Совмещаемым компонентом может выступать абсолютно любая белковая молекула, например, лиганд, который активируется при взаимодействии с рецептором клеточной поверхности [17] и выступает либо в роли антагониста, блокирующего рецепторное связывание (этанерсепт, афлиберсепт и др.), либо в роли агониста, стимулирующего функцию рецептора по снижению или повышению иммунной активности (ромиплостим). Прикрепление Fc-фрагмента IgG к эффекторным белкам придает гибридам определенное количество дополнительных положительных биологических и фармакологических свойств [17-19]. Наличие Fc-домена значительно увеличивает период полувыведения гибридов in vivo, продлевая

их терапевтическую активность, благодаря его взаимодействию с консервативным неонатальным FcRn-рецептором, являющимся частью естественной схемы сдерживания лизосомальной деградации иммуноглобулинов [20], и замедлению почечной фильтрации за счет увеличения молекулярной массы [21]. За счет эндоцитоза Бе-гибридных белков опосредованного взаимодействием Fc-фрагмента с рецепторами FcRn [20], экспрессированными на эндотелии сосудов и эпителии легких, становится возможным транспорт данного белка после ингаляционного введения [22,23]. Известно, что молекулы являются одними из самых распространенных белков сыворотки крови человека и обладают наибольшим периодом полувыведения (Таблица 1) [9,20,24], поэтому являются привлекательными для конструирования Бе-гибридов.

Таблица 1 - Номинальные значения периодов полувыведения человеческих белков из сыворотки крови [9]

Белок-носитель Номинальный период полувыведения (часы) Молекулярная масса (кДа)

Бычий сывороточный альбумин 456 67

Трансферрин 288 80

1М01, 1Е02, 1М04 } 480 146

1ЕО3 144 165

]£А мономер 120 160

Ретинол-связывающий белок 12 21

С-реактивный белок 48 125

Фибриноген 100 340

48 188

Пентамер 1£;М 144 970

ГЬ-2 1.7 15

ЮР-1 0.17 8

иен 0.3 22

вЬР-1 0.03 4

Fc-фрагмент является консервативным для определенного изотипа антител и специфически опосредует такие реакции как опсонизация через взаимодействие с FcyR, антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC, antibody-depend cell-mediated cytotoxity) и реакцию активации системы комплемента посредством связывания с ее первым компонентом C1q (CDC, complement-dependent cytotoxity). Изучение структуры и состава Fc-части позволило выявить такие специфические мотивы, замены аминокислот в которых впоследствии приводят к созданию «улучшенных» гибридов [2,4,9,11,18,25-27] и увеличению периода полувыведения препарата из сыворотки, или модификация которых способствует повышению его аффинности по отношению к FcRn, Fcy рецепторам, уменьшению частоты дозирования или иммуногенности [9]. Такие изменения, несомненно, дают преимущества в виде потенциально улучшенных фармакокинетических и фармакодинамических свойств [18]. В процессе моделирования Fc-гибридных белков значительные усилия были предприняты для создания подходящих связующих фрагментов, соединяющих эффекторную молекулу с Fc-регионом [2]. В идеале, линкерная область должна оставаться стабильной внутри большого круга кровообращения, не обладать иммуногенностью и не препятствовать эффективному взаимодействию активной части Fc-гибрида с клеткой-мишенью [28].

Возросшее внимание к активному изучению и созданию препаратов на

основе Fc-гибридов, естественно, приводит к росту их неклинического

применения. Одной из таких областей является спорт и улучшение

физических характеристик тела. Несмотря на то, что некоторые препараты

еще не прошли клинических испытаний до конца или неодобрены для

коммерциализации через аптечную сеть, спортсмены находят их на «черном»

рынке. В соответствии со Всемирным антидопинговым кодексом и

Запрещенным списком 2016 года [29], ВАДА строго контролирует как

применение препаратов, не прошедших клинических испытаний или

испытания которых приостановлены, согласно статье S0, так и «пептидных

16

гормонов, факторов роста и подобных им субстанциям и миметикам» согласно статье S2. Последняя включает препараты на основе гибридных молекул, а единственным запрещенным Fc-гибридным белком является агонист рецепторов эритропоэтина - ЭПО-Рс. Далее подробнее рассмотрим строение получение и свойства гибридного ЭПО-Рс.

Таблица 2 - Гибридные белки, одобренные для маркетинга в настоящее время [9]

Торговое название Формат белка Фирма- Дата одобрения Молекулярная Область Суммарный объем

(США) производитель (РБЛ/ЕМА) мишень применения/лечение продаж в 2014 г.;

млн. долл. США $

Enbrel® (этанерцепт) Fc-часть IgG1, слитая с р75 экзодоменом рецептора TNF Immunex (Amgen) 2 ноября 1998 TNF-a Ревматоидный артрит $8.888

Ontak® (денилейкин дифтитокс) IL-2, слитый с дифтерийным токсином Eisai 5 февраля 1999 Рецептор IL-2 Онкология Нет информации

Amevive® (алефацепт) СБ2-связывающий домен LFA-3, слитый с Fc IgG1 Biogen 30 января 2003; снят в 2011 Ингибирование CD2-LFA-3 рецептора на активированных Т-клетках Псориаз Нет информации

Orencia® (абатацепт) CTLA4, слитый с модифицированной Fc IgG BMS 23 декабря 2005 CD80/CD86 рецепторы Ревматоидный артрит $1.679

Arcalyst® (рилонацепт) Рецептор IL-1, слитый с Fc IgG1 Regeneron 27 февраля 2008 Антагонист IL-1b, IL-1a, IL-1RA Криоглобулинемия $14.4

Nplate® (ромиплостим) Аналог тромбопоэтина, Fc-пептидный белок Amgen 22 августа 2008 TPO рецептор Тромбоцитопения $491

Elonva® (корифоллитропин-а) FSH, слитый с карбокси-терминальным пептидом (CTP) Merck Одобрен ЕМА 1 февраля 2010 FSH рецептор Фертильность Нет информации

Nulojix® (белатацепт) CTLA4, слитый с модифицированной Fc частью IgG (обладает большей аффинностью по сравнению с абатацептом) BMS 16 июня 2011 CD80/CD86 рецепторы Трансплантация почек Нет информации

Eylea® (афлиберцепт) Рецептор VEGF, слитый с Fc IgG1 Bayer-Schering Pharma/ Regeneron 18 ноября 2011 VEGF Возрастная макулярная дегенерация $2.775

Торговое название (США) Формат белка Фирма-производитель Дата одобрения (ББА/ЕМА) Молекулярная мишень Область применения/лечение Суммарный объем продаж в 2014 г.;

млн. долл. США $

2акгар® (зив-афлиберцепт) Рецептор УЕвБ, слитый с Бе IgG1 Sanofi/ Regeneron 3 августа 2012 Метастазирующий колоректальный рак $73.3

А1ршИх® (эфтренонаког-а) Рекомбинантный человеческий Фактор IX, слитый с Бе IgG Biogen Idec/ Biovitrum/ SOBI 28 марта 2014 Замещение фактора Гемофилия В $76

Tanzeum® (US), Ерегаап® (Еи) (альбиглютид) GLP-1, слитый с бычьим сывороточным альбумином GSK 15 апреля 2014 Рецептор GLP-1 Сахарный диабет 2 тип $8.9

Е1ойа1е® (эфралоктоког-а) Фактор VIII, лишенный В-домена, слитый с Бе Biogen Idec/SOBI 9 июня 2014 Замещение фактора Гемофилия А $58.4

ТгиНейу® (дулаглютид) Бе IgG, слитая с GLP-1 Eli Lilly 18 сентября 2014 Агонист рецепторов GLP-1 Сахарный диабет 2 тип $10.2

Продолжение Таблицы 2

1.2 Строение, получение и свойства ЭПО-Бе

Гибридный белок ЭПО-Бе состоит из одной (моно-ЭПО-Бе) или двух

(би-ЭПО-Бе) молекул рекомбинантного человеческого ЭПО, соединенных с

димерным Бе-фрагментом человеческого иммуноглобулина [23] при помощи

линкерной аминокислотной последовательности, состоящей из 2-16

аминокислотных остатков, преимущественно глицина, серина, аланина и

треонина [30]. В большинстве российских и зарубежных патентов для

конструирования молекул Бе-гибридов используют Бе-фрагменты

иммуноглобулина G классов IgG1 [30,31], а также IgG2 и IgG4 [32],

включающие шарнирную область, Сн2- и Сн3-домен. Эти классы

иммуноглобулинов обладают более длительным периодом полувыведения из

организма, по сравнению с IgG3, циркулирующим в крови не более недели

(Таблица 1). Бе-фрагменты вышеприведенных IgG в основном отличаются

аминокислотным составом и длиной шарнирного участка. Молекула би-ЭПО-

Бе имеет молекулярную массу около 140 кДа и состоит из 794 аминокислот

(2x165 аминокислот - ЭПО (ишргО Р01588) и 2-х Бе-фрагментов IgG -

2x232 аминокислот (И^гО: P01859)) [7]. По информации, полученной из

других источников, би-ЭПО-Бе содержит в своей структуре 2 молекулы

ЭПО, каждая по 166 аминокислотных остатков без сигнального пептида, и

двух Бе-фрагментов, представляющих собой СН2-СН3 домен IgG (по 226

аминокислот), соединенных гибким глицин-сериновым спейсерным

пептидом [31,33] и имеет молекулярную массу около 150 кДа. Димер

образован двумя идентичными мономерными цепями (ЭПО-линкер-Бе; на

рисунке выделены серым и бежевым цветом), содержит 806 аминокислот и

стабилизирован двумя дисульфидными мостиками между остатками

цистеинов, входящих в шарнирную область СН2-домена Бе-фрагмента IgG1.

Бйопй с соавторами [23] показали, что моно-ЭПО-Бе обладает лучшей

биодоступностью, которая в 6 раз превышает таковую для би-ЭПО-Бе.

Однократная пульмонарная доза моно-ЭПО-Бе приводила к значительному

увеличению количества незрелых эритроцитов периферической крови на 5-7

20

день после применения по сравнению с рекомбинантным ЭПО и би-ЭПО-Fc [23]. Однако авторы не приводят точную аминокислотную последовательность синтезированной молекулы и лишь указывают, что ее молекулярная масса около 112 кДа.

Каждая молекула ЭПО содержит по 4 сайта гликозилирования, три из которых ^-связанные (с аспарагином - Asn 24, Asn 38 и Asn 83) и один О-связанный (с серином - Ser 126) (Рисунок 2) [34-36].

Две идентичных мономерных цепи выделены серым и бежевым цветом. Дисульфидные связи и сайты гликозилирования отмечены оранжевыми и голубыми сферами. Участки молекулы, имеющие форму а-спиралей отмечены красным, у^-листы желтым и петли зеленым цветом.

Рисунок 2 - Трехмерная модель гибридного ЭПО-Рс белка, состоящего из двух молекул ЭПО, соединенных с Рс-димером [37]

Гликаны представлены би-, три- и тетраантенными структурами,

присоединенными ковалентно к полипептидной последовательности и

различающимися по степени разветвления ^-связанных углеводных цепей

21

[37,38] (Рисунок 2). В свою очередь, Fc-фрагмент имеет один ^-связанный гликан с биантенной структурой в положении Asn297 (Рисунок 2). Строение и состав гликанов определяется особенностями клеточной линии, в которой происходит синтез гликопротеина (CHO, BHK, NS/0 и др.) [39-40]. Вследствие этого ЭПО-Fc не является гомогенной молекулой, а смесью многих гликоформ, которые различаются по характеру гликозилирования и сиалирования. По этой причине гликоформы ЭПО-Fc имеют различный заряд при одинаковой аминокислотной последовательности. Сиаловые кислоты, являясь терминальными остатками гликанов, играют особую роль в функциональной активности как ЭПО, так и ЭПО-Fc [41-42]. Их удаление ферментом сиалидазой (нейраминидазой) приводит к образованию асиало-ЭПО, который теряет биологическую активность in vivo [43]. В работах Briggs [44] и George [45] получены данные о локализации и механизмах инактивации эритропоэтина. Результаты этих исследований говорят о ферментативном механизме инактивации ЭПО, связанным с лизосомами печени. Процесс деградации эритропоэтина начинается в плазме с десиализации гликанов. После постепенного удаления сиаловых кислот нейраминидазой обнажаются следующие по порядку в цепи гликана остатки галактозы, которые затем распознаются и связываются с рецепторами клеточных мембран печени, захватываются лизосомами и подвергаются деградации [43-45].

В структуре ЭПО-Fc молекулы ЭПО имеют по две дисульфидные связи между цистеиновыми остатками в положениях Cys7-Cys161 и Cys29-Cys33 [47,48], а димерный Fc-фрагмент две или четыре дисульфидные связи в шарнирной области (в зависимости от класса совмещаемого Fc-фрагмента -IgG1, IgG2 и IgG4) и по одной в CH2- и ОН3-домене [46].

Для улучшения фармакокинетических свойств и модулирования

активности молекулы гибридного белка в его структуру могут вносить

мутации, инсерции и делеции аминокислот в положениях

Leu234Leu235Gly236Gly237, Leu281Leu282Gly283Gly284, Asn297, Pro331,

22

Pro378 Fc-части IgG1 [32], и His32, Ser34, Pro90, Arg131 и Arg139 части ЭПО для увеличения биологической активности [32,49], изменения положения дисульфидных связей [33] и другие изменения структуры. В некоторых патентах отсутствует какая-либо информация о пептидном линкере и молекулы ЭПО и Fc-фрагмента иммуноглобулина соединены напрямую посредством шарнирной области IgG [30]. Также интересен тот факт, что в молекуле ЭПО, входящей в структуру гибридного белка, может присутствовать С-концевой аргинин, соответствующий положению Arg166. Человеческий эндогенный ЭПО состоит из 165 аминокислотных остатков, хотя синтезируется в виде предшественника, состоящего из 166 аминокислот. При попадании в кровоток или при экскреции в мочу предшественник ЭПО лишается концевой аминокислоты путем ферментативного отщепления с помощью специфического фермента карбоксипептидазы (CpB) [50]. CpB также является одним из важнейших ферментов для превращения проинсулина в инсулин [51,52]. За счет действия CpB у антител после синтеза происходит отщепление С-концевого лизина. Fc-фрагмент IgG в составе гибридного белка не является исключением и лишен терминального остатка Lys с С-конца. В ряде работ было установлено, что в CHO-клетках, рекомендованных FDA для производства биологических субстанций, включая моноклональные антитела, обнаруживается высокая активность карбоксипептидазы [53]. Таким образом, лизин удаляется уже на этапе синтеза Fc-гибрида в культуре СНО-клеток.

Учитывая вышесказанное, можно сказать, что структура ЭПО-Fc может варьировать в зависимости от способа получения и модификаций, вводимых в аминокислотную последовательность. На данный момент подробная структура ЭПО-Fc неизвестна и является собственностью фирм-производителей .

Для получения гибридного ЭПО-Fc белка на первой стадии создают

генетическую конструкцию для последующей трансфекции в

эукариотические клетки. Ген, как правило, получают путем химического

23

синтеза последовательности отдельных компонентов или на основании генетического материала человека путем амлификации гена ЭПО и фрагмента ДНК Бе-части IgG. При необходимости проводят направленный мутагенез, включают последовательности, кодирующие линкерную область и сигнальный пептид (СП), определяющий направление транспорта секреторного белка внутри просвета эндоплазматического ретикулума клетки после трансляции и способствующий проникновению молекулы сквозь мембрану посредством экзоцитоза во внеклеточное пространство. Рядом исследований было установлено, что различные сигнальные последовательности могут приводить к увеличению секреции белка [54-56]. Было обнаружено, что сигнальные пептиды чрезвычайно гетерогенны, и что многие прокариотические и эукариотические СП являются функционально взаимозаменяемыми, даже между различными видами [57-59]. На основании этих наблюдений, СП из различных видов могут использоваться для экспрессии представляющего интерес гена в определенной системе клетки-хозяина. НеБкеШ с соавторами [60] показали, что не всегда нативные СП, входящие в состав ^-2, СЭ5, легкой цепи иммуноглобулина каппа, трипсиногена, сывороточного альбумина, пролактина и многих других, являются эффективными по сравнению с таковыми других видов, также опосредующих секрецию в СНО-клетках [56]. Суммируя результаты предыдущих исследований, КоЬег с соавторами [61] идентифицировали сигнальные последовательности, которые могут быть слиты с рекомбинантными белками для улучшения эффективности их секреции. Из 16 пептидов-кандидатов, относящихся к различным белкам, были отобраны два - MKWVTБISLLБLБSSAYS пре-про-белка сывороточного альбумина человека и MTRLTVLALLAGLLASSRA пре-про-белка азуроцидина. Данные СП значительно увеличивают эффективность экспрессии широкого спектра биофармацевтических белков, включая антитела [61].

Для оптимальной экспрессии ЭПО-Бе в клетках млекопитающих, в

плазмиду вкючают последовательность Козака [62, 63].

24

Полную последовательность рекомбинантного ЭПО-Fc выделяли, амплифицировали и клонировали в экспрессирующий вектор эукариотических клеток pCD1 и др. Внедренная последовательность нуклеиновых кислот в составе плазмиды, была подтверждена ДНК секвенированием [64]. Для экспрессии белка часто используются клетки яичника китайского хомячка (СНО) с дефицитом дигидрофолатредуктазы, одобренные FDA для производства биологических субстанций. Fc-гибриды могут быть экспрессированы в других клеточных линиях, например, BHK, NS/0, однако они будут обладать меньшей биологической активностью, ввиду наличия менее разветвленных гликанов и меньшего содержания остатков сиаловых кислот в структуре молекулы [37]. Подробнее процесс биотехнологического производства гибридного белка ЭПО-Fc описан в ряде патентов США [64-65].

ЭПО-Fc был разработан в качестве эритропоэз-стимулирующего препарата нового поколения с пролонгированным действием. Основная цель приема гибридного белка спортсменами, как и иных эритропоэз-стимулирующих агентов, заключается в стимуляции продукции красных кровяных клеток, и как следствие, увеличению кислородной емкости крови и выраженной стимуляции обменных процессов организма. Попадая в организм человека, ЭПО-Fc связывается с рецепторами к ЭПО человека (ЭПО-р), на поверхности клеток эритроидных предшественников (КОЕэ, базофильных эритробластах и проэритробластах) костного мозга. При этом ЭПО-рецептор претерпевает конформационные изменения, димеризуется, и происходит активация цитоплазматических тирозинкиназ (JAK2), инициирующих фосфорилирование как аминокислотных остатков тирозина в составе рецептора, так и внутриклеточных сигнальных белков STAT-5 (Signal transducers and activators of transcriptions) [66,67]. Последние диссоциируют от рецептора, димеризуются, проникают в ядро и запускают процесс транскрипции специфических генов, приводящий к пролиферации и

дифференцировке клетки-предшественника (Рисунок 3) [68].

25

мембрана клетки

^ЭЙО^

цитоплазма клетки

транскрипция гено

ьт

ядро клетки

Рисунок 3 - Механизм передачи сигнала в клетке при связывании ЭПО с

рецептором

Присутствие в гибридной молекуле димерного Бе-фрагмента, как уже было отмечено ранее, улучшает фармакокинетические свойства эритропоэтина за счет взаимодействия со специфическими рецепторами (БеЯд, FcyR), экспрессированными как на клеточной поверхности, так и на эндотелии сосудов. Далее подробнее рассмотрим биологические процессы, опосредованные взаимодействием Бе-части гибридной молекулы с рецепторами, белковыми факторами системы комплемента и цитотоксическими Т-клетками.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Постников, Павел Викторович, 2016 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Capon, D. J. Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy / D. J. Capon, S. M. Shamov, J. Mordenti, S. A. Marsters, T. Gregory, H. Mitsuya, R. A. Byrn, C. Lycas, F. M. Wurm, J. E. Groopman // Nature. — 1989. — Vol. 337. — No 6207. — P. 525—531.

2. Rath, T. Fc-fusion proteins and FcRn: structural insights for longer-lasting and more effective therapeutics / T. Rath, K. Baker, J. A. Dumont, R. T. Peters, H. Jiang, S.-W. Qiao, W. I. Lencer, G. F. Pierce, R. S. Blumberg // Crit. Rev. Biotechnol. — 2015. — Vol. 35. — No 2. — P. 235—254.

3. Chan, A. C. Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation / A. C. Chan, P. J. Carter // Nat. Rev. Immunol. — 2010. — Vol. 10. — No 5. — P. 301—316.

4. Weiner, L. M. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy / L. M. Weiner, R. Surana, S. Wang // Nat. Rev. Immunol. — 2010. — Vol. 10. — No 5. — P. 317—327.

5. Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2010 / J. M. Reichert // MAbs. — 2010. — Vol. 2. — No 1. — P. 84—100.

6. Reichert, J. M. Which are the antibodies to watch in 2012? / J. M. Reichert // MAbs. — 2012. — Vol. 4. — No 1. — P. 1—3.

7. Reichel, C. Detection of EPO-Fc fusion protein in human blood: screening and confirmation protocols for sports drug testing / C. Reichel, M. Thevis // Drug Test. Anal. — 2012. — Vol. 4. — No 11. — P. 818—829.

8. Walpurgis, K. Myostatin inhibitors in sports drug testing: Detection of myostatin-neutralizing antibodies in plasma/serum by affinity purification and Western blotting / K. Walpurgis, A. Thomas, W. Schanzer, M. Thevis // Proteomics Clin. Appl. — 2016. — Vol. 10. — No 2. — P. 195—205.

9. Strohl, W. R. Fusion Proteins for Half-life Extention for Biologics as a Strategy to Make Biobetters / W. R. Strohl // BioDrugs. — 2015. — Vol. 29. — No 4. — P. 215—239.

10. McManus, L. M. Pathobiology of Human Disease: A Dynamic Encyclopedia of Disease Mechanisms / L. M. McManus, R. N. Mitchell. — Academic Press (1st Ed.), Elsevier, Oxford, UK. — 2014. — P. 5000. ISBN: 9780-12-386457-4.

11. Nelson, A. L. Development trends for human monoclonal antibody therapeutics / A. L. Nelson, E. Dhimolea, J. M. Reichert // Nat. Rev. Drug Discov.

— 2010. — Vol. 9. — No 10. — P. 767—774.

12. Reichert, J. M. Monoclonal antibodies as innovative therapeutics / J. M. Reichert // Curr. Pharmaceut. Biotechnol. — 2008. — Vol. 8. — No 6. — P. 423—430.

13. Jones, T. D. The development of a modified human IFN-alpha2b linked to the Fc portion of human IgG1 as a novel potential therapeutic for the treatment of hepatitis C virus infection / T. D. Jones, M. Hanlon, B. J. Smith, C. T. Heise, P. D. Nayee, D. A. Sanders, A. Hamilton, C. Sweet, E. Unitt, G. Alexander, K. M. Lo, S. D. Gillies, F. J. Carr, M. P. Baker // J. Interferon Cytokine Res. — 2004. — Vol. 24. — No 9. — P. 560—572.

14. Lo, K. M. High level expression and secretion of Fc-X fusion proteins in mammalian cells / K. M. Lo, Y. Sudo, J. Chen, Y. Li, Y. Lan, S. M. Kong, L. Chen, Q. An, S. D. Gillies // Protein Eng. — 1998. — Vol. 11. — No 6. — P. 495—500.

15. Mohler, K. M. Soluble tumor necrosis factor (TNF) receptors are effective therapeutic agents in lethal endotoxemia and function simultaneously as both TNF carriers and TNF antagonists / K. M. Mohler, D. S. Torrance, C. A. Smith, R. G. Goodwin, K. E. Stremler, V. P. Fung, H. Madani, M. B. Widmer // J. Immunol. — 1993. — Vol. 151. — No 3. — P. 1548—1561.

16. Way, J. C. Improvement of Fc-erythropoietin structure and pharmacokinetics by modification at a disulfide bond / J. C. Way, S. Lauder, B. Brunkhorst, S. M. Kong, A. Qi, G. Webster, I. Campbell, S. McKenzie, Y. Lan, B. Marelli, L. A. Nguyen, S. Degon, K. M. Lo, S. D. Gillies // Protein Eng. Des. Sel.

— 2005. — Vol. 18. — No 3. — P. 111—118.

131

17. Czajkowsky. D. M. Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives / D. M. Czajkowsky, J. Hu, Z. Shao, R. J. Pleass // EMBO Mol. Med. — 2012. — Vol. 4. — No 10. — P. 1015—1028.

18. Beck, A. Biosimilar, biobetter and next generation therapeutic antibodies / A. Beck // MAbs. — 2011. — Vol. 3. — No 2. — P. 107—110.

19. Huang, C. Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and MIMETIBODY technology / C. Huang // Curr. Opin. Biotechnol. — 2009. — Vol. 20. — No 6. — P. 692—699.

20. Roopenian, D. C. FcRn: the neonatal Fc receptor comes of age / D. C. Roopenian, S. Akilesh // Nat. Rev. Immunol. — 2007. — Vol. 7. — No 9. — P. 715—725.

21. Kontermann, R. E. Strategies for extended serum half-life of protein therapeutics / R. E. Kontermann // Curr. Opin. Biotechnol. — 2011. — Vol. 22. — No 6. — P. 868—876.

22. Bitonti, A. J. Pulmonary administration of therapeutic proteins using an immunoglobulin transport pathway / A. J. Bitonti, J. A. Dumont // Adv. Drug Deliv. Rev. — 2006. — Vol. 58. — No 9—10. — P. 1106—1118.

23. Bitonti, A. J. Pulmonary delivery of an erythropoietin Fc fusion protein in non-human primates through an immunoglobulin transport pathway / A. J. Bitonti, J. A. Dumont, S. C. Low, R. T. Peters, K. E. Kropp, V. J. Palombella, J. M. Stattel, Y. Lu, C. A. Tan, J. J. Song, A. M. Garcia, N. E. Simister, G. M. Spiekermann, W. I. Lencer, R. S. Blumberg // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004. — Vol. 101. — No 26. — P. 9763—9768.

24. Baker, K. Immune and non-immune functions of the (not so) neonatal Fc receptor, FcRn / K. Baker, S. W. Qiao, T. Kuo, K. Kobayashi, M. Yoshida, W. I. Lencer, R. S. Blumberg // Semin Immunopathol. — 2009. — Vol. 31. — No 2. — P. 223—236.

25. Beck, A. Strategies and challenges for the next generation of therapeutic

antibodies / A. Beck, T. Wurch, C. Bailly, N. Corvaia // Nat. Rev. Immunol. —

2010. — Vol. 10. — No 5. — P. 345—352.

132

26. Beck, A. Therapeutic antibodies and derivatives: from the bench to the clinic / A. Beck, T. Wurch, N. Corvaia // Curr. Pharm. Biotechnol. — 2008. — Vol. 9. — No 6. — P. 421—422.

27. Lonberg, N. Fully human antibodies from transgenic mouse and phage display platforms / N. Lonberg // Curr. Opin. Immunol. — 2008. — Vol. 20. — No 4. — P. 450—459.

28. Iyer, U. Antibody drug conjugates - Trojan horses in the war on cancer / U. Iyer, V. J. Kadambi // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. — 2011. — Vol. 64. — No 3. — P. 207—212.

29. The 2016 WADA Prohibited List [Электронный ресурс] // World AntiDoping Agency: [сайт]: — URL: http://www.rusada.ru/sites/default/files/content/files/Запрещенный%20список%2 02016%20года( 1).pdf. (16.04.2016)

30. Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo: Патент US 8431132 B2 / H. Wang, D. U. Yong, R. Zhang, J. Hu, L. Liu; патентообладатель Novagen Holding Corporation; опубл. 30.04.2013.

31. Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities: Патент США 7250493 B2 / патентообладатель L. H. K. Sun, B. N. C. Sun, C. R. Y. Sun; заявл. 17.12.2004; опубл. 31.07.2007.

32. Fc-erythropoietin fusion protein with improved pharmacokinetics: Патент США 20050202538 A1 / S. Gillies, J. Way, K. M. Lo; патентообладатель Merck Patent GmbH; заявл. 30.12.2004; опубл. 15.09. 2005.

33. Fc fusion proteins of human erythropoietin with increased biological activities: Патент США 7030226 B2 / патентообладатель L. H. K. Sun, B. N. C. Sun, C. R. Y. Sun; заявл. 17.12.2004; опубл. 18.04.2006.

34. Tsuda, E. Comparative structural sudy of N-linked oligosaccharides of

urinary and recombinant erythropoietins / E. Tsuda, M. Goto, A. Murakami, K.

Akai, M. Ueda, G. Kawanishi, N. Takahashi, R. Sasaki, H. Chida, H. Ishikara //

Biochemistry. — 1988. — Vol. 27. — No 15. — P. 5646—5664.

133

35. Takeuchi, M. Structures and functional roles of the sugar chains of human erythropoietins / M. Takeuchi, A. Kobata // Glycobiology. — 1991. — Vol. 1. — No 4. — P. 337—346.

36. Egrie, J. C. The role of carbohydrate on the biological activity of erythropoietin / J. C. Egrie, J. R. Grant, D. K. Gillies, K. H. Aoki, T. W. Strickland // Glycoconj. J. — 1993. — Vol. 10. — P. 263.

37. Salgado, E. R. Post-translational modification of a chimeric EPO-Fc hormone is more important than its molecular size in defining its in vivo hematopoietic activity / E. R. Salgado, R. Montesino, S. P. Jiménez, M. González, F. Hugues, O. I. Cabezas, R. Maura-Perez, P. Saavedra, E. Lamazares, A. Salas-Burgos, J. C. Vera, O. Sánchez, J. R. Toledo // Biochim. Biophys. Acta. — 2015. —Vol. 1850. — No 9. — P. 1685—1693.

38. Skibeli, V. Sugar profiling proves that human serum erythropoietin differs from human recombinant erythropoietin / V. Skibeli, G. Nissen-Lie, P. Torjesen // Blood. — 2001. — Vol. 98. — No 13. — P. 3626—3634.

39. Nimtz, M. Structures of sialylated oligosaccharides of human erythropoietin expressed in recombinant BHK-21 cells / M. Nimtz, W. Martin, V. Wray, K. D. Klöppel, J. Augustin, H. S. Conradt // Eur. J. Biochem. — 1993. — Vol. 213. — No 1. — P. 39—56.

40. Zhang, P. A functional analysis of N-glycosylation-related genes on sialylation of recombinant erythropoietin in six commonly used mammalian cell lines / P. Zhang, D. L. Tan, D. Heng, T. Wang, N. Mariati, Y. Yang, Z. Song // Metab. Eng. — 2010. — Vol. 12. — No 6. — P. 526—536.

41. Dube, S. Glycosylation at specific sites of erythropoietin is essential for biosynthesis, secretion and biological functions / S. Dube, J. W. Fisher, J. S. Powell // J. Biol. Chem. — 1988. — Vol. 263. — No 33. — P. 17516—17521.

42. DeLorme, E. Role of glycosylation on the secretion and biological activity of erythropoietin / E. DeLorme, T. Lorenzini, J. Giffin, F. Martin, F. Jacobsen, T. Boone, S. Elliott // Biochemistry. — 1992. — Vol. 31. — No 41. — P. 9871— 9876.

43. Румянцев, А. Г. Эритропоэтин: биологические свойства, возрастная регуляция эритропоэза, клиническое применение / А. Г. Румянцев, Е. Ф. Морщакова, А. Д. Павлов. — М.: ГЭОТАР - МЕД, 2002. — С. 400.

44. Briggs, D. W. Hepatic clearance of intact and desiasylated erythropietin / D. W. Briggs, J. W. Fisher, W. J. George // Am. J. Physiol. — 1974. — Vol. 227. — No 6. — P. 1385—1388.

45. George, W. J. Metabolism of erythropoietin / W. J. George, D. W. Briggs,

G. M. Rodger, J. W. Fisher. In: Kidney Hormones. Ed. J. W. Fisher. London, UK. — 1977. — Vol. 2. — P. 329—356.

46. Liu, H. Disulfide bond structures of IgG molecules: structural variations, chemical modifications and possible impacts to stability and biological function /

H. Liu, K. May // MAbs. — 2012. — Vol. 4. — No 1. — P. 17—23.

47. Lai, P. H. Structural characterization of human erythropoietin / P. H. Lai, R. Everett, F. F. Wang, T. Arakawa, E. Goldwasser // J. Biol. Chem. — 1986. — Vol. 261. — No 7. — P. 3116—3121.

48. Shimizu, T. Biochemical properties of human urinary megakaryocyte colony-stimulating factor and erythropoietin: the role of sulfhydryl groups and disulfide bonds / T. Shimizu, T. Miyake, A. M. Pilch, C. Mantel, M. J. Murphy Jr. // Exp. Cell. Biol. — 1986. — Vol. 54. — No 5-6. — P. 281—286.

49. Wen, D. Erythropoietin structure-function relationships. Identification of functionally important domains / D. Wen, J. P. Boissel, M. Showers, B. C. Ruch, H. F. Bunn // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269. — No 36. — P. 22839—22846.

50. Recny, M. A. Structural characterization of natural human urinary and recombinant DNA-derived erythropoietin. Identification of des-arginine 166 erythropoietin / M. A. Recny, H. A. Scoble, Y. Kim // J. Biol. Chem. — 1987. — Vol. 262. — No 35. — P. 17156—17163.

51. Yang, Z. H. Separation and characterization of trypsin and carboxypeptidase B-digested products of Met-Lys-human proinsulin / Z. H. Yang, X. Du, J. G. Tang // Appl. Biochem. Biotechnol. — 1999. — Vol. 76. — No 2. — P. 107—114.

52. Ivankin, A. N. Production of human insulin from proinsulin by a biological catalysis / A. N. Ivankin, A. D. Nekliudov, S. I. Mitaleva // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. — 1998. — Vol. 34. — No 5. — P. 534—538.

53. Hu, Z. Carboxypeptidase D is the only enzyme responsible for antibody C-terminal lysine cleavage in Chinese Hamster ovary (CHO) cells / Z. Hu, H. Zhang, B. Haley, F. Macchi, F. Yang, S. Migashi, J. Elich, R. Yang, Y. Tang, J. C. Joly, B. R. Snedecor, A. Shen // Biotechnol. Bioeng. — 2016. — Vol. 113. — No 10. — P. 2100—2106. doi: 10.1002/bit.25977.

54. Zhang, L. Alteration in the IL-2 signal peptide affects secretion of proteins in vitro and in vivo / L. Zhang, Q. Leng, A. J. Mixson // J. Gene Med. — 2005. — Vol. 7. — No 3. — P. 354—365.

55. Knappskog, S. The level of synthesis and secretion of Gaussia princeps luciferase in transfected CHO cells is heavily dependent on the choice of signal peptide / S. Knappskog, H. Ravneberg, C. Gjerdrum, C. Trasse, B. Stern, I. F. Pryme // J. Biotechnol. — 2007. — Vol. 128. — No 4. — P. 716—725.

56. Mammalian expression vector with a highly efficient secretory signal sequence: Патент США WO 2008/148519 A2 / патентообладатель R. Young, J. Rance; заявл. 03.06.2008; опубл. 11.12.2008.

57. Gierasch, L. M. Signal sequences / L. M. Gierasch // Biochemistry. — 1989. — Vol. 28. — No 3. — P. 923—930.

58. von Hejne, G. Signal sequences: The limits of variation / G. von Hejne // J. Mol. Biol. — 1985. — Vol. 184. — No 1. — P. 99—105.

59. Tan, N. S. Engineering a novel secretion signal for cross-host recombinant protein expression / N. S. Tan, B. Ho, J. L. Ding // Protein Eng. — 2002. — Vol. 15. — No 4. — P. 337—345.

60. Protein expression system : Патент США WO 2005/001099 A2 / патентообладатель J. Hesketh, H. Ravneberg, C. Gjerdrum, A. Tauler, I. Pryme, B. Stern; заявл. 25.06.2004; опубл. 06.01.2005.

61. Kober, L. Optimized signal peptides for the Development of High Expressing CHO Cell Lines / L. Kober, C. Zehe, J. Bode // Biotechnol. Bioeng. — 2013. — Vol. 110. — No 4. — P. 1164—1173.

62. Kozak, M. At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells / M. Kozak // J. Mol. Biol. — 1987. — Vol. 196. — No 4. — P. 947—950.

63. Kozak, M. The scanning model for translation: an update / M. Kozak // J. Cell. Biol. — 1989. — Vol. 108. — No 2. — P. 229—241.

64. Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo: Патент США 20130224198 A1 / патентообладатель Novagen Holding Corporation; заявл. 29.04.2013; опубл. 29.08.2013.

65. Recombinant human EPO-Fc fusion proteins with prolonged half-life and enhanced erythropoietic activity in vivo: Патент США 20090297522 A1 / патентообладатель Novagen Holding Corporation; заявл. 27.01.2007; опубл. 03.12.2009.

66. Yoshimura, A. Physician Education: The Erythropoietin Receptor and Signal Transduction / A. Yoshimura, K. Arai // Oncologist. — 1996. — Vol. 1. — No 5. — P. 337—339.

67. Arcasoy, M. O. Co-operative signalling mechanisms required for erythroid precursor expansion in response to erythropoietin and stem cell factor / M. O. Arcasoy, X. Jiang // Br. J. Haematol. — 2005. — Vol. 130. — No 1. — P. 121— 129.

68. Chen, C. The erythropoietin receptor and its signaling cascade / C. Chen, A. D. Sytkovski. In: Jelkmann, J. (Ed.); Erythropoietin: molecular biology and clinical use. Johnson City, TN: Graham Publishing Co. — 2003. — P. 165—194.

69. Wilson, I. A. Unusual MHC-like molecules: CD1, Fc receptor, the hemochromatosis gene product, and viral homologs / I. A. Wilson, P. J. Bjorkman // Curr. Opin. Immunol. — 1998. — Vol. 10. — No 1. — P. 67—73.

70. Ghetie, V. Abnormally short serum half-lives of IgG in beta 2-microglobulin-deficient mice / V. Ghetie, J. G. Hubbard, J. K. Kim, M. F. Tsen, Y. Lee, E. S. Ward // Eur. J. Immunol. — 1996. — Vol. 26. — No 3. — P. 690—696.

71. Wani, M. A. Familial hypercatabolic hypoproteinemia caused by deficiency of the neonatal Fc receptor, FcRn, due to a mutant beta2-microglobulin gene / M. A. Wani, L. D. Haynes, J. Kim, C. L. Bronson, C. Chaudhury, S. Mohanty, T. A. Waldmann, J. M. Robinson, C. L. Anderson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2006. — Vol. 103. — No 13. — P. 5084—5089.

72. Israel, E. J. Increased clearance of IgG in mice that lack beta 2-microglobulin: possible protective role of FcRn / E. J. Israel, D. F. Wilsker, K. C. Hayes, D. Schoenfeld, N. E. Simister // Immunology. — 1996. — Vol. 89. — No 4. — P. 573—578.

73. Junghans, R. P. The protection receptor for IgG catabolism is the brta2-microglobulin-cjntaining neonatal intestinal transport receptor / R. P. Junghans, C. L. Anderson // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1996. — Vol. 93. — No 11. — P. 5512—5516.

74. Martin, W. L. Crystal structure at 2.8 A of an FcRn/heterodimeric Fc complex: mechanism of pH-dependent binding / W. L. Martin, A. P. West Jr, L. Gan, P. J. Bjorkman // Moll. Cell. — 2001. — Vol. 7. — No 4. — P. 867—877.

75. Kim, J. K. Catabolism of murine IgG1 molecule: evidence that both CH2-CH3 domain interfaces are required for persistence of IgG1 in the circulation of mice / J. K. Kim, M. F. Tsen, V. Ghetie, E. S. Ward // Scand. J. Immunol. — 1994. — Vol. 40. — No 4. — P. 457—465.

76. Kim, J. K. Identifying amino acid residues that influence plasma clearance of murine IgG1 fragments by site-directed mutagenesis / J. K. Kim, M. F. Tsen, V. Ghetie, E. S. Ward // Eur. J. Immunol. — 1994. — Vol. 24. — No 3. — P. 542— 548.

77. Burmeister, W. P. Crystal structure at 2.2A resolution of the MHC-related neonatal Fc receptor / W. P. Burmeister, L. N. Gastinel, N. E. Simister, M. L.

Blum, P. J. Bjorkman // Nature. — 1994. — Vol. 372. — No 6504. — P. 336— 343.

78. Shields, R. L. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R / R. L. Shields, A. K. Namenuk, K. Hong, Y. G. Meng, J. Rae, J. Briggs, D. Xie, J. Lai, A. Stadlen, B. Li, J. A. Fox, L. G. Presta // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276. — No 9. — P. 6591—6604.

79. Huang, X. Binding structures and energies of the human neonatal Fc receptor with human Fc and its mutants by molecular modeling and dynamics simulations / X. Huang, F. Zheng, C. - Z. Zhan // Mol. Biosyst. — 2013. — Vol. 9. — No 12. — P. 3047—3058.

80. West, A. P. Crystal structure and immunoglobulin G binding properties of the human major histocompatibility complex-related Fc receptor / A. P. West, P. J. Bjorkman // Biochemistry. —2000. — Vol. 39. — No 32. — P. 9698—9708.

81. Martin, W. L. Characterization of the 2:1 complex between the class I MHC-related Fc receptor and its Fc ligand in solution / W. L. Martin, P. J. Bjorkman // Biochemistry. — 1999. — Vol. 38. — No 39. — P. 12639—12647.

82. Tesar, D. B. Ligand valency affects transcytosis, recycling and intracellular trafficking mediated by the neonatal Fc receptor / D. B. Tecar, N. E. Tiangco, P. J. Bjorkman // Traffic. — 2006. — Vol. 7. — No 9. — P. 1127—1142.

83. DeLano, W. L. Convergent solutions to binding at a protein-protein interface / W. L. DeLano, M .H. Ultsch, A. M. de Vos, J. A. Wells // Science. — 2000. — Vol. 287. — No 5456. — P. 1279—1283.

84. Idusogie, E. E. Mapping of the C1q binding site on rituxan, a chimeric antibody with a human IgG1 Fc / E. E. Idusogie, L. G. Presta, H. Gazzano-Santoro, K. Totpa, P. Y. Wong, M. Ultsch, Y. G. Meng, M. G. Mulkerrin // J. Immunol. — 2000. — Vol. 164. — No 8. — P. 4178—4184.

85. Duncan, A. R. The binding site for C1q on IgG / A. R. Duncan, G. Winter //

Nature. — 1988. — Vol. 332. — No 6166. — P. 738—740.

139

86. Simmons, L. C. Expression of full-length immunoglobulins in Escherichia Coli: rapid and efficient production of aglycosylated antibodies / L. C. Simmons, D. Reilly, L. Klimowski, T. S. Raju, G. Meng, P. Sims, K. Hong, R. L. Shields, L. A. Damico, P. Rancatore, D. G. Yansura // J. Immunol. Methods. — 2002. — Vol. 263. — No 1-2. —P. 133—147.

87. Pincetic, A. Type I and type II Fc receptors regulate innate and adaptive immunity / A. Pincetic, S. Bournazos, D. J. DiLillo, J. Maamary, T. T. Wang, R. Dahan, B. M. Fiebiger, J. V. Ravetch // Nat. Immunol. — 2014. — Vol. 15. — No 8. — P. 707—716.

88. Oganesyan, V. Structural insights into neonatal Fc receptor-based recycling mechanisms / V. Oganesyan, M. M. Damschroder, K. E. Cook, Q. Li, C. Gao, H. Wu, W. F. Dall'Acqua // J. Biol. Chem. — 2014. — Vol. 289. — No 11. — P. 7812—7824.

89. Stapleton, N. M. Competition for FcRn-mediated transport gives rise to short half-life of human IgG3 and offers therapeutic potential / N. M. Stapleton, J. T. Andersen, A. M. Stemerding, S. P. Bjarnarson, R. C. Verheul, J. Gerritsen, Y. Zhao, M. Kleijer, I. Sandlie, M. de Haas, I. Jonsdottir, C. E. van der Schoot, G. Vidarsson // Nat. Commun. — 2011. — Vol. 2. — P. 599.

90. Vaughn, D. E. Identification of critical IgG binding epitopes on the neonatal Fc receptor / D. E. Vaughn, C. M. Milburn, D. M. Penny, W. L. Martin, J. L. Johnson, P. J. Bjorkman // J. Mol. Biol. — 1997. — Vol. 274. — No 4. — P. 597—607.

91. Andersen. J. T. Structure-based mutagenesis reveals the albumin-binding site of the neonatal Fc receptor / J. T. Andersen, B. Dalhus, J. Cameron, M. B. Daba, A. Plumridge, L. Evans, S. O. Brennan, K. S. Gunnarsen, M. Bj0räs, D. Sleep, I. Sandlie // Nat. Commun. — 2012. — Vol. 3. — P. 610.

92. Schmidt, M. M. Crystal structure of an HAS/FcRn complex reveals

recycling by competitive mimicry of HSA ligands at a pH-dependent hydrophobic

interface / M. M. Schmidt, S. A. Townson, A. J. Andreucci, B. M. King, E. B.

Schirmer, A. J. Murillo, C. Dombrowski, A. W. Tisdale, P. A. Lowden, A. L.

140

Masci, J. T. Kovalchin, D. V. Erbe, K. D. Wittrup, E. S. Furfine, T. M. Barnes // Structure. — 2013. — Vol. 21. — No 11. — P. 1966—1978.

93. Sand, K. M. K. Dissection of the neonatal Fc receptor (FcRn)-albumin interface using mutagenesis and anti-FcRn albumin-blocking antibodies / K. M. Sand, B. Dalhus, G. J. Christianson, M. Bern, S. Foss, J. Cameron, D. Sleep, M. Bj0ras, D. C. Roopenian, I. Sandlie, J. T. Andersen // J. Biol. Chem. — 2014. — Vol. 289. — No 24. — P. 17228—17239.

94. Chaudhury, C. Albumin binding to FcRn: distinct from the FcRn-IgG interaction / C. Chaudhury, C. L. Brooks, D. C. Carter, J. M. Robinson, C. L. Anderson // Biochemistry. — 2006. — Vol. 45. — No 15. — P. 4983—4990.

95. Andersen, J. T. Cross-species binding analyses of mouse and human neonatal Fc receptor show dramatic differences in immunoglobulin G and albumin binding / J. T. Andersen, M. B. Daba, G. Berntzen, T. E. Michaelsen, I. Sandlie // J. Biol. Chem. — 2010. — Vol. 285. — No 7. — P. 4826—4836.

96. Zhou, J. Generation of mutated variants of the human form of the MHC class I-related receptor, FcRn, with increased affinity for mouse immunoglobulin G / J. Zhou, J. E. Johnson, V. Ghetie, R. J. Ober, E. S. Ward // J. Mol. Biol. — 2003. — Vol. 332. — No 4. — P. 901—913.

97. Zhou, J. Conferring the binding properties of the mouse MHC class I-related receptor, FcRn, onto the human ortholog by sequential rounds of site-directed mutagenesis / J. Zhou, F. Mateos, R. J. Ober, E. S. Ward // J. Mol. Biol. — 2005. — Vol. 345. — No 5. — P. 1071—1081.

98. Vaughn, D. E. High-affinity binding of the neonatal Fc receptor to its IgG ligand requires receptor immobilization / D. E. Vaughn, P. J. Bjorkman // Biochemistry. — 1997. — Vol. 36. — No 31. — P. 9374—9380.

99. Sockolosky, J. T. The neonatal Fc receptor, FcRn, as a target for drug delivery and therapy / J. T. Sockolosky, F. C. Szoka // Adv. Drug. Deliv. Rev. — 2015. — Vol. 91. — P. 109—124.

100. Ober, R. J. Differences in promiscuity for antibody-FcRn interactions across species: implications for therapeutic antibodies / R. J. Ober, C. G. Radu, V. Ghetie, E. S. Ward // Int. Immunol. — 2001. — Vol. 13. — No 12. — P. 1551—1559.

101. Ward, E. S. Evidence to support the cellular mechanism involved in serum IgG homeostasis in humans / E. S. Ward, J. Zhou, V. Ghetie, R. J. Ober RJ // Int. Immunol. — 2003. — Vol. 15. — No 2. — P. 187—195.

102. Ober, R. J. Exocytosis of IgG as mediated by the receptor, FcRn: an analysis at the single-molecule level / R. J. Ober, C. Martinez, X. Lai, J. Zhou, E. S. Ward // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2004. — Vol. 101. — No 30. — P. 11076—11081.

103. Ward, E. S. From sorting endosomes to exocytosis: association of Rab4 and Rab11 GTPases with the Fc receptor, FcRn, during recycling / E. S. Ward, C. Martinez, C. Vaccaro, J. Zhou, Q. Tang, R. J. Ober // Mol. Biol. Cell. — 2005. — Vol. 16. — No 4. — P. 2028—2038.

104. Gan, Z. Analyses of the recycling receptor, FcRn, in live cells reveal novel pathways for lysosomal delivery / Z. Gan, S. Ram, C. Vaccaro, R. J. Ober, E. S. Ward // Traffic. — 2009. — Vol. 10. — No 5. — P. 600—614.

105. Weflen, A. W. Multivalent immune complexes divert FcRn to lysosomes by exclusion from recycling sorting tubules / A. W. Weflen, N. Baier, Q. J. Tang, M. Van den Hof, R. S. Blumberg, W. I. Lencer, R. H. Massol // Mol. Biol. Cell. — 2013. — Vol. 24. — No 15. — P. 2398—2405.

106. Ober, R. J. Visualizing the site and dynamics of IgG salvage by the MHC class I-related receptor, FcRn / R. J. Ober, C. Martinez, C. Vaccaro, J. Zhou, E. S. Ward // J. Immunol. — 2004. — Vol. 172. — No 4. — P. 2021—2029.

107. Yoshida, M. Human neonatal Fc receptor mediates transport of IgG into luminal secretions for delivery of antigens to mucosal dendritic cells / M. Yoshida, S. M. Claypool, J. S. Wagner, E. Mizoguchi, A. Mizoguchi, D. C. Roopenian, W. I. Lencer, R. S. Blumberg // Immunity. — 2004. — Vol. 20. — No 6. — P. 769— 783.

108. Duncan, A. R. Localization of the binding site for the human high-affinity Fc receptor on IgG / A. R. Duncan, J.M. Woof, L.J. Partridge, D.R. Burton, G. Winter // Nature. — 1988. — Vol. 332. — No 6164. — P. 563—564.

109. Sensel, M. G. Amino acid differences in the N-terminus of C(H)2 influence the relative abilities of IgG2 and IgG3 to activate complement / M. G. Sensel, L. M. Kane, S. L. Morrison // Mol. Immunol. — 1997. — Vol. 34. — No 14. — P. 1019—1029.

110. Thommesen, J. E. Lysine 322 in the human IgG3 C(H)2 domain is crucial for antibody dependent complement activation / J. E. Thommersen, T. E. Michaelsen, G. A. Loset, I. Sandlie, O. H. Brekke // Mol. Immunol. —2000. — Vol. 37. — No 16. — P. 995—1004.

111. Tao, M.H. Structural features of human immunoglobulin G that determine isotype-specific differences in complement activation / M. H. Tao, R. I. Smith, S. L. Morrison // J. Exp. Med. — 1993. — Vol. 178. — No 2. — P. 661—667.

112. Xu, Y.Residue at position 331 in the IgGl and IgG4 CH2 domains contributes to their differential ability to bind and activate complement / Y. Hu, R. Oomen, M. H. Klein // J. Biol. Chem. — 1994. — Vol. 269. — No 5. — P. 3469—3474.

113. Wines, B. D. The IgG Fc contains distinct Fc receptor (FcR) binding sites: the leukocyte receptors Fc gamma RI and Fc gamma RIIa bind to a region in the Fc distinct from that recognized by neonatal FcR and protein A / B. D. Wines, M. S. Powell, P. W. Parren, N. Barnes, P. M. Hogarth // J. Immunol. — 2000. — Vol. 164. — No 10. — P. 5313—5318.

114. Jefferis, R. IgG-Fc-mediated effector functions: molecular definition of interaction sites for effector ligands and the role of glycosylation / R. Jefferis, J. Lund, J. D. Pound // Immunol. Rev. — 1998. — Vol. 163. — P. 59—76.

115. Burton, D.R. Immunoglobulin G: functional sites / D. R. Burton // Mol. Immunol. — 1985. — Vol. 22. — No 3. — P. 161—206.

116. Lu, J. Structure of FcyRI in complex with Fc reveals the importance of

glycan recognition for high-affinity IgG binding / J. Lu, J. Chu, Z. Zou, N. B.

143

Hamacher, M.W. Rixon, P.D. Sun // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2015. — Vol. 112. — No 3. — P. 833—838.

117. Lund, J. Human FcRI and FcRII interact with distinct but overlapping sites on human IgG / J. Lund, G. Winter, P. T. Jones, J. D. Pound, T. Tanaka, M. R. Walker, P. J. Artymiuk, Y. Arata, D. R. Burton, R. Jefferis, J. M. Woof // J. Immunol. — 1991. — Vol. 147. — P. 2657—2662.

118. Morgan, A. The N-terminal end of the CH2 domain of chimeric human IgG1 anti-HLA-DR is necessary for C1q, FcRI and FcRIII binding / A. Morgan, N. D. Jones, A. M. Nesbitt, L. Chaplin, N. W. Bodmer, J. S. Emtage // Immunology. — 1995. — Vol. 86. — No 2. — P. 319—324.

119. Gergely, J. The two bindingsite models of human IgG binding Fcy receptors / J. Gergely, G. Sarmay // FASEB J. — 1990. — Vol. 4. — No 15. — P. 3275— 3283.

120. Shields, R. L. High resolution mapping of the binding site on human IgG1 for Fc gamma RI, Fc gamma RII, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgG1 variants with improved binding to the Fc gamma R / R. L. Shields, A. K. Namenuk, K. Hong, G. Meng, J. Rae, J. Briggs, D. Xie, J. Lai, A. Stadlen, B. Li, J. A. Fox, L. G. Presta // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276. — No 9. — P. 6591— 6604.

121. Lund, J. A protein structural change in aglycosylated IgG3 correlates with loss of huFc gamma R1 and huFc gamma Rill binding and/or activation / J. Lund, T. Tanaka, N. Takahashi, G. Sarmay, Y. Arata, R. Jefferis. // Mol. Immunol. — 1990. — Vol. 27. — P. 1145—1153.

122. Jefferis, R. Interaction sites on human IgG-Fc for FcgR: current models / R. Jefferis, J. Lund // Immunology Letters. — 2002. — Vol. 82. — No 1—2. — P. 57—65.

123. Oganesyan, V. Structural insights into the interaction of human IgG1 with FcyRI: no direct role of glycans in binding / V. Oganesyan, Y. Mazor, C. Yang, K. E. Cook, R. M. Woods, A. Ferguson, M. A. Bowen, T. Martin, J. Zhu, H. Wu, W.

F. Dall'Acqua // Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. — 2015. — Vol. 71. — No 11. — P. 2354—2361. doi: 10.1107/S1399004715018015.

124. Wu, A. M. Engineered antibodies for molecular imaging of cancer / A. M. Wu // Methods. — 2014. — Vol. 65. — No 1. — P. 139—147.

125. Swiercz, R. Use of Fc-engineered antibodies as clearing agents to increase contrast during PET / R. Swiercz, S. Chiguru, A. Tahmasbi, S. M. Ramezani, G. Hao, D. K. Challa, M. A. Lewis, P. V. Kulkarni, X. Sun, R. J. Ober, R. P. Mason, E. S. Ward // J. Nucl. Med. — 2014. — Vol. 55. — No 7. — P. 1204—1207.

126. Medesan, C. Delineation of the amino acid residues involved in transcytosis and catabolism of mouse IgG1 / C. Medesan, D. Matesoi, C. Radu, V. Ghetie, E. S. Ward // J. Immunol. — 1997. — Vol. 158. — No 5. — P. 2211—2217.

127. Ghetie, V. Increasing the serum persistence of an IgG fragment by random mutagenesis / V. Ghetie, S. Popov, J. Borvak, C. Radu, D. Matesoi, C. Medesan, R. J. Ober, E. S. Ward // Nat. Biotechnol. — 1997. — Vol. 15. — No 7. — P. 637—640.

128. Dall'Acqua, W. F. Properties of human IgG1s engineered for enhanced binding to the neonatal Fc receptor / W. F. Dall'Acqua, P. A. Kiener, H. Wu // J. Biol. Chem. — 2006. — Vol. 281. — No 33. — P. 23514—23524.

129. Robbie, G. J. A novel investigational Fc-modified humanized monoclonal antibody, motavizumab-YTE, has an extended half-life in healthy adults / G. J. Robbie, R. Criste, W. F. Dall'Acqua, K. Jensen, N. K. Patel, G. A. Losonsky, M. P. Griffin // Antimicrob. Agents Chemother. — 2013. — Vol. 57. — P. 6147—6153.

130. Zalevsky, J. Enhanced antibody half-life improves in vivo activity / J. Zalevsky, A. K. Chamberlain, H. M. Horton, S. Karki, I. W. Leung, T. J. Sproule,

G. A. Lazar, D. C. Roopenian, J. R. Desjarlais // Nat. Biotechnol. — 2010. — Vol. 28. — No 2. — P. 157—159.

131. Zheng, Y. Translational pharmacokinetics and pharmacodynamics of an FcRn-variant anti-CD4 monoclonal antibody from preclinical model to phase I study / Y. Zheng, H. Scheerens, J. C. Davis Jr, R. Deng, S. K. Fischer, C. Woods,

P. J. Fielder, E. G. Stefanich // Clin. Pharmacol. Ther. — 2011. — Vol. 89. — No 2. — P. 283—290.

132. WADA Technical Document - TD2014EPO. Harmonization of analysis and reporting of erythropoiesis stimulating agents (ESAs) by electrophoretic techniques. [Электронный ресурс] // World Anti-Doping Agency : [сайт] : — URL: https://wada-main-prod. s3. amazonaws.com/resources/files/WADA-TD2014EPO-v1-Harmonization-of-Analysis-and-Reporting-of-ESAs-by-Electrophoretic-Techniques-EN.pdf (11.02.2016)

133. Reichel, C. SARCOSYL-PAGE: a new method for the detection of MIRCERA- and EPO-doping in blood / C. Reichel, F. Abzieher, T. Geisendorfer // Drug Test. Anal. — 2009. — Vol. 1. — No 11-12. — P. 494—504.

134. Reichel, C. SARCOSYL-PAGE: a new electrophoretic method for the separation and immunological detection of PEGylated proteins / C. Reichel // Methods Mol. Biol. — 2012. — Vol. 869. — P. 65—79.

135. Reichel, C. SDS-PAGE of recombinant and endogenous erythropoietins: benefits and limitations of the method for application in doping control / C. Reichel, R. Kulovics, V. Jordan, M. Watzinger, T. Geisendorfer // Drug Test. Anal.

— 2009. — Vol. 1. — No 1. — P. 43—50.

136. Westermeier, R. Electrophoresis in Practice. A guide to methods and applications of DNA and protein separations. Eds. R. Westermeier. — WILEY-VCH, Weinheim, Germany, 2005. — P. 406.

137. Shapiro, A. L. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels / A. L. Shapiro, E. Vinuela, J. V. Maizel // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 1967. — Vol. 28. — No 5. — P. 815—820.

138. Postnikov, P. V. Basic analytical methods for identification of erythropoiesis-stimulating agents in doping control / P. V. Postnikov, G. I. Krotov, Yu. A. Efimova, G. M. Rodchenkov // RUSS. CHEM. REW. — 2016. — Vol. 85.

— No 2. — P. 99—114. DOI: 10.1070/RCR4563

139. Lönnberg, M. Rapid affinity purification of erythropoietin from biological samples using disposable monoliths / M. Lönnberg, Y. Dehnes, M. Drevin, M. Garle, S. Lamon, N. Leuenberger, T. Quach, J. Carlsson // J. Chromatogr. A. — 2010. — Vol. 1217. — No 45. — P. 7031—7037.

140. MAIIA Diagnostics EPO Purification kit [Электронный ресурс] // MAIIA Diagnostics: [сайт]: — URL: http://maiiadiagnostics.com/products/epo_purification_kit/ (15.02.2016)

141. Kohler, M. Discrimination of recombinant and endogenous urinary erythropoietin by calculating relative mobility values from SDS gels / M. Kohler, C. Ayotte, P. Desharnais, U. Flenker, S. Lüdke, M. Thevis, E. Völker—Schänzer, W. Schänzer // Int. J. Sports Med. — 2007. — Vol. 29. — No 1. — P. 1—6.

142. Lasne, F. Double-blotting: a solution to the problem of nonspecific binding of secondary antibodies in immunoblotting procedures / F. Lasne // J. Immunol. Methods. — 2003. — Vol. 276. — No 1-2. — P. 223—226.

143. Bajla, I. GASepo-a software solution for quantitative analysis of digital images in Epo doping control / I. Bajla, I. Holländer, M. Minichmayer, G. Gmeiner, C. Reichel // Comput. Meth. Programs Biomed. — 2005. — Vol. 80. — No 3. — P. 246—270.

144. Stolc, S. Improvement of band segmentation in Epo images via column shift transformation with cost functions / S. Stolc, I. Bajla // Med. Biol. Eng. Comput. — 2006. — Vol. 44. — No 4. — P. 257—274.

145. Lasne, F. Recombinant erythropoietin in urine / F. Lasne, J. De Ceaurriz // Nature. — 2000. — Vol. 405. — P. 635.

146. Wide, L. Molecular charge heterogeneity of human serum erythropoietin / L. Wide, C. Bengtsson // Br. J. Haematol. — 1990. — Vol. 76. — No 1. — P. 121— 127.

147. Tam, R. C. Comparisons of human, rat and mouse erythropoietins by

isoelectric focusing: differences between serum and urinary erythropoietins / R. C.

Tam, S. L. Coleman, R. J. Tiplady, P. L. Storring, P. M. Cotes // Br. J. Haematol.

—1991. — Vol. 79. — No 3. — P. 504—511.

147

148. Wide, L. Detection in blood and urine of recombinant erythropoietin administered to healthy men / L. Wide, C. Bengtsson, B. Berglund, B. Ekblom // Med. Sci. Sports Exerc. — 1995. — Vol. 27. — No. 11. — P. 1569—1576.

149. Harlow, E. Using antibodies. A laboratory manual. Eds. E. Harlow, D. Lane.

— Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1999. — P. 74.

150. B. O. Böhm, P. Kern, B. Neumeister, In: Klinikleitfaden Labordiagnostik, 4th Ed (Eds: B. Neumeister, I. Besenthal, B. O. Böhm). — Urban & Fischer, München, Germany, 2009. — P. 418—421.

151. Reichel, C. Practicing IEF-PAGE of EPO: The impact of detergents and sample application methods on analytical performance in doping control / C. Reichel // Drug Test. Anal. — 2014. — Vol. 2. — No 11-12. — P. 603—619.

152. Sobolevsky, T. Anti-doping analyses at the Sochi Olympic and Paralympic Games 2014 / T. Sobolevsky, G. Krotov, M. Dikunets, M. Nikitina, E. Mochalova, G. Rodchenkov // Drug Test. Anal. — 2014. — Vol. 6. — No 11-12. — P. 1087— 1101.

153. Lasne, F. Detection of isoelectric profiles of erythropoietin in urine: Differentiation of natural and administered recombinant hormones / F. Lasne, L. Martin, N. Crepin, J. de Ceaurriz // Anal.Biochem. — 2002. — Vol. 311. — P. 119.

154. Bjerrum, O. J. Buffer systems and transfer parameters for semi-dry electroblotting with horizontal apparatus / O. J. Bjerrum, C. Schafer-Nielsen, in Electrophoresis '86, (Ed: M. J. Dunn). — Wiley-VCH, Weinheim, 1986. — P. 315

— 327.

155. Collin, M. EndoS, a novel secreted protein from Streptococcus pyogenes with endoglycosidase activity on human IgG / M. Collin, A. Olsen // EMBO J. — 2001. — Vol. 20. — No 12. — P. 3046—3055.

156. Collin, M. Effect of SpeB and EndoS from Streptococcus pyogenes on human immunoglobulins / M. Collin, A. Olsen // Infect. Immun. — 2001. — Vol. 69. — No 11. — P. 7187—7189.

157. Zhang, Z. SpeB proteolysis with imaged capillary isoelectric focusing for the characterization of domain-specific charge geterogeneities of reference and biosimilar rituximab / Z. Zhang, R. Perrault, Y. Zhao, J. Ping // J. Chromatogr. B.

— 2016. — Vol. 1020. — P. 148—157.

158. Wang, A. C. Cleavage sites of human IgG1 immunoglobulin by papain / A. C. Wang, I. Y. Wang // Immunochemistry. — 1976. — Vol. 14. — No 3. — P. 197—200.

159. An, Y. A new tool for monoclonal antibody analysis. Application of IdeS proteolysis in IgG domain-specific characterization / Y. An, Y. Zhang, H.-M. Mueller, M. Shameem, X. Chen // mAbs. — 2014. — Vol. 6. — No 4. — P. 879— 893.

160. von Pawel-Rammingen, U. IdeS, a novel streptococcal cysteine proteinase with unique specificity for immunoglobulin G / U. von Pawel-Rammingen, B. P. Johansson, L. Bjorck // EMBO J. — 2002. — Vol. 21. — No 7. — P. 1607—1615.

161. Chevreux, G. Fast analysis of recombinant monoclonal antibodies using IdeS proteolytic digestion and electrospray mass spectrometry / G. Chevreux, N. Tilly, N. Bihoreau // Anal. Biochem. — 2011. — Vol. 415. — No 2. — P. 212— 214.

162. Wenig, K. Structure of the streptococcal endopeptidase IdeS, a cysteine proteinase with strict specificity for IgG / K. Wenig, L. Chatwell, U. von PawelRammingen, L. Bjorck, R. Huber, P. Sondermann // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

— 2004. — Vol. 101. — No 50. — P. 17371—17376.

163. Wagner-Rousset, E. Antibody-drug conjucate model fast characterization by LC-MS following IdeS proteolytic digestion / E. Wagner-Rousset, M. -C. Janin-Bussat, O. Colas, M. Excoffier, D. Ayoub, J.-F. Haeuw, I. Rilatt, M. Perez // MAbs. — 2014. — Vol. 6. — No 1. — P. 173—184.

164. Elliott, S.D. A proteolytic enzyme produced by group a streptococci with special reference to its effect on the type-specific m antigen / S.D. Elliott // J. Exp. Med. — 1945. — Vol.81. — No 6. — P. 573—592.

165. Burton, D. R. Immunoglobulin G: functional sites / D. R. Burton // Mol. Immunol. — 1985. — Vol. 22. — No 3. — P. 161—206.

166. Adamczyk, M. Papain digestion of different mouse IgG subclasses as studied by electrospray mass spectrometry / M. Adamczyk, J. C. Gebler, J. Wu // J. Immunol. Methods. — 2000. — Vol. 237. — No 1—2. — P. 95—104.

167. Jefferis, R. Antibody therapeutics: isotype and glycoform selection / R. Jefferis // Expert Opin. Biol. Ther. — 2007. — Vol. 7. — No 9. — P. 1401—1413.

168. Goetze, A. M. Rapid LC-MS screening for IgG Fc modifications and allelic variants in blood / A. M. Goetze, Z. Zhang, L. Liu, F. W. Jacobsen, G. C. Flynn // Mol. Immunol. — 2011. — Vol. 49. — No 1-2. — P. 338—352.

169. Goetze, A. M. Rates and impact of human antibody glycation in vivo / A. M. Goetze, L. Liu, T. Arroll, L. Chu, G. C. Flynn // Glycobiology. — 2012. — Vol. 22. — No 2. — P. 221—234.

170. Strand, J. Characterization of Fc-fusion protein aggregates derived from extracellular domain disulfide bond rearrangements / J. Strand, C.-T. Huang, J. Xu // J. Pharm. Sci. — 2013. — Vol. 102. — No 2. — P. 441—453.

171. Lynaugh, H. Rapid Fc glycosylation analysis of Fc fusions with IdeS and liquid chromatography mass spectrometry / H. Lynaugh, H. Li, B. Gong // MAbs.

— 2013. — Vol. 5. — No 5. — P. 641—645.

172. Goetze, A. M. High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans / A.M. Goetze, Y.D. Liu, Z. Zhang, B. Shah, E. Lee, P.V. Bondarenko, G.C. Flynn // Glycobiology. — 2011.

— Vol. 21. — No 7. — P. 949—959.

173. Flynn, G. C. Naturally occurring glycan forms of human immunoglobulins G1 and G2 / G.C. Flynn, X. Chen, Y.D. Liu, B. Shah, Z. Zhang // Molecular Immunology. — 2010. — Vol. 7. — No 11-12. — P. 2074—2082.

174. Schriebl, K. Biochemical characterization of rhEpo-Fc fusion protein expressed in CHO cells / K. Schriebl, E. Trummer, C. Lattenmayer, R. Weik, R. Kunert, D. Müller, H. Katinger, K. Vorauer-Uhl // Protein Expl.Purif. — 2006. — Vol. 49. — No 2. — P. 265—275.

175. Souillac, P. O. Biophysical characterization of insoluble aggregates of a multi-domain protein: an insight into the role of the various domains / P. O. Souillac // J. Pharm. Sci. — 2005. — Vol. 94. — No 9. — P. 2069—2083.

176. Sakurai, K. Effects of a reduced disulfide bond on aggregation properties of human IgG1 CH3 domain / K. Sakurai, R. Nakahata, Y. H. Lee, J. Kardos, T. Ikegami, Y. Goto // Biochim. Biophys. Acta. — 2015. — Vol. 1854. — No 10. — P. 1526—1535.

177. Way, J. C. Improvement of Fc-erythropoietin structure and pharmacokinetics by modification at a disulfide bond / J. C. Way, S. Lauder, B. Brunkhorst, S. M. Kong, A. Qi, G. Webster, I. Campbell, S. McKenzie, Y. Lan, B. Marelli, L. A. Nguyen, S. Degon, K. M. Lo, S. D. Gillies // Protein Eng. Des. Sel.

— 2005. — Vol. 18. — No 3. — P. 111—118.

178. Kiese, S. Shaken, not stirred: Mechanical stress testing of an IgG1 antibody / S. Kiese, A. Pappenberger, W. Friess, H.-C. Mahler // J. Pharm. Sci. — 2008. — Vol. 97. — No 10. — P. 4347—4366.

179. Carpenter, J. F. Inhibition of stress-induced aggregation of protein therapeutics / J. F. Carpenter, B. S. Kendrick, B. S. Chang, M. C. Manning, T. W. Randolph // Methods Enzymol. — 1999. — Vol. 309. — P. 236—255.

180. Mahler, H.-C. Induction and analysis of aggregates in a liquid IgG1-antibody formulation / H.-C. Mahler, R. Muller, W. Friess, A. Delile, S. Matheus // Eur. J. Pharm. Biopharm. — 2005. — Vol. 59. — No 3. — P. 407—417.

181. Wang, W. Protein aggregation and its inhibition in biopharmaceutics / W. Wang // Int. J. Pharm. — 2005. — Vol. 289. — No 1-2. — P. 1—30.

182. Karshikoff, A. Non-covalent interactions in proteins / A. Karshikoff; 1st Ed.

— Imperial College Press, London, UK, 2006. — P. 348.

183. Cromwell, M. E. Protein aggregation and bioprocessing / M. E. Cromwell, E. Hilario, F. Jacobson // AAPS J. — 2006. — Vol. 8. — No 3. — P. 572—579.

184. Andya, J. D. Mechanisms of aggregate formation and carbohydrate excipient

stabilization of lyophilized humanized monoclonal antibody formulations / J. D.

Andya, C. C. Hsu, S. J. Shire // AAPS. Pharm. Sci. — 2003. — Vol. 5. — P. 10.

151

185. Shahrokh, Z. Major degradation products of basic fibroblast growth factor: Detection of succinimide and iso-aspartate in place of aspartate 15 / Z. Shahrokh, G. Eberlein, D. Buckley, M. V. Paranandi, D. W. Aswad, P. Stratton, R. Mischak, Y. J. Wang // Pharm. Res. — 1994. — Vol. 11. — No 7. — P. 936—944.

186. Kaisermayer, C. Biphasic cultivation strategy to avoid EPO-Fc aggregation and optimize protein expression / C. Kaisermayer, D. Reinhart, A. Gili, M. Chang, P. M. Aberg, A. Castan, R. Kunert // J. Biotechnol. — 2016. — Vol. 227. — P. 3—9.

187. Arakawa, T. Factors affecting short-term and long term stabilities of proteins // T. Arakawa, S. J. Prestrelski, W. C. Kenney, J. F. Carpenter // Adv. Drug Deliv. Rev. — 1985. — Vol. 46. — No 1-3. — P. 307—326.

188. IdeS protease protocol [Электронный ресурс] // Promega Corporation: [сайт] : — URL:

http://worldwide.promega.com/~/media/files/resources/protocols/product%20infor mation%20sheets/n/ides%20protease%20protocol.pdf (18.05.2016)

189. Warburg, O. Isolierung und Kristallisation des Garugsterments Enolase / O. Warburg, W. Christian // Biochem. Z. — 1941. — Vol. 310. — P. 384—421.

190. ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009. Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий [Электронный ресурс] // / Межгосударственный совет по стандартизации, метрологии и сертификации: [сайт]: — URL: http://www.rustehsert.ru/docs/gost170252009.pdf (23.06.2016)

191. World Anti-Doping Code. International Standart for Laboratories [Электронный ресурс] // World Anti-Doping Agency: [сайт]: — URL: https://wada-main-prod. s3 .amazonaws.com/resources/files/isl_june_2016.pdf (23.06.2016)