Анализ влияния рекомбинантных белков вируса африканской чумы свиней на его репродукцию in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, кандидат наук Мазлум Али

• Мазлум Али
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Мазлум Али

ОГЛАВЛЕНИЕ

1 ВВЕДЕНИЕ

1.1 Актуальность темы исследования

1.2 Степень разработанности проблемы

1.3 Цели и задачи исследования

1.4 Научная новизна результатов

1.5 Теоретическая и практическая значимость проведённых 8 исследований

1.6 Методология и методы исследования

1.7 Положения, выносимые на защиту

1.8 Личный вклад соискателя

1.9 Степень достоверности и апробация результатов

1.10 Публикации

1.11 Объем и структура диссертации

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Африканская чума свиней, историческая справка

2.2 Факторы распространения АЧС

2.3 Структура вируса АЧС и его геном

2.4 Функциональные особенности генов вируса АЧС

2.5 Перспективы возможности создания средств специфической 33 профилактики при АЧС

2.6 Заключение по обзору литературы

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материалы

3.2 Методы

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Анализ возможности экспресс-оценки уровня репродукции 49 вируса АЧС с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

4.1.1 Построение калибровочной кривой для определения количества 50 копий гена B646L вируса АЧС

4.1.2 Определение титра вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17 в 53 реакции гемадсорбции и ПЦР-РВ

4.1.3 Определение титра вируса по показателю Ct

4.2 Изучение консервативности генов вируса АЧС российских 60 изолятов

4.2.1 Анализ расположения и направления открытых рамок 61 считывания генов O61R, CP204L, X69R, A179L, B646L, I215L, E248R, EP402R и DP96R

4.2.2 Оптимизация условий амплификации выбранных генов с 62 использованием подобранных праймеров

4.2.3 Определение нуклеотидных последовательностей генов

российских изолятов и филогенетический анализ

4.3 Пополнение библиотеки генов вируса АЧС

4.3.1 Клонирование генов вируса АЧС

4.3.2 Библиотека генов вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17

4.4 Получение клонов-продуцентов рекомбинантных белков вируса 78 АЧС

4.5 Синтез рекомбинантных белков p30 и p54 в клетках E.coli

4.6 Изучение влияния рекомбинантных белков p30 и р54 вируса 86 АЧС на репродукцию вируса in vitro

4.7 Синтез рекомбинантных белков pX69R, pE248R и CD2v в 90 клетках CV-1

4.7.1 Анализ экспрессии генов вируса АЧС в клетках CV-1: оценка 91 специфичности рекомбинантных белков и определение их локализации

4.7.2 Накопление и очистка рекомбинантного белка CD2v

4.8 Изучение влияния рекомбинантного белка CD2v вируса АЧС на 93 репродукцию вируса in vitro

4.9 Изучение влияния рекомбинантных гликопротеинов pX69R и 96 pE248R вируса АЧС на его репродукцию in vitro

5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5.1 Выводы

6. ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8. ПРИЛОЖЕНИЯ

1 ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Анализ влияния рекомбинантных белков вируса африканской чумы свиней на его репродукцию in vitro»

1.1 Актуальность темы исследования

Вирус африканской чумы свиней (АЧС) вызывает различные формы течения болезни от сверхострой до субклинической [97]. Животные после переболевания АЧС приобретают, как правило, нестерильный иммунитет, причём, даже для авирулентных штаммов длительность вирусоносительства может превышать 300 дней.

Характерными признаками АЧС являются высокотемпературная лихорадка, цианоз кожи с обширными кожными геморрагиями, лимфоденит, нарушение проницаемости стенок сосудов, венозная и воспалительная гиперемия, тромбозы, обширные кровоизлияния в слизистых и серозных оболочках, коже и паренхиматозных органах. Вирус поражает клетки мононуклеарно-фагоцитарной системы, способствуя тем самым снижению иммунного ответа. Домашние и дикие свиньи восприимчивы к вирусу АЧС, причём, на африканском континенте бородавочники (РИасосковгш africanus) и мягкие клещи рода Ornithodoros являются естественным резервуаром инфекции [110].

АЧС в настоящее время представляет угрозу для развития свиноводства и международной торговли свиноводческой продукцией не только из-за расширения границ распространения уже циркулирующего вируса в странах Европы и Азии, но также из -за риска его новой интродукции из стремительно растущего количества эндемичных по АЧС африканских стран.

Несмотря на предпринимаемые меры борьбы, распространение АЧС принимает глобальный характер, поэтому необходимость создания вакцины против АЧС остаётся главной целью исследователей и способом для защиты от панзоотии, что было отмечено С. Вискаино на VIII Международном ветеринарном конгрессе в г. Москва [1].

Созданию эффективной вакцины против АЧС препятствует ряд таких

факторов, как длительный срок присутствия вируса в организме

4

инфицированных животных, высокая скорость изменчивости вируса, гетерогенность состава его популяции, наличие 9 сероиммунотипов и 24 генотипов вируса, циркулирующего в разных странах и на разных континентах [11, 13, 14, 8 5].

Для создания эффективной вакцины необходимо знание о структуре и функциях как протективных белков, так и белков, ответственных за вирулентность вируса АЧС и «ускользание» от иммунного ответа. В настоящее время реализуются различные подходы по изучению функций этих белков, от получения рекомбинантных белков и антител к ним до конструирования делеционных мутантов вируса АЧС и изучения их биологических свойств [31, 121].

Пионерские работы Neilan и др. по анализу функций р30, p54, р72 с использованием рекомбинантных белков и антител к ним положили начало целому направлению исследований роли вирусных белков в иммуногенезе при АЧС [121]. Анализ биологических свойств вируса АЧС с удаленными генами, например, такими как гены белков 9GL и UK, ответственных за вирулентность, позволяет определить основы вирулентности вируса АЧС [32].

Однако для поиска протективных антигенов вируса АЧС необходимы дальнейшие исследования, определяющие их влияние на скорость и уровень его репродукции in vitro и in vivo.

1.2 Степень разработанности проблемы

Геном вируса АЧС представлен двухцепочечной молекулой ДНК и варьирует по длине от 170 до 190 т.п.н., и содержит концевые тандемные повторы. Различия в длине генома между изолятами вируса объясняются вставками или делециями последовательностей в левой и правой концевых областях генома. Количество открытых рамок считывания (ОРС) генома вируса АЧС варьирует от 160 до 175 в зависимости от изолята, причём, 110 из них у большинства изолятов вируса представляют лишь одну копию гена.

Salas M.L. и др. в 2012 г. определили 54 вирусных гена, кодирующих структурные белки вируса АЧС [141], а Dixon L. и др. разделили гены с известной функцией на 4 группы: гены, кодирующие белки, ответственные за нуклеотидный метаболизм, транскрипцию и репарацию - 34; гены, кодирующие белки, ответственные за взаимодействие с клеткой хозяина - 8; гены, кодирующие ферменты - 4, и гены, кодирующие структурные белки -23. Тем не менее, для некоторых белков необходимо проведение дополнительных исследований по изучению их характеристик, поскольку более чем 28 генов вируса АЧС кодируют белки с неизвестной функцией [38].

Технология получения рекомбинантных белков в про- и эукариотических системах широко применяется в качестве альтернативных источников вирусного антигена благодаря её высокой степени функциональной гомологии и простоте.

К настоящему моменту рекомбинантные аналоги большинства белков вируса АЧС были использованы для изучения их влияния на репродукцию вируса и оценки возможности их применения для диагностики [31, 49, 121].

Из-за безопасности условий производства и технологичности получения, высокой специфичности и чувствительности, использование рекомбинантных белков стало более предпочтительным во многих диагностических наборах для выявления антител к вирусу АЧС. Так, при диагностике АЧС рекомбинантные белки p72, p30 и p54 широко используются в иммуноблоттинге и ИФА.

Исходя из вышеизложенного, дальнейшие исследования по определению генов и/или антигенов, которые влияют на скорость и уровень репродукции вируса АЧС и могут быть включены в рекомбинантную ДНК-или субъединичную вакцину, а также по установлению антигенов, активирующих клеточный и гуморальный иммунный ответ, который обеспечил бы надёжную защиту от АЧС, является актуальной задачей. Данное направление и обусловило цель нашей работы.

1.3 Цель и задачи исследования

Целью данной работы является разработка методологических подходов для изучения воздействия рекомбинантных белков, синтезированных в про- и эукариотических системах, на репродукцию вируса африканской чумы свиней в культурах клеток и анализ их влияния на уровень его накопления.

Для выполнения поставленной выше цели необходимо было решить следующие задачи:

1. определить пригодность использования полимеразной цепной реакции в режиме реального времени для экспресс-оценки уровня репродукции вируса АЧС;

2. провести генетический анализ изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ, определить их консервативность и отобрать для клонирования;

3. получить рекомбинантные клоны, содержащие гены, кодирующие структурные белки и белки, ответственные за вирулентность вируса АЧС, и пополнить клонотеку генов;

4. создать экспрессирующие конструкции путём реклонирования генов в плазмидный вектор pCI-neo для синтеза гликопротеинов в эукариотических системах, и в pET32b(+) - для получения белков в прокариотах;

5. изучить влияние рекомбинантных белков на репродукцию вируса АЧС in vitro.

1.4 Научная новизна результатов

Изучена структура и подобраны праймеры для амплификации полноразмерных генов A179L, DP96R, X69R, E248R, и I215L; определены их нуклеотидные последовательности для разных изолятов вируса АЧС, выделенных на территории РФ.

Опубликованы в GenBank полные нуклеотидные последовательности генов A179L, DP96R, X69R, E248R, и I215L вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17 (MH894396, MH894397, MH894398, MH894399, MH894400).

Сконструирована клонотека генов вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17, представленная рекомбинантными плазмидами со встройкой генов A179L, DP96R, X69R, E248R, O61R, EP402R и I215L, кодирующих трансмембранные белки и белки, ответственные за вирулентность вируса АЧС.

Впервые в Российской Федерации получены рекомбинантные плазмиды pCI-neo/X69R и pCI-neo/E248R, несущие нуклеотидные последовательности генов, кодирующих белки вируса АЧС pX69R и pE248R, соответственно. С помощью РПИФ установлена локализация этих белков в клетках CV-1.

Кроме того, in vitro установлено повышающее репродукцию вируса АЧС воздействие рекомбинантных pE248R pX69R белков.

В 2018 году получен патент на адаптированный к росту в культуре клеток CV-1 штамм вируса африканской чумы свиней «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-1» № 2675535 - 2018.

1.5 Теоретическая и практическая значимость проведённых исследований

Данная работа анализирует один из подходов к поиску белков в качестве кандидатов для создания средств специфической профилактики при АЧС.

Результаты по изучению влияния рекомбинантных белков вируса АЧС p30, p54, CD2v, pE248R и pX69R на репродукцию вируса АЧС in vitro могут быть использованы для подбора компонентов, входящих в состав высокоэффективной вакцины против АЧС.

Полученная клонотека является альтернативным источником генов при

конструировании генетически модифицированного вируса АЧС и при

получении рекомбинантных белков для создания диагностических

препаратов. Кроме того, рекомбинантные плазмиды можно использовать для

8

экспрессии генов при иммунизации лабораторных животных с целью получения моноспецифических сывороток.

Разработанные методические рекомендации по оценке уровня репродукции вируса АЧС методом ПЦР-РВ могут использоваться для предварительного экспресс-определения его титра накопления в крови и культурах клеток.

1.6 Методология и методы исследований

В работе использовали молекулярно-биологические (ПЦР в реальном времени, ПЦР, секвенирование и филогенотический анализ, клонирование и реклонирование, трансфекция клеток), вирусологические (культивирование вируса и титрование вируса), препаративные (электорофорез в агарозном геле и ПААГ, хроматографическая очистка белка), а также серологические методы (иммуноблоттинг и реакция прямой иммунофлуоресценции). Все исследования по диссертационной работе выполнены на базе референтной лаборатории по африканской чуме свиней Федерального государственного бюджетного учреждения (ФГБУ) «ВНИИЗЖ».

1.7 Положения, выносимые на защиту

Экспресс-оценку уровня репродукции вируса АЧС в крови и культурах клеток возможно проводить методом ПЦР-РВ с использованием формулы, полученной в результате определения корреляции значений Ct и титра вируса в РГАд.

Последовательности генов A179R, DP96R, EP402R, E248R, I215L и X69R не отличаются между собой у изученных изолятов РФ, но отличаются по структуре от европейских и африканских изолятов, не относящихся ко II генотипу.

Интродукция рекомбинантных белков p30 и р54 снижает репродукцию вируса АЧС in vitro, а гликопротеины CD2v, pE248R и pX69R - увеличивают её в определённые интервалы времени.

1.8 Личный вклад соискателя

Представленные в работе экспериментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. Автор выражает благодарность за содействие в выполнении работы заведующему референтной лабораторией по АЧС к.в.н. Иголкину А.С., за консультативную помощь д.б.н., профессору Груздеву К.Н., а также за практическую помощь в выполнении отдельных этапов работы сотрудникам ФГБУ «ВНИИЗЖ» к.б.н. Зинякову К.Г., к.б.н. Чупину С.А., к.б.н. Шульпину М.И., к.б.н. Спрыгину А.А., к.б.н. Андриясову А.В., к.б.н. Ароновой Е.В., к.б.н. Елсуковой А.А., к.б.н. Жукову И.Ю.

1.9 Степень достоверности и апробация результатов

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на

заседаниях Учёного совета и методической комиссии ФГБУ «ВНИИЗЖ» (2015 - 2019 гг.), на заседаниях Научно-технического совета Россельхознадзора (2015 - 2018 гг.), на IV Международной научной конференции «Достижения молодых учёных в ветеринарную практику» (г. Владимир, 2016 г.), на VII Международном Ветеринарном Конгрессе «Единый мир - единое здоровье» (г. Уфа, 2017г.), на 11 Международном конгрессе по ветеринарной вирусологии - ESVV 2018 совместно с 12 ежегодным EPIZONE «Университет ветеринарной медицины» (г. Вена, Австрия, 2018г.), на семинаре по лабораторной диагностике и контролю распространения вируса АЧС и вируса КЧС «Университет ветеринарной медицины» (г. Ганновер, Германия, 2018г.) и на Международной научно-практической конференции «Перспективы российской ветеринарной науки», посвящённой 60-летию ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Достоверность проведённых исследований подтверждена результатами комиссионных испытаний и патентом на изобретение.

1.10 Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 научных работ, в том числе 6 статей в изданиях по перечню ВАК Министерства образования и науки РФ для докторских и кандидатских диссертаций.

1.11 Объем и структура диссертации

Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 13 таблицами и 34 рисунками. Список использованной литературы включает 164 источников, из них 150 -иностранные. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих достоверность результатов работы, её научную новизну и практическую значимость.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Африканская чума свиней, историческая справка

Африканская чума свиней (АЧС) является особо опасной геморрагической вирусной болезнью, уведомление о которой является обязательным вследствие высокой смертности заражённых животных, масштабности распространения и существенного санитарного и социально-экономического влияния на развитие свиноводства и международную торговлю его продукцией. [38].

Причиной болезни является ДНК-содержащий вирус АЧС, единственный член семейства Asfaviridae.

Эпизоотология АЧС очень сложна и значительно варьирует по динамике и факторам распространения между странами, регионами и континентами, демонстрируя различные сценарии развития эпизоотии.

Её характер зависит от свойств циркулирующего вируса, наличия и роли в распространении вируса природных резервуаров и векторов передачи, а также от экологических, социальных и культурных факторов.

До недавнего времени АЧС была, в основном, эндемичной в странах Африки к югу от Сахары, с очагами эпизоотий в Португалии, Испании (19571995 гг.) и на Сардинии (с 1978 г.). В сложившейся на данный момент ситуации в Европе, важно отметить, что, начиная с единичного заноса вируса АЧС в Грузию из Восточной Африки в 2007 году, болезнь быстро распространилась по всему Кавказу и проникла на тысячи километров на северо-запад Российской Федерации [19, 34].

С начала эпизоотии АЧС в 2007 г. и по 2018 г. на территории РФ было зарегистрировано 1274 вспышки АЧС, из которых более 50% зафиксировали в популяции домашних свиней из небольших хозяйств. До 2011г. очаги инфекции в основном отмечали на территории Южного и СевероКавказского федеральных округов, где возникла первичная эндемичная по АЧС зона «юг». В 2012-2013 гг. болезнь регистрировали и в Центральном

федеральном округе, где в результате образовалась вторая эндемичная по АЧС зона - «север» [2, 22].

Дальнейшее распространение болезни привело к её появлению в 2012 г. в Украине, в 2013 г. в Беларуси и в начале 2014 г. в странах Европейского Союза (ЕС): в Литве и в Польше. В этот же год вирус АЧС проник в Эстонию, Латвию, поражая как домашних, так и диких животных [53, 74].

Клиническая картина АЧС 2013-2015гг. в Восточной Европе, была характерна для острой формы АЧС [55, 63, 126]. Однако, уже через год после появления АЧС на территории стран ЕС отмечено выявление сероположительных диких кабанов, что предполагает наличие выживших животных, и что было продемонстрировано в эксперименте in vivo [67, 103].

Серьёзность нарастания угрозы АЧС подтверждается спорадическими вспышками АЧС в Молдове в сентябре 2016 года [161], Чехии и в Румынии в 2017 г. [122], в Венгрии, Китае и Бельгии в 2018 г. [123], а позже в том же году в Монголии, затем в 2019 г. вспышки были зарегистрированы во Вьетнаме.

Кроме того, в Африке к югу от Сахары в Кот-длИвуаре и Кабо-Верде были вновь зарегистрированы вспышки АЧС после более чем 15-летнего отсутствия [162, 163]. За последнее десятилетие значительно выросло число стран, сообщивших о вспышках АЧС: на данный момент насчитывается более 25 неблагополучных по АЧС африканских стран [27].

Таким образом, в настоящее время АЧС представляет угрозу для развития свиноводства и торговой зоны ЕС не только из-за расширения границ распространения уже циркулирующего вируса, но также из-за риска его новой интродукции из растущего количества эндемичных африканских стран.

2.2 Факторы распространения АЧС

Занос вируса АЧС в свободные зоны обычно происходит в результате попадания в пищу свиней или кабанов инфицированного мяса или мясных отходов (особенно, пищевые отходы с кораблей и самолётов).

Возбудитель распространяется, главным образом, путём прямого контакта между больными и здоровыми животными, а также алиментарным или аэрозольным путём. Домашние свиньи играют важную роль в последующей передаче болезни, на которую влияют такие факторы, как низкий уровень биобезопасности свиноводческих хозяйств, так и не прошедшие дезинфекционную обработку транспортные средства.

При первичном попадании возбудителя АЧС в популяцию домашних свиней или кабанов наблюдается сверхострая, острая или подострая формы течения болезни с высокой летальностью до 95-100% (4 - 9 дней после инфицирования).

Однако длительная циркуляция вируса АЧС в дикой природе приводит к появлению ослабленных вариантов вируса АЧС, вызывающих хроническое или даже бессимптомное течение инфекции. При болезни, вызванной низко вирулентным вирусом АЧС, её клинические проявления более разнообразны или трудно распознаются. Возбудитель АЧС может персистировать в организме инфицированных животных в течение нескольких месяцев без проявления очевидных клинических признаков [Lv17/WB-Rie1] [46, 54, 143].

Переболевшие, а также животные с субклинической или хронической формой инфекции, играют важную роль в распространении болезни, что приводит к поддержанию её очагов в эндемичных районах или к спорадическим вспышкам в ранее свободных от АЧС зонах.

Вирус АЧС может длительное время присутствовать в органах и тканях инфицированных свиней, так, например, в экспериментальных исследованиях, проведённых Gallardo С. и др. в 2015 г., были идентифицированы ткани животных, сохранившие инфекционный вирус в течение 180 дней после заражения [53].

Возбудитель АЧС поражает диких и домашних животных всех пород и возрастов семейства Suidae. Болезнь приводит к проявлению характерных клинических признаков и поражений, которые различаются в зависимости от вирулентности изолята, вида животных и их иммунологического статуса.

Европейский дикий кабан (Sus scrofa) и дикие свиньи восприимчивы к этой болезни и при заражении проявляют сходные клинические признаки, однако, её летальность ниже, чем у домашних свиней.

Дикий кабан передаёт вирус даже в отсутствие домашней свиньи [135], что означает, что вирус АЧС эффективно размножается в его организме и может длительно циркулировать в популяции диких кабанов [3].

В странах Балтии и Польше дикий кабан играет основную роль в распространении возбудителя, в то время, как продвижение вируса на большие расстояния (Румыния Чехия, Венгрия, Китай) скорее всего связано с человеческим фактором [78, 88].

Высокая устойчивость вируса АЧС к воздействию окружающей среды способствует эффективности факторов механической передачи. Отмечено, что незаконное использование свежесобранной травы из заражённых районов в качестве корма, являются наиболее вероятным путём заноса на фермы с низким уровнем биологической безопасности [88,124].

Особое внимание уделяется природным ландшафтам, где популяции диких кабанов играют важную роль для сохранения вируса АЧС в природе, и где существует возможность его передачи домашним свиньям путём прямых или непрямых контактов [124].

В определённых условиях активную роль в распространении АЧС играют вектора-переносчики. Так, например, в странах Восточной и Южной Африки циркуляция вируса АЧС поддерживается на протяжении веков в сильватическом цикле, включающем мягких клещей (род Ornithodoros) и бессимптомно инфицированных диких африканских кистеухих свиней и бородавочников (Phacochoerus spp). Сильватический цикл вируса АЧС, сформировавшийся между клещами и дикими кабанами, может поддерживаться неопределённый срок. Этот цикл позволяет осуществлять циркуляцию вируса и его сохранность в дикой природе, поддерживая исходный вирус и создавая новые варианты (рисунок 1).

Рисунок 1. Три пути передачи вируса африканской чумы свиней (ФАО, 2017 г.).

У инфицированных диких африканских представителей семейства Suidae, как правило, наблюдается субклиническое и длительное бессимптомное течение инфекции, следствием которого являются животные-вирусоносители. Следовательно, на африканском континенте образовался стационарный природный резервуар АЧС. Эти животные являются вирусоносителями, способными передавать вирус клещам и домашним свиньям при прямом контакте.

В эндемичных областях описаны два дополнительных варианта передачи вируса АЧС без участия бородавочника: от домашней свиньи клещам, и от домашних свиней домашним свиньям, при том условии, если вирус сохраняется у домашних свиней в отсутствии каких-либо других позвоночных или беспозвоночных хозяев [18, 27, 42, 46].

2.3. Структура вируса АЧС и его геном

Вирус АЧС имеет икосаэдрическую форму со средним диаметром 200нм и состоит из внутреннего кора (ядра), образованного центральным геном-содержащим нуклеоидом и окружённого несколькими концентрическими слоями: плотным белковым слоем ядерной оболочки, внутренней липидной оболочкой и капсидом, который является внешним слоем внутриклеточных вирионов [33, 48, 83].

Внеклеточные вирионы обладают внешней оболочкой, полученной почкованием из плазматической мембраны [56]. Двумерный анализ очищенного внеклеточного вируса выявил 54 структурных белка с молекулярным весом от 10 кДа до 150 кДа [79].

Как и другие сложные ДНК-содержащие вирусы, у возбудителя АЧС есть ряд механизмов, чтобы обойти защитные системы хозяина, включая врождённые и приобретённый иммунные механизмы, такие, как подавление продукции интерферона I типа, регуляция апоптоза, развитие гиперергического воспаления и активация экспрессии иммуномодулирующих генов клетки-хозяина [24, 52].

В настоящее время известны 19 генов структурных белков [38, 47], локализация которых определена в разных слоях вирусной частицы (рисунок 2).

Рисунок 2. Схема структурных компонентов вириона и локализация белков в вирионе до и после его почкования через клеточную мембрану.

Как видно на рисунке 2, вирион вируса АЧС имеет икосаэдрическую форму, сформированную 5 группами белков, к каждой группе относятся два и более структурных белка.

Общепризнанно, что вирус АЧС является выходцем из Восточной Африки, поскольку болезнь была впервые описана в Кении в 1921 г. после первой вспышки в 1903 г. Однако анализ скорости замещения привёл к получению очень интересных показателей TMRCA (Time to the most recent common ancestor - время до самого последнего общего предка), позволивших определить, что наиболее близкий предок всех изолятов вируса АЧС, циркулирующего в настоящее время, появился примерно три столетия назад, т.е. в 1700 г.

Размер генома вируса АЧС варьирует в зависимости от изолята от 170 до 190 кб (т.п.н.) и кодирует от 150 до 167 открытых рамок считывания (ОРС). Геном вируса имеет центральный консервативный регион, а также правую и левую вариабельные области.

125,2-12« тлл

Рисунок 3. Карта генома вируса АЧС.

Первоначально дифференциация вариантов вируса АЧС проводилась на основе рестрикционных карт и определении размера генома [89]. Высокий уровень изменчивости наблюдался, главным образом, в пределах 38-47 т.п.н. на левом конце и 13-16 т.п.н. на правом конце генома (рисунок 3) [89, 158, 160]. Эти две вариабельные области содержат мультигенные семейства (МОБ), которые играют существенную роль в регуляции экспрессии генов и различаются по количеству тандемных повторов.

Кроме того, многообразие вариантов вируса АЧС порождается также варьированием количества аминокислотных повторов в 14 белках, включая центральный вариабельный регион (CVR), кодируемый геном B602L, и белок оболочки p54, кодируемый геном E183L [29, 61, 86, 91, 118].

По сравнению с другими крупными ДНК-содержащими вирусами такими, как гамма-герпесвирус позвоночных (10-9 замен/позиция/год), и

_п

мелкими ДНК-содержащими вирусами (например, вирус Каннингема) (10 замен/позиция/год), вирус АЧС обладает очень высокой эволюционной скоростью изменчивости (3.31 х 10-4 замен/позиция/год и экспоненциальный рост 0,01 в год -1).

Как было установлено, при анализе нуклеотидных последовательностей генома вируса АЧС, скорость замен у него варьировала от 10-4 до 10-5, что приближает его к РНК-содержащим вирусам, которые

_Л _с

обычно имеют близкий показатель эволюционной скорости: от 10 до 10 замен/позиция/год [72, 93, 127]

С помощью селекционного клонирования доказано, что природные популяции вируса АЧС представлены различными генетическими и антигенными вариантами [98]. Клональный анализ природных изолятов вируса АЧС показал, что их популяции могут быть гетерогенны по составу, поэтому, по мнению Blasco R. и др. (1989 г.), любая классификация изолятов вируса должна базироваться на данных о центральной области молекулы ДНК [158].

Сложность классификации изолятов вируса АЧС Восточной и Южной Африки обусловила разработку системы генетического группирования на основе анализа последовательности высоко консервативного гена B646L, кодирующего мажорный вирусный белок VP72 [91]. Первоначально все имевшиеся на тот момент изоляты были распределены на 10 генотипов [86]. Однако на настоящий момент в Мозамбике идентифицировали уже XXIV генотип вируса АЧС [85], выделенного из мягких клещей (рисунок 4).

Высокая степень гомологии между западноафриканскими, европейскими и южноамериканскими изолятами, позволила сгруппировать их в I генотип.

Рисунок 4. Генотипы вируса АЧС: А - филогенетический анализ на основе последовательности гена Б646Ь, 55 изолятов вируса АЧС, представляющими 24 генотипа; Б - распространение генотипов вируса АЧС в мире.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мазлум Али, 2019 год

H30^HT Источник

Kashino 04/13 дикий кабан

Odintsovo 02/14 дикий кабан

Irkutsk 03/2017 домашняя свинья

Krasnodar 07/17 домашняя свинья

Omsk 10/2017 домашняя свинья

Belgorod 10/17 дикий кабан

Krasnoyarsk 10/2017 домашняя свинья

Kaliningrad 12/17 домашняя свинья

Belgorod 12/17 домашняя свинья

Вирус АЧС штамм «АЧС/ВНИИЗЖ/CV-l», полученный путём адаптации с помощью последовательного пассирования в перевиваемой культуре клеток почки африканской зелёной мартышки (CV-1).

Культуры клеток: CV-1 - перевиваемая линия клеток почки зелёной мартышки; КМС - первичная культура клеток костного мозга свиньи; CC -первичная культура клеток селезёнки свиньи.

Эритроциты свиней: в работе использовали 10% суспензию эритроцитов в физиологическом растворе.

Питательные среды, сыворотки, растворы и реактивы: использовали химические реактивы фирм «Sigma», «AppliChem», «Life Technologies», «Thermo Fisher Scientific», реактивы российского производства марки "ч.д.а." и "х.ч.", питательные среды, антибиотики, фетальную сыворотку КРС (Sigma, НуОоп и PAN BIOTECH, США и PAA, Австрия), а также FS FetalClon II (НуОош, США), питательную среду

DMEM-F12 (Thermo Fisher Scientific), TaqMut-ДНК-полимераза (афермент), Pfu ДНК-полимераза, Т4 ДНК-лигаза, эндонуклеазы рестрикции BamHI, NotI, XhoI, Xbal, NcoI и EcoRI (Thermo Fisher Scientific).

Наборы реактивов: набор тест-системы «АЧС» для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (ФБУН «ЦНИИ»), набор тест-системы для выявления генома вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), набор «ДНК-сорб-Б» (ООО «НекстБио», Россия) для выделения вирусной ДНК из вируссодержащих образцов, набор CloneJet PCR cloning kit (Thermo Fisher Scientific), набор TransformAid bacterial transformation kit (Thermo Fisher Scientific) и набор реагентов для элюции ДНК из агарозных гелей GeneJet gel extraction kit (Thermo Fisher Scientific).

Плазмидные векторы и бактериальные штаммы: плазмида pJET1.2/blunt (Thermo Fisher Scientific); экспрессирующие плазмиды pET32b(+) (Novagen) и pCI-neo (Promega), штаммы E.coli JM-109 (F' traD36 proA+ B+ lacIlq A(lacZ)M15 / e14- (McrA-) A(lac-proAB)endA1 gyrA96 (Nalr) thi-1 hsdR17 (rk-mk+) glnV44 relA1 recA1) и BL21(DE3) (F~ompT gal dcm lon

_ __с

hsdSB(rB mB ) X(DE3 [lacI lacUV5-T7p07 ind1 sam7 nin5]) [malB ]K-12(^ )) (Promega).

Web-ресурсы: для анализа нуклеотидных последовательностей генома штаммов и изолятов вируса АЧС использовали ресурсы международных баз данных NCBI, EMBL.

Олигонуклеотиды: в работе были использованы следующие праймеры, приведённые в таблице 3.

Таблица 3

Праймеры, использованные для амплификации генов и фрагментов

генов вируса АЧС

Ген Название праймера Последовательность 5' - 3' Длина п.н. Сайты рестрик-таз Размер продукта ПЦР п.о. Исто чник

O61R Fp12/24 GCGGATCCTTGAATAAGCGTTAAC 24 BamHI 421 [49]

Rp12/25 GCGGATCCGACATCATTATGGATGA 25 BamHI

B646L Fp72/27 TATCAGGATCCTTCGCATAAACCGCCA 27 BamHI 1981 [121]

Rp72/27 GGAAGCCCACAGATCTAACCCATTGTG 27 BglII

CP204L Fp30/28 AGAGGTTGAAGATCCATGGTTACCCATT 28 NcoI 680 [121]

Rp30/28 CTAATAAATCTGGATCCTGCTGCTGCAG 28 BamHI

фрагмент B646L p72-U GGCACAAGTTCGGACATGT 19 - 478 [91]

p72-D GTACTGTAACGCAGCACAG 19 -

фрагмент B602L CVR1 ACTTTGAAACAGGAAACATAATGATG 26 - 665 [41]

CVR2 ATATTTTGTAATATGTGGGCTGCTG 25 -

Полногеномные последовательности: 8 полногеномных последовательностей изолятов вируса АЧС из Европы и 6 из Африки были использованы из ОепБапк и представлены в таблице 4.

Таблица 4

Изоляты вируса АЧС (GenBank)

№ п/п Изолят Вирулентность Длина генома (п.н.) Генотип Источник № GenBank

1 Georgia 2007/1 Вирулентный 189344 II дикий кабан FR682468

2 BA71V Авирулентный 170101 I клетки Vero NC001659

3 BA71 Вирулентный 180365 I домашняя свинья KP055815

4 E75 Вирулентный 181187 I домашняя свинья FN557520

5 Lisbon 60 Вирулентный 182365 I домашняя свинья KM262844

6 26544/0G10 Вирулентный 182906 I дикий кабан KM102979

7 NHV Авирулентный 172051 I домашняя свинья KM262845

8 OURT 88/3 Авирулентный 171719 I клещи Ornithodoros AM712240

9 Malawi Lil-20/1 Вирулентный 187612 VIII клещи Ornithodoros AY261361

10 Ken06.Bus Вирулентный 191058 IX клещи Ornithodoros HM745253

11 Ken05/TK1 Вирулентный 184368 X домашняя свинья FJ154439

12 Benin 97/1 Вирулентный 182284 I домашняя свинья AM712239

13 Tengani 62 Вирулентный 185689 V домашняя свинья AY261364

14 Kenya 1950 Вирулентный 193886 X домашняя свинья AY261360

3.2 Методы

Дизайн, расчёт и проверку олигонуклеотидных праймеров проводили в поисковой системе БепсЫт§.

Для «виртуального» клонирования генов использовали программу Benchling, сравнительный анализ гомологии, филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов проводили с помощью программ BioEdit 6.0.7. и MEGA 5.05.

Вирусологические методы:

Молекулярно-биологические исследования: выделение плазмидной ДНК, постановку ПЦР, электрофорез ДНК в агарозном геле, рестрикцию ДНК, лигирование проводили, как описано Sambrook (2006 г.) [142]. Нуклеотидную последовательность встройки определяли секвенированием совместно с Зиняковым Н.Г по методу Sanger. Клонирование проводили в соответствии с инструкцией к набору «CloneJet PCR cloning kit от производителя (Thermo Fisher Scientific)». Расчёт необходимого количества вектора для проведения одной реакции лигирования производили в соответствии с рекомендацией к набору, а именно по соотношению встройки к вектору 3:1. Трансформацию клеток E.coli проводили согласно инструкции набора «TransformAid transformation Kit (Thermo Fisher Scientific)» для приготовления компетентных клеток и их плазмидной трансформации.

Индукцию экспрессии проводили согласно руководству пользователя для pET-системы (Novagen) с использованием IPTG и «автоиндукции» с а-лактозой по методу Studier; очистку рекомбинантных белков, полученных в pET-системе, проводили методом металл-хелатной хроматографии на Ni-сефарозном сорбенте (Sigma).

Трансфекцию клеток CV-l проводили согласно руководству набора Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific); очистку рекомбинантных белков, полученных в pCI-neo, проводили согласно методу очистки не маркированных белков из геля SDS - ПААГ по протоколу Richard R. Burgess 2009 г. [57].

Постановка РПИФ: проводили с применением ФИТЦ - конъюгатов (специфические ФИТЦ-иммуноглобулины для иммунофлуоресцентной диагностики АЧС (ВНИИВВиМ, г. Покров).

Электрофорез белков и иммуноблотинг: анализ белков осуществляли в 10% SDS-полиакриламидном геле (SDS-ПААГ) по методу Laemmli (1970

г.) [111].

Определение концентрации общего белка проводили по методу Lowry

[131].

Приготовление культур клеток: первичные культуры клеток свиней для дальнейшей работы получали согласно ГОСТ 28573-90 и методическим рекомендациям [9, 10].

Определение титра вируса: титрование материала проводили с использованием культуры клеток на 96-луночных планшетах по стандартной методике [9]. Инфекционный титр вируса вычисляли по методу Кербера (в

-5

модификации Ошмарина) и выражали в lg ГАдЕ50/см .

Обнаружение генома вируса А ЧС: в пробах выявляли наличие генома возбудителя АЧС методом ПЦР-РВ с использованием тест-системы «АЧС» для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (ФБУН «ЦНИИ») и тест-системы для выявления генома вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Статистическая обработка включала расчёты средних арифметических значений, коэффициентов вариации, достоверности статистической разницы между средними величинами, определёнными по разностному методу Стьюдента-Фишера, расчёт стандартных отклонений результатов РГАд, выраженных в lg, с помощью программы Microsoft Office Excel 2013, вычисления эволюционных дистанций c помощью программ MEGA 5.05., обработку результатов с помощью пакета прикладных программ Statistica 10.0 (Stat Soft. Inc., США).

4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 Анализ возможности экспресс-оценки уровня репродукции вируса АЧС с использованием полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Метод, позволяющий определять количество инфекционных единиц вируса в различных образцах, является необходимым инструментом в вирусологии. Определение титра вируса в культуре клеток занимает продолжительный период времени: от 5 до 10 дней в зависимости от свойств исходного изолята.

С появлением новейших технологий для определения титра вируса в пробе всё чаще применяют количественный метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), основанного на показателе С!

Значения порогового цикла (О:), определяемое в результате ПЦР-РВ, является точным и воспроизводимым результатом с низким стандартным отклонением [132, 134]. После получения результатов (3,0 - 3,5 часа) и проведения соответствующих расчётов ориентировочный титр вируса в испытуемой пробе определяется в течение 1-2 минут либо с использованием графика, либо по соответствующей формуле [134].

В доступной литературе представлено много работ, посвящённых возможности применения ПЦР-РВ для определения титра вируса при диагностических исследованиях, при обработке экспериментальных данных или приготовлении вакцин. На данный момент ПЦР-РВ успешно используют для определения титра вируса, уровня репродукции и количества копий генома разных вирусов (вирус Ящура, вирус Нюкасила, пикорнавирус, лентивирус, разные серотипы вируса гриппа и рекомбинантный вирус леса Семлики) [4, 68, 99, 108, 109, 132, 133, 134,157].

Кроме того, в зарубежной литературе представлен ряд работ, в которых демонстрируется определение вирулентности вируса АЧС по уровню его содержания в крови, определённому по значению О: [44, 112].

Целью данного этапа работы являлась разработка экспресс-оценки уровня репродукции вируса АЧС на основе использования ПЦР в режиме реального времени.

Первоначально было необходимо провести расчёт минимального количества копий генома в пробе вируса АЧС и определить корреляцию изменений показателя Ct в ПЦР в режиме реального времени с показателями значений титра вируса, устанавливаемого в реакции гемадсорбции.

4.1.1 Построение калибровочной кривой для определения количества копий гена B646L вируса АЧС

На матрице ДНК культурального вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17 амплифицировали полноразмерную копию гена B646L вируса АЧС, используя классическую ПЦР с праймерами, фланкирующими полноразмерный ген (таблица 3, раздел 3.1 Материалы). Условия проведения ПЦР и температурный режим амплификации соответствовали рекомендациям автора [121].

Очистка ПЦР-продукта проводилась методом электрофоретического разделения в 1,0% агарозном геле (Рисунок 5), далее ПЦР-продукт гена B646L был выделен из геля.

Рисунок 5. Результаты электрофоретического разделения в 1,0% геле агарозы ПЦР-продукта (изолят Krasnodar 07/17 вируса АЧС).

Примечание: треки 1 и 2 - ПЦР-продукт полноразмерного гена B646L; трек 3 - маркер 1к (Thermo Fisher Scientific) с линейкой фрагментов от 10000 п.н. до 250 п.н.

На спектрофотометре определили концентрацию очищенного ПЦР-продукта, а для расчёта количества копий гена Б646Ь применили метод абсолютной количественной оценки с использованием следующей формулы:

количество копий гена = (концентрация ПЦР продукта (нг)х 6.022х1023) / (длина ПЦР продукта х 1х109 х 650).

Поскольку размер амплифицированного фрагмента 1981 п.н. и его концентрация после очистки из агарозного геля равнялась 25,1 нг/мкл, то рассчитанное количество копий гена составляло 1,17х 1011 копий/мкл.

Затем приготовили 10 последовательных десятикратных разведений образца ПЦР-продукта и провели их анализ в ПЦР-РВ с трёхкратной повторностью. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5

Значения О ПЦР-РВ в зависимости от количества копий гена B646L

вируса АЧС

(п=3)

Разведение пробы* Среднее значение С:** Стандартное отклонение (о )*** Результат

10-4 5,8 ± 0,3 Пол.

10-5 8,2 ± 0,28 Пол.

10-6 11,34 ± 0,13 Пол.

10-7 15,15 ± 0,22 Пол.

10-8 18,09 ± 0,65 Пол.

10-9 21,11 ± 0,53 Сомн.

10-10 25,00 ± 0,73 Сомн.

Примечание:

Результат ПЦР-РВ оценивают в соответствии с инструкцией производителя (положительный результат - значение С: ПЦР-РВ не превышает 20,0; сомнительный результат -значение С: между 20,0 и 30,0; отрицательный результат - значение С: отсутствует).

*: Для исследования использовали 10"4-10"10 разведения материала, т.к. из-за более высокой концентрации ДНК в первых трёх разведениях получали ложноотрицательный результат в ПЦР-РВ.

**:Среднее значение О: (х) рассчитано по формуле: 4 п

***Стандартное отклонение (,7 ) рассчитано по формуле: л^ ^

где о = стандартное отклонение, а п = размер выборки.

На основе полученных данных с помощью программного обеспечения прибора построили график зависимости порогового цикла от концентрации матрицы, использованной в реакции (десятикратные разведения амплификата гена Б646Ь) (Рисунок 6).

28 г

26 ■

24 ■

22 -

20 ■

13 ■ о 16 -

14 ■ 12 -10 -е ■ б -4 I-

1(И 10"5 10"5 10"т 10"а 10"1г

кип ество копий

Рисунок 6. График зависимости значений О: ПЦР-РВ от количества

копий гена Б646Ь Таким образом, по построенному калибровочному графику, который представляет собой практически прямую линию, возможно определить количество копий гена Б646Ь в исследуемой пробе, имея значение порогового цикла С:, или даже количество геномов вируса АЧС, поскольку данный ген представлен в его геноме единственной копией.

Таким образом, в результате анализа установлена обратно-пропорциональная зависимость между количеством копий гена B646L и значениями Ct ПЦР-РВ: при уменьшении количества копий ДНК в исследуемой матрице возрастает значение Ct ПЦР-РВ. Содержанию ДНК 1,17х106 копий в 1 мкл (или 25,1х10-4 нг/мкл) соответсвует показатель Ct - 6 циклов, тогда как для пробы с содержанием ДНК 1,17 копий/мкл (или 25,1х10-10 нг/мкл) - уже 25 циклов.

Как видно из рисунка 6, график характеризует практически линейную зависимость показателя Ct от количества копий гена B646L вируса АЧС, когда снижение концентрации в 10 раз приводит к увеличению Ct на 3 цикла.

Следовательно, с использованием ПЦР-РВ возможно провести предварительное экспресс-определение количества копий генома вируса АЧС в пробе.

4.1.2 Определение титра вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17 в реакции гемадсорбции и ПЦР-РВ

Для точного определения титра вируса АЧС в пробе с помощью реакции гемадсорбции провели сравнительный анализ чувствительности первичных культур клеток СС и КМС к вирусу АЧС.

С этой целью параллельно заразили культуры клеток СС и КМС

-5 -5

вирусом АЧС изолята Krasnodar 07/17 в дозе 10 ГАдЕ50/см на флакон T-25

л

(объем 50 мл - 25 см ). Из каждого флакона на седьмые сутки отобрали по 300 мкл вируссодержащей жидкости, исследовали образцы методом ПЦР-РВ и провели определение титра вируса АЧС в двух указанных культурах клеток в РГАд. Титр вируса АЧС в культуре клеток СС составил 1,16 х106

-5 С

ГАдЕ50/см , а титр вируса АЧС в культуре клеток КМС составил 1,07х10

-5

ГАдЕ50/см , т.е. практически в 10 раз ниже. Полученные результаты РГАд соответствовали данным ПЦР-РВ, так как на седьмые сутки значение Ct проб с культуры клеток СС составило 12,2, а с культуры клеток КМС - 15,9.

Поскольку обе культуры клеток были использованы для заражения одной и той же дозой вируса, а репродукция вируса АЧС в культуре клеток

53

СС проходила более эффективно по сравнению с культурой клеток КМС, то для выполнения дальнейших этапов работы выбрана культура клеток СС, как она наиболее чувствительная к вирусу АЧС.

Затем определили наличие корреляции значений Ct ПЦР-РВ с титром вируса, полученным в РГАд в культуре клеток СС. Исходный титр вируса составлял 7,16±0,01 ГАдЕ50/см , пробу использовали для приготовления семи десятикратных разведений. Для достоверности анализа все десятикратные разведения проб исследовали в трёх повторностях как для выделения ДНК вируса АЧС, так и для постановки ПЦР-РВ с данными образцами. Для объективной оценки результатов реакции вычисляли среднее значение Ct, стандартное отклонение и пределы 95%-го доверительного интервала (таблица 6).

Таблица 6

Результаты ПЦР в реальном времени для разных разведений

культурального образца вируса АЧС

(n = 3)

Разведение Среднее значение Ct* Результат Стандартное отклонение С7 )** 95% доверительный интервал***

исходный материал 8,03 Пол. ±0,12 7,67 - 8,39

10-1 11,95 Пол. ±0,136 11,54 - 12,36

10-2 16,23 Пол. ±0,542 14,6 - 17,86

10-3 19,84 Пол. ±0,138 19,43 - 20,25

10-4 23,86 Сомн. ±0,565 22,17 - 25,56

10-5 27,37 Сомн. ±0,574 25,65 - 29,07

10-6 н.з. Отриц. н.з. н.з.

10-7 н.з. Отриц. н.з. н.з.

* Среднее значение С! (Л") рассчитано по формуле: п

|ЕСу: - у)3

**Стандартное отклонение ('и ) рассчитано по формуле: л1 ***95% доверительный интервал рассчитан по формуле: 95% доверительный интервал = Za/2 х о/^(п)

Za/2 = коэффициент доверия, где а = доверительный уровень, о = стандартное отклонение, п = размер выборки.

Также для аналогичных исследований использовали пробы крови, полученной от заражённого этим же вирусом животного, титр вируса в крови составлял 7,23±0,01 ^ ГАдЕ50/см . После приготовления разведений пробы внесли в культуру клеток СС и параллельно использовали для постановки ПЦР-РВ (таблица 7).

Таблица 7

Результаты ПЦР в реальном времени для разных разведений образца крови вируса АЧС

(П = 3)

Разведение Среднее значение а Результат Стандартное отклонение (а ) 95% доверительный интервал

исходный материал 8,234 Пол. ±0,224 7,562 - 8,906

10-1 12,254 Пол. ±0,361 11,171 - 13,337

10-2 16,15 Пол. ±0,242 15,424 - 16,876

10-3 21,714 Сомн. ±0,484 20,262 - 23,16

10-4 24,27 Сомн. ±0,215 23,625 - 24,915

10-5 27,38 Сомн. ±0,674 25,35 - 29,402

10-6 н.з. Отриц. н.з. н.з.

10-7 н.з. Отриц. н.з. н.з.

Таким образом, при анализе корреляции между показателями О ПЦР-РВ и результатами титрования проб в культуре клеток СС удалось установить близкую к линейной зависимость показателя О от титра вируса АЧС. Необходимо отметить, что в данном случае снижение титра вируса на 1,0 приводило к увеличению значения О: на 4 цикла (рисунок 7).

На основе полученных данных с помощью программного обеспечения прибора построили графики зависимости порогового цикла О: от показателей титра вируса АЧС (рисунок 7).

765432 765432

Тигр вируса {Tg ГАдЕ^см3 ) Титр вируса (lg ГАдЕ5о/см3)

Рисунок 7. Значение Ct ПЦР-РВ при разных титрах вируса АЧС изолята Krasnodar 07/17 в культуре клеток (слева) и в крови (справа).

Полученные результаты также демонстрировали равномерное нарастание значения Ct ПЦР-РВ при снижении титра вируса в крови, а построенные графики представляли линейную зависимость: значения Ct увеличивались на 4 циклах при снижении титра вируса на 1 lg.

4.1.3 Определение титра вируса по показателю Ct

Поскольку полученные в результате экспериментов графики представляли собой практически прямую линию, отражающую зависимость показателя Ct ПЦР-РВ от титра вируса, то расчёт ориентировочного титра вируса в пробе проводили с использованием показателя Ct.

На оси ординат отмечали полученное в ПЦР-РВ значение Ct и опустили перпендикулярную линию на графическую линию. Из точки пересечения с графиком, в свою очередь, опустили перпендикулярную прямую на ось абсцисс. Числовое значение места пересечения перпендикулярной линии с осью абсцисс и соответствовало искомому значению тира вируса (рисунок 8).

Титр вирус а. ГАдЕао ' см:3

Рисунок 8. График значений О ПЦР-РВ при разных титрах вируса

АЧС.

Примечание: - перпендикулярные линии к оси ординат и абсцисс. Из графика видно, что если значение О: равно 11,0, то рассчитанный титр вируса составит ~6,3 ГАдЕ50/см .

Для определения формулы расчёта титра вируса построили линию регрессии и определили коэффициент корреляции между логарифмом титра вируса и знчением С: с помощью программы 8:аЙ8Йса (рисунок 9).

7 6 5 4 3 2

Тигр вируса (к; ГАдЕзо/сы3 )

Рисунок 9. График зависимости между логарифмом титра вируса АЧС и значением С: ПЦР-РВ.

В наших исследованиях коэффициент корреляции составил 0,9683, что свидетельствует о высокой достоверности (точности) исследований и позволяет производить вычисление титра вируса в пробе. Данный график,

описывается формулой 1е т = 1,655 ~1ё Сг, где Т- титр вируса (ГАдЕ50/см3),

0,0988

что позволяет рассчитать ориентировочный титр вируса по полученному значению С: в реакции ПЦР-РВ.

Для подтверждения правильности определения титра вируса на основе полученных результатов ПЦР-РВ использовали пробы разных изолятов вируса АЧС с известным титром, который был определён по стандартной методике в РГАд с использованием культуры клеток СС на 96-луночных планшетах [9]. Затем исследовали все пробы методом ПЦР-РВ и по полученному значению С: рассчитали титр по формуле. Результаты сравнительного анализа значений титров приведены в таблице 8.

Таблица 8

Сравнение рассчитанного по О титра и титра, определённого в РГАд,

для разных изолятов вируса АЧС

(п=2)

№ Изолят Титр в РГАд (^ГАдЕ50/см3) Значение Ct Титр рассчитан по формуле (!§ГАдЕ5о/см3)

1 Krasnodar 07/17 5,20 ± 0,05 13,15±0,20 5,42±0,14

2 Arm 07 5,70± 0,03 12,71±0,10 5,57±0,17

3 Omsk 10/2017 3,20±0,11 22,5±0,08 3,06±0,12

4 Belgorod 10/17 4,45 ± 0,06 16,0±0,00 4,56±0,00

5 Kaliningrad 12/17 5,95 ± 0,08 11,3±0,09 6,09±0,07

6 Irkutsk 03/2017 4,45 ± 0,06 15,6±0,20 4,67±0,10

Как видно из данных таблицы 8, титр вируса, определённый в РГАд и рассчитанный по формуле на основании значений О, совпадают с точностью

-5

до ±0,1-0,5 ^ ГАдЕ50/см , следовательно, разработанный экспресс-метод оценки уровня репродукции позволяет определить ориентировочный титр вируса АЧС в пробе в течение 3,0 - 3,5 часов.

Изучение соответствия титра вируса значениям С: с использованием набора ПЦР-РВ, разработанного в ФГБУ ВНИИЗЖ, дало аналогичные результаты.

Таким образом, тест-система "АЧС" для выявления вируса африканской чумы свиней методом полимеразной цепной реакции (ФБУН «ЦНИИ»), так и тест-система, разработанная в ФГБУ «ВНИИЗЖ», пригодны для использования с целью предварительной оценки уровня репродукции вируса АЧС в инфицированной культуре клеток или крови заражённого животного.

Поскольку чувствительность РГАд в 10 раз выше (1 ГАдЕ - 10-12 вирионов), чем чувствительность ПЦР-РВ (10 ГАдЕ или —100-120 вирионов, или —117 копий), то определение минимальных значений титра вируса в ПЦР-РВ невозможно. Однако постановка РГАд более трудоёмка и длительна (7-10 суток) по сравнению с ПЦР-РВ (2 час 30 минут), поэтому для определения динамики изменения уровня репродукции использование ПЦР-РВ предпочтительнее, так как точность ПЦР-метода при определении минимальных изменений уровня накопления вируса выше, чем у РГАд.

Выявленная корреляция между значением О: и титром вируса в пробе позволяет использовать в лабораторной практике ПЦР-РВ для количественного определения содержания вируса в образце, а также даёт возможность детального изучения ряда биологических свойств возбудителя АЧС.

Следовательно, разработана экспресс-оценка уровня репродукции вируса АЧС в образцах крови и культуры клеток методом ПЦР-РВ позволяет в течение 3 - 3,5 часов оценить изменения в уровне репродукции вируса АЧС с определением ориентировочного значения титра вируса.

Тем не менее, следует учитывать, что корреляция значений С: может изменяться в зависимости от чувствительности ПЦР-набора, целевого детектируемого участка генома вируса АЧС и чувствительности культуры клеток, на которой проводится определение титра вируса.

При необходимости можно использовать ПЦР-РВ для определения количества копий генома вируса в исследуемых образцах с поправкой на то, что предварительно должна быть изучена корреляция показателей титра вируса АЧС в РГАд и значений Ct определённого набора.

4.2 Изучение консервативности генов вируса АЧС российских изолятов

Определение консервативности генов вируса АЧС является

необходимым этапом при подборе иммунологически значимых антигенов

для разработки на основе их использования эффективной вакцины против

АЧС, поскольку полноценная защита от АЧС формируется в результате

инактивации продуктов экспрессии стабильных генов, ответственных за

такие фундаментальные свойства вируса АЧС как вирулентность,

серотипоспецифичность и т.д. [139].

Исходя из вышеизложенного, на основании анализа изученной

литературы для исследований выбраны следующие гены вируса АЧС:

-участок C-конца гена B646L, определяющего генотип и кодирующего

высококонсервативный белок p72;

-ген A179L, кодирующий вирусспецифический ингибитор апоптоза;

-ген E248R, кодирующий поздний структурный компонент вирусной

частицы, являющийся субстратом вирус-опосредованной окислительно-

восстановительной системы;

-ген DP96R, кодирующий высококонсервативный белок,

определяющий вирулентность вируса АЧС для домашних свиней, но не

влияющий на рост в макрофагах in vitro, который также негативно

регулирует экспрессию IFN типа I и передачу сигналов NF-kB, что играет

важную роль в «ускользании» вируса от иммунной системы;

-ген I215L, кодирующий убиквитин-конъюгирующий фермент (E2),

взаимодействующий непосредственно с белками вируса АЧС, которые

синтезируются в клетках хозяина и связывающий их с убиквитином, что

играет значительную роль в последовательной экспрессии белков вируса

60

АЧС на мембране инфицированных клеток и/или определении путей их модификации в органеллах;

-ген X69R, кодирующий неизвестный и неохарактеризованный трансмембранный белок рХ69, расположенный в левой вариабельной области генома вируса АЧС.

Для сравнительного изучения были взяты несколько вариабельных

генов:

- центральный вариабельный регион (CVR) гена B602L, кодирующего белок, ответственный за сборку вириона и располагающийся в центральной вариабельной области;

-ген O61R, кодирующий белок прикрепления р12 с интергенным регионом, который обладает высокой степенью изменчивости при пассировании;

-ген CP204L, кодирующий белок проникновения р30, являющийся одним из наиболее иммуногенных структурных белков, ответственных за интернализацию вируса АЧС;

-ген EP402R, кодирующий поверхностный белок CD2v, ответственный за гемадсорбцию.

4.2.1 Анализ расположения и направления открытых рамок считывания генов O61R, CP204L, X69R, A179L, B646L, I215L, E248R, EP402R и DP96R

Поскольку начало глобальной эпизоотии в странах Европы и Азии положил вирус изолята Georgia 2007/1, отнесённый ко II генотипу, то для анализа расположения генов в геноме вируса АЧС использовали данные GenBank, а именно изолята Georgia 2007/1.

Проведённый анализ позволил определить места локализации указанных генов на карте генома штамма Georgia 2007/1 вируса АЧС (Рисунок 10).

Рисунок 10. Карта полноразмерного генома вируса АЧС штамма Georgia 2007/1 с расположением ОРС генов X69R, A179L, EP402R, B646L, CP402L, O61R, E248R, I215L и DP96R.

Примечание: К [>стрелки показывают расположение ОРС, её размер и направление. Синим цветом выделены ОРС с ориентацией в обратном направлении, а оранжевым цветом выделены ОРС с ориентацией в прямом направлении.

Как видно из рисунка 10, целевые гены вируса АЧС подразделяются на 2 группы: гены с открытой рамкой считывания слева направо (E248R, DP96R, X69R, EP402R и O61R), и гены с открытой рамкой считывания справа налево (A179L, CP204L B646L и I215L).

4.2.2 Оптимизация условий амплификации выбранных генов с использованием подобранных праймеров

Для генов X69R, A179L, I215L, E248R, EP402R и DP96R с помощью программы Benchling были рассчитаны и подобраны праймеры, фланкирующие соответствующие гены (таблица 9), а также предполагаемые условия их амплификации в ПЦР.

Проверка правильности подбора праймеров и оптимизация условий амплификации проводились по следующим параметрам: температурный режим, концентрация MgCl2, длительность и количество циклов.

Таблица 9

Праймеры, подобранные для амплификации генов вируса АЧС

Ген Позиция гена Направление считывания Название праймеров Последовательность 5' ^ 3' Позиция праймеров Размер фрагмента (пн.)

Е248Я 166992167738 Слева направо Е248Я-Б СТТЛЛОЛТЛЛТОООЛООСТСТЛСЛЛО 166983 167008 759

Е248Я-Я ЛТТЛТТЛС0ЛЛЛС00СЛ0СЛТТ 167721 167742

1215Ь 173792174430 Справа налево 1215Ь-Б ЛЛТСЛЛСЛСТТЛЛТОТЛТОСЛЛШТ 173754 173778 717

1215Ь-Я ЛвОЛООЛЛТСЛЛССЛОООЛЛСГТ 174449 174471

БР96Я 184331184621 Слева направо БР96Я-Р ОТЛТЛОТЛОЛТСГТЛОСЛТвТ 184314 184334 404

БР96Я-К ЛЛЛТЛТТЛОЛТСТЛЛСЛШТТ 183698 184718

Л179Ь 5377954318 Справа налево Л179Ь-и ЛТОЛЛСШССЛШТЛЛЛЛТС 53748 53767 679

Л179Ь-Б СвТООССТЛЛСЛТТТОТТОТ 54408 54427

Х69Я 1922719436 Слева направо Х69Я-Б ОТТСЛСТООТОТССЛТОЛТСЛЛЛЛ 18470 18493 1140

Х69Я-Я ССТЛЛЛТОЛТЛЛЛЛСШЛТТЛСЛТС 19586 19610

Е402Я 7336974451 Слева направо СБ2У-1-Р ТвТТСТТЛЛ ОЛТвЛТЛЛТ ЛСТ 73359 73379 1129

СБ2У-1-Я СЛТСТЛвЛЛ ЛвОТТЛЛЛТ ЛЛТ 74468 74488

Оптимальную температуру отжига праймеров устанавливали на амплификаторе «Мав:егсус1ег-пехш», используя для постановки реакции градиент температур от 49°С до 58°С с шагом 1°С. Данный интервал температуры был выбран по предварительной температуры рассчитана для праймеров по программы ВепсЫт§.

В результате проведённых исследований подобраны следующие температурные режимы для этого амплификатора (таблица 10).

Таблица 10

Режим амплификации полноразмерных копий генов Х69Я, Л179Ь, Т215Ь, Е248Я, БР96Я и ЕР402Я генома вируса АЧС.

Этапы ПЦР Кол-во Температурный режим

циклов Х69Я Л179Ь 1215Ь Е248Я БР96Я ЕР402Я

Предварительный цикл 1 98°С-2' 98°С—2' 98°С-2' 98°С-2' 98°С-2' 98°С-2'

Денатурация 95°С—30" 95°С—30" 95°С—30 ?? 95°С—30" 95°С-30" 95°С-30"

Отжиг-праймеров 35 50°С—30" 50°С—30" 50°С—30 52°С—30" 50°С-30" 50°С-30"

Элонгация 72°С —2' 72°С—1'' " 72°С-2' 72°С—2' 72°С-60'' 72°С-60''

Завершающий цикл 1 72°С - 5' 72°С-5' 72°С-5' 72°С-5' 72°С-5' 72°С-5'

Из данных, приведённых в таблице 10, следует, что для лучшей денатурации матрицы в предварительном цикле её прогрев должен проводиться при температуре 98°С в течение двух минут, поскольку крупная двухцепочечная молекула ДНК вируса АЧС размером до 190 т.п.н. имеет шпильки на концах, что в значительной степени влияет на скорость и степень ее ренатурации.

Температурные режимы амплификации исследуемых генов стадии отжига варьировали в зависимости от ОС-содержания праймеров. Длительность фазы элонгации подобрана в зависимости от длины синтезируемого фрагмента. Оптимальное количество циклов - 35.

Концентрация М§С12 в реакционной смеси варьировала от 1 до 4 мМ, что позволило повысить эффективность связывания праймеров с матрицей ДНК вируса АЧС без потери специфичности. Для амплификации генов значение 2,5 мМ М§С12 оказалось оптимальным.

Результаты применения рассчитанных праймеров оценивали детекцией полученных продуктов амплификации с помощью электрофореза в 1,0% агарозном геле (рисунок 11).

А 1000 пл - "50 ел 500 П-Н —~~~ IK A179L град и сит тем. от 49"С до 584" Ж Dp96R i ради гит тем. от « ы 4В'( до5в"С IK E248KrpuiK>irrте*. от 49"С до 5*"С

Б X69R градиент тем. от 49°С до 5ГС 1К E15L градиект тем от 49°С до 5В°С

Рисунок 11. Результаты электрофоретичекого разделения ПЦР-продуктов изолята Krasnodar 07/17 вируса АЧС с использованием пяти пар праймеров.

Примечание: А - электрофореграмма ПЦР-продуктов A179L, DP96R, E248R изолята Krasnodar 07/17 при использовании градиента температур с 49°С до 58°С в 1,0% агарозном геле; Б - электрофореграмма ПЦР-продуктов X69R, I215L изолята Krasnodar 07/17 в 1,0% агарозном геле при использовании градиента температур от 49°С до 58°С.

Выбранные праймеры и оптимизированные условия амплификации

позволили наработать препаративные количества (0,3 - 0,5мкг) полноразмерных копий и фрагментов генов вируса АЧС, содержащих гены: ПЦР-продукт X69R- 1140 п.н.; ПЦР-продукт A179L - 679 п.н.; ПЦР-продукт DP96R - 404 п.н.; ПЦР-продукт E248R - 759 п.н.; ПЦР-продукт I215L - 717 п.н. и ПЦР-продукт EP402R - 1129 п.н.

Для получения ПЦР-продуктов, содержащих последовательности полных генов CP204L, O61R и фрагментов генов B646L (478 п.н.) и B602L (665 п.н.), использовали праймеры и условия амплификации в соответствии с рекомендациям авторов (таблица 3, раздел 3.1 Материалы) [41, 49, 91, 121].

4.2.3 Определение нуклеотидных последовательностей генов российских изолятов и филогенетический анализ

Определение нуклеотидных последовательности отобранных генов российских изолятов проводили секвенированием по общепринятой методике (раздел 3.2 Методы).

Для сравнительного анализа уровня изменчивости анализируемых генов полученные результаты секвенирования российских изолятов выравнивали с последовательностями 8 Европейских изолятов (I генотип) и 6 изолятов из Африки (I - X генотипов), взятых из ОепБапк (таблица 4, раздел 3.1 Материалы).

На основе проведённого анализа были построены дендрограммы для 9 генов (рисунки 12 - 17).

b646l

Kaliningrad_12/17

0dintsovo_02/14

Belgorod_12/17

Belgorod_10/17

Kras noyars k_10/2017

0msk_10/2017

Krasnodar_07/17

Irkutsk_03/2017

Georgia_2007/1

Kashino 04/13

- Tengani_62

BA71V BA71 L60 E75

26544/0G10 NHV

0URT_88/3 Benin_97/1 - Malawi Lil-20/1

1001 '

Ken06.Bus

, Ken05/TK1

■ Kenya_1950

Рисунок 12. Дендрограмма, построенная по методу «Bootstrap (максимального подобия)» на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей С-конца гена B646L изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации, а также Европы и Африки.

Как уже отмечалось ранее, сравнительный анализ последовательности С-конца гена B646L служит методом установления генотипа изолята вируса АЧС. Согласно филогенетическому анализу все изоляты из Российской

90

92

96

96

0.005

Федерации вместе с референтным штаммом Georgia 2007/1 относятся ко второму генотипу. В то же время европейские изоляты и изолят Benin 97/1 принадлежат к первому генотипу. Изолят Tengani 62 принадлежит к пятому генотипу, Malawi Lil-20/1 - к восьмому генотипу, Ken06.Bus - к девятому и Ken05/TK1 и Kenya 1950 - к десятому, что соответствует литературным данным (рисунок 12).

Для определения изолятов, максимально соответствующих по своей генетической структуре исходному изоляту Georgia 2007/1, использовали анализ центрального вариабельного региона (CVR) гена B602L, который состоит из 665 п.н. и служит маркером дифференциации изолятов, относящихся к одному генотипу. Исходя из этого, CVR 54 изолятов, выделенных на территории РФ в 2013-2017 гг., исследованы методом секвенирования с дальнейшим сравнительным анализом этого региона референтного изолята Georgia 2007/1.

Рисунок 13. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей CVR гена B602L российских изолятов.

Как видно из рисунка 13, в результате анализа обнаружены однонуклеотидные мутации в 4 локусах: замена «С» на «Т» в положении 994 гена B602L в 6 изолятах (Sudogda-Vladimir 16-DP, Arkhangelsk 16-DP, Tambov 2016, Krasnodar 2016, Gorokhovets-Vladimir 17-WB/325, Orel 17-WB/337), замена «А» на «Т» в положении 1136 в 5 других изолятах (Anino-

Moscow 13-WB, Karamzino-Tver 13-WB, Shihobalovo-Vladimir 13-WB, Sobinka-Vladimir 15-WB, Sobinka-Vladimir 16-WB), а также две одновременные замены «С» на «Т» в позиции 979 и «А» на «G» в позиции 1115 в 14 изолятах (Che 07, Abk 07, Arm 07, Az 08B, Az 08D, Oren 08, Ing 08, StPet 09, Kalmykia 09, Rostov 09, Dagestan 09, Ukr12/Zapo, Krasnodar 07/15, Crimea 01/16 Martins). К чевертой группе были отнесены изоляты Irkutsk 03/2017, Krasnodar 07/17, Omsk 10/2017, Belgorod 10/17, Krasnoyarsk 10/2017, Kaliningrad 12/17, Belgorod 12/17.

Анализ нуклеотидных последовательностей двух трансмембранных белков E248R и EP402R показал высокую консервативность нуклеотидных последовательностей генов российских изолятов, так как они оказались сгруппированы в один клад (100% гомология), а изолят Benin 97/1 и европейские изоляты I генотипа принадлежали к другой группе и, как и ожидалось, африканские изоляты V-Х генотипа располагались отдельно от первых двух кладов и друг от друга (гомология 65% до 96%) (рисунок 14).

e248r

49 1—

Benin 97/1 OURT 88/3 NHV

26544/OGIO E75 L60 BA71 BA71V

-Tengani 62

Belgorod 12/17 Kaliningrad 12/17 Belgorod 10/17 Georgia 2007/1 Krasnodar 07/17 Odintsovo 02/14 Kashino 04/13 Irkutsk 03/2017 Omsk 10/2017 - Malawi Lil-20/1

-Kenya 1950

-Ken06.Bus

- Ken05/TK1

ep402r

- Tengani 62

Omsk 10/2017 Krasnoyarsk 10/2017 Krasnodar 07/17 Georgia 2007 Odintsovo 02/14 Kashino 04/13 Irkutsk 03/2017 Kaliningrad 12/17 Belgorod 12/17 Belgorod 10/17 ■ Malawi Lil-20/1

-Г

0 I—

Ken05/TK1

100 Kenya 1950

— 26544/0G10 BA71 BA71V L60 E75 NHV

OURT 88/3 Benin 97/1

Рисунок 14. Дендрограмма, построенная по методу «Bootstrap (максимального подобия)», на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей генов E248R (слева) и EP402R (справа) изолятов вируса

79

99

57

100

100

85

0.005

0.02

АЧС, выделенных на территории Российской Федерации, а также Европы и Африки.

Для последовательности гена БР402Я установлены некоторые различия у европейских изолятов I генотипа, причём гены штаммов 26544/0010 и ВА71 отличались от всех изолятов в данной группе (гомология 73% и 99%).

Филогенетический анализ генов А179Ь и ВР96Я, ответственных за вирулентность вируса АЧС, подтвердил их высокую консервативность. Для гена ЭР96Я установлена значительная гомология между российскими и европейскими изолятами I генотипа (97% гомология первого и второго генотипа), а африканские изоляты У-Х генотипа отличались от всех анализируемых изолятов (гомология 48% до 80%) (рисунок 15).

a179l

97

Georgia 2007/1 Kashino 04/13 Irkutsk 03/2017 Krasnodar 07/17 Omsk 10/2017 Krasnoyarsk 10/2017 Belgorod 10/17 Belgorod 12/17 Kaliningrad 12/17 Odintsovo 02/14 BA71V BA71 L60

-Benin 97/1

E75

26544/0G10 NHV

OURT 88/3

- Tengani 62

q

51 I

511 Kenya 1950

dp96r

Georgia 2007/1 Kashino 04/13 Irkutsk 03/2017 Krasnodar 07/17 Omsk 10/2017 Krasnoyarsk 10/2017 Belgorod 10/17 Belgorod 12/17 Kaliningrad 12/17 Odintsovo 02/14 -Malawi Li 1-20/1

NHV

OURT 88/3

26544/OG10

E75

L60

BA71V

BA71

>3 L T

Benin 97/1 Kenya 1950

94

63 L Tengani 62

Рисунок 15. Дендрограмма, построенная по методу «Bootstrap (максимального подобия)», на основании данных гомологии нуклеотидных последовательностей генов A179L (слева) и DP96R (справа) изолятов вируса АЧС, выделенных на территории Российской Федерации, а также Европы и Африки.

100

65

4

00

В9

9£

Malawi Li 1-20/1

0.005

0.5

Анализ A179L также выявил близкую гомологию между российскими и европейскими изолятами I генотипа (99% гомология). В то же время африканские изоляты V-Х генотипа значительно отличались друг от друга (95% - 96% гомология), что говорит о разной эволюционной истории изучаемых изолятов (рисунок 15).

Анализ структуры гена I215L, также как DP96R и A179L, показал очень высокий уровень консервативности и сходства между российскими и европейскими изолятами I генотипа (95,7% гомология), как и с африканскими изолятами Malawi Lil-20/1 и Benin 97/1 (гомология 88% и 95%, соответствено). В то же время другие изоляты V-Х генотипа из Африки отличались между собой (86% - 96,6%).

i215l

953

Belgorod 12/17 Kaliningrad 12/17 Belgorod 10/17 Irkutsk 03/2017 Omsk 10/2017 Krasnoyarsk 10/2017 Krasnodar 07/17 Kashino 04/13 Georgia 2007 Odintsovo 02/14 — Malawi Lil-20/1 26544/0G10 NHV

OURT 88/3

BA71V

BA71

L60

E75