Методы выявления и изучение молекулярно-генетических свойств изолятов вирусов оспы птиц тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат биологических наук Елаткин, Николай Павлович

• Елаткин, Николай Павлович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Елаткин, Николай Павлович

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Общая характеристика

2.2. Морфология

2.3. Классификация

2.4. Геном ВОП

2.5. Морфогенез

2.6. Взаимодействие вируса с организмом-хозяином

2.7. Культивирование ВОП

2.8. ' Патогенез и распространение заболевания

2.9. Заболевание

2.10. Антигенная и генетическая вариабельность и филогения ВОП

2.11. Диагностика инфекции, вызываемой ВОП

2.12. Профилактика и лечение

2.13. Вирус оспы птиц и вирус ретикулоэндотелиоза (РЭВ)

2.14. Вирусы оспы птиц в качестве вакцинных векторов

2.15. Заключение по обзору литературы

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы

3.2. Методы

3.2.1. Выделение ДНК

3.2.2. ПЦРиПЦР-РВ

3.2.3. Очистка продуктов ПЦР для секвенирования и клонирования

3.2.4. Получение плазмид, несущих последовательности генов Р4Ь

и М1

3.2.5. Определение первичной нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов к ДНК

3.2.6. Нуклеотидный анализ последовательностей ПЦР-ампликонов

3.2.7. Гистологические исследования тканей

3.2.8. Статистическая обработка результатов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И

ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Разработка диагностических методов ПЦР для выявления

В ОП и идентификации вида вируса

4.1.1. Выбор праймеров для ПЦР и ПЦР-РВ

4.1.2. Оптимизация параметров ПЦР

4.1.3. Аналитическая чувствительность ПЦР и ПЦР-РВ

4.1.4. Разработка внутреннего контрольного образца для ПЦР-РВ

4.1.5. Оценка эффективности амплификации фрагмента гена Р4Ь в ПЦР-РВ

4.1.6. Специфичность ПЦР и ПЦР-РВ

4.1.7. Разработка положительного контроля для ПЦР и ПЦР-РВ

4.1.8. Выявление вирусов оспы птиц в пробах биоматериала

4.2. Изучение молекулярно-биологических свойств изолятов вируса оспы птиц

4.2.1 Выявление ВОП гистологическим методом у

экспериментально заражённых птиц

4.2.2. Анализ вариабельности последовательности гена P4b (fpvl67) вируса оспы птиц

4.2.3. Анализ вариабельности последовательности гена H3L (fpvl40) вируса оспы птиц

4.3. Дифференциация полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса оспы кур

4.3.1. Анализ последовательности генного локуса Н9 вируса оспы кур

4.3.2. Выявление наличия последовательности генома вируса ретикулоэндотелиоза птиц в геноме ВОП

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

8 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методы выявления и изучение молекулярно-генетических свойств изолятов вирусов оспы птиц»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Оспа птиц (ОП) - вирусное заболевание домашних и многих видов диких птиц, распространенное во многих странах мира с развитым птицеводством. Возбудителем оспы птиц является ДНК-содержащий эпителиотропный вирус рода Avipoxvirus, подсемейства Chordopoxvirinae, семейства Poxviridae, в котором насчитывается 10 видов [82]. Наибольший экономический ущерб птицеводству причиняет вирус оспы кур (ВОК, fowlpox), который определен как типичный вид данного рода [144].

Оспа кур наносит птицеводческим хозяйствам экономический ущерб, вызывая смертность до 50%, снижение яйценоскости и приводя к вынужденному убою больных и переболевших птиц [66]. Специфическая вакцинопрофилактика оспы птиц применяется не во всех хозяйствах, что сохраняет возможность для распространения заболевания.

Эффективность мероприятий по борьбе с оспой птиц во многом зависит от своевременного выявления возбудителя. Диагноз основывается на данных клинических и патологоанатомических наблюдений, оценки эпизоотической ситуации и результатах комплекса лабораторных исследований с выделением вируса [11].

Лабораторная диагностика оспы птиц включает выделение вируса на хорионаллантоисной оболочке (ХАО) SPF-эмбрионов кур, гистологических исследованиях и электронной микроскопии [144]. Данные методы хотя и достаточно надежны, но весьма трудоемки и требуют значительного времени.

Лабораторные методы, основанные на выявлении генетического материала вируса оспы птиц (ВОП), обладают более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с другими методами и сокращают время постановки диагноза до 4-5 часов с момента отбора проб. В последнее время появились методы ПЦР для выявления ВОП [8, 83, 84, 91, 118]. Сравнительно недавно для выявления ВОП разработан такой метод,

как ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) [121]. Метод ПЦР-РВ более чувствителен по сравнению с обычной ПЦР и позволяет проводить количественный анализ исследуемого гена. Одним из недостатков метода ПЦР является возможность ингибирования реакции при исследовании проб патологического материала. Для контроля процесса выделения ДНК и наличия ингибиторов реакции в исследуемой пробе используется внутренний контрольный образец (ВКО), т.е. гетерологичная ДНК, которая добавляется в пробу перед выделением, а также положительный контрольный образец (ПКО).

Известные виды и штаммы ВОП могут значительно отличаться по биологическим и генетическим свойствам [140], поэтому необходимо не только выделять изоляты, но также проводить их изучение. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов даёт возможность устанавливать филогенетические связи ВОП. Чаще всего для этого анализируют участок гена P4b (fpvl67) и H3L (фу 140) [91, 118], кодирующие структурные иммунодоминантные белки ВОП. Необходимо отметить, что генетическое разнообразие изолятов ВОП, встречающихся на территории РФ, остаётся в настоящее время малоизученным.

Поскольку используются живые вакцины против оспы кур, необходимо дифференцировать полевые изоляты вируса от вакцинных штаммов. Работа, проведенная Susan A. Jarmin с коллегами [118], позволила выявить генный локус Н9, который может быть использован для различия полевых изолятов оспы кур от вакцинных штаммов.

Имеются свидетельства того, что вирус ретикулоэндотелиоза птиц (РЭВ) участвует в патогенезе В OK, увеличивая его вирулентность за счет подавления иммунного ответа [126]. РЭВ - иммуносупрессивный ретровирус. Как правило, вирулентные штамма ВОК имеют полногеномную последовательность РЭВ в своём геноме, в то время как вакцинные штаммы несут только длинные концевые повторы (LTR) [121].

Исходя из вышеизложенного, разработка и усовершенствование методов выявления ВОП в пробах патологического материала, дифференциация вакцинных штаммов от полевых изолятов, а также изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов ВОП является актуальной задачей.

Степень разработанности проблемы. Отечественными исследователями опубликован ряд рекомендаций по борьбе с оспой птиц (Новочеркасск, 1984; Кишинёв, 1989), разработаны вакцины против оспы птиц и изучены их свойства (Черкезова Т.В., 1989; Бочарников A.B., 2003; Николаева И.П., 2003; Смирнов В.Н., 2003; Черкезова Т.В., 2003; Бочарников A.B., 2004; Похвальный С.А., 2011). Предложены системы ПЦР и ПЦР в режиме реального времени для выявления ВОП (Huw Lee & Hwa Lee, 1997; Hauck, 2009; Jarmin S., 2006). Отечественными исследователями разработан метод гнездовой ПЦР на ген тимидинкиназы для выявления ВОП (Батченко Г.В., 2006).

Цель и задачи исследования. Основной целью данных исследований являлась разработка и усовершенствование методов выявления и дифференциации ВОП, а также изучение молекулярно-генетических свойств выделенных изолятов.

Для достижения поставленных целей было необходимо решить следующие задачи:

1. Разработать метод выявления ВОП на основе полимеразной цепной реакции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с рекомбинантными положительным и внутренним контрольными образцами.

2. Определить первичную нуклеотидную последовательность и провести филогенетический анализ фрагментов генов P4b, Fpvl40 и генного локуса Н9 полевых изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также 5 вакцинных и одного полевого штамма ВОК.

3. Разработать метод выявления генома вируса ретикулоэндотелиоза (РЭВ) в геноме ВОП с использованием ПЦР и провести анализ изолятов и штаммов ВОП на наличие встроенной последовательности РЭВ.

4. Изучить молекулярно-генетические свойства изолятов и штаммов

ВОП.

Научная новизна результатов исследования.

1. Разработаны методы выявления ВОП с помощью ПЦР и ПЦР-РВ с рекомбинантными ПКО и ВКО.

2. Определены нуклеотидные последовательности фрагментов генов Р4Ь, Рру140 и генного локуса Н9 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также пяти вакцинных штаммов и штамма ВОК для контрольного заражения. Проведен филогенетический анализ изолятов и штаммов ВОП с использованием полученных последовательностей.

3. Разработан метод выявления встройки генома РЭВ в ВОП с использованием ПЦР и проведен анализ изолятов и штаммов ВОП на наличие встроенной последовательности РЭВ.

Практическая значимость работы. С помощью разработанных методов выявления генома ВОП на основе ПЦР исследовано 65 проб патологического материала от кур, голубей и диких птиц, поступивших в 2008-2012 гг. из России, Украины и Казахстана. В 16 пробах от кур и 3 пробах от голубей был выявлен ВОП. Установлено, что из 18 выявленных изолятов 16 являются вирусами оспы кур и 2 - вирусами оспы голубей. Разработаны методы, позволяющие дифференцировать полевые изоляты ВОК, выделенные в России, от вакцинных штаммов. 18 изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., пять вакцинных и один штамм ВОК для контрольного заражения были исследованы на наличие генома вируса ретикулоэндотелиоза птиц. Изучены молекулярно-генетические свойства изолятов и штаммов ВОП.

Научные результаты, выносимые на защиту:

Методы выявления ВОП на основе ПЦР и ПЦР-РВ с рекомбинантным положительным и внутренним контролем.

Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов Р4Ь, БруМО изолятов ВОП, выделенных в 2008-2012 гг., а также 5 вакцинных и одного штамма ВОК для контрольного заражения.

Способ дифференциации полевых изолятов ВОК от вакцинных штаммов на основе анализа генного локуса Н9.

Результаты анализа изолятов и штаммов ВОП с помощью ПЦР и ПЦР-РВ на наличие встроенной последовательности РЭВ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В соответствии с формулой специальность 03.02.02 Вирусология, охватывает проблемы инфекционности вирусов, разработки мер и средств диагностики вызываемых вирусами заболеваний, включая области исследования - генной инженерии, изучение генетических и негенетических взаимодействий между вирусами, эпидемиологии и путей распространения вирусных инфекций, изучение путей передачи вирусов, выявление естественных хозяев, разработку мер диагностики вирусных заболеваний, совершенствование лабораторных диагностических систем. В диссертационной работе проведены исследования по разработке методов ПЦР для выявления ВОП, а так же исследования молекулярно-биологических и филогенетических свойств изолятов ВОП.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 4, 6, 8, 10.

Апробация результатов исследования. Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2010-2012 гг., доложены и опубликованы на Международных научно-практических конференциях молодых ученых (Россия, 2010г.; Россия, 2012г.) и Международной научно-практической

конференции «Трансмиссивные болезни животных: актуальные аспекты биобезопасности и контроля» (Крым, Украина, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 3 работы опубликованы в изданиях, включенных в перечень высшей аттестационной комиссии (ВАК) РФ.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические предложения, приложения. Список использованной литературы включает 154 источника. Работа иллюстрирована 25 рисунками и 7 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, ее научную новизну и практическую значимость.

Личный вклад автора в выполнении работы. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.б.н. Колосову С.Н., вед. биологу Ушаковой А.Н., к.б.н. Зинякову Н.Г., д.б.н. Мудрак Н.С., вед. вет. врачу Похвальному С.А., к.б.н. Андрейчуку Д.Б., к.в.н. Чвале И.А. за помощь в проведении отдельных этапов работы.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Общая характеристика

Оспа птиц (Variola avium, Fowl pox, Wet pox, Borreliata avium, контагиозная эпителиома, дифтерия птиц, злокачественный катар индеек, синусит идеек, заразная болезнь глаз индеек, кожная бугорчата, ложноперепончатая ангиома, «моллюск» птиц, ОП) - инфекционная болезнь, сопровождающаяся развитием оспенных экзантем на неоперенных участках кожи или дифтеритических поражений слизистой оболочки ротовой полости, либо одновременным проявлением указанных патологий. Впервые оспа кур описана в 1775 г. под названием заразного конъюнктивита [1].

Общие свойства сем. Poxviridae включают [100]: (1) продукцию большого (приблизительно 300 нм) вирионного комплекса, содержащего ферменты, участвующие в синтезе мРНК; (2) геном, состоящий из односегментной линейной двухцепочечной молекулы ДНК размером 130-300 тпн со шпилечной петлёй на каждом конце, и (3) репликацию, происходящую в цитоплазме.

Вирусы оспы содержат приблизительно 200 генов [55, 122, 138]. Гены, находящиеся недалеко от центра вирусного генома, обычно важны для репликации вируса и кодируют, например, ферменты, необходимые для транскрипции, репликации ДНК и структурные вирусные белки. В противоположность этому, гены, расположенные недалеко от концов генома, обычно несущественны для вирусной репликации, и кодируют белки, взаимодействующие с организмом хозяином или отвечающие за вирулентность. Жизненный цикл происходит исключительно в цитоплазме инфицированной клетки [100].

Вирусы оспы птиц реплицируются исключительно в птицах [74]. Штаммы дикого типа могут вызывать серьёзные заболевание у своих природных хозяев. Некоторые из них могут инфицировать виды, не являющиеся их натуральными хозяевами, но без патологических изменений.

К примеру, вирус оспы голубей естественно аттенуирован для кур и поэтому был использован как вакцина для них [74].

2.2. Морфология

Вирусы оспы птиц большие, овально-сферические оболочечные, их геном представляет двухнитевую ДНК размером от 260 до 365 т.п.н. [139]. Форма зрелого вириона кирпичеобразная с округленными краями. Он состоит из расположенной в центре сердцевины электронной плотности, вогнутой с двух сторон, или нуклеоида, двух боковых телец в каждой вогнутости и оболочки. Внешнее покрытие состоит из произвольно расположенных поверхностных трубочек [47] В исследовании проведённом ОиЬосЬе1 с коллегами [133] не обнаружили сердцевину в форме гантели или боковых телец при анализе вируса с помощью криоэлектронной микроскопии. Вместо этого была выявлена гомогенная сердцевина в форме бруска [133]. В оболочке выявляются полые, трубчатые филаменты диаметром 8 нм. Нуклеоид, представляет собой на поперечных срезах комплекс из цветкообразных структур диаметром 25 нм и мелких элементов диаметром 13 нм. Центральная трубчатая структура состоит из слоёв (дисков), каждый из которых сформирован 12 субъединицами. Трубчатый нуклеоид окружён цветкообразной структурой, состоящей из «лепестков» (56 нм), которые, по-видимому, располагаются вокруг трубчатой структуры по спирали таким образом, что на каждый оборот спирали приходится 7 «лепестков». На противоположных концах вириона находятся два боковых тела [1]. Внешняя оболочка вируса толщиной 12 нм, с периодическими выпячиваниями в виде трубок (вирусные ворсинки). Оболочка имеет три слоя, из которых наружный и внутренний - осмофильные, а промежуточный - осмофобный. Толщина каждого слоя окола 4 нм. Ворсинки имеют диаметр 7-8 нм, длина их достигает нескольких десятков нм. Ворсинки отходят от наружного осмофильного слоя оболочки и у основания шире (диаметр 15 нм), чем к вершине (диаметр 6,5 нм). При деструкции вирус утрачивает ворсинки. Стенка сердцевины вириона состоит из внутренней гладкой

мембраны толщиной приблизительно 5 нм и наружного слоя регулярно расположенных цилиндрических субъединиц, длина которых около 10 нм, а диаметр - 5 нм [1].

В отличие от большинства ДНК-содержащих вирусов, ВОП легко реплицируются в цитоплазме эпителиальных клеток инфицированных птиц, в результате чего происходит характерный цитопатогенный эффект (ЦПЭ) в течение 4-6 суток в зависимости от изолята вируса [50]. ВОП также увеличивает хорионаллантоисную мембрану (ХАО) зараженных эмбрионов, и в результате формируются компактные, пролиферативные оспенные поражения иногда в центре, иногда на всей ХАО [62]. Однако, некоторые изоляты, не вызывают увеличения ХАО эмбрионов. ВОП - этиологический агент заболевания, характеризующегося поражениями кожи домашних и диких птиц [50]. В результате гистологических исследованиях ультраструктуры обнаружено, что вирусы оспы птиц проходят те же стадии, что и другие представители вирусов оспы позвоночных, включая формирование характерных цитоплазматических телец включений, которые наблюдаются в некоторых эпителиальных и мононуклеарных клетках заражённых организмов. Вирусные частицы ВОП могут быть обнаружены и впоследствии охарактеризованы с использованием просвечивающей электронной микроскопии [151].

2.3. Классификация

Общая классификация вирусов оспы

Сем. Poxviridae разделено на два подсемейства Chordopoxvirinae и Entomopoxvirinae, на основе разделения по спектру хозяев: позвоночных и насекомых, соответственно. Подсемейство Chordopoxvirinae состоит из девяти родов: Avipoxvirus, Capripoxvirus, Leporipoxvirus, Molluscipoxvirus, Orthopoxvirus, Parapoxvirus, Monkeypox, Suipoxvirus and Yatapoxvirus. Виды внутри рода генетически и антигенно родственны и имеют сходную морфологию. Отсутствие межродовой перекрёстной гибридизации ДНК при

строгих условиях свидетельствует о иуклеотидной идентичности ниже, чем 75%. Род Capripoxvirus включает вирус оспы овец, вире оспы коз и вирус нодулярного дерматита, который поражает КРС. В роде Leporipoxvirus только вирус миксомы, вызывающий миксоматоз, имеет ветеринарную значимость. В роде Molluscipoxvirus известен только вирус контагиозной моллюсковидной опухоли, который является вирусом человека. Род Orthopoxvirus наиболее изучен. Вирусы этого рода имеют как узкий, так и широкий круг хозяев. Вирус натуральной оспы - специфический человеческий вирус. В противоположность этому вирус осповакцины -вирус, который использовали как вакцину против натуральной оспы, имеет широкий круг хозяев [128, 35]. Этот вирус способен реплицироваться in vitro и in vivo в организме различных видах позвоночных от птиц до человека. Вирус коровьей оспы также имеет широкий круг хозяев, включая птиц. Природным резервуаром вируса являются грызуны, которые могут иногда случайно, инфицировать коров, кошек и человека [34]. Род Monkeypox имеет географическое распространение, ограниченное Западной и Центральной Африкой [108]. Этот вирус белок вызывает редкие случаи заболевания, подобного натуральной оспе, когда он передаётся обезьянам или людям. Три вируса домашних животных рода Parapoxvirus иногда могут инфицировать людей: orf вирус, обычно вызывающий заболевание овец, вирус псевдокоровьей оспы и вирус бычьего папулезного стоматита, обычно поражающий КРС. Вирус оспы свиней - единственный представитель рода Suipoxvirus, периодически вспышки инфекции, вызываемой этим вирусом, наблюдаются в свиноводческих районах по всему миру. Род Yatapoxvirus содержит танапокс вирус и опухолевый вирус оспы обезьян Яба [107].

Род Avipoxvirus - вирус оспы птиц

Вирусы рода Avipoxvirus относятся к подсемейству Chordopoxvirinae, которые имеют часть свойств характерных для других вирусов оспы [139, 140]. Род Avipoxvirus объединяет серологически родственные вирусы, которые инфицируют только птиц и выделены из поражений, найденных у

всех видов домашних и многих видов диких птиц [74]. Вирусам, выделяемым из различных видов птиц, даются названия в зависимости от их хозяев, например вирус оспы канареек, вирус оспы кур и др. Вирусы оспы птиц не способны полностью завершить репликативный цикл в любом другом организме, кроме птиц. Вирус оспы кур определен как типичный вид данного рода [144].

В то время как в мире только 10 штаммов были охарактеризованы и классифицированы как виды ВОП [149], инфекция, вызываемая вирусом оспы птиц наблюдалась у более чем 278 из 9000 известных видов птиц, охватывающих 23 семейства [144, 147]. Эти штаммы различны по вирулентности и видовой специфичности, что говорит о необходимости решения в ближайшее время задачи по анализу и характеристики новых изолятов.

Основываясь на докладе Боллингера об инфицированных оспой клетках цыплят и последующей работе Феннера и Барнета [73] ВОП и другие вирусы оспы были классифицированы на основе следующих признаков: первичный хозяин, рост и морфологическая характеристика на ХАО эмбрионов или культуре клеток, клинические признаки при различных заболеваниях человека, птиц и животных [72], а не на основе генетической идентичности, которая может обеспечить быструю и надёжную идентификацию вируса [23, 91, 92]. Эти критерии остались базовыми для классификации ВОП в дальнейшем, несмотря на разработку новых молекулярных методов, с помощью которых можно решить вопрос о видовой специфичности ВОП.

В связи с накоплением информации о геноме вирусов оспы птиц, есть предпосылки для изменения существующей номенклатуры вирусов оспы в общем, и ВОП в частности, основываясь на данных молекулярных исследований. Предлагаются различные подходы по изменению номенклатуры ВОП [118]. Как временный подход к номенклатуре, предлагается снизить число общепризнанных видов для соответствия с

филогенетическим группами. Это могли бы быть вирусы оспы кур и подобные им, вирусы оспы индеек и подобные вирусы, вирусы оспы канареек и подобные им, вирусы оспы скворцов и вирусы оспы воробьёв. Вирусы оспы голубей не стоит выделять в отдельный вид, поскольку неопределённо, к какой существующей таксономической группе вирусов они относятся [118].

Важным в изменении номенклатуры в долгосрочной перспективе является то, что ВОП представлены только одним родом (.Avipoxvirus), в то время как вирусы оспы млекопитающих представлены семью родами. При этом по гомологичным генам Р4Ь, разница между ВОП сравнима с той, что наблюдается между существующими родами вирусов млекопитающих [118, 140].

Семейство Poxviridae разделяется на подсемейства вирусов насекомых (Entomopoxvirinae) и позвоночных (Chordopoxvirinae). Это разделение предлагает узкие границы для таксономической номенклатуры, поэтому можно было бы разделить вирусы оспы млекопитающих от ВОП и позволить систематическое разделение ВОП. Два альтернативных подхода можно было бы предложить для такого разделения. В первую очередь можно предложить заменить два существующих подсемейства на три: для вирусов насекомых (insecto), диапсид (diapsida или archosauria), куда войдут ВОП, и млекопитающих (synapsidá). Другой альтернативой могло бы быть поднятие семейства Poxviridae до статуса порядка и существующих подсемейств до статуса семейств. Это позволило бы группировать вирусы насекомых {insecto), диапсид (diapsida или archosauria) и млекопитающих (synapsidá) на уровне семейств [118].

Третьим подходом могло бы быть сохранение существующей номенклатуры семейства и подсемейств, но замена существующего рода Avipoxvirus на три или более, основываясь на больших кладах с соответствующей номенклатурой. Потеря рода Avipoxvirus смогла бы быть компенсирована включением слова «avipoxvirus» в родовые названия, как

например Falconiform avipoxvirus (с или без пробела), Psittacine avipoxvirus, Passeriform avipoxvirus, Galliform avipoxvirus или Collumbiform avipoxvirus. Такие названия родов, конечно, могут также совмещаться с ранее описанными двумя подходами [118]. Таким образом, накопление данных о геноме изолятов вирусов оспы птиц и изучение их свойств необходимо для понимания таксономического положение ВОП среди других вирусов оспы. 2.4. Геном ВОП

Вирусы оспы птиц имеют несегментированную линейную двух нитевую ДНК размером 260-365 т.п.н. с низким содержанием оснований Г+Ц (30-40%). Кодирующая область генома фланкирована двумя идентичными концевыми повторами, которые ковалентно связаны со шпилечными петлями и содержат несколько сотен близкорасположенных открытых рамок считывания (ОРС) [140]. Центральный регион кодирующей области содержит примерно 90-106 гомологичных генов, кодирующие белки, отвечающие за базовые процессы репликации, включая транскрипцию и модификацию вирусной РНК, репликацию ДНК, структурные белки и белки, участвующие в сборке зрелых внутриклеточных и оболочечных внеклеточных вирионов. Вообще, как и у остальных вирусов оспы, гены, находящиеся в этом регионе имеют общие функции и относительно консервативны среди вирусов оспы. В отличие от них, гены, находящиеся на концах генома, более вариабельны, что было показано на разнообразных кодируемых ими белках, отвечающих за ограничение круга хозяев [139].

Полностью определены первичные последовательности генома трёх наиболее изученных ВОП: вируса оспы кур FWPV USDA (вирус, используемый в США для контрольного заражения) (Animal Health Inspection Service Centre for Veterinary Biologicals, Ames Iowa, USA), вируса оспы кур FWPV-FP9 (аттенуированный европейский вирус, клонированный на бляшках и адаптированный к культуре клеток) и вирулентного штамма вируса оспы канареек CNPV (Wheatley С93, American Type Culture Collection; ATCC VR-111) [90, 139, 140]. Несмотря на то, что нуклеотидная и

аминокислотная последовательности этих трёх вирусов известны, функции некоторых предполагаемых генов и белков остаются до конца не определены. Сравнение штаммов FP9 и FWPV USDA показывают 118 различий, вследствие которых 71 ген подвергается изменениям путём делеций (26 делеций размером 1-9334 п.о.), встроек (15 встроек размером 1108 п.о.), замен, обрыванием или сдвигом рамок считывания. Штамм FP9 -производний от европейского штамма FWPV НР1, который был получен путём 400 пассажей на культуре фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Анализ последовательности FWPV НР1 по локусам, в которых была обнаружена разница между FP9 и FWPV US, показал, что 68 из 118 локусов отличались от FWPV USDA, но были идентичны FP9. Таким образом, это показывает, что более чем половина отличий между потомками представлена различиями между родительским вирулентным вирусом НР1 и FWPV USDA [90]. Дальнейшее сравнение молекулярных данных показало, что вирус оспы кур и вирус оспы канареек имеют высокую идентичность аминокислот, значительную перестановку последовательностей генов, делеции и вставки. Геном ВОКР длиннее генома ВОК приблизительно на 80-100 т.п.о. Оба вируса экспрессируют гены с гомологичными иммуномодуляторными функциями, которые могут отвечать за вирулентность и видоспецифичность [139], но ВОКР показывает более широкий клеточный тропизм в восприимчивых организмах, чем ВОК. Гены, располагающиеся в неконсервативных регионах более подвержены мутациям и рекомбинации, они участвуют в определении круга хозяев, патогенезе, являются иммуномодуляторами [113], могут быть ответственны за некоторые аспекты клеточного и/или тканевого тропизма, или осуществлять другие клеточные функции [139].

Гены, определяющие вирулентность, обычно имеют неконсервативную природу и влияют на патологические свойства вирусов в инфицированном организме. Эти гены важны для вирусной эволюции, они изучались в работах, направленных на понимание некоторых эволюционных стратегий

вирусов оспы, обеспечивающих их репликацию [87]. Многие из этих подходов берут своё начало из опытов по выключению вирусных генов, в которых целевой разрыв специфического гена, вызывает специфические фенотипические изменения, отражающие нормальную биологическую функцию этого белкового продукта. Несмотря на некоторые значительные достижения, сделанные в секвенировании геномов и in vitro характеристике ВОП [41, 84, 139, 140], недостаточно работ по изучению генов, ограничивающих круг хозяев вирусов оспы птиц. Широкий набор гомологогичных генов, предполагаемая функция которых - ограничение круга хозяев, такие как рецепторы клеток натуральных киллеров, хемокинов, ингибиторов сериновых протеиназ и генов, включённых в апоптоз, клеточный рост, тканевой тропизм и ограничивающих круг восприимчивых видов птиц, наводят на мысль о значительной адаптации вирусов в организмах восприимчивых видов птиц [140]. 2.5. Морфогенез

Вход и выход из клетки вируса усложнён наличием по крайней мере двух различных форм, которые могут инфицировать клетки: внутриклеточный зрелым вирусом (intracellular mature virus (1MV)) и внеклеточный оболочечный вирус (extracellular enveloped virus (EEV)). Эти две формы окружены различными липидными мембранами и поверхностными белками, которые ещё полностью не охарактеризованы [152].

После связывания вируса с клеточной мембраной, следует слияние, процесс которого еще не достаточно изучен, в результате идёт проникновение кора вириона в цитоплазму клетки [41]. Высвободившийся кор, имеет эндогенную РНК-полимеразу и транскрипционные факторы, инициирующие первый этап транскрипции ранних вирусных генов путём синтеза вирусной матричной РНК под контролем ранних вирусных промоторов. Это следует после стадии раздевания, т.е. освобождения вирусной ДНК в цитоплазме и предшествует репликации ДНК, а также

началу транскрипции средних и поздних генов. Когда накапливаются продукты поздних вирусных генов, происходит сборка и морфогенез инфекционных вирусных частиц. В процессе морфогенеза, вирусы оспы птиц индуцируют формирование телец включений в цитоплазме инфицированных клеток. Репликация вирусной ДНК в эпителии кожи начинается через 12-24 часа после инфицирования. А первое появление инфекционного вируса наблюдается спустя 22-24 часа. Гиперплазия эпителия через 36-48 часов заканчивается увеличением в 2,5 раза количества клеток к 72 часу. В первые 69 часов инфекции скорость синтеза низкая, но затем в интервале 60-72 часов синтез вирусной ДНК усиливается, а потом происходит резкое снижение синтеза клеточной ДНК. Между 72 и 96 часами синтез вирусной ДНК постепенно становится более заметным и никакой дальнейшей гиперплазии уже не наблюдается [51].

Общепринято, что включения, которые могут также называться вирусными фабриками, вироплазмами или вирусными репликативными комплексами, являются местами активной вирусной репликации и сборки вирусных частиц внутри инфицированных клеток. Одна из моделей функционирования телец включений подразумевает, что они служат для концентрирования и изолирования белков, нуклеиновых кислот и других небольших молекул, важных для вирусных процессов в клетке [152].

В восприимчивых клетках, первыми вирусными структурами, которые могут быть обнаружены электронной микроскопией, являются образования серповидной формы, состоящие из мембраны с шипиками на выпуклой поверхности [41]. Эти структуры формируются внутри неинфекционных сферических незрелых вирисов (НВ) (non-infectious spherical immature viruses (IV)), из которых через несколько этапов созревания формируется внутриклеточный зрелый вирус (ВЗВ) (the intracellular mature virus (IMV)). Внутриклеточный зрелый вирус представляет большинство инфекционного потомства из каждой инфицированной клетки [41; 45]. Существует три возможных механизма выхода вирусов оспы из клетки, в зависимости от

штамма вируса, типа клеток и времени после инфекции [45, 150, 151]. Они могут выходить путём цитолиза, в этом случае ВЗВ выходит, когда подвергается лизису в результате ЦПД на поздних стадиях инфекции. Во втором случае они могут выходить путём экзоцитоза, индуцированного вирусом. В третьем случае внутриклеточные зрелые вирионы выходят путём почкования, ВЗВ мигрируют наружу из вирусных фабрик через плазматическую мембрану. Показано, что почкование - основной путь выхода вирионов для ВОП [41] в отличие от вирусов оспы млекопитающих, которые выходят из клетки путём экзоцитоза внутриклеточного обол очечного вируса (intracellular enveloped virus (IEV)(BOB)) [129]. При этом вирионы приобретают дополнительную двойную мембрану [41; 45]. В непермиссивных клетках африканской зелёной обезьяны (VERO) и линии клеток человека (MRC-5), блокируется цикл морфогенеза ВОП. Блокирование происходит на стадии, следующей за формированием НВ. Было показано, что не происходит изменений в экспрессии ранних генов [69, 106, 130], а, следовательно, эта блокада не может быть связана с клеточными рецепторами.

Тропизм вирусов зависит не только от специфических поверхностных клеточных рецепторов, но и от наличия в клетках дополнительных внутриклеточных факторов, необходимых для эффективной вирусной репликации, и от способности специфического вируса успешно манипулировать внутриклеточными сигналами, которые регулируют клеточные противовирусные процессы, следующие после проникновения вируса [113]. ВОП имеют большой геном, что позволяет им экспрессировать уникальный набор белков, которые функционируют как факторы, определяющие круг хозяев [152]. Эти белки специфически взаимодействуют с клеточными белками, управляют метаболизмом и сигналами внутри клетки хозяина, обеспечивая оптимальные для репликации вируса условия. Однако, в некоторых клетках, особенно млекопитающих, репликация ВОП блокирована. Это может быть следствием невозможности специфически

активировать вирусом сигнальные пути метаболизма или медиаторы в этих клетках. Роль медиаторов и иммунопатология ВОП сложна и недостаточно хорошо изучена [152]. Однако, учитывая множество стадий в морфогенезе ВОП, необходимо отметить, что эти вирусы индуцируют определённые медиаторы, которые позволяют им сохраняться и взаимодействовать с хозяйскими клетками. Некоторые потенциальные медиаторы идентифицированы [140] и ждут точной функциональной характеристики. Одни эти молекулы не могут полностью объяснить события в клетках млекопитающих, в которых происходит репликация ВОП. Поэтому, идентификация новых медиаторов, которые участвуют в регуляции ответа в инфицированных ВОП клетках млекопитающих или птиц, могла бы помочь расширить знания об иммунном ответе .против ВОП и связанной с ним иммунно-опосредованной патологии, а также клеточном тропизме вируса. Это очень важно для исследования этих характеристик в дальнейшем, особенно для исследования типов клеток, которые, как недавно показано, обеспечивают репликацию ВОП [150]. 2.6. Взаимодействие вируса с организмом-хозяином

По сравнению с другими вирусами оспы, такими как вирус осповакцины, механизмы, отвечающие за патогенез ВОП, изучены мало. ВОП развили многообразные механизмы доставки генов и дополнительных белков в клетки хозяйского организма. Как и многие другие ДНК-содержащие вирусы, у ВОП, предположительно, многие из этих генов, ответственны за уход от иммунного ответа организма хозяина. Такие вирусные гены, обычно кодирующие важные для вируса белки, подвергаются молекулярным изменениям, которые приводят к успешному слиянию с мембранной, проникновению и внутриклеточному транспорту. Они включают гены, кодирующие белки, действующие на ранние врождённые пути иммунитета, как например пути метаболизма, включающие интерферон [146], копирующие распознающие рецепторы, например толл-подобные рецепторы [42], хемокины [20] и цитокины [21], также как и на

пути метаболизма, которые действуют на более поздний адаптивный иммунный ответ [61, 27]. Инфицирование клеток вирусом - сложный процесс, в ходе которого вирус должен преодолеть некоторые ограничивающие факторы организма хозяина и его иммунитет. Межклеточные белковые взаимодействия и пути метаболизма в большинстве случаев изменяются под воздействием вирусных белков, выводя вирус из под клеточного контроля и меняя нуклеотидный обмен, что приводит к прекращению синтеза клеточной ДНК [39]. Поэтому понимание функций вирусных белков и механизмов их взаимодействия с белками организма-хозяина необходимо не только для понимания работы биологической системы вирус-организм, но и для разработки эффективных вакцин, основанных на применении специфических антигенов и возможных иммуностимулирующих молекул, а также антивирусных комплексов. 2.7. Репродукция ВОП в культурах клеток

Со времени первых выделений ВОП в культуре клеток, эти вирусы считаются высокоспецифичными к виду организма хозяина. Они реплицируются только в культурах клеток птиц, особенно хорошо в клетках фибробластов эмбирионов кур (ФЭК) [79]. Клетки ФЭК имеют хороший коэффициент деления по сравнения с другими клеточными линиями, поэтому они пригодны для размножения вируса в больших количествах, например для получения антигена для вакцины или для диагностики. ВОП показали хорошую репродукцию в клетках почки эмбрионов кур, кожи эмбрионов кур [78; 120] и перепелиных клеточных линиях, таких как QT-35 [50, 142]. Однажды ВОП был выделен от млекопитающего. В 1969, живой ВОК был выделен от больного носорога. Изолят был идентифицирован как атипичный ВОК, основываясь на его патологической, вирусологической и серологической характеристиках [94]. Nelson [103] отмечал лёгкую патологию у мышей вследствие интраназального заражения ВОК, без его репликации. Недавние исследования также показали репликацию ВОП в культурах клеток млекопитающих, таких как клетки трахеи эмбрионов быка

(РВТ) [86] и клетках почки хомячка [150], что показано наличием инфекционных вирусных частиц и цитопатического действия. Эти исследования поднимают вопрос о видовой специфичности и механизмах ограничения круга хозяев вирусов, и ставят под сомнение гипотезы о том, что ВОП не может полностью завершить цикл репликации в клетках млекопитающих.

2.8. Патогенез и распространение заболевания 0

Инфекция, вызываемая ВОП, связана с высоким уровнем заболеваемости и смертности в популяциях домашних и диких птиц [40, 144]. Заболевания, вызванные вирусами оспы кур и вирусами оспы индеек, являются наиболее важными для птицеводства. Большинство исследователей описывали случаи заболевания, вызыванные лишь одним изолятом ВОП, поэтому трудно сравнить патогенность различных ВОП у различных видов птиц. Для установления патогенности новых изолятов обычно проводят опыты на курах, но есть случаи, когда ВОП, выделенные от диких птиц, не могут размножаться в данном организме.

Пытаясь идентифицировать и характеризовать патогенность ВОП, ТпраШу и соавт. [50] показали, что изоляты вируса оспы гавайского ворона имели обычно невысокую патогенность при заражений кур, характеризующуюся сравнительно небольшими 'непродолжительными поражениями в месте введения, которые контрастировали с генерализованными обширным пролиферирующим поражениям, формирующимся при заражении изолятами ВОК [50]. В другом экспериментальном исследовании, два изолята ВОП, полученные от исчезающих видов гавайских диких птиц (гавайский гусь (ВгаШа 8апйу1сеп818) и шафрановая вьюрковая цветочница-палила (ЬохШйеБ ЬаШеш)), сравнивались с ВОК при заражении 8РР-цыплят. Уровень антител измерялся методом ИФА до и после иммунизации гавайскими изолятами вируса оспы птиц и после заражения ВОК. Оба гавайских изолята формировали только небольшие непродолжительные по времени поражения

на месте введения вируса и не обеспечили защиты против последующего контрольного заражения вирулентным штаммом ВОК, в результате которого наблюдали сильные поражения. В противоположность высокому уровню антител у кур, иммунизированных ВОК, птицы, иммунизированные обоими гавайскими изолятами, формировали низкий или умеренный уровень противовирусных антител [88]. Описывалось также изучение патогенеза ВОП у попугаев, индеек, голубей и канареек [116]. Канарейки были высоко восприимчивы к вирусу оспы канареек, но показали устойчивость к вирусу оспы индеек, ВОК и вирусу оспы голубей [50]. Вирус оспы, выделенный от канадского гуся (Branta canadensis) передавался домашним гусям, но не передавался курам и домашним уткам [62]. Вирус оспы голубей вызывал слабую инфекцию у кур и индеек, но был более патогенен для голубей [116]. Вирусы, выделенные от сороки (Pica pica) и большой синицы (Parus major) не поражали цыплят, однако, вирус, выделенный от другого близкого вида (Gymnorhina tibicen), вызывал поражения у цыплят [80]. Эти работы основываются на клинических наблюдениях у кур и наводят на мысль о специфичности вируса к видам хозяев и его патогенности. Не смотря на широкую распространённость ВОП, изучение экспериментальных заражений проводится с использованием сравнительно небольшой части изолятов ВОП. Исследования особенно сфокусированы на изолятах ВОК, в то время как опубликовано мало экспериментальных работ об изолятах вируса оспы канареек, перепёлок, вьюрков и голубей [50, 78, 120]. Действительно, приблизительно половина опубликованных исследований о ВОП были посвящены только изолятам ВОК. Механизм передачи вируса, следует изучить для большого количества изолятов, с целью лучшего понимания патогенеза и определения зависимости между иммунитетом и защитой.

Вспышки заболевания, вызываемого вирусом оспы птиц, происходят по всему миру, как среди диких, так и среди домашних птиц. Благодаря тому, что оспа поражает более 278 видов птиц, заболевание в разное время отмечалось и отмечается на всех континентах, за исключением Антарктиды

[40]. При этом ВОП способен персистировать длительное время на ограниченных территориях, где нет постоянного заноса вируса извне. Так происходит к примеру на Галапагоских островах, где вирус был занесён в конце 19 века и выявляется по настоящее время уже в течение 110 лет [17]. Длительное время выявляется вирус и отмечаются вспышки заболевания в Новой Зеландии [56, 141], на Гавайях [136]. Эпизоотии, вызываемые ВОКР среди канареек на Канарских островах зачастую могут угрожать существованию некоторых видов [91].

Наибольший интерес представляют вспышки заболевания, вызываемого ВОК среди домашних птиц, прежде всего кур и индеек. По данным Международного Эпизоотического Бюро в 2005 году заболевание было отмечено во многих странах по всему миру: в США, Канаде, странах Карибского бассейна, Аргентине, Германии, Франции, Португалии, Ирландии, Грузии, Израиле, Ливии, в государствах Центральной и Южной Африки, Индонезии, Малайзии, Южной Корее, Японии, Австралии, Новой Зеландии, странах Тихоокеанского бассейна и других странах. Единичные случаи отмечены в Китае, Индии, Чили [77] (рис.1.). Недавно отмечено выявление ВОК на фермах среди индеек в Мексике (\VVPA, 2011). Вспышка заболевания отмечалась в 2010 году среди 8-недельных бройлеров на ферме в Калифорнии (США) [30]. Есть сообщение о том, что описанное в 2011 году массовое заболевание индеек в Австрии, вызвано вирусом оспы кур. По сообщению 1лд8с1юлу Б с коллегами в течение долгого периода заболевание оспой птиц не было значимо для коммерческого птицеводства в Германии, однако, начиная с 1999 года по настоящее время, повысилось число новых вспышек заболевания. Оспа кур остаётся актуальной проблемой для промышленного птицеводства в Российской Федерации. Так в период с 2009 по 2011 гг. геном вируса оспы птиц был выявлен в 9 пробах из 6 регионов России [7].

Эти данные подтверждают актуальность разработки современных, надёжных и быстрых методов диагностики ВОП и анализа выявляемых изолятов, а также необходимость проведения мониторинговых исследований.

V.AHIDOIE О 2 0121

Рис.1. Распространение заболевания, вызываемого вирусом оспы кур, в 2005 г. по данным МЭБ

2.9. Заболевание

Передача вируса может происходить механическим путём через повреждения кожи или, чаще, с помощью переносчиков, через укусы насекомых, таких как комары и москиты [114]. В качестве носителей вируса оспы могут выступать одиннадцать видов двукрылых насекомых [37]. В распространение вируса оспы птиц могут быть также вовлечены клещи, например, Dermanyss gallinae [123]. В организме комаров вирус сохраняется (без размножения) более 200 дней, в организме клещей - 97 дней, клопов -35 дней, мух-жигалок и москитов - 20 дней [1]. Отмечена механическая передача вируса оспы птиц от инфицированных индюков индейкам при искусственном осеменении [148]. При обращении с птицами во время вакцинации люди могут переносить на руках и одежде вирус, который затем может попасть в глаза восприимчивых птиц. Аэрозоли от больных птиц, или проглатываемые заражённые корма и вода также представляют собой источники вируса [54]. В условиях зараженной вирусом окружающей среды

аэрозоль, образованный перьями и высохшими струпами, содержащими вирусные частицы, обеспечивает возможность инфицирования через раны на коже и верхние дыхательные пути. Клетки слизистой оболочки верхних дыхательных путей и ротовой полости очень чувствительны к вирусу. Именно там может начаться развитие инфекции в отсутствии очевидных травм и ран [5].

Инкубационный период при. естественном инфицировании колеблется примерно от 4 до 14 дней у кур, индеек и голубей, до 4 дней — у канареек. В некоторых стаях вирус может существовать в виде латентной инфекции [143]. Заболевание наиболее часто характеризуется кожными пролиферирующими поражениями, представляющими собой эпителиальную гиперплазию эпидермиса, что в результате приводит к формированию бородавчатых выступов (оспин). Первоначально они ограниченны неоперёнными частями тела, такими как лапы, ступни, веки, основание клюва. После выздоровления и исчезновения поражений кожи, обычно видимы рубцы. Смертность у диких птиц обычно низкая, зависит от числа и размера пролиферативных поражений. Однако если инфекция на неоперённых участках тела происходит вместе с вторичной бактериальной инфекцией, то смертность может быть высокой [152]. Другой, менее распространённой формой инфекции, вызываемой ВОП, является влажная дифтерическая форма [100], которая проявляется в виде фибро-некротических и пролиферирующих поражений слизистых оболочек пищеварительного и верхнего отдела респираторного трактов и которая характеризуется обычно более высокой смертностью, по сравнению с кожной формой [144]. В некоторых случаях у птиц наблюдается одновременно и кожная и дифтерическая форма заболевания, в этих случаях уровень смертности намного выше, чем только при кожной форме. Не смотря на многообразие организмов хозяев и вирусных штаммов, наблюдаются общие патологические признаки у инфицированных домашних птиц, хотя клиническая картина сильно зависит от вирулентности вируса, восприимчивости хозяина, распространения и типа поражений [144].

Влияние оспы на кур обычно проявляется в истощении и плохом наборе веса. При инфицировании несушек у них задерживается время начало несения яиц. Болезнь длится приблизительно 3-4 недели, но при наличии осложняющих факторов срок может быть гораздо длиннее. У кур отмечают кожную (оспенную), дифетрическую, смешанную и атипичную (или скрытую -с поражениями внутренних органов) формы оспы кур. При кожной форме на коже гребня, сережок, вокруг клюва и носовых отверстий, в окружности клоаки, на неоперённых участках ног и тела появляются оспины. Они формируются в течение 1-2 недель, остаются обособленными, величиной 0,40,6 см или сливаются, образуя сплошное поражение. Дифтеритические поражения локализуются преимущественно в ротовой полости, около углов клюва, на языке, небе, щеках, вокруг и внутри гортани, иногда в трахее. Смертность при кожной форме до 5-8%, при дифтеритической и смешанной, особенно у молодняка до 50-70%. У кур несушек возможно снижение яйценоскости на 40-50% [1].

В течение вспышек оспы птиц, смертность у канареек и других мелких птиц может достигать 80-100%. Канарейки болеют оспой в очень тяжёлой форме, сопровождающейся массовой гибелью. При сверхостром течении канарейки погибают без видимых клинических признаков, практически внезапно. При остром течении (лёгочная форма) гибель происходит в течение 2-3 дней. Болезнь сопровождается отдышкой, конъюктивитом. В углах клюва формируются кожные утолщения [1].

Значительная смертность наблюдается также у перепелов при инфицировании их вирусом оспы перепелов. В противоположность этому, у кур и индеек смертность обычно ниже [144]. Однако в тяжелых случаях она может быть выше 50%.

Заболеваемость и смертность от оспы среди голубей и попугаев примерно такие же, как у кур [5]. У голубей при кожной форме струпчатые оспенные очаги образуются в области клюва, вокруг носовых и ушных отверстий, около глаз. Поражение глаз сопровождается светобоязнью,

слезотечением, иногда склеиванием век, разрушением глазного яблока и утратой зрения [1].

При коммерческом разведении индеек задержка роста имеет большую финансовую значимость, чем смертность. У индеек оспа чаще протекает хронически и может наблюдаться в хозяйстве месяцами. Оспа индеек характеризуется более частым поражением желудочно-кишечного тракта, при этом в большей степени поражается зоб и железистый желудок, в меньшей -кишечник. Большая часть потерь связана со слепотой из-за кожных глазных поражений и голоданием. Если оспа поражает птиц маточных стай, может наблюдаться снижение яйценоскости и нарушение фертильности. При неосложненной слабой инфекции болезнь в стае может длиться 2-3 недели. Сильные вспышки часто длятся 6, 7 и даже 8 недель [1,5].

Имеется взаимосвязь между ВОК и ретровирусом птиц -ретикулоэндетелиальным вирусом (РЭВ). Однако, возможная роль одновременной инфекции РЭВ, возникающей из провируса, интегрированного в геном ВОК, в ходе проявления вспышки инфекции ВОК, остаётся неопределённой. Хорошо известно, что инфекция, вызываемая РЭВ, приводит к иммуносупрессии у инфицированных птиц [131]. Таким образом, можно предположить, что наличие РЭВ при инфекции ВОК может осложнять ход заболевания.

Не смотря на тот факт, что некоторые клеточные линии млекопитающих могут поддерживать репликацию ВОП, это не служит доказательством того, что ВОП вызывают развитие заболевание у человека, в противоположность тому, что известно для других вирусов оспы, таких как некоторые вирусы параоспы [107].

2.10. Антигенная и генетическая вариабельность и филогения ВОП

Современные знания об антигенных вариантах ВОП основываются на изучении ограниченного числа вирусных изолятов в реакциях, включающих связывание комплемента, пассивную гемагглютинацию, преципитацию в агаровом геле, иммунопероксидазный метод, вирусную нейтрализацию и

иммунофлюоресценцию [52, 78, 120]. Помимо иммунологических методов, вариабельность ВОП также изучалась с помощью генетических методов, таких как рестрикционный анализ [145]. Сравнивали геномы ВОК и вируса оспы перепёлок, обработанные рестриктазами ВашН1, ЕсоШ, и НтсИН, при этом наблюдались отличия в структуре получаемых фрагментов между изолятами. Структура фрагментов рестрицированных геномов трёх изолятов вируса оспы перепёлок была очень похожей между собой. Однако когда определяли иммуногенные белки трёх изолятов ВОК, двух изолятов вируса оспы перепёлок, вируса оспы юнко и вируса оспы голубей методом иммуноблотинга, фиксировали как и сходные так и уникальные антигены. Наибольшие различия наблюдались между вирусом оспы перепёлок и ВОК, показывающие большую изменчивость между ними, на которую указывает разница в иммуногенности и антигенных свойствах, включая чувствительность в реакции нейтрализации [5]. Общепринятым методом для видовой идентификации вирусов оспы является секвенирование, основанное на использовании ПЦР и гибридизации со специфическими праймерами [91]. Этот метод основывается на быстром генетическом анализе единичных генов или нескольких генов, которые показывают межвидовую вариабельность [92].

Понимание филогении ВОП важно для понимания специфичности к видам хозяев и вирулентности, а также для понимания изменчивости различных вирусов. Не смотря на то, что доступны полные геномные последовательности ВОК и ВОКР [139, 140], малоизвестно о филогении ВОП. Это, возможно, связано со сложностью выбора общеродовых или видоспецифичных праймеров, которые могут использоваться для амплифицирования различных генов. Наиболее общепринятым локусом для ПЦР, является локус Р4Ь [91]. Недавние работы по филогении изолятов ВОП, основанные на анализе данного локуса [92, 151], показали, что большинство изолятов группируются в две группы вокруг ВОК и ВОКР, в то время как в другой работе, основанной на анализе того же локуса, показана третья

группа: вирусов оспы попугаев. При этом изоляты некоторых крупных групп вирусов, таких как вирусы оспы голубей и индеек, не формируют отдельной группы, а распределяются по разным группам [31]. Это говорит о том, что вирусы различных генетических групп могут вызывать заболевания у голубей и индеек. Частичное секвенирование генома ВОКР в районе локуса тимидинкиназы [84] показало неожиданно большую разницу с ВОК. Это подтвердилось, когда был получена полногеномная последовательность ВОКР [139], позволившая полностью сравнить его с ВОК [140]. Большую разницу между этими вирусами иллюстрирует тот факт, что гомологичный ген Р4Ь, кодирующий консервативный коровый белок массой 75,2 Ша, найденный у всех вирусов оспы [24, 91] имеет аминокислотную идентичность только 64,2% у ВОК и ВОКР. При этом следует отметить высокую идентичность как нуклеотидных, так и белковых последовательностей, внутри групп вирусов, превышающую 90% для каждой группы [140].

Недостаточно полная картина о филогенетических отношениях вирусов оспы птиц объясняется тем, что большинство знаний касающихся вирусов оспы птиц основывается на изучении клинических изолятов от заболевших птиц. Инфекционная история таких изолятов часто неясна. Однако важно проводить широкомасштабные исследования, такие, как проводились на Канарских островах [91], которые включают изучение природных вирусов, иногда вызывающих субклинические проявления, в природных популяциях. Подобные исследования, проведённые недавно в Новой Зеландии [56] показали наличие циркуляции вирусов трёх субкладов у птиц различных систематических групп при исследовании гена Р4Ь. При этом наибольшее число изолятов (74%), циркулирующих в том числе и среди эндемичных видов птиц, на 100% гомологично вакцинному аттенуированному штамму НР-В, используему для вакцинации домашних птиц. Изоляты двух других субкладов гомологичны изолятам от голубя и альбатроса, выделенным в Европе, и изоляту от канареек, выделенным на Канарских островах [56].

Особенность подхода к таксономии ВОП на основании вида хозяина состоит в том, что род или вид птиц у которого вирус вызывает сильное заболевание, и, по этой причине от которого наиболее легко может быть выделен, не обязательно является природным резервуаром вируса, что зачастую подтверждается анализом последовательностей генов этих вирусов [31]. В этом контексте можно отметить отчёт [19] описывающий близко связанные последовательности гена Р4Ь от широкой группы различных птиц, представленных в центре дикой природы в Вирджинии, США в 2003-2004. Вирусы формировали тесную генетическую подгруппу, по сути формируя новый субклад. При этом круг видов-хозяев включает такие кардинально различные виды птиц, как серо-голубая комароловка, пересмешник (Mimus polyglottes), мексиканская чечевица (Carpodacus mexicanus) и большая голубая цапля (Ardea herodias).

Недавняя работа, основанная на анализе трёх генов, включая Р4Ь, показывает, что вирус оспы пингвинов, выделенный из поражений вокруг глаз африканского пингвина (Spheniscus demersus), был наиболее тесно связан с вирусами оспы индеек, страусов и голубей [48].

Эти данные указывают на необходимость изучения не только ВОП выделяемых от домашних птиц, но и на выявление и изучение вирусов от диких и синантропных птиц. 2.11. Диагностика инфекции, вызываемой ВОП Клиническая диагностика

Клинические признаки у инфицированных птиц представлены различными поражениями кожи, варьирующими от папул до наростов. Большие поражения при обеих и кожной и дифтерической форме наблюдаемые у птиц и при последующем вскрытии, обычно достаточны для подозрения на инфекцию ВОП [144]. Но этих признаков иногда недостаточно для окончательной постановки диагноза болезни, вызываемой как ВОП, так и другими агентами, такими как вирус папилломы, клещи лап (scaly leg mites) [5] и микотоксины, которые могут вызывать схожие поражения кожи [144].

Кандидоз, нематодоз кишечника и трихомониаз могут вызывать поражения ротовой полости, сходные с дифтерической формой инфекции, вызываемой ВОП [110]. Поэтому важно сохранять пробы и подтвердить вирусную этиологию инфекции. Лабораторная диагностика Гистопатология и электронная микроскопия

Подозрение на инфекцию ВОП может быть подкреплено, если это возможно, вскрытием, особенно если в ротовой полости обнаруживается дифтерическая форма. Последующие гистологические исследования срезов тканей, окрашенных классическим методом Гимзы, могут выявить типичные большие, сплошные или кольцеобразные, эозинофильные внутрицитоплазматические включения, известные как тельца Боллингера [18]. Просвечивающая электронная микроскопия также может точно подтвердить наличие инфекции ВОП, продемонстрировав вирусные частицы ВОП внутри телец включений. Идентификация ВОП может также проводиться методом электронной микроскопии инфицированных клеток с негативным окрашиванием 2% фосфорновольфрамовой кислотой. Этот метод обычно использовался национальными референтными или исследовательскими лабораториями для идентификации ВОП [151]. Вирусовыделение

Доказательство инфекционности вируса введением в ХАО куриных эмбрионов гомогената клинических проб, полученных из типичных для ВОП кожных поражений, является «золотым стандартом» в диагностике ВОП, не смотря на то, что некоторые штаммы ВОП плохо растут на куриных эмбрионах [80]. Оспенные поражения размером 0,5-1,5 мм наблюдаются на мембране на 3-5 день после заражения, в зависимости от вирулентности вируса [62]. Другой метод выделения ВОП заключается в вырезании и гомогенизации поражений кожи, с последующей инокуляцией гомогенизированного супернатанта в чувствительную культуру клеток, такую как ФЭК. В результате формируется ЦПД в течение 4-6 дней после

введения, в зависимости от изолята вируса и множественности инфекции [50].

Биопроба

Биопробу проводят на клинически здоровых курах свободных от антител к вирусу оспы. Исследуемый материал втирают стерильной щеточкой в слегка скарифицированную поверхность гребня или фолликулы голени, освобождённые от перьев. Также возможно заражение путём прокола в перепонку крыла. Положительная биопроба сопровождается развитием на пятый-седьмой день после заражения оспенных поражений на гребне и типичного для оспы фолликулита на голени [1].

Серологический анализ

Удобные серологические методы пассивной нейтрализации и иммунодиффузии в агаровом геле продолжают повсеместно использоваться для наблюдения и контроля за заболеванием у различных видов домашних птиц [36; 105, 134], не смотря на наличие современных молекулярных и иммунологических методов. Эти методы более затратные по времени, особенно когда исследуется большое количество сывороток, и их чувствительность ниже по сравнению с другими методами, такими как иммуноферментный анализ (ИФА) [25]. ИФА описан как не видоспецифический метод для птиц [46]. Он быстрее и легче для обнаружения антител ВОП, особенно когда исследуется большое количество проб. ИФА чувствительнее по сравнению с реакцией нейтрализации [49, 46]. Разработаны и используются методики ИФА для определения эффективности вакцинации коммерческой и дикой птицы против ВОК, когда иммунодиффузия в агаровом геле неэффективна вследствие недостаточной наработки преципитирующих антител [70, 88]. Молекулярные методы для детекции и характеристики

ВОП всё больше выявляется и характеризуется с помощью ПЦР, методом выявления полиморфизма рестрикционных фрагментов, саузерн-блоттинга и секвенированием определённых генов, таких как гена корового

белка Р4Ь [23, 91, 92]. ПЦР позволяет выявить вирусную нуклеиновую кислоту во многих случаях с более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с культуральным методом [91]. Помимо гена Р4Ь для диагностики и характеристики ВОП исследовались другие гены, такие как гены, кодирующие три иммунодоминантных антигена ВОП: Бру140, Рру168 и Рру191 [83], с использованием различных праймеров и секвенирования специфических генов. Разработаны системы на последовательность гена тимидинкиназы [84]. Предложен гнездовой вариант ПЦР на участки данных генов (Р4Ь и тимидинкиназы), что повышает чувствительность метода [8]. Секвенирование ПЦР ампликонов позволяет быстро найти гомологичные последовательности в базах данных для подтверждения и выявления филогенетического родства. Сообщается, что анализ локуса Н9, включающего рамку считывания Рру241, позволяет проводить различия между некоторыми полевыми и вакцинными европейскими изолятами [31].

Для диагностики возможно также использовать полиморфизм длины фрагмента, который может быть обнаружен непосредственно в ПЦР без рестрикционного анализа, при использовании локуса фу140 [83].

В настоящее время в лабораторной диагностике нашел широкое применение метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). В частности, для дектеции генома оспы птиц предложена ПЦР в режиме реального времени с праймерами на консервативную область гена Р4Ь [4, 121]. ПЦР в режиме реального времени использовали для выявления рекомбинантного ВОП в индивидуальных бляшках. Этот метод исключает необходимость амплификации и гибридизации, как при обычной методике, и позволяет значительно сэкономить время при каждом цикле очистки вируса на бляшках [57]. Представлен гнездовой вариант ПЦР в режиме реального времени на ген Р4Ь, использованный для детекции ДНК ВОП в пробах крови птиц Hemignathus \1геп8 [136]. Перспективным направлением представляется разработка мультиплекс ПЦР-РВ для

диагностики ВОП и других инфекционных агентов, вызывающих сходную клиническую картину, таких как вирус папиломы [22]. 2.12. Профилактика и лечение

Как и для большинства вирусных инфекций, для инфекции вызываемой ВОП нет специфического лечения [41]. Доступное лечение включает использование йод-глицериновых компрессов на пролиферирующие поражения кожи для лучшего заживления, применение антибиотиков для предотвращения вторичных бактериальных инфекций и витамина А для лучшего выздоровления [59].

Экономическая целесообразность контроля за заражением птиц ВОП требует недорогих стратегий защиты при сохранении эффективности защиты. Профилактика заболевания может быть достигнута вакцинацией [41]. Дойл [67] впервые описал возможность использования живого ВОК или вируса оспы голубей для вакцинации против инфекции, вызываемой ВОК. С того времени, разработаны и используются рекомбинантные и живые модифицированные вакцины для предотваращения заражения вирусом оспы птиц кур, голубей, индеек и перепелов [28, 85, 102, 125].

Эти вакцины очень эффективны и, несомненно, в большой степени содействовали предотвращению заболеваний в птицеводческих хозяйствах [106; 125]. С тех пор различные ВОП выделены от различных видов птиц, и только некоторые изоляты были охарактеризованы. Разработка таксон-специфических вакцин, предназначенных для всех видов птиц трудна. Имеющиеся вакцины часто применялись в фундаментальных экспериментах для большего понимания молекулярной биологии, патологии и эпидемиологии этих вирусов, что необходимо для разработки вакцин, которые будут эффективно защищать различные виды птиц [152].

В Росси также разработан ряд вакцин для профилактики заболевания, вызываемого ВОП. Ранее в нашей стране использовали вакцины на основе штаммов «Нью-Джерси» и «27-АШ» (11; 13). В настоящее время вакцины готовят из иммуногенных, ареактивных штаммов гетерологического вируса

оспы голубей (шт. Н), из природоослабленных штаммов вируса оспы кур или аттенуированных на культуре клеток вирусов оспы кур (шт. К и шт.ВГНКИ 3/7). Чаще всего культивирование проводят в культуре клеток куриных эмбрионов [10]. Продолжаются работы по изучению свойств, усовершенствованию и оптимизации использования существующих вакцин [2, 3, 16], а также по разработке новых [12]. 2.13. Вирус оспы птиц и вирус ретикулоэндотелиоза (РЭВ)

Профилактика ВОК в промышленном птицеводстве достигается, прежде всего, вакцинацией живым ВОК или генетически сходными с ним штаммами ВОКР, полученными на ФЭК [144]. Отмечалось большое количество вспышек в вакцинированных стадах, что наводит на мысль о неэффективности некоторых вакцин, использованных против заболевания [26]. Было показано, что в США коммерческая вакцина портив ВОК, оказалась контаминирована РЭВ и вызывала лимфому у бройлеров. Было показано, что последовательность генома РЭВ интегрирована в геном вакцин против ВОК, также как и в геном полевых изолятов ВОК [89, 98, 125, 127]. Сайт интеграции генома РЭВ неизменный, в то время как размер интегрируемых фрагментов различается у разных изолятов и штаммов. Выделяют два различных типа интегрированных последовательностей: длинные концевые повторы размером приблизительно 200-600 п.н. и почти полноразмерный провирус РЭВ приблизительно 8000 п.н. [76, 89, 127]. Большинство вакцинных штаммов имеют только длинные концевые повторы, в то время как полевые изоляты ВОК имеют полноразмерный провирус. Сингх и др. [125], однако, обнаружили длинные концевые повторы РЭВ различного размера в геноме не только двух коммерческих вакцин против ВОК, но и в геноме четырёх полевых изолятов. Несколько исследователей показали, что источником РЭВ инфекции были контаминированные вакцины против ВОК- [26, 33, 115] и герпесвируса индеек [33, 115, 119, 154]. Ретикулоэндотелиоз - это онкогенное и иммуносупрессивное заболевание. Описано, что штаммы РЭВ вызывают

заболевание, характеризующееся хронической лимфомой, неопластическими поражениями и синдромом карликовости у кур, индеек и перепелов [109, 153]. РЭВ входит в группу ретровирусов птиц, включающую дефективный РЭВ-Т и не дефективный РЭВ-А, вирус некроза селезёнки, вирус инфекционной анемии утят и синтициальный вирус кур [153]. Наличие РЭВ в вакцинах против ВОК и случающиеся неудачи в использовании вакцин портив ВОК для создания высокого уровня иммунологической защиты против заражения полевыми изолятами ВОК являются важными проблемами для птицеводства [71], что показывает необходимость разработок альтернативных вакцин.

2.14. Вирусы оспы птиц в качестве вакцинных векторов

Аттенуированные штаммы вирусов оспы птиц имеют долгую и безопасную историю применения в качестве вакцин [58]. Наиболее изученные и доступные аттенурованные штаммы оспы кур - производные вирулентного штамма НР-1 [75]. Вирусы, прошедшие более 200 пассажей на ФЭК, считают аттенуированными, но они всё ещё реплицируются в куриных эмбрионах и обладают остаточной патогенностью для кур при внутривенном или аэрозольном введении. Вирусы, пассированные более 400 раз, считают непатогенными при любых способах заражения. Эти штаммы плохо реплицируются на куриных эмбрионах и в тоже время хорошо реплицируются на ФЭК. Когда рассматривается разработка нового вектора на основе вируса оспы птиц для получения вакцины для птиц, рекомендуется использование аттенуированных штаммов для снижения риска и возможных последствий при распространении вируса на другие виды птиц [132].

Однако возникает необходимость новых подходов в вакцинации. Использование живого вирусного вектора для доставки и презентации иммуногенных антигенов является привлекательным подходом, имеющим преимущества перед традиционными платформами благодаря более высокому качеству и силе иммунного ответа.

Было показано, что вектор NYVAC индуцирует CD4+ Т-клеточный ответ, в то время как модифицированный вакцинный вирус Анкара (modified vaccinia virus Ankara (MVA)) индуцирует сильный CD8+ Т-клеточный ответ и сопоставимый CD4+ Т-клеточный ответ, что необходимо для защиты [65].

В настоящее время широкий круг семейств вирусов используется для работ в качестве вакцинных векторов для человека и животных. Среди них ВОК и ВОКР представляют огромный интерес в качестве векторов, и некоторые ветеринарные векторные вакцины на основе вирусов оспы птиц уже лицензированы и используются в Северной Америке, Южной Америке и Европе [152]. Наиболее важными характеристиками векторных вакцин на основе оспы птиц, является то, что они, в отличие от большинства других ДНК вирусов, реплицируются в цитоплазме инфицированной клетки и ферментативные функции, используемые для транскрипции и репликации, обеспечиваются самим вирусом [101, 111]. Другие аргументы за использование ВОП-векторов: (1) возможность приспосабливать, встраивать и эффективно экспрессировать большое количество чужеродной ДНК или сразу несколько генов, кодирующих разные антигены [106], (2) они не могут полность завершить репликативный цикл в клетках любых организмов, кроме птиц [43, 104, 117], (3) антитела против вирусов оспы млекопитающих не нейтрализуют ВОП и, поэтому предшествующая вакцинация вирусом осповакцины не снижает иммуногенности векторов на основе ВОК и ВОКР, (4) известно, что ВОК и ВОКР не вызывают выработку высокого уровня нейтрализующих антител, что позволяет использовать эти вектора несколько раз без уменьшения защиты, в отличие от вируса осповакцины. Эта отличительная черта критична для терапевтических вакцин, для которых необходима повторная усиливающая прививка[112].

ВОП-векторные вакцины использовались в качестве вакцин против некоторых инфекций животных, включая вирус лихорадки Западного Нила, вирус чумки собак, вирус лейкемии кошачьих, вирус бешенства и вирус гриппа лошадей [38]. Наиболее заметен среди них TRO VAC AI Н5 -

рекомбинантный ВОК, который экспрессирует Н5 антиген вируса гриппа птиц. Этот продукт имеет лицензию на использование в США в экстренных случаях для вакцинации кур с 1998 года и широко использовался в Центральной Америке [63]. Векторная вакцина ALVAC на основе ВОКР недавно была зарегистрирована для ветеринарного использования в ЕС (Proteq-Flu) и США (Recombitek) [97]. Она представляет собой вакцинный ВОКР, экспрессирующим гены гемагглютининов H3N8 штамма вируса гриппа лошадей, и содержит полимерный адьювант (Carbopol; Menai Ltd.). Она стимулирует и клеточный и гуморальный иммунитет. Вакцины TROVAC и ALVAC, были проверены в большом числе исследований, которые показали их безопасность при использовании на различных видах, иммунодепрессивных животных и волонтёрах [79].

Не смотря на то, что размножение ВОП ограничено только птицами, аттенуированные штаммы вирусов оспы птиц являются эффективными и чрезвычайно безопасными векторами для млекопитающих. Было показано, что инокуляция рекомбинантного вируса на основе оспы птиц в клетки млекопитающих приводила к экспрессии чужеродного гена и индуцировала протективный иммунитет при введении в организм млекопитающих [68, 137]. Даже если ВОП обычно не реплицируются в млекопитающих, вакцинные вектора могут передаваться в популяции птиц через популяции млекопитающих. Возможно также, что вектор путём спонтанных мутаций и рекомбинаций приобретет способность реплицироваться. Принимая это во внимание, в процессе разработки и создания вирусных векторов нужно, чтобы минимум два гена, отвечающие за распространение и репликацию, были выключены делециями, для того, чтобы не произошло восстановления способности к репликации. Насколько известно, таких реверсий не наблюдалось в клинически испытанных ВОП-векторных вакцинах.. Несмотря на это, возможность репликации ВОП в некоторых клетках млекопитающих [86, 150] показывает, что необходимо ещё много узнать о механизмах репликации и о взаимодействии с организмами хозяевами этих

вирусов, включая уход от иммунного ответа, механизмы клеточного

тропизма и ограничения круга хозяев.

Заключение

ВОП вызывают экономически значимое для птицеводства заболевание, а также заболевание декоративных и диких птиц. Поэтому всегда будут необходимы профилактические мероприятия, такие как своевременная диагностика с последующей идентификацией вируса и вакцинация. Поэтому необходимы более эффективные, быстрые, надёжные методы диагностики, позволяющие типировать вирус ВОП, а также дифференцировать вакцинные и полевые изоляты. Наиболее перспективными методами для этого являются молекулярные методы диагностики, такие как ПЦР, ПЦР в режиме реального времени и секвенирование участков генома ВОП. ВОП не зоонозные вирусы, и они не могут проходить полный цикл репликации в клетках млекопитающих. Однако недавно было показано, что ВОК может реплицироваться и продуцировать зрелые вирионы в некоторых определённых клеточных линиях млекопитающих. Это иллюстрирует тот факт, что знания о природе ВОП ещё недостаточны. Действительно, только несколько изолятов были охарактеризованы и классифицированы. Изучение биологических свойств изолятов ВОП, таких как, механизмы ограничения круга хозяев, патогенез, иммунитет к вирусу и стратегии ухода вируса от иммунного ответа критически важны для контроля заболеваний, вызываемых ВОП. Помимо этого важной задачей является разработка новых безопасных вакцин. Многообещающим подходом использования ВОП в качестве вектора для рекомбинантных вакцин, является повышение эффективности и избегания контаминации РЭВ и другими агентами. Для этого также важно наличие надёжных методов выявления РЭВ в геноме ВОП на основе ПЦР и ПЦР-РВ.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 3.1. Материалы

Вирусы. В работе использовали изоляты ВОП, выделенные из полевых образцов, отобранных от кур, голубей и диких птиц на территории Российской Федерации в 2008-2012 гг., изоляты ВОП, полученные из ННЦ «ИЭКВМ» (г. Харьков, Украина), штамм для контрольного заражения Кучинский (ФГБУ «ВГНКИ», Москва), вакцинные штаммы ВОП: КЭМ-7 (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), HP-B (AVINOVA), «К» (Авивак), ВГНКИ 3/7 («ПЗБ», Покров), Gibbs (Авивак) (табл.1). Для оценки специфичности разработанных методов ПЦР использовали другие ДНК-содержащие патогены птиц, а также вирус осповакцины (табл.2).

Куриные эмбрионы. Использовали 9-11-суточные SPF-эмбрионы кур фирмы Lohman Tierzucht (Германия).

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Елаткин, Николай Павлович

6. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методы полимеразной цепной (ПЦР) и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с рекомбинантными положительным и внутренним контрольными образцами для выявления ВОП, аналитическая чувствительность которых составила 101'4 ЭИД50/мл (8,1 копийДНК/реакцию) и 1,19 ЭИД50/мл (2,0 копий ДНК/реакцию), соответственно. С помощью разработанных методов геном ВОП выявили в 18 пробах.

2. В результате проведенных гистологических исследований эпителиальных тканей кожи кур, зараженных вирусом оспы кур изолята Chicken/RusIvanovo/FPV/l 857/10, были обнаружены характерные эозинофильные тельца включений.

3. Определена первичная нуклеотидная последовательность фрагмента гена Р4Ь размером 578 п.н. и гена Fpvl40 размером 1983 п.н. 18 изолятов ВОП, 5 вакцинных и штамма ВОК «Кучинский». В результате проведённого филогенетического анализа установлено, что 22 изолятов и штаммов ВОП относятся к вирусам оспы кур, в то время как 2 изолята относятся к вирусам оспы голубей.

4. Разработан метод для амплификации участка гена Р4Ь 1281 п.н. на основе ПЦР. По результатам филогенетического анализа изолятов и штаммов ВОП было показано высокое внутривидовое сходство вирусов по этому участку гена.

5. Определены первичные нуклеотидные последовательности генного локуса Н9 14 изолятов ВОП, 5 вакцинных и полевого штамма ВОК «Кучинский». Анализ последовательностей данного локуса позволяет дифференцировать полевые изоляты от вакцинных штаммов.

6. Разработаны методы ПЦР для выявления генома вируса ретикулоэндотелиза птиц и для выявления сайта встраивания генома РЭВ в геном ВОП. Анализ 18 изолятов ВОП, 5 вакцинных и одного полевого штамма ВОК на наличие встройки генома РЭВ показал, что в геноме всех полевых изолятов ВОК имеется полная геномная последовательность РЭВ, в то время как в вакцинных штаммах - только длинные концевые повторы РЭВ.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В результате проведенных исследований разработаны следующие нормативные документы:

- «Методические рекомендации по выявлению вируса оспы кур с помощью полимеразной цепной реакции» (2010 г.);

- «Методические рекомендации по выявлению ДНК вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с рекомбинантным положительным контролем» (2011 г.)

Данные методические рекомендации прошли комиссионные испытания, были одобрены Учёным советом, утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» и рекомендованы для использования при проведении диагностических и научных исследований.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование современных методов диагностики инфекционных заболеваний, основанных на выявления генетического материала возбудителя, имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными лабораторными методами. Так молекулярно-генетические методы позволяют получить результат исследования за более короткий период времени, что значительно ускоряет процедуру постановки диагноза. Изучение структуры генома позволяет дать индивидуальную характеристику выявленного изолята, которая при сравнительном анализе может служить основой для определения его филогенетической принадлежности, а также определения возможных источников и путей распространения. Вместе с тем традиционные методы исследования, такие как вирусовыделение в SPF-эмбрионах кур и гистологические исследования, не теряют своей актуальности и остаются «золотыми стандартами» при проведении диагностических исследований на наличие ВОП.

В настоящем исследовании были разработаны методы ПЦР для выявления и дифференциации ВОП. Методы включают ПЦР и ПЦР-РВ, в которых геном-мишенью является ген Р4Ь. Оба метода включают рекомбинантный положительный контрольный образец, а метод ПЦР-РВ внутренний контрольный образец, который позволяет контролировать процесс выделения и исключать ложноотрицательные результаты вследствие ингибирования ПЦР или старения реактивов. При разработке метода ПЦР-РВ с ВКО был определен такой важный параметр реакции, как эффективность амплификации, что позволило оценить эффективность работы тест-системы и дать более полную характеристику разработанному методу. Было установлено, что для системы праймеров на ген Р4Ь, эффективность амплификации при внесении ВКО снизилась с 86,6% до 81,2%

С использованием различных изолятов и штаммов ВОП методы ПЦР и ПЦР-РВ были оптимизированы по температурному профилю реакции и составу реакционной смеси.

Аналитическая чувствительность разработанного метода ПЦР, определенная с разведениями препарата вакцинного штамма "КЭМ-7" вируса оспы кур, составила 10м ИЭД50/мл или 0,125 ИЭД5о/реакцию, а при использовании в качестве матрицы рекомбинантной плазмиды - 1620 копии/мл или 8,1 копии/реакцию.

Аналитическая чувствительность метода ПЦР-РВ, определенная с разведениями препарата вакцинного штамма "КЭМ-7", вируса оспы кур составила 1,19 ЭИД50/мл или 0,059 ЭИД50/реакцию, а при использовании в качестве матрицы рекомбинантной плазмиды - 400 копии/мл или 2,0 копии/реакцию.

Тестирование специфичности ПЦР и ПЦР-РВ проводили в присутствии вируса осповакцины и различных ДНК-содержащих патогенов птиц (Mycoplasma gallisepticum, вирус инфекционного ларинготрахеита, аденовирус, вирус болезни Марека). Результаты показали, что неспецифической амплификации отмечено не было, а разработанные методы специфично выявляли ДНК ВОП.

С использованием разработанных методов было исследовано 65 проб патологического материала от кур, голубей и диких птиц, поступивших в период с 2008 по 2012 гг. В результате проведенных исследований методом ПЦР и ПЦР-РВ вирус оспы птиц был выявлен в 16 пробах из 10 регионов России, а также 2 пробах с Украины. Из 18 положительных проб, 15 проб были получены от кур и 3 пробы от голубей. Все положительные пробы были получены в весенний и осенний период, что может быть следствием сезонности распространения заболевания.

Были проведены гистологические исследования кожных тканей перепонки крыла с характерными поражениями через две недели после внутрикожного заражения вирусом оспы кур изолята Chicken/RusIvanovo/ FPV/1857/10. В результате проведённых исследований в гистологических препаратах были обнаружены характерные оспенные поражения: эозинофильные серповидные тельца включений, увеличенные в размере клетки в два-три раза по сравнению с отрицательным контролем, паутиновидные цитоплазматические структуры.

Анализ филогенетических дендрограмм, построенных на основе нуклеотидных последовательностей гена Р4Ь, позволяет выявить наличие трёх генетических групп среди вирусов оспы птиц: вирусов оспы кур и схожих с ними вирусов, вирусов оспы канареек и схожих с ними вирусов и вирусов оспы попугаев. Отличия нуклеотидных последовательностей между представителями этих генетических групп достигают значения 18,3%. Среди вирусов оспы кур и вирусов, схожих с ними, можно выделить пять подгрупп. В генетической группе вирусов оспы канареек и схожих с ними вирусов можно выделить четыре подгруппы. В группу вирусов оспы попугаев входит одна подгруппа. Все выделенные в ходе работы изоляты из России и Украины относились к группе вирусов оспы кур и схожих с ними вирусов. Все изоляты от кур относятся к подгруппе 1, к которой относится большинство изолятов от кур со всего мира. К этой подгруппе относится и изолят, выделенный от голубя в районе птицефабрики, от кур с которой одновременно выявляли ВОП. Другие два изолята от голубей, исследованные в ходе нашей работы, из России и Украины относятся к подгруппе 4, в которую кроме всего прочего объединены три изолята от голубей из Германии, Индии и Англии.

Для того чтобы увеличить участок анализируемой последовательности гена Р4Ь были подобраны праймеры, позволяющие амплифицировать участок гена размером 1281 п.о. По результатам сравнительного анализа двенадцати последовательностей расширенного участка гена Р4Ь изолятов ВОП, была установлена очень высокая идентичность их нуклеотидных последовательностей (99-100%), за исключением изолята, выделенного от голубя (приблизительно 96%).

Был проведен анализ последовательностей гена фу 140 изолятов ВОП. При этом наблюдается полиморфизм длины этого гена. Между исследованными изолятами вируса кур и голубей, различие составляет 14 п.н. На основании выравнивания 43 последовательностей была построена дендрограмма, отражающая генетическое родство изолятов и штаммов вирусов оспы птиц по участку гена фу 140. Анализ нуклеотидных последовательностей гена фу 140 позволяет выявить наличие трёх генетических групп: вирусов оспы кур и схожих с ними вирусов; вирусов оспы голубей, индеек и схожих с ними вирусов, а также вирусов оспы канареек и схожих с ними вирусов. Первая группа (вирусов оспы кур) включает в себя все представленные последовательности изолятов, выделенных от кур, включая те, которые получены в ходе нашей работы. Сюда же входит изолят вируса, выделенный нами от голубя, отловленного в районе птицефабрики. Другие два изолята от голубей, исследованные в ходе нашей работы, из России и Украины относятся к группе вирусов оспы голубей, индеек и схожих с ними вирусов. Анализ данного гена в отличие от гена Р4Ь позволяет дифференцировать вирусы индеек от вирусов голубей.

Был проведен анализ нуклеотидных последовательностей локуса Н9, который может быть потенциально использован для различия полевых изолятов от вакцинных штаммов. ПЦР-продукты были получены для всех изолятов и штаммов вируса оспы кур, за исключением штамма «Кучинский». Размер ампликона со всеми изолятами и штаммами составил приблизительно 2200 п.н. за исключением вакцинного штамма «ВГНКИ 3/7». Со штаммом «ВГНКИ 3/7» с одной системой праймеров нарабатывается два ПЦР фрагмента размером 2200 и 1000 п.н., что может быть следствием гетерогенности данного штамма. Анализ нуклеотидных последовательностей локуса Н9 показал, что последовательность в 1000 п.н. штамма «ВГНКИ 3/7» идентична последовательности локуса вакцинных штаммов Chick'N'Pox и FPV М (номер доступа АМ396439) и сопоставима с расчётным продуктом 999 п.н. для FPV USDA. Дополнительная последовательность в 1207 нуклеотидов, обнаруженная во всех изолятах и штаммах, за исключением штаммов «Кучинский» сходна с последовательностями двух европейских полевых изолятов (НР1 и FPV 174), и трех вакцинных штаммов: Nobilis Variole W (Nobilis), Diftosec CT (Diftosec) и Poxine.

Полученные в ходе работы и имеющиеся в базе данных последовательности имеют различия. Так, в позиции 473 во всех вакцинных штаммах, секвенированных в ходе нашей работы (КЭМ-7, ВГНКИ 3/7, НР-В, К, Gibbs), а также в полевом изоляте с птицефабрики Украины наблюдается замена основания А на С, приводящая к смене аминокислоты изолейцина на лейцин. Во всех полевых изолятах, выделенных на территории России, в двух европейских полевых изолятах (AM396440/HPl-200/Germany, AM396436/FPV 174/04/UnitedKingdom), а также в вакцинных штаммах АМЗ 96441/Duphar (Poxine) и AM396439/FPV M (Websters) сохраняется основание А.

Другим важным различием, обнаруженным в ходе работы, является делеция четырёх нуклеотидов (СТАТ) в позиции 893-896 во всех полевых изолятах с территории России, полученных в ходе работы. В тоже время во всех вакцинных штаммах, секвенированных в ходе нашей работы, во всех изолятах и штаммах, представленных в базах данных, а также в полевом изоляте, выделенном от курицы с птицефабрики Украины, эта последовательность сохраняется.

Таким образом, выявленные различия позволяют проводить дифференциацию полевых изолятов, выявляемых на территории России, от вакцинных штаммов.

Есть данные о том, что вирус ретикулоэндотелиоза участвует в патогенезе ВОК, увеличивая его вирулентность за счет подавления иммунного ответа. РЭВ - иммуносупрессирующий онкогенный ретровирус. Как правило, вирулентные штамма ВОК имеют полногеномную последовательность РЭВ в своём геноме, в то время как вакцинные штаммы имеют только длинные концевые повторы.

Нами был проведен анализ всех изолятов и штаммов ВОП, изученных в данной работе, методом ПЦР с праймерами, рассчитанными на все гены вируса ретикулоэндотелиоза птиц и на область встройки ДНК РЭВ в геном ВОП, а также методом ПЦР в режиме реального времени с праймерами, рассчитанными на последовательность гена gag вируса ретикулоэндотелиоза птиц. В случае положительного результата в ПЦР, делали вывод о наличие полногеномной последовательности РЭВ в геноме ВОП. В ходе проведённого анализа изолятов и штаммов ВОК на наличие вируса ретикулоэндотелиоза было установлено, что все полевые изоляты имеют встройку полного генома вируса ретикулоэндотелиза, в отличие от вакцинных штаммов. ДНК РЭВ не была обнаружена в обоих изолятах вируса оспы голубей предположительно потому, что геном ВОГ не имеет специфического сайта рекомбинации для встраивания генома вируса ретикулоэндотелиза. Было показано, что во всех вакцинных штаммах ВОП есть длинные концевые повторы РЭВ.

Результаты проведенного анализа на наличие последовательности полного генома РЭВ в полевых изолятах ВОК совпадают с анализом генного локуса Н9. Таким образом, проведение молекулярно-генетического анализа данных сайтов генома ВОП позволяет дифференцировать выявляемые полевые изоляты оспы от вакцинных штаммов.

114

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Елаткин, Николай Павлович, 2013 год

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бакулин В.А. Оспа птиц // Зооиндустрия. - 2005. -№ 8-9. - С. 4-7.

2. Бочарников A.B., Ковалишина Н.И. К вопросу о продолжительности иммунитета у кур, вакцинированных различными дозами эмбрионвакцины против оспы птиц // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: метериалы Междунар. науч. конф., посвящ. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ», Владимир, 30-31 окт. 2003г. -Владимир, 2003. - С. 366-368.

3. Бочарников A.B., Кулаков В.Ю. Стабильность вакцинных штаммов вирусов инфекционного ларинготрахеита и оспы птиц // Ветеринария. -2004. - № 3. - С. 22-24.

4. Выявление генома вируса оспы птиц методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени / Н.П. Елаткин, Д.Б. Андрейчук, Н.С. Мудрак [и др.] // Молекулярная диагностика: сб. тр. VII Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, Москва. - М., 2010. Т. 2. -С.95-97.

5. Калнек / Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц // М. 2003.

6. Культуральная вакцина против ньюкаслской болезни и оспы птиц // В.Н. Смирнов, А.Т. Кушнир, Д.В. Колбасов и др. / V Международный конгресс по птицеводству, Москва, 21-24 апреля 2003. - Москва, 2003. -С. 125-129.

7. Елаткин Н.П., Ушакова А.Н. Выявление вируса оспы птиц с помощью молекулярно-биологических методов на территории Российской Федерации в 2009-2011 гг. // Ветеринария и кормление. - 2011. - № 6. -С. 20-21.

8. Методика выявления генома вируса оспы кур методом полимеразной цепной реакции / Г.В. Батченко, С.Н. Колосов, Л.О. Щербакова, В.В. Дрыгин; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2006. - 6с.

9. Методика оценки патогенности Mycoplasma gallisepticum гистохимическим методом / A.B. Спрыгин, A.B. Борисова, М.И. Сорокина и др.; ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2009. - 12с.

Ю.Николаева И.П., Седунова А.И., Талыбова О.Н. Культивирование вируса оспы кур // V Международный конгресс по птицеводству, Москва, 21-24 апреля 2003. - Москва, 2003. - С. 103-105.

11. Оспа птиц и мероприятия по её профилактике в хозяйствах Ростовской области: рекомендации; Северо-кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт. - Новочеркасск, 1984. - 12с.

12. Похвальный С.А., Кулаков В.Ю. Иммунобиологические свойства аттенуированного штамма «КЭМ-7» вируса оспы кур // Ветеринария и кормление - 2011. - № 6. - С. 42-43.

13. Профилактика оспы птиц: рекомендации; Кишиневский сельскохозяйственный институт. - Кишинёв, 1989. - 8с.

14. Трифати Д.Н., Рид В.М. Оспа // Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц / под ред. Б.У. Кэлнека. - 10е изд. - Эймс, Айова, США, 2003. - Г. 24. - С. 743-761.

15. Черкезова Т.В. Реактогенность, безвредность и иммуногенность вакцинного штамма «К» вируса оспы кур для цыплят суточного возраста // Деп. рукопись в РЖ сер. Ветеринария ВНИИиТЭИ Госкомпродзаг СМ СССР, ВАСХНИЛ, М., - 1989, № 7. - С. 28.

16. Черкезова Т.В. Формирование иммунитета к оспе у цыплят раннего возраста: автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Москва, 2003. - 18 с.

17.110 Years of Avipoxvirus in the Galapagos Islands / P.G. Parker, E.L. Buckles, H. Farrington [et al] // PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6, N 1. - P. 1-7.

18. AAAP. Avian Histopathology / ed. O.J. Fletcher. - 3rd ed. - Madison, WI: Omni Press, 2008.-438 p.

19. Adams, C. J., Feldman S. H., Sleeman J. M. Phylogenetic analysis of avian poxviruses among free-ranging birds of Virginia // Avian Dis. - 2005. - Vol. 49, N 1. - P. 601-605.

20.Alcami, A. New insights into the subversion of the chemokine system by poxviruses // Eur. J. Immunol. - 2007. - Vol. 37. - P. 880-883.

21. Alcami, A., Smith G.L. A soluble receptor for interleukin-1 beta encoded by vaccinia virus: a novel mechanism of virus modulation of the host response to infection // Cell. - 1992. - Vol. 71, - P. 153-67.

22.A multiplex PCR for detection of poxvirus and papillomavirus in cutaneous warts from live birds and museum skins / J. Pérez-Tris, R.A. Williams, E. Abel-Fernández [et al] // Avian Dis. - 2011. - Vol. 55, № 4. - P. 545-553.

23.Analysis and comparison of the 4b core protein gene of avipoxviruses from wild birds: evidence for interspecies spatial phylogenetic variation / S.C. Weli, T. Traavik, M. Tryland [et al] // Arch. Virol. - 2004. - Vol. 149. - P. 2035-2046.

24.Analysis of the fowlpox virus gene encoding the 4b core polypeptide and demonstration that it possesses efficient promoter sequences / M.M. Binns, M.E.G. Boursnell, F.M. Tomley, J. Campbell // Virology. - 1989. - Vol. 170.-P. 288-291.

25. An epizootic of avian pox in endemic short-toed larks (Calandrella rufescens) and Berthelot's pipits (Anthus berthelotti) in the Canary Islands, Spain / J.E. Smits, J.L. Telia, M. Carrete [et al] // Vet. Pathol. - 2005. - Vol. 42. - P. 5965.

26. An outbreak of lymphomas in commercial broiler breeder chickens vaccinated with a fowlpox vaccine contaminated with reticuloendotheliosis virus / A.M. Fadly, R.L. Witter, E.J. Smith [et al] // Avian Pathol. - 1996. - Vol. 25. - P. 35-47.

27.Antoniou, A.N., Powis S.J. Pathogen evasion strategies for the major histocompatibility complex class I assembly pathway // Immunology. - 2008. -Vol. 124. - P. 1-12.

28.Applications of canarypox (ALVAC) vectors in human and veterinary vaccination / J. Taylor, J. Tartaglia, M. Rivière [et al] // Dev. Biol. Stand. -1994.-Vol. 82.-P. 131-135.

29.A sensitive one-step real-time PCR for detection of avian influenza viruses using a MGB probe and an internal positive control / L. Di Trani, B. Bedini, I. Donatelli [et al] // BMC Infectious Diseases. - 2006. - Vol. 6, N 87.

30.Atypical distribution of fowl pox lesions in broilers / CG Senties-Cue, BR Charlton, P Woolcock Brunetti [et al] // Avian Dis. - 2010. - Vol. 54, № 4. -P. 1316-1318.

31. Avipoxvirus phylogenetics: identification of a PCR length polymorphism that discriminates between the two major clades / S. Jarmin, R. Manvell, R.E. Gough [et al] // J. Gen. Virol. -2006. - Vol. 87. - P. 2191-2201.

32. A virulence factor of myxoma virus colocalizes with NF-kB in the nucleus and interferes with inflammation / C. Camus-Bouclainville, L. Fiette, S. Bouchiha [et al] // Virol. J. - 2004. - V. 78. - P. 2510-2516.

33.Bagust, T.J., Dennett D.P. Reticuloendotheliosis virus: experimental infection of poultry and immunofluorescent identification of Australian isolates // Australian Vet. J. - 1977. - Vol. 53. - P. 506-508.

34.Baxby, D., Bennett M., Getty B. Human cowpox 1969-93: a review based on 54 cases // Br. J. Dermatol. - 1994. - Vol. 131. - P. 598-607.

35.Baxby D. Jenner's smallpox vaccine. The riddle of the origin of vaccinia virus: - London: Heinemann Educational Books Ltd, 1981.

36.Baxi, M.K., Oberoi M.S. Comparative evaluation of cell culture-adapted and chicken embryo-adapted fowl pox vaccine strains // Avian Dis. - 1999. - Vol. 43. - P. 16-21.

37.Beard, C.W, Schnitzlein W.M., Tripathy D.N. Effect of route of administration on the efficacy of a recombinant fowlpox virus against H5N2 avian influenza // Avian Dis. - 1992. - Vol. 36. -P. 1052-1055.

38.Biological and immunogenic properties of a canarypox-rabies recombinant, ALVAC-RG (vCP65) in non-avian species / J. Taylor, B. Meignier, J. Tartaglia [et al] // Vaccine. - 1995. - Vol. 13. - P. 539-549.

39.Boehmer, P.E., Lehman I.R. Herpes simplex virus DNA replication // Annu. Rev. Biochem. - 1997. - Vol. 66. - P. 347-384.

40.Bolte, A. L., Meurer J., Kaleta E. F. Avian host spectrum of avipoxviruses // Avian Pathol. - 1999. - Vol. 28, N 5. - P. 415-432.

41.Boulanger, D., Smith T., Skinner M.A. Morphogenesis and release of fowlpox virus // J. Gen. Virol. - 2000. - Vol. 81. - P. 675-687.

42., A.G., Unterholzner L. Viral evasion and subversion of pattern recognition receptor signaling // Nature Reviews Immunology. - 2008. - Vol. 8. - P. 911922.

43.Boyle, D., Heine H. Recombinant fowlpox virus vaccines for poultry // Immunol. Cell Biol. - 1993. - Vol. 71. - P. 391-397.

44.Bradley, R. R., Terajima M. Vaccinia virus K1L protein mediates host-range function in RK-13 cells via ankyrin repeat and may interact with a cellular GTPase-activating protein // Virus Res. - 2005. - Vol. 114. - P. 104-112.

45.Budding of fowlpox and pigeonpox viruses at the surface of infected cells / Y. Hatano, M. Yoshida, F., J. Uno [et al] // Electron. Microsc. (Tokyo) - 2001. -Vol. 50.-P. 113-124.

46.Buscaglia, C., Bankowski R.A., Miers L. Cell-culture virus-neutralization test and enzyme-linked immunosorbent assay for evaluation of immunity in chickens against fowlpox // Avian Dis. - 1985. - Vol. 29. - P. 672-680.

47.Carter, J.K.Y., Cheville N.F. Isolation of surface tubules of fowlpox virus // Avian Dis. - 1981. - Vol. 25. - P. 454-462.

48.Carulei, O., Douglass N., Williamson A.L. Phylogenetic analysis of three genes of Penguinpox virus corresponding to Vaccinia virus G8R (VLTF-1), A3L (P4b) and H3L reveals that it is most closely related to Turkeypox virus, Ostrichpox virus and Pigeonpox virus // Virol. J. - 2009. - N 6. - P. 52.

49.Characterization of avipoxviruses from wild birds in Norway / S.C. Weli, M.I. Okeke, M. Tryland [et al] // Can. J. Vet. Res. - 2004. - Vol. 68. - P. 140-145.

50.Characterization of poxviruses from forest birds in Hawaii / D.N. Tripathy, W.M. Schnitzlein, P.J. Morris [et al] // J. Wildl. Dis. - 2000. - Vol. 36. - P. 225-230.

51.Cheevers, W.P., O'Callaghan D.J., Randall C.C. Biosynthesis of host and viral deoxyribonucleic acid during hyperplastic fowlpox infection in vivo // J. Virol. - 1968. - N 2. - P. 421-429.

52.Chung, Y.S., Spradbrow P.B. Studies on poxvirus isolated from a magpie in Queensland // Australian. Vet. J. - 1977. - Vol. 53. - P. 334-336.

53.Clinical Trials database. - URL: http://clinicaltrials.gov (дата обращения: 07.07.12).

54.Clubb S.L. Avian pox in cage and aviary birds. In Zoo and wild animal medicine // ed M.E. Fowler. - Philadelphia, Pennsylvania: WB Saunders Company, 1986. - P. 213-219.

55.Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses / S.N. Shchelkunov, S.M. Resenchuk, A.V. Totmenin [et al] // FEBS Lett. - 1993. -Vol. 327.-P. 321-324.

56.Concurrent avian malaria and avipox virus infection in translocated South Island saddlebacks (Philesturnus carunculatus carunculatus) / M.R. Alley, K.A. Hale, W. Cash [et al] / New Zeeland Vet. J. - 2010. - Vol. 58, N 4. - P. 218-223.

57.Construction of recombinant fowlpox viruses carrying multiple vaccine antigens and immunomodulatory molecules / DB Boyle, MA Anderson, R Amos [et al] // Biotechniques. - 2004. - Vol. 37. - P. 104-106, 108-111.

58.Cook, G.C. The smallpox saga and the origin(s) of vaccination // J. Royal Soc. Health. - 1996. - Vol. 116. - P. 253-255.

59.Cooper J.E. Veterinary aspect of captive bird of prey - Cherington, UK: Standfast Press, 1985. - 256 p.

60.Courtney, В. C. Development of internal controls for probe-based nucleic acid diagnostic assays / В. C. Courtney, M. M. Smith, E. A. Henchal [et al] // Anal. Biochem. - 1999. - Vol. 270. - P. 249-256.

61.Cowpox Virus Evades CTL Recognition and Inhibits the Intracellular Transport of MHC Class I Molecules / A. Dasgupta, E. Hammarlund, M.K. Slifka, K. Friih // The Journal of Immunology. - 2007. - Vol. 178. - P. 16541661.

62.Cox, W.R. Avian pox infection in a Canada goose (Branta canadensis) // J. Wild. Dis. - 1980. - Vol. 16. - P. 623-626.

63.Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian influenza / M. Bublot, N. Pritchard, D.E. Swayne [et al] // Ann. New York Acad. Sci. -2006.-Vol. 1081.-P. 193-201.

64.Development of internal controls for PCR detection of Bacillus anthracis / G. Brightwell, M. Pearce, D. Leslie [et al] // Mol. Cell. Probes. - 1998. - Vol. 12. -P. 367-377.

65.Differential CD4+ versus CD8+ T-cell responses elicited by different poxvirus-based human immunodeficiency virus type 1 vaccine candidates provide comparable efficacies in primates / P. Mooij, S.S. Balla-Jhagjhoorsingh, G. Koopman Beenhakker [et al] // J. Virol. - 2008. - Vol. 2. -P. 2975-2988.

66.Diversity, origins and virulence of Avipoxviruses in Hawaiian Forest Birds / S.I. Jarvi, D. Triglia, A. Giannoulis [et al] // Conserv. Genet. - 2008. - Vol. 9, N2.-P. 339-348.

67.Doyle, T.M. Immunisation of fowls against fowlpox by means of pigeon pox virus // J. Comparative Pathol. - 1930. - Vol. 43. - P. 40-45.

68.Efficacy studies on a canarypox-rabies recombinant virus / J. Taylor, C. Trimarchi, R. Weinberg [et al] // Vaccine. - 1991. - Vol. 9. - P. 190-193.

69.Evidence for incomplete replication of a penguin poxvirus in cells of mammalian origin / L.M. Stannard, D. Marais, D. Kow, K.R. Dumbell // J. Gen. Virol. - 1998.-Vol. 79.-P. 1637-1646.

70.Evaluation of immune effects of fowlpox vaccine strains and field isolates / J. Wang, J. Meers, P.B. Spradbrow, W.F. Robinson // Vet. Microbiol. - 2006. -Vol. 116.-P. 106-119.

71.Fatunmbi, 0.0., Reed W.M. Evaluation of a commercial quail pox vaccine (Bio-Pox Q) for the control of "variant" fowl poxvirus infections // Avian Dis.

- 1996.-Vol. 40.-P. 792-797.

72.Fenner, F. Adventures with poxviruses of vertebrates // FEMS Microbiology Reviews. - 2000. - Vol. 24, N 6. - P. 123-133.

73.Fenner, F., Burnet FM. A short description of the poxvirus group (vaccinia and related.viruses) // Virology. - 1957. - Vol. 4. - P. 305-314.

74.Fenner F. Poxviruses // Fields virology. / ed. Knipe D.M., Howley P.M. -New York: Lippincott Raven Press, 1996. - P. 2673-2702.

75.Field and vaccine strains of fowlpox virus carry integrated sequences from the avian retrovirus, reticuloendotheliosis virus / C. Hertig, B.E. Coupar, A.R. Gould, D.B. Boyle // Virology. - 1997. - Vol. 235. - P. 367-376.

76.Field isolates of fowlpox virus contaminated with reticuloendotheliosis virus / I.S. Diallo, M.A. Mackenzie, P.B. Spradbrow, W.F. Robinson // Avian Pathol.

- 1998.-Vol. 27.-P. 60-66.

77.Fowlpox. - URL: http://web.oie.int/wahis/public.php (дата обращения: 14.02.12).

78.Ghildyal, N., Schnitzlein W.M., Tripathy D.N. Genetic and antigenic differences between fowl pox and quail pox viruses // Arch. Virol. - 1989. -Vol. 106. - P. 85-92.

79.Highly attenuated poxvirus vectors: NYVAC, ALVAC and TROVAC. E. Paoletti, J. Taylor, B. Meignier [et al] // J. Dev. Biol. Stand. - 1995. - Vol. 84. -P. 159-163.

80.Holt, G., Krogsrud J. Pox in wild birds // Acta. Vet. Scand. - 1973. - Vol. 14. -P. 201-203.

81.Hoorfar, J., Cook N. Critical aspects of standardization of PCR // Methods Mol. Biol. - 2003. - Vol. 216. - P. 51-64.

82.ICTV avipoxvirus taxonomy. - URL:-

http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2007 (дата

обращения: 22.10.12).

83.Identification and characterization of three immunodominant structural proteins of fowlpox virus / D. Boulanger, P. Green, B. Jones, [et al] // J. Virol. - 2002. - Vol. 76. - P. 9844-9855.

84.Identification of the canarypox virus thymidine kinase gene and insertion of foreign genes / H. Amano, S. Morikawa, H. Shimizu [et al] // Virology . -1999.-Vol. 256, 280-290.

85. Infection of human cancer cells with myxoma virus requires Akt activation via interaction with a viral ankyrin-repeat host range factor / G.Wang, J. W. Barrett, M. Stanford [et al] // Proc Natl.Acad. Sci. USA- 2008. - Vol. 103. . p. 4640^4645.

86.Investigation of the morphology of cell clones, derived from the mammalian EBTr cell line and their susceptibility to vaccine avian poxvirus strains FK and Dessau / I.V. Sainova, A.I. Kril, K.B. Simeonov // J. Virol. Methods. -2005.-Vol. 124.-P. 37-40.

87.Johnston, J.B., McFadden G. Technical knockout: understanding poxvirus pathogenesis by selectively deleting viral immunomodulatory genes // Cell Microbiol. - 2004. - Vol. 9. - P. 695-705.

88.Kim, T., Tripathy D.N. Evaluation of pathogenicity of avian poxvirus isolates from endangered Hawaiian wild birds in chickens // Avian Dis. - 2006. - Vol. 50.-P. 288-291.

89.Kim, T.J., Tripathy D.N. Reticuloendotheliosis virus integration in the fowl poxvirus genome: not a recent event // Avian Dis. - 2001. - Vol. 45. - P. 663669.

90.Laidlaw, S.M., Skinner M.A. Comparison of the genome sequence of FP9, an attenuated, tissue culture-adapted European strain of Fowlpox virus, with those of virulent American and European viruses // J. Gen. Virol. - 2004. -Vol. 85. - P. 305-3.322.

91.Lee, H.L., Hwa Lee K. Application of the polymerase chain reaction for the diagnosis of fowl poxvirus infection // J. Virol. Methods. - 1997. - Vol. 63. -P. 113-119.

92.Luschow, D., Hoffmann T., Hafez H.M. Differentiation of avian poxvirus strains on the basis of nucleotide sequences of 4b gene fragment // Avian Dis. - 2004. - Vol. 48, N 3. - P. 453-462.

93.Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrooks S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. - N.Y.: Cold Spring Harbor, 2006. - 800 p.

94.Mayr, A., Mahnel H. Characterization of a fowlpox virus isolated from a rhinoceros // Arch. Gesamte Virusforsch. - 1970. - Vol. 31. - P. 51-60.

95.Mayr, A., Malicki K. Attenuation of virulent fowl pox virus in tissue culture and characteristics of the attenuated virus // Zentralbl Veterinarmed. - 1966. -Vol. 13.-P. 1-13.

96.Mercer, A. A., Fleming S. B., Ueda N. F-box-like domains are present in most poxvirus ankyrin repeat proteins // Virus Genes - 2005. - Vol. 31.-P. 127-133.

97.Minke, J.M., Audonnet J.C., Fischer L. Equine viral vaccines: the past, present and future // Vet. Res. - 2004. - Vol. 35. - P. 425-443.

98.Molecular characterization of reticuloendotheliosis virus insertions in the genome of field and vaccine strains of fowl poxvirus / M. Garcia, N. Narang, W.M. Reed [et al] // Avian Dis. - 2003. - Vol. 47. - P. 343-354.

99. Morphogenesis of canary poxvirus and its entrance into inclusion bodies / R.E. Ricklefs, J.L. Bollmerb, G.J. Sadasiv [et al] // Am. J. Vet. Res. - 1985. -Vol. 46.-P. 529-535.

100. Moss B. Poxviridae: the viruses and their replication // Fields virology / ed. B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley. - New York: Lippincott Raven Press, 1996.-P. 2637-2671.

101. Moss, B. Vaccinia and other poxvirus expression vectors // Curr. Opin. Biotechnol. - 1992. - Vol. 3. - P. 518-522.

102. Myxoma virus M-T5 protects infected cells from the stress of cell cycle arrest through its interaction with host cell cullin-1 Johnston / Wang J. B., Barrett G, Nazarian J. W [et al] // J. Virol. - 2005. - Vol. 79. - P. 1075010763.

103. Nelson, J.B. The behaviour of poxviruses in respiratory tract: IV. The nasal instillation of fowlpoxvirus in chickens and in mice // J. Exp. Med. - 1941. -Vol. 31.-P. 203-212.

104.NYVAC: a highly attenuated strain of vaccinia virus / J. Tartaglia, M.E. Perkus, J. Taylor [et al] // Virology. - 1992. - Vol. 188. - P. 217-232.

105. OIE. Quality standard and guidelines for veterinary laboratories: infectous diseases. - 2nd ed. - Paris, 2008. - 70 p.

106.Paoletti, E. Application of pox virus vectors: an update // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996.-Vol. 93.-P. 11349-11353.

107.Pastoret, P.P., Vanderplasschen A. Poxviruses as vaccine vectors // Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 344, № 26. - P. 343-355.

108.Pattyn, S.R. Monkeypoxvirus infections // Revue Scientifique et Technique de 1'Office International des Epizooties. - 2000. - Vol. 19. - P. 92-97.

109. Payne, L.N. Retrovirus-induced disease in poultry // Poult. Sci. - 1998. -Vol. 77. - P. 1204-1212.

110. Pennycott, T.W. Scaly leg, papillomas and pox in wild birds // Vet. Rec. -2003.-Vol. 152.-P. 444.

111. Perkus, M.E., Tartaglia J., Paoletti E. Poxvirus-based vaccine candidates for cancer, AIDS, and other infectious diseases // J. Leukoc. Biol. - 1995. - Vol. -58. - P. 1-13.

112. Phase I study of sequential vaccinations with fowlpox-CEA (6D)-TRICOM alone and sequentially with vaccinia-CEA (6D)-TRICOM, with and without granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, in patients with carcinoembryonic antigen-expressing carcinomas / J.L. Marshall, J.L. Gulley, P.M. Arlen [et al] // J. Clin. Oncol. - 2005. - Vol. 23. - P. 720-731.

113.Poxviruses and immune evasion / B.T. Seet, J.B. Johnston, C.R. Brunetti [et al] // Annu. Rev. Immunol. - 2003. - Vol. 21. - P. 377-423.

114. Proctor, H., Owens I. Mites and birds: Diversity, parasitism and coevolution // Trends in Ecology and Evolution. - 2000. - Vol. 15. - P. 358-364.

115.Proventriculitis, "nakanuke" and reticuloendotheliosis in chickens following vaccination with herpesvirus of turkeys (HVT) / C.A. Jackson, S.E. Dunn, D.I. Smith [et al] // Aust. Vet. J. - 1977. - Vol. 53. - P. 457-459.

1 ló.Psittacine poxvirus: virus isolation and identification, transmission and cross-challenge studies in parrots and chickens / T.R. Boosinger, R.W. Winterfield, D.S. Feldman, A.S. Dhillon // Avian Dis. - 1982. - Vol. 26, N 2. _ p. 437-444.

117.Recombinant fowlpox virus inducing protective immunity in non-avian species / J. Taylor, R. Weinberg, B Languet [et al] // Vaccine. - 1988. - Vol. 6.-P. 497-503.

118. Retention of 1,2 kbp of 'novel' genomic sequence in two European field isolates and some vaccine strains of Fowlpox virus extends open reading frame fpv241 / S. Jarmin, R. Manvell, R.E. Gough [et al] // J. Gen. Virol. -2006. - Vol. 87. - P. 3545-3549.

119. Reticuloendotheliosis group virus pathogenic to chicken isolated material infected with turkey herpesvirus (HVT) / H. Koyama, Y. Suzuki, Y. Ohwada, Y. Saito // Avian Dis. - 1977. - Vol. 20. - P. 429-434.

120. Schnitzlein, W.M., Ghildyal N., Tripathy D.N. A rapid method for identifying the thymidinekinase genes of avipoxviruses // J. Virol. Methods. -1988.-Vol. 20.-P. 341-352.

121. Serologic response against fowl Poxvirus and Reticuloendotheliosis virus after experimental and natural infections of chickens with Fowl Poxvirus / R. Hauck, C. Prusas, H. M. Hafez, D. Luschow // Avian Diseases - 2009. - V. 53.-P. 205-210.

122. Shchelkunov, S.N., Blinov V.M., Sandakhchiev L.S. Genes of variola and vaccinia viruses necessary to overcome the host protective mechanisms // FEBS Lett. - 1993. - Vol. 319. - P. 80-83.

123.Shirinov, F.B., Ibragimova A.I., Misirov Z.G. Spread of fowl poxvirus by the mite Dermanyssus gallinae // Veterinariya. - 1972. - Vol. 4. - P. 48-49.

124. Shisler, J. L., Jin X. L. The vaccinia virus K1L gene product inhibits host NF-kB activation by preventing IkBa degradation // Virology Journal. - 2004.

- Vol. 78. - P. 3553-3560.

125. Singh, P., Kim T.J., Tripathy D.N. Re-emerging fowlpox: evaluation of isolates from vaccinated flocks // Avian Pathol. - 2000. - Vol. 29. - P. 449455.

126. Singh, P., Schnitzlein W.M., Tripathy D.N. Constraction and characterization of fowlpox virus field isolate whose genome lacks Reticuloendotheliosis provirus nucleotide sequences //• Avian Dis. - 2005. -Vol. 49.-P. 401-408.

127. Singh, P., Schnitzlein W.M., Tripathy D.N. Reticuloendotheliosis virus sequences within the genomes of field strains of fowlpox virus display variability // J. Virol. - 2003. - Vol. 77. - P. 5855-5862.

128. Smallpox and its eradication / F. Fenner, D.A. Anderson, I. Arita [et al] -Geneva: World Health Organisation, 1988. - 320 p.

129. Smith G.L., Law M. The exit of vaccinia virus from infected cells // Virus Res. - 2004. - Vol. 106. - P. 189-197.

130. Somogyi, P., Frazier J., Skinner M.A. Fowlpox virus host range restriction: gene expression, DNA replication, and morphogenesis in non-permissive mammalian cells // Virology. - 1993. - Vol. 197. - P. 439-444.

131. Specificity in the immunosuppression induced by avian reticuloendotheliosis virus / M.H. Walker, B.J. Rup, A.S. Rubin, H.R. Bose // J. Infect. Immun. -1983.-Vol. 40.-P. 225-235.

132. Stability of recombinant vacciniarabies vaccine in veterinary use / P.P. Pastoret, B. Brochier, B. Languet [et al] // Dev. Biol. Stand. - 1996. - Vol. 87.

- P. 245-249.

133. Structure of intracellular mature vaccinia virus observed by cryoelectron microscopy / J. Dubochet, M. Adrian, K. Richter [et al] // J. Virol. - 1994.-Vol. 68.-P. 1935-1941.

134.Tadese, T., Potter E.A., Reed W.M. Development of a mixed antigen agar gel enzyme assay (AGEA) for the detection of antibodies to poxvirus in chicken and turkey sera // J. Vet. Med. Sci. - 2003. - Vol. 65. - P. 255-258.

135. Tadese, T., Reed, W. M. Detection of specific reticuloendotheliosis virus sequence and protein from REV-integrated fowlpox virus strains // J. Virol. Methods. - 2003. - Vol. 110. - P. 99-104.

136.Taqman Real-Time PCR Detects Avipoxvirus DNA in Blood of Hawafi "Amakihi (Hemignathus virens) / M.E.M. Farias, D.A. LaPointe, C.T. Atkinson [et al] // PLoS ONE. - 2010. - Vol. 5, N 5. - P. 1-6.

137. Taylor, J., Paoletti E. Fowlpox virus as a vector in non-avian species // Vaccine. - 1988. - Vol 6. - P. 466-468.

138. The complete DNA sequence of vaccinia virus / S.J. Goebel, G.P. Johnson, M.E. Perkus [et al] // Virology. - 1990. - Vol. 179. - P. 247-266.

139. The genome of canarypox virus / E.R. Tulman, C.L. Afonso, Z. Lu [et al] // J. Virol. - 2004. - Vol. 78. - P. 353-366.

140. The genome of fowlpox virus / C. L. Afonso [et al] // J. Virol. - 2000. -Vol. 74,-P. 3815-3831.

141. The phylogenetic analysis of avipoxvirus in New Zealand / H.H. Jeong, L. Howe, M. Alley, B. Gartrell // Veterinary Microbiology. - 2011. in press.

142.Transactivation of latent Merak's disease herpesvirus gene in QT35, a quail fibroblast cell line, by herpesvirus of turkeys / T. Yamaguchi, S.L. Kaplan, P. Wakenell, K.A. Schat // J. Virol. - 2000. - Vol. 74. - P. 10176-10186.

143.Tripathy, D.N., Hanson L.E. Immunity to fowlpox // Am. J. Vet. Res. - 1975. - Vol. 36. - P. 541-544.

144.Tripathy D.N., Reed W.M. Poxvirus // Diseases of Poultry. - Ames, IA: Iowa State University Press, 2003. - P. 253-269.

145.Tripathy D.N., Reed W.M. Pox // A laboratory manual for isolation, identification and characterization of avian pathogens / ed. L. Dufour-Zavala. - 5th ed. - Madison, Wisconsin: Omni Press, 2008. - Chap. 25. - P. 116-119.

146. Vaccinia virus blocks Stat 1-dependent and Stat 1-independent gene expression induced by type I and type II interferons / B.A. Mann, J.H. Huang, P. Li [et al] // J. Interferon Cytokine Res. - 2008. - Vol. 28 - P. 367-380.

147. Van Riper C., Forrester D.J. Avian pox // Infectious Diseases of Wild Birds / N.J. Thomas, D.B. Hunter, C.T. Atkinson. - Ames, Iowa: Blackwell Publishing, 2007. - P. 131-176.

148. Venereal pox in breeder turkeys in Minnesota / A.L. Metz, L. Hatcher, J.A. Newman, D.A. Halvorson // Avian Dis. - 1985. - Vol. 29.-P. 850-853.

149. Virus Taxonomy: Vlllth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses" / C.M. Fauquet, M.A. Mayo, J. Maniloff [et al] // Elsevier Academic Press, 2005. - 443 p.

150.Weli, S.C., Nilssen O., Traavik T. Avipoxvirus multiplication in a mammalian cell line // Virus Res. - 2005. - Vol. 109. - P. 39-49.

151. Weli, S.C., Nilssen O., Traavik T. Morphogenesis of fowlpox virus in a baby hamster kidney cell line // Med. Electron. Microsc. - 2004. - Vol. 37. - P. 225-235.

152. Weli S.C., Tryland M. Avipoxviruses: infection biology and their use as vaccine vectors // Virology Journal. - 2011. - Vol. 8. - P. 49.

153. Witter R..L., .L. Reticuloendothelosis // Diseases of poultry / ed. T.M. Saif, H.J. Barnes, J. Glisson, L.R. McDougald, D.E. Swayne. - 1 lnd ed. - Ames, IA: Iowa State University Press, 2003. - P. 517-535.

154. Yuasa, N., Yoshida I., Taniguchi T. Isolation of a reticuloendotheliosis virus from chickens inoculated with Marek's disease vaccine // Natl. Inst. Anim. Health (Tokyo). - 1976. - Vol. 16. - P. 141-151.