Поиск фармакологических веществ для терапии нейрофиброматоза II типа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.06, кандидат наук Степанова, Дина Сергеевна

• Степанова, Дина Сергеевна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Степанова, Дина Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава I. Обзор литературы

1.1 Общие представления о нейрофиброматозе II типа

1.2 Причины развития НФ II. №2 - «нетипичный» онкосупрессор

1.3 Продукт гена №2 - белок мерлин

1.3.1 Мерлин, или шванномин, - новый представитель семейства

Эзрин/Радиксин/Моэзин

1. 3.2 Регуляция активности белка мерлин

1.3.3 Функции и локализация белка мерлин, взаимодействия с другими белками

1.3.4 Роль белка мерлин в контактном торможении клеточного роста

1.3.5 Сигнальные пути с участием мерлина и его онкосупрессорная функция

1.4 Современные подходы к поиску терапии для нейрофиброматоза II

1.5 Злокачественная трансформация и изменения клеточного метаболизма 34 Глава И. Материалы и методы исследования

2.1 Культивирование клеточных линий

2.2 Получение фибробластов, нокаутных по гену ТУ/2

2.3 Геномное типирование

2.3 Определение уровня пролиферации и выживаемости клеток

2.4 Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ

2.5 Трансфекции

2.6 Реэкспрессия белка мерлин в клетках 7У/2-отрицательной мышиной шванномы

2.7 Иммуноблоттинг

2.8 Количественная ПЦР (кПЦР)

2.9 Измерение внутриклеточных уровней ацетил- и малонил-КоА

2.10 Измерение флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET)

2.11 Исследования противоопухолевой активности препаратов на ксенографтной модели НФ II

2.12 Определение половинной ингибиторной концентрации (IC50)

2.13 Статистический анализ

Глава III. Результаты и обсуждение

3.1.1 Получение фибробластов, нокаутных по гену Nf2

3.1.2 Влияние утраты белка мерлин на функциональные свойства клеток MEF Nf2'f~

3.2 Скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных веществ

3.3 Первичная валидация результатов скрининга

3.3.1 Изучение зависимости цитотоксического эффекта исследуемых соединений от их концентрации и тестирование соединений-кандидатов

на клетках TV/2-отрицательных линий

3.3.2 Тестирование фармакологических аналогов соединений, отобранных

по результатам скрининга

3.3.3 Реэкспрессия белка мерлин в клетках линии Nf2-отрицательной шванномы

3.4 Исследование механизма действия ловастатина в отношении Неотрицательных клеток

3.4.1 Эксперименты по снижению цитотоксичности статинов

3.4.2 Истощение внутриклеточного пула геранилгераниола - ключевое

звено селективной токсичности статинов

3.4.3 Активация Racl, сопровождающаяся нарушением её геранилирования и клеточной гибелью

3.4.4 Транслокация Racl в ядро под действием статинов

3.5 Ингибиторы синтазы жирных кислот (FASN) как потенциальные препараты для фармакотерапии НФ II

3.5.1 Сходство эффектов от нокдауна гена Fasn и действия церуленина на А//2-отрицательные клетки

3.5.2 Эксперименты по снижению цитотоксического действия церуленина

3.5.3 Различия внутриклеточных уровней ацетил-коА и малонил-коА в клетках линий MEF Nf2'f' и MEF

3.5.4 Повышенный уровень синтеза жирных кислот в TV/2-отрицательных клетках

3.6 Эксперименты по изучению противоопухолевой активности ловастатина, золендроновой кислоты и церуленина в ксенографтной

модели НФП на мышах

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Благодарности

Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

НФ II - нейрофиброматоз второго типа РАК - р21-активируемые киназы

RAC - RAS-related СЗ botulinum toxin substrate (родственный антигену крысиной саркомы субстрат ботулинического токсина СЗ) HRS - HGF-regulated kinase substrate (субстрат киназы, регулируемой гепатоцеллюлярным фактором роста)

MTOR - mammalian target of rapamycin, белок-мишень рапамицина

млекопитающих

JIB - лекарственные вещества

ЦНС - центральная нервная система

ПНС - периферическая нервная система

ВШ - вестибулярная шваннома

Rb - retinoblastoma protein (ретинобластомный белок)

RAS - rat sarcoma, онкоген крысиной саркомы

ERM - семейство эзрин-радиксин-моэзин

RHO - RAS homolog gene family, семейство гомологов RAS

ПКА - протеинкиназа А

PIP - фосфатидилинозитолфосфат

MYPT - миозинфосфатаза

CPI 17 - малый белок-ингибитор фосфатаз, регулируемый протеинкиназой С, с молекулярной массой 17 kDa

ERK - extracellular signal-regulated kinases, киназы, регулируемые внеклеточной сигнализацией

CDK4 - cyclin-dependent kinase 4 (циклин-зависимая киназа 4) PI3K - киназа фосфатидилинозитола-3-фосфата

АКТ - v-akt murine thymoma viral oncogene homolog 1 (гомолог онкогена вирусной мышиной тимомы v-akt), протеинкиназа В

ERBB - V-erb-b2 avian erythroblastic leukemia viral oncogene homolog, гомолог онкогена вирусной эритробластной лейкемии птиц RTK - рецепторные тирозин-киназы

STAT - signal transducers and activators of transcription, передатчики сигнала и активаторы транскрипции

STAM - signal transducing activator molecule, молекула-активатор передачи сигнала

CRL4 - cullin-RING ubiquitin ligase 4, убиквитинлигаза, содержащая куллин и цинковый палец,

PDGFR - platelet-derived growth factor receptor, рецептор тромбоцитарного фактора роста

EGFR - epithelial growth factor receptor, рецептор эпителиального фактора роста VEGFR - vascular endothelial growth factor receptor, рецептор эндотелиального фактора роста

МЕК - mitogen-activated kinases, митоген-активируемые киназы

RAF - v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog, гомолог онкогена вирусной

саркомы мышей

DCAF - DDB1 CUL4 associated factor, фактор, ассоциированный с CRL4-

убиквитинлигазой

ЭР - рецепторы эстрогена

CD20 - В-лимфоцитарный поверхностный антиген кластера дифференцировки

ЛДГА - лактатдегидрогеназа

ПДК - киназа пируватдегидрогиназы

FASN - fatty acid synthase, синтаза жирных кислот

DMEM - Dulbecco's minimal essential medium, модифицированная по Дульбекко среда Игла

MEF - mouse embryo fibroblasts, мышиные эмбриональные фибробласты GFP - green fluorescent protein, зелёный флуоресцентный белок CFP - cyan fluorescent protein, голубой флуоресцентный белок YFP - yellow fluorescent protein, жёлтый флуоресцентный белок

дНТФ - динуклеотидтрифосфаты ДМСО - диметилсульфоксид

FDR - false discovery rate, доля ложноположительных отклонений

миРНК - малые интерферирующие РНК

ПХ - пероксидаза хрена

ЩФ - щелочная фосфатаза

ПЦР - полимеразная цепная реакция

Fasn - ген синтазы жирных кислот

Асс - ацетил-коА карбоксилаза

Асаса - ген ацетил-коА карбоксилазы

АсасЪ - ген Асс2

Lpinl - ген Lipinl

Acl - АТФ-цитратлиаза

Acly - ген АТФ-цитратлиазы

Acecsl - ацетил-коА синтетаза

Acss2 - ген ацетил-коА синтетазы

Acsll - long fatty acid acyl-coA ligase, лигаза длинноцепочечных жирных ацил-коА

Acs 11 - ген лигазы длинноцепочечных жирных ацил-коА

Srbpl - ген стерольного регуляторного элемента Srebpl

Cptlc - ген карнитилпальмитоилтрансферазы 1у

Cpt2 - ген карнитилпальмитоилтрансферазы II

ТФЭ - твердофазная экстракция

УВЭЖХ-МС - ультравысокоэффективная жидкостная хроматография с масс-спектрометрией

FRET - fluorescence resonance energy transfer, резонансный перенос энергии флуоресценции

PBD - р21 -связывающий домен

IC50 - половинная ингибиторная концентрация

Bcl-2 - B-cell leukemia/lymphoma 2, белок В-клеточной лейкемии/лимфомы

Bcl-XL - B-cell leukemia/lymphoma XL, белок В-клеточной лейкемии/лимфомы XL

Bad - Bcl2-associated agonist of cell death, ассоциированный с Bcl2 агонист клеточной гибели

ГМГ-коА - З-гидрокси-Зметилглутарил коэнзим А SIRT1 - протеиндеацетилаза Sirtuinl GT I - геранилтрансфераза I ТОФК- 5-тетрадецилокси-2-фуроевая кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск фармакологических веществ для терапии нейрофиброматоза II типа»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень её разработанности

Нейрофиброматоз второго типа (НФ II) - аутосомно-доминантное наследственное заболевание, характеризующееся образованием множественных доброкачественных опухолей, преимущественно шванном и менингиом, локализующихся в центральной нервной системе и по ходу периферических нервов [1]. Несмотря на доброкачественную природу новообразований, заболевание часто приводит к летальному исходу вследствие формирования внутричерепных неоперабельных опухолей, нарушающих функции мозга. Медикаментозного лечения этой болезни не существует, более того, пациенты вынуждены подвергаться многократным хирургическим вмешательствам по удалению опухолей, что рано или поздно приводит к глухоте и слепоте.

Развитие заболевания связано с повреждением гена №2 [1,2]. С мутациями в этом гене связано как образование спорадических шванном и менингиом по всему телу, так и развитие опухолей, на первый взгляд не связанных с нейрофиброматозом, например, злокачественных мезотелиом.

ИГ2 проявляет себя как онкосупрессор, для его инактивации необходимо выключение обоих аллелей. Это предположение было сделано после того, как исследования показали, что пациенты с нейрофиброматозом II гетерозиготны по а в клетках опухолей, развивающихся у этих пациентов, обнаруживается биаллельное выключение А^Р2 [3].

Продукт гена АФ2 - мерлин - гомологичен белкам эзрин-радиксин-моэзинового семейства, отвечающим за взаимодействие компонентов цитоскелета и клеточной мембраны [4]. Доказано, что мерлин взаимодействует с белками клеточной поверхности, белками, отвечающими за динамику цитоскелета, и белками, участвующими в ионном транспорте. В норме мерлин регулирует как пролиферацию, так и обусловленное актином движение клетки. Клетки, утратившие ген №2, неспособны образовывать стабильные клеточные контакты.

Известно, что клетки, нокаутные по гену NF2, не испытывают контактного торможения клеточного роста, и, напротив, оверэкспрессия мерлина приводит к угнетению пролиферации [5]. Не вполне ясно, каким образом мерлин регулирует клеточный рост, однако недавние исследования показали, что основными его мишенями являются р-21-активируемые киназы (РАК). В норме мерлин ингибирует р-21-активируемые киназы, а его утрата приводит к избыточной активации р-21 -активируемых киназ с последующим запуском сигнальных путей, отвечающих за усиленный клеточный рост. Тем не менее, доподлинно неизвестно, насколько велик вклад активации р-21-активируемых киназ в изменения клеточного роста в NF2'f' клетках.

Мерлин участвует в регуляции множества сигнальных путей, включая активацию малых гуанозинтрифосфатаз (ГТФаз) семейства rat sarcoma-related СЗ botulinum toxin substrate (НАС), взаимодействие с поверхностным антигеном кластера дифференцировки 44 (CD44), белком HRS (HGF-regulated kinase substrate, субстрат киназы, регулируемой гепатоцитарным фактором роста), комплексом MTOR (mammalian target of rapamycin, белок-мишень рапамицина млекопитающих), фактором регуляции натрий-протонного обмена, спектрином ßll и многими другими, однако функции мерлина до сих пор не ясны, а взаимодействия не изучены.

До сих пор не существует фармакотерапии нейрофиброматоза II типа. Пациенты вынуждены подвергаться многократным хирургическим вмешательствам, что снижает качество и продолжительность жизни. Таким образом, поиск лекарственнх веществ (ЛВ) для лечения нейрофиброматоза II типа является чрезвычайно актуальной задачей. Традиционный подход к решению этой задачи заключался в испытании зарегистрированных противоопухолевых препаратов на пациентах с нейрофиброматоза II типа и пока не привел к положительнрым результатам [6, 7]. Мы опробовали качественно иное решение задачи, а именно, провели скрининг коллекции биологически-активных соединений, относящихся к различным классам лекарственных веществ.

Цель исследования

Целью данной работы является поиск кандидатов для фармакотерапии нейрофиброматоза второго типа при помощи химического скрининга. Задачи:

1) Модифицировать имеющуюся клеточную линию с высоким уровнем экспрессии N/2, добиваясь нокаута N/2.

2) Охарактеризовать полученную линию и сравнить ее с исходной - изогенной - линией, используя следующие критерии:

а морфологию Ь кривые роста

с устойчивость клеток к истощению среды ё устойчивость клеток к действию цитотоксических агентов.

3) Сравнить действие некоторых известных биологически активных молекул на изогенные 7у/2-отрицательные и Д//2-положительные линии с целью определения веществ, избирательно действующих на ИГ2'/' клетки с помощью химического скрининга.

а провести скрининг коллекции низкомолекулярных биоактивных соединений (оценить соотношение выживаемости Д//2-отрицательных и 7у/2-положительных клеток в присутствии исследуемых соединений) Ь валидировать результаты скрининга:

• изучить зависимость эффекта отобранных в скрининге соединений от концентрации

• протестировать выбранные соединения на различных N£2-отрицательных линиях

• оценить влияние реэкспрессии белка мерлин в А^/2-отрицательных клетках на эффект исследуемых веществ.

• протестировать фармакологические аналоги веществ, отобранных по результатам скрининга.

4) Определить механизм действия веществ-кандидатов, найденных в результате скрининга.

5) Проверить эффективность отобранных соединений in vivo.

Научная новизна работы

Работа содержит новые данные о селективно токсичных в отношении Nf2-отрицательных клеток J1B. Показана избирательная токсичность ингибитора 3-гидроксиметилглутарил-коА редуктазы ловастатина и ингибитора синтазы жирных кислот церуленина в отношении TV/2-отрицательных клеток и описан механизм селективности действия данных соединений. Работа содержит новые данные о роли активации цитоплазматической фракции малой ГТФазы Racl в запуске клеточной гибели. Ранее были подробно описаны функции мембранной фракции Racl, играющей важную роль в направленном движении клетки. Однако, есть лишь одна статья, демонстрирующая роль активированной Racl в цитоплазме [8]. В данной работе показано, что гиполипидемические препараты группы статинов, вызывая истощение внутриклеточного пула геранил-гераниола, переводят Racl из мембранной фракции в цитоплазматическую, а также, селективно активируют Racl в /V/2-отрицательных клетках, вызывая их гибель. Мы впервые описали синергизм между статинами и ингибитором геранилтрансферазы I.

Работа содержит данные о роли белка мерлин в регуляции метаболизма жирных кислот. Известно, что мерлин является одновременно онкосупрессором и регулятором актинового цитоскелета. Помимо стабилизации клеточных контактов организации актинового цитоскелета, мерлин отвечает за контактное торможение роста. Однако до сих пор не была показана связь белка мерлин с метаболическим сдвигом. Мы впервые показали, что скорость основных метаболических путей существенно повышена в iV/2-отрицательных клетках по сравнению с нормальными. В данной работе выявлены особенности метаболического сдвига в TV/2-отрицательных клетках, и установлено, что благодаря этим особенностям

ингибиторы синтазы жирных кислот, в частности, церуленин, обладают селективностью в отношении /у/2-отрицательных клеток.

Впервые предложены два возможных подхода к лечению НФ II: ингибирование З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы препаратами группы статинов и геранилтрансферазы I золедроновой кислотой; и ингибирование синтазы жирных кислот церуленином.

Теоретическая и практическая значимость диссертации

При отсутствии терапевтических средств для лечения НФ II в настоящее время активно ведется поиск и изучение ферментных каскадов, которые могут быть нарушены в результате утраты мерлина. В данной работе были обнаружены существенные изменения метаболического профиля 7у/2-отрицательных клеток, а также, доказана необходимость нормального геранилирования ГТФазы Яас1 для выживания Л//2-отрицательных клеток. Таким образом, результаты работы позволяют рассматривать ингибиторы геранилтрансферазы I, З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы и синтазы жирных кислот в качестве новых потенциальных фармакологических веществ в лечении НФ II.

Методология и методы исследования

В исследовании применён высокопроизводительный ненаправленный фармакологический скрининг для поиска соединений, обладающих избирательной токсичностью в отношении Л//2-отрицательных клеток. Для установления механизма избирательной цитотоксичности исследуемых соединений применены такие современные методы молекулярной фармакологии, биохимии и молекулярной фармакологии, как модуляция генной экспрессии, количественная полимеразная цепная реакция, ультравысокоэффективная жидкостная хроматография, резонансный перенос энергии флуоресценции. Эффективность исследуемых соединений подтверждена в исследованиях на

ксенографтной модели нейрофиброматоза II типа на самках бестимусных мышей

{пи/пи).

Основные положения, выносимые на защиту

1) Получена клеточная линия мышиных эмбриональных фибробластов, нокаутных по гену N/2, моделирующая нейрофиброматоз II типа.

2) Фармакологический скрининг, проведённый на полученной клеточной линии, выявил два соединения: ингибитор З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин, проявляющие избирательную цитотоксичность в отношении N/2-отрицательных клеток. Дальнейшие исследования показали, что фармакологические аналоги обнаруженных соединений: гиполипидемические препараты группы статинов и ингибиторы синтазы жирных кислот, а также ингибитор геранилтрансфераз золедроновая кислота также обладают избирательной цитотоксичностью в отношении 7у/2-отрицательных клеток.

3) Механизм избирательной цитото'ксичности ингибиторов З-гидрокси-З-метилглутарил-коА и геранилтрансфераз связан с истощением внутриклеточного пула геранилгераниола, что приводит к отсоединению от клеточной мембраны малой ГТФазы Яас1. Под действием статинов Яас1 транслоцируется в ядро, где в Д//2-отрицательных клетках активируется и вызывает клеточную гибель.

4) Механизм избирательной цитотоксичности ингибиторов синтазы жирных кислот связан с более высоким уровнем метаболизма жирных кислот в N/2-отрицательных клетках по сравнению с нормальными клетками.

5) Исследованные соединения (ловастатин, симвастатин, золедроновая кислота и церуленин) замедляли рост шванном у бестимусных мышей в ксенографтной модели нейрофиброматоза II типа.

Степень достоверности и апробация результатов диссертационной работы

Высокий уровень достоверности результатов работы подтверждается достаточным объемом экспериментальных данных, наличием необходимых контролей, использованием высокотехнологичного оборудования, адекватных современных методов и критериев статистической обработки данных. Результаты работы были представлены в виде устных и стендовых докладов на международных конференциях: "Cell Symposia: Systems Approach to Metabolic Diseases" (Чикаго, США, 2014), "The NF Conference 2013", (Монтеррей Бэй, США, 2013), "18th Annual Postdoctoral and Graduate Student Conference" (Филадельфия, США, 2013), "The NF Conference 2011" (Джексон Хол, США 2011), "17th Annual Postdoctoral and Graduate Student Conference" (Филадельфия, США, 2011).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие представления о нейрофиброматозе II типа

Нейрофиброматоз второго типа (НФН) - аутосомно-доминантное наследственное заболевание, характеризующееся образованием множественных доброкачественных опухолей, преимущественно шванном и менингиом, локализующихся в центральной нервной системе и по ходу периферических нервов. Заболевание встречается с частотой примерно 1 на 33 - 40 тысяч [1]. НФН развивается при возникновении инактивирующих мутаций в онкосупрессорном гене А[5]. Клинически заболевание проявляется формированием опухолей центральной нервной системы (ЦНС): вестибулярных шванном, внутричерепных менингиом, опухолей спинного мозга и его оболочек, эпендимом, глиом; и опухолей периферической нервной системы (ПНС) (рис. 1 - 3) [2, 9].

НФ II не обязательно сопровождается образованием фибром. Нейрофибромы скорее характерны для нейрофиброматоза 1 типа, при котором им обязательно сопутствуют пятна цвета кофе с молоком. При НФ II пятна «кофе-с-молоком» встречаются у 2% пациентов, что необходимо учитывать при диагностике.

Рисунок 1 «Фибромы при НФ II»

Рисунок 2 «Множественные менингиомы при НФII»

Образование множественных

менингиом (обозначены красными

стрелками) типично для пациентов с НФ II. У 60% пациентов с НФ II обнаруживается хотя бы одна менингиома.

Рисунок 3 «Двусторонняя вестибулярная шваннома»

Шванномы VIII пары черепно-мозговых нервов обозначены красными стрелками. Белой стрелкой обозначена менингиома. Симметричное образование шванном на обоих нервах VIII пары является патогномоничным признаком НФ II.

Заболевание также всегда сопровождается аномалиями развития хрусталика [1, 10, 11], и сетчатки [10]. Патогномоничным признаком нейрофиброматоза II является развитие двусторонней вестибулярной шванномы (ВШ) - опухоли, растущей из шванновой оболочки черепных нервов VIII пары — причём билатеральную ВШ обнаруживают у 85% пациентов с НФ II [11-13]. Увеличение опухоли приводит к развитию сенситивной атаксии и глухоты. Односторонняя ВШ встречается у 5% пациентов [12]. У 60% пациентов обнаруживают как минимум одну внутричерепную или спинальную менингиому [14]. Эпендимомы обнаруживают в 5% случаев НФ II [12-15]. У 2% пациентов обнаруживают пигментацию по типу пятен цвета «кофе с молоком» - характерный симптом нейрофиброматоза I типа (болезни Реклингаузена), что вносит путаницу при постановке диагноза [12-15]. Несмотря на доброкачественную природу новообразований, заболевание часто приводит к летальному исходу вследствие

формирования внутричерепных неоперабельных опухолей, нарушающих функции мозга. Медикаментозного лечения этой болезни не существует, более того, пациенты вынуждены подвергаться многократным хирургическим вмешательствам по удалению опухолей, что рано или поздно приводит к глухоте и слепоте.

Причины развития НФ II. NF2 - «нетипичный» онкосупрессор

Развитие заболевания связано с повреждением гена NF2 [1, 2]. Мутации в этом гене вызывают как образование спорадических шванном и менингиом по всему телу, так и развитие опухолей, на первый взгляд не связанных с нейрофиброматозом, например, злокачественных мезотелиом.

Медицинские генетики относят НФ II к заболеваниям, наследуемым аутосомно-доминантным путем [1, 11]. Действительно, пациенты с НФ II гетерозиготны по гену NF2 и получают мутантный аллель от одного из родителей [16], однако для развития заболевания необходимо инактивирующее повреждение второго - нормального - аллеля, что соответствует механизму двухступенчатой инактивации Кнудсона [17]. Гомозиготы по мутантному NF2 погибают на доэмбриональной стадии развития до начала гаструляции [16, 18].

Высокий уровень экспрессии NF2 наблюдается в эмбриональном периоде; во взрослых организмах ген активен в шванновских клетках, клетках оболочек мозга, эпендимоцитах и эпителиоцитах хрусталика [19]. В спорадических шванномах и менингиомах в большинстве случаев обнаруживаются мутации в гене NF2 [20, 21], что доказывает, что инактивация этого гена ведет к неопластическому перерождению шванновских и лептоменингеальных клеток in vivo. Исследования позволяют предположить, что онкосупрессорная функция NF2 очень значительна: в 1999 г. Cheng et al. показал, что большая часть мезотелиом, вызванных асбестовой пылью, несут мутации в гене NF2 [3], также Fleury-Feith et al., 2003, показал, что у мышей, гетерозиготных по Nf2, при воздействии асбеста возникают злокачественные мезотелиомы, характеризующиеся потерей

гетерозиготности [22]. Более того, мутации или утрата NF2 наблюдаются в некоторых случаях меланомы, тироидной карциномы, гепатоцелюллярной карциномы и опухолей влагалищ периферических нервов [2, 23-25]. Мыши, гетерозиготные по Nf2, склонны к образованию остеосарком, фибросарком и гепатоцелюллярных карцином [12]. И наоборот, восстановление экспрессии Nf2 в опухолевых клетках тормозит или даже останавливает развитие опухоли [26]. Оверэкспрессия данного гена в нормальных клетках приводит к остановке клеточного цикла в Gi фазе [26].

Определение генетического дефекта, вызывающего развитие НФ II, неожиданно показало, что онкосупрессором в данном случае является белок-компонент цитоскелета [4, 27]. До этого момента были известны «классические» онкосупрессоры, как, например, р53 и ретинобластомный белок Rb, -находящиеся в ядре и непосредственно контролирующие клеточный цикл [28]. Также, был описан ген NF1, негативно регулирующий промитотический сигнальный путь от RAS (rat sarcoma, онкогена крысиной саркомы) [28]. Однако продукт гена NF2, мерлин, или шванномин, как оказалось, не имеет каталитических или ДНК-связывающих участков, но обнаруживает существенную гомологию с белками моэзин-эзрин-радиксинового семейства [16].

Продукт гена NF2 - белок мерлин.

Мерлин, или шванномин, - новый представитель семейства

Эзрин/Радиксин/Моэзин

Белки этого семейства обеспечивают взаимодействие компонентов актинового цитоскелета с цитоплазматической мембраной. До открытия мерлина считалось, что семейство образовано тремя отчетливо сходными (по сиквенсу) белками, которые впервые были выделены и затем исследованы Bretscher et al. в 1983-89 [29]. Эзрин (цитовиллин или р81) впервые выделили из микроворсинок

энтероцитов тонкого кишечника; в этих клетках он играет роль линкера между плазматической мембраной и актиновыми филаментами. Радиксин актиномодулирующий белок, впервые выделенный из фракции межклеточных контактов (присутствует в опоясывающих десмосомах [30], а также десмосомах, присутствующих в кольце деления клеток животных). Моэзин - с одной стороны выявляется в филоподиях, а с другой - будучи встроенным в плазматическую мембрану выполняет функции одного из рецепторов гепараната, т.е. является гепарин-связывающим белком.

У белков этого семейства наиболее консервативным является ЫН2-концевой участок; степень гомологии - приблизительно 80% (рис. 4).

Рисунок 4 «Гомология белков эзрин-радиксин-моэзинового семейства»

ГЕЙМ домен

Эзрин

пролиновый Актин/ЕЕКМ-(Х-спираль регион связывающий

домен

Радиксин

86%

62%

Моэзин

86%

60%

Мерлин

62%

25%

ЕЕКМ-связываюший домен

В связи с очень высокой степенью гомологии этих белков их идентификация в клетке с помощью иммуноцитохимических методов была затруднена, однако в последнее время удалось надежно показать, что каждый из этих белков имеет в клетке вполне определенную локализацию, а также и то, что они все выступают как интегральные мембранные белки и играют существенную роль в ассоциации между актиновыми филаментами и плазматической

мембраной. Кроме того, они играют определенную роль во взаимодействиях "клетка-клетка" и участвуют в структуризации сайтов адгезии.

Продукт гена - мерлин - стал четвертым членом эзрин-радиксин-моэзинового семейства, предположительно, отвечающим за взаимодействие компонентов цитоскелета и клеточной мембраны. Как и другие белки этого семейства, он содержит высоко консервативный >1-концевой ЕЕЫМ-домен, за которым следует суперспирализованный участок [4, 27]. У мерлина, в отличие от других представителей ЕЯМ-семейства, на С-конце нет актин-связывающей последовательности [16]. Предположительно, белки ЕИМ-семейства существуют в двух конформациях: закрытой (неактивной) и открытой, обеспечивающей взаимодействие определенных плазматических рецепторов с актиновым цитоскелетом и регулирующей сигнализацию ЯНО-ГТФаз [16, 29, 31]. Фосфорилирование высококонсервативных сериновых остатков на С-конце и связывание фосфатидилинозитол(4,5)-бифосфата с РЕКМ-доменом нарушают внутримолекулярные взаимодействия и переводят белки ЕЯМ-семейства из закрытой конформации в открытую [29]. Однако мерлин, находясь в открытой, фосфорилированной, конформации, способен образовывать гетеродимеры с другими членами семейства, а его закрытая форма участвует в подавлении пролиферации и, следовательно, должна считаться активной. Таким образом, мерлин ведет себя противоположно другим членам ЕЯМ-семейства [32]. Активация мерлина связана с дефосфорилированием серина 8ег518 на С-конце молекулы [16]. Повышение уровня дефосфорилированного мерлина наблюдается в клетках, испытывающих контактное торможение роста, при откреплении клеток от субстрата, в отсутствие факторов роста или при контакте клеток с гиалуроновой кислотой [33, 34], что доказывает, что мерлин собирает сигналы от множества различных ингибиторов роста.

Регуляция активности белка мерлин

Как уже было сказано выше, ключевым в регуляции активности мерлина является серин Ser518. Его фосфорилирование вызывает резкое увеличение подвижности молекулы и переход закрытой конформации в открытую [35-38], что подавляет супрессорную функцию мерлина [34]. Наиболее изучено фосфорилирование мерлина под влиянием малой ГТФазы Racl [36]. Посредником Rac-обусловленного фосфорилирования мерлина являются эффекторы Rac - р21 -активируемые киназы (Рак) - семейство серин-треониновых киназ, активируемых членом семейства малых ГТФаз - белком р21 [35, 37]

Существует также Рак-независимый путь фосфорилирования мерлина под влиянием протеинкиназы А (ПКА) [39]. Однако практически ничего не известно о фосфорилировании мерлина по другим аминокислотным остаткам. На N-конце молекулы инактивацию мерлина осуществляет фосфатидилинозитолбифосфат (pip2), который связывается с высококонсервативными Р1Р2-связывающими сайтами [40].

Наиболее изученным активирующим воздействием на мерлин является его взаимодействие с миозин-фосфатазой MYPT1-PP15 [41], которая способна дефосфорилировать Ser518 мерлина, тем самым вызывая его переход в активную закрытую конформацию. Миозин-фосфатаза MYPT1-PP15 состоит из двух субъединиц: посадочной MYPT1, которая связывается с ближней к N-концу частью суперспирали мерлина, и киназной РР15 [16]. В 2007 г. Ahronowitz et al. показал, что миссенс-мутация NF2, обнаруживаемая в клетках спорадических менингиом (L339F) препятствует связыванию MYPT1-PP15 с мерлином, что, возможно, свидетельствует о необходимости этого взаимодействия для онкосупрессорной активности мерлина[17]. Это предположение подтверждается и тем фактом, что CPI-17, малый белок (17 kDa) - ингибитор фосфатаз, регулируемый протеинкиназой С, вызывает неопластическую трансформацию клеток in vitro в результате инактивации мерлина [41]. Повышение уровня CPI-17 в клетках панкреокарциномы и меланомы увеличивает способность этих клеток к

опухолеобразованию in vivo [16]. Индуцированная экспрессия мерлина в мышиных эмбриональных фиброб ластах NIH3T3 ингибирует мерлин и активирует промитотический сигнальный путь RAS-ERK, в результате чего такие клетки приобретают способность расти в полужидком агаре и образовывать опухоли при подсадке бестимусным мышам [16]. Подобный же эффект оказывает аномальная активация РАК [16] - серин-треониновых неспецифических киназ, участвующих в организации актинового цитоскелета, и регулируемых белком р21 - представителем суперсемейства малых ГТФаз. Мутантная форма РАК с постоянной активностью нарушает контактное торможение роста в нормальных эндотелиальных клетках, поскольку фосфорилирует и, следовательно, ингибирует мерлин [42]. Также РАК способны фосфорилировать CPI-17 in vitro [43]. Если этот механизм работает in vivo, то РАК способны ингибировать MYPT1, а следовательно, и инактивировать мерлин.

Функции и локализация белка мерлин, взаимодействия с другими белками

Визуализация мерлина представляет определенные трудности в связи с низким уровнем эндогенного белка в большинстве клеток. Однако функции белка тесно связаны с его локализацией в клетке, поэтому многие исследователи предприняли попытки описать распределение экзогенного, оверэкспрессированного мерлина, несмотря на то, что такой подход может не вполне точно отражать реальную картину. Тем не менее, эти работы подтвердили гипотетические представления о мерлине как о белке, связывающем актиновый цитоскелет и клеточную мембрану. Мерлин скапливается в области плотных контактов, где он колокализован с моэзином [29]. В культуре клеток млекопитающих эндогенный и экзогенный мерлин сконцентрирован в участках клетки с наибольшей плотностью актиновых структур, как, например, складчатость мембраны или опоясывающие десмосомы [5, 31, 44] Известно, что клетки, утратившие ген NF2, перестают испытывать контактное торможение роста [5], что согласуется с локализацией мерлина в области плотных контактов и

подтверждает его участие в контроле пролиферации и контактном торможении роста. Снижение экспрессии ИП ведет к возникновению дефектных кадгерин-опосредованных клеточных контактов [5]. Все эти исследования подтверждают взаимодействие мерлина с актиновым цитоскелетом, несмотря на отсутствие у этого белка актин-связывающего участка на С-конце. Действительно, в 2001 г. было показано, что актин связывается с Ы-концевым доменом мерлина [45, 46]. Также взаимодействие мерлина с актиновым цитоскелетом может осуществляться с помощью промежуточных белков - спектрина, паксиллина или белков Е11М-семейства [47-51]. Еще одним доказательством служат существенные изменения кортикального актинового скелета в шванновских клетках и кератиноцитах, дефектных по №2 [5, 52]. Значительные дефекты актинового цитоскелета наблюдаются в клетках всех опухолей, возникающих при НФ II [53].

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Степанова, Дина Сергеевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Была разработана клеточная система для исследования гена Nf2 in vitro и выполнен химический скрининг с использованием этой системы. Из девяти соединений-кандидатов, отобранных по результатам скрининга, два: ингибитор 3-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин - успешно прошли валидацию и были отобраны для последующих испытаний.

Было доказано, что ингибирование З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазы вызывает истощение внутриклеточного пула геранил-гераниола, что приводит к разъякориванию малой ГТФазы Racl и отсоединению её от клеточной мембраны. Было установлено, что Racl активируется под действием статинов только в TV/2-отрицательных клетках. Было также показано, что активация Racl, не ассоциированной с клеточной мембраной, приводит к клеточной гибели. Ранее подобная роль Racl описана не была. В последующих исследованиях предстоит выяснить механизм Racl-опосредованной клеточной гибели.

Также было доказано, что утрата гена Nf2 приводит к метаболическому сдвигу, заключающемуся в резком повышении скорости синтеза жирных кислот. TV/2-отрицательные клетки зависимы от нормального функционирования синтазы жирных кислот. Данные исследования позволяют предположить, что утрата гена Nf2 приводит к нарушению бета-окисления жирных кислот, что негативно отражается на энергетическом метаболизме этих клеток. Снижение продукции энергии и повышенные энергетические потребности, обусловленные высокой скоростью роста, приводят к резкому повышению синтеза жирных кислот и зависимости от нормального функционирования участвующих в синтезе ферментов.

Полученные результаты позволяют предположить обусловленные утратой гена Nf2 глубокие сдвиги во всех метаболических путях. Известно, что для раковых клеток характерна триада метаболических изменений: предпочтение гликолиза перед митохондриальным окислением (эффект Варбурга), повышение

уровня липогенеза и повышение уровня глютаминолиза. В данной работе было подтверждено повышение уровня липогенеза в TV/2-отрицательных клетках. Последующие исследования будут направлены на оценку остальных метаболических путей в этих клетках.

Несмотря на множество открытых вопросов, очевидно, что синтаза жирных кислот, геранилтрансфераза I и З-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктаза представляют собой перспективные мишени для фармакотерапии НФ И. Гиполипидемические препараты группы статинов, воздействующие на 3-гидрокси-З-метилглутарил-коА редуктазу и препарат золедроновой кислоты Зомета, применяющийся для лечения остеопороза и являющийся ингибитором геранилтрансферазы I, являются уже одобренными к применению лекарственными средствами, и, таким образом, для этих препаратов могут быть начаты клинические испытания II и III фазы на пациентах с НФ II. И хотя церуленин и его аналоги пока находится на стадии доклинических испытаний, повышенный интерес к этой группе веществ позволяет надеяться, что вскоре появится эффективное лекарственное средство, блокирующее синтазу жирных кислот, которое можно будет применять для терапии НФ II.

ВЫВОДЫ

1. Получена линия мышиных эмбриональных фибробластов, нокаутных по гену Nf2, моделирующая нейрофиброматоз II типа.

2. Сравнение данной линии с исходной (контрольной) показало, что полученные Д/2-отрицательные клетки отличаются от контрольных по морфологии (имеются признаки дезорганизации актинового цитоскелета, отсутствуют плотные клеточные контакты), большей скоростью роста и устойчивостью к неблагоприятным воздействиям среды.

3. На полученных клеточных линиях проведён скрининг коллекции 486 низкомолекулярных биоактивных соединений, который выявил 9 веществ, обладающих селективностью в отношении антипролиферативного действия на А//2-отрицательные клетки.

• Из отобранных по результатам скрининга 9 соединений-кандидатов 2 - ингибитор З-гидрокси-З-метилглутарил-коА-редуктазы ловастатин и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин - прошли первичную валидацию результатов скрининга, проявив стабильную селективность в отношении различных /V/2-отрицательных клеток. Селективность оказалась также характерна для фармакологических аналогов данных соединений: гиполипидемических препаратов группы статинов и ингибиторов синтазы жирных кислот лютеолина и С75, а реэкспрессия белка мерлин в TV/2-отрицательных клетках приводила к обращению токсичности исследуемых соединений.

4. Установлен механизм действия соединений, выбранных по результатам скрининга:

• Селективная цитотоксичность ловастатина в отношении Nf2-отрицательных клеток обусловлена раъякориванием малой ГТФазы Racl и отсоединением её от клеточной мембраны. Под действием ловастатина Racl транслоцируется в ядро и активируется в NJ2-отрицательных клетках, вызывая клеточную гибель. В ходе

исследований также обнаружена селективная токсичность ингибитора геранилтрансферазы I золедроновой кислоты в отношении Nf2-отрицательных клеток. • Селективная цитотоксичность церуленина обусловлена различиями в уровнях метаболизма жирных кислот в Л//2-отрицательных и нормальных клетках. Показано, что под влиянием церуленина накопление промежуточных продуктов синтеза насыщенных жирных кислот в iV/2-отрицательных клетках происходит интенсивнее в 1,5 -2,5 раза по сравнению с контрольными клетками. Также, уровень экспрессии ферментов, участвующих в липогенезе, в NJ2-отрицательных клетках повышен на 30 - 50% по сравнению с контрольными клетками.

5. Ингибитор З-гидрокси-З-метилглутарил-коА-редуктазы ловастатин, ингибитор геранилтрансферазы I золедроновая кислота и ингибитор синтазы жирных кислот церуленин обладают выраженной противоопухолевой активностью в испытаниях in vivo на мышах с ксенографтной трансплантацией мышиных и крысиных шванном. Все три соединения снижали скорость роста шванном на 80% по сравнению с контрольной группой.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Материалы диссертационной работы по изучению метаболического профиля Л//2-отрицательных опухолевых клеток могут быть использованы в разработке методов фармакотерапии для лечения НФ II. Описанные в данной работе изменения уровней синтеза жирных кислот, характерные для опухолей, ассоциированных с НФ II, позволяют применить новый подход - воздействие на участвующие в данных метаболических путях ферменты - к терапии данного заболевания и могут способствовать дальнейшему изучению приложения ингибиторов синтазы жирных кислот в терапии доброкачественных опухолей нервной системы. Препараты золедроновой кислоты могут быть рекомендованы для дальнейших исследований возможности их использования в качестве противоопухолевых средств для лечения 11ас-зависимых форм рака (метастазирующий рак молочной железы, немелкоклеточный рак лёгкого и др.)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Степанова, Дина Сергеевна, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Evans, D.G., et al., A genetic study of type 2 neurofibromatosis in the United Kingdom. I. Prevalence, mutation rate, fitness, and confirmation of maternal transmission effect on severity. J Med Genet, 1992. 29(12): p. 841-6.

2. Bianchi, A.B., et al., Mutations in transcript isoforms of the neurofibromatosis 2 gene in multiple human tumour types. Nat Genet., 1994 6(2): p. 185-92.

3. Cheng, J.Q., et al., Frequent mutations ofNF2 and allelic loss from chromosome band 22ql2 in malignant mesothelioma: evidence for a two-hit mechanism of NF2 inactivation. Genes Chromosomes Cancer, 1999 24(3): p. 238-42.

4. Rouleau, G.A., et al., Alteration in a new gene encoding a putative membrane-organizing protein causes neuro-fibromatosis type 2. Nature, 1993. 363(6429): p. 515-21.

5. Lallemand, D., et al., NF2 deficiency promotes tumorigenesis and metastasis by destabilizing adherens junctions. Genes Dev, 2003. 17(9): p. 1090-100.

6. Plotkin, S.R., et al., Audiologic and radiographic response of NF2-related vestibular schwannoma to erlotinib therapy. Nat Clin Pract Oncol, 2008 5(8): p. 487-91.

7. Plotkin, S.R., et al., Hearing improvement after bevacizumab in patients with neurofibromatosis type 2. N Engl J Med, 2009. 361(4): p. 358-67.

8. Liang, S.L., H. Liu, and A. Zhou, Lovastatin-induced apoptosis in macrophages through the Racl/Cdc42/JNKpathway. J Immunol, 2006. 177(1): p. 651-6.

9. Мельников, P. A. and B.B. Китаев, Нейрофиброматоз, in Большая медицинская энциклопедия, Б.В. Петровского, Editor. 1981, Советская энциклопедия, р. 310-311.

10. Parry, D.M., et al., Germ-line mutations in the neurofibromatosis 2 gene: correlations with disease severity and retinal abnormalities. Am J Hum Genet, 1996. 59(3): p. 529-39.

11. Baser, M.E., et al., Presymptomatic diagnosis of neurofibromatosis 2 using linked genetic markers, neuroimaging, and ocular examinations. Neurology, 1996. 47(5): p. 1269-77.

12. Ruttledge, M.H. and G.A. Rouleau, Role of the neurofibromatosis type 2 gene in the development of tumors of the nervous system. Neurosurg Focus. 19(5): p. E6.

13. Козлов, A.B., ed. Нейрофиброматоз 2 (НФ2) Хирургия опухолей основания черепа, ed. А.Н. Коновалов. 2004, Можайский полиграфический комбинат. 169-170.

14. Patronas, N.J., et al., Intramedullary and spinal canal tumors in patients with neurofibromatosis 2: MR imaging findings and correlation with genotype. Radiology, 2001. 218(2): p. 434-42.

15. Mautner, V.F., et al., The neuroimaging and clinical spectrum of neurofibromatosis 2. Neurosurgery, 1996. 38(5): p. 880-5; discussion 885-6.

16. Okada, Т., L. You, and F.G. Giancotti, Shedding light on Merlin's wizardry. Trends Cell Biol, 2007. 17(5): p. 222-9.

17. Ahronowitz, I., et al., Mutational spectrum of the NF2 gene: a meta-analysis of 12 years of research and diagnostic laboratory findings. Hum Mutat, 2007. 28(1): p. 1-12.

18. McClatchey, A.I., et al., The Nf2 tumor suppressor gene product is essential for extraembryonic development immediately prior to gastrulation. Genes Dev, 1997. 11(10): p. 1253-65.

19. den Bakker, M.A., et al., Expression of the neurofibromatosis type 2 gene in human tissues. J Histochem Cytochem, 1999. 47(11): p. 1471-80.

20. Kalamarides, et al., Nf2 gene inactivation in arachnoidal cells is rate-limiting for meningioma development in the mouse. Genes Dev. , 2002. 16(9): p. 1060-5.

21. Giovannini, M., et al., Conditional biallelic Nf2 mutation in the mouse promotes manifestations of human neurofibromatosis type 2. Genes Dev, 2000. 14(13): p. 1617-30.

22. Fleury-Feith, J., et al., Hemizygosity of Nf2 is associated with increased susceptibility to asbestos-induced peritoneal tumours. Oncogene. 22(24): p. 3799-805.

23. Lasota, J., et al., The neurofibromatosis type 2 gene is mutated in perineurial cell tumors: a molecular genetic study of eight cases. Am J Pathol. ,2001. 158(4): p. 1223-9.

24. Pineau, P., et al., Homozygous deletion scanning in hepatobiliary tumor cell lines reveals alternative pathways for liver carcinogenesis. Hepatology, 2003. 37(4): p. 852-61.

25. Sheikh, H.A., et al., Molecular genotyping of medullary thyroid carcinoma can predict tumor recurrence. Am J Surg Pathol. , 2004 28(1): p. 101-6.

26. Poulikakos, P.I., et al., Re-expression of the tumor suppressor NF2/merlin inhibits invasiveness in mesothelioma cells and negatively regulates FAK. Oncogene, 2006. 25(44): p. 5960-8.

27. MacCollin, M., et al., DNA diagnosis of neurofibromatosis 2. Altered coding sequence of the merlin tumor suppressor in an extended pedigree. JAMA, 1993. 270(19): p. 2316-20.

28. Sherr, C.J., Principles of tumor suppression. Cell, 2004. 116(2): p. 235-46.

29. Bretscher, A., K. Edwards, and R.G. Fehon, ERM proteins and merlin: integrators at the cell cortex. Nat Rev Mol Cell Biol, 2002 3(8): p. 586-99.

30. Lankes, W.T. and H. Furthmayr, Moesin: a member of the protein 4.1-talin-ezrin family of proteins. Proc Natl Acad Sci USA, 1991. 88(19): p. 8297-301.

31. Gonzalez-Agosti, C., et al., The merlin tumor suppressor localizes preferentially in membrane ruffles. Oncogene, 1996.13(6): p. 1239-47.

32. McClatchey, A.I., Merlin and ERM proteins: unappreciated roles in cancer development? Nat Rev Cancer, 2003. 3(11): p. 877-83.

33. Morrison, H., et al., The NF2 tumor suppressor gene product, merlin, mediates contact inhibition of growth through interactions with CD44. Genes Dev, 2001. 15(8): p. 968-80.

34. Shaw, R.J., A.I. McClatchey, and T. Jacks, Regulation of the neurofibromatosis type 2 tumor suppressor protein, merlin, by adhesion and growth arrest stimuli. J Biol Chem, 1998. 273(13): p. 7757-64.

35. Kissil, J.L., et al., Merlin phosphorylation by p21-activated kinase 2 and effects of phosphorylation on merlin localization. J Biol Chem, 2002. 277(12): p. 103949

36. Shaw, R.J., et al., The Nf2 tumor suppressor, merlin, functions in Rac-dependent signaling. Dev Cell, 2001.1(1): p. 63-72.

37. Xiao, G.H., et al., p21-activated kinase links Rac/Cdc42 signaling to merlin. J Biol Chem, 2002. 277(2): p. 883-6.

38. Rong, R., et al., Serine 518 phosphorylation modulates merlin intramolecular association and binding to critical effectors important for NF2 growth suppression. Oncogene, 2004. 23(52): p. 8447-54.

39. Alfthan, K., et al., Cyclic AMP-dependent protein kinase phosphorylates merlin at serine 518 independently of p21 -activated kinase and promotes merlin-ezrin heterodimerization. J Biol Chem, 2004. 279(18): p. 18559-66.

40. Barret, C., et al., Mutagenesis of the phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP(2)) binding site in the NH(2)-terminal domain of ezrin correlates with its altered cellular distribution. J Cell Biol, 2000. 151(5): p. 1067-80.

41. Jin, H., et al., Tumorigenic transformation by CPI-17 through inhibition of a merlin phosphatase. Nature, 2006. 442(7102): p. 576-9.

42. Okada, T., M. Lopez-Lago, and F.G. Giancotti, Merlin/NF-2 mediates contact inhibition of growth by suppressing recruitment of Rac to the plasma membrane. J Cell Biol, 2005. 171(2): p. 361-71.

43. Takizawa, N., Y. Koga, and M. Ikebe, Phosphorylation of CPI17 and myosin binding subunit of type 1 protein phosphatase by p21 -activated kinase. Biochem Biophys Res Commun, 2002. 297(4): p. 773-8.

44. Maeda, M., et al., Expression level, subcellular distribution and rho-GDI binding affinity of merlin in comparison with Ezrin/Radixin/Moesin proteins. Oncogene, 1999.18(34): p. 4788-97.

45. James, M.F., et al., The neurofibromatosis 2 protein product merlin selectively binds F-actin but not G-actin, and stabilizes the filaments through a lateral association. Biochem J, 2001. 356(Pt2): p. 377-86.

46. Brault, E., et al., Normal membrane localization and actin association of the NF2 tumor suppressor protein are dependent on folding of its N-terminal domain. J Cell Sci, 2001. 114(Pt 10): p. 1901-12.

47. Scoles, D.R., et al., Neurofibromatosis 2 tumour suppressor schwannomin interacts with betall-spectrin. Nat Genet., 1998. 18(4): p. 354-9.

48. Gronholm, M., et al., Homotypic and heterotypic interaction of the neurofibromatosis 2 tumor suppressor protein merlin and the ERMprotein ezrin. J Cell Sci, 1999.112(Pt 6): p. 895-904.

49. Meng, J.J., et al., Interaction between two isoforms of the NF2 tumor suppressor protein, merlin, and between merlin and ezrin, suggests modulation of ERM proteins by merlin. J Neurosci Res, 2000. 62(4): p. 491-502.

50. Nguyen, R., D. Reczek, and A. Bretscher, Hierarchy of merlin and ezrin N- and C-terminal domain interactions in homo- and heterotypic associations and their relationship to binding of scaffolding proteins EBP50 and E3KARP. J Biol Chem, 2001. 276(10): p. 7621-9.

51. Fernandez-Valle, C., et al., Paxillin binds schwannomin and regulates its density-dependent localization and effect on cell morphology. Nat Genet., 2002. 31(4): p. 354-62.

52. Pelton, P.D., et al., Ruffling membrane, stress fiber, cell spreading and proliferation abnormalities in human Schwannoma cells. Oncogene, 1998. 17(17): p. 2195-209.

53. Hirokawa, Y., et al., A clue to the therapy of neurofibromatosis type 2: NF2/merlin is a PAK1 inhibitor. Cancer J, 2004. 10(1): p. 20-6.

54. Johnson, K.C., et al., Cellular transformation by a FERM domain mutant of the Nf2 tumor suppressor gene. Oncogene, 2002. 21(39): p. 5990-7.

55. Hamaratoglu, F., et al., The tumour-suppressor genes NF2/Merlin and Expanded act through Hippo signalling to regulate cell proliferation and apoptosis. Nat Cell Biol, 2006. 8(1): p. 27-36.

56. Maitra, S., et al., The tumor suppressors Merlin and Expanded function cooperatively to modulate receptor endocytosis and signaling. Curr Biol, 2006. 16(7): p. 702-9.

57. Silva, E., et al., The tumor-suppressor gene fat controls tissue growth upstream of expanded in the hippo signaling pathway. Curr Biol, 2006. 16(21): p. 2081-9.

58. Xiao, G.H., J. Chernoff, and J.R. Testa, NF2: the wizardry of merlin. Genes Chromosomes Cancer, 2003. 38(4): p. 389-99.

59. McClatchey, A.I. and M. Giovannini, Membrane organization and tumorigenesis—the NF2 tumor suppressor, Merlin. Genes Dev, 2005. 19(19): p. 2265-77.

60. Bosco, E.E., et al., NF2-deficient cells depend on the Racl-canonical Wnt signaling pathway to promote the loss of contact inhibition of proliferation. Oncogene, 2010. 29(17): p. 2540-9.

61. Manchanda, P.K., et al., Racl is required for Prkar la-mediated Nf2 suppression in Schwann cell tumors. Oncogene, 2013. 32: p. 3491-3499.

62. Qiu, R.G., et al., An essential role for Rac in Ras transformation. Nature, 1995. 374(6521): p. 457-9.

63. Hill, C.S., J. Wynne, and R. Treisman, The Rho family GTPases RhoA, Racl, and CDC42Hs regulate transcriptional activation by SRF. Cell, 1995. 81(7): p. 115970.

64. Khosravi-Far, R., et al., Activation of Racl, RhoA, and mitogen-activated protein kinases is required for Ras transformation. Mol Cell Biol, 1995 15(11): p. 644353.

65. Scott, G.A. and L. Cassidy, Racl mediates dendrite formation in response to melanocyte stimulating hormone and ultraviolet light in a murine melanoma model. J Invest Dermatol, 1998. 111(2): p. 243-50.

66. Pervaiz, S., et al., Activation of the RacGTPase inhibits apoptosis in human tumor cells. Oncogene, 2001. 20(43): p. 6263-8.

67. Hodgson, L., A.J. Henderson, and C. Dong, Melanoma cell migration to type IV collagen requires activation ofNF-kappaB. Oncogene, 2003. 22(1): p. 98-108.

68. Shieh, D.B., et al., Cell motility as a prognostic factor in Stage I nonsmall cell lung carcinoma: the role of gelsolin expression. Cancer, 1999. 85(1): p. 47-57.

69. Soon, L.L., et al., Overexpression of WISP-1 down-regulated motility and invasion of lung cancer cells through inhibition of Rac activation. J Biol Chem, 2003. 278(13): p. 11465-70.

70. Lee, T.K., et al., Significance of the Rac signaling pathway in HCC cell motility: implications for a new therapeutic target. Carcinogenesis, 2005. 26(3): p. 681-7.

71. Liu, J.F., et al., Functional Rac-1 and Nek signaling networks are required for FGF-2-induced DNA synthesis in MCF-7 cells. Oncogene, 1999.18(47): p. 642533.

72. Mira, J.P., et al., Endogenous, hyperactive Rac3 controls proliferation of breast cancer cells by a p21-activated kinase-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000. 97(1): p. 185-9.

73. Keely, P.J., et al., Cdc42 and Racl induce integrin-mediated cell motility and invasiveness through PI(3)K. Nature, 1997. 390(6660): p. 632-6.

74. Scoles, D.R., et al., The neurofibromatosis 2 tumor suppressor protein interacts with hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate. Hum Mol Genet, 2000. 9(11): p. 1567-74.

75. Komada, M., et al., Hrs, a tyrosine kinase substrate with a conserved double zinc finger domain, is localized to the cytoplasmic surface of early endosomes. J Biol Chem, 1997. 272(33): p. 20538-44.

76. Simonsen, A., et al., EEA1 links PI(3)Kfunction to Rab5 regulation of endosome fusion. Nature, 1998. 394(6692): p. 494-8.

77. Shih, S.C., et al., Epsins and Vps27p/Hrs contain ubiquitin-binding domains that function in receptor endocytosis. Nat Cell Biol, 2002. 4(5): p. 389-93.

78. Raiborg, C. and H. Stenmark, Hrs and endocytic sorting of ubiquitinated membrane proteins. Cell Struct Funct, 2002. 27(6): p. 403-8.

79. Lloyd, T.E., et al., Hrs regulates endosome membrane invagination and tyrosine kinase receptor signaling in Drosophila. Cell, 2002. 108(2): p. 261-9.

80. Asao, H., et al., Hrs is associated with STAM, a signal-transducing adaptor molecule. Its suppressive effect on cytokine-induced cell growth. J Biol Chem, 1997. 272(52): p. 32785-91.

81. Takeshita, T., et al., STAM, signal transducing adaptor molecule, is associated with Janus kinases and involved in signaling for cell growth and c-myc induction. Immunity, 1997. 6(4): p. 449-57.

82. Scoles, D.R., et al., Neurofibromatosis 2 (NF2) tumor suppressor schwannomin and its interacting protein HRS regulate STAT signaling. Hum Mol Genet, 2002. 11(25): p. 3179-89.

83. Lopez-Lago, M.A., et al., Loss of the tumor suppressor gene NF2, encoding merlin, constitutively activates integrin-dependent mTORCl signaling. Mol Cell Biol., 2009. 29(15): p. 4235-49.

84. James, M.F., et al., NF2/merlin is a novel negative regulator of mTOR complex I, and activation of mTORCl is associated with meningioma and schwannoma growth. Mol Cell Biol, 2009. 29(15): p. 4250-61.

85. Li, W., et al., Merlin/NF2 suppresses tumorigenesis by inhibiting the E3 ubiquitin ligase CRL4(DCAF1) in the nucleus. Cell, 2010 Feb 19. 140(4): p. 477-90.

86. Lallemand, D., A.L. Saint-Amaux, and M. Giovannini, Tumor-suppression functions of merlin are independent of its role as an organizer of the actin cytoskeleton in Schwann cells. J Cell Sci, 2009 Nov 15. 122(Pt 22): p. 4141-9.

87. Ammoun, S., et al., Dissecting and targeting the growth factor-dependent and growth factor-independent extracellular signal-regulated kinase pathway in human schwannoma. Cancer Res. 68(13): p. 5236-45.

88. Ammoun, S., et al., Nilotinib alone or in combination with selumetinib is a drug candidate for neurofibromatosis type 2. Neuro Oncol, 2011. 13(7): p. 759-66.

89. Ahmad, Z.K., et al., ErbB expression, activation, and inhibition with lapatinib and tyrphostin (AG825) in human vestibular schwannomas. Otol Neurotol, 2011. 32(5): p. 841-7.

90. Giovannini, M., et al., mTORCl inhibition delays growth of neurofibromatosis type 2 schwannoma. Neuro Oncol, 2014. 16(4): p. 493-504.

91. Brooks, C.L. and W. Gu,/>53 regulation by ubiquitin. FEBS Lett, 2011. 585(18): p. 2803-9.

92. John, J., et al., Kinetics of interaction of nucleotides with nucleotide-free H-ras p21. Biochemistry, 1990. 29(25): p. 6058-65.

93. Radu, M., et al., PAK signalling during the development and progression of cancer. Nat Rev Cancer, 2014.14(1): p. 13-25.

94. Bradshaw-Pierce, E.L., et al., Tumor P-Glycoprotein Correlates with Efficacy of PF-3758309 in in vitro and in vivo Models of Colorectal Cancer. Front Pharmacol, 2013. 4:22.

95. Vander Heiden, M.G., L.C. Cantley, and C.B. Thompson, Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science, 2009. 324(5930): p. 1029-33.

96. WARBURG, O., On respiratory impairment in cancer cells. Science, 1956. 124(3215): p. 269-70.

97. Robey, I.F., et al., Regulation of the Warburg effect in early-passage breast cancer cells. Neoplasia, 2008. 10(8): p. 745-56.

98. Zhao, Y., E.B. Butler, and M. Tan, Targeting cellular metabolism to improve cancer therapeutics. Cell Death Dis, 2013. 4: p. e532.

99. Pandey, P.R., et al., Anti-cancer drugs targeting fatty acid synthase (FAS). Recent Pat Anticancer Drug Discov, 2012. 7(2): p. 185-97.

100. Wise, D.R. and C.B. Thompson, Glutamine addiction: a new therapeutic target in cancer. Trends Biochem Sci, 2010. 35(8): p. 427-33.

101. Rossignol, R., et al., Energy substrate modulates mitochondrial structure and oxidative capacity in cancer cells. Cancer Res, 2004. 64(3): p. 985-93.

102. Jordan, V.C. and A.M. Brodie, Development and evolution of therapies targeted to the estrogen receptor for the treatment and prevention of breast cancer. Steroids, 2007. 72(1): p. 7-25.

103. Subbaramaiah, K., et al., EP2 and EP4 receptors regulate aromatase expression in human adipocytes and breast cancer cells. Evidence of a BRCA1 and p300 exchange. J Biol Chem, 2008. 283(6): p. 3433-44.

104. Vecchione, L., et al., Novel investigational drugs for gastric cancer. Expert Opin Investig Drugs, 2009 18(7): p. 945-55.

105. Santin, A.D., et al., Trastuzumab treatment in patients with advanced or recurrent endometrial carcinoma overexpressing HER2/neu. Int J Gynaecol Obstet, 2008. 102(2): p. 128-31.

106. Messersmith, W.A. and D.J. Ahnen, Targeting EGFR in colorectal cancer. N Engl J Med, 2008. 359(17): p. 1834-6.

107. Salloway, S., et al., Two phase 3 trials of bapineuzumab in mild-to-moderate Alzheimer's disease. N Engl J Med, 2014. 370(4): p. 322-33.

108. Vermorken, J.B., et al., Overview of the efficacy of cetuximab in recurrent and/or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck in patients who previously failed platinum-based therapies. Cancer J, 2008. 112(12): p. 2710-9.

109. Maloney, D.G., et al., IDEC-C2B8: results of a phase I multiple-dose trial in patients with relapsed non-Hodgkin's lymphoma. J Clin Oncol, 1997. 15(10): p. 3266-74.

110. Zhao, Y., et al., Overcoming trastuzumab resistance in breast cancer by targeting dysregulatedglucose metabolism. Cancer Res, 2011. 71(13): p. 4585-97.

111. Zhou, M., et al., Warburg effect in chemosensitivity: targeting lactate dehydrogenase-A re-sensitizes taxol-resistant cancer cells to taxol. Mol Cancer, 2010. 9:33.

112. Wang, J.B., et al., Targeting mitochondrial glutaminase activity inhibits oncogenic transformation. Cancer Cell, 2010. 18(3): p. 207-19.

113. Conzen, S.D. and C.N. Cole, The three transforming regions of SV40 T antigen are required for immortalization of primary mouse embryo fibroblasts. Oncogene., 1995 11(11): p. 2295-302.

114. Miiller, C.C., et al., Quantitative genotyping of mouse brain-specific PEX13 gene disruption by real-time PCR. Journal of Neuroscience Methods, 2009. 181(1): p. 73-81.

115. Giovannini, M., et al., Conditional biallelic Nf2 mutation in the mouse promotes manifestations of human neurofibromatosis type 2. Genes Dev, 2000. 14(13): p. 1617-1630.

116. Gilibili, R.R., et al., Development and validation of a highly sensitive LC-MS/MS method for simultaneous quantitation of acetyl-CoA and malonyl-CoA in animal tissues. Biomed Chromatogr, 2011. 25(12): p. 1352-9.

117. Hodgson, L., F. Shen, and K. Hahn, Biosensors for Characterizing the Dynamics of Rho Family GTPases in Living Cells, in Current Protocols in Cell Biology. 2010, John Wiley & Sons, Inc. p. 14.11.1-14.11.26.

118. Conzen, S.D. and C.N. Cole, The three transforming regions of SV40 T antigen are required for immortalization of primary mouse embryo fibroblasts. Oncogene, 1995.11(11): p. 2295-302.

119. Bertrand, R., et al., Induction of a common pathway of apoptosis by staurosporine. Exp Cell Res, 1994. 211(2): p. 314-21.

120. Berghmans, S., et al., tp53 mutant zebrafish develop malignant peripheral nerve sheath tumors. Proc Natl Acad Sci USA, 2005. 102(2): p. 407-12.

121. McClatchey, A.I., et al., Mice heterozygous for a mutation at the Nf2 tumor suppressor locus develop a range of highly metastatic tumors. Genes Dev, 1998. 12(8): p. 1121-33.

122. Somanath, P.R., et al., The role of PAK-I in activation of MAP kinase cascade and oncogenic transformation by Akt. Oncogene, 2009. 28(25): p. 2365-9.

123. Chappell, W.H., et al., Ras/Raf/MEK/ERKandPI3K/PTEN/Akt/mTOR inhibitors: rationale and importance to inhibiting these pathways in human health. Oncotarget, 2011. 2(3): p. 135-64.

124. Kissil, J.L., et al., Merlin, the product of the Nf2 tumor suppressor gene, is an inhibitor of the p21-activated kinase, Pakl. Mol Cell, 2003. 12(4): p. 841-9.

125. !!! INVALID CITATION !!!

126. Mather, J., Animal Cell Culture Methods, in Methods in Cell Biology, J.P. Mather and D. Barnes, Editors. 1998, Elsevier.

127. Prados, M.D., Holland-Frei Cancer Medicine. 5 ed. 2000: BC Decker.

128. Ronnett, G.V., et al., Fatty acid metabolism as a target for obesity treatment. Physiol Behav, 2005 May 19. 85(1): p. 25-35.

129. Loftus, T.M., et al., Reduced food intake and body weight in mice treated with fatty acid synthase inhibitors. Science, 2000. 288(5475): p. 2379-81.

130. Shiragami, R., et al., Enhanced antitumor activity of cerulenin combined with oxaliplatin in human colon cancer cells. Int J Oncol, 2013. 43(2): p. 431-8.

131. Menendez, J.A., et al., Pharmacological inhibition of fatty acid synthase (FAS): a novel therapeutic approach for breast cancer chemoprevention through its ability to suppress Her-2/neu (erbB-2) oncogene-induced malignant transformation. Mol Carcinog., 2004. 41(3): p. 164-78.

132. Swinnen, J.V., et al., Androgens, lipogenesis and prostate cancer. J Steroid Biochem Mol Biol., 2004. 92(4): p. 273-9.

133. Sumi, S., et al., Lovastatin inhibits pancreatic cancer growth regardless of RAS mutation. Pancreas, 1994. 9(5): p. 657-61.

134. Jones, K.D., et al., Lovastatin induces growth inhibition and apoptosis in human malignant glioma cells. Biochem Biophys Res Commun, 1994. 205(3): p. 1681-7.

135. Marcelli, M., et al., Caspase-7 is activated during lovastatin-induced apoptosis of the prostate cancer cell line LNCaP. Cancer Res, 1998. 58(1): p. 76-83.

136. Seeger, H., D. Wallwiener, and A.O. Mueck, Statins can inhibit proliferation of human breast cancer cells in vitro. Exp Clin Endocrinol Diabetes, 2003. 111(1): p. 47-8.

137. Kou, R., J. Sartoretto, and T. Michel, Regulation of Racl by Simvastatin in Endothelial Cells. JBC, 2009. 284(22): p. 14734-14743.

138. Stofega, M.R., et al., Constitutive p21 -activated Kinase (PAK) Activation in Breast Cancer Cells as a Result of Mislocalization of PAK to Focal Adhesions. Mol Biol Cell, 2004.15(6): p. 2965-2977.

139. Simon, A.R., et al., Regulation of STAT3 by direct binding to the Racl GTPase. Science, 2000. 290: p. 144-147.