Функциональная характеристика гликопротеина СD2v вируса африканской чумы свиней, слитого с Fс фрагментом иммуноглобулина G свиньи тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Каторкина Елена Ивановна

• Каторкина Елена Ивановна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Каторкина Елена Ивановна

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие сведения о вирусе АЧС

2.2. Строение вируса АЧС

2.3. Структура и состав частиц вируса африканской чумы свиней

2.4. Механизмы репродукции вируса АЧС

2.5. Механизмы формирования иммунного ответа против вируса

2.6. Разработка вакцин против вируса африканской чумы свиней

2.7. Технология Fc-слияния белков для разработки вакцин против возбудителей инфекционных болезней человека и животных

2.8. Принцип дизайна и структура Fc-слитых белков

2.9. Функции Fc-фрагмента

2.10. Использование Fc - слитых белков в качестве противовирусных вакцин

2.11. Заключение по обзору литературы

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

3.1.1. Штаммы и изоляты вируса АЧС

3.1.2. Культуры клеток и питательные среды

3.1.3. Сыворотки и иммуноглобулин

3.1.4. Плазмиды и бактериальные штаммы

3.1.5. Коммерческие наборы

3.1.6. Ферменты

3.1.7. Аминокислотные последовательности

3.2. Методы исследований

3.2.1. Расчет олигонуклеотидов

3.2.2. Синтез олигонуклеотидов

3.2.3. Выделение мононуклеарных клеток крови (PBMC)

3.2.4. Культивирование вируса

3.2.5. Выделение ДНК

3.2.6. Выделение РНК

3.2.7. Выделение плазмидной ДНК

3.2.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

3.2.9. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

3.2.10. Электрофорез нуклеиновых кислот

3.2.11. Выделение и очистка нуклеиновых кислот из агарозного геля

3.2.12. Рестрикционный анализ

3.2.13. Лигирование

3.2.14. Трансформация клеток E.coli

3.2.15. Секвенирование

3.2.16. Культивирование клеточной линии CHO

3.2.17. Трансфекция клеточных линий CHO

3.2.18. Определение жизнеспособности и концентрации живых клеток

3.2.19. Электрофорез белков в полиакриламидном геле

3.2.20. Иммуноблотинг

3.2.21. Анализ дегликозилирования

3.2.22. Реакция гемадсорбции

3.2.23. Анализ пролиферации PBMC (peripheral blood mononuclear cells) свиньи

3.2.24. Тест на индукцию интерферона - у клетками PBMC

3.2.25. Программное обеспечение

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Биоинформатический анализ первичной последовательности белка CD2v вируса АЧС

4.2. Идентификация В- и Т- клеточных эпитопов в белке CD2v вируса АЧС т silico

4.2.1. Идентификация Т- клеточных эпитопов в белке CD2v вируса АЧС ш silico

4.2.2. Идентификация В- клеточных эпитопов в белке CD2v вируса

4.2.3. Анализ В- и Т- клеточных эпитопов в белке CD2v т silico

4.3. Дизайн экспрессионных плазмид, несущие гены химерной молекулы CD2v, слитые с Fc-доменом иммуноглобулина IgG1 свиньи

4.4. Создание экспрессионных плазмид, несущие гены химерной молекулы CD2v, слитые с Fc-доменом иммуноглобулина IgG1 свиньи

4.4.1. Амплификация гена CD2v вируса АЧС

4.4.2. Амплификация гена Fc-домена иммуноглобулина IgG1 свиньи

4.4.3. Клонирование и скрининг клонов экспрессионных плазмид, несущих гены химерной молекулы CD2v, слитые с Fc-доменом иммуноглобулина IgG1 свиньи

4.5. Временная экспрессия химерной молекулы CD2v, слитой с Fc IgG1 в

клетках яичников китайского хомячка (СНО)

4.6. Аналитическое выделение рекомбинантных белков CD2v-Fc и Fc-CD2v после транзиторной экспрессии

4.7. Создание стабильных клеточных линий CHO-CD2v-Fc и СНО^с-

CD2v

4.7.1. Трансфекция клеток СНО плазмидами pCD2v-Fc и pFc-CD2v

4.7.2. Селекция клеток СНО, трансфецированных плазмидами pCD2v-Fc и pFc-CD2v

4.7.3. Характеристика стабильных клеточных линий «CHO-CD2-Fc» и «СНО-Fc-CD2»

4.7.4. Характеризация клеточных линий «CHO-CD2-Fс» и «СНО-Fс-CD2»

4.8. Дегликозилирование белков CD2-Fс и Fс-CD2

4.9. Связывание химерных белков CD2-Fс и Fс-CD2 с антивидовым

коньюгатом

4.10. Анализ связывания химерных рекомбинантных молекул CD2v с антителами гипериммунной сыворотки против вируса АЧС

4.11. Реакция гемадсорбции эритроцитов COS-1, экспрессирующие химерные белки CD2-Fc и Fc-CD2

4.12. Анализ пролиферации клеток РВМС

4.13. Анализ связывания химерных молекул с Fc-рецептором

4.14. Тест на индукцию интерферона - у клетками РВМС

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6.2. Выводы

6.3. Практические предложения

6.4. Перспективы дальнейшей разработки темы

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

9. ПРИЛОЖЕНИЯ

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональная характеристика гликопротеина СD2v вируса африканской чумы свиней, слитого с Fс фрагментом иммуноглобулина G свиньи»

Актуальность темы исследования

Африканская чума свиней - контагиозная болезнь домашних свиней, в том числе декоративных, и диких кабанов.

В 2007 году АЧС впервые зарегистрирована в Грузии, позднее, во многих республиках Северного Кавказа. В настоящее время, по данным Россельхознадзора вирус АЧС присутствует в некоторых областях Российской Федерации, а также на территории соседних стран, включая Украину, Польшу, Латвию, Литву, Эстонию и Молдову, а в 2017 была зарегистрирована в Чешской Республике и Румынии [2].

В 2018 году Министерство сельского хозяйства Китая (MARA) зафиксировало вспышку АЧС в 31 провинциях (Zhou X. et al., 2018). В 2019 году были зарегистрированы вспышки в Монголии и Вьетнаме, Филлипинах, Лаосской Народно-Демократической республике. По данным Food and Agriculture Organization of the United Nations вспышки АЧС отмечены в феврале 2020 года в Камбоджи, Мьянме, Индонезии (http://www.fao.org/ag/againfo/programmes/ en/ empres/ASF/situation_update.htm).

Геном вируса АЧС представлен двуцепочечной линейной молекулой ДНК, содержащей 170-190 тыс. п.н., кодирующий более 100 белков [15, 110]. Из всех известных белков вируса АЧС гликопротеины р54 и CD2v, расположенные на поверхности вирусной частицы являются наиболее вариабельными. Белок CD2v обусловливает гемадсорбирующие свойства вируса и кодируется геном EP402R [120]. Было показано, что белок CD2 играет важную физиологическую роль в облегчении адгезии между Т-клетками и антиген-презентирующими клетками (АПК) путем специфического взаимодействия с LFA-3 (lymphocyte function-associated antigen - 3), тем самым способствуя распознаванию Т-клетками чужеродных антигенов, представленных основным комплексом гистосовместимости на АПК SLA [81]. Блокирование этого взаимодействия CD2-

LFA3 свободным лигандом, анти-CD2-антителами или растворимым CD2 приводило к ингибированию различных функций Т-клеток [19].

Изоляты вируса АЧС представлены поликлональными популяциями, различающимися по вирулентности, гемадсорбирующим и антигенным свойствам, что свидетельствует о его антигенной вариабельности [3, 4]. Многообразие генетических вариантов вируса АЧС является одной из причин отсутствия эффективных вакцин против данной болезни и, обеспечивают уклонение от защитных систем организма [37, 61].

Один из современных подходов в создании эффективных вакцин, приводящих к индукции клеточного иммунитета, был реализован при получении химерного белка, состоящего из Fc-домена [73, 122].

Технология Fc- слияния успешно была применена для борьбы против ряда инфекционных заболеваний, вирусной и бактериальной этиологии [82]. Например, таких как вирус иммунодефицита человека [30], вирус Эбола [71], вирус лихорадки Денге [68], вирус гриппа [64], Mycobacterium tuberculosis [79], вирус классической чумы свиней [75].

Основываясь на результатах исследований ученых, можно сказать, что технология Fc-слияния для презентации антигенов вируса АЧС ранее не применялась и является перспективным подходом для разработки кандидатной вакцины против АЧС.

Степень разработанности проблемы

На протяжении многих лет исследовательские группы всего мира усиленно работают над созданием вакцины против АЧС. Однако поиск протективного белка вируса АЧС остается открытым. Отмечено, что белок CD2v, обладает гемадсорбирующей активностью и демонстрирует определенный протективный потенциал [5], рассматривается как наиболее перспективный антиген для создания кандидатной вакцины против АЧС [112].

Fc-химерные последовательности — это гибридные последовательности, в которых Fc-фрагмент IgG (Fc-IgG) и целевой терапевтический белок или антиген

представляют собой единый белковый продукт, полученный на основе генных конструкций [1]. При разработке рекомбинантного белка на основе Fc- слияния, в качестве кандидата в вакцины против вирусов классической чумы свиней (КЧС), полученной в бакуловирусной системе, было показано, что внутримышечная, внутрибрюшинная или интраназальная вакцинация рекомбинантными бакуловирусами, вызывает стойкий гуморальный и клеточный иммунный ответ против вируса КЧС [101]. Высокие титры КЧС-специфических и нейтрализующих антител, а также повышенные уровни секреции ^N-7 указывают на то, что рекомбинантный бакуловирус эффективно доставляет экзогенный антиген в клетки свиней [75].

В качестве протективных антигенов могут выступать структурные, капсидные, гликопротеины, а также протеины, отвечающие за гемадсорбирующие свойства вируса, в нашем случае белок CD2v вируса АЧС. Иммунизация свиней очищенными рекомбинантными белками вируса АЧС позволяет эффективно включать механизмы клеточного и гуморального иммунитета.

Цель и задачи исследования

Целью исследования является функциональная характеристика гликопротеина CD2v вируса АЧС, слитого с Fc-фрагментом свиного IgG 1 изотипа.

Для достижения поставленной цели необходимо было выполнить следующие задачи:

1. Идентифицировать Т- и В- клеточных эпитопов в первичной последовательности белка CD2v штаммов и изолятов вируса АЧС.

2. Создать генно-инженерные конструкции, экспрессирующие химерные белки CD2v, содержащие Fc- фрагменты свиного IgG 1 изотипа на N и С-конце белковой молекулы.

3. Получить рекомбинантные химерные белки CD2v вируса АЧС, слитые с Fc фрагментом свиного IgG 1 изотипа в эукариотической системе экспрессии.

4. Дать физико-химическую характеристику химерных молекул Fc-CD2v и CD2v-Fc.

5. Провести тестирование химерных молекулы Fc-CD2v и CD2v-Fc in

vitro:

- анализ пролиферации клеток PBMC;

- связывание с рецепторами FcgRI и FcRn;

- индукция интерферона - у клетками PBMC.

Научная новизна работы

Впервые получены химерные молекулы антигена CD2v вируса АЧС (штамм «Ставрополь 01/08»), слитые с Fc-доменом свиного IgG 1 изотипа, которые являются аутентичными по отношению к исходным молекулам.

Впервые получены стабильные клеточные линии «CHO-CD2-Fo> и «CHO-Fс-CD2», экспрессирующие химерные рекомбинантные молекулы Fc-CD2v и CD2v-Fc, которые обладают Fc-опосредованной активностью, пролиферирующими свойствами и вызывают выброс интерферона-у

Теоретическая и практическая значимость исследования

Создание химерного антигена CD2v, отвечающего за серотиповую специфичность вируса АЧС, с помощью технологии Fc-слияния позволит изучить характеристики и тонкие механизмы действия иммуномодулирующих белков, а также будет способствовать развитию стратегии для создания кандидатов вакцин против вируса АЧС.

Сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие внеклеточный, растворимый домен белка CD2v (штамм Ставрополь), слитый с Fc-фрагментом свиного IgG 1 изотипа, расположенные на N- и C- концах молекулы CD2v.

Получены клеточные линии «CHO-CD2-Fo> и «CHO-Fс-CD2», стабильно экспрессирующие химерные рекомбинантные молекулы Fc-CD2v и CD2v-Fc вируса АЧС (штамм Ставрополь) и изучены такие характеристики, как, жизнеспособность, скорость роста и продуктивность клеточных линий.

Химерные молекулы CD2v обладают Fc-опосредованной функцией связываться с Fc-y рецепторами (FcyR1 и FcRn) в наномолярном диапазоне, что способствует активации иммунных клеток и выбросу цитокинов, таких как интереферон-у, а также увеличению периода полувыведения за счет взаимодействия с неонатальным рецептором - FcRn.

Разработанный подход слияния свиного Fc-домена и схема получения химерных молекул CD2v-Fc с вирусными антигенами, может быть применена для антигенов других инфекций свиней.

Методология и методы исследования

Методология проведенных исследований включает: биоинформатические методы; вирусологические; молекулярно - биологические; клеточной биологии, физико-химические.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Участок с 17 по 204 аминокислоту первичной последовательности белка CD2v вируса АЧС содержит клеточные эпитопы (4 В - и 5 Т- клеточных эпитопов).

2. Сознанные генетические конструкции pFc-CD2v и pCD2v-Fc, на основе плазмидного вектора рСМУ (Addgene).

3. Полученные стабильные клеточные линии «CHO-Fc-CD2v» и «СНО-CD2v-Fc», экспрессирующие химерные рекомбинантные белки Fc-CD2v и CD2v-Fc, которые на протяжении 10 пассажей показывают сохранение ростовых свойств культуры и постоянный уровень продуктивности целевых молекул.

4. Рекомбинантные химерные белки Fc-CD2v и CD2v-Fc обладают Fc-опосредованной активностью, пролиферирующими свойствами и вызывают выброс интерферона-у.

Личный вклад соискателя

Исследования по теме диссертационной работы (планирование и выполнение основных работ экспериментов, обобщение полученных результатов) проведены соискателем самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали: к.б.н., К.А. Мима, к.б.н. И.А. Титов, к.б.н. Бурмакина Г.С.

Степень достоверности и апробации результатов

Степень достоверности результатов проведенных экспериментов подтверждена статистическими обработкой полученных результатов.

Апробация диссертации состоялась 26 июня 2020 г на заседании межлабораторного совета научного сектора ФГБУ ФИЦВим, согласно выписке из протокола №1 от 29.06.2020 г.

Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на XIX Всероссийской молодежной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» 15-16 апреля 2019 года, г. Москва, Россия; 13-м Ежегодном собрании ЕРКОКЕ 26-28 августа 2019 года, г. Берлин, Германия; X Международной научно-практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения», 24 июня, 2020 года, г. Ульяновск, Россия.

Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 6 научных работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ при публикации основных научных результатов диссертаций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы, методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения,

список сокращений, список использованной литературы, включающий 126 источника, из которых 121 - иностранные. Диссертация иллюстрирована 47 рисунками и 21 таблицей. В приложении представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Общие сведения о вирусе АЧС

Африканская чума свиней - это вирусное заболевание свиней, которое приводит к высокой смертности среди домашних свиней, в то же время протекает бессимптомно у естественных хозяев диких кабанов [9]. Это приводит к значительным экономическим потерям, которые неизбежны при отсутствии эффективной вакцины, а доступными методами борьбы с болезнями являются карантин пострадавшего района и убой инфицированных животных [94].

Вирус АЧС является двухцепочечным ДНК-вирусом со сложной молекулярной структурой. Это единственный член семейства Asfarviridae и единственный ДНК-вирус, передающийся членистоногими, мягкими клещами рода Ornithodoros. Мягкие клещи (Omithodoros moubata) участвуют в лесном цикле передачи вируса в Африке и О. егсайсш в Европе [70].

Заболевание, вызванное этим вирусом, было впервые выявлено в Кении в 1920-х годах [47]. Некоторое время ограничивалось Африкой, пока не распространился в Европу в середине прошлого века, а затем в Южную Америку и Карибский бассейн. Болезнь была ликвидирована в Европе (за исключением Сардинии) в 1990-х годах, с помощью радикальных программ борьбы и искоренения. Однако в 2007 году болезнь снова распространилась из Африки на Кавказ, особенно в Грузию, а в 2014 году она достигла восточной территории Европейского Союза [93, 121].

В настоящее время АЧС присутствует в Закавказье, некоторых областях Российской Федерации и соседних странах, включая Украину, Польшу, Латвию, Литву, Эстонию и Молдову, а также, в последнее время была зарегистрирована в Чешской Республике и Румынии (рисунок 1). Вспышки среди домашних свиней также произошли на востоке Российской Федерации, в том числе в районах, близких к монгольским границам [93].

Рисунок 1 - Эпизоотическая ситуация по АЧС в РФ, странах Европы и

Азии, 2007-2020 г.г. (по данным МЭБ и срочных сообщений ветслужб

субъектов РФ)

В 2018 году Министерство сельского хозяйства и сельского хозяйства Китая (MARA) подтвердило свою первую вспышку африканской чумы свиней в провинции Ляонин, а также еще в 31 провинциях Китая. 23 апреля 2019 года Министерство сообщило, что 1 020 000 свиней были выбракованы, чтобы остановить дальнейшее распространение [125].

15 января 2019 года было зарегистрировано 11 вспышек в 6 провинциях Монголии (Улан-Баторе), в которых участвовало 105 свиноферм и домохозяйств. Более 3115 свиней, это больше 10% от общей популяции свиней Монголии, погибли или были уничтожены в результате вспышек АЧС.

Во Вьетнаме 19 февраля 2019 года также сообщили о вспышках АЧС, в общей сложности в 24 провинциях.

В Камбодже Министерство сельского, лесного и рыбного хозяйства подтвердило первую вспышку АЧС 2 апреля 2019 года по данным

Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединенных Наций (http://www.fao. org/ag/ againfo/programmes/en/ empres/ASF/situation_update.html).

Трансграничное распространение вируса АЧС происходит в результате незаконных перемещений зараженных свиней, ввоза свинины или продуктов из свинины, зараженных АЧС [119]. Несмотря на то, что эти факторы риска остаются основными причинами распространения АЧС на большие расстояния [104, 125], локальное распространение инфекции может происходить путем перемещения зараженного дикого кабана, находящегося на свободе, а также через естественно сформировавшиеся ландшафты, что делает вирус эндемичным для популяций дикого кабана в Европейском Союзе [40, 89].

АЧС встречается в нескольких клинических формах, которые могут варьироваться от сверхострой до хронической. Клинические проявления зависят от вирулентности изолята, хозяина, дозы и путей заражения. Инкубационный период колеблется от 3 до 19 дней [16]. Клинические признаки и поражения включают застойные, геморрагические изменения, такие как кровоизлияние, отек, асцит, а также функциональные расстройства пищеварительной и дыхательной систем [110]. Диапазон смертности варьируется от 10 до 100%, в зависимости от вирулентности изолята. Штаммы АЧС II генотипа, ответственные за евразийские вспышки, обладают высокой вирулентностью и вызывают острую клиническую форму, связанную с почти 100% смертностью у домашних свиней и дикого кабана [21, 48, 54, 59]. Есть данные, что умеренно вирулентный штамм АЧС циркулирует в Европе [51, 124].

Из-за отсутствия вакцин с защитной эффективностью, АЧС представляет серьезную угрозу для всех европейских стран. Эпидемиологическая сложность АЧС была четко продемонстрирована в восточной и южной частях Африки. После генетической характеристики которого, основанной на вариабельной последовательности в C-терминальной области гена B646L, кодирующего основной капсидный белок p72, выявили наличие 22 генотипов [18, 25]. Недавно был описан новый генотип 23, который имеет много общего с генотипами 9 и 10,

включающие изоляты, циркулирующие в странах Восточной Африки и Республике Конго[7].

2.2. Строение вируса АЧС

Вирус АЧС представляет собой оболочечный ДНК - вирус, длина его генома составляет от 170 до 193 т.п.н. [34]. Закодированные гены близко расположены в геноме, однако кодированная ориентация соседних генов в некоторых геномных областях одинакова [46]. Вирус АЧС имеет сходство с поксвирусом и иридовирусом, поскольку все они являются цитоплазматическими ДНК-вирусами [82]. Сначала был полностью секвенирован испанский изолят BA71V, который был хорошо приспособлен для роста в клетках культуры ткани. До настоящего времени было определено 11 полных последовательностей генома АЧС, и количество открытых рамок считывания (ORF - open reading frame) различается в зависимости от изолята. Геном АЧС кодирует от 151 до 167 ORF. Среди них 110 ORF высоко консервативны в 11 изолятах [42]. Крупные частицы вируса АЧС имеют диаметр от 170 до 190 нм и состоят из сложных многослойных структур которые имеют округлую или икосаидрическую форму [107]. Кодируемые структурные белки участвуют в репликации генома и вирусной инфекции [46]. Результаты некоторых исследований показали, что более 50 белков упакованы в вирионы и участвуют при вирусной инфекции, такие как: pp220, pp62, p72, p54, p30, CD2v, p10, p12, p14.5 и p17. Белки p54 и p30 являются очень важными антигенными структурными белками. Белок p72 важен для формирования вирусного капсида на более поздней стадии вирусной инфекции. CD2v является гликопротеином, который может вызывать адсорбцию эритроцитов вокруг инфицированных вирусом АЧС клеток и внеклеточных вирусных частиц. Исследователи обнаружили, что белок CD2v локализуется вокруг вирусных фабрик во время инфекции АЧС [88].

Таким образом, все выше перечисленные белки могут быть использованы в качестве целей исследования для анализа механизма инфекции вируса АЧС[102].

2.3. Структура и состав частиц вируса африканской чумы свиней

Частица вируса АЧС имеет икосаэдрическую морфологию со средним диаметром 200 нм и состоит из нескольких концентрических доменов: внутреннее ядро, образованное центральным геном - содержащий нуклеоид, покрытый толстым белковым слоем, который является оболочкой ядра; внутренняя липидная оболочка, окружающая ядро и капсид, который является самым внешним слоем внутриклеточных вирионов (рисунок 2А) [12, 32]. Внеклеточные вирионы обладают внешней оболочкой, приобретенной зародышем от плазматической мембраны (рис. 2В) [26].

Двумерный анализ очищенного внеклеточного вируса выявил 54 структурных белка с молекулярной массой в диапазоне от 10000 до 150000 [45]. Вирионы также содержат транскрипционный механизм для синтеза, кэппирования и полиаденилирования ранней РНК [106]. Известно, что 19 генов кодируют структурные белки [122], и была идентифицирована локализация некоторых из этих белков в различных доменах вирусной частицы, как описано на рисунке 2С

Рисунок 1 - Структура и белковый состав вируса АЧС. Электронные микрофотографии внутриклеточной полной частицы вируса АЧС (A) и внеклеточного зрелого вириона вируса АЧС (B). Указаны различные структурные домены: внешняя оболочка (oe), капсид (ca), внутренняя оболочка ^е), оболочка ядра (cs) и нуклеоид (nu). Бары, 50 нм. Рисунок C иллюстрирует локализацию различных структурных белков вируса АЧС

[26]

Внешняя оболочка. Морфология наружной оболочки внеклеточного вируса аналогична «мембранной части», характерной для плазматической мембраны, во время процесса выхода вируса из клетки [26]. За прикрепление вируса отвечает белок р12, который локализуется на внешней оболочке [31]. Другим вирусным белком, который предположительно локализуется во внешней оболочке, является вирусный гомолог клеточного CD2 (pE402R), который опосредует гемадсорбцию инфицированных клеток [103]. Клеточный белок, обозначенный p24 [111], присутствует в плазматической мембране и внедряется в частицы вируса.

Капсид. Структура капсида была детально изучена с помощью различных методов электронной микроскопии, которая показала, что он образован примерно 2000 капсомерами, который внешне похожи на гексагональные призмы длиной 13 нм, шириной 5-6 нм и углублением по середине. Межкапсомерное расстояние составляет 7,4 нм. Протеин р72, кодируемый геном B646L, является основным компонентом капсомеров [52] и составляет около трети массы белка вирусной частицы.

Белок р72 -капсидный белок, который имеет сходство с основным капсидным белком pE120R и участвует в транспорте зрелых частиц вируса АЧС с фабрики на плазматическую мембрану для выхода из клетки [44].

Внутренняя оболочка. Внутренняя оболочка зрелой вирусной частицы выглядит как единая липидная мембрана при визуализации обычными методами электронной микроскопии [10] и современной криотехникой [60]. Морфологические и иммуноцитохимические данные показывают, что внутренняя оболочка происходит из эндоплазматического ретикулума [10] через механизм, который в настоящее время недостаточно изучен. Мембранные белки р54, р17 и pE248R являются составляющим звеном этого домена.

Интересно, что белок прикрепления к вирусу р12, который первоначально находится во внешней вирусной оболочке [31], также является компонентом внутренней оболочки. Иммунофлуоресцентная микроскопия АЧС-инфицированных клеток на поздних периодах после инфицирования показывает, что р12 локализуется на перинуклеарных вирусных фабриках, а также в вирусных частицах, распространяющихся по цитоплазме и клеточной поверхности. Такое субклеточное распределение почти идентично распределению, наблюдаемому для белка внутренней оболочки р17, но явно отличается от распределения клеточного белка р24, который локализуется на плазматической мембране. Кроме того, иммуноэлектронная микроскопия оттаявших криосрезов инфицированных клеток показывает, что р12 связан с предшественниками вирусной мембраны, собирая частицы и внутриклеточные зрелые вирусы. В отличие от вышеописанного, белок р24 обнаруживается на плазматической мембране и, по-видимому,

концентрируется в тех местах, где зарождаются частицы вируса АЧС, что свидетельствует о селективном рекрутировании этого клеточного белка зародышевой частицей. Соответственно, р24 обнаруживается во внешней оболочке внеклеточных вирионов после предварительного встраивания иммунолабильности. В целом, эти результаты указывают на то, что трансмембранный белок р12 расположен во внутренней оболочке структуры вируса АЧС, где он может играть морфогенетическую роль.

Ядро оболочки. Оболочка ядра состоит из толстого слоя белка размером около 30 нм, и является независимым доменом ядра вируса, который охватывает центральный нуклеоид [11]. Этот домен в основном состоит из продуктов переработки полипротеинов рр220 и рр62. Было показано, что белок pS273R, который также является компонентом оболочки ядра, верно обрабатывает полипротеины вируса в анализах с использованием трансфецированных клеток, экстрактов из трансфецированных клеток или рекомбинантного очищенного фермента pS273R [105]. Процессинг полипротеина происходит упорядоченной последовательностью протеолитических расщеплений по мотивам Gly-Gly-X, в результате чего образуются шесть основных компонентов оболочки ядра: белки р150, р37, р34 и р14, полученные из полипротеина рр220 и белки р35 и р15, продукты рр62 [11].Все эти продукты присутствуют в эквимолекулярных количествах в частице зрелого вируса и в совокупности составляют 32% от общей массы вириона. Этот механизм экспрессии генов уникален среди ДНК-вирусов и отражает необходимость поддерживать упорядоченное расположение этих структурных белков в зрелых вирионах.

Нуклеоид. Нуклеоид представляет собой плотную структуру длиной 80 нм, содержащую вирусный геном [12] и нуклеопротеины, такие как ДНК-связывающий белок р10 и белок pA104R. Предполагается, что нуклеоид также содержит транскрипционный механизм для синтеза и модификации ранних РНК, который включает мультисубъединичную РНК-полимеразу, поли-А-полимеразу, ферменты и факторы ранней транскрипции [106].

2.4. Механизмы репродукции вируса АЧС

Инфекционный цикл АЧС начинается с вирусной адсорбции и проникновения в клетку-хозяина. Ранние исследования по проникновению вируса АЧС характеризовали это событие как процесс, зависящий от низкого pH и температуры, что соответствует специфическим рецептор-опосредованным эндоцитозом в клетках Vero и свиных макрофагах [8].

Однако рецептор(ы) для вируса все еще остаются неизвестными. Ограниченный клеточный тропизм АЧС позволяет предположить, что для инфекции необходим специфический для макрофагов рецептор.

Успешное заражение свиных макрофагов и моноцитов АЧС коррелирует с экспрессией рецептора «мусорщика» CD163, отличительной чертой созревания макрофагов. Ранее предполагалось, что это потенциальный вирусный рецептор, поскольку моноклональные антитела против этой молекулы способны блокировать инфекцию первичных альвеолярных макрофагов [109].

Однако, более поздние исследования показали, что CD163 не является необходимым рецептором для заражения изолятами вируса Georgia 2007/1. У свиней с полным нокаутом белка CD163, полученного с использованием системы CRISPR/Cas9, не было выявлено различий в клинических признаках, смертности, патологии или виремии [95].

Одним из выводов этих исследований было то, что CD163 может быть необходим, но недостаточен для инфекционности.

Хотя существует поддержка рецептор-зависимых механизмов проникновения вируса, таких как клатрин-опосредованный динамин-зависимый эндоцитоз [49], также имеются доказательства того, что вирус АЧС использует другие механизмы, такие как фагоцитоз [17] и макропиноцитоз (рисунок 3) [62]. Также холестерин необходим для успешного проникновения в клетку. Эти механизмы встречаются как в клетках-мишенях макрофагов, так и в клетках Vero с использованием вирусных изолятов, адаптированных к этой клеточной линии.

Кроме того, некоторые белки вируса АЧС вовлечены в механизм проникновения, такой как p30, важный для процесса перемещения веществ внутрь

клетки, в то время как другие белки, такие как р12 и р54, были идентифицированы как потенциальные белки прикрепления вирусных частиц к поверхности клетки-хозяина [57].

Рисунок 2 - Проникновение вируса АЧС в клетку [61]

АЧС проникает в клетку-хозяина через сложный процесс, опосредованный динамином и клатрином путем эндоцитоза и макропиноцитоза. Спустя всего несколько секунд вирус АЧС проходит по эндоцитарному пути и достигает зрелых эндосомальных компартментов, где происходит декапсидирование вируса и слияние внутренней вирусной оболочки с эндосомальной мембраной. Вновь синтезированные вирионы собираются на вирусной фабрике и покидают клетку либо путем экзоцитоза, слияния везикул в цитоплазме (аутофагия), на плазматической мембране, либо через образование апоптотических тел [50].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Каторкина Елена Ивановна, 2020 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Стратегии модуляции фармакокинетики рекомбинантных терапевтических белков/ Е.А. Звонова // Успехи современной биологии. - 2017. - Т. 137, № 4. - C. 398-419.

2. Вирус Африканской чумы свиней: использование генетических маркеров при анализе путей его распространения/ А. Мазлум, А.С. Иголкин, Н.Н. Власова, Д. В. Роменская// ветеринария сегодня. - 2019. - Т.30, №3. - С. 3-14.

3. Иммунологически значимые гликопротеины p54 и CD2v вируса африканской чумы свиней: биоинформатический анализ генетических вариаций и гетерогенности/ К.А. Мима, Г.С. Бурмакина, И.А. Титов [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2015. - Т. 50, № 6. - С. 785-793.

4. Белки вируса африканской чумы свиней/ А.Д. Середа, Д.В. Колбасов // Научный журнал КубГАУ. - 2012. - №77. - С. 21-37.

5. Механизмы иммунной защиты и перспективы создания днк-вакцин против африканской чумы свиней/ А.Д. Середа, А.Р. Иматдинов, О.А. Дубровская [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2017. - Т. 52, № 6. - C. 1069-1082.

6. Deletion of virulence associated genes from attenuated African swine fever virus isolate OUR T88/3 decreases its ability to protect against challenge with virulent virus/ C. C. Abrams, L. Goatley, E. Fishbourne [et al.] // Virology. - 2013. - Vol.433, № 1. - P. 99-105.

7. Identification of a New Genotype of African Swine Fever Virus in Domestic Pigs from Ethiopia / J. E. Achenbach, E. Gelaye, T.R. Chibssa [et al.]// Transboundary and Emerging Diseases. - 2017. - Vol.64, № 5.- P. 1393-1404.

8. Interaction of African swine fever virus with macrophages/ A. Alcamí, A. L. Carrascosa, E. Viñuela // Virus Research. - 1990. - Vol.17, № 2. - P. 93-104.

9. African swine fever virus infection of the bushpig (Potamochoerus porcus) and its significance in the epidemiology of the disease / E.C. Anderson, G.H. Hutchings, N. Mukarati [et al.] // Veterinary Microbiology. - 1998. - Vol. 62, № 1. - P. 1-15.

10. African swine fever virus is enveloped by a two-membraned collapsed cisterna derived from the endoplasmic reticulum / G. Andrés, G. Ramón, S. Carmen [et al.] // Journal of Virology. - 1998. Vol.72, № 11. - P. 8988-9001.

11. African swine fever virus polyproteins pp220 and pp62 assemble into the core shell/ G. Andrés, A. Alejo, J. Salas, [et al.]// Journal of Virology. - 2002. Vol.76, № 24. - P. 12473-12482.

12. Simón-Mateo C., Viñuela E. Assembly of African swine fever virus: role of polyprotein pp220/ G. Andrés, C. Simón-Mateo, E. Viñuela // Journal of Virology. - 1997. Vol.71, № 3. - P. 2331-2341.

13. Enhancing DNA immunization by targeting ASFV antigens to SLA-II bearing cells/ J. M. Argilaguet, E. Pérez-Martín, C. Gallardo [et al] // Vaccine. - 2011. - Vol.29, № 33.

- P. 5379-5385.

14. DNA vaccination partially protects against African Swine Fever virus lethal challenge in the absence of antibodies/ J. M. Argilaguet, E. Pérez-Martín, M. Nofrarías, [et al.] // PLoS ONE. - 2012.- Vol.7, № 9. - e40942.

15. Approaches and perspectives for development of African Swine Fever virus vaccines/ M. Arias, A. De La Torre, C. Gallardo [et al.]// Vaccines. - 2017. - Vol.5, № 4.

16. Gaps in African swine fever: Analysis and priorities/ M. Arias, C. Jurado, C. Gallardo [et al.]// Transboundary and Emerging Diseases. - 2018. - Vol.65. - P. 235-247.

17. Cellular processes essential for African swine fever virus to infect and replicate in primary macrophages/ S. Basta, H. Gerber A., Schaub [et al.]. // Veterinary Microbiology.

- 2010. - Vol. 140, № 1-2. - P. 9-17.

18. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation/ A. D. S. Bastos, M.-L. Penrith, C. Cruciére [et al.] // Archives of Virology. - 2003. - Vol. 148, № 4. - P. 693-706.

19. CD2 Immunobiology/ C. Binder, F. Cvetkovski, F. Sellberg [et al.]// Frontiers in Immunology. - 2020. - Vol. 11, № JUN. - P. 1090.

20. Modern adjuvants do not enhance the efficacy of an inactivated African swine fever virus vaccine preparation/ S. Blome, C. Gabriel, M. Beer// Vaccine. - 2014. - Vol. 32, № 31. - P. 3879-3882.

21. High virulence of African Swine Fever virus vaucasus isolate in European Wild Boars of all ages/ S. Blome, C. Gabriel, A. Breithaupt [et al.]// Emerging Infectious Diseases journa. - 2012.- Vol. 18, № 4. - P. 708.

22. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal/ F. S. Boinas, G. H. Hutchings, L. K. Dixon and P. J. Wilkinson// Journal of General Virology. - 2004. - Vol.85, № 8. - P. 2177-2187.

23. Deletion of a CD2-Like Gene, 8-DR, from African Swine Fever Virus Affects Viral Infection in Domestic Swine/ M. V. Borca, C. Carrillo, L. Zsak// Journal of Virology. -1998. - Vol.4, №72. - P. 2881-2889.

24. The Ep152R ORF of African swine fever virus strain Georgia encodes for an essential gene that interacts with host protein BAG6/ M. V. Borca, V. O'Donnell, L. G. Holinka [et al.]// Virus Research. - 2016. - Vol. 223. - P. 181-189.

25. Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973-1999)/ C. I. Boshoff, A. D. S. Bastos, L. J. Gerber, W. Vosloo // Veterinary Microbiology. - 2007. - Vol.121, № 1-2. - P. 45-55.

26. Electron microscope observations of African swine fever virus in tissue culture cells/ S. S. Breese, C. J. DeBoer // Virology. - 1966. - Vol.28, № 3 (28). - P. 420-428.

27. Development of an epitope conservancy analysis tool to facilitate the design of epitope-based diagnostics and vaccines/ H. Bui, J. Sidney, W. Li, [et al.]// BMC Bioinformatics. - 2007. - Vol.8, № 1. - P. 361.

28. African swine fever virus serotype-specific proteins are significant protective antigens for African swine fever/ G. Burmakina, A. Malogolovkin, E. R. Tulman [et al.] // The Journal of General Virology. - 2016. - Vol.97, № 7. - P. 1670-1675.

29. Identification of T-cell epitopes in African swine fever virus CD2v and C-type lectin proteins/ G. Burmakina, A. Malogolovkin, E. R. Tulman //Journal of General Virology. -2019. - Vol.100, № 2. - P. 259-265.

30. Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy/ D. J. Capon, S.M. Chamow, J. Mordenti [et al]// Nature. - 1989. - Vol.339. - P.525-531.

31. Localization of the African Swine Fever Virus Attachment Protein P12 in the Virus Particle by Immunoelectron Microscopy/ A. L. Carrascosa, I. Saastre, P. González, E. Viñuela// Virology. - 1993. - Vol.193, № 1. - P. 460-465.

32. General morphology and capsid fine structure of African swine fever virus particles // J. L. Carrascosa, J. M. Carazo, A. L. Carrascosa [et al.]// Virology. - 1984. - Vol. 132, № 1. - P. 160-172.

33. Prediction of linear B-cell epitopes using amino acid pair antigenicity scale/ J. Chen, H. Liu, J. Yang, K-C. Chou // Amino Acids. - 2007. - Vol.33, № 3 (33). - P. 423-428.

34. Recombinant Newcastle disease virus expressing African swine fever virus protein 72 is safe and immunogenic in mice/ X. Chen, J. Yang, Y. JI, [et al.]// Virologica Sinica. - 2016. Vol.31, № 2. - P. 150-159.

35. Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality/ X. Chen, J. Zaro, W.-C. Shen //Advanced drug delivery reviews. - 2013. - Vol. 65, № 10. - P. 1357-1369.

36. Recombinant therapeutic monoclonal antibodies: Mechanisms of action in relation to structural and functional duality/ N. Congy-Jolivet, Al. Probst, H. Watier, G. Thibault// Critical Reviews in Oncology/Hematology. - 2007. - Vol.64, № 3. - P. 226233.

37. Identification and utility of innate immune system evasion mechanisms of ASFV/ S. Correia, S. Ventura, R. M. Parkhouse// Virus Research. - 2013. - Vol.173, Issue 1. - P. 87-100.

38. Half-lives of immunoglobulins IgG, IgA and IgM in the serum of new-born pigs/ J. Curtis, F. J. Bourne // Immunology. - 1973. - Vol.24, № 1 (24). - P.147-155.

39. Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives/ D.M. Czajkowsky, Z. Shao, J. Hu, R.J. Pleass // EMBO Molecular Medicine. - 2012. - Vol.4, № 10. P. 10151028.

40. Assessing the Risk of African Swine Fever Introduction into the European Union by Wild Boar/ A. De la Torre, J. Bosch, I. Iglesias, [et al.]// Transboundary and Emerging Diseases. - 2015. - Vol.62, № 3. - P. 272-279.

41. A novel TLR3 inhibitor encoded by African swine fever virus (ASFV)/ V. L. de Oliveira, S. C. P. Almeida, H. R. Soares// Archives of Virology. - 2011. Vol.156, Issue 4. - P. 597-609.

42. Phylogenomic analysis of 11 complete African swine fever virus genome sequences/ E. P. de Villiersa, C. Gallardob, M. Arias [et al.]// Virology. - 2010. Vol.400, №1. - P. 128-136.

43. Monomeric Fc fusions: impact on pharmacokinetic and biological activity of protein therapeutics/ J. A. Dumont, S. C. Low, R. T. Peters, A. J. Bitonti// BioDrugs: clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy. - 2006. - Vol.20, № 3. - P. 151-160.

44. Generation of filamentous instead of icosahedral particles by repression of African swine fever virus structural protein pB438L/ C. Epifano, J. Krijnse-Locker, M. L. Salas [et al.]// Journal of Virology. - 2006. - Vol.80, № 23. - P. 11456-11466.

45. Two-dimensional analysis of african swine fever virus proteins and proteins induced in infected cells/ A. Esteves, M. I. Marques, J. V. Costa// Virology. - 1986. - Vol. 152, № 1. - P. 192-206.

46. Nuclear Export of African Swine Fever Virus p37 Protein Occurs through Two Distinct Pathways and Is Mediated by Three Independent Signals/ A. Eulalio, I. Nunes-Correia, A. Carvalho// Journal of Virology. - 2006. - Vol. 80, № 3. - P. 1393-1404.

47. On A Form of Swine Fever Occurring in British East Africa (Kenya Colony)/ R. Eustace Montgomery// Journal of Comparative Pathology and Therapeutics. - 1921. -Vol. 34. - P. 159-191.

48. Characterization of African Swine Fever Virus Caucasus Isolate in European Wild Boars/ C. Gabriel, S. Blome, A. Malogolovkin [et al.]// Emerging Infectious Diseases journal. - 2011. -Vol. 17, № 12. - P.2342-2345.

49. African swine fever virus infects macrophages, the natural host cells, via clathrin- and cholesterol-dependent endocytosis/ I. Galindo, M. A. Cuesta-Geijo, K. Hlavova // Virus Research. - 2015. Vol.200. - P. 45-55.

50. African Swine Fever Virus: A Review/ I. Galindo, C. Alonso// Viruses. - 2017. - Vol. 9, № 5. - P. 1-10.

51. Evolution in Europe of African swine fever genotype II viruses from highly to moderately virulent/ C. Gallardo, I. Nurmoja, A. Soler [et al]// Veterinary Microbiology.

- 2018. Vol. 219. - P. 70-79.

52. Inducible Gene Expression from African Swine Fever Virus Recombinants: Analysis of the Major Capsid Protein p72/ R. Garcia-Escudero, G. Andres, F. Almazan, E. Vinuela// Journal of Virology. - 1998. - Vol.72, № 4. - P. 3185-3195.

53. Subunit Vaccine Approaches for African Swine Fever Virus/ N. Gaudreault, J. A. Richt // Vaccines. - 2019. - Vol. 7, № 2. - P. 56.

54. Molecular Characterization of African Swine Fever Virus, China, 2018/ S. Ge, J. Li, X. Fan [et al.]// Emerging Infectious Diseases journal. - 2018. - Vol. 24, № 11. - P. 21312133.

55. Binding capacity differences for antibodies and Fc-fusion proteins on protein A chromatographic materials/ S. Ghose, B. Hubbard, S. M. Cramer// Biotechnology and Bioengineering. - 2007. - Vol. 96, № 4. - P. 768-779.

56. Sensitivity of African swine fever virus to type I interferon is linked to genes within multigene families 360 and 505/ J. P. Golding, L. Goatley, S. Goodbourn [et al.]// Virology. - 2016. - Vol. 493. - P. 154-161.

57. The African swine fever virus proteins p54 and p30 are involved in two distinct steps of virus attachment and both contribute to the antibody-mediated protective immune response/ P. Gomez-Puertas, F. Rodriguez, J. M. Oviedo [et al]// Virology. - 1998. - Vol. 243, № 2. - P. 461-471.

58. Molecular immunobiology of macrophages: recent progress/ S. Gordona, S. Clarkea, D. Greavesa, A. Doyle// Current Opinion in Immunology. - 1995. - Vol. 7, Issue 1. -P. 24-33.

59. Transmission routes of African swine fever virus to domestic pigs: current knowledge and future research directions/ C. Guinat, A. Gogin, S. Blome [et al.] // Veterinary Record.

- 2016. - Vol. 178, № 11. - P. 262-267.

60. The Envelope of Intracellular African Swine Fever Virus Is Composed of a Single Lipid Bilayer/ P. C. Hawes, C. L. Netherton, T. E. Wileman [et al.]// Journal of Virology.

- 2008. - Vol. 82, № 16. P. 7905-7912.

61. Modeling of the Toll-like receptor 3 and a putative Toll-like receptor 3 antagonist encoded by the African swine fever virus/ E. S. Henriques, R. M. M. Brito, H. Soares [et al.]// Protein Science. - 2011. - Vol. 20, № 2. - P. 247-255.

62. African Swine Fever Virus Undergoes Outer Envelope Disruption, Capsid Disassembly and Inner Envelope Fusion before Core Release from Multivesicular Endosomes/ B. Hernáez, M. Guerra, M. L. Salas, G. Andrés// PLoS pathogens. - 2016. -Vol. 12, № 4. - P. 1-32.

63. Mouse x pig chimeric antibodies expressed in Baculovirus retain the same properties of their parent antibodies/ A. M. Jar, F. A. Osorio, O. J. López// Biotechnology Progress. - 2009. - Vol. 25, № 2. - P. 516-523.

64. The Potential Role of Fc-Receptor Functions in the Development of a Universal Influenza Vaccine/ Jegaskanda S. // Vaccines. - 2018. - Vol.6, № 2. - P. 1-17.

65. The development of veterinary vaccines: a review of traditional methods and modern biotechnology approaches/ S. Jorge, O. A. Dellagostin// Biotechnology Research and Innovation. - 2017. - Vol. 1, № 1. - P. 6-13.

66. Computational vaccinology and epitope vaccine design by immunoinformatics/ K. Saeed, J. Abolfazl, B. Hojat [et al.]// Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. -2014. - Vol. 61, № 3. P. 285-307.

67. Role of Recombinant DNA Technology to Improve Life/ S. Khan, M. Wajid Ullah, R. Siddique [et al.]// International Journal of Genomics. - 2016. - Vol. 2016. - P. 1-14.

68. Plant-expressed Fc-fusion protein tetravalent dengue vaccine with inherent adjuvant properties/ M. Y. Kim, A. Copland, K. Nayak [et al.]// Plant Biotechnology Journal. -2018. Vol. 16. - P. 1283-1294.

69. Protection of European domestic pigs from virulent African isolates of African swine fever virus by experimental immunisation/ K. King, D. Chapman, J. M. Argilaguet [et al.] // Vaccine. - 2011. - Vol. 29, № 28. P. 4593-4600.

70. African swine fever virus replication in the midgut epithelium is required for infection of Ornithodoros ticks/ S. B. Kleiboeker, G. A. Scoles, T. G. Burrage, J. Sur // Journal of Virology. - 1999. - Vol. 73, № 10. - P. 8587-8598.

71. Ebola virus glycoprotein Fc fusion protein confers protection against lethal challenge in vaccinated mice/ K. Konduru, S. B. Bradfute, J. Jacques [et al.]// Vaccine. - 2011. -Vol. 29, № 16. - P. 2968-2977.

72. Expression Library Immunization Can Confer Protection against Lethal Challenge with African Swine Fever Virus/ A. Lacasta, M. Ballester, P. L. Monteagudo// Journal of Virology. - 2014. - Vol. 88, № 22. - P. 13322-13332.

73. Fc fusion as a platform technology: potential for modulating immunogenicity/ D. Levin, B. Golding, S. E. Strome [et al.]// Trends in Biotechnology. - 2015. - Vol. 33, № 1. - P. 27-34.

74. Inhibitory Fcy receptor engagement drives adjuvant and anti-tumor activities of agonistic CD40 antibodies/ F. Li, J. V. Ravetch // NIH Public Access. - 2011. - Vol. 333, № 6045. - P. 1030-1034.

75. Surface displaying of swine IgG1 Fc enhances baculovirus-vectored vaccine efficacy by facilitating viral complement escape and mammalian cell transduction/ Z. Liu, Y. Liu, Y. Zhang [et al.] // Veterinary Research. - 2017. - Vol. 48, № 1. - P. 1-29.

76. Induction of Robust Immune Responses in Swine by Using a Cocktail of Adenovirus-Vectored African Swine Fever Virus Antigens/ S. Lokhandwala, S. D. Waghela, J. Bray [et al.] // Clinical and Vaccine Immunology. - 2016. - Vol. 23, № 11 (23). - P. 888-900.

77. Safety and immunogenicity of mammalian cell derived and Modified Vaccinia Ankara vectored African swine fever subunit antigens in swine/ J. Lopera-Madrida, J. E. Osorioa, Y. Heb [et al.]// Veterinary Immunology and Immunopathology. - 2017. - Vol. 185. - P. 20-33.

78. Adjuvant-Free Immunization with Hemagglutinin-Fc Fusion Proteins as an Approach to Influenza Vaccines/ S. Loureiro, J. Ren, P. Phapugrangkul [et al.]// Journal of Virology. - 2011. - Vol. 85, № 6. - P. 3010-3014.

79. Antibody Fc Glycosylation Discriminates Between Latent and Active Tuberculosis/ L. L. Lu, J. Das, P. S. Grace [et al.]// The Journal of Infectious Diseases. - 2020. - P. 10.

80. Surface display of IgG Fc on baculovirus vectors enhances binding to antigen-presenting cells and cell lines expressing Fc receptors/ J. C. Martyn, A. J. Cardin, B. D. Wines [et al.]// Archives of Virology. - 2009. - Vol. 154, № 7. - P. 1129-1138.

81. A Subtle Role for Cd2 in T Cell Antigen Recognition/ P.A. Merwe // Journal of Experimental Medicine. - 1999. - Vol. 190, № 10. - P. 1371-1374.

82. Molecular characterization of African swine fever virus from domestic pigs in northern Tanzania during an outbreak in 2013/ G. Misinzo, D. E. Kwavi, C. D. Sikombe [et al] // Tropical Animal Health and Production. - 2014. - Vol. 46, № 7. - P. 1199-1207.

83. BA71ACD2: a New Recombinant Live Attenuated African Swine Fever Virus with Cross-Protective Capabilities/ P. L. Monteagudo, A. Lacasta, E. López [et al.]// Journal of Virology. - 2017. - Vol. 91, № 21. - P. 17.

84. Mort M., VACCINE SAFETY BASICS learning manual / M. Mort - Geneva. - World Health Organization. - 2013.

85. Immunization of African Indigenous Pigs with Attenuated Genotype I African Swine Fever Virus OURT88/3 Induces Protection Against Challenge with Virulent Strains of Genotype I/ L. K. Mulumba-Mfumu, L. C. Goatley, C. Saegerman [et al.]// Transboundary and Emerging Diseases. - 2016. - Vol. 63, № 5. - P. 323-327.

86. Recombinant vaccines and the development of new vaccine strategies/ I. P. Nascimento, L. C. C. Leite // Brazilian Journal of Medical and Biological Research. -2012. - Vol. 45, № 12. - P. 1102-1111.

87. Development trends for therapeutic antibody fragments/ A. L. Nelson, J. M. Reichert // Nature Biotechnology. - 2009. - Vol. 27, № 4. - P. 331-337.

88. African swine fever virus p10 protein exhibits nuclear import capacity and accumulates in the nucleus during viral infection/ I. Nunes-Correia, J. M. Rodriguez, A. Eulalio [et al.]// Veterinary Microbiology. - 2008. - Vol. 130, № 1. - P. 4759.

89. Epidemiological analysis of the 2015-2017 African swine fever outbreaks in Estonia/ I. Nurmoja, K. Motus, M. Kristian [et al.]// Preventive Veterinary Medicine. - 2018.- Vol. 181. - P. 12.

90. African Swine Fever Virus Georgia Isolate Harboring Deletions of MGF360 and MGF505 Genes Is Attenuated in Swine and Confers Protection against Challenge with

Virulent Parental Virus/ V. O'Donnell, L. G. Holinka, P. D. Gladue [et al.]// Journal of Virology. - 2015. - Vol. 89, № 11. - P. 6048-6056.

91. In vivo depletion of CD8+ T lymphocytes abrogates protective immunity to African swine fever virus/ C. A. L. Oura, M. S. Denyer, H. Takamatsu, R. M. E. Parkhouse // Journal of General Virology. - 2005. - Vol. 86, № 9. - P. 2445-2450.

92. A New Approach to Drug Therapy: Fc-Fusion Technology/ V. Pechtner, C. A. Karanikas, L.E. García-Pérez, W. Glaesner// Primary Health Care Open Access. - 2017.

- Vol. 07, № 01. - P. 5.

93. Epidemiology of African Swine Fever in Poland since the detection of the first case/ Z. Pejsak, M. Truszczynski, K. Niemczuk [et al.]// Polish Journal of Veterinary Sciences.

- 2014. - Vol. 17, № 4. - P. 665-672.

94. Review of African swine fever: transmission, spread and control/ M. L. Penrith, W. Vosloo// Journal of the South African Veterinary Association. 2009. - Vol. 80, № 2. - P. 58-62.

95. Genetically edited pigs lacking CD163 show no resistance following infection with the African swine fever virus isolate, Georgia 2007/1/ L. Popescu, N. N. Gaudreault, K.M. Whitworth [et al.] // Virology. - 2017. - Vol. 501. - P. 102-106.

96. Fc-fusion proteins and FcRn: structural insights for longer-lasting and more effective therapeutics/ T. Rath, K. Baker, J.A. Dumont// Critical Reviews in Biotechnology. - 2015.

- Vol. 35, № 2. - P. 235-254.

97. Antibody-based therapeutics to watch in 2011/ J. M. Reichert// mAbs. - 2011. - Vol. 3, № 1. - P. 76-99.

98. Unraveling the Armor of a Killer: Evasion of Host Defenses by African Swine Fever Virus/ A. Reis // Journal of Virology. - 2017. - Vol. 6, № 91. - P. 16.

99. Deletion of African swine fever virus interferon inhibitors from the genome of a virulent isolate reduces virulence in domestic pigs and induces a protective response/ A. L. Reis, C. C. Abrams, L. C. Goatley [et al.]// Vaccine. - 2016. - Vol. 34, № 39. - P. 4698-4705.

100. Deletion of the African Swine Fever Virus Gene DP148R Does Not Reduce Virus Replication in Culture but Reduces Virus Virulence in Pigs and Induces High Levels of

Protection against Challenge/ A. L. Reis, L. C. Goatley, T. Jabbar [et al.]// Journal of Virology. - 2017. - Vol. 91, Issue 24. - P. 16.

101. CP7_E2alf oral vaccination confers partial protection against early classical swine fever virus challenge and interferes with pathogeny-related cytokine responses/ P. Renson, M. Le Dimna, A.Keranflech [et al.]// Veterinary Research. -2013. - Vol. 44, № 1. - P. 9.

102. The structural protein p54 is essential for African swine fever virus viability/ F. Rodriguez, V. Ley, P. G6mez-Puertas [et al.] // Virus Research. - 1996. - Vol. 40, № 2. -P. 161-167.

103. African swine fever virus encodes a CD2 homolog responsible for the adhesion of erythrocytes to infected cells/ J. M. Rodríguez, R. J. Yáñez, F. Almazán [et al.]// Journal of Virology. - 1993. - Vol. 67, № 9. - P. 5312-5320.

104. The CD2v protein enhances African swine fever virus replication in the tick vector, Ornithodoros erraticus/ R. J. Rowlands, M. M. Duarte, F. Boinas [et al.]// Virology. -2009. - Vol. 393, № 2. - P. 319-328.

105. Polyprotein Processing Protease of African Swine Fever Virus: Purification and Biochemical Characterization/ D. Rubio, A. Alejo, I. Rodríguez, M. L. Salas// Journal of Virology. - 2003. - Vol. 77, № 7. - P. 4444-4448.

106. Salas M. L., A. Granoff, R. G. African swine fever virus (ASFARVIRIDAE)/ M. L. Salas, A. Granoff, R. G. Webster// Oxford: Elsevier - 1999. - P. 30-38.

107. African swine fever virus morphogenesis/ M. L. Salas, G. Andrés // Virus Research. - 2013. - Vol. 173, № 1. - P. 29-41.

108. Different routes and doses influence protection in pigs immunised with the naturally attenuated African swine fever virus isolate OURT88/3/ J. P. Sánchez-Cordón, D. Chapman, T. Jabbar [et al.]// Antiviral Research. - 2017. - Vol. 138. - P. 1-8.

109. Expression of porcine CD163 on monocytes/macrophages correlates with permissiveness to African swine fever infection/ C. Sánchez-Torres, P. Gómez-Puertas, M. Gómez-del-Moral [et al.]// Archives of Virology. - 2003. - Vol. 148, № 12. - P. 23072323.

110. An update on the epidemiology and pathology of African swine fever/ J. M. Sánchez-Vizcaíno, L. Mur, J .C. Gomez-Villamandos, L.Carrasco// Journal of Comparative Pathology. - 2015. - Vol. 152, № 1. - P. 9-21.

111. Monoclonal antibodies specific for African swine fever virus proteins/ A. Sanz, B. García-Barreno, M. L. Nogal [et al.] // Journal of Virology. - 1985. - Vol. 54, № 1. - P. 199-206.

112. Serotype-specific and haemadsorption protein of the african swine fever viruS/ A. D. Sereda, A. S. Kazakova, I. R. Imatdinov, D. V. Kolbasov // Slovenian Veterinary Research. - 2018. - Vol. 55, № 3. - P. 141-150

113. Infectious disease vaccines/ A. K. Shen, M. T. Cooke // Nature Reviews Drug Discovery. - Vol. 3, № 18. - P. 169-170.

114. Competition for FcRn-mediated transport gives rise to short half-life of human IgG3 and offers therapeutic potential/ N. M. Stapleton, J. T. Andersen, A. M. Stemerding // Nature Communications. - 2011. - Vol. 2. - P. 599.

115. The Antibody Response in Pigs Inoculated with Attenuated African Swine Fever Virus/ S. S. Stone, P. D. DeLay, E. C. Sharman// Canadian Journal of Veterinary Research. - 1968. - Vol. 32, № 3. - P. 455-460.

116. NetCTLpan: pan-specific MHC class I pathway epitope predictions/ T. Stranzl, M. V. Larsen, C. Lundegaard, M. Nielsen// Immunogenetics. - 2010. - Vol. 62, № 6. - P. 357-368.

117. Recombinant polyepitope vaccines for the delivery of multiple CD8 cytotoxic T cell epitopes/ S. A. Thomson, S. L. Elliott, M. A. Sherritt [et al.]// The Journal of Immunology. - 1996. - Vol. 157, № 2. - P. 822-826.

118. Pharmacokinetic properties of IgG and various Fc fusion proteins in mice/ F. Unverdorben, F. Richter, M. Hutt [et al.]// mAbs. - 2015. - Vol. 8, № 1. - P. 120-128.

119. Statistical Exploration of Local Transmission Routes for African Swine Fever in Pigs in the Russian Federation, 2007-2014/ T. Vergne, A. Gogin, D. U. Pfeiffer// Transboundary and Emerging Diseases. - 2017. - Vol. 64, № 2. - P. 504-512.

120. A precise extraction of R=oL/oT from a global analysis of the SLAC deep inelastic e-p and e-d scattering cross sections/ L. W. Whitlow, S. Rock, A. Bodek [et al.] // Physics Letters B. - 1990. - Vol. 250, № 1. - P. 193-198.

121. Current status of African swine fever virus in a population of wild boar in eastern Poland (2014-2015) // Archives of Virology. 2016. № 1 (161). C. 189-195.

122. Analysis of the Complete Nucleotide Sequence of African Swine Fever Virus/ G. Wozniakowski, E. Kozak, A. Kowalczyk [et al.]// Virology. - 1995. - Vol. 208, № 1. - P. 249-278.

123. Efficient Mucosal Delivery of Vaccine Using the FcRn-Mediated IgG Transfer Pathway/ L. Ye, R. Zeng, Y. Bai [et al.]// Nature biotechnology. - 2011. - Vol. 28, № 2. - P. 158-163.

124. Deletion at the 5'-end of Estonian ASFV strains associated with an attenuated phenotype/ L. Zani, J. H. Forth, L. Forth [et al.]// Scientific Reports. - 2018. - Vol. 8, № 1. - P. 6510.

125. Emergence of African Swine Fever in China, 2018/ X. Zhou // Transboundary and Emerging Diseases. - 2018. - Vol. 65, № 6. - P. 1482-1484.

126. A Nonessential African Swine Fever Virus Gene UK Is a Significant Virulence Determinant in Domestic Swine/ L. Zsak, E. Caler, Z. Lu [et al.]// Journal of Virology. -1998. - Vol. 72, № 2. - P.1028-1035.

9. ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1

122

Приложение 2

124