Получение стабильной клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантный белок I329L вируса АЧС -антагонист TLR-3 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Каторкин Сергей Александрович

• Каторкин Сергей Александрович
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Каторкин Сергей Александрович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общие сведения о вирусе Африканской чумы свиней

1.2. Репликация и сборка вируса АЧС

1.3. Строение генома вируса АЧС

1.3.1. Гены, участвующие в репликации и репарации вирусной ДНК

1.3.2. Гены, кодирующие ферменты, участвующие в транскрипции и процессинге мРНК

1.3.3. Гены, кодирующие другие ферменты

1.3.4. Гены, кодирующие структурные и участвующие в сборке белки

1.3.5. Гены, кодирующие иммуномодулирующие и белки иммунного уклонения

1.3.6. Мультигенные семейства

1.4. Механизмы вирусной эвазии

1.4.1. Ингибирование врожденного иммунитета

1.4.1.1. Ингибирование системы комплемента

1.4.1.2. Ингибирование интерферонового ответа

1.4.1.3. Ингибирование апоптоза

1.4.1.4. Ингибирование естественных киллеров NC - клеток

1.4.1.5. Ингибирование цитокинов и хемокинов

1.4.2. Ингибирование приобретенного гуморально-клеточного иммунитета

1.4.2.1. Ингибирование антител

1.4.2.2. Ингибирование главного комплекса гистосовместимости ГКГС (МНС) класса I и II

1.5. Толл-подобный рецепторный (TLR) сигнальный путь

1.5.1. Толл-подобный рецептор 3 (TLR3)

1.6. Заключение по обзору литературы

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Секвенирование полного генома полевых изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ

3.2. Сравнительный анализ последовательности геномов исследуемых полевых изолятов вируса АЧС

3.3. Сравнительный анализ выявленных изменений в геномах изолятов вируса АЧС

3.4. Анализ наличия TRS-вставки в межгенной области I73R/I329L для внутригенотиповой дифференциации изолятов вируса АЧС

3.5. Анализ генетической стабильности гена I329L

3.6. Биоинформатический анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей белка I329L

3.7. Создание генно-инженерной конструкции, несущей полноразмерный ген белка I329L вируса АЧС (штамм Ставрополь 01/08)

3.8. Получение стабильной клеточной линии, экспрессирующая белок

I329L вируса АЧС

3.8.1. Оценка стабильности экспрессии гена рекомбинантного белка I329L вируса АЧС в клеточной линии СНО

3.9. Депонирование клеточной линии в музее клеточных линий ФИЦВиМ

3.10. Исследование физико-химических и иммунохимических свойств рекомбинантного белка I329L

3.10.1. Анализ электрофоретической подвижности в ПААГ геле

3.10.2. Анализ степени гликозилирования рекомбинантного белка I329L вируса АЧС

3.10.3. Анализ связывания рекомбинантного белка I329L с антителами гипериммунной сыворотки против вируса АЧС

3.10.4. Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA) рекомбинантного белка I329L вируса АЧС

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1. ВЫВОДЫ

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение стабильной клеточной линии, экспрессирующей рекомбинантный белок I329L вируса АЧС -антагонист TLR-3»

Актуальность работы

Вирус африканской чумы свиней (АЧС) является возбудителем одной из самых опасных болезней для представителей домашних и диких свиней семейства Suidae. Африканская чума свиней характеризуется лихорадкой, кровоизлияниями во внутренних органах, цианозом кожи ушных раковин, подгрудка, живота и конечностей. Вирус АЧС является единственным известным ДНК-содержащим арбовирусом. Высоковирулентные штаммы вируса вызывают смертность, близкую к 100 % [1,2].

Вирус АЧС, представляет собой ДНК-содержащий вирус с икосаэдрической морфологией и классифицируется, как единственный член семейства вирусов Asfarviridaе [3].

Полевые изоляты вируса АЧС представлены поликлональными популяциями, различающимися по вирулентности, гемадсорбирующим и антигенным свойствам, что свидетельствует о его антигенной вариабельности [18, 31]. Многообразие генетических вариантов вируса АЧС также является одной из причин отсутствия эффективных вакцин против данной болезни [36]. Всё это обусловливает трудность борьбы с АЧС и необходимость совершенствования противоэпизоотических мероприятий на основе новейших научных достижений в области молекулярной и клеточной биологии [62].

За время эволюции вирус АЧС выработал стратегии уклонения от иммунной системы хозяина за счет функционирования различных генов (ЕР153^ A179L, A238L, A224L, I329L, MGF360/530, DP71L) вируса АЧС, влияющих на разные сигнальные пути проявления гуморального и клеточного иммунитета [94] .

Эти белки вируса АЧС обеспечивают уклонения от защитных систем макроорганизма, путем ингибирования внутриклеточных сигнальных путей и также транскрипционной активации важных иммуномодулирующих генов.

Этим можно частично объяснить отсутствие эффективного иммунного ответа хозяина на инфицирование вирусом АЧС.

В связи с этим, изучение ключевых генов и белков иммунного уклонения, может служить важным инструментом в борьбе с африканской чумой, и является актуальным направлением в изучение роли и функций данных белков в патогенезе заболевания.

Степень разработанности проблемы.

В 2004 году Dixon L.K с соавторами установили, что вирус АЧС обладает широким арсеналом белков, обеспечивающих уклонение от иммунной системы хозяина, что, возможно, является основным препятствием для создания средств защиты от болезни [36]. Установлено, что некоторые белки вируса АЧС такие как: A238L, ингибирует активацию ядерного фактора - каппа В и кальциневрина фосфотазы; A276R, ингибирует индукцию интерферона-b; A528R, ингигибирует индукцию и влияние интреферонов I и II типов; I329L, является антагонистом и ингибитором сигнального пути TLR3, снижающего индукцию интерферона организма [64].

Способность вируса восстанавливать свою вирулентность после заражения слабо вирулентными изолятами также свидетельствуют о том, что вирус имеет эффективные механизмы уклонения от систем защиты организма, в частности, врожденного иммунитета. Parkhouse с коллегами выдвинули гипотезу о том, что некоторые гены вируса АЧС в течение эволюции приобрели способность обеспечивать уклонение от иммунной системы инфицированного хозяина, за счет влияния на сигнальную систему Толл-подобных рецепторов (TLR), которая сохраняется как у млекопитающих, так и у членистоногих [72].

Определено 13 различных TLR (TLR-1 - TLR-13) у млекопитающих. Димеризация TLR, происходящая при взаимодействии с соответствующими лигандами, инициирует внутриклеточный сигнальный каскад с последующим рекрутированием внутриклеточных адапторных белков.

При этом происходит индукция воспалительных цитокинов и хемокинов, а также индукция интерферона-Р (Ш^Р). В свою очередь, Ш^Р усиливает интерфероновый ответ и развитие противовирусной активности, тем самым способствует формированию противовирусной защиты [57].

В настоящее время отсутствует какая-либо информация о роли белка I329L вируса АЧС в патогенезе болезни. Нет данных о его генетической стабильности, а также отсутствуют «инструменты» для изучения механизма действия иммуномодулирующего белка рI329L вируса АЧС российского происхождения.

Цель и задачи исследования.

Создание продуцента рекомбинантного белка I329L вируса АЧС -

антагониста TLR-3 и изучение его физико -химических свойств.

Для достижения поставленной цели необходимо было выполнить следующие задачи:

1. Определить полный геном полевых изолятов от домашних свиней вируса АЧС, выделенных на территории РФ.

2. Провести сравнительный анализ последовательности геномов исследуемых полевых изолятов вируса АЧС.

3. Выявить доменную организацию белка иммунного уклонения I329L вируса АЧС

4. Получить экспрессионную конструкцию, несущую полноразмерный белок I329L вируса АЧС.

5. Получить стабильную клеточную линию CHO-I329L-his, экспрессирующую белок I329L-his вируса АЧС.

6. Изучить физико-химические и иммунологические свойства рекомбинантного белка I329L-his.

Научная новизна работы.

Впервые получены полные последовательности генома двух полевых

изолятов вируса АЧС «Тверь 06/2012» и «Кашинский 09/2012», выделенных от домашних свиней в Российской Федерации в 2012 году. Выявлены общие

характерные изменения в 7 генах: QP383R, CP2475L, CP204L, NP419L, B602L, A224L и K78R, а также, обнаружены инсерции в межгенном участке I73R/I329L и MFG 505-9R и MFG 505-10R (9R/10R) для изолята «Тверь 06/2012».

Впервые в Российской Федерации получена рекомбинантная конструкция, несущая полноразмерный ген I329L вируса АЧС.

Впервые в мире получена стабильная клеточная линия «CHO-I329L-Шэ», экспрессирующая полноразмерный белок I329L вируса АЧС -антагонист ТЬК-3.

Впервые в Российской Федерации получен рекомбинантный полноразмерный белок I329L (с гексагистидиновой меткой), аутентичный по физико-химическим и иммунологическим свойствам белку вируса АЧС.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

1. Получена и депонирована в музее клеточных культур ФГБНУ ФИЦВиМ,

стабильная клеточная линия CHO-I329L-His, представляющая собой уникальную модель для изучения вирус-клеточных взаимодействий вируса АЧС, которая может быть использована для изучения свойств иммуномодулирующих белков и также для создания дефектных рекомбинантных вирусов АЧС в качестве кандидатных вакцин.

2. Получены полные нуклеотидные последовательности геномов полевых изолятов вируса АЧС («Тверь 06/2012», «Кашинский 09/2012»), которые могут быть использованы для сравнительных анализов последовательностей генома.

3. В составе вектора рВМЫ (Лёё§епе, США) получена рекомбинантная экспрессионная плазмида, несущая полноразмерный ген I329L вируса АЧС.

Методология и методы исследования.

В работе использовали биоинформатические методы; молекулярно -биологические; клеточно-биологические, физико-химические, а также световую микроскопию.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Сравнительный анализ последовательностей полных геномов полевых

изолятов «Тверь 06/2012», «Кашинский 09/2012», выделенных от домашних свиней в Российской Федерации показал наличие общих мутаций в 7 генах: QP383R, CP2475L, CP204L, NP419L, B602L, A224L и K78R. Филогенетический анализ полевых изолятов, циркулирующих на территории РФ, позволил разделить их на 2 кластера, что свидетельствует об эволюции вируса АЧС.

2. Стабильная клеточная линия «CHO-I329L-His», экспрессирующая полноразмерный белок I329L, вируса АЧС.

3. Физико-химические и иммунологические свойства рекомбинантного белка I329L вируса АЧС антагониста TLR-3.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории Молекулярной вирусологии ФГБНУ ФИЦВиМ (к.б.н. К.А. Мима, к.б.н. И.А. Титов, к.б.н. Бурмакина Г.С.).

Степень достоверности и апробации результатов. Достоверность всех экспериментальных показателей подтверждена статистическими критериями и комиссионными испытаниями. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ФГБНУ ФИЦВиМ (2012-2017 гг.); Международном симпозиуме «North American PRRS Symposium» (Чикаго, США, 5-6 сентября 2015 г.); X Международном конгрессе «Epizone» (г. Монпелье, Франция, 2015 г.); 19 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века»; 21 Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века»; Молодежной научной конференции

«Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (г. Москва 2017 г.).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 странице машинописного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 41 рисунками. Список литературы включает 110 источников, из которых 83 иностранные.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Общие сведения о вирусе Африканской чумы свиней

Вирус Африканской чумы свиней (АЧС) вызывает геморрагическую лихорадку с высокими показателями смертности у домашних свиней и диких кабанов, а также хроническое течение без проявления каких - либо признаков заболевания среди бородавочников (Ркасосковгш авШор1сш) и кустарниковых (Ро1атосИовгш рогсш) аборигенных свиней (рисунок 1.) [1, 2, 3].

Рисунок 1. Восприимчивые животные и переносчики вируса АЧС:

Примечание. А) - европейский дикий кабан; Б) - кустарниковая свинья (Potamochoerus porcus); В) - бородавочник (Phacochoerus aethiopicus); Г) -мягкие клещи (Ornithodoros moubata); Д) - домашняя свинья (Sus scrofa).

Вирус АЧС является единственным представителем семейства Asfaviridae, содержит двухцепочечную ДНК и размножается в мягких клещах рода Ornithodoros, которые, служат в качестве вектора [1, 2].

АЧС является эндемичным для стран Африки к югу от Сахары и существует в дикой природе за счет циркуляции между клещами рода

Ornithodoros (Ornithodoros твиЪа1а и Ornithodoros вггаИеш), и дикими кустарниковыми свиньями и бородавочниками [1, 12].

Считается, что кустарниковые свиньи и бородавочники являются естественными резервуарами вируса АЧС, так как у них нет клинических признаков заболевания, инфицированных вирулентными штаммами вируса, которые убивают домашних свиней в течение 5-10 дней после инфекции [15, 16].

Вирус АЧС спорадически регистрировался за пределами стран Африки. Так в 1957 году он был обнаружен в Португалии и Испании, где болезнь оставалась эндемичной до 1990-х годов.

Вирус был зарегистрирован и в других европейских странах (Италия, Франция, Нидерланды), а также в странах Карибского бассейна (Куба, Доминиканская республика и Гаити) и Бразилии [33]. Заболевание было ликвидировано в большинстве из этих стран, за исключением о. Сардиния, где она по-прежнему сохраняется и является эндемическим с 1982 года [11].

Было отмечено, что в процессе циркуляции вируса АЧС среди домашних и диких свиней вирус значительно эволюционировал в сторону снижения вирулентности полевых изолятов, которые вызывали хронические формы заболевания [15, 34].

При изучении заболевания у домашних свиней были обнаружены низковирулентные изоляты, которые снижают смертность и, в некоторых случаях, приводят к хронической форме инфекции. Тем не менее, переболевшие свиньи, могут оставаться инфицированными в течение длительного времени, тем самым оставаясь резервуаром для заражения здоровых свиней [11, 15].

Первые вспышки АЧС на территории Российской Федерации были зарегистрированы в ноябре 2007 г. в Нагорно-Карабахском районе, граничащие с территорией Грузии и Армении, где ранее в августе 2007 года была диагностирована и официально подтверждена АЧС.

Затем в 2008 г. в южной части России (Чеченская республика, Ставропольский край, Краснодарский край) было зарегистрировано более 70 вспышек АЧС. Далее в 2009 г. вирус АЧС был занесен на территорию Оренбургской и Ленинградской областей, затем он постепенно распространился по всей центральной части России. В настоящее время африканская чума свиней постоянно регистрируется в различных регионах России [32].

Начиная с 2014 года были выявлены первые случаи обнаружения АЧС среди кабанов в странах Балтии и Польши. Быстрое распространение этого заболевания на территориях указанных выше стран, объясняется высокой плотностью поголовья диких кабанов, что значительно усложняет контроль и искоренение АЧС [14].

В настоящее время эпизоотическая ситуация остается напряженной, с колоссальными последствиями для всей отрасли свиноводства в Российской Федерации и стран Европы. Сохраняется высокий риск распространения болезни в других европейских странах.

Вирус африканской чумы свиней, вызывает геморрагии, резкое увеличение селезенки и сопровождается обширным разрушением лимфоидной ткани вследствие апоптоза. К другим иммунологическим изменениям относятся гипергаммоглобулинемия, а также снижение реакции на лектины Т-клетками инфицированных животных [58].

Вирус поражает клетки моноцитарного происхождения - макрофаги, главные клетки иммунной системы. Для успешного инфицирования и репликации в макрофагах вирус использует различные стратегии для модуляции и/или вмешательства в иммунный ответ хозяина во время инфекции. Во время острой формы заболевания наблюдается снижение количество циркулирующих лимфоцитов и нейтрофилов [7, 42].

Некоторые исследователи показали, что классические нейтрализующие антитела, продуцируемые во время вирусной инфекции, могут играть ключевую роль в формировании защитного иммунного ответа против АЧС

[37]. Животные, инфицированные низковирулентным штаммом/изолятом, были защищены от заражения более вирулентными изолятами АЧС. Еще одно важное наблюдение в поддержку существования защитного серологического иммунитета, свидетельствуют данные о частичной защите от высокопатогенных вирусных изолятов, животных, которым вводили сыворотки от переболевших свиней [52, 99, 100].

Несмотря на очевидную необходимость, вакцина против АЧС пока недоступна, а борьба с заболеванием основана на быстрой диагностике, внедрению санитарных мер и ограничения передвижения восприимчивых животных.

1.2. Репликация и сборка вируса АЧС.

Ферменты, необходимые для репликация ДНК вируса, экспрессируются сразу же после проникновения вируса в цитоплазму клетки. Подобно вирусам оспы, вирионы вируса АЧС содержат белки, необходимые для всех этапов транскрипции и репликации [15].

Вирус проникает в клетку с помощью рецепторного эндоцитоза и высвобождается из эндоцитарных везикул в цитоплазму. После вхождения в цитоплазму вирионы освобождаются от оболочки и их ДНК транскрибируется вирионной ДНК зависимой РНК полимеразой [42].

Репликация ДНК вируса АЧС напоминает репликацию вируса оспы. Родительская ДНК служит матрицей для первого этапа репликации ДНК, а затем - матрицей для синтеза большого репликативного комплекса, который расщепляется с образованием зрелой вирионной ДНК [42].

Однако, на ранней стадии репликации вируса АЧС синтез вирусной ДНК выявляется в виде плотных очагов в ядре рядом с мембраной, а на более поздней стадии вирусная ДНК находится исключительно в цитоплазме. На ранней стадии репликации в ядре находятся небольшие фрагменты вирусной ДНК, а на более поздней стадии в цитоплазме содержатся более длинные фрагменты (~37—46Б). Эти фрагменты ДНК, вероятно, являются

предшественниками, которые, сшиваясь («голова — хвост»), превращаются в полноразмерную геномную ДНК [45].

Сборка икосаэдрического капсида происходит на модифицированных мембранах эндоплазматического ретикулума. Продукты протеолитического процессинга полипротеинов образуют основную оболочку между внутренней мембраной и нуклеопротеидной оболочкой ядра. Дополнительный наружный слой мембраны формируется в виде частиц плазматической мембраны [36].

Вирус АЧС кодирует белки, которые ингибируют сигнальные пути в инфицированных макрофагах и, таким образом, модулируют транскрипционную активацию генов иммунного ответа. Кроме того, вирус кодирует белки, которые ингибируют апоптоз инфицированных клеток, которые облегчают воспроизводство потомства вирионов [36, 45].

Вирусные мембранные белки имеют сходство с клеточными белками адгезии, которые модулируют взаимодействие вирус-инфицированных клеток и внеклеточных вирионов [41, 45].

1.3. Строение генома вируса АЧС

Геном вируса АЧС представляет собой линейную двухцепочечную молекулу ДНК, длина которой варьирует от 170 до 193 тысяч пар нуклеотидов (тпн). К'- и С'- концевые участки генома вируса связаны друг с другом ковалентной связью и содержат инвертированные повторы и шпильки, к которым примыкают терминальные инвертированные последовательности (ТИП) [17, 48].

Геном вируса АЧС кодирует от 151 до 167 открытых рамок считывания (ОРС), из которых до 31 ОРС объединены в 5 мультигенных семейств, названные по среднему составу аминокислот и кодируемых ими белков. Различия в длине генома изолятов вируса АЧС связаны с разным числом геном в составе мультигенных семейств (MGF). Изменения длины

генома у разных изолятов происходят в результате потери или уменьшения количества коротких тандемных повторов или межгенных областей [48].

Chapman с коллегами определили полные последовательности геномов 12 изолятов вируса АЧС. Так первая полная последовательность генома вируса АЧС была определена у штамма BA71V , адаптированного к культуре клеток Vero. Номенклатуры выявленных генов были названы на основании расположения генов, начиная с левого конца (N) генома. Однако серьёзное замешательство в номенклатуре генов было вызвано наличием у разных изолятов большого количества копий вариабельных генов, располагающихся в областях мультигенных семейств. Так была предложена новая номенклатура генов, получившие названия в соответствии с расположением в пределах каждого мультигенного семейства и положением от левого конца (N) генома [48].

Полученные данные позволили провести сравнительный анализ полных геномов авирулентных и вирулентных штаммов и изолятов вируса АЧС для последующего исследования молекулярных механизмов патогенности [56].

При сравнении геномов патогенных и непатогенных изолятов вируса АЧС с уже известными последовательностями, адаптированного к культуре клеток Vero штамма Ba71V, было установлено, что длина геномов анализируемых изолятов варьировала от 170 до 182 тпн., а количество открытых рамок считывания - от 151 до 157 [56].

У изолятов Benin 97/1 OURT88/3 были выявлены делеции длиной от 8 до 10 тпн. В правом концевом участке генома штамма Ba71V, по сравнению с другими двумя исследованными изолятами, была обнаружена делеция длиной 3 тпн. Данный участок кодирует пять открытых рамок считывания, в том числе и дополнительную рамку считывания, кодирующая структурный белок p22 [48, 26].

У изолята OURT88/3 обнаружены вставки в открытой рамке считывания, кодирующей CD2v белок и лектин C-типа [47].

Кроме того, отличия в геномах всех исследованных штаммов и изолятов вируса АЧС были обнаружены в расположениях всех пяти различных мультигенных семейств. Так, открытая рамка считывания 109, участвующая в процессе репликации вируса, сборки вириона и формирования защитного ответа хозяина, не дублируется и является консервативной для всех трех вирусов. Представленные авторами результаты свидетельствуют о генетической вариабельности изолятов вируса АЧС, отличающиеся по патогенности [43].

Гены близко расположенные друг от друга, кодируются на обеих нитях вирионной ДНК без четкого смещения по всему геному. Однако в некоторых геномных областях, ориентация соседних генов является одинаковой (рисунок 2). Например, они включают регионы расположения мультигенных семейств, которые формировались путем дублирования генов [34].

Известно, что вирус АЧС, транскрибируется в цитоплазме инфицированных клеток, поэтому гены не содержат интронов и не происходит сплайсинга транскриптов. Также не существует доказательств наличия, кодируемых вирусом микроРНК [42].

В ходе изучения функций вирусных генов, было установлено, что целый ряд кодируемых белков не являются необходимыми для репликации вируса, а участвуют во взаимодействии с хозяином, и являются факторами вирулентности и эвазии [17, 42].

Промоторные последовательности, как правило, являются короткими и аденин-тимин (АТ) богатыми, и они распознаются вирусными факторами транскрипции, специфичными для разных стадий экспрессии вирусных генов: раннего, среднего и позднего классов [41].

Белки экспрессируются по каскадному механизму, частично происходящих в ядре клетки с использованием ферментов и других факторов, отвечающих за «упаковку» вирусной частицы [31].

Рисунок 2. Схема расположения открытых рамок считывания вирулентного изолята вируса АЧС Georgia 2007/1 (FR682468).

Примечание. ОРС показаны стрелками, указывающие их размер и

направление, в котором они считываются. Цвета ОРС связаны с известными функциями. Черный цвет указывает на ОРС кодирующие ферменты и факторы, участвующие в репликации, репарации или транскрипции генома. Серый цвет указывает на ОРС, кодирующие структурные белки. Розовый цвет означает, ОРС кодирующие белки участвующие в уклонение от защиты хозяина. Бирюзовые, синие, зеленые, коричневые и лиловые цвета указывают на принадлежность их к мультигенным семействам. ОРС, кодирующие белки с другими предсказанными функциями, представлены желтым цветом. ОРС, кодирующие белки неизвестной функции, показаны белым цветом. Красный текст указывает на ОРС, удаление которых снижает вирулентность вируса.

1.3.1. Гены, участвующие в репликации и репарации вирусной

ДНК.

Вирус АЧС содержит гены, кодирующие ферменты, вовлечённые в нуклеотидный метаболизм (рибонуклеотидредуктаза, тимидинкиназа, тимидилаткиназа, дезоксиуридинтрифосфатаза), репликацию, репарацию и транскрипцию ДНК (ДНК-полимераза, ДНК-лигаза, топоизомераза II , Таблица 1. Гены вируса АЧС, кодирующие структурные и

участвующие в морфогенезе белки.

№ п/п Функция гена Название гена Кодируемый белок, кДА

1 Структурный белок Р22 KP177R 20,2

2 Гистон-подобный белок A104R 11,5

3 Структурный белок Р11.5 A137R 21,1

4 Структурный белок Р10 A78R 8,4

5 Белок PA151R. Компонент окислительно-восстановительного пути A151R 17,5

6 P72 основной капсидный белок, участвующий в проникновении вируса B646L 73,2

7 Сульфгидрил-оксидазный компонент окислительно-восстановительного пути B119L 14,4

8 Белок P49, участвующий в формировании икосаэдрической формы капсида B438L 49,3

9 Вирусный шаперон. Участвует в формировании капсида. Не входит в состав вириона. B602L 45,3

10 ERV 1 -подобный белок. Участвует в окислительно-восстановительных пути метаболизма B119L 14,4

11 SUMO-1-подобная протеаза. Участвует в расщепление полипротеинов S273R 31,6

12 Белок Pp220 полипротеиновый предшественник p150, P37, p14 и p34. Требуется для упаковки ядра. CP2475L 281,5

13 Белок P32 (P30) фосфопротеин. Участвует в проникновении вируса. CP204L 23,6

14 Pp62 (pp60) полибелковый предшественник P35иp15 CP530R 60,5

15 Р12-связывающий белок O61R 6,7

16 Р17. Участвует в сборке капсида вириона Б117Ь 13,1

17 J5R. Трансмембранный домен И108Я 12,5

18 Р54 (]13Б). Участвует в проникновении вируса. Б183Б 19,9

19 J18L. Трансмембранный домен Б199Б 22

20 Р14.5. ДНК-связывающий белок. Служит для перемещения вирионов в плазме мембраны. Б120Я 13,6

E248R (k2R). Возможный компонент

21 окислительно-восстановительный пути требуется для образования дисульфидных связей. Б248Я 27,5

22 XP124L. Член мультигенного семейства 110. MGF 110-4Б (ХР124Б) 14,2

CD2 подобный белок хозяина.

23 Требуется для связывания красных кровяных телец инфицированными клетками. Гликопротеин внешней оболочки вируса БР402Я 45,3

гуанилтрансфераза, метилтрансфераза, РНК-трифосфотаза, нуклеозид дифосфат Х гидролаза (Nudix), три члена суперсемейства II ДНК-геликаз, 8-гидрокси-ГТФ-аза, апуриновая/апиримидиновая эндонуклеаза, ДНК-зависимая-РНК-полимераза) [35]. Известные на данный момент гены, участвующие в репликации и репарации вирусной ДНК, представлены в таблице 1.

Имеются ферменты посттрансляционной модификации белков (убиквитин-конъюгирующий фермент и серин/треонин протеинкиназа), а также ферменты, участвующие в синтезе изопреновых соединений (пренилтрансферазы) [35].

Активной цистеиновой протеазой, способной процессировать рр62 и рр220 в месте последовательности Gly-Gly-X, является вирусспецифическая цистеиновая протеиназа pS273R [60, 67].

Макрофаги являются высокодифференцированными, неделящимися клетками, и поэтому они не способны синтезировать нуклеотиды, и, следовательно, имеют ограниченный пул доступных нуклеотидов, особенно

низкое содержание TTP и dCTP. Предполагается, что присутствие вирусной dU^^Li в цитоплазме инфицированных клеток обеспечивает высокое соотношение TTP/dUTP, чтобы минимизировать неправильное включение урацила в вирусную ДНК. Несмотря на отсутствие вирусного фермента в клеточном ядре, его раннее присутствие в цитоплазме достаточно, чтобы эффективно поддерживать целостность синтезируемой вирусной ДНК [45].

Делеция гена, кодирующего dUTPазу, снижает репликацию вируса в макрофагах [41]. Делеция гена B119L, вовлеченного в вирусный морфогенез как компонент окислительно-восстановительной цепи, снижает репликацию вируса в макрофагах в 100 раз, а также его вирулентность для свиней [29, 54].

Делеция гена тимидинкиназы приводит к снижению репродукции вируса АЧС в свиных макрофагах (0,1-1 % от уровня исходного вируса). Делеционный мутант по ТК-гену вызывал скоротечную лихорадку у свиней и характеризовался пониженными показателями титров виремии и смертности животных. Таким образом, было показано, что ТК-ген необходим вирусу АЧС для репродукции в макрофагах свиньи in vitro и является фактором, влияющим на его вирулентность для свиней [35, 41].

1.3.2. Вирусные ферменты, участвующие в транскрипции и

процессинге мРНК.

Известные на данный момент гены, участвующие в транскрипции и процессинге мРНК, представлены в таблице 2.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Каторкин Сергей Александрович, 2018 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Африканская чума свиней в Европе [электронный рессурс] / АгроХХ1 - Российский агропромышленный портал // животноводство. -Режим доступа: https: //www.agroxxi. ru/zhivotnovodstvo/novosti/afrikanskaj а-chuma-svinei-v-evrope.html

2. Бакулов, И.А. Проблемы современной эволюции африканской чумы свиней / И.А. Бакулов, В.В. Макаров// Вестн. с.-х. науки. - 1990.- № 3. -С.46-55.

3. Болоцкий, И.А. Африканская чума свиней / И.А. Болоцкий, А.П. Васильев, В.И. Семенцов. - Свиноферма. - 2008.- № 9. - С. 43-46.

4. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин и др. - М.: ВНИТИБП, 1998. - С.770-777.

5. Выявление вируса АЧС в продуктах, приготовленных из свинины / Д.В. Колбасов, С.Ж. Цыбанов, А.С. Малоголовкин и др. - Ветеринария. -2011. - № 10. - С. 54-55.

6. ГОСТ 28573-90. Свиньи. Методы лабораторной диагностики африканской чумы. - Москва: Изд-во стандартов, 1991. - 10 с.

7. Гуморальные и клеточно- опосредованные механизмы иммунитета при африканской чуме свиней (обзор) / А.Д. Середа, А.С. Казакова, А.Р. Иматдинов, Д.В. Колбасов // Сельскохозяйственная биология. - 2013. - Т. 50, №6. С. 709-718.

8. Дуева, Е.В. Разработка низкомолекулярных ингибиторов репродукции переносимых клещами флавовирусов: дис. канд. хим. наук / Дуева Евгения Владимировна; ФГБНУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова. - Москва, 2016. - 130с.

9. Иммунобиологические свойства аттенуированных вариантов вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации / В.И. Балышева, Е.Ю. Прудникова, Т.В. Гальнбек, В.М. Балышев // Российская сельскохозяйственная наука. - 2015. - №1-2. - С. 65-69.

10. Использование рекомбинантного белка р30 вируса африканской чумы свиней в непрямом варианте иммуноферментного анализа / М.Р. Якупов, А.С. Яковлева, А.В. Каньшина и др. // Ветеринария. - 2015. - №8. - С. 58 - 62.

11. Казакова, А.С. Конструирование продуцентов рекомбинантных белков Р72, Р30, и Р54 вируса африканской чумы свиней: дис. ... канд. биол. наук / Казакова Анна Сергеевна; ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. -Покров, 2013. - 135с.

12. Копытов, В.О. Клонирование и экспрессия генов структурных белков Р30 и Р72 вируса африканской чумы свиней: дис. канд. биол. Наук / В.О. Копытов; ГНУ ВНИИВВиМ Росслельхозакадемии. - Покров, 2004. -137с.

13. Маниатис, Т. (1984). Методы генной инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э.Фрич, Дж. Сэмбрук // Москва: Мир, 1984.

14. О резком обострении эпизоотической ситуации по АЧС в странах Балтии и Польши [электронный рессурс] / Россельхознадзор // эпизоотическая ситуация АЧС. - Режим доступа: http: //www.fsvps.ru/fsvps/asf/news/18098. html

15. Природная очаговость африканской чумы свиней / В.В. Макаров [и др.] // Ветеринарная патология. - 2011. - № 3. - С. 9-18.

16. Природная очаговость африканской чумы свиней : учеб. пособие для вузов / В.В. Макаров, Ф.И. Василевич, Б.В. Боев, О.И. Сухарев ; МГАВМиБ, РУДН. - М.: ЗооВетКнига, 2014 - 65 с.

17. Середа, А.Д. Белки вируса африканской чумы свиней [Электронный ресурс] / А.Д. Середа, Д.В. Колбасов // Научный журнал КубГАУ. - 2012. - Т. 3, №77. - Режим доступа: http://ej.kubagro.ru/2012/03/pdf/35.pdf

18. Середа, А.Д. Моделирование IN VITRO защитных иммунных механизмов при африканской чуме / А.Д. Середа // Сельскохозяйственная биология. - 2013. - №4. С. 59-64.

19. Середа, А.Д. Серологические и физико-химические свойства ГП 110-140 вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, Е.Г. Анохина, Л.Г. Фугина // Ветеринария. - 1993. - № 1. - С. 26-28.

20. Середа, А.Д. Функциональная роль гликозилирования вирусных компонентов / А.Д. Середа, А.А. Пиря. - Вопросы вмрусологии - 1992. - Т. 37, №5-6. - С. 267-270.

21. Серологическая диагностика методом иммуноблоттинга при хронической и бессимптомной формах африканской чумы свиней / О.А. Дубровская, А.С. Казакова, А.П. Васильев и др. // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2015. - №2. - С. 78 - 79.

22. Тест-система для экспресс-диагностики африканской чумы свиней методом иммуноблоттинга с использованием рекомбинантного белка р30 / А.С. Казакова, А.Д. Середа, О.М. Стрижакова и др. // Ветеринария. -2014. - №9. - С. 52 - 56.

23. Титов Л.П., Карпов И.А. Противовирусный иммунитет: молекулярно-клеточные механизмы, закономерности развития и иммунопатология // Белорусский медицинский журнал, 2007.- № 1.- С. 19.

24. Транзиентная экспрессия [электронный рессурс] // База знаний по биологии человека. Режим доступа: http://humbio.ru/humbio/tarantul_sl/00001590.htm

25. Эпизоотологический мониторинг африканской чумы свинсй в Республике Абхазия / В.И. Герасимов, С.А. Кукушкин, Э.А. Аншба и др. // Ветеринарный врач. - ФЦТРБ ВПИВ И.- Казань, 2008. - №5,- С.21-25.

26. Эффективность дезинфицирующих препаратов против вируса африканской чумы свиней в почве и воде / В.М. Балышев, В.И. Балышева, А.Д. Середа и др. // Ветеринария. - 2015. - №12. - С. 35-38.

27. Якупов, М.Р. Использование рекомбинантных белков р30, рK205R и рB602L в серодиагностике африканской чумы свиней / М.Р. Якупов, А.С. Яковлева, А.В. Щербаков // Ветеринария сегодня. - 2015. - Т. 3, №14. - С. 37

28. A comparison of viral immune escape strategies targeting the MHC class I assembly pathway. / Fruh, K. [et al.] // Immunol. Rev. - 1999. 168: p. 157166.

29. African swine fever virus Georgia isolate harboring deletions of MGF360 and MGF505 genes is attenuated in swine and confers protection against challenge with virulent parental virus / V. O'Donnell [et al.] // Journal of Virology. - 2015. - Vol. 89, № 11. - P. 6048-6056.

30. African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007-2012. / Gogin A, Gerasimov V, Malogolovkin A, Kolbasov D. // Virus Res.- 2013;p. 173:198-203.

31. African swine fever virus serotype-specific proteins are significant protective antigens for African swine fever. / Malogolovkin A., [et al.] // J Gen Virol. - 2016, 97, p. 1670-1675.

32. African Swine Fever Virus: a new old enemy of Europe. / Wyzewski Z. [et al.] // Ann Parasitol. - 2016, 62, 161-167.

33. African Swine Fever. Encyclopedia of Immunology. / Denyer, M. S. [et al.] // p. 54. doi:10.1006/rwei.1999.0015. ISBN 9780122267659.

34. African Swine Fever Virus. / Dixon L.K. [et al.] // Animal Viruses: Molecular Biology. Caister Academic Press. ISBN 978-1-904455-22-6. t

35. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems. / Dixon, L.K. [et al.] // Vet. Immunol Immunopathol. - 2004. - 100:117134.

36. African swine fever virus replication and genomics. / Dixon L.K. [et al.] // Virus Res. - 2013, 173, p. 3-14.

37. African swine fever virus structural protein p72 contains a conformational neutralizing epitope. / Borca M.V. [et al.] // Virology. - 2001: 413418.

38. African swine fever virus p10 protein exhibits nuclear import capacity and accumulates in the nucleus during viral infection. / I. Nunes-Correia, J.M.

Rodríguez, A. Eulálio [et al.]. // Vet. Microbiol. - 2008. - V. 27. - № 130(1-2). - P. 47-59.

39. African Swine Fever Virus IAP Homologue Inhibits Caspase Activationand Promotes Cell Survival in Mammalian Cells. / Nogal M.L. [et al.] // J. Virol. - 2001; 2535-2543.

40. African Swine Fever: A disease characterized by apoptosis. / Parkhouse R.M.E. [et al.] // J. Gen. Virol. - 2014: 1427-1438.

41. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems. / L.K. Dixon [et al.] // Vet. Immunol. Immunopathol. - 2004. - № 100. -P. 117-134.

42. African swine fever virus. / E.R. Tulman [et al.] // Curr. top. microbial. and immunol. - 2009. - № 328. - P. 43-87.

43. African swine fever virus multigene family 360 and 530 genes affect host interferon response. / Afonso C. [et al.] // J. Virol.- 2004; 78: 1858-1864.

44. African Swine Fever Virus EP153R Open Reading Frame Encodes a Glycoprotein Involved in the Hemadsorption of Infected Cells. / Galindo I. [et al.] // J. Virol. - 2000; p. 340-351.

45. African swine fever virus controls the host transcription and cellular machinery of protein synthesis. / Sánchez E.G. [et al.] // Virus Res 2013, 173, p. 58-75.

46. African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007-2012. / A. Malogolovkin [et al.] // Virus Res. - 2013. -Vol. 173, №1. - P. 198-203.

47. African swine fever virus encodes a CD2 homolog responsible for the adhesion of erythrocytes to infected cells / F. Almazan [et al.] // J. Virol. - 1993. -Vol. 67, №9. - P. 5312-5320.

48. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus. / Yáñez, R. J. [et al.] // Virology.- 2008(1): 249-78.

49. A structural DNA binding protein of African swine fever virus with similarity to bacterial histone-like proteins / M.V. Borca [et al.] // Archives of Virology. - 1996. - Vol. 141, № 2. - P. 301-313.

50. A179L, a viral Bcl-2 homologue, targets the core Bcl-2 apoptotic machinery and its upstream BH3 activators with selective binding restrictions for Bid and Noxa. / Alonso C. [et al.] // J. Virol. - 2008; 375(2): p. 561-572.

51. Biological characterization of African swine fever virus genotype ii strains from north-eastern Estonia in european wild boar. / Blome S. [et al.] //: Transbound Emerg Dis. - 2017. Doi: 10.1111/tbed.12614.

52. Blome S. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar / S. Blome, C. Gabriel, M. Beer // Virus Research. - 2013. -Vol. 173, № 1. - P. 122-130.

53. Creation of a recombinant Rift Valley fever virus with a two-segmented genome. / Brennan B, J. [et al.] // Virol.- 2011. 85: 10310-10318.

54. Cytokine mRNA expression and pathological findings in pigs inoculated with African swine fever virus (E-70) deleted on A238L. / Martins C. [et al.] // Vet. Immunol. Immunopathol. - 2008; 124; p. 107-119.

55. Comparative sequence analysis of genes encoding outer proteins of African swine fever virus isolates from different regions of Russian Federation and Armenia / N.N. Vlasova [et al.] // International Journal of Virology and Molecular Biology. - 2012. - Vol. 1, № 1. - P. 1-11.

56. Comparison of the genome sequences of nonpathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates. / Dixon, L.K. [et al.] // Journal of General Virology. - 2008. 89, p. 397-408

57. Colonna, M. 2007. TLR pathways and IFN-regulatory factors: To each its own. Eur. J. Immunol. 37: 306-309.

58. Coggins, L. African swine fever virus. Pathogenesis. Prog. Med. Virol. - 1974. - 18: p. 48-63.

59. Recombinant new castle disease virus expressing African swine fever virus protein 72 is safe and immunogenic in mice. / Chen X. // Virol Sin. - 2016, 31, p. 1-10.

60. Evolutionary genomics of nucleocytoplasmic large DNA viruses/ / Aravind, L. [et al.] // Virus Research.- 2006.-117 (1), p. 156-184.

61. Gel Shift/ EMSA Protocol. / Jianping Ye [et al.]

62. Genetic variation among African swine fever genotype II viruses, eastern and central Europe. / Gallardo C. [et al.] // Emerg Infect Dis. -2014, 20,

1544-1547.

63. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation / A. Bastos [et al.] // Archives of Virology. - 2003. - Vol. 148, № 4. - P. 693-706.

64. Genomic analysis of highly virulent Georgia 2007/1 isolate of African swine fever virus. / Chapman D.A. [et al.] // Emerg Infect Dis. - 2011, 17, p. 599605.

65. Genomic analysis of highly virulent Georgia 2007/1 isolate of African swine fever virus. / Dixon, L.K. [et al.] // Emerging Infectious Diseases. - 2011. -17 (4), p.599-605.

66. In vivo depletion of CD8+ T lymphocytes abrogates protective immunity to African swine fever virus / C.A. Oura [et al.] // Journal of General Virology. - 2005. -Vol. 86, № 9. - P. 2445-2450.

67. Host cell targets for African swine fever virus. / Alonso C. [et al.] // Virus Res. - 2015, 209, 118-127.

68. Mardis, E.R. Next-generation DNA sequencing methods / E.R. Mardis // Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. - 2008. - Vol. 9. - P. 387-402.

69. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 / K. Tamura [et al.] // Molecular Biology and Evolution. - 2007. - Vol. 24, № 8. - P. 1596-1599.

70. Modeling of the Toll-like receptor 3 and a putative Toll-like receptor 3 antagonist encoded by the African swine fever virus. / R Michael, E Parkhous [et al.] // Protein Sci. - 2011 Feb; 20(2): p. 247-255.

71. Molecular characterization of African swine fever virus isolates originating from outbreaks in the Russian Federation between 2007 and 2011 / A. Malogolovkin [et al.] // Veterinary Microbiology. - 2012. - Vol. 158, № 3. - P. 415-419.

72. Novel TLR3 inhibitor encoded by the African Swine Fever Virus (ASFV). / Parkhouse RME. [et al.] // Arch Virol.- 2010 (accepted 29 November)., in press

73. Identification of the principal serological immunodeterminants of African swine fever virus by screening a virus cDNA library with antibody. / Parkhouse, R.M.E. [et al.] // Gen. Virol. - 2002. - 83: p. 1331-1342.

74. Improved Strategy for Molecular Characterization of African Swine Fever Viruses from Sardinia, Based on Analysis of p30, CD2V and I73R/I329L Variable Regions. / Oggiano A. [et al.] // Transbound Emerg Dis. - 2017 Aug;64(4): 1280-1286. doi: 10.1111/tbed.12504. Epub 2016 May 13.

75. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. / Baum, A., and A. Garcia-Sastre.// Amino Acids. - 2010 38:p. 1283-1299.

76. Influenza A and B viruses expressing altered NS1 proteins: A vaccine approach. / Zheng H [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2000. 97: 4309-4314.

77. Live attenuated influenza viruses containing NS1 truncations as vaccine candidates against H5N1 highly pathogenic avian influenza. / Solorzano A [et al.] // J Virol. - 2009. - 83: p. 1742-1753

78. Isolation of cytotoxic T lymphocytes from healthy seropositive individuals specific for peptide epitopes from Epstein-Barr virus nuclear antigen 1: implications for viral persistence and tumor surveillance. / Khanna, R. [et al.] // Virology. - 2014. p.633-637.

79. Innate immune recognition: mechanisms and pathways. / Medzhitov R., Janeway C. Jr. // Immunol Rev.- 2000.- Vol. 173.- P. 89-97.

80. Interferons and viruses: an interplay between induction, signalling, antiviral responses and virus countermeasures. / Randall RE, Goodbourn // J Gen Virol. - 2008. 89: p.1-47.

81. Pathogenesis of African swine fever in domestic pigs and European wild boar. / Blome S., Gabriel C., Beer M.// Virus Res. - 2013, 173, 122-130.

82. Phase I/II trial of a replication-deficient trivalent influenza virus vaccine lacking NS1. / Mossler C. [et al.] // Vaccine. -2013.- 31: p.6194-6200.

83. Passively transferred African swine fever virus antibodies protect swine against lethal infection. / Rock, D.L. [et al.] // Virology. - 2008. p.350-354.

84. Pathogen recognition and innate immunity. / Akira, S., S. Uematsu, and O. Takeuchi. // Cell.- 2006124:p. 783-801.

85. Performance comparison of benchtop high-throughput sequencing platforms / N.J. Loman [et al.] // Nature Biotechnology. - 2012. - Vol. 30, № 5. -P. 434-439.

86. Poxvirus tropism./ McFadden G. // Nature reviews Microbiology. -2005; (3):p. 201-213

87. Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences. / Villiers E.P.D. // Virology. - 2010, 400, p.128-136.

88. Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. / Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. // Nature 413 (6857). - 2001: 732-8. (doi:10.1038/35099560. PMID 11607032).

89. Related strains of African swine fever virus with different virulence: genome comparison and analysis / R. Portugal [et al.] // Journal of General Virology. - 2015. - Vol. 96, № 2. - P. 408-419.

90. Respiratory syncytial virus modified by deletions of the NS2 gene and amino acid S1313 of the L polymerase protein is a temperature-sensitive, live-attenuated vaccine candidate that is phenotypically stable at physiological temperature. / Buchholz UJ [et al.] // J Virol. - 2013. 87: p.1985-1996.

91. Rift valley fever virus lacking the NSs and NSm genes is highly attenuated, confers protective immunity from virulent virus challenge, and allows for differential identification of infected and vaccinated animals. / Ksiazek TG[et al.] // J Virol.- 2008. 82: p.2681-2691.

92. Roles of African swine fever virus structural proteins in viral infection. / Jie Zhang [et al.] // J.Veterinary Research. - 2017-06-12 | DOI: https://doi.org/10.1515/jvetres-2017-0017.

93. Salas, M. African swine fever virus morphogenesis / M.L. Salas, G. Andres // Virus Research. - 2013. - Vol. 173, № 1. - P. 29-41.

94. Sensing of viral infection and activation of innate immunity by tolllike receptor 3». / Vercammen E, Staal J, Beyaert R. // Clin. Microbiol. Rev. 21 (1). - 2008.: 13-25. DOI:10.1128/CMR.00022-07. PMID 18202435.

95. Stable expression of rabies virus glycoprotein in Chinese hamster ovaryro / S. R. Burger [et al.] // Journal of General Virology.-1991, 72, p. 359-367.

96.cells

97. Tandem Repeat Insertion in African swine fever virus, Russia, 2012 / K.V. Goller [et al.] // Emerging Infectious Diseases. - 2015. - Vol. 21, № 4. - P. 731.

98. The african swine fever virus IAP homolog is a late structural polypeptide. / Rodriguez J. [et al.] // J. Virol. - 1995; 214: p.670-674.

99. The African swine fever virus DP71L protein recruits the protein phosphatase 1 catalytic subunit to dephosphorylate eIF2alpha and inhibits CHOP induction but is dispensable for these activities during virus infection. / Dixon L.K. [et al.] // J. Virol. - 2010; 84(20).

100. The Pathogenesis of African Swine Fever in the resistant bushpig. / Parkhouse R.M.E. [et al.] // J. Gen. Virol. - 1998. P.1439-1443.

101. The subcellular distribution of multigene family 110 proteins of African swine fever virus is determined by differences in C-terminal KDEL endoplasmic reticulum retention motifs. / Netherton C. [et al.] // Journal of Virology. - 200478 (7), p. 3710-3721.

102. To kill or be killed: viral evasion of apoptosis. / Benedict, C.A. [et al.] // Nat. Immunol. - 2002 (11): 1013-1018

103. Toll-like Receptor signalling Pathways. / Barton, G.M., Medzhitov, R. // Science. - 2003. 300:p.1524-1525.

104. Toll-like receptors 9 and 3 as essential components of innate immune defense against mouse cytomegalovirus infection. / Tabeta, K., [et al.] // Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. - 2004. - 101: 3516-3521.

105. TLR3: interferon induction by double-stranded RNA including poly(I:C)». / Matsumoto M, Seya T // Adv. Drug Deliv. Rev. 60 (7).- 2008: 80512. DOI: 10.1016/j.addr.2007.11.005. PMID 18262679.

106. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. / Garcia-Sastre, A., and C. A. Biron. // Science. - 2006. 312:p. 879-882.

107. Unravelling the armour of a killer: Evasion of host defence's by African swine fever virus. / L. K. Dixon [et al.] // J. Virol. - 2016.: doi:10.1128/JVI.02338-16.

108. Vaccinia virus G8R protein: a structural ortholog of proliferating cell nuclear antigen (PCNA). / Da Silva, M., Upton, C. // PLoS ONE. - 2009. - 4 (5), http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0005479, Article Number: e5479.

109. Virulent African swine fever virus isolates are neutralized by swine immune serum and by monoclonal antibodies recognizing a 72-kDa viral protein. / Zsak, L. [et al.] // Virology.- 2002: p. 596-602

110. http: //www.oie.int