Противоящурные вакцины типов О, Азия-1, А для формирования раннего иммунитета у животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Елькина Юлия Сергеевна

• Елькина Юлия Сергеевна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Елькина Юлия Сергеевна

1.1 Актуальность темы

1.2 Степень разработанности темы

1.3 Цель и задачи исследования

1.4 Научная новизна исследования

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

1.6 Методология и методы исследований

1.7 Основные положения, выносимые на защиту

1.8 Личный вклад соискателя

1.9 Апробация результатов исследования

1.10 Объем и структура диссертации

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Вирус ящура, его филогенетическая характеристика

2.2 Антигенные и иммуногенные свойства компонентов вируса ящура

2.3 Технология производства противоящурных вакцин

2.3.1 Культивирование вируса ящура

2.3.2 Инактивация вируса ящура

2.3.3 Очистка и концентрирование вируса ящура

2.3.4 Адъюванты в противоящурных вакцинах

2.4 Виды противоящурных вакцин для сельскохозяйственных животных

2.4.1 Сорбированные вакцины

2.4.2 Эмульсионные вакцины

2.4.3 Эмерджентные вакцины

2.5 Иммунитет при ящуре

2.5.1 Постинфекционный иммунитет

2.5.2 Поствакцинальный иммунитет

2.6 Заключение по обзору литературы

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы

3.2 Методы

4 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Адаптация изолятов вируса ящура О/MOG/13/2017, Азия-1 Пакистан/2018, A/EGY/2/2018 к монослойным культурам клеток СП, IB-RS-

2, ПСГК-30, ВНК-21

4.2 Получение индикаторного (контрольного) вируса ящура штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-ГУ

4.3 Адаптация вируса ящура штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-^ к суспензионной культуре клеток ВНК-

21

4.4 Подготовка посевного вируса ящура О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-ГУ

4.5 Влияние режима инактивации и очистки на компонентный состав вируса ящура штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-

IV

4.6 Концентрирование вируса ящура штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-^ методом ультрафильтрации

4.7 Изготовление инактивированных противоящурных вакцин для ранней

защиты

4.7.1 Определение количества 146+75S компонентов, необходимых для формирования защиты в ранние сроки после вакцинации

4.7.1.1 с использованием сорбированной вакцины для КРС

4.7.1.2 с использованием эмульсионной вакцины для свиней

4.8 Исследование сывороток крови животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура после вакцинации эмерджентными вакцинами

5 ОБСУЖДЕНИЕ

6 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6.1 Итоги выполненных исследований (выводы)

6.2 Практические предложения

6.3 Перспектива дальнейшей разработки темы

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

8 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

9 ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Противоящурные вакцины типов О, Азия-1, А для формирования раннего иммунитета у животных»

ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность темы

Ящур - высококонтагиозное вирусное заболевание, поражающее как диких,

так и домашних парнокопытных животных. Ящур считается одним из наиболее экономически важных заболеваний скота из-за его способности заражать множество видов, влиять на продуктивность животных и быстро распространяться внутри и между географическими регионами [22Б, 156].

Многие исследователи [107, 150] отмечали, что в течение 40 лет особые генетические подтипы (топотипы) вируса ящура сохраняются в ограниченном диапазоне стран и только периодически и временно выходят за рамки своего территориального распространения. Вирус ящура присутствует на территориях Африки, Азии и Южной Америки, может легко пересечь международные границы и стать причиной эпидемии в ранее свободных от заболевания районах [25В].

В Российской Федерации применяется система профилактических мероприятий и борьбы с ящуром, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в зонах высокой степени риска заноса вируса, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных [65].

Вакцинация животных предусматривает использование моно- и поливалентных инактивированных вакцин, изготовленных из штаммов разных типов вируса ящура, которые можно использовать для профилактики или экстренной защиты, отдельно или более эффективно в качестве дополнения к ветеринарно-санитарным мерам [79].

Для купирования вспышки ящура и предупреждения распространения вируса требуется быстрая типизация изолятов вируса ящура и изучение их биологических свойств, что необходимо при выборе подходящего штамма для производства противоящурных вакцин [3, 18, 34].

Особую опасность представляют эпизоотии ящура, вызванные вирусом, антигенно отличающимся от используемых производственных штаммов. Высокая мутационная изменчивость генома и, как следствие, антигенная вариабельность

изолятов вируса ящура в пределах одного генотипа, приводит к возникновению новых полевых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов [2, 64, 124, 139].

Стратегия экстренной, вынужденной вакцинации при заносе возбудителя на территорию России приобретает особую важность, основанием для которой является необходимость создания ранней защиты всех восприимчивых животных. Сокращение времени для формирования иммунитета против ящура в организме восприимчивых животных является актуальной задачей.

По данным ряда авторов [79, 15], вакцинация может уменьшить количество выделяемого вируса по сравнению с неиммунизированными животными и снизить риск распространения инфекции по мере увеличения интервала между вакцинацией и заражением вирусом.

Для улучшения мер борьбы с заболеванием в энзоотичных странах важно отслеживать текущие варианты распространенения полевых изолятов вируса ящура для обеспечения того, чтобы в короткие сроки иметь возможность исследования биологических свойств интересующего изолята и разработать эффективную вакцину из вызвавшего вспышку вируса [74, 83, 158, 175].

Существует угроза заноса штаммов вируса ящура генетических линий О/МЕ^АЛпё 2001, Азия-1М£ГЛ^таЬ-08, А/AFRICA/G-IV на территорию РФ. Вирус ящура О/MOG/13/2017 генетической линии О/МЕ^А/Гпё 2001 имеет тенденцию к распространению в странах Юго-Восточной Азии. По данным филогенетического анализа, изолят О/MOG/13/2017 имеет более 99% родства с изолятами, которые вызвали вспышки в Забайкальском крае Российской Федерации в 2016 году. Также период с сентября 2017 года по март 2018 года было зарегистрировано еще около 30 вспышек ящура типа О у крупного рогатого скота, овец и коз в нескольких аймаках Монголии, что также свидетельствует о быстром распространении вируса ящура на территориях страны [156, 176].

Изолят Азия-1 Пакистан/2018, принадлежащий родословной Азия -1М^ГА^тёЬ-08, вызвал вспышку ящура в 2018 году в Пакистане и до сих пор представляет угрозу распространения ящура типа Азия -1 в странах Западной и

Центральной Азии. Это связано преимущественно с незаконным перемещением людей и скота отсутствием в некоторых районах ветеринарной инфраструктуры [132, 176].

Изолят A/EGY/2/2018 генетической линии A/AFRICA/G-IV был нотифицирован в 2017-2018 годах во многих странах Северо-Восточной Африки, активно развивающих индустрию туризма и имеющих торгово-экономические связи с Россией, вследствие чего всегда существует риск заноса заболевания на территорию РФ [18, 176].

Изготовление профилактических препаратов из новых антигенно различающихся штаммов вируса ящура, способных сформировать напряженный иммунитет у естественно восприимчивых животных на ранних сроках после вакцинации, является актуальной задачей наших исследований.

1.2 Степень разработанности темы

Быстрая защита против ящура представляет принципиально новую стратегию вакцинопрофилактики и является следствием специфического устранения врожденной (видовой) восприимчивости организма к определенному заболеванию [6А]. Разработке противоящурных вакцин для формирования раннего иммунитета у животных, а также усовершенствованию стратегий борьбы с внезапно возникающими вспышками заболевания, проведения экстренной вакцинации и поддержания статуса благополучия на территории стран, граничащих с эндемичными по ящуру государствами, посвящены исследования многих ученых: Cox S.I. et al., 2009; Дудников А.И. и др., 2008.

Однако в доступной литературе представлено недостаточно информации об обосновании быстрой подготовки изолятов в качестве кандидатов для изготовления вакцин, о количестве иммуногенных компонентов, необходимых для индуцирования защитного иммунитета у животных через 4-7 дней после вакцинации, а также об использовании эффективных адъювантов в препаратах.

1.3 Цель и задачи исследования

Целью нашей работы являлась разработка противоящурных вакцин для ранней защиты из новых штаммов генетических линий О/МЕ^АЛпё 2001, Азия-1М^ГА^тёЬ-08, А/АШСАЮ-^ и их испытание на естественно восприимчивых животных.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- адаптировать изоляты вируса ящура О/MOG/13/2017 (О/МЕ^А/Гпё 2001), Азия-1 Пакистан/2018 (Азия-1/ASГA/Sindh-08), A/EGY/2/2018 (А/АFRГCA/G-ГV) к производственным культурам клеток (ПСГК-30, ГB-RS-2, СП и ВНК-21) для получения посевного вируса штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-ГУ;

- подготовить индикаторные штаммы вируса ящура О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-^ для проверки иммуногенности вакцин и уровней гуморального иммунитета у естественно восприимчивых животных;

- отработать технологические режимы инактивации, очистки и концентрирования антигенов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-^ при изготовлении вакцин для ранней защиты;

- изготовить опытные образцы эмульсионных вакцин с различным содержанием иммуногенных компонентов из штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205^-ГУ;

- изучить антигенные и протективные свойства изготовленных вакцин на естественно восприимчивых сельскохозяйственных животных на 4-7 сутки после вакцинации.

1.4 Научная новизна исследования

Научная новизна состоит в том, что:

- изучены культуральные свойства вируса ящура О/MOG/13/2017, Азия-1 Пакистан/2018, A/EGY/2/2018;

- получены индикаторные штаммы О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-1У с целью проверки иммуногенной активности вакцин для свиней и крупного рогатого скота;

- отработаны режимы инактивации, концентрирования и очистки вируса ящура О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-1У;

- изготовлены экспериментальные образцы инактивированных эмульсионных противоящурных вакцин для ранней защиты из штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-ГУ;

- определено количество 146+758 компонентов в вакцине, формирующее иммунную защиту через 7 суток после вакцинации против гомологичного штамма вируса ящура О №2344/Монголия/2017;

- определено количество иммуногенных компонентов, индуцирующих защиту у животных на 4 сутки после вакцинации против гомологичных штаммов вируса ящура Азия-1 №2356/14/18 и А №2205/0-1У.

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Исследования проводились в рамках федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2015-2020 годы)» по государственным контрактам №15/18 от 20.03.2018, №25/19 от 01.04.2019, №10/20 от 02.03.2020 на выполнение научно-исследовательских и опытно-конструкторских работ по созданию новых защитных препаратов на основе циркулирующих вновь выделенных изолятов особо опасных и экзотических инфекций животных и их испытание.

На основании результатов проведенных исследований подготовлены:

«Методические рекомендации по определению титра инфекционной активности культурального вируса ящура в сырье для вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ)»;

СТО 00495527-0143-2018 «Вакцина против ящура сорбированная моно-и поливалентная (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21)»;

СТО 00495527-0065-2020 «Вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная «АРРИАХ-ВАК».

Получен патент на изобретение № 2741639 «Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная»;

Оформлена заявка № 2021113565 от 12.05.2021 на получение патента «Вакцина для ранней защиты против ящура из штамма А №2205Ю-^ культуральная инактивированная эмульсионная».

1.6 Методология и методы исследований

В работе использованы вирусологические, серологические и иммунологические методы исследований с использованием клеточных культур, лабораторных и естественно восприимчивых к ящуру животных.

1.7 Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты адаптации изолятов О/MOG/13/2017, Азия-1 Пакистан/2018, A/EGY/2/2018 к культурам клеток ПСГК-30, ГВ^-2, СП, ВНК-21;

- подготовка индикаторных штаммов вируса ящура О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-^ на КРС и свиньях;

- результаты инактивации, очистки и концентрирования штаммов вируса ящура О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-^;

- количество иммуногенных компонентов в эмульсионной вакцине, индуцирующих иммунитет через 4-7 суток после вакцинации против гомологичных и гетерологичных штаммов вируса ящура.

1.8 Личный вклад соискателя

Работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность за консультативную, научно-методическую и практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы коллективу лаборатории профилактики ящура, д-ру ветеринарн. наук Михалишину Д.В., канд. биол. наук

Доронину М.И., канд. ветеринарн. наук Борисову А.В., канд. биол. Жбановой Т.В. и сотрудникам научной библиотеки ФГБУ «ВНИИЗЖ».

наук

1.9 Апробация результатов исследования

Результаты исследований по теме диссертации были представлены и обсуждены на заседаниях комиссии ФГБУ «ВНИИЗЖ» по заслушиванию выполнения индивидуальных планов аспирантов в период 2017-2020 гг., опубликованы в четырех статьях журналов перечня ВАК, а также представлены в виде статьи на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Ивана Васильевича Звягина в октябре 2020г. в ФГБНУ ВНИТИБП (Московская область, г. Щелково). Достоверность проведенных исследований подтверждена результатами комиссионных испытаний.

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работ, в том числе 4 статьи в изданиях, включенных в Перечень ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций, а также получен патент на изобретение № 2741639 «Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная».

1.10 Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 153 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение, заключение, список сокращений и условных обозначений, список использованной литературы, приложения; иллюстрирована 27 таблицами и 12 рисунками. Список использованной литературы включает 176 источников, из них 109 иностранных. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Вирус ящура, его филогенетическая характеристика

Впервые ящур было описан в 1546 г. в Италии ученым О. Егасав1шо. Важнейшим результатом работы немецких исследователей Б. ЬоеГйег и Р.Егоб^ в 1897 году было открытие вирусной природы возбудителя заболевания и его основных свойств [50, 66].

Вирус ящура относится к семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, имеет вирион размером около 20 нм. Геном представлен одноцепочечной линейной РНК с приблизительно 8500 оснований, окруженных четырьмя структурными белками (УР1, УР2, УР3 и УР4), которые образуют икосаэдрический капсид [66, 96, 114].

В настоящее время различают семь иммунологически различных серотипов вируса ящура (О, А, С, Азия 1, САТ-1, САТ-2 и САТ-3) с широким спектром антигенных и эпизоотических отдельных подтипов внутри каждого серотипа. Как типичный РНК-содержащий вирус, вирус ящура отличается высокой частотой мутаций, отраженных в показателях эволюции генома. Различные сероварианты вируса ящура возникают вследствие генетической рекомбинации, непрерывной циркуляция вируса в полевых условиях, во время персистирующей инфекции в организме животных [4, 45, 114, 156].

Вирус ящура размножается чрезвычайно быстро, отличается высокой контагиозностью и поражает домашних и свободно живущих парнокопытных млекопитающих [4, 169].

В настоящее время глобальное заражение животных ящуром поддерживается в трех континентальных резервуарах - Азии, Африке и Южная Америка, которые подразделяются на семь основных вирусных пулов инфекции, представляющих собой отдельные экосистемы: Юго-Восточная Азия и Китай, Южная Азия, Ближний и Средний Восток, Западная и Центральная Африка, Восточная Африка, Южная Африка и Южная Америка. Каждый пул включает минимум три серотипа вируса, которые развиваются и циркулируют внутри этих региональных экосистем, являются специфическими для региона и для которых часто (в случае вирусов типа A и СAT) требуются индивидуальные вакцины.

Восьмой пул инфекции в Западной Европе присутствовал до 1980-х годов, но был ликвидирован с помощью комбинации профилактических вакцинаций и зоосанитарных мер [24, 63, 86].

Для каждого серотипа вируса ящура характерны свои эпизоотологические характеристики [134].

Серотип О представляет серьезную угрозу в Европе и является самым распространенным серотипом в мире. Некоторые генетические линии этого серотипа вызывают заболевание преимущественно у свиней, тогда как другие (РаиАв1а) не ограничены конкретным хозяином [69, 134].

Серотип А отличается большим антигенным разнообразием между вирусами этого серотипа, и часто между ними нет перекрестной защиты. Существует также доказательство того, что рекомбинация в серотипе А встречается гораздо чаще, чем у других серотипов. Также отмечено, что много новых линий серотипа А регулярно появляются и могут исчезнуть [89, 135].

Штаммы серотипа Азия-1 кажутся менее опасными и вызывают вспышки ящура в Азиатских странах. Тем не менее, в последние годы рост распространения вирусов этого типа наблюдали в Турции и Греции в 2000 году, на территории Северной Кореи в 2007 году, в Китае ящур данного типа регистрировали на протяжении 2001-2009 гг. В 2018-2019 гг. вирус ящура типа Азия-1 был выявлен в следующих странах: Непал, Афганистан, Иран, Пакистан и Бангладеш [24А, 135, 157].

Серотипы САТ 1, 2 ,3 обычно циркулируют в Африке, но также были спорадические вспышки в Саудовской Аравии и Кувейте в 2000 году, в Египте и Ливии в 2012 году. Существует более высокая вариация последовательности в каждом из трех типов САТ, чем в серотипе О [72].

За последние 20 лет не было крупных вспышек вируса ящура серотипа С. Два основных пика встречаемости серотипа С отмечали в 70-80 годах прошлого столетия в Южной Америке, а также в Бразилии и Кении в 2004 году. Исчезновение данного серотипа можно объяснить тем, что некоторые вирусы по своей природе являются более адаптивными, чем другие [150].

В эндемичных по ящуру странах очень важно отслеживать текущие варианты распространенных серотипов и генетических линий вируса, чтобы получить информацию о происхождении вспышки, предупредить занос ящура на территории пограничных государств, подобрать наиболее подходящие вакцинные штаммы для производства профилактических препаратов [135].

Для отображения эволюционной динамики и установления взаимосвязи между генетическими линиями, а также для отслеживания подлинного происхождения и движения штаммов, вызвавших вспышки, используются секвенирование и филогенетические анализы на основе частичных или полных нуклеотидных последовательностей, кодирующие структурный белок вируса ящура VP1, который входит в состав главной антигенной детерминанты, обусловливающей типовую и штаммовую специфичность вируса. Впервые данный подход в исследованиях ящура применили E. Beck и K. Strohmaier в 1987 г. Филогенетический анализ применяется в эпизоотологических исследованиях ящура с начала 90-х г. прошлого века [4, 72, 150, 169].

Стационарно неблагополучными по ящуру являются такие страны как: Индия, Пакистан, Иран, Турция, Израиль, Саудовская Аравия, Вьетнам, Малайзия, Таиланд, Филиппины и другие [48].

2.2 Антигенные и иммуногенные свойства компонентов вируса ящура

Использование современных вирусологических, биохимических и иммунохимических методик помогает обогащать текущие знания об антигенах ящура, которые продуцируются во время инфекционного цикла в культуре клеток и в организме животных. В настоящее время известны четыре вида вирусспецифических антигенов вируса ящура: 146 S компонент, 75S частицы, 12S компонент и 3,8 S субъединицы [44].

146S компонент (полные частицы) состоит из одной молекулы вирусной РНК и 60 копий полипептида, каждая из которых представляет собой комплекс белков VP1 -VP2 -VP3 - VP4. Так называемый «иммунизирующий» 146 S антиген по своим размерам (25нм), константе седиментации (146S) и плотности (1,43 г/мл)

идентичен полному вириону, обладает наибольшей инфекционной и комплементсвязывающей активностью, иммуногенностью и устойчивостью [63, 112].

Вторым компонентом, с которым связано 85% комплементсвязывающей активности вируса ящура, является 75 S антиген. Размер этого антигена составляет 21нм, константа седиментации - 75S, плотность 1,31 г/мл. 75S частицы не содержат инфекционной РНК, включают в себя 60 копий полипептида VP1 -VP3 -VP0, обладают комплементсвязывающими и преципитирующими свойствами [44, 45, 63].

Учеными Trautman B. R. et al. в 1968 году было установлено, что в результате прогревания при 56°С или диализа против цитратно-фосфатного буфера с рН 4,5 146S антиген распадается на 12S компоненты - структурные компоненты капсида, состоящие из белков VP1, VP2, VP3. Их диаметр 7нм, константа седиментации 12-14S, плотность 1,5 г/мл. В исследованиях отмечается, что структурная субъединица 12 S, обладая серологическими свойствами при отсутствии инфекционности, продуцирует только низкие уровни вируснейтрализующих антител [4, 63].

3,8S субъединица или VIA-антиген был открыт в 1966 году учеными Graves J.H. et al. Данный компонент не является компонентом вириона, но является вирусспецифическим протеином, образующимся в тканях организма или культуре клеток в результате вирусной инфекции. Было доказано, что VIA-антиген является РНК-полимеразой, индуцированной вирусной рибонуклеиновой кислотой. Константа седиментации VIA-антигена составляет 3,8 S, он термолабилен и теряет активность в среде с pH 5,0. Этот антиген является ответственным за перекрестные межтиповые реакции [56].

В опытах на морских свинках выявили, что в сравнительном аспекте наиболее высокой иммуногенной активностью обладает 146 S компонент. Учеными были изготовлены препараты 146S, 75S и 12S частиц вируса ящура А Крузейро с различными адъювантами. Животных вакцинировали подкожно, а затем исследовали сыворотки крови на наличие вируснейтрализующих антител.

По результатам исследования было выявлено, что вакцина из 146 Б частиц была более иммуногенной, чем из 75 Б капсид. Препарат 12Б субъединиц, приготовленный из 146Б вирионов, не вызывал у лабораторных животных образования вируснейтрализующих антител и не создавал у них иммунитета. В то же время аналогичный препарат из пустых 75Б частиц обладал определенным протективным эффектом [66].

В исследованиях на мышах также было показано, что для получения у животных иммунного ответа требовалось введение в 2-3 раза большего количества 75 Б и в 15-20 раз - 12Б компонента. Следовательно, 146 Б компонент считают базовым антигеном при создании противоящурных вакцин, а содержание этого антигена является важным показателем качества профилактических препаратов. Данный факт служит аргументом для детального исследования каждой партии сырья для производства противоящурных вакцин на определение количества 146Б компонента. Для этих целей широкое применение получил количественный вариант реакции связывания комплемента (РСК): концентрацию 146Б частиц определяют разделением в градиенте концентрации сахарозы и измерением оптического поглощения при 254-260 нм или комплементсвязывающей активности соответствующих фракций [43, 58].

Иммуногенность противоящурных вакцин находится в прямой зависимости не только от концентрации 146 Б частиц вируса ящура, но и от состояния полипептида УР1 в их составе. Среди структурных белков УР1 экспонируется на поверхности капсида и играет важную роль в формировании вируснейтрализующих антител. В опытах на свиньях, морских свинках и КРС учеными было установлено, что при исследовании иммуногенных свойств полипептидов УР1, УР2 и УР3 вируса ящура преципитирующие и нейтрализующие антитела образовывались лишь на введение полипептида УР1[44, 66]. Ме1оеп Я.И. е1 а1. [140В] подтвердили иммуногенность полипептида УР1 вируса ящура для морских свинок и экспериментально доказали отсутствие иммуногенности белка УР4.

Котовой М.В. и Дудниковым Л.И. [22А] был разработан экспресс-метод определения количественной и качественной характеристик полипептида VP1 в образцах вакцин. Метод основан на способности трипсина в дозе 2мг/мл расщеплять белок VP1 с последующим анализом препаратов методами количественной РСК и электрофорезом в полиакриламидном геле.

Частичная или полная кодирующая последовательность VP1 использовалась в молекулярно-биологических исследованиях, разработке инженерных вакцин и создании диагностических методов. Частичные и полные нуклеотидные последовательности VP1 являются предпочтительной областью для изучения и сравнения изолятов вируса ящура [4, 112, 114].

2.3 Технология производства противоящурных вакцин

Вакцины против ящура были одними из первых вакцин, которые были разработаны, начиная с конца 19-го века. Благодаря открытиям ряда исследователей, в том числе европейских, таких как Valle Н. (Франция), Waldman О. (Германия), Frenkel H.S. (Голландия) и Capstick P.B. (Великобритания), вакцины против ящура начали производиться в промышленных масштабах с 1950 года, что сделало возможной вакцинацию миллионов животных в Европе и за ее пределами [137].

Качество противоящурных вакцин во многом зависит от производственного штамма вируса. Термин «производственный штамм» означает популяцию вируса, которая в совокупности с культуральной системой и условиями выращивания обеспечивает получение иммуногенного биопрепарата [60].

Технология изготовления противоящурных вакцин из очищенного и концентрированного вируса ящура включает:

- культивирование суспензионной культуры клеток ВНК-21;

- получение культурального вируса;

- инактивацию вируса с применением производных этиленимина, обеспечивающих сохранение его физической структуры;

- очистку суспензии вируса с использованием полимерных флокулянтов и хлороформа;

- концентрирование вируса или антигена на сорбентах, осаждением полиэтиленгликолем, с помощью метода ультрафильтрации;

- изготовление сорбированного или эмульсионного препарата с использованием соответствующего адъюванта;

- контроль готовой противоящурной вакцины по нескольким параметрам: полнота инактивации, стерильность, безвредность и иммуногенность [14].

2.3.1 Культивирование вируса ящура

В период 30-50 годов прошлого столетия производство противоящурных вакцин базировалось на вирусном сырье в виде лимфы и оболочек афт, снятых с языка крупного рогатого скота. Вследствие большой эпизоотической опасности получения афтозного вируса и его высокой стоимости была необходимость найти более приемлемые и безопасные источники вируса. Поиски привели к разработке методов культивирования вируса ящура в организме новорожденных крольчат, в эпителиальных тканях языка крупного рогатого скота и в культуре клеток [80, 137].

Бгепке1 Н.Б. 1948-1954г [120А] был выполнен целый комплекс работ, связанных с изучением условий культивирования и накопления вируса ящура в эксплантатах эпителия языка крупного рогатого скота. Собранный эпителий впоследствии был инфицирован вирусом ящура, чтобы производить большое количество реплицированного урожая вируса, который смешивали с хлороформом, осветляли центрифугированием и фильтровали через фильтры Зейтца. Испытание защитных свойств вакцин, полученных из вируса, выращенного в эксплантатах, и полевого вируса показало их одинаково высокую активность.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Елькина Юлия Сергеевна, 2022 год

использованных

в

опыте

Анализ данных таблицы 17 показал, что вакцины, содержащие в прививной дозе не менее 32 мкг иммуногенных компонентов, защищают привитых животных через 10 суток после заражения гетерологичными штаммами вируса ящура.

4.7.1.2 с использованием эмульсионной вакцины для свиней

Из полученных концентратов антигенов вируса О №2344/Монголия/2017, О №2047/Саудовская Аравия/08, О №2147/Приморский/2012 изготовили моновалентные эмульсионные противоящурные вакцины с применением адъюванта Мо^ашёе ГБЛ-206 УО. Для этого полученные концентраты смешивали при помощи гомогенизатора БНуегБОИ 5Ь с масляным адъювантом Мо^ашёе ГБЛ-206 УО в пропорции 50:50 по массе. Смешивание проводили при 850 об/мин в течение 5 минут. Затем полученные вакцины в стерильных условиях фасовали во флаконы.

Количество иммуногенных компонентов в 2 см3 вакцины О №2344/Монголия/2017 составило 12,11 мкг, в 2 см3 вакцины О №2047/Саудовская Аравия/08 - 15,05 мкг и О №2147/Приморский/2012 - 14,6 мкг. По пять голов подсвинков иммунизировали каждой вакциной внутримышечно за ухом в две точки по 2 см3. Уровни гуморального иммунитета определяли в реакции нейтрализации через 4 и 7 дней после иммунизации. Контрольное заражение свиней проводили через 7 дней после введения вакцин адаптированным к свиньям вирусом О №2344/Монголия/2017. Результаты представлены в таблице 18.

Таблица 18 - Исследование гуморального и протективного иммунитета у свиней, вакцинированных

эмульсионными препаратами против ящура типа О (М±т, р<0,001)

Титры ВНА против вируса ящура, 1о§2 Результаты

Характеристика 4 СПВ 7 СПВ заражения

вакцины/количество вирусом

мкг 146+758 в дозе О №2047 О № 2147/ О №2344/ О №2047 О № 2147/ О №2344/ О №2344

/Саудовская Аравия/08 Приморский/ 2012 Монголия/ 2017 /Саудовская Аравия/08 Приморский /2012 Монголия/ 2017 /Монголия/17 через 7 СПВ (защита/ опыт)

Эмульсионная, О №2047/ 3,00±0,38 1,95±0,10 2,05±0,17 3,40±0,36 2,10±0,10 2,35±0,35 4/5

Саудовская Аравия/08/ 30,1 мкг

Эмульсионная, О №2147/ 2,30±0,22 3,35±0,17 3,25±0,18 2,95±0,15 4,20±0,29 3,60±0,27 5/5

Приморский/2012/ 29,2 мкг

Эмульсионная, О №2344/ 1,50±0,18 1,75±0,18 3,00±0,36 2,00±0,33 3,25±0,26 3,90±0,30 5/5

Монголия/2017/

24,2 мкг

Контроль 0/1

Примечание: числитель - количество защищенных животных при контрольном заражении; знаменатель - количество животных, использованных в опыте

По данным таблицы 18 видно, что после контрольного заражения через 7 СПВ были защищены все животные, привитые эмульсионными вакцинами из штаммов О №2344/Монголия/2017 и О №2147/Приморский/2012, а вакцина из штамма О №2047/Саудовская Аравия/08 защитила четыре животных из пяти. Контрольное животное заболело через 48 часов с генерализацией процесса.

В этом же исследовании, результаты которого представлены на рисунке 7, изучили динамику титров антител у свиней после применения двойной дозы вакцин из штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08, О №2147/Приморский/2012 и О №2344/Монголия/2017 против гомо- и гетерологичных штаммов через 4 и 7 суток после вакцинации. Вспышки ящура у вакцинированного поголовья, за редким исключением, вызваны изолятами, отличающимися в антигеном отношении от производственных штаммов, включенных в вакцину. В производственной практике для изготовления противоящурных вакцин активно используются штаммы О №2047 Саудовская Аравия/08 и О №2147 Приморский/2012. Из рассмотренных вариантов против штамма О №2344 Монголия/2017 в ранние сроки может быть сформирован защитный иммунитет с использованием для вакцинации препаратов, содержащих в своем составе данные штаммы в количестве не менее 30 мкг в дозе.

Рис. 7 - Динамика титров ВНА у свиней после применения двойной дозы вакцин из штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08, О №2147/Приморский/2012 и О №2344/Монголия/2017 против гомологичных и

гетерологичных штаммов вируса ящура на 4 и 7 СПВ

Согласно рисунку 7, уровень ВНА у привитых животных вакциной из штамма О №2047 Саудовская Аравия/08 составил через 4 СПВ - 2,05±0,17 и через 7 СПВ - 2,35±0,35 против гетерологичного штамма О №2344 Монголия/2017, что в 1,93 раз ниже на 4 СПВ и в 2,1 раз ниже на 7 СПВ, чем против гомологичного штамма.

Вакцина из штамма О №2147 Приморский/2012 индуцирована титры ВНА против штамма О №2344 Монголия/2017 в количестве 3,25±0,18 и 3,60±0,27 через 4 и 7 СПВ, соответственно, что в 1,10 и 1,50 раз ниже, чем против гомологичного штамма.

У свиней, привитых вакциной из штамма О №2344 Монголия/17, титры ВНА в отношении гомологичного штамма с 4 по 7 СПВ возросли в 1,86 раз. Изготовленные препараты в отношении гомологичных штаммов индуцируют более высокие уровни ВНА.

Работа по оценке влияния количества иммуногенных компонентов и времени после вакцинации КРС была проведена с эмульсионной вакциной из штамма О №2344 Монголия/2017, содержащей в прививном объеме 2 см3 12,1 мкг 146+758 компонентов.

Четыре группы по шесть голов КРС были иммунизированы внутримышечно в среднюю треть шеи вакциной из штамма О №2344 Монголия/2017 в дозах 2 и 4 см3, а вакцинами из штаммов О №2147/Приморский/2012 и О №2047/Саудовская Аравия/08 в дозе 4 см3. Инъекции вакцины в дозе 4см3 проводили в две точки по 2см3. Количество иммуногенных компонентов 146+75Б в прививной дозе 2см3 вакцины из штамма О №2344 Монголия/2017 было равно 12,1 мкг, вакцины из штамма О №2147/Приморский/2012 - 14,6 мкг и вакцины из штамма О №2047/Саудовская Аравия/08 - 15,05 мкг. Гуморальный иммунитет против гомологичных и гетерологичных штаммов изучали через 4 и 7 СПВ. Результаты исследований отражены на рисунке 8.

Рис. 8 - Динамика титров ВНА через 4 и 7 СПВ у КРС, иммунизированного эмульсионными вакцинами с

различным содержанием иммуногенных компонентов

Исследования против гомологичного вируса в зависимости от количества иммуногенных компонентов показали, что при введении одной дозы 2 см3/12,1 мкг 146+75 Б компонентов эмульсионной вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017 через 4 СПВ титры антител против гомологичного вируса составили 2,83±0,33 при инъекции 4см3 /24,2 мкг 146+75Б компонентов -3,46±0,24 Увеличение прививной дозы в два раза увеличило прирост ВНА в 1,55 раза (на 0,63 ^2) по сравнению с однократной дозой.

Через 7 СПВ титры против гомологичного вируса составили 4,67±0,23 Двукратное увеличение иммуногенных компонентов увеличило количество антител до 5,00±0,21 ^2 (на 0,54 ^2) в 1,25 раза. Два основных фактора важны для формирования раннего иммунитета - количество иммуногенных компонентов и время после вакцинации.

При однократной дозе введения вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017 на 4 сутки после иммунизации КРС уровень ВНА против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 составлял 2,21±0,41 и 2,46±0,29 соответственно.

Выявлено, что на 4 сутки после введения двойной дозы моновалентной эмульсионной вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017 уровень ВНА против гомологичного штамма составил 3,46±0,19 против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 составил 3,21±0,33 и 3,21±0,22 соответственно.

Увеличение прививной дозы в два раза увеличило титры ВНА против гомологичного вируса в 1,54 раза, а против гетерологичных О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 в 2,37 и 2,00 раза, соответственно.

На 7 СПВ после введения одной дозы вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017 уровень ВНА против гомологичного штамма составлял 4,67±0,21 а против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 соответствовал значениям 3,58±0,12 и 3,92±0,19

Таким образом, на 7 сутки после иммунизации количество антител против гомологичного штамма превышало содержание ВНА против гетерологичных

штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 в 2,1 и 1,7 раза, соответственно.

После введения двукратной дозы данного вакцинного препарата на 7 сутки титр антител против гомологичного штамма О №2344/Монголия/2017 составил 5,00±0,22 против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 - 4,46±0,33 и 4,33±0,22 1og2, соответственно. То есть на 7 сутки после введения животным 4 см3 вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017 уровень антител против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 практически не отличался от титра ВНА против гомологичного штамма. Следует отметить, что иммунизация 4 см3 КРС по сравнению с инъекцией 2 см3 вакцины позволила на 7 сутки увеличить количество антител против штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 в 1,46 и 1,59 раза, соответственно.

Из данных рисунка 8 следует, что у КРС, привитых эмульсионной противоящурной вакциной из штамма О №2047/Саудовская Аравия/08 в дозе 4см3, на 4 и 7 сутки после инокуляции уровень антител составлял 2,42±0,14 и 4,92±0,15 соответственно. Значения титров антител с 4 по 7 сутки после иммунизации увеличились в 5,7 раз.

На 4 сутки после введения данной вакцины титры антител против гетерологичных штаммов О №2147/Приморский/2012 и О №2344/Монголия/2017 составляли 1,88±0,15 и 2,00±0,35 соответственно. Степень различия между титрами антител против гомологичного и гетерологичных штаммов О №2147/Приморский/2012 и О №2344/Монголия/2017 составила 1,5 и 1,3 раза, соответственно.

На 7 сутки после вакцинации этим же препаратом количество ВНА против гетерологичных штаммов О №2147/Приморский/2012 и О №2344/Монголия/2017 соответствовало значениям 3,33±0,19 и 2,83±0,12 что в 3,0 и 4,3 раза ниже по сравнению с титрами антител против гомологичного штамма.

У КРС, привитых 4 см3 моновалентной эмульсионной вакциной из штамма О №2147/Приморский/2012, титры антител против гомологичного штамма на 4 и

7 сутки после иммунизации составили 2,25±0,14 и 4,13±0,11 соответственно. Количество ВНА против гомологичного штамма с 4 по 7 сутки возросло в 3,7 раз.

Через 4 СПВ данной вакциной количество ВНА против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2344/Монголия/2017 составляло 1,75±0,13 и 1,79±0,10 соответственно, что в 1,4 раза ниже, чем против гомологичного штамма. На 7 сутки после иммунизации титры антител против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2344/Монголия/2017 соответствовали значениям 3,29±0,12 и 3,46±0,10 Таким образом, количество антител против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2344/Монголия/2017 снизилось в 1,8 и 1,6 раза по сравнению с титрами ВНА против гомологичного штамма.

Через 7 СПВ провели контрольное заражение 4 групп вакцинированного КРС вирусом О №2344/Монголия/2017 интрадермалингвально в дозе 104 ИД50/0,2см3. Результаты контрольного заражения отражены в таблице 19.

Таблица 19 - Исследование гуморального и протективного иммунитета у КРС, привитого моновалентными

эмульсионными вакцинами (M±m, p<0,001)

Характеристика вакцины/количество мкг 146+75 Б в дозе Титры антител против вируса ящура, Результаты заражения штаммом О №2344/Монголия/ 17 через 7 суток после вакцинации (защищено/ заражено)

4 сутки после вакцинации 7 сутки после вакцинации

О №2047 /Саудовская Аравия/08 О №2147/ Приморский/ 2012 О№2344/ Монголия/17 О№2047/ Саудовская Аравия/08 О №2147/ Приморский/ 2012 О №2344/ Монголия/2017

Эмульсионная, О №2344/ Монголия/2017/ 12,1мкг 2,21±0,41 2,46±0,29 2,83±0,33 3,58±0,12 3,92±0,19 4,67±0,23 6/6

Эмульсионная, О№2344/ Монголия/2017/ 24,2 мкг 3,21±0,33 3,21±0,22 3,46±0,24 4,46±0,12 4,33±0,11 5,00±0,21 6/6

Эмульсионная, О №2047/ Саудовская Аравия/08/ 30,1 мкг 2,42±0,14 1,88±0,15 2,00±0,22 4,92±0,15 3,33±0,19 2,83±0,12 5/6

Эмульсионная, О №2147/ Приморский/2012/ 29,2 мкг 1,75±0,13 2,25±0,14 1,79±0,10 3,29±0,12 4,13±0,11 3,46±0,10 6/6

Контроль 1 0/1

Контроль 2 0/1

Примечание: числитель - количество КРС, защищенных после контрольного заражения; знаменатель - количество КРС, зараженных

контрольным вирусом.

Из данных таблицы 19 видно, что после однократного введения моновалентной эмульсионной вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017 отмечали индукцию ВНА в титрах, достаточных для защиты от прямого заражения гомологичным штаммом. Результаты контрольного заражения штаммом О №2344/Монголия/17 подтвержают, что у всех шести животных, иммунизированных двойной дозой вакцин из штаммов О №2147/Приморский/2012 и О №2344/Монголия/17, на 7 сутки после вакцинации генерализации процесса заболевания не наблюдали. Эмульсионная противоящурная вакцина из штамма О №2047/Саудовская Аравия/08 через 7 суток после введения не обеспечила защиту одной из шести голов КРС. Заболевшее животное на 7 сутки после вакцинации имело титр ВНА, равный 2,75 У двух контрольных животных генерализация процесса обнаружена через 48 часов после заражения контрольным вирусом ящура.

В опытах на овцах испытали эмульсионную вакцину О №2344/Монголия/2017 на формирование иммунитета в ранние сроки после вакцинации. Животных вакцинировали двойной дозой (2 см3/12,1 мкг 146+758 компонентов) внутримышечно в две точки по 1 см3. Гуморальный иммунитет изучали через 4 СПВ против гомологичных и гетерологичных штаммов. Контрольное заражение овец не проводили из -за отсутствия вируса, адаптированного к этому виду животных. Результаты исследований представлены в таблице 20.

Таблица 20 - Исследование гуморального иммунитета у овец, привитых противоящурной инактивированной эмульсионной вакциной из штамма О

№2344/Монголия/2017 (М±т, р<0,005)

Характеристика вакцины/ № Титры ВНА на 4 СПВ (^2) против штаммов

количество мкг 146+75 Б в животного вируса ящура

дозе О №2047/ О №2147/ О №2344/

Саудовская Аравия/08 Приморский/ 2012 Монголия/ 2017

1 2,50 3,00 3,75

Эмульсионная, 2 3,25 2,75 3,75

О №2344/Монголия/2017/ 3 3,00 3,50 3,50

2см3 /12,1мкг 4 3,00 3,75 4,00

М±т 2,94±0,38 3,25±0,38 3,75±0,14

Из данных таблицы 20 следует, что на 4 сутки после иммунизации уровень антител против гомологичного штамма составил 3,75±0,14 Титры ВНА

против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 соответствовали значениям 2,94±0,38 и 3,25±0,38 что в 1,8 и 1,4 раза меньше, чем против гомологичного. Таким образом, на 4 сутки после введения вакцинного препарата у овец установили титры антител в пределе 2,94-3,75 Применение противоящурной инактивированной эмульсионной

вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017, содержащей в прививной дозе 12,1 мкг 146+75 Б компонентов, способствует формированию иммунитета у овец через 4 СПВ.

Была изготовлена эмульсионная вакцина с типом эмульсии «вода-масло-вода» из концентрированного антигена Азия-1 №2356/14/18 с содержанием 22,2 мкг 146+75Б компонентов в прививной дозе 2 см3. Иммуногенная активность препарата испытана количественным методом на КРС. Животных вакцинировали внутримышечно в верхнюю треть шеи. Первую группу из пяти голов прививали в дозе 2 см3, вторую группу из пяти голов 1/4 дозы и третьей группе из пяти голов вводили 1/16 дозы. Кровь для определения титров ВНА отбирали через 4 СПВ. Контрольное заражение проводили гомологичным вирусом через 4 СПВ. Результаты опытов на КРС отражены в таблице 21 и на рисунке 9.

Азия-1 № 2356/14/2018 на КРС (М±т, р<0,001)

Характеристика № Прививная Титры ВНА через 4 СПВ против вируса, Результаты

вакцины животных доза контрольного заражения

п/п (см3/мкг) Азия-1 № Азия-1 Азия-1/ Азия-1 Азия-1 Азия-1 вирусом Азия-1 №

2356/ Пакистан/ Шамир /Таджики №1730 №1987/ 2356/14/2018

14/2018 2009 3/89 стан/2011 Иран 58/99 Амурский/ (защищено/заражено)

2005

1 2,75 2,00 1,50 1,75 1,50 1,50

2 2,50 1,50 1,25 1,75 1,25 1,75

3 2,0/22,2 4,25 1,75 1,75 2,00 1,25 2,25 5/5

Эмульсионная 4 4,25 1,50 1,25 2,00 1,75 2,75

Азия-1 № 5 3,75 1,75 1,00 1,50 1,50 1,75

2356/14/2018 М±т 3,50±0,37 1,70±0,10 1,35±0,13 1,80±0,10 1,45±0,10 2,00±0,22

на КА-206

6 3,00

7 1,75

8 0,5/5,5 3,00 Не исследовали 3/5

9 2,75

10 1,25

М±т 2,35±0,36

11 2,75

12 2,00

13 0,12/1,39 2,00 Не исследовали 2/5

14 2,50

15 2,75

М±т 2,40±0,17

Контроль 0/2

Примечание: числитель - количество защищенных животных; знаменатель - количество зараженных животных

ее о

3,5

й н

2,5

1,5

0,5 0

3,5

2.4

2

1 1,7 П 1,35 ■ | 1,8 ■ __ 1,45

__ 1 __ п

_ _ _ _ _

Азия-1 №2356/14/18 Азия-1 Азия-1 Л» 1946 Шамир 3 89 Азия-1 №2145 Азия-1 №1730 Иран 58 99 Азия-1

№2109/Пакистан/2009 Таджикистан/2011 Л» 198 7/Амур скнй/2005

Вакцина из штамма Азия-1 №2356/14/18

■ прививная доза 2.0 см3/22,2 мкг □ прививная доза 0,5 см3/5,5 мкг □ прививная доза 0.12 см3/1,39 мкг

Рис. 9 - Антигенная активность противоящурной эмульсионной вакцины из штамма

Азия-1 № 2356/14/2018 на КРС

Результаты, представленные в таблице 21 и на рисунке 9, показали, что противоящурная вакцина из штамма Азия-1 №2356/14/18, введенная КРС в цельном виде (2см3), на 4 сутки после иммунизации вызывала образование ВНА в количестве 3,50±0,37 введенная в разведении 1/4 (0,5см3) - 2,35±0,36 и в разведении 1/16 (0,12см3) - 2,40±0,17 против гомологичного штамма. Титры ВНА против гетерологичных штаммов Азия-1 №2109/Пакистан/2009, Азия-1 № 1946/Шамир 3/89, Азия-1 № 2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1730 Иран 58/99и Азия-1 Амурский при введении вакцины в цельном виде на 4 СПВ были равны 3,50±0,37; 1,70±0,10; 1,35±0,13; 1,80±0,10; 1,45±0,10 и 2,00±0,22 log2, соответственно. Активность вакцины в прививной дозе для КРС составила 8 РБ50 при контрольном заражении гомологичным вирусом через 4 СПВ.

В следующей серии опытов количественный контроль иммуногенной активности эмульсионной вакцины Азия-1 № 2356/14/2018 проводили на свиньях. Вакцину вводили внутримышечно за ухом в дозах 2 см3, 0,4 см3, 0,08 см3. Контрольное заражение свиней проводили через 4 СПВ введением под слизистую языка 104 ИД50/0,2 см3 адаптированного к свиньям вируса Азия-1 №2356/14/2018. Результаты исследований представлены в таблице 22 и на рисунке 10.

2356/14/2018 на свиньях (M±m, p<0,001)

Характеристика № Прививна Титры ВНА через 4 СПВ против вируса, Результаты

вакцины животны я доза контрольного

х п/п (см3/мкг) Азия-1 Азия-1 Азия-1№ Азия-1 Азия-1 Азия-1 заражения вирусом

№ 2356/ №2109 1946/ №2145/ №1730 Иран №1987/ Азия-1

14/2018 Пакистан/ 2009 Шамир 3/89 Таджикиста н/2011 58/99 Амурский/ 2005 № 2356/14/2018 (защищено/заражено)

1 3,00 2,00 1,50 2,00 1,50 1,75

2 3,75 3,00 3,25 3,00 2,00 2,75

3 2,0/22,2 4,00 2,00 2,00 2,50 1,50 2,00 5/5

4 4,25 2,75 2,25 2,00 1,75 2,00

Эмульсионная 5 4,25 3,00 1,50 1,75 2,00 1,75

Азия-1 М±т 3,85±0,23 2,55±0,23 2,10±0,32 2,25±0,22 1,75±0,11 2,05±0,18

№ 2356/14/2018 на КА-206

6 7 3,75 3,50

8 0,4/4,44 3,25 Не исследовали 5/5

9 3,00

10 3,25

М±т 3,35±0,13

11 3,00

12 2,75

13 0,08/0,89 3,25 Не исследовали 5/5

14 2,50

15 3,00

М±т 2,90±0,13

Контроль 0/2

Примечание: числитель - количество защищенных животных; знаменатель - количество зараженных животных

4,5

ел о

* 3,5 &

£ з

2,5

1,5

0,5

2.9

2,55

2Д 2,25 2,05

1,75

Азвя-1 Лг235йУ14/18

Азия-1 Азвя-1 №1946 Шамир 3/89

№2109/Па киста н 2009

Азия-1 №2145 Таджикистан/2011

Азия-1 Л»1730 Иран 58 99

Азия-1 Л»1987/Амурс кий/2005

Вакцина из штамма Азия-1 Л°2356/14/2018

□ прививная доза 2,0 см3/22,2 мкг □ прививная доза 0,4 сы3/4,44 мкг □привнвнаядоза0,08 см3/0,89 м кг

Рис. 10 - Антигенная активность противоящурной эмульсионной вакцины из штамма

Азия-1 № 2356/14/2018 на свиньях

Из данных таблицы 22 и рисунка 10 следует, что у свиней, иммунизированных против вируса ящура штамма Азия-1 №2356/14/18 вакциной в цельном виде (2,0 см3), титры антител на 4 сутки после вакцинации были равны 3,85±0,23 иммунизированных вакциной в разведении 1/5 (0,4 см3) - 3,35±0,13 и в разведении 1/25 (0,08 см3) - 2,90±0,13 против гомологичного штамма. Титры ВНА против гетерологичных штаммов Азия-1 №2109/Пакистан/2009, Азия-1 № 1946/Шамир 3/89, Азия-1 № 2145/Таджикистан/2011, Азия-1 №1730 Иран 58/99, Азия-1 №1987/Амурский/2005 при введении вакцины в цельном виде составили 2,55±0,23; 2,10±0,32; 2,25±0,22; 1,75±0,11 и 2,05±0,18 1о&, соответственно.

После контрольного заражения при патологоанатомическом осмотре не обнаружили генерализации процесса у всех вакцинированных животных. Контрольные два подсвинка заболели ящуром через 48-72 часа после заражения. Активность вакцины в прививной дозе 2 см3 составила 55 РБ50.

Аналогичную работу по оценке иммуногенности эмульсионной вакцины А №2205Ю-1У проводили на КРС и свиньях. Препарат в прививном объеме 2см3 содержал 26,45 мкг 146Б компонента. КРС вакцинировали внутримышечно в средней трети шеи. Первую группу из пяти голов прививали в дозе 2 см3, вторую группу из пяти голов 1/4 дозы и третьей группе из пяти голов вводили 1/16 дозы. Кровь для определения титров ВНА отбирали через 4 СПВ. Контрольное заражение проводили через 4 СПВ путем введения 104 ИД50/0,2см3 гомологичного вируса. Результаты представлены в таблице 23 и на рисунке 11 .

на КРС (M±m, p<0,001)

№ животных Прививн Титры ВНА через 4 СПВ против вируса, Результаты

п/п ая доза (см3/мкг) контрольного заражения вирусом А №2205/0-1У (защищено/заражено)

А №2205/ G-IV А №2248/ Египет/ 18/2012 А №2029/ Турция/0 6 А22 №550/ Азербайдж ан/64 А22 Ирак 24/64 А №2269/ ВНИИЗЖ/ 2015 А №2155/ Забайкальск ий/2013

1 4,50 1,75 1,75 2,25 2,50 1,50 1,25

2 2,50 1,25 1,25 1,75 1,75 1,00 0,75

3 2,0/26,45 4,50 1,75 1,75 2,25 2,25 1,50 1,25 5/5

4 3,00 1,50 1,00 2,00 2,00 1,00 1,25

5 2,75 1,00 1,00 1,75 1,50 0,75 1,00

M±m 3,45±0,44 1,45±0,15 1,35±0,17 2,00±0,11 2,00±0,18 1,15±0,15 1,10±0,10

6 2,50

7 2,75

8 0,50/6,61 2,75 Не исследовали 5/5

9 3,00

10 3,25

M±m 2,85±0,13

11 3,00

12 2,50

13 0,12/1,65 3,75 Не исследовали 3/5

14 1,50

15 1,75

M±m 2,50±0,41

Контроль 0/2

Примечание: числитель - количество защищенных животных; знаменатель - количество зараженных животных

3,45

2,5

2 2

1,45 1,35 п И п

П 1 п г _ь 1,15 п 1 1 1,1

п ш

_ _ _ _ _ _

А№2205/С-1У А№2248/Египет/18/2012 А №2029/Туриия/06 А №550/Азербайджан/64 А22 Ирак 24/64 А №2269/ВНШЗЖ/2015 А №2155/

3абайкальский/2013

Вакцина из штамма А №2205/С-1У

■прививная доза 2,0 см3/26,45 мкг □прививная доза 0,5 см3/6,61 мкг □прививная доза 0,12 см3/1,65 мкг

Рис. 11 - Антигенная активность противоящурной эмульсионной вакцины из штамма

А №2205^-ТУ на КРС

Как видно из данных таблицы 23 и рисунка 11, у КРС, иммунизированных противоящурной вакциной из штамма А №2205/0-1У в цельном виде (2см3), титры антител на 4 СПВ составили 3,45±0,44 привитых вакциной в

разведении 1/4 (0,5см3) - 2,85±0,13 ^ и в разведении 1/16 (0,12см3) - 2,50±0,41 против гомологичного штамма. Титры ВНА против гетерологичных штаммов А №550/Азербайджан/64, А22 Ирак 24/64, А №2248/Египет/18/2012, А №2029/Турция/06, А №2269/ВНИИЗЖ/2015, А №2155/Забайкальский/2013 при введении вакцины в цельном виде были равны 3,45±0,44; 2,00±0,11; 2,00±0,18; 1,45±0,15; 1,35±0,17; 1,15±0,15 и 1,10±0,10 log2, соответственно. Результаты контрольного заражения показали, что вакцина противоящурная эмульсионная из штамма А №2205/0-1У, введенная в цельном виде и в разведении 1/4 защищает от заражения гомологичным штаммом все пять животных. Два контрольных животных заболели ящуром через 24-48 часов. Иммуногенная активность эмульсионной вакцины А №2205Ю-1У составила 18,18 РБ50 в дозе 2см3 для КРС.

Эта же вакцина была испытана на свиньях. Препарат вводили внутримышечно без разведения в дозе 2 см3 пяти животным, пяти - в разведении 1/5 и пяти - в разведении 1/25. Контрольное заражение проводили через 4 СПВ путем введения гомологичного адаптированного вируса под слизистую языка в дозе 104 ИД50/0,2см3. Результаты исследований отражены в таблице 24 и на рисунке 12.

на свиньях (M±m, p<0,001)

№ животных п/п Прививн ая доза (см3/мкг) Титры ВНА через 4 СПВ против вируса, ^2 Результаты контрольного заражения вирусом А №2205Ю-1У (защищено/заражено)

А №2205/ а-1У А22 №550/ Азербайд жан/64 А22 Ирак 24/64 А №2248/ Египет/ 18/2012 А №2029/ Турция/06 А №2269/ ВНИИЗЖ/ 2015 А №2155/ Забайкальский /2013

1 2 3 4 5 2,0/26,45 2,50 3,50 3,00 3,50 3,00 2,00 3,00 2,00 2,25 2,75 2,25 2,50 2,00 2,50 2,25 1,75 2,00 1,50 1,25 1,00 1,50 2,00 1,50 1,75 2,00 1,00 1,75 0,75 1,25 1,25 1,50 1,75 1,50 1,50 1,75 5/5

М±т 3,10±0,19 2,40±0,20 2,30±0,10 1,50±0,18 1,75±0,11 1,20±0,17 1,60±0,10

6 7 8 9 10 0,4/5,29 2,50 3,00 2,25 3,00 1,75 Не исследовали 4/5

М±т 2,50±0,24

11 12 13 14 15 0,08/1,06 2,50 1,75 2,00 1,75 2,00 Не исследовали 3/5

М±т 2,00±0,14

Контроль 0/2

Примечание: числитель - количество защищенных животных; знаменатель - количество зараженных животных

3,1

2,5 1 л

1 2,3

1,5 1,75 1,6

1,2

A JV»2205/G-IV А Л»550/Азербайджан/64 А22 Ирак 24/64 А №2248/Епшет/18/2012 А Ж029/Турция/06 А Л»2269/ВНИИЗЖ/2015 А №2155/

3абайкальгкий/2013

Вакцина из штамма A №2205/G-IV

■ прививная доза 2,0 см3/26,45 мкг □ прививная доза 0,4 см3/5,29 мкг □прививная доза 0,08 см3/1,06 мкг

Рис. 12 - Антигенная активность противоящурной эмульсионной вакцины из штамма

А №«2205^-1У на свиньях

Из данных таблицы 24 и рисунка 12 следует, что противоящурная вакцина из штамма А №2205/0-1У в цельном виде (2см3) индуцировала у свиней выработку ВНА в титре 3,10±0,19 введенная в разведении 1/5 (0,4см3) -2,50±0,24 1о§2 и в разведении 1/25 (0,08см3) - 2,50±0,24 на 4 СПВ против гомологичного штамма. Титры антител при введении вакцины в цельном виде против гетерологичных штаммов А22 №550/Азербайджан/64, А22 Ирак 24/64, А №2248/Египет/18//2012, А №2029/Турция/06, А №2269/ВНИИЗЖ/2015, А №2155/Забайкальский/2013 соответствовали значениям 2,40±0,20; 2,30±0,10; 1,50±0,18; 1,75±0,11; 1,20±0,17 и 1,60±0,10 1og2, соответственно. Иммуногенная активность эмульсионной вакцины для свиней составила 22,22 РБ50 в дозе 2 см3.

4.8 Исследование сывороток крови животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура после вакцинации эмерджентными

вакцинами

В период репродукции вируса ящура в культуре клеток ВНК-21 синтезируются структурные белки, которые входят в состав вируса, и неструктурные, которые не входят в состав вируса. В процессе репликации в зараженной клетке образуется одинаковое количество структурных и неструктурных белков. Обе группы белков попадают в организм животного и на них вырабатываются антитела, которые определяются в крови животных.

Для повышения качества вакцин необходимо удалять неструктурные белки из суспензии, используемой для приготовления вакцин, т.к. по их определению дифференцируют переболевших ящуром животных от вакцинированных.

В настоящее время требованием МЭБ к противоящурным вакцинам является отсутствие наличия неструктурных белков в составе вакцины. Особенно это актуально для высококонцентрированных вакцин, какими являются препараты для ранней защиты.

Мы провели опыты с эмульсионными вакцинами О №2344/Монголия/17, Азия-1 №2356/14/18, А №2205/0-1У. С этой целью были использованы животные, на которых проводили контроль препаратов на авирулентность и безвредность.

Для проведения испытаний на авирулентность каждую вакцину вводили КРС интрадермолингвально в количестве 2,0 см3 (по 0,1 см3 в 20 точек), а свиньям внутрикожно по 0,1 см3 в две точки венчика на каждой конечности.

Одновременно с испытанием вакцин на авирулентность тем же животным вводили тройную дозу каждой из вакцин внутримышечно в области средней трети шеи с целью испытания на безвредность. Наблюдение за животными вели в течение 14 суток.

На 14 день после начала испытаний на авирулентность и безвредность животным вводили среднюю пробу каждой из вакцин в количестве одной прививной дозы в область средней трети шеи внутримышечно КРС, свиньям внутримышечно в область верхней трети шеи за ухом. Через 14 суток после последней вакцинации (28 сутки) от животных производили отбор проб крови для получения сывороток.

Исследование на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура проводили с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ). Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «PrioCHECK® FMDV NS ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot-and-Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды).

До иммунизации сыворотки крови животных в отношении наличия антител к неструктурным белкам (NSP) вируса ящура были отрицательными: значение PI<50%, значение оптической плотности отрицательного контроля >1,000, процент ингибиции слабоположительного контроля >50%, положительного контроля - >70%. Результаты исследования в блокирующем варианте ИФА сывороток крови представлены в таблицах 25, 2б, 27.

Таблица 25 - Исследование сывороток крови КРС и свиней, привитых вакциной из штамма О №2344 Монголия/2017, на наличие антител к

неструктурным белкам вируса ящура

№/вид животног о Значение оптической плотности Процент ингибиции (Р1), %

Тип обра зца Рефе ренс знач ения До вакци нации На 14 СПВ На 14 сутки после после дней вакци нации (28 сутки) Тип образц а Рефер енс-значен ия До вакцина ции На 14 сутки после вакцина ции На 14 сутки после последн ей вакцина ции (28 сутки)

СПК 0,66 СПК 65,90

ПК 0,17 ПК 90,95

ОК 1,95 ОК 0,00

КРС 1 1,65 1,73 1,17 15,85 7,30 40,39

2 1,31 1,51 1,78 33,08 18,90 29,10

3 1,58 1,39 1,39 19,43 25,19 28,94

4 1,36 1,48 1,47 30,32 20,78 24,80

свинь и 1 1,69 1,03 1,43 13,16 44,47 26,84

2 1,18 1,24 1,80 39,62 33,62 27,92

3 1,29 1,67 1,44 34,15 10,47 26,33

4 1,65 1,53 1,21 15,75 18,10 38,04

Примечание: СПК - слабоположительный контроль, ПК - положительный контроль, ОК -отрицательный контроль.

Из данных, приведенных в таблице 25, следует, что сыворотки крови животных, отобранные от КРС и свиней, после введения вакцины из штамма О №2344 Монголия/2017 имели процент ингибиции Р1 менее 50%. Это указывает на отсутствие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Таблица 26 - Исследование сывороток крови КРС и свиней, привитых вакциной из штамма Азия-1 №2356/14/18, на наличие антител к

неструктурным белкам вируса ящура

№/вид

животного Значение оптической плотности Процент ингибиции (PI), %

Ти Рефе До На 14 На 14 Тип Рефер До На 14 На 14

п ренс вакцина сутки сутки обра енс- вакци сутки сутки

обр - ции после после зца значен нации после после

азц знач вакцина последн ия вакци послед

а ения ции ей вакцина ции (28 сутки) наци и ней вакцин ации (28 сутки)

СП 0,88 СПК 52,66

К -//- -//-

ПК 0,28 ПК 84,63

ОК 1,87 ОК 0,00

1 1,80 1,53 1,66 3,73 18,09 11,25

КРС 2 1,72 1,56 1,32 7,73 16,48 29,45

3 //- 1,83 1,63 1,56 //- 2,13 12,80 16,48

4 1,79 1,81 1,42 4,21 13,20 24,01

1 1,79 1,71 1,86 4,21 8,59 0,53

свинь 2 1,82 1,80 1,77 //- 2,65 3,73 5,17

и 3 1,72 1,72 1,65 7,73 7,73 11,52

4 1,78 1,59 1,81 4,64 14,72 2,93

Примечание: СПК - слабоположительный контроль, ПК - положительный контроль, ОК -отрицательный контроль.

Из данных, приведенных в таблице 26, следует, что сыворотки крови животных, отобранные от 4 голов КРС и свиней, после введения вакцины из штамма Азия-1 №2356/14/18 через 14 суток после последней иммунизации имели процент ингибиции Р1 менее 50%, то есть были отрицательные.

Таблица 27 - Исследование сывороток крови КРС и свиней, привитых вакциной из штамма А №«2205^-ТУ на наличие антител к неструктурным

белкам вируса ящура

№/вид

животного Значение оптической плотности пробы Процент ингибиции (Р1), %

Тип Рефе До На 14 На 14 Тип Рефер До На 14 На 14

обра ренс вакци сутки сутки образ енс- вакц сутки сутки

зца - нации после после ца значен инац после после

знач вакцина последн ия ии вакци послед

ения ции ей вакцина ции (28 сутки) наци и ней вакцин ации (28 сутки)

СПК 0,53 СПК 58,08

ПК 0,20 -//- ПК 83,59 -//-

ОК 1,27 ОК 0,00

КРС 1 1,25 1,22 - 1,57 3,846 -

2 1,05 1,12 - 7,50 11,69 -

1 1,18 1,15 - 7,14 9,73 -

Свиньи 2 1,20 1,10 - 5,41 12,95 -

Примечание: СПК - слабоположительный контроль, ПК - положительный контроль, ОК -отрицательный контроль.

Полученные результаты, представленные в таблице 27, свидетельствуют о том, что сыворотки крови животных, привитых противоящурной вакциной из штамма А №°2205Ю-1У, не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения Р1 для сывороток крови КРС и свиней <50%).

110

5 ОБСУЖДЕНИЕ

Ящур является самым контагиозным заболеванием млекопитающих и обладает огромным потенциалом для нанесения серьезного экономического ущерба в отношении парнокопытных животных. Антигенная множественность и постоянная совместная циркуляция различных серотипов в данном географическом регионе и стойкость вируса у инфицированных или вакцинированных животных очень затрудняют борьбу с заболеванием. Ящур носит острый эпизоотический характер, поэтому проведение комплекса мероприятий, включающий охрану животноводческих предприятий от заноса вируса, соблюдение карантинно-ограничительных и ветеринарно-санитарных мер в очагах инфекции, неблагополучных пунктах и в угрожаемой зоне, служит основой успеха в борьбе с заболеванием [9, 14, 19, 78].

Вакцинация является основным методом создания массовой невосприимчивости животных к ящуру. Для специфической профилактики практическое применение нашли моно- и поливалентные сорбированные и эмульсионные культуральные инактивированные вакцины, обладающие определенной безопасностью и иммуногенной активностью. Использование вакцин способствует выработке у животных кратковременных реакций антител, вследствие чего производители обычно рекомендуют проводить ревакцинацию в эндемичных условиях три раза в год после двойного начального курса [14, 126, 160].

В промышленных условиях технология производства противоящурных вакцин сводится к подбору перевиваемых линий клеток для эффективного культивирования вируса ящура, усовершенствованию способов инактивации, методов очистки и концентрирования вирусных иммуногенных антигенов, подбору эффективных адъювантов, оптимизации компонентного состава при составлении вакцины [57].

За последние десятилетия стало ясно, что высокоэффективные вакцины способны обеспечить существенный уровень защиты животных и ускорить развитие иммунитета [172]. Вакцины для экстренной защиты, как правило,

содержат более высокую концентрацию антигена, чем обычные профилактические вакцины и, как следствие, являются более эффективными для формирования более быстрого иммунного ответа и надежной защиты внутри серотипа [92]. Исследования многих авторов [74, 128, 155, 158, 175] подтверждают, что при использовании высокоэффективных вакцин отмечается увеличение титра вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных, что служит защитой от заражения ящуром, приводит к сдерживанию инфекции и ее купированию в первичном очаге.

Появление антигенно отличающихся штаммов вируса ящура нередко создает проблему эффективности используемых ранее вакцин при купировании вспышек ящура. Индукция вируснейтрализующих антител и гуморальные ответы, генерируемые вакцинами против ящура, очень часто ограничены, серотипом, а в некоторых случаях даже штаммоспецифичны. В процессе разработки наиболее специфичных антигенов неизбежно приходится использовать зараженный материал, хотя бы для выделения и секвенирования нуклеиновых кислот, несущих генетическую информацию патогена [53, 124].

Так, выделенный в 2016 году изолят вируса ящура типа О на территории Забайкальского края РФ, а также в 2017-2018 годах на территории Монголии значительно отличался от производственных штаммов вируса ящура, используемых в РФ в качестве вакцинных. Изолят вируса ящура типа Азия-1 вызвал вспышку ящура в 2018 году в Пакистане и до сих пор представляет угрозу распространения ящура типа Азия-1 в странах Западной и Центральной Азии. Изолят вируса ящура типа А был нотифицирован в 2017-2018 годах во многих странах Северо-Восточной Африки и имеет тенденцию к распространению в соседние регионы.

Быстрое распространении вируса ящура новых генетических линий на территориях эндемичных стран свидетельствует о существующем риске заноса заболевания на территориию Российской Федерации. Изучение иммунобиологических свойств штаммов для выбора лучших при изготовлении специфических вакцин и дальнейшее изучение эффективности противоящурных

вакцин, способных защитить естественно восприимчивых животных на ранних сроках после вакцинации против гомологичных и гетерологичных штаммов, является актуальной задачей [132, 156].

В результате многочисленных исследований, проведенных зарубежными и отечественными учеными, накоплен обширный материал, касающийся оптимизации технологического процесса культивирования вируса яшура в перевиваемых культурах клеток. Важным этапом в технологии изготовления противоящурных вакцин является получение вируссодержашего материала и его адаптация к системе культивирования с максимальным накоплением специфического вирусного белка [57].

Известно, что культивирование вируса ящура в клеточных системах часто приводит к неодинаковым конечным результатам, выражающимся в различной степени накопления вирусной массы, времени наступления цитопатического действия (ЦПД) и характере его проявления [30, 44]. В работах ряда исследователей сообщено об определенных трудностях адаптации эпизоотических изолятов вируса ящура. Установлено, что после адаптации вируса ящура, выделенного из афт КРС, в течение 3-6 пассажей к культурам клеток ППК, СПЭВ, ПСГК, СПП, ВНК-21 происходит накопление вирусоспецифического белка в пределах 2-3 мкг/см3 и 70-80% 146S компонента. Некоторыми исследователями при изучении чувствительности клеток ВНК-21, СП, СПЭВ, ПСГК, IBRS-2 к вирусу ящура было установлено накопление инфекционной активности в титре от 6,5 до 8,5 ^ ТЦД50/0,1 см3, концентрация вирусоспецифического белка 1,2-3,6 мкг/см3, титр комплементсвязывающей активности 1:8 [21, 22Б, 33]

Клетки BHK-21 являются наиболее чувствительными к вирусу ящура, что обеспечивает в дальнейшем крупномасштабную продукцию антигена с высоким накоплением иммуногенных компонентов. Кроме того, адаптация вируса ящура зависит от количества проведенных пассажей в других перевиваемых клеточных линиях, не менее 7-8, прежде чем вирус будет успешно адаптирован к ВНК-21 [127].

На начальном этапе была проведена адаптация изолятов О/МОО/13/2017, Азия-1 Пакистан/2018, Л/Е0У/2/2018 к монослойным перевиваемым клеточным линиям СП, ПСГК-30, ГБ-К8-2, ВНК-21, изучено время репродукции, количество накопления 146 Б компонента и титр инфекционности. На протяжении 6ти последовательных пассажей отмечали высокие титры инфекционной активности (5,33-7,10 ^ТЦД50/см3) и количество 146Б частиц (0,29-1,48 мкг/см3) на всех используемых монослойных культурах клеток. Репродукция вируса происходила за 15-22 часа инкубации.

Исторически сложилось так, что заражение животных во время экспериментальных исследований осуществляется путем интрадермалингвальной инъекции (для КРС) и в области венчика каждой конечности внутрикожно (для свиней). Такие способы введения представляет собой последовательную и строгую модель исследований заражения вирусом ящура с целью получения вируссодержащего материала. Динамика инфицирования вирусом ящура определяется путем сбора возникающих афт в заранее определенные моменты времени после заражения вирусом, приготовлением вирусной суспензии и определением титра инфекционной активности в культуре клеток СП или на животных. 81епГе1& С. й а1. [91] в своих исследованиях отмечали, что после обычной инокуляции языка крупного рогатого скота вирулентными штаммами вируса ящура через 24 часа у всех животных наблюдались афтозные поражения в ротовой полости или на одной конечности через 48 часов.

В наших экспериментах вируссодержащий материал был собран от КРС и свиней через 48-72 часа после инокуляции и имел титр инфекционной активности не менее 4,00-5,50 ^ИД50 /0,1см3.

Диев В. И. и др. [49] в своих работах по оценке имунного состояния овец отмечал, что ящур у мелкого рогатого скота часто протекает в легкой форме и бессимптомно, следовательно, адаптировать вирус ящура к этому виду животных достаточно сложно. Для того чтобы вирус обладал достаточной активностью, он должен пройти 10 пассажей на овцах.

В нашей работе при попытке адаптировать вирус ящура штамма О №2344/Монголия/2017 к овцам вируссодержащий материал был собрал в малых количествах и не обладал достаточной активностью, поэтому дальнейшая работа была остановлена.

Важным этапом производственного процесса является получение матрового вируса ящура с достаточным количеством иммуногенных компонентов. Нургазиевым Р.З. и соавт. [36] в результате проведенных экспериментов было установлено, что культуры клеток IB-RS-2 и ВНК-21 являлись наиболее пригодными для культивирования вируса ящура типа А, и чтобы получить высокий титр вируса, достаточно 2-3 пассажей. В нашей работе при получении матрового вируса ящура, адаптированного к монослойным культурам клеток, чувствительность клеток ПСГК-30 и ВНК-21 по сравнению с другими культурами была выше. В своей работе мы использовали вирус ящура штамма О №2344/Монголия/2017 для сравнения выхода иммуногенных компонентов и титра инфекционности в производственных расплодках при заражении суспензии клеток ВНК-21 предпосевным вирусом (6ым пассажем в монослойной культуре клеток ПСГК-30) и 3им пассажем в монослойной культуре клеток ПСГК-30, т.к. на этапе адаптации он имел высокий титр инфекционности и наиболее высокое накопление 146 S компонента.

В результате проведенных исследований, для дальнейшего использования в производственном цикле был взят посевной вирус, адаптированный к культуре клеток ПСГК-30 на уровне 3его пассажа.

Специалистами по изучению биологических свойств вируса ящура установлено, что его накопление в чувствительных клеточных культурах также зависит от множественности заражения [32, 42]. В соответствии с регламентом, при получении вирусных полуфабрикатов суспензию клеток ВНК-21 заражают вирусом ящура в дозе 0,2-1,5 ТЦД50/кл. При этом репродукция вируса длится в течение 10-24 ч. Однако позже было выяснено, что для каждого производственного штамма вируса ящура существует оптимальная доза заражения суспензионной культуры ВНК-21. В исследованиях мы использовали

дозу заражения 0,001 ТЦД50/кл, и установили, что репродукция вируса ящура штаммов вируса ящура О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18 и Л №2205Ю-1У в суспензионной культуре клеток ВНК-21 происходит в течение 1821ч с высоким накоплением вирусного белка. Высокая инфекционная активность вируса, репродуцированного в культуре клеток ПСГК-30, дает возможность использовать малые дозы для заражения суспензионной культуры клеток ВНК-21.

После многолетнего изучения инактивирующей активности различных химических веществ на вирус ящур, ученые остановились на применении производных этиленимина. Наиболее подходящим инактивантом был определён аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). В работах Улупова Н.А. и др. [60] отмечено, что концентрация АЭЭИ от 0,02 до 0,08% не влияет на иммуногенность вакцин после инактивации вируса и через год, и через восемь лет хранения при температуре 4-10°С.

В своих исследованиях мы использовали АЭЭИ в концентации 0,03%. Инактивацию проводили в неочищенной от балластных белков вирусной суспензии при температуре 37°С, рН 7,2-7,8 в течение 12 часов. Результаты исследования кинетики инактивации вирусов свидетельствуют о том, что снижение титра инфекционности до 10° ^ТЦД50/см3 произошло за 3-4 часа инкубации в зависимости от типа вируса. Расчетный уровень безопасности составил одну инфекционную единицу в объеме 1016-1021 см3.

При производстве противоящурных вакцин большое значение имеет очистка вируссодержащей суспензии от балластных белков. В промышленных и лабораторных условиях для очистки вируссодержащих суспензий ящура применяли различные флокулянты. Основными недостатками применения флокулянтов являются низкая технологичность и эффективность удаления балластных белков, снижение титра инфекционной активности и содержания 146Б компонента в вирусной суспензии [35, 39].

В настоящее время при изготовлении инактивированных противоящурных вакцин в качестве флокулянта используется полигексаметиленгуанидин (ПГМГ). Ряд исследователей отмечали, что применение полигексаметиленгуанидина

усиливает флокуляцию балластных белков и их дальнейшую седиментацию при внесении его до начала инактивации вируса ящура АЭЭИ, а увеличение концентрации ПГМГ вызывает потерю иммуногенных компонентов вируса ящура. Использование в производственных условиях ПГМГ после инактивации дает флокулирующий эффект балластных белков с сохранением иммуногенных компонентов [32А, 62].

В наших исследованиях были изучены режимы инактивации культурального вируса ящура штаммов О №2344 Монголия/2017, Азия-1 №2356/2018 и А №2205/G-IV в присутствии флокулянта ПГМГ в концентрации 0,007% после проведения очистки вирусного антигена от балластных белков и инактинации 0,03% АЭЭИ. Было установлено, что потери по общему вирусному белку составляли 13,85-18,11%, а потери I46S+75S иммуногенных компонентов составили 5,35-18,30 % в зависимости от типа вируса.

Важным показателем, влияющим на качество вакцин, является количество антигена в препарате, так как именно этот фактор во многом определяет активность вакцин. Свидетельством этого являются работы отечественных и зарубежных авторов по усовершенствованию методов концентрирования вируса ящура в процессе производства вакцин и разработке способов получения банка высокоактивных антигенов, способных сохранять длительное время иммуногенность. Одним из подходов для решения данных вопросов является использование метода ультрафильтрации для получения

высококонцентрированного антигена. Концентрирование вируса ящура штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205/G-IV проводили методом ультрафильтрации с использованием кассеты тангенциальной фильтрации серии Omega Centrasette. Данная ультрафильтровальная установка дает возможность концентрирования больших объемов вирусного антигена в 50100 раз с минимальными потерями 146+75S компонентов [32А].

В идеале вакцины должны быть способны стимулировать мощный длительный иммунитет после однократной вакцинации. Много исследований было направлено на улучшение качества противоящурных вакцин и иммунных

ответов вакцинируемых животных. В зависимости от типа и качества, вакцины с более низкой эффективностью применяются с профилактической целью в эндемичных районах, чтобы обеспечить иммунитет, который часто длится больше 4-6 месяцев. Основное требование к вакцинам для ранней защиты - это возможность в течение 4-7 дней после вакцинации обеспечить защиту животных, что послужит средством контроля распространения вируса ящура. Кроме того, высокоэффективная вакцина должна быть изготовлена из штамма вируса ящура, гомологичного полевому изоляту, вызвавшего вспышку [172].

С целью определения оптимального количества иммуногенных компонентов в прививном объеме, способных обеспечить защиту КРС от заражения гетерологичными штаммами О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-1У, нами были изготовлены сорбированные противоящурные вакцины из производственных штаммов О№2047 Саудовская Аравия/08, Азия-1 №1987/ Амурский/2005 и А22 №550/Азербайджан/64. При выборе штаммов руководствовались результатами количественной РСК по определению ОВБ и 146+75 Б компонентов, так как противоящурные сыворотки против данных штаммов являлись наиболее близкими в антигенном отношении. Установили, что противоящурные вакцины должны содержать в прививной дозе не менее 30 мкг иммуногенных компонентов для обеспечения защиты привитых животных через 10 суток после заражения гетерологичными штаммами вируса ящура.

Важными преимуществами эмульсионных противоящурных вакцин является то, что они обладают надежной авирулентностью и заданным защитным эффектом, выраженным в иммунизирующих дозах, обеспечивают формирование у животных наиболее напряженного и продолжительного иммунитета. Также в литературных источниках отмечено, что эмульсионные противоящурные вакцины на основе масляного адъюванта Мо^ашёе 18Л-206 УО способствуют выработке вируснейтрализующих антител у животных на 3-5 сутки после иммунизации [9, 35, 79].

Наша работа по изучению иммуногенных свойств эмульсионных вакцин против вируса ящура типа О проводились поэтапно. В опытах на КРС и свиньях исследовали гуморальный и протективный иммунитет в ответ на введение противоящурной эмульсионной вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017, а также оценивали иммуногенные свойства противоящурных вакцин, изготовленных из производственных штаммов №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012, с высоким содержанием 146+75S иммуногенных компонентов в прививном объеме.

Было установлено, что титры ВНА у свиней, привитых противоящурной вакциной из штамма О №2047 Саудовская Аравия/08, против гетерологичного штамма О №2344 Монголия/2017 были в 1,93 раза ниже на 4 СПВ и в 2,1 раз ниже на 7 СПВ, чем против гомологичного штамма. Вакцина из штамма О №2147 Приморский/2012 индуцирована титры ВНА против штамма О №2344 Монголия/2017 ниже в 1,10 на 4 СПВ ив 1,50 раз на 7 СПВ, чем против гомологичного штамма. У свиней, привитых вакциной из штамма О №2344 Монголия/17, титры ВНА в отношении гомологичного штамма с 4 по 7 СПВ возросли в 1,86 раз.

В опытах на КРС изучали динамику титров ВНА в ответ на введение противоящурных вакцин из тех же штаммов, а также сравнивали уровень гуморального иммунитета у КРС при применении вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017 в однократной (12,1 мкг 146+75S) и двукратной дозе (24,2 мкг 146+75S).

Установлено, что увеличение прививной дозы вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017 в два раза увеличило прирост ВНА в 1,55 раза по сравнению с однократной дозой на 4 СПВ и в 1,25 раза на 7 СПВ против гомологичного штамма. Следовательно, при снижении концентрации антигена в прививном объеме снижается и уровень гуморального иммунитета у КРС, что можно проследить по титрам ВНА. На 4 сутки после иммунизации количество антител против гомологичного штамма превышало содержание ВНА против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О

№2147/Приморский/2012 в 1,5 и 1,3 раза и на 7 СПВ в 2,1 и 1,7 раза, соответственно. Кроме того, данная вакцина, введенная в однократной и двукратной дозе, обеспечивала защиту всех 6 голов КРС в результате контрольного заражения гомологичным штаммом на 7 СПВ.

Иммунизация КРС двойной дозой (30,1 мкг 146+75Б) противоящурной вакцины из штамма О №2047/Саудовская Аравия/2008 также подтверждает увеличение титров антител в 5,7 раз в период с 4 по 7 СПВ против гомологичного штамма. Степень различия между титрами антител на 4 СПВ против гомологичного и гетерологичных штаммов О №2147/Приморский/2012 и О №2344/Монголия/2017 составила 1,5 и 1,3 раза, соответственно, а на 7 СПВ - 3,0 и 4,3 раза. Данная вакцина через 7 суток после введения не обеспечивала защиту одной из шести голов КРС. Заболевшее животное на 7 сутки после вакцинации имело титр ВНА, равный 2,75 1о§2.

При введении КРС вакцины из штамма О №2147/Приморский/2012, содержащей в прививном объеме 29,2 мкг 146+75Б, титры ВНА против гомологичного штамма с 4 по 7 сутки возросли в 3,7 раз. Количество антител против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2344/Монголия/2017 снизилось в 1,4 раза на 4 СПВ и в 1,8 и 1,6 раз по сравнению с титрами ВНА против гомологичного штамма на 7 СПВ. На 7 сутки при контрольном заражении гетерологичным штаммом О №2344 Монголия/2017 все шесть животных, иммунизированные данной вакциной, были защищены.

Проведенные исследования свидетельствуют о том, что, несмотря на значительные антигенные отличия широко используемых в производстве штаммов вируса ящура О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012, вакцины, изготовленные на их основе, способны обеспечить защиту КРС и свиней от генерализованной формы ящура при заражении вирусом гетерологичного штамма О №2344/Монголия/2017 на 4 и 7 СПВ.

Применение противоящурной инактивированной эмульсионной вакцины из штамма О №2344/Монголия/2017, содержащей в прививной дозе 12,1 мкг

146+75S компонентов, способствует формированию иммунитета у овец через 4 СПВ в титре 3,75±0,14 против гомологичного штамма. Уровень гуморального иммунитета у овец против гетерологичных штаммов О №2047/Саудовская Аравия/08 и О №2147/Приморский/2012 был в 1,8 и 1,4 раза меньше, чем против гомологичного.

В нашей работе было проведено исследование иммуногенной активности эмульсионных противоящурных вакцин из штаммов Азия-1 №2356/14/18 и А №2205Ю-^ на КРС и свиньях на 4 сутки после иммунизации. Иммуногенная активность противоящурной вакцины из штамма Азия-1 №2356/14/18 в прививном объеме 2см3 (22, 2 мкг 146+75S) составила 8 PD50 для КРС и 55,90 PD50 для свиней при контрольном заражении гомологичным вирусом через 4 СПВ. Уровень ВНА у КРС против гомологичного штамма Азия-1 №2356/14/18 был выше в 2,83-4,29 раз у КРС и в 2,46-4,76 раз у свиней, чем против гетерологичных штаммов вируса ящура типа Азия-1.

Противоящурная вакцина из штамма А №2205Ю-^ (26,45 мкг 146+75 S) показала высокую иммуногенную активность против гомологичного вируса ящура и содержала в прививном объеме 2см3 18,18 PD50 для КРС и 22,22 PD50 для свиней.

Результаты экспериментальных исследований позволяют судить о высокой эффективности моновалентных противоящурных вакцин, изготовленных из новых штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-^. Вакцины характеризуются высокой иммуногенной активностью, авирулентны, безвредны, не индуцируют выработку антител к неструктурным белкам.

В настоящее время противоящурные вакцины для ранней защиты наиболее перспективны, поэтому необходимо интенсифицировать работы по внедрению промышленной технологии их изготовления и широкому применению для купирования и ликвидации вспышек ящура и его профилактики.

121

6 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 6.1 Итоги выполненных исследований (выводы):

1. Разработаны моновалентные эмульсионные вакцины против вируса ящура типов О, Азия-1, А для ранней защиты, которые являются авирулентными, безвредными, стерильными, иммуногенными и не индуцируют выработку антител к неструктурным белкам вируса ящура.

2. Адаптированы изоляты вируса ящура О/МОО/13/2017, Азия-1 Пакистан/2018, A/EGY/2/2018 к монослойным культурам клеток СП, ГБ-К8-2, ПСГК-30, ВНК-21 и оптимизированы условия получения производственных расплодок для изготовления инактивированных вакцин путем использования 3его пассажа в культуре клеток ПСГК-30 в качестве предпосевного вируса.

3. Адаптированы штаммы вируса ящура О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-1У к суспензионной клеточной линии ВНК-21 и установлено, что репродукция вирусов происходит с проявлением специфической гибели клеток на 90-100% через 19-20 ч после инфицирования, наибольшее количество 146 Б компонента отмечается на этапе 5-6ого пассажей.

4. Установлено, что отработанный режим инактивации вирусов 0,03% АЭЭИ, рН 7,2-7,8, температура 37°С и время инкубации 12 часов обеспечивал содержание одной инфекционной частицы в 1016-1021см3 инактивированной суспензии.

5. Определено, что моновалентная эмульсионная вакцина из штамма О №2344/Монголия/2017 с содержанием 12,1 мкг 146+75Б компонентов в прививной дозе 2 см3 на 4 СПВ индуцировала титры ВНА против гомологичного штамма в 1,2 раза ниже по сравнению с применением двойной дозы, на 7 СПВ индуцировала титры ВНА в пределе 4,67±0,23 и обеспечила защиту КРС от заражения гомологичным вирусом.

6. Установлено, что моновалентная эмульсионная вакцина из штамма О №2047/Саудовская Аравия/08 с содержанием 30,1 мкг 146+75Б компонентов в прививной дозе 2 см3 защитила 80% КРС и 80% свиней после контрольного заражения гетерологичным вирусом О №2344 Монголия/2017 на 7 СПВ.

7. Показано, что моновалентная эмульсионная вакцина из штамма О №2147 Приморский/2012 с содержанием 29,3 мкг иммуногенных компонентов в прививной дозе 4 см3 защитила КРС и свиней через 7 СПВ от заражения гетерологичным вирусом О №2344/Монголия/2017.

8. Определено, что противоящурная инактивированная эмульсионная вакцина из штамма Азия-1 №2356/14/18, содержащая в прививном объеме 2 см3 22,2 мкг иммуногенных компонентов, обладала иммуногенной активностью 8 PD50 для КРС и 55 PD50 для свиней через 4 суток после иммунизации при контрольном заражении гомологичным вирусом.

9. Установлено, что иммуногенная активность эмульсионной вакцины из штамма А №2205Ю-!У, содержащей в прививном объеме 2 см3 26,45 мкг 146+75S компонентов, была 18,18 PD50 для КРС и 22,22 PD50 для свиней через 4 суток после иммунизации при контрольном заражении гомологичным вирусом.

6.2 Практические предложения

На основании проведенных исследований были разработаны, рассмотрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ»: «Методические рекомендации по определению титра инфекционной активности культурального вируса ящура в сырье для вакцины методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ)»; СТО 00495527-0065-2020 «Вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная «АРРИАХ-ВАК»; СТО 00495527-0143-2018 «Вакцина против ящура сорбированная моно-и поливалентная (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21)».

6.3 Перспектива дальнейшей разработки темы

Дальнейшие исследования могут быть направлены на разработку и изготовление поливалентных эмульсионных вакцин для ранней защиты из актуальных штаммов О №2344/Монголия/2017, Азия-1 №2356/14/18, А №2205Ю-IV для практического применения.

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АЭЭИ - аминоэтилэтиленимин; ВНА - вируснейтрализующие антитела;

ВНК-21 - перевиваемая клеточная культура почки сирийского хомячка;

ВЯ - вирус ящура;

ГОА - гидроокись алюминия;

ИД50 - пятидесятипроцентная инфекционная доза;

ИмД50 - пятидесятипроцентная иммунизирующая доза;

ИФА - иммуноферментный анализ;

КВЯ - культуральный вирус ящура;

КК - культура клеток;

КРС - крупный рогатый скот;

ОВБ - общий вирусный белок;