Получение и изучение свойств ДНК-конструкций, кодирующих гены потенциально протективных белков вируса африканской чумы свиней тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Иматдинов Алмаз Рамисович

• Иматдинов Алмаз Рамисович
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Иматдинов Алмаз Рамисович

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Механизмы иммунитета при африканской чуме свиней

2.2 Состояние исследований по разработке вакцин против АЧС

2.2.1 Инактивированные вакцины

2.2.2 Субъединичные вакцины

2.3 Живые вакцины

2.4 Гемадсорбция при африканской чуме свиней

2.5 Серотипоспецифический и гемадсорбирующий белок вируса африканской чумы свиней

2.6 Перспективы создания ДНК-вакцин против африканской чумы свиней

2.7 Заключение по обзору литературы

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы и оборудование

3.1.1 Вирус

3.1.2 Штаммы микроорганизмов и плазмидные векторы

3.1.3 Культуры клеток

3.1.4 Питательные среды, растворы для культивирования и антибиотики

3.1.5 Животные

3.1.6 Вирусоспецифические сыворотки

3.1.7 Коммерческие наборы

3.1.8 Реактивы и растворы

3.1.9 Лабораторное оборудование и расходные материалы

3.1.10 Программное обеспечение

3.2 Методы исследований

3.2.1 Выращивание перевиваемых линий клеток

3.2.2 Приготовление культуры лейкоцитов свиней

3.2.3 Определение инфекционной активности вируса АЧС

3.2.4 Определение серотиповой принадлежности вируса АЧС

3.2.5 Подбор олигонуклеотидных праймеров

2

3.2.6 Выделение нуклеиновых кислот

3.2.7 Постановка полимеразной цепной реакции

3.2.8 Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле

3.2.9 Выделение нуклеиновых кислот из агарозного геля и их очистка

3.2.10 Рестрикция ДНК

3.2.11 Лигирование

3.2.12 Трансформация клеток Е. соИ

3.2.13 Выделение плазмидной ДНК

3.2.14 Количественная оценка ДНК

3.2.15 Секвенирование

3.2.16 Трансфекция плазмидной ДНК

3.2.17 Белковый электрофорез и иммуноблоттинг

3.2.18 Иммуноферментный анализ

3.2.19 Получение ФИТЦ-иммуноглобулинов

3.2.20 Реакция прямой иммунофлюоресценции

3.2.21 Метод иммуноферментных пятен (ЕК^ро^

3.2.22 Статистическая обработка полученных результатов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Конструирование библиотеки генов, кодирующих белки сэ2у, р30 и р54 вируса африканской чумы свиней

4.1.1 Расчет праймеров

4.1.2 Культивирование вируса АЧС

4.1.3 Оптимизация условий ПЦР

4.1.4 Клонирование ампликонов генов в плазмидный вектор

4.2 Биоинформатический анализ

4.3 Конструирование химерных генов, кодирующих эктодомены белков CD2v, р30 и р54 вируса АЧС штамма МК-200

4.4 Клонирование химерных генов в плазмидный вектор для экспрессии в эукариотических системах

4.5 Характеристика рекомбинантных (г) белков rCD2v, гр30 и гр54 вируса АЧС в иммуноблоттинге

4.6 Изучение антигенной активности продуктов трансляции генов методом

прямой иммунофлуоресценции

4.7 Иммунизация свиней рекомбинантными плазмидами pCI-neo/ASFV/CD2v, pa-neo/ASFV/p30 и pa-neo/ASFV/p54

4.8 Конструирование рекомбинантных плазмид pUbb76A_CD2v, pUbb76A_p30 и pUbb76A_p54

4.9 Определение иммуногенности и протективности рекомбинантных плазмид pUbb76A_CD2v, pUbb76A_p30 и pUbb76A_p54

4.9.1 Клинические и патологоанатомические признаки

4.9.2 Динамика изменения инфекционного титра вируса АЧС в крови зараженных свиней

4.9.3 Иммунологический анализ

4.9.4 Накопление вируса АЧС в культурах клеток ЛС свиней

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1 Выводы

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. ШИСОК ИЛЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА

9. ПРИЛОЖЕНИЯ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и изучение свойств ДНК-конструкций, кодирующих гены потенциально протективных белков вируса африканской чумы свиней»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Африканская чума свиней (АЧС) -контагиозная, септическая болезнь свиней, характеризующаяся лихорадкой, признаками токсикоза, геморрагическим диатезом и высокой летальностью. К АЧС восприимчивы домашние свиньи и дикие кабаны независимо от породы и возраста, у которых инфекция может протекать сверхостро, остро, подостро, хронически и бессимптомно. Возбудитель болезни - крупный оболочечный вирус семейства Asfarviridae, содержащий двухцепочечную линейную ДНК 170-190 т.п.о., кодирующую более 150 белков, большинство из которых вовлечены во взаимодействия «вирус-хозяин» [70]. В Африке АЧС поддерживается в цикле передачи между бородавочниками (РИасосковгш Брр.), кустарниковыми свиньями (Ро1отосЬогш рогсш) и мягкими клещами рода Оrnithodoros [70]. В 2007 г. произошел занос возбудителя АЧС из Африки на территорию Грузии, затем в европейские и азиатские страны (Армения, Иран, Азербайджан, Россия, Украина, Беларусь, Латвия, Литва, Эстония, Польша, Румыния, Бельгия, Китай, КНДР, Республика Корея, Вьетнам) [146, 108, 190, 69, 74]. Это обстоятельство стимулировало всесторонние фундаментальные и прикладные исследования, направленные на разработку средств специфической защиты и профилактики заболевания.

Несмотря на то, что пригодных для практического применения вакцин против АЧС не разработано, формирование иммунной защиты против АЧС подтверждается тем, что болезнь не является смертельной для восприимчивых гигантских лесных, кистеухих, кустарниковых свиней и бородавочников в Африке. Выделены из популяций диких и домашних свиней, и получены в лабораторных условиях в процессе аттенуации в культурах клеток штаммы вируса АЧС, которые не вызывают гибели восприимчивых животных, и способны формировать защиту от последующего заражения гомологичными вирулентными штаммами [135, 196, 170, 230]. Получены «живые культуральные вакцины» на основе

аттенуированных штаммов для временной защиты свиней от вируса АЧС сероиммунотипов [19, 42, 97]. Однако их практическое применение неприемлемо из-за ряда причин: носительство вакцинного вируса, развитие поствакцинальных осложнений, в отдельных случаях недостаточная протективность для животных с ослабленным иммунитетом. Заражение привитых животных вирулентным штаммом вируса АЧС гомологичного сероиммунотипа приводило к его приживлению и длительному носительству.

Согласно разработанной Макаровым В.В. иммунологической концепции, определяющая роль в защите при АЧС принадлежит механизмам, направленным против зараженных клеток: цитотоксическим Т-лимфоцитам-киллерам, эффекторам антителозависимого и комплементзависимого цитолиза, ^киллерам [23]. Этим и объясняется, почему исследования по разработке инактивированных вакцин не принесли положительных результатов [14, 127].

В 90-х годах прошлого века был предложен метод ДНК-иммунизации [107]. Концептуально важно, что ДНК-вакцины потенциально безопасны для животных и индуцируют не только гуморальный, но и клеточный иммунитет [164]. На сегодня для профилактического применения в ветеринарии лицензированы ДНК-вакцины против вируса Западного Нила и вируса инфекционного геморрагического некроза лососевых рыб [167]. Получены кандидатные ДНК-вакцины против вирусов бычьего герпесвируса-1, диареи КРС, чумы собак, классической чумы свиней, ящура, гепатита B уток, инфекционной бурсальной болезни, инфекционного гемопоэтического некроза, японского энцефалита, репродуктивного и респираторного синдрома свиней, псевдобешенства, бешенства, везикулярного стоматита и вирусной геморрагической септицемии [110, 87, 171]. Существенным недостатком ДНК-вакцин является относительно низкий уровень индукции иммунных реакций, особенно у крупных млекопитающих. Для преодоления этой

проблемы испытывают различные подходы [233, 219, 167, 199].

6

При АЧС кандидатные ДНК-вакцины являются не только желаемой конечной целью исследований, но и уникальным инструментом исследования потенциально протективных белков и особенностей формирования иммунологической защиты против этого заболевания.

Степень разработанности темы. Разработка и совершенствование технологий создания кандидатных ДНК-вакцин параллельно дало исследователям новый инструмент поиска протективных белков вирусов, поскольку ДНК-вакцины индуцируют не только гуморальные, но и клеточные механизмы специфической защиты [191, 164, 203]. Иммунизация свиней рекомбинантной плазмидой, содержащей гены вируса АЧС, кодирующие слитые вирионные белки р30 (Р) и р54 (Р) (рСМУ-РР), не индуцировала инструментально регистрируемого иммунного ответа. После включения в эту плазмиду фрагмента гена внеклеточного домена гликопротеина sHA (бСВ2у) иммунизация свиней рекомбинантной плазмидой pCMV-sHAPQ вызывала сильный гуморальный иммунный ответ, но не защиту от последующего заражения вирулентным вирусом АЧС [120]. Для стимулирования преимущественно специфического CD8+-Т-клеточного ответа была предложена и испытана ДНК-конструкция рСМV-UbsHAPQ, включающая гены белков р30, р54, sHA и клеточного убиквитина (ЦЪ). Иммунизация свиней рСМV-UbsHAPQ не индуцировала формирования противовирусных антител, но обеспечивала частичную защиту от гибели от контрольного заражения гомологичным вирулентным вирусом АЧС. Протективность коррелировала с пролиферацией антиген-специфических СЭ8+-Т-клеток от иммунизированных животных [112]. Значимость убиквитинирования подтверждена результатами иммунизации свиней АББУ™ - ДНК-библиотекой кодирующей короткие рестрикционные фрагменты генома вируса АЧС, слитые с геном убиквитина. Частичная защита животных после контрольного заражения вирусом АЧС была достигнута при отсутствии инструментально определяемых антител, что, по

мнению авторов, подтверждает гипотезу о решающей роли cd8+-t-ktotok в формировании защиты от АЧС [124].

Исчерпывающих знаний о протективных белках вируса АЧС и особенностях формирования иммунологических механизмов защиты до сих пор нет. Перспективным подходом в решении указанных проблем является исследование антигенности, иммуногенности и протективности белков, экспрессируемых рекомбинантными плазмидами, включающими гены потенциально протективных белков.

Цель и задачи исследований. Целью работы являлось получение и изучение свойств ДНК-конструкций, кодирующих эктодомены белков CD2v, p30 и p54 вируса африканской чумы свиней.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. провести биоинформатический анализ трех потенциально протективных белков CD2v, р30 и р54 вируса АЧС штамма МК-200;

2. получить экспрессирующие плазмиды, кодирующие эктодомены белков CD2v, p30 и p54 вируса АЧС штамма МК-200;

3. исследовать антигенные свойства и полипептидный состав белков, синтезируемых в первичных и перевиваемых культурах клеток, трансфицированных полученными плазмидами;

4. изучить иммуногенные и протективные свойства белков, кодируемых рекомбинантными плазмидами.

Научная новизна результатов исследований. Получены три рекомбинантные эукариотические плазмиды с фрагментами генов вируса АЧС EP402R, CP204L, E183L, кодирующие эктодомены белков CD2v, p30, p54 вируса АЧС штамма МК-200 и три рекомбинантные эукариотические плазмиды, каждая из которых дополнительно включает лидирующую последовательность гена убиквитина.

Методами иммуноблоттинга и иммунофлуоресценции установлена

вирусная специфичность белков, синтезированных in vitro в результате

8

трансфекции перевиваемой (HEK293T) и первичной (лейкоцитов свиней) культур клеток плазмидами pCI-neo/ASFV/CD2v, pCI-neo/ASFV/p30 и pCI-neo/ASFV/p54.

Показано, что иммунизация свиней аутологичными лейкоцитами, трансфицированными in vitro плазмидами pCI-neo/ASFV/CD2v, pCI-neo/ASFV/p30 и pCI-neo/ASFV/p54, не индуцирует синтез вирусоспецифических антител и защиту от гомологичного вирулентного штамма вируса АЧС.

В результате иммунизации свиней смесью трех ДНК-конструкций, каждая из которых содержала ген убиквитина и фрагмент гена, кодирующего эктодомен одного из потенциально протективных белков (CD2v, р30, р54) вируса АЧС штамма МК-200, зарегистрировано формирование вирусоспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов.

Теоретическая и практическая значимость работы. На основании анализа научной литературы о структуре вирионов, иммуногенных и протективных свойствах белков вируса АЧС определен состав генов для конструирования кандидатных ДНК-вакцин.

Получены плазмидные конструкции pJET1.2/CD2v-M200/10, pJET1.2/p30-M200/2, pJET1.2/p54-M200/1, содержащие полноразмерный ген EP402R (CD2v) и фрагменты генов CP204L (p30), E183L (p54) вируса АЧС штамма МК-200 без изменения их рамок считывания.

Депонированы в GenBank нуклеотидные последовательности гена CP204L (GenBank MK211505) вирулентного штамма Мозамбик-78 и нуклеотидные последовательности генов CP204L (GenBank MK211506), E183L (GenBank MK234865) аттенуированного штамма МК-200 вируса АЧС.

В результате биоинформатического анализа аминокислотных последовательностей белков CD2v, p30 и p54 вируса АЧС штамма МК-200 выявлены их сигнальные, трансмембранные и цитоплазматические домены. Определены эктодомены, содержащие прогнозируемые T- и В-клеточные эпитопы, сайты N-гликозилирования и SLA-мотивы. На основе полученных

9

результатов обоснован выбор участков генов ЕР402Я (CD2v), СР204Е ф30), Е183Ь (р54) для конструирования целевых рекомбинантных ДНК.

Изучен антигенный, иммуногенный и протективный потенциал белков, кодируемых рекомбинантными плазмидами, содержащими эктодомены белков CD2v, p30 и p54 вируса АЧС.

Показано, что индукции вирусоспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов недостаточно для развития защиты от АЧС.

Созданные рекомбинантные плазмиды могут быть использованы для разработки кандидатных ДНК-вакцин.

Методология и методы исследования. В работе использовали молекулярно-биологические (выделение нуклеиновых кислот, ПЦР, рестрикция ДНК, секвенирование, клонирование, трансформация и трансфекция клеток), вирусологические (получение и культивирование первичных культур клеток, культивирование и титрование вируса, инфицирование животных), физико-химические (электрофорез нуклеиновых кислот и полипептидов, хроматография, спектрофотометрия, центрифугирование, рН-метрия), серологические (РЗГАд, ТФ ИФА, РПИФ), иммунохимические (ИБ, ELISpot) методы, статистический анализ.

Положения, выносимые на защиту:

1.Биоинформатический анализ аминокислотных последовательностей белков CD2v, р30 и р54 вируса АЧС штамма МК-200.

2. Конструкции эукариотических рекомбинантных плазмид рС1-neo/ASFV/CD2v, pa-neo/ASFV/p30 и pa-neo/ASFV/p54, кодирующие эктодомены генов ЕР402Я, СР204Ь и Е183Е вируса АЧС штамма МК-200, и рекомбинантных плазмид pUbb76A_CD2v, pUbb76A_p30, pUbb76A_p54, каждая из которых дополнительно включала в качестве лидирующей последовательность гена убиквитина под контролем цитомегаловирусного промотора.

3. Антигенные, иммуногенные и протективные свойства белков,

экспрессируемых сконструированными рекомбинантными плазмидами.

10

Личный вклад автора. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ФГБНУ ФИЦВиМ: д.в.н. В.М. Балышеву, д.б.н. С.Г. Юркову, к.б.н. А.С. Малоголовкину, к.б.н. А.С. Казаковой, к.в.н. С.П. Живодерову, к.б.н. В.М. Лыска, к.б.н. И.А. Титову, к.б.н. И.В. Ногиной за помощь в проведении отдельных этапов работы.

Степень достоверности и апробация результатов. Материалы диссертационной работы заслушаны и обсуждены на заседаниях ученого совета ФГБНУ ФИЦВиМ (2015-2019 гг.), XXV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (г. Москва, 2018), XII Международном конгрессе «Epizone» (г. Вена, Австрия, 2018 г.), Международной научно-практической конференции, посвященной 120-летию со дня создания ВИЭВ (г. Москва, 2018 г.), V Международной конференции молодых ученых, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов «ОрепВю» (пос. Кольцово, 2018 г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 5 статей - в рекомендованном ВАК Министерства образования и науки Перечне рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, заключение, приложения; иллюстрирована 10 таблицами и 32 рисунками. Список использованной литературы включает 244 источников, из них 187 иностранных.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Африканская чума свиней (АЧС) установлена более ста лет назад английским ученым Montgomery R.E. [176]. Возбудитель болезни - крупный оболочечный вирус семейства Asfarviridae, содержащий двухцепочечную линейную ДНК 170-190 т.п.о., кодирующую более 150 белков, большинство из которых вовлечены во взаимодействие «вирус-хозяин» [70]. Его вирулентные штаммы вызывают контагиозную геморрагическую болезнь со 100 % смертностью домашних свиней (Sus scrofa domesticus) и диких кабанов (Sus scrofa). В Африке АЧС поддерживается в цикле передачи между природными хозяевами — бородавочниками (Phacochoerus spp.), кустарниковыми свиньями (Potomochorus porcus) и мягкими клещами рода Ornithodoros [70]. Как правило, у них вирус АЧС вызывает субклиническую хроническую или инаппарантную форму инфекции. Эндемичность болезни в большинстве стран Африки (суб-Сахара) и Сардинии создает значительную опасность для свободных от заболевания стран. В 2007 г. в Грузии были зарегистрированы первые вспышки АЧС в кавказском регионе [65]. Оттуда болезнь проникла в Армению, Азербайджан, Нагорный Карабах, Иран, Абхазию, Россию. Далее АЧС распространилась на Украину, Беларусь, Латвию, Литву, Эстонию, Польшу, Румынию, Бельгию, Китай, КНДР, Республику Корея, Вьетнам [146, 108, 190, 69, 74].

2.1 Механизмы иммунитета при африканской чуме свиней

При острой, наиболее распространенной форме инфекции, 100 %

домашних свиней и европейских диких кабанов погибают в течение 5-10

суток после начала проявления клинических признаков. В то же время, ряд

высокопатогенных для домашних свиней штаммов вируса АЧС не является

смертельными для восприимчивых гигантских лесных, кистеухих,

кустарниковых свиней, бородавочников в Африке. Выделены в природе и

получены в лабораторных условиях в процессе аттенуации в культурах

клеток или направленного изменения генома вируса множество штаммов,

которые не вызывают гибели домашних свиней и способны формировать

12

защиту от последующего заражения гомологичными, но не гетерологичными, вирулентными штаммами [196, 224, 170, 230, 205]. Российскими учеными была экспериментально обоснована сероиммунотиповая классификация штаммов вируса АЧС, и получены живые культуральные вакцины из аттенуированных штаммов для временной защиты свиней от вируса АЧС I-V сероиммунотипов [19, 42, 97]. Все это свидетельствует о развитии у животных иммунной защиты против АЧС.

Гуморальный иммунитет.

Вирусоспецифические антитела рассматриваются как необходимый компонент защиты при АЧС. Перенос сыворотки или молозива от реконвалесцентов интактным свиньям может, в случае их последующего заражения вирулентным штаммом, может задержать проявление клинических симптомов болезни, уменьшить виремию и увеличить процент выживших особей [161, 210].

В частности, пассивный перенос конвалесцентной сыворотки защищал 85 % свиней от последующего заражения гомологичным штаммом Е75, при 100 % гибели контрольных животных, которым вводили иммуноглобулины от интактной свиньи [186]. Однако, механизмы реализации гуморального иммунного ответа уже длительное время остаются дискуссионными.

Вируснейтрализующие антитела.

Впервые о выявлении антител, нейтрализующих вирус АЧС in vitro, сообщили Parker J. и Plowright W. (1968) [184]. Проведенные различными научными группами в 80-х годах эксперименты позволили прийти к заключению, что вирус АЧС не индуцирует нейтрализующие антитела [237, 138]. Однако, с 90-х годов стало появляться все больше работ, отстаивающих гипотезу, что вируснейтрализующие антитела важны при формировании защиты от АЧС, что нашло отражение в исчерпывающем обзоре Escribano J. M. с соавт. [122].

Сообщалось, что сыворотка от конвалесцентной свиньи, которой инокулировали аттенуированный штамм E75CV1-4, нейтрализовала в

13

культурах клеток Vero и макрофагах свиньи 86-97 % инфекционности вирулентных штаммов, не только исходного штамма E75, но и E70, Lisbon 60, Malawi Lil 20/1 и низкопассажного культурального штамма Е75, обозначенного E75CV/V3 [238]. Сыворотка, полученная на 9-й день после введения свиньям аттенуированных штаммов, нейтрализовала более 50 % вирусной инфекционности [178]. Неожиданным стал факт, что иммунные сыворотки не обладали способностью к нейтрализации в культурах клеток вариантов вируса АЧС на высоком уровне пассажей, в частности, из штаммов Lisbon 60, Haiti, Dominican Republic I, Dominican Republic II, Brazil II. Сходные результаты были получены с моноклональными антителами к р72. Авторы предположили, что адаптация вируса приводит к утрате специфических детерминант, связанных с нейтрализацией вируса. Однако, затем сообщили, что обнаруженные различия не связаны с антигенной структурой, а обусловлены изменением состава фосфолипидов мембран [220].

Исследование сывороток от конвалесцентных животных показало, что в ходе инфекции белки вируса р72, р30 и р54 являются наиболее активными по антигенности и иммуногенности. Сыворотка свиней против рекомбинантного белка экспрессирующей конструкции, включающей гены, кодирующие p72, p30 и p54, нейтрализовала 70 % инфекционности вируса АЧС. Антитела к р72 и р54 ингибировали прикрепление вирионов к клеткам, в то время как антитела к р30 - проникновение вируса внутрь клеток [90, 140, 226]. Интересно, что антисыворотка к рекомбинантному оболочечному белку прикрепления р12 не снижала инфекционность вируса АЧС в опытах in vitro [178].

Иммунизация свиней комбинацией вирусных белков р54 и р30-32 приводила к отсрочке начала проявления клинических симптомов болезни после инфицирования животных вирулентным штаммом возбудителя [78, 220, 177].

Российские исследователи не получили экспериментального подтверждения нейтрализации вируса АЧС. Титрование инкубированного с антителами от конвалесцентных животных и комплементом вируса АЧС штамма Франция-32 показало отсутствие какого-либо нейтрализующего эффекта, в том числе и по типу комплементзависимого виролиза [25]. По данным электронной микроскопии иммунный комплекс вирион+антитело беспрепятственно проникает в чувствительные клетки. По мнению Макарова В.В. [23, 25], специфика макрофагов, как клеток-мишеней, прежде всего их фагоцитирующая способность, исключает необходимость рецепторного механизма начального этапа взаимодействия вирус-клетка. Кроме того, размеры вируса АЧС делают его объектом «компетенции» фагоцитоза, опсонизация вирионов в результате образования иммунных комплексов на их поверхности неизбежно благоприятствует их проникновению и дезинтеграции за счет опсонинопосредованной активации фагоцитоза [23, 25].

Антителозависимая клеточная цитотоксичность.

Часть феноменов, особенно in vivo, которые пытались объяснить нейтрализацией вируса, получили иную трактовку, когда были продемонстрированы антителоопосредованный цитолиз зараженных вирусом АЧС моноцитов и макрофагов в реакциях комплементзависимого цитолиза и антителозависимой клеточной цитотоксичности [13, 179, 180]. АЗКЦ регистрировали уже на третьи-шестые сутки после инокуляции свиньям

о Q

аттенуированного штамма ФК-32/135 в дозе 10 , ГАЕ50 или

3 0

умеренновирулентного штамма ФНГ в дозе 10 , ТЦД50. Поскольку в эти же сроки методом радиоиммунопреципитации в сыворотках крови животных обнаруживали антитела к полипептидам с м.м. 14, 30, 38, 69, 95 кДа, то можно предположить, что именно они, или часть из них, и опосредуют КЗЦ и АЗКЦ. По данным Шубиной Н.Г. с соавт. (1993) иммунизация свиней очищенными белками р14, р25, р28, р31, р38, р73 индуцировало лизис зараженных вирусом АЧС клеток по механизмам КЦЗ и АЗКЦ [33].

15

Клеточно-опосредованный иммунитет.

Получены факты, указывающие на важную роль клеточно-опосредованных иммунных механизмов для выживания свиней при АЧС: были продемонстрированы изменение активности нормальных киллеров (№ киллеров) и формирование ЦТЛ [182, 181].

Натуральные киллеры.

Роль ^киллеров в защите против АЧС была показана в исследованиях с использованием свиней, инокулированных авирулентным штаммом МНУ, когда наблюдали две формы инфекции: свиней без клинических проявлений и свиней, у которых развивалась хроническое течение болезни. При острой и подострой формах течения АЧС активность ^киллеров снижалась на 3-6 сутки после заражения с последующем приближением к норме в случае выживания животных. У свиней с хронической формой АЧС не наблюдали изменений в активности ^киллеров (по сравнению с контрольными животными), через 14 суток после инфицирования у животных регистрировали лихорадку и виремию, а также высокие уровни специфических антивирусных антител с маркерами

гипергаммаглобулинемии, включающих IgG1, IgG2, ^М и ^А. При асимптоматическом течении болезни виремия редко наблюдалась на поздних стадиях инфекции, уровни сывороточных ^ были неизменными, концентрации специфических антител к вирусу АЧС были относительно низкими, но уровни активности ^киллеров были очень высокими. Эти животные оставались клинически здоровыми после заражения вирулентным штаммом L60 [224]. Полученные результаты свидетельствуют о важной роли ^киллеров в формировании устойчивости свиней к инфекции.

Цитотоксические Т-лимфоциты.

Значение ЦТЛ в обеспечении вирусспецифической защиты в ранние

сроки после инфицирования вирусом АЧС впервые было

продемонстрировано в середине 80-х годов [73, 181, 240]. Было показано, что

только очищенные CD8+ лимфоциты, но не очищенные CD4+ лимфоциты,

16

обладали киллерной активностью и эту функцию блокировали анти CD8+ антитела.

Активность АЧС-специфичных ЦТЛ была исследована на SLA инбредных минипигах, экспериментально инокулированных авирулентным штаммом NHV вируса АЧС. Вторичные ЦТЛ были активированы in vitro в культуре клеток лейкоцитов крови посредством рестимуляции эффекторных клеток низкими дозами гомологичного штамма вируса АЧС в течение 48-72 часов. Было показано, что ЦТЛ активность была ограничена рестрикцией по SLA I потому, что (1) блокирование антигенов клеток-мишеней моноклональными антителами против антигенов SLA I приводило к значительному сокращению активности ЦТЛ; (2) существовал предпочтительный лизис соответствующих по SLA I зараженных вирусом АЧС клеток-мишеней; (3) разрушение клеток-эффекторов CD8+ специфическими моноклональными антителами и комплементом приводило к уменьшению активности ЦТЛ. Лизис цитотоксическими Т-лимфоцитами макрофагов, инфицированных гомологичным вирулентным штаммом L60, был выше лизиса макрофагов, инфицированных гетерологичными штаммами DR-II и Tengani [71]. Последнее свидетельствовало, что ЦТЛ иммунотипоспецифичны.

Решающая роль вирусоспецифических ЦТЛ в защите от АЧС была подтверждена демонстрацией того, что истощение моноклональными антителами in vivo CD8+ T-лимфоцитов аннулирует защитный иммунитет [153]. Свиньи, инокулированные аттенуированным штаммом OUR/T88/3 и через месяц обедненные CD8+ лимфоцитами посредством 5-6 дневного введения моноклональных антител к CD8+, утратили защиту от последующего заражения вирулентным штаммом OUR/T88/1, реагируя виремией и лихорадкой.

Следует отметить, что методическая возможность выявления первичных ЦТЛ зависит от дозы и биологических свойств штаммов вируса АЧС. Наглядно это продемонстрировано в исследованиях Середы А.Д.

17

(2010), в которых требование SLA I рестрикции было достигнуто путем использования в качестве клеток-мишеней культуры клеток А-клеток лейкоцитов периферической крови, взятой от свиньи до инокуляции вируса (0 день), а клеток-эффекторов - аутологичных лимфоцитов периферической крови, взятой в период с 1 по 12 день после инокуляции вируса АЧС [48]. На 6-8 день после инокуляции свиньям аттенуированного штамма ФК-32/135 в

о с

дозе 10 , ГАЕ50 специфический цитолиз А-клеток, зараженных штаммом ФК-32/135, клетками-эффекторами достигал 20 %, в дозе 106,0 ГАЕ50 - 5 %, в дозе

3 0

1030 ГАЕ50 - 0 %. Инокуляция свиньям вирулетного штамма Франция-32 в перечисленных дозах не индуцировала клеточно-опосредованного цитолиза клеток-мишеней, зараженных штаммами Франция-32 или ФК-32/135 [53]. Последний факт, по-видимому, свидетельствует о маскированном состоянии иммунодоминантных эпитопов мишеневого белка у штамма Франция-32. Оказалось, что проблема презентации мишеневых антигенов проявляется не только на уровне эффекторных реакций, но и на уровне их распознавании Т-хелперами. Спленоциты подсвинка, инокулированного авирулентным штаммом ФК-32/135, в присутствии А-клеток, зараженных штаммом ФК-32/135, продуцировали интерлейкин-2 в количествах, как при стимуляции митогенами. В присутствии А-клеток, зараженных умеренновирулентным штаммом ФНГ, продукция интерлейкина-2 была в 2,5 раза ниже, а штаммом Франция-32 - в 6-7 раз ниже. Следует отметить, что спленоциты подсвинка, инокулированного штаммом ФК-32/135, в присутствии аутологичных А-клеток, зараженных гетерологичным в сероиммунотиповом отношении штамма Мозамбик-78, интерлейкин-2 не продуцировали вовсе.

Синергизм протективных механизмов иммунитета.

Исходя их сроков инкубационного периода и гибели животных при

АЧС, вероятно, исход заболевания определяется динамикой развития

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Иматдинов Алмаз Рамисович, 2019 год

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Антигенные свойства вируса африканской чумы свиней в искусственных и естественных смешанных популяциях / А.Д. Середа, В.М. Балышев, Ю.П. Моргунов [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2014. -№ 4. - С. 64-69.

2. Ашмарин, И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов / И.П. Ашмарин, Н.Н. Васильев, В.А. Амбросов - Л.: Издательство Ленинградского университета, 1974. - 76с.

3. Бейли, Н. Статистические методы в биологии / Н. Бейли -Москва: Изд-во иностранной литературы, 1962. - 260с.

4. Биологические свойства вируса африканской чумы свиней / Ф.А. Бадаев, Э.В. Рудобельский, С.Ф. Чевелев [и др.] // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. Конф. ВНИИВВиМ. - Т.1. - Покров, 1992. - С. 24-27.

5. Биологические характеристики штаммов вируса африканской чумы свиней 8-го сероиммунотипа, адаптированных к перевиваемой линии клеток СОS-1 / Ю.П. Моргунов, А.С. Малоголовкин, С.Ю. Моргунов [и др.] // Ветеринария. - 2015. - № 10. - С. 53-57.

6. Бредихина, Т.Г. Некоторые биологические свойства аттенуированного штамма «КЦ-160» вируса АЧС 1 серотипа. Сообщение 1. Реактогенность и реверсибельность / Т.Г. Бредихина, В.М. Колосов // Тезисы науч. - теор. конф. ВНИИВВиМ, посвященной 60-летию образования СССР. -Покров, 1983. - С. 123-124.

7. Бредихина, Т.Т. Селекция аттенуированного варианта вируса АЧС 1 серотипа из штамма «Катанга-105». / Т.Т. Бредихина, В.М. Колосов, С.Н. Архипова // Тез. науч.-теор. конф. ВНИИВВиМ, посвященной 60-летию образования СССР. - Покров, 1983. - С. 120-123.

8. Бурлаков, В.А. Иммунологические свойства вируса и проблемы разработки средств специфической профилактики АЧС: дис. ... д-ра

ветеринарных наук / Бурлаков Валентин Александрович. - Покров, 1979. -478с.

9. Витин, В.Г. Индукция ранней защиты от африканской чумы у свиней, вакцинированных концентратами вирус-вакцин / В.Г. Витин, В.А. Мищанин // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1988. - С. 119-122.

10. Дифференциация вирулентных и аттенуированных штаммов вируса АЧС в РЗГА / Н.И. Митин, А.А. Шевченко, В.М. Балышев [и др.] // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. Тезисы науч. конф. ВНИИВВиМ, посвященной 40-летию Великой Победы. -Покров, 1985. - С. 39-41.

11. Жестерев, В.И. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма КК-262 ППК вируса АЧС II типа / В.И. Жестерев, В.А. Мищанин, Р.В. Кошелева // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Т.1.-Покров, 1986. - С. 386-389.

12. Иматдинов, И.Р. Конструирование и клонирование искусственных генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт: дис. ... канд. биол. наук: 03.01.06, 03.02.02 / Иматдинов Ильназ Рамисович. - Покров, 2014. - 161 с.

13. Иммунные реакции на вирус африканской чумы свиней / А.Д. Середа, С.Л. Соловкин, Л.Г. Фугина [и др.] // Вопросы вирусологии. - 1992. -Т. 37, № 3-4. - С. 168-170.

14. Иммунологический алгоритм оценки протективного потенциала вирусных компонентов (Изучение препаратов очищенного инактивированного вируса африканской чумы свиней) / В.В. Макаров, В.С. Перзашкевич, А.Д. Середа [и др.] // Вестник РАСХН. - 1995. - № 6. - С. 6062.

15. Инструкция о мероприятиях по предупреждению и ликвидации африканской чумы свиней (Утверждена Главным управлением ветеринарии Министерства сельского хозяйства СССР 21 ноября 1980 г.).

138

16. Истомин, С.В. Изучение напряженности иммунитета у поросят, полученных от свиноматок, вакцинированной против АЧС вакциной штамма «МК-200» / С.В. Истомин, С.В. Миколайчук, Г.Г. Юрков // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Т.1. - Покров, 1986. - С.401-403.

17. Коваленко, Я.Р. Африканская чума свиней / Я.Р. Коваленко, М.А. Сидоров, Л.Г. Бурба - Москва: Колос, 1972. - 200с.

18. Колбасов, Д.В. Вопросы биологии вируса африканской чумы свиней в клещах / Д.В. Колбасов, А.Д. Середа // Ветеринария. - 2013. - № 1. - С. 19-23.

19. Колбасов, Д.В. Итоги разработки живых вакцин против африканской чумы свиней / Д.В. Колбасов, В.М. Балышев, А.Д. Середа // Ветеринария. - 2014. - Т. 8. - С. 3-8.

20. Коромыслов, Е.В. Распределение и накопление вакцинного штамма «ФК» вируса АЧС в органах и тканях свиней при различных методах вакцинации / Е.В. Коромыслов // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1984. - С. 244-246.

21. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин - Москва: Высшая школа, 1980. - 352с.

22. Макаров, В.В. Африканская чума свиней / В.В. Макаров -Москва: РУДН, 2011. - 286с.

23. Макаров, В.В. Иммунологическая концепция африканской чумы свиней (некоторые итоги исследований) / В.В. Макаров // Ветеринарная практика - 2013. - Т. 62, № 3. - С. 7-22.

24. Макаров, В.В. Популяционная структура вируса африканской чумы свиней по признаку количественной гемадсорбции / В.В. Макаров // Вопросы вирусологии - 1991. - № 4. - С. 321-324.

25. Макаров, В.В. Реакции вируса африканской чумы свиней с антителами и причины отсутствия нейтрализации / В.В. Макаров, М.С. Малахова, Н.А. Власов // Доклады ВАСХНИЛ. - 1991. - № 12. - С. 27-31.

26. Макаров, В.В. Эпизоотологическая характеристика вируса африканской чумы свиней / В.В. Макаров, О.И. Сухарев, И.В. Цветнова // Ветеринарная практика - 2013. - Т. 1, № 60. - С. 6-16.

27. Малахова, М.С. Взаимодействие вируса АЧС с иммунокомпетентными клетками свиньи: дисс. ... канд. биол. наук: 03.00.06 / Малахова Марина Станиславовна. - Покров, 1987. - 237с.

28. Межклеточные взаимодействия в культурах клеток костного мозга свиньи и ППК-66б, зараженных вирусом африканской чумы / Н.Г. Шубина, А.А. Колонцов, М.С. Малахова [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1996. - Т. 122, № 10. - С. 418424.

29. Моргунов, Ю.П. Разработка вирусвакцины из штамма ТСП-80/300 против АЧС, вызываемой вирусом 5-го серотипа / Ю.П. Моргунов, Ю.И. Петров, Н.И. Митин // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1989. - С. 130-132.

30. Новые подходы и перспективы разработки эффективных вакцин против АЧС, вызываемой вирусом I серотипа / Ю.И. Петров, Н.И. Митин, Л.Л. Черятников [и др.] // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Т.1. - Покров, 1989.- С. 128-130.

31. Петров, Ю.И. Вопросы стандартизации вакцинных препаратов против АЧС / Ю.И. Петров, Н.Т. Татаринцев, Л.Л. Черятников // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Т.1. - Покров, 1986. - С. 178181.

32. Петров, Ю.И. Живые вакцины против АЧС, разработка, условия применения и ограничения / Ю.И. Петров // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1988.- С. 37-42.

33. Полипептиды вируса африканской чумы свиней-индукторы мишени иммунологических реакций, направленных на элиминирование зараженных клеток / Н.Г. Шубина, А.А. Колонцов, А.А. Песковацков [и др.] // Российская сельскохозяйственная наука. - 1993. - № 5. - С. 44-45.

140

34. Получение вакцинного штамма «МК» / В.А. Бурлаков, Н.И. Митин, А.П. Котельников [и др.] // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1981. - С. 152-153.

35. Получение типовых задерживающих гемадсорбцию референс-сывороток к вирусу африканской чумы свиней / В.М. Балышев, М.В. Болгова, В.И. Балышева [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2015. - № 2. - С. 23-25.

36. Разработка и апробация вирусвакцины против АЧС 3-го серотипа / Ю.И. Петров, Н.И. Митин, А.П. Котельников [и др.] // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1985. - С.18-24.

37. Разработка микрометода типизации вируса африканской чумы свиней / В.М. Балышев, И.В. Федорищев, М.В. Салина [и др.] // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы науч. -практ. конф. ВНИИВВиМ - Покров, 1995. - С. 143-144.

38. Реактогенные и иммуногенные свойства аттенуированного штамма Катанга-350 вируса АЧС / В.И. Репин, Л.Л. Черятников, Ю.И. Петров [и др.] // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы науч.-практ. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - Покров, 1995. - С. 140141.

39. Селекция аттенуированнго варианта вируса АЧС 8 серотипа (шт. Родезия-2) после УФ-облучения / В.Г. Кротков, Н.И. Митин, Ю.И. Петров [и др.] // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Покров, 1989. - С. 133-134.

40. Селянинов, Ю.О. Вирус африканской чумы свиней: физическое картирование генома штаммов / Ю.О. Селянинов, В.М. Балышев, С.Ж. Цыбанов // Вестник российской сельскохозяйственной науки - 2000. - № 5. -С. 75-76.

41. Середа А.Д. Гликопротеины вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, Е.Г. Анохина, В.В. Макаров // Вопросы вирусологии. - 1994. -Т. 39, № 6. - С. 278-281.

42. Середа, А.Д. Антигенное разнообразие вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, В.М. Балышев // Вопросы вирусологии. - 2011. - Т. 56, № 4. - С. 38-42.

43. Середа, А.Д. Идентификация изолятоспецифического гликополипептида вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа, В.В. Макаров // Ветеринария. - 1992. - № 1. - С. 22-24.

44. Середа, А.Д. Иммуногенные и протективные свойства гликопротеинов вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа // Актуальные вопросы ветеринарной биологии - 2013. - Т. 20, № 4. С. 31-35.

45. Середа, А.Д. Количественное определение антигенного родства гемадсорбирующих штаммов вируса АЧС / А.Д. Середа // Ветеринария. -2011. - № 6. - С. 26-28.

46. Середа, А.Д. Моделирование in vitro защитных иммунных механизмов при африканской чуме свиней / А.Д. Середа // Сельскохозяйственная биология. - 2013. - Т. 48, № 4. - С. 59-64.

47. Середа, А.Д. Определение серотиповой специфичности негемадсорбирующих штаммов вируса африканской чумы свиней / А.Д. Середа // Научый журнал КубГАУ. - 2010. - № 62. - С. 122-127.

48. Середа, А.Д. Противоклеточные эффекторы иммунитета при африканской чуме свиней / А.Д. Середа // Научый журнал КубГАУ. - 2010. -№ 62. - С. 138-146.

49. Середа, А.Д. Серологические и физико-химические свойства ГП 110-140 вируса АЧС / А.Д. Середа, Е.В. Анохина, Л.Г. Фугина // Ветеринария. - 1993. - № 1. - С. 26-28.

50. Сероиммунологическая классификация природных изолятов вируса африканской чумы свиней / И.Ф. Вишняков Н.И. Митин, Ю.И. Петров [и др.]. // Актуальные вопросы ветеринарной вирусологии: материалы науч.-практ. конф. ВНИИВВиМ. - Покров, 1995. - С. 141-143.

51. Сероиммунологическая принадлежность вируса африканской чумы свиней, выделенного в Российской Федерации / В.М. Балышев, Ю.Ф.

142

Калантаенко, М.В. Болгова [и др.] // Доклады РАСХН. - 2011. - № 5. - С.52-53.

52. Сравнительный анализ показателей функциональной активности гуморального и клеточного иммунитета при вирусных инфекциях in vivo / В.В. Макаров, И.Ф. Вишняков, А.А. Коломыцев [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. - Т. 120, № 12. - С. 599602.

53. Тестирование первичных вирусспецифических Т-лимфоцитов свиней / А.Д. Середа, С.Л. Соловкин, Е.К. Сенечкина [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 1994. - № 6. - С. 112-115.

54. Тестирование первичных вирусспецифических Т-лимфоцитов свиней / А.Д. Середа, С.Л. Соловкин, Е.К. Сенечкина [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 1994. - № 6. - С. 112-115.

55. Функциональная роль гликозилирования вирусных компонентов /

B.В. Макаров, А.Д. Середа, А.А. Пиря [и др.] // Вопросы вирусологии. - 1992. - № 5-6. - С. 267-270.

56. Экология вируса африканской чумы свиней / Ф.А. Бадаев, Л.Л. Черятников, Э.В. Рудобельский [и др.] // Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. Конф. ВНИИВВиМ. - Т.1.- Покров, 1992. - С. 44.

57. Экспериментальная оценка концентрированной лиофилизированной вакцины против АЧС из штамма МК200 3-го серотипа /

C.В. Истомин, С.В. Миколайчук, С.Г. Юрков [и др.] // Тезисы докладов научной конференции ВНИИВВиМ. - Т.1.- Покров, 1986. - № 1. - С. 301304.

58. A DNA vaccine expressing the E2 protein of classical swine fever virus elicits T cell responses that can prime for rapid antibody production and confer total protection upon viral challenge / L. Ganges, M. Barrera, J.I. Nunez [et al.] // Vaccine - 2005. - Vol. 23, N 28. - P. 3741-3752.

59. A novel DNA vaccine based on ubiquitin-proteasome pathway targeting 'self-antigens expressed in melanoma/melanocyte / M. Zhang, C. Obata, H. Hisaeda [et al.] // Gene Ther. - 2005. - Vol. 12, N 13. - P. 1049-1057.

60. A novel monoclonal antibody inhibits the immune response of human cells against porcine cells: identification of a porcine antigen homologous to CD58 / K. Crosby, C. Yatko, H. Dersimonian [et al.] // Transplantation. - 2004. - Vol. 77, N 8. - P. 1288-1294.

61. A pseudotype baculovirus-mediated vaccine confers protective immunity against lethal challenge with H5N1 avian influenza virus in mice and chickens / Q. Wu, L. Fang, X. Wu [et al.] // Mol. Immunol. - 2009. - Vol. 46, N 11-12. - P. 2210-2217.

62. Adjuvants and delivery systems in veterinary vaccinology: current state and future developments / P.M.H. Heegaard, L. Dedieu, N. Johnson [et al.]// Arch. Virol. - 2011. - Vol. 156, N 2. - P. 183-202.

63. African swine fever // Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals (mammals, birds and bees). - Paris, 2012. - Vol. 2, Chapter 2.8.1. - P. 1067-1079.

64. African swine fever in Madagascar: Epidemiological assessment of the recent epizootic / F. Roger, C. Cruciere, N. Randriamahefa [et al.] // Proceedings of the 9th Internafional Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics. - 2000 - P. 230-245.

65. African swine fever in the North Caucasus region and the Russian Federation in years 2007-2012 / A. Gogin, V. Gerasimov, A. Malogolovkin [et al.] // Virus Res. - 2013. - Vol. 173, N 1. - P. 198-203.

66. African swine fever virus CD2v and C-type lectin gene loci mediate serological specificity / A. Malogolovkin, G. Burmakina, E.R. Tulman [et al.] // J. Gen. Virol. - 2015. - Vol. 96, N 4. - P. 866-873.

67. African swine fever virus encodes a CD2 homolog responsible for the adhesion of erythrocytes to infected cells. / J.M. Rodriguez, R.J. Yanez, F. Almazan [et al.] // J. Virol. - 1993. - Vol. 67, N 9. - P. 5312-5320.

144

68. African swine fever virus is enveloped by a two-membraned collapsed cisterna derived from the endoplasmic reticulum. / G. Andrés, R. García-Escudero, C. Simón-Mateo [et al.] // J. Virol. - 1998. - Vol. 72, N 11. - P. 8988-9001.

69. African swine fever virus isolate, Georgia, 2007 / R.J. Rowlands, V. Michaud, L. Heath [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 14, N 12. - P. 1870-1874.

70. African swine fever virus proteins involved in evading host defence systems / L.K. Dixon, C.C. Abrams, G. Bowick [et al.] // Vet. Immunol. Immunopathol. - 2004. - Vol. 100, N 3-4. - P. 117-134.

71. African swine fever virus specific porcine cytotoxic T cell activity / C.L.V. Martins, M.J.P. Lawman, T. Scholl [et al.] // Arch. Virol. - 1993. - Vol. 129, N 1-4. - P. 211-225.

72. African Swine Fever Virus Structural Protein p72 Contains a Conformational Neutralizing Epitope / M.V. Borca, P. Irusta, C. Carrillo [et al.] // Virology - 1994. - Vol. 201, N 2. - P. 413-418.

73. African swine fever virus-specific cytotoxic T lymphocytes recognize the 32 kDa immediate early protein (vp32) / F. Alonso, J. Domínguez, E. Viñuela [et al.] // Virus Res. - 1997. - Vol. 49, N 2. - P. 123-130.

74. African swine fever: A re-emerging viral disease threatening the global pig industry / P.J. Sánchez-Cordón, M. Montoya, A.L. Reis [et al.] // Vet. J.

- 2018. - Vol. 233. - P. 41-48.

75. An African Swine Fever Virus Gene with Similarity to the T-Lymphocyte Surface Antigen CD2 Mediates Hemadsorption / M.V. Borca, G.F. Kutish, C.L. Afonso [et al.] // Virology - 1994. - Vol. 199, N 2. - P. 463-468.

76. Andrés, G. Assembly of African swine fever virus: role of polyprotein pp220. / G. Andrés, C. Simon-Mateo, E. Vinuela // J. Virol. - 1997. - Vol. 71, N 3.

- P. 2331-2341.

77. Antigen delivery systems for veterinary vaccine development: Viral-vector based delivery systems / A. Brun, E. Albina, T. Barret [et al.] // Vaccine -2008. - Vol. 26, N 51. - P. 6508-6528.

78. Antigenic and immunogenic properties of a chimera of two immunodominant African swine fever virus proteins / M.G. Barderas, F. Rodríguez, P. Gómez-Puertas [et al.] // Arch. Virol. - 2001. - Vol. 146, N 9. - P. 1681-1691.

79. Antigenic properties and diagnostic potential of African swine fever virus protein pp62 expressed in insect cells / C. Gallardo, E. Blanco, J.M. Rodríguez [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44, N 3. - P. 950-956.

80. BacMam immunization partially protects pigs against sublethal challenge with African swine fever virus. / J.M. Argilaguet, E. Pérez-Martín, S. López [et al.] // Antiviral Res. - 2013. - Vol. 98, N 1. - P. 61-65.

81. BacMam-Mediated Gene Delivery into Multipotent Mesenchymal Stromal Cells / O'Grady M., Batchelor R.H., Scheyhing K., [et al.] // Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols) / ed. M. Vemuri, L. Chase, M. Rao. - Humana Press, 2011. - Vol. 698. - P. 485-504.

82. Baculovirus vectors for efficient gene delivery and expression in mammalian cells / N.N. Koroleva, P.V. Spirin, A.V. Timokhova [et al.] // Mol. Biol. - 2010. - Vol. 44, N 3. - P. 479-487.

83. BepiPred-2.0: improving sequence-based B-cell epitope prediction using conformational epitopes / M.C. Jespersen, B. Peters, M. Nielsen [et al.] // Nucleic Acids Res. - 2017. - Vol. 45, N 1. - P. 24-29.

84. Blome, S. Modern adjuvants do not enhance the efficacy of an inactivated African swine fever virus vaccine preparation / S. Blome, C. Gabriel, M. Beer // Vaccine - 2014. - Vol. 32, N 31. - P. 3879-3882.

85. Boyle, J.S. Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion antigen that is directed to sites of immune induction / J.S. Boyle, J.L. Brady, A.M. Lew // Nature - 1998. - Vol. 392, N 6674. - P. 408-411.

86. Breese, S.S. Electron microscopy of African swine fever virus hemadsorption. / S.S. Breese, W.R. Hess, W.R. Hess // J. Bacteriol. - 1966. - Vol. 92, N 1. - P. 272-274.

87. Cantlon, J. Immune responses in mice, cattle and horses to a DNA vaccine for vesicular stomatitis / J. Cantlon, P. Gordy, R. Bowen // Vaccine -2000. - Vol. 18, N 22. - P. 2368-2374.

88. Cellular immunity in ASFV responses / H.-H. Takamatsu, M.S. Denyer, A. Lacasta [et al.] // Virus Res. - 2013. - Vol. 173, N 1. - P. 110-121.

89. Characterization and molecular basis of heterogeneity of the African swine fever virus envelope protein p54. / F. Rodriguez, C. Alcaraz, A. Eiras [et al.] // J. Virol. - 1994. - Vol. 68, N 11. - P. 7244 -7252.

90. Characterization of P30, a highly antigenic membrane and secreted protein of African Swine Fever Virus / C.L. Afonso, C. Alcaraz, A. Brun [et al.] // Virology - 1992. - Vol. 189, N 1. - P. 368-373.

91. Characterization of pathogenic and non-pathogenic African swine fever virus isolates from Ornithodoros erraticus inhabiting pig premises in Portugal / F.S. Boinas, G.H. Hutchings, L.K. Dixon [et al.] // J. Gen. Virol. - 2004. - Vol. 85, N 8. - P. 2177-2187.

92. Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi // Anal. Biochem. - 1987. - Vol. 162, N 1. - P. 156-159.

93. Co-expression of Ubiquitin gene and capsid protein gene enhances the potency of DNA immunization of PCV2 in mice / F. Fu, X. Li, Y. Lang [et al.] // Virol. J. - 2011. - Vol. 8, N 1. - P. 264.

94. Coggins, L. African swine fever virus. Pathogenesis. / L. Coggins // Prog. Med. Virol. - 1974. - Vol. 18. - P. 48-63.

95. Coggins, L. Segregation of a nonhemadsorbing African swine fever virus in tissue culture. / L. Coggins // Cornell Vet. - 1968. - Vol. 58, N 1. - P. 1220.

96. Coggins, L. Studies with hinde attenuated African swine fever virus. / L. Coggins, J.E. Moulton, G.S. Colgrove // Cornell Vet. - 1968. - Vol. 48, N 4. -P. 525-540.

97. Comparative analysis of African swine fever virus genotypes and serogroups. / A. Malogolovkin, G. Burmakina, I. Titov [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2015. - Vol. 21, N 2. - P. 312-315.

98. Comparison of a Radioimmunoprecipitation Assay to Immunoblotting and ELISA for Detection of Antibody to African Swine Fever Virus / C. Alcaraz, M. De Diego, M. J. Pastor [et al.] // J. Vet. Diagnostic Investig. - 1990. - Vol. 2, N 3. - P. 191-196.

99. Comparison of the genome sequences of non-pathogenic and pathogenic African swine fever virus isolates / D.A.G. Chapman, V. Tcherepanov, C. Upton [et al.] // J. Gen. Virol. - 2008. - Vol. 89, N 2. - P. 397-408.

100. Condreay, J. Baculovirus Expression Vectors for Insect and Mammalian Cells / J. Condreay, T. Kost // Curr. Drug Targets. - 2007. - Vol. 8, N 10. - P. 1126-1131.

101. Construction and immunogenicity of pseudotype baculovirus expressing GP5 and M protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus / S. Wang, L. Fang, H. Fan [et al.] // Vaccine. - 2007. - Vol. 25, N 49. - P. 8220-8227.

102. Coxsackievirus-adenovirus receptor genetically fused to anti-human CD40 scFv enhances adenoviral transduction of dendritic cells / A.V Pereboev, C.K. Asiedu, Y. Kawakami [et al.] // Gene Ther. - 2002. - Vol. 9, N 17. - P. 11891193.

103. Deletion of a CD2-like gene, 8-DR, from African swine fever virus affects viral infection in domestic swine. / M.V. Borca, C. Carrillo, L. Zsak [et al.] // J. Virol. - 1998. - Vol. 72, N 4. - P. 2881-2889.

104. Detection of African swine fever virus antibodies by immunoblotting assay. / M.J. Pastor, M.D. Laviada, J.M. Sanchez-Vizcaino [et al.] // Can. J. Vet. Res. - 1989. - Vol. 53, N 1. - P. 105.

105. Detection of African Swine Fever Virus Antibodies in Serum and Oral Fluid Specimens Using a Recombinant Protein 30 (p30) Dual Matrix Indirect

ELISA / L.G. Giménez-Lirola, L. Mur, B. Rivera [et al.] // PLoS One. - 2016. -Vol. 11, N 9: e0161230.

106. DeTray, D.E. African swine fever / D.E. DeTray // Adv. Anim. Vet. Sci. - 1963. - N 8. - P. 299-333.

107. Direct gene transfer into nonhuman primate myofibers in vivo / S. Jiao, P. Williams, R.K. Berg [et al.] // Hum. Gene Ther. - 1992. - Vol. 3, N 1. - P. 21-33.

108. Dixon, L.K. African swine fever / L.K. Dixon, H. Sun, H. Roberts // Antiviral Res. - 2019. - Vol. 165. - P. 34-41.

109. Dixon, L.K. Genetic Diversity of African Swine Fever Virus Isolates from Soft Ticks (Ornithodoros moubata) Inhabiting Warthog Burrows in Zambia / L.K. Dixon, P.J. Wilkinson // J. Gen. Virol. - 1988. - Vol. 69, N 12. - P. 29812993.

110. DNA immunization with bovine herpesvirus-1 genes. / L.A. Babiuk, P.J. Lewis, G. Cox [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 1995. - Vol. 772. - P. 47-63.

111. DNA immunization with minigenes: low frequency of memory cytotoxic T lymphocytes and inefficient antiviral protection are rectified by ubiquitination / F. Rodriguez, L.L. An, S. Harkins [et al.] // J. Virol. - 1998. - Vol. 72, N 6. - P. 5174-5181.

112. DNA Vaccination Partially Protects against African Swine Fever Virus Lethal Challenge in the Absence of Antibodies / J.M. Argilaguet, E. Pérez-Martín, M. Nofrarías [et al.] // PLoS One. - 2012. - Vol. 7, N 9: e40942.

113. DNA vaccines expressing B and T cell epitopes can protect mice from FMDV infection in the absence of specific humoral responses / B. Borrego, P. Fernandez-Pacheco, L. Ganges [et al.] // Vaccine. - 2006. - Vol. 24, N 18. - P. 3889-3899.

114. Effect of tunicamycin on the biogenesis of hepatitis C virus glycoproteins / N. Reszka, E. Krol, A.H. Patel [et al.] // Acta Biochim. Pol. - 2010. - Vol. 57, N 4. - P. 541.

115. Ekue, N.F. Comparison of genomes of African swine fever virus isolates from Cameroon, other African countries and Europe / N.F. Ekue, P.J. Wilkinson // Rev. Elev. Med. Vet. Pays trop..- 2000. - Vol. 53, N 3. - P. 229-238.

116. Electron microscopic study of hemadsorption on vaccinia virus infected cells / Y. Saburi, K. Okuda, T. Takahashi [et al.] // Microbiol. Immunol. -1977. - Vol. 21, N 10. - P. 593-600.

117. ELISPOT assays provide reproducible results among different laboratories for T-cell immune monitoring—even in hands of ELISPOT-inexperienced investigators / W. Zhang, R. Caspell, A.Y. Karulin [et al.] // J. Immunotoxicol. - 2009. - Vol. 6, N 4, - P. 227-234.

118. Emergence of African swine fever virus, northwestern Iran / P. Rahimi, A. Sohrabi, J. Ashrafihelan [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 16, N 12. - P. 1946.

119. Enhancement of the priming efficacy of DNA vaccines encoding dendritic cell-targeted antigens by synergistic toll-like receptor ligands / C. Grossmann, M. Tenbusch, G. Nchinda [et al.] // BMC Immunol. - 2009. - Vol. 10, N 1. - P. 43.

120. Enhancing DNA immunization by targeting ASFV antigens to SLA-II bearing cells. / J.M. Argilaguet, E. Pérez-Martín, C. Gallardo [et al.] // Vaccine. -2011. - Vol. 29, N 33. - P. 5379-5385.

121. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases / D.G. Gibson, L. Young, R.-Y. Chuang [et al.] // Nat. Methods. - 2009. - Vol. 6, N 5. - P. 343.

122. Escribano, J.M. Antibody-mediated neutralization of African swine fever virus: Myths and facts / J.M. Escribano, I. Galindo, C. Alonso // Virus Res. -2013. - Vol. 173, N 1. - P. 101-109.

123. Escribano, J.M. Proteins specified by African Swine Fever virus: V.-Identification of immediate early, early and late proteins / J.M. Escribano, E. Tabarés // Arch. Virol. - 1987. - Vol. 92, N 3-4. - P.221-232.

124. Expression library immunization can confer protection against lethal challenge with African swine fever virus / A. Lacasta, M. Ballester, P.L. Monteagudo [et al.] // J. Virol. - 2014. - Vol. 88, N 22. - P. 13322-13332.

125. Expression library immunization to discover and improve vaccine antigens / M.A. Barry, D.P.G. Howell, H.A. Andersson [et al.] // Immunol. Rev. -2004. - Vol. 199, N 1. - P. 68-83.

126. Facciabene, A. Baculovirus vectors elicit antigen-specific immune responses in mice / A. Facciabene, L. Aurisicchio, N. La Monica // J. Virol. -2004. - Vol. 78, N 16. - P. 8663-8672.

127. Forman, A.J. The immunological response of pigs and Guinea pigs to antigens of African swine fever virus / A.J. Forman, R.C. Wardley, P.J. Wilkinson // Arch. Virol. - 1982. - Vol. 74, N 2-3. - P. 91-100.

128. Functional significance of the hemadsorption activity of influenza virus neuraminidase and its alteration in pandemic viruses / J. Uhlendorff, T. Matrosovich, H.-D. Klenk [et al.] // Arch. Virol. - 2009. - Vol. 154, N 6. - P. 945957.

129. Genetic characterisation of African swine fever viruses from outbreaks in southern Africa (1973-1999) / C.I. Boshoff, A.D.S. Bastos, L.J. Gerber [et al.] // Vet. Microbiol. - 2007. - Vol. 121, N 1-2. - P. 45-55.

130. Genome sequence of African swine fever virus BA71, the virulent parental strain of the nonpathogenic and tissue-culture adapted BA71V / J.M. Rodriguez, L.T. Moreno, A. Alejo [et al.] // PLoS One - 2015. - Vol. 10, N 11: e0142889.

131. Genomic analysis of highly virulent Georgia 2007/1 isolate of African swine fever virus. / D.A.G. Chapman, A.C. Darby, M. Da Silva [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2011. - Vol. 17, N 4. - P. 599-605.

132. Genotyping field strains of African swine fever virus by partial p72 gene characterisation / A.D.S. Bastos, M.-L. Penrith, C. Cruciere [et al.] // Arch. Virol. - 2003. - Vol. 148, N 4. - P. 693-706.

133. Goatley, L.C. Processing and localization of the African swine fever virus CD2v transmembrane protein / L.C. Goatley, L.K. Dixon // J. Virol. - 2011.

- Vol. 85, N 7. - P. 3294-3305.

134. Gonzalvo, F.R. Characterization of a soluble hemagglutinin induced in African swine fever virus-infected cells / F. R. Gonzalvo, J. M. Coll // Virology.

- 1993. - Vol. 196, N 2. - P. 769-777.

135. Gonzalvo, F.R., Immunological responses of pigs to partially attenuated ASF virus and their resistance to virulent homologous and heterologous viruses / F.R. Gonzalvo, M.E. Carnero, V. Bruyel // FAO/CEE Expert Consultation on African Swine Fever Research. - Sassari, 1981. - P. 2066-2216.

136. Green, M.R. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. -4th ed. / M.R. Green, J. Sambrook. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012. - P. 2096.

137. Hamdy, F.M. Clinical and immunologic responses of pigs to African swine fever virus isolated from the Western Hemisphere. / F.M. Hamdy, A.H. Dardiri // Am. J. Vet. Res. - 1984. - Vol. 45, N 4. - P. 711-714.

138. Hess, W.R. African swine fever: a reassessmont / W.R. Hess // Adv. Vet. Sci. Comp. Med. - 1981. - Vol. 25. - P. 39-69.

139. Heterologous prime-boost vaccinations for poverty-related diseases: advantages and future prospects / K. Radosevic, A. Rodriguez, A. Lemckert [et al.] // Expert Rev. Vaccines. - 2009. - Vol. 8, N 5. - P. 577-592.

140. Highly specific confirmatory Western blot test for African swine fever virus antibody detection using the recombinant virus protein p54 / C. Alcaraz, F. Rodriguez, J.M. Oviedo [et al.] // J. Virol. Methods. - 1995. - Vol. 52, N 1-2. - P. 111-119.

141. Holliger, P. Engineered antibody fragments and the rise of single domains / P. Holliger, P.J. Hudson // Nat. Biotechnol. - 2005. - Vol. 23, N 9. - P. 1126-1136.

142. Human chemokine MIP1a increases efficiency of targeted DNA fusion vaccines / P.A. Ruffini, G. Gredeland, A.B. Fredriksen [et al.] // Vaccine -2010. - Vol. 29, N 2. - P. 191-199.

143. Huser, A. Baculovirus Vectors / A. Huser, C. Hofmann // Am. J. Pharmacogenomics. - 2003. - Vol. 3, N 1. - P. 53-63.

144. Identification of a 25-aminoacid sequence from the major African swine fever virus structural protein VP72 recognised by porcine cytotoxic T lymphocytes using a lipoprotein based expression system / A. Leitao, A. Malur, P. Cornelis [et al.] // J. Virol. Methods. - 1998. - Vol. 75, N 1. - P. 113-119.

145. Identification of the principal serological immunodeterminants of African swine fever virus by screening a virus cDNA library with antibody / S. D. Kollnberger, B. Gutierrez-Castaneda, M. Foster-Cuevas [et al.] // J. Gen. Virol. -2002. - Vol. 83, N 6. - P. 1331-1342.

146. Identification of wild boar-habitat epidemiologic cycle in African swine fever epizootic / E. Chenais, K. Stahl, V. Guberti [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2018. - Vol. 24, N 4. - P. 810-812.

147. Immunization of Pigs by DNA Prime and Recombinant Vaccinia Virus Boost to Identify and Rank African Swine Fever Virus Immunogenic and Protective Proteins / J.K. Jancovich, D. Chapman, D.T. Hansen [et al.] // J. Virol. -2018. - Vol. 92, N 8: e02219-17.

148. Immunization with a DNA chimeric molecule encoding a hemagglutinin peptide and a scFv CD21-specific antibody fragment induces long-lasting IgM and CTL responses to influenza virus / N. Ivanovska, A. Tchorbanov, J. Prechl [et al.] // Vaccine. - 2006. - Vol. 24, N 11. - P. 1830-1837.

149. Immunization with pseudotype baculovirus expressing envelope protein of Japanese encephalitis virus elicits protective immunity in mice / Y. Li, J. Ye, S. Cao [et al.] // J. Gene Med. - 2009. - Vol. 11, N 1. - P. 57-65.

150. Immunological conception of African swine fever / V. Makarov, V. Nedosekov, A. Sereda [et al.] // Zool. Ecol. - 2016. - Vol. 26, N 3. - P. 236-243.

151. Implementation of BacMam virus gene delivery technology in a drug discovery setting / T.A. Kost, J.P. Condreay, R.S. Ames [et al.] // Drug Discov. Today - 2007. - Vol. 12, N 9-10. - P. 396-403.

152. In vitro and in vivo association of African swine fever virus with swine erythrocytes. / J.C. Quintero, R.D. Wesley, T.C. Whyard [et al.] // Am. J. Vet. Res. - 1986. - Vol. 47, N 5. - P. 1125-1131.

153. In vivo depletion of CD8+ T lymphocytes abrogates protective immunity to African swine fever virus / C.A.L. Oura, M.S. Denyer, H. Takamatsu [et al.] // J. Gen. Virol. - 2005. - Vol. 86, N 9. - P. 2445-2450.

154. In vivo study of hemadsorption in African swine fever virus infected cells / M.A. Sierra, J.C. Gomez-Villamandos, L. Carrasco [et al.] // Vet. Pathol. -1991. - Vol. 28, N 2. - P. 178-181.

155. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. / E.A. Emini, J.V Hughes, D.S. Perlow [et al.] // J. Virol. - 1985. - Vol. 55, N 3. - P. 836-839.

156. Inhibition of African swine fever infection in the presence of immune sera in vivo and in vitro. / F.G. Ruiz, M.E. Carnero, C. Caballero [et al.] // Am. J. Vet. Res. - 1986. - Vol. 47, N 6. - P. 1249-1252.

157. Inhibitors of glycosylation reverse retroviral interference / A. Rein, A.M. Schultz, J.P. Bader [et al.] // Virology - 1982. - Vol. 119, N 1. - P. 185-192.

158. Isolation of a non-haemadsorbing, non-cytopathic strain of African swine fever virus in Madagascar / M. Gonzague, F. Roger, A. Bastos [et al.] // Epidemiol. Infect. - 2001. - Vol. 126, N 3. - P. 453-459.

159. Jori, F. Role of Wild Suids in the Epidemiology of African Swine Fever / F. Jori, A.D.S. Bastos // Ecohealth. - 2009. - Vol. 6, N 2. - P. 296-310.

160. Karplus, P.A. Flexibility scale / P.A. Karplus, G.E. Schulz // Naturwissenschaften. - 1985. - Vol. 72. - P. 212-213.

161. Knudsen, R.C. In vitro immune serum-mediated protection of pig monocytes against African swine fever virus. / R.C. Knudsen, E.V Genovesi, T.C. Whyard // Am. J. Vet. Res. - 1987. - Vol. 48, N 7. - P. 1067-1071.

154

162. Kolaskar, A.S. A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens / A.S. Kolaskar, P.C. Tongaonkar // FEBS Lett. -1990. - Vol. 276, N 1-2. - P. 172-174.

163. Kost, T.A. Recombinant baculoviruses as mammalian cell gene-delivery vectors / T.A. Kost, J.P. Condreay // Trends Biotechnol. - 2002. - Vol. 20, N 4. - P. 173-180.

164. Kutzler, M.A. DNA vaccines: ready for prime time? / M.A. Kutzler, D.B. Weiner // Nat. Rev. Genet. - 2008. - Vol. 9, N 10. - P. 776-788.

165. Kyhse-Andersen, J. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polycrylamide to nitrocellulose / J. Kyhse-Andersen // J. Biochem. Biophys. Methods. - 1984. -Vol. 10, N 3-4. - P. 203-209.

166. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature - 1970. - Vol. 227, N 5259. - P. 680.

167. Liu, M.A. DNA Vaccines: Recent Developments and Future Possibilities / M.A. Liu, B. Wahren, G.B.K. Hedestam // Hum. Gene Ther. - 2006. - Vol. 17, N 11. - P. 1051-1061.

168. Live attenuated African swine fever viruses as ideal tools to dissect the mechanisms involved in viral pathogenesis and immune protection / A. Lacasta, P. L. Monteagudo, Á. Jiménez-Marín [et al.] // Vet. Res. - 2015. - Vol. 46, N 1. - P. 135.

169. Malmquist, W.A. Hemadsorption and cytopathic effect produced by African Swine Fever virus in swine bone marrow and buffy coat cultures. / W.A. Malmquist, D. Hay // Am. J. Vet. Res. - 1960. - Vol. 21. - P. 104-108.

170. Malmquist, W.A. Serologic and immunologic studies with African swine fever virus. / W.A. Malmquist // Am. J. Vet. Res. - 1963. - Vol. 24. - P. 450.

171. Mateen, I. A Review on DNA Vaccines / I. Mateen, S. Irshad // Int. J. Heal. Sci. - 2012. - Vol. 1, N 1. - P. 1-7.

155

172. Mebus, C.A. African swine fever. / C.A. Mebus // Adv. Virus Res. -1988. - Vol. 35. - P. 251-269.

173. Mebus, C.A. Western hemisphere isolates of African swine fever virus: asymptomatic carriers and resistance to challenge inoculation. / C.A. Mebus, A.H. Dardiri // Am. J. Vet. Res. - 1980. - Vol. 41, N 11. - P. 1867-1869.

174. Molecular epidemiology of African swine fever virus studied by analysis of four variable genome regions. / R.J. Nix, C. Gallardo, G. Hutchings [et al.] // Arch. Virol. - 2006. - Vol. 151, N 12. - P. 2475-2494.

175. Monoclonal antibodies of African swine fever virus: antigenic differences among field virus isolates and viruses passaged in cell culture. / B. Garcia-Barreno, A. Sanz, M.L. Nogal [et al.]// J. Virol. - 1986. - Vol. 58, N 2. - P. 385-392.

176. Montgomery, R.E. On A Form of Swine Fever Occurring in British East Africa (Kenya Colony) / R.E. Montgomery // J. Comp. Pathol. Ther. - 1921. -Vol. 34. - P. 159-191.

177. Neutralizing antibodies to African swine fever virus proteins p30, p54, and p72 are not sufficient for antibody-mediated protection / J. Neilan, L. Zsak, Z. Lu [et al.] // Virology. - 2004. - Vol. 319, N 2. - P. 337-342.

178. Neutralizing antibodies to different proteins of African swine fever virus inhibit both virus attachment and internalization. / P. Gomez-Puertas, F. Rodriguez, J.M. Oviedo [et al.] // J. Virol. - 1996. - Vol. 70, N 8. - P. 5689-5694.

179. Norley, S. Effector mechanisms in the pig. Antibody-dependent cellular cytolysis of African swine fever virus infected cells. / S. Norley, R. Wardley // Res. Vet. Sci. - 1983. - Vol. 35, N 1. - P. 75-79.

180. Norley, S.G. Complement-mediated lysis of African swine fever virus-infected cells. / S.G. Norley, R.C. Wardley // Immunology. - 1982. - Vol. 46, N 1. - P. 75.

181. Norley, S.G. Cytotoxic lymphocytes induced by African swine fever infection. / S.G. Norley, R.C. Wardley // Res. Vet. Sci. - 1984. - Vol. 37, N 2. - P. 255-257.

182. Norley, S.G. Investigation of porcine natural-killer cell activity with reference to African swine-fever virus infection. / S.G. Norley, R.C. Wardley // Immunology - 1983. - Vol. 49, N 4. - P. 593.

183. Novel vectors for simultaneous high-level dual protein expression in vertebrate and insect cells by recombinant baculoviruses / G.M. Keil, C. Klopfleisch, K. Giesow [et al.] // J. Virol. Methods. - 2009. - Vol. 160, N 1-2. - P. 132-137.

184. Parker, J. Plaque formation by African swine fever virus / J. Parker, W. Plowright // Nature - 1968. - Vol. 219, N 5153. - P. 524.

185. Parker, J.M.R. New hydrophilicity scale derived from highperformance liquid chromatography peptide retention data: correlation of predicted surface residues with antigenicity and x-ray-derived accessible sites / J.M.R. Parker, D. Guo, R.S. Hodges // Biochemistry. - 1986. - Vol. 25, N 19. - P. 54255432.

186. Passively Transferred African Swine Fever Virus Antibodies Protect Swine against Lethal Infection / D.V. Onisk, M.V. Borca, S. Kutish [et al.] // Virology - 1994. - Vol. 198, N 1. - P. 350-354.

187. Pellequer, J.-L. Correlation between the location of antigenic sites and the prediction of turns in proteins / J.-L. Pellequer, E. Westhof, M.H.V. Van Regenmortel // Immunol. Lett. - 1993. - Vol. 36, N 1. - P. 83-99.

188. Peterson, A. Monoclonal antibody and ligand binding sites of the T cell erythrocyte receptor (CD2) / A. Peterson, B. Seed // Nature - 1987. - Vol. 329, N 6142. - P. 842-846.

189. Petisca, N.J. Quelques aspects morphologiques des suites de la vaccination contre la peste porcine Africaine (virose L) au Portugal / N.J. Petisca // Bull. Off. Int. Epiz. - 1965. - Vol. 63. - P. 199-237c.

190. Phylogeographic analysis of African swine fever virus, Western Europe, 2018 / M. Garigliany, D. Desmecht, M. Tignon [et al.] // Emerg. Infect. Dis. - 2019. - Vol. 25, N 1. - P. 184-186.

191. Plasmid DNA vaccination using skin electroporation promotes poly-functional CD4 T-cell responses / A. Brave, S. Nyström, A.-K. Roos [et al.] // Immunol. Cell Biol. - 2011. - Vol. 89, N 3. - P. 492-496.

192. Ponnuswamy, P.K. Hydrophobic packing and spatial arrangement of amino acid residues in globular proteins / P.K. Ponnuswamy, M. Prabhakaran, P. Manavalan // Biochim. Biophys. Acta - Protein Struct. - 1980. - Vol. 623, N 2. -P. 301-316.

193. Porcine CD58: cDNA cloning and molecular dissection of the porcine CD58-human CD2 interface / A. Brossay, F. Hube, T. Moreau [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2003. - Vol. 309, N 4. - P. 992-998.

194. Prados, F.J. Sequence and characterization of the major early phosphoprotein p32 of African swine fever virus. / F.J. Prados, E. Vinuela, A. Alcami // J. Virol. - 1993. - Vol. 67, N 5. - P. 2475-2485.

195. Prime-Boost Strategies in DNA Vaccines / C.J. Dale, S. Thomson, R. De Rose // DNA vaccines: methods and protocols. - New Jersey: Humana Press, 2006. - Vol. 127. - P. 171-198.

196. Protection of European domestic pigs from virulent African isolates of African swine fever virus by experimental immunisation / K. King, D. Chapman, J.M. Argilaguet [et al.] // Vaccine. - 2011. - Vol. 29, N 28. - P. 4593-4600.

197. Protein measurement with the Folin phenol reagent. / O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Farr [et al.] // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193, N 1. - P. 265-275.

198. Proteins specified by African swine fever virus. II. Analysis of proteins in infected cells and antigenic properties. / E. Tabares, J. Martinez, F.G. Ruiz [et al.] // Arch. Virol. - 1980. - Vol. 66, N 2. - P. 119-132.

199. Rajcani, J. Current developments in viral DNA vaccines: shall they solve the unsolved? / J. Rajcani, T. Mosko, I. Rezuchova // Rev. Med. Virol. -2005. - Vol. 15, N 5. - P. 303-325.

200. Recombinant Protein p30 for Serological Diagnosis of African Swine Fever by Immunoblotting Assay / A.S. Kazakova, I.R. Imatdinov, O.A.

158

Dubrovskaya [et al.] // Transbound. Emerg. Dis. - 2017. - Vol. 64, N 5. - P. 14791492.

201. Related strains of African swine fever virus with different virulence: genome comparison and analysis / R. Portugal, J. Coelho, D. Hoper [et al.] // J. Gen. Virol. - 2015. - Vol. 96, N 2. - P. 408-419.

202. Revilla, Y. Interferon-Gamma Production by African Swine Fever Virus-Specific Lymphocytes / Y. Revilla, L. Pena, E. Vinuela // Scand. J. Immunol. - 1992. - Vol. 35, N 2. - P. 225-230.

203. Rodriguez, F. DNA immunization: ubiquitination of a viral protein enhances cytotoxic T-lymphocyte induction and antiviral protection but abrogates antibody induction. / F. Rodriguez, J. Zhang, J.L. Whitton // J. Virol. - 1997. -Vol. 71, N 11. - P. 8497-8503.

204. Ruiz-Gonzalvo, F. Functional and immunological properties of the baculovirus-expressed hemagglutinin of African swine fever virus / F. Ruiz-Gonzalvo, F. Rodriguez, J.M. Escribano // Virology - 1996. - Vol. 218, N 1. - P. 285-289.

205. Ruiz-Gonzalvo, F. Immunological responses of pigs to partially attenuated African swine fever virus and their resistance to virulent homologous and heterologous viruses / F. Ruiz-Gonzalvo, M.E. Carnero, V. Bruyel // African Swine Fever. Proc. EUR - 1983. - Vol. 8466. - P. 2066-2216.

206. Salas, M.L. African swine fever virus morphogenesis / M.L. Salas, G. Andrés // Virus Res. - 2013. - Vol. 173, N 1. - P. 29-41.

207. Sanchez Botija, C. La Peste Suina / C. Sanchez Botija // Zooprofilassi.

- 1963. - Vol. 18. - P. 578-607c.

208. Sanchez-Botija, C. Laboratory manual for diagnosis of african swine fever / C. Sanchez-Botija, A. Ordas // Madrid Inst. Nac. Investig. Agrar. - 1977. -P. 133-136.

209. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1977. - Vol. 74, N 12.

- P. 5463-5467.

210. Schlafer, D.H. African swine fever convalescent sows: subsequent pregnancy and the effect of colostral antibody on challenge inoculation of their pigs. / D.H. Schlafer, J.W. McVicar, C.A. Mebus // Am. J. Vet. Res. - 1984. - Vol. 45, N 7. - P. 1361-1366.

211. Serological behaviour of isolated African swine fever virus / J.D. Vigario, A.M. Terrinha, A.L. Bastos [et al.] // Arch. Virol. - 1970. - Vol. 31, N 3. - P. 387-389.

212. Shi, X. Role of N-linked glycans on Bunyamwera virus glycoproteins in intracellular trafficking, protein folding, and virus infectivity / X. Shi, K. Brauburger, R.M. Elliott // J. Virol. - 2005. - Vol. 79, N 21. - P. 13725-13734.

213. Single chain antibody fragments for the selective targeting of antigens to dendritic cells / C. Demangel, J. Zhou, A.B.H. Choo [et al.] // Mol. Immunol. -2005. - Vol. 42, N 8. - P. 979-985.

214. Stone, S.S. Antibody response to inactivated preparations of African swine fever virus in pigs. / S.S. Stone, W.R. Hess // Am. J. Vet. Res. - 1967. -Vol. 28, N 123. - P. 475.

215. Systematic analysis of longitudinal serological responses of pigs infected experimentally with African swine fever virus / A.L. Reis, R.M.E. Parkhouse, A.R. Penedos [et al.] // J. Gen. Virol. - 2007. - Vol. 88, N 9. - P. 24262434.

216. Talaat, A.M. Expression library immunization: a road map for discovery of vaccines against infectious diseases / A.M. Talaat, K. Stemke-Hale // Infect. Immun. - 2005. - Vol. 73, N 11. - P. 7089-7098.

217. Tang, X.-C. Baculovirus-produced influenza virus-like particles in mammalian cells protect mice from lethal influenza challenge / X.-C. Tang, H.-R. Lu, T.M. Ross // Viral Immunol. - 2011. - Vol. 24, N 4. - P. 311-319.

218. Targeting of influenza epitopes to murine CR1/CR2 using single-chain antibodies / J. Prechl, A. Tchorbanov, A. Horvath [et al.] // Immunopharmacology - 1999. - Vol. 42, N 1-3. - P. 159-165.

219. Targeting plasmid-encoded proteins to the antigen presentation pathways / J.A. Leifert, M.P. Rodriguez-Carreno, F. Rodriguez [et al.] // Immunol. Rev. - 2004. - Vol. 199, N 1. - P. 40-53.

220. The African Swine Fever Virus Proteins p54 and p30 Are Involved in Two Distinct Steps of Virus Attachment and Both Contribute to the Antibody-Mediated Protective Immune Response / P. Gómez-Puertas, F. Rodríguez, J.M. Oviedo [et al.] // Virology. - 1998. - Vol. 243, N 2. - P. 461-471.

221. The CD2v protein enhances African swine fever virus replication in the tick vector, Ornithodoros erraticus / R.J. Rowlands, M.M. Duarte, F. Boinas [et al.] // Virology - 2009. - Vol. 393, N 2. - P. 319-328.

222. The CD2v protein of African swine fever virus interacts with the actin-binding adaptor protein SH3P7 / P.C. Kay-Jackson, L.C. Goatley, L. Cox [et al.] // J. Gen. Virol. - 2004. - Vol. 85, N 1. - P. 119-130.

223. The efficacy of DNA vaccination is enhanced in mice by targeting the encoded protein to dendritic cells. / G. Nchinda, J. Kuroiwa, M. Oks [et al.] // J. Clin. Invest. - 2008. - Vol. 118, N 4. - P. 1427-1436.

224. The non-haemadsorbing African swine fever virus isolate ASFV/NH/P68 provides a model for defining the protective anti-virus immune response / A. Leitao, C. Cartaxeiro, R. Coelho [et al.] // J. Gen. Virol. - 2001. -Vol. 82, N 3. - P. 513-523.

225. The progressive adaptation of a georgian isolate of African swine fever virus to vero cells leads to a gradual attenuation of virulence in swine corresponding to major modifications of the viral genome / P.W. Krug, L.G. Holinka, V. O'Donnell [et al.] // J. Virol. - 2015. - Vol. 89, N 4. - P. 2324-2332.

226. The structural protein p54 is essential for African swine fever virus viability / F. Rodriguez, V. Ley, P. Gómez-Puertas [et al.] // Virus Res. - 1996. -Vol. 40, N 2. - P. 161-167.

227. The T lymphocyte glycoprotein CD2 binds the cell surface ligand LFA-3 / P. Selvaraj, M.L. Plunkett, M. Dustin [et al.] // Nature - 1987. - Vol. 326, N 6111. - P. 400.

228. Tulman, E.R. African swine fever virus / E.R. Tulman, G.A. Delhon, B.K. Ku, D.L. Rock // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 2009. - N 328. - P. 43-87.

229. Tunicamycin depresses P-glycoprotein glycosylation without an effect on its membrane localization and drug efflux activity in L1210 cells / M. Seres, D. Cholujova, T. Bubencikova [et al.] // Int. J. Mol. Sci. - 2011. - Vol. 12, N 11. - P. 7772-7784.

230. Vaccination of domestic pigs with a naturally attenuated strain of African swine fever virus / P. Mutowembwa, R. Souto, J.H. van Heerden, [et al.] // Proc. of the 9th Annual Congress of the Southern African Society for Veterinary Epidemiology and Preventive Medicine (18-20 August 2010). Farm Inn, 2010. - P. 126-128.

231. Vaccination of mice with recombinant baculovirus expressing spike or nucleocapsid protein of SARS-like coronavirus generates humoral and cellular immune responses / B. Bai, X. Lu, J. Meng [et al.] // Mol. Immunol. - 2008. - Vol. 45, N 4. - P. 868-875.

232. Vaccine potential of two previously uncharacterized African swine fever virus isolates from southern Africa and heterologous cross protection of an avirulent European isolate / R. Souto, P. Mutowembwa, J. Van Heerden [et al.] // Transbound. Emerg. Dis. - 2016. - Vol. 63, N 2. - P. 224-231.

233. van Drunen Littel-van den Hurk, S. Strategies for improved formulation and delivery of DNA vaccines to veterinary target species / S. Van Drunen Littel-van den Hurk, S.L. Babiuk, L.A. Babiuk // Immunol. Rev. - 2004. -Vol. 199, N 1. - P. 113-125.

234. van Drunen Little-van den Hurk, S. Electroporation enhances immune responses and protection induced by a bovine viral diarrhea virus DNA vaccine in newborn calves with maternal antibodies / S. van Drunen Littel-van den Hurk, Z. Lawman, D. Wilson [et al.] // Vaccine. - 2010. - Vol. 28, N 39. - P. 6445-6454.

235. Variable regions on the genome of Malawi isolates of African swine fever virus / K.J. Sumption, G.H. Hutchings, P.J. Wilkinson [et al.] // J. Gen. Virol.

- 1990. - Vol. 71, N 10. - P. 2331-2340.

236. Vigario, J.D. Antigenic relationships among strains of African swine fever virus / J.D. Vigario, A.M. Terrinha, J.F.M. Nunes // Arch. Gesamte Virusforsch. - 1974. - Vol. 45, N 3. - P. 272-277.

237. Vinuela, E. African swine fever virus. / E. Vinuela // Curr. Top. Microbiol. Immunol. - 1985. - Vol. 116. - P. 151-170.

238. Virulent African swine fever virus isolates are neutralized by swine immune serum and by monoclonal antibodies recognizing a 72-kDa viral protein / L. Zsak, D.V Onisk, C.L. Afonso [et al.] // Virology. - 1993. - Vol. 196, N 2. - P. 596-602.

239. Wahren, B. DNA Vaccines: Recent Developments and the Future / B. Wahren, M.A. Liu // Vaccines. - 2014. - N 2. - P. 785-796.

240. Wardley, R.C. The host response to African swine fever virus. / R.C. Wardley, S.G. Norley, C.V Martins [et al.] // Prog. Med. Virol. - 1987. - Vol. 34.

- P. 180.

241. Wardley, R.C. The role of antibody in protection against African swine fever virus / R.C. Wardley, S.G. Norley, P.J. Wilkinson [et al.] // Vet. Immunol. Immunopathol. - 1985. - Vol. 9, N 3. - P. 201-212.

242. Wesley, R.D. Genome relatedness among African swine fever virus field isolates by restriction endonuclease analysis / R.D. Wesley, A.E. Tuthill // Prev. Vet. Med. - 1984. - Vol. 2, N 1-4. - P. 53-62.

243. Wodak, S.J. Computer analysis of protein-protein interaction / S.J. Wodak, J. Janin // J. Mol. Biol. - 1978. - Vol. 124, N 2. - P. 323-342.

244. Zucas, A. La peste porcine africane / A. Zucas, I. Haad, B. Larenandie // Coll.de Monogr. - 1967. - P. 114.

8. СПИСОК ИЛЛЮСТРИРОВАННОГО МАТЕРИАЛА

Рисунки:

1. Индукция клеточного и гуморального иммунитета ДНК-вакцинами.

2. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов в 1,5 % агарозном геле.

3. Схема рекомбинантной плазмиды pJET1.2/CD2v.

4. Схема рекомбинантной плазмиды рШТ1.2/р30.

5. Схема рекомбинантной плазмиды рШТ1.2/р54.

6. Электрофореграмма разделения продуктов амплификации при скрининге плазмид pJET1.2/CD2v (А), рЖГ1.2/р30 (Б), рЛБТ1.2/р54 (В).

7. Выравнивание нуклеотидных последовательностей гена ЕР402Я (СБ2У).

8. Выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагмента гена СР204Ь (р30).

9. Выравнивание нуклеотидных последовательностей фрагмента гена Е183Ь (р54).

10. Прогнозирование топологии трансмембранных регионов в аминокислотных последовательностях белков CD2v, р30 и р54 вируса АЧС штамма МК-200 (ТМНММ 2.0).

11. Сигнальный пептид с потенциальным сайтом расщепления в последовательности белка CD2v вируса АЧС штамма МК-200 (Б1§па1Р 5.0).

12. Прогнозируемые сайты ^гликозилирования в CD2v вируса АЧС штамма МК-200 (№1Ш1ус 1.0).

13. Прогнозируемые сайты ^гликозилирования в р54 вируса АЧС штамма МК-200 (№1Ш1ус 1.0).

14. Потенциальные В-клеточные эпитопы в аминокислотной последовательности белка CD2v вируса АЧС штамма МК-200.

15. Потенциальные В-клеточные эпитопы в аминокислотной последовательности белка р30 (1-186 а.о.) вируса АЧС штамма МК-200.

16. Потенциальные В-клеточные эпитопы в аминокислотной последовательности белка р54 вируса АЧС штамма МК-200.

17. Потенциальные Т-клеточные эпитопы в аминокислотных последовательностях белков СБ2у (16-217 а.о.), р30 (48-182 а.о.) и р54 (54199 а.о.) вируса АЧС штамма МК-200.

18. Детекция продуктов амплификации при скрининге плазмид ртТ1.2/81в/СВ2у1вИЛ^МТгМ (А), pffiT1.2УSigLeftTrMУp30 (Б), pffiT1.2УSigLeftTrMУp54 (В).

19. Схема открытых рамок считывания для химерных генов с клонированными последовательностями фрагментов, кодирующих белки вируса африканской чумы свиней р30, р54 и СD2v, в полученных ДНК-конструкциях.

20. Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов химерных генов в 1,5 % агарозном геле при скрининге рекомбинантных плазмид.

21. Люминесцентная микроскопия культуры клеток НЕК293Т при оптимизации протокола трансфекции кальций-фосфатным методом на 2 сутки (увеличение х100).

22. Иммуноблоттинг, демонстрирующий синтез рекомбинантных белков гр30 (А), гр54 (Б) и гр CD2v (В) в трансфицированных плазмидами рС1-пео/Л8БУ/р30/1, рС1-пео/Л8ЕУ/р54/1, pCI-neoУASFVУCD2vУ1 клетках НЕК293Т и антигенную активность гр30 (Г).

23. Иммунофлуоресцентная микроскопия синтеза антигенно активных продуктов трансляции в клетках перевиваемой линии НЕК293Т (А) и первичной культуры лейкоцитов свиньи (Б), трансфицированных рекомбинантной плазмидой рС1-пео/Л8БУ/р30.

24. Термометрия иммунизированных рекомбинантными плазмидами (1-4) и контрольной (5) свиней после заражения вирулентным штаммом Мозамбик-78 вируса АЧС.

25. Детекция продуктов амплификации при скрининге плазмид риЪЬ76Л_р30 (Л), риЪЬ76Л_р54 (В), риЬЬ76Л_СБ2у (С).

165

26. Схематическое изображение открытых рамок считывания экспрессирующей области плазмид рШЬ76А_р30 (А), риЪЬ76А_р54 (В), риЬЬ76Л_СБ2у (С).

27. Термометрия иммунизированных (№№ 1-4) и контрольного (№ 5) свиней после заражения вирулентным штаммом Мозамбик-78 вируса АЧС дозой 100 ГАЕ50.

28. Патологоанатомические изменения в органах павшей свиньи после заражения вирулентным штаммом Мозамбик-78 вируса АЧС в дозе 100 ГАЕ50.

29. Лимфатические узлы павшей свиньи после заражения вирулентным штаммом Мозамбик-78 вируса АЧС в дозе 100 ГАЕ50.

30. Инфекционные титры вируса АЧС штамма Мозамбик-78 в крови свиней в различные дни после заражения.

31. АЧС-индуцированные специфические ответы Т-клеток моноцитов / макрофагов культур лейкоцитов свиней от иммунизированных (№№ 1 -4) и контрольной (№ 5) свиней (вирус АЧС штамм Мозамбик-78).

32. Накопление вируса АЧС штамма Мозамбик-78 в культурах лейкоцитов свиней от иммунизированных (№№ 1 -4) и контрольной (№ 5) свиней. Таблицы:

1. Характеристика живых культуральных вакцин против вируса АЧС 1-У сероиммунотипов.

2. Антигенное родство (%) препаратов ГП 110-140 референтных штаммов 1-1У сероиммунотипов вируса АЧС с антисыворотками 1-1У серотипов (п= 35).

3. Антигенное родство (%) ГП 110-140 из штаммов Франция-32 и Португалия-60 с антисыворотками 1-1У серотипов и к штамму Португалия-60.

4. Специфические олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие участки генов БР402^ CP204L, E183L вируса АЧС.

5. Пептиды c высокой аффинностью связывания, выявленные в аминокислотной последовательности белка CD2v (16-217 а.о.) вируса АЧС штамма МК-200 с использованием аллельных вариантов молекул SLA I класса.

6. Пептиды c высокой аффинностью связывания, выявленные в аминокислотной последовательности белка p30 (48-182 а.о.) вируса АЧС штамма МК-200 с использованием аллельных вариантов молекул SLA I класса.

7. Пептиды c высокой аффинностью связывания, выявленные в аминокислотной последовательности белка p54 (54-199 а.о.) вируса АЧС штамма МК-200 с использованием аллельных вариантов молекул SLA I класса.

8. Специфичные олигонуклеотидные праймеры, необходимые для сборки химерных конструкций.

9. Условия амплификации химерных генов Ubb76A/CD2IgHA, Ubb76A/p30 и Ubb76A/p54.

10. Результаты иммунизации свиней рекомбинантными плазмидами pUbb76A_CD2v, pUbb76A_p30, pUbb76A_p54.

9. ПРИЛОЖЕНИЯ

GenBank

African swine fever virus isolate M-78 phosphoprotein p30 (CP204L) gene, partial cds

GenBank: MK211505.1 FASTA Granhire

Goto: LOCUS

DEFINITION

ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM

REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL

MK211505 495 bp DNA linear VRL 06-MAR-2019

African swine fever virus isolate M-78 phosphoprotein p30 (CP204L) gene_, partial cds. MK211505 MK211505.1

African swine fever virus ftfruan win? fpypr virus

Viruses; dsDNA viruses, no RNA stage; Asfarviridae; Asfivirus. 1 (bases 1 to 405)

ImatdinoVjA., Sereda,A., Kazakova,A. and Morozova,D. Direct Submission

Submitted (21-NOV-2018) State Collection of Microorganisms, Federal Research Center for Virology and Microbiology, Academician Bakoulov Street, Bldg. 1, Volginsky, Vladimir Region 601125, Russia Location/Qualifiers 1. .465

/organism="African swine fever virus"

/mol_type="genomic DNA"

/serotype="3"

/isolate="M-78"

/host="domestic pig"

/db_xref="taxon:10497"

/country="Mozambique"

/collect iondate="1978"

/note="genotype: V"

<1..>405

/gene="CP204L"

<1..>405

/gene="CP204L"

/note="ectodomain"

/codon_start=l

/product="phosphoprotein p30"

/proteln_id="m7?478.r

/translation="STVKYDIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVL FEE ETESSA SSENIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPPSDAPKDSTLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDF NKVIRAHNFIQTIHGTPLKEEEKEWRLMVIKL"

1 agtactgtta agtatgatat tgtgaaatct gctcgtatat atgcaggaca agggtatact

61 gaacatcagg ctcaagaaga atggaatatg attctgcatg tgctgtttga agaggaaacg

121 gaatcctcag catcatcgga aaacattcat gaaaaaaatg ataatgaaac caatgaatgc

181 acatcctcct ttgaaacatt gtttgagcaa gagcccccat cagatgcacc taaagactcc

241 acgctgtata tgcttgcaca aaagactgtg caacacattg aacaatatgg aaaggcacct

301 gattttaaca aggttattag agcacataac tttattcaaa ccattcatgg aacccctcta

361 aaggaagaag aaaaagaggt ggtaagactc atggttatta aactt

https://www.ncbi.nlm.nih gov/nuccore/MK211505.1

African swine fever virus isolate MK-200 phosphoprotein p30 (CP204L) gene, partial cds

GenBank: MK211506.1 FASTA Graphics

Goto: LOCUS

DEFINITION

ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM

REFERENCE AUTHORS TITLE JOURNAL

MK211506 405 bp DMA linear VRL 06-MAR-2019

African swine fever virus isolate HK-260 phosphoprotein p30

(CP204L) gene, partial cds.

MK211506

MK211506.1

African swine fever virus Afriran ^winf fpypr virus

Viruses; dsDNA viruses, no RNA stage; Asfarviridae; Asfivirus. 1 (bases 1 to 405)

ImatdinoVjA.j Sereda,A., Kazakova,A. and Morozova5D. Direct Submission

Submitted (21-NOV-2018) State Collection of Microorganisms, Federal Research Center for Virology and Microbiology, Academician Bakoulov Street, Bldg. 1, Volginsky, Vladimir Region 601125, Russia ##Assembly-Data-START##

Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END##

Location/Qualifiers 1..405

/organism="African swine fever virus"

/mol_type="genomic DNA"

/serotype="3"

/isolate="MK-200"

/db_xref="taxon:18497"

/lab_host="pig"s bone marrow"

/country="Russia"

/collection_date="1980"

/note="passage 200 of isolate M-78;

genotype: V"

<1..>405

/gene="CP204L"

<1..>405

/gene="CP204L"

/note="ectodomain"

/codon_start=l

/product="phosphoprotein p30" /protein id="0BH73479.1"

/translation="STVKYDIVKSARIYAGQGYTEHQAQEEWNMILHVLFEEETES5A SSENIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPPSDAPKDSTLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDF NKVIRAHNFIQTIHGTPLKEEEKEWRLMVIKL"

1 agtactgtta agtatgatat tgtgaaatct gctcgtatat atgcaggaca agggtatact

61 gaacatcagg ctcaagaaga atggaatatg attctgcatg tgctgtttga agaggaaacg

121 gaatcctcag catcatcgga aaacattcat gaaaaaaatg ataatgaaac caatgaatgc

181 acatcctcct ttgaaacatt gtttgagcaa gagcccccat cagatgcacc taaagactcc

241 acgctgtata tgcttgcaca aaagactgtg caacacattg aacaatatgg aaaggcacct

301 gattttaaca aggttattag agcacataac tttattcaaa ccattcatgg aacccctcta

361 aaggaagaag aaaaagaggt ggtaagactc atggttatta aactt

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/MK211506.1

GenBank

African swine fever virus isolate MK-200 structural protein p54 (E183L) gene, partial cds

GenBank: MK234865.1 FASTA Gmnhics

Go to LOCUS

DEFINITION

ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM