Защита эндотелиальных клеток сосудов человека от повреждения при ишемии in vitro: Роль белка теплового шока HSP27 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Локтионова, Светлана Анатольевна

• Локтионова, Светлана Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Локтионова, Светлана Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ В ТЕКСТЕ

ДИССЕРТАЦИИ

I.ВВЕДЕНИ Е

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: Белки теплового шока, истощение АТФ и

толерантность к ишемии

1. Белки теплового шока: свойства, функции, регуляция экспрессии.

1.1. Общая характеристика белков теплового шока

1.2. Класс НБРЮО

1.3. Класс НЭРЭО

1.4. Класс НвР70

1.4.1. Краткая характеристика класса НЭР70

1.4.2. Функции НБР70

1.5. Класс НЭРбО

1.6. Семейство малых НБРэ (НЭР27 и альфа-кристаллины)

1.6.1. Краткая характеристика семейства малых НБРв

1.6.2. Фосфорилирование малых НЭРэ

1.6.3. Функции малых НБРэ

1.7. Убиквитин

1.8. Другие представители стресс-белков и шаперонов

1.9. Индукция НЭРэ

2. Истощение АТФ как "протеотоксический" стресс

2.1. Энергетический баланс клетки

2.2. Падение уровня клеточного АТФ как причина ионного дисбаланса при ишемии

2.3. Агрегация и инактивация ферментов

2.4. Дефосфорилирование белков

2.5. Разрушение и реорганизация цитоскелета

2.5.1. Разрушение актиновых микрофиламентов при падении уровня клеточного АТФ

2.5.2. Влияние истощения АТФ на организацию микротрубочек

2.5.3. Влияние истощения АТФ на промежуточные филаменты

2.6. Увеличение коньюгации внутриклеточных белков с убиквитином

2.7. Истощение клеточного АТФ вызывает активацию генов теплового шока

3. Участие НЭРэ в защите клеток от ишемического повреждения

3.1. Участие НЭР70 в защите клеток от ишемического стресса

3.2. Участие малых НБРэ в защите клеток от ишемического стресса

Заключение

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Выделение, культивирование и идентификация в культуре эндотелиальных клеток сосудов человека

1.2. Выделение эндотелиальных клеток

1.3. Культивирование эндотелиальных клеток

1.4. Идентификация эндотелиальных клеток в культуре

2. Имитирующий ишемию метаболический стресс

3. Предобработка клеток

4. Измерение уровня АТФ в клетках

5. Измерение внутриклеточного Са2+

6. Флуоресцентная микроскопия

7,Определение концентрации F-актина в ЭК на спектрофлуориметре

8. Клеточное фракционирование неионным детергентом Тритоном X-100

9. Электрофорез и иммуноблоттинг

10. Анализ изоформного спектра HSP27

11. Статистическая обработка результатов

Материалы

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Архитектура актинового цитоскелета, распределение и статус HSP27 в культивируемых эндотелиальных клетках сосудов человека

2. Блокада энергетического метаболизма как in vitro модель ишемического повреждения эндотелия сосудов человека

3. Изменения морфологии, актинового цитоскелета и статуса HSP27 в ЭК сосудов человека, подвергнутых ишемическому стрессу in

vitro

4. Ранние эффекты теплового шока на HSP27, актин и устойчивость эндотелиальных клеток к ишемии in vitro

5. Индуцированная тепловым шоком "поздняя" толерантность эндотелиальных клеток к ишемии in vitro

6. Ингибиторы протеинфосфатаз защищают эндотелиальные клетки при ишемическом стрессе in vitro

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

VII. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ВСТРЕЧАЮЩИХСЯ В ТЕКСТЕ ДИССЕРТАЦИИ

AT - антитела

ГА -гербимицин А

ГМК - гладкомышечные клетки

ДАБ - диаминобензидин

ИЭФ - изоэлектрическая фокуссировка

ТРИТЦ - тетраметилродаминизотиоцианат

ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

ЭК - эндотелиальные клетки

ЭПР - эндоплазматический ретикулум

BSA - бычий сывороточный альбумин

СССР - карбонилцианид хлорфенилгидразон

DMEM - Dulbecco's modified Eagle medium

ECL - enhanced chemiluminiscence (метод)

HEPES - оксиэтилпиперазинэтансульфокислота

HSE - heat shock element

HSF - heat shock factor

HSPs - белки теплового шока

Ig - иммуноглобулины

MAP киназы - митогенактивируемые протеинкиназы PBS - фосфатный буфер РР - протеинфосфатазы TxRd - техасский красный Ub - убиквитин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Защита эндотелиальных клеток сосудов человека от повреждения при ишемии in vitro: Роль белка теплового шока HSP27»

ВВЕДЕНИЕ

Ишемия - состояние, при котором из-за спазма или тромбоза сосудов кровоснабжение части органа оказывается недостаточным для обеспечения метаболизма, является причиной таких патологий как инфаркт миокарда и инсульт головного мозга. На клеточном уровне ишемия характеризуется падением уровня АТФ в результате угнетения гликолиза и окислительного фосфорилирования, нарушением ионного баланса (ростом концентрации Са2+, Na+, Н+ и падением содержания К+), а также накоплением конечных продуктов метаболизма, что ведет к повреждению и гибели клеток. Известно, что клетки млекопитающих способны адаптироваться к ишемическому состоянию. Предобработка клеток и органов коротким ишемическим стрессом, тепловым шоком [Currie et al., 1988; 1990; 1993; Donnelly, 1992; Yellon, 1992; Marber, 1993], гипоксией [Меерсон и др., 1990] или иммобилизационным стрессом [Меерсон и Малышев, 1993] уменьшает их чувствительность к повреждающему действию последующей ишемии. Таким образом, существует реальная возможность, используя внутренние ресурсы клеток, сохранить их жизнеспособность в течение острого ишемического приступа. В связи с этим особое значение приобретает раскрытие эндогенных механизмов клеточной защиты, использование которых позволило бы разработать методы уменьшения структурных и функциональных повреждений клеток в период недостаточного снабжения органа кровью.

Работы последних лет позволяют предположить, что важную роль в приобретении клетками толерантности к ишемии играют стресс-белки или белки теплового шока (HSPs). В экспериментах на трансгенных мышах установлено, что избыток внутриклеточного HSP70 уменьшает зону инфаркта и обеспечивает восстановление сократительной функции миокарда после ишемии [Marber et al., 1995, Plumier et al., 1995]. Показано, что гиперэкспрессия HSP27 и альфа В-кристаллина [Martin et al., 1997], а также совместная гиперэкспрессия HSP60 и HSP10 [Lau et al., 1997] в трансфицированных крысиных кардиомиоцитах защищает трансфектанты от гибели

при длительном истощении АТФ. Тем не менее, механизм такой обусловленной стресс-белками защиты не ясен.

Объектами модельных исследований, проводимых в этой области, как правило, являются кардиомиоциты, гепатоциты, клетки мозга и некоторые клеточные линии миогенного и опухолевого происхождения. В то же время, мало внимания уделяется эндотелиальным клеткам (ЭК), при этом используется эндотелий животных, а не человека. Тем не менее, именно степень повреждения ЭК может определять выживаемость той или иной ткани после острого ишемического приступа. ЭК кровеносных сосудов образуют монослой, выполняющий физиологическую функцию избирательно проницаемого барьера между кровью и подлежащими тканями. Осуществление этой функции контролируется актиновым цитоскелетом ЭК [Gotiieb et al., 1991; Garcia et al., 1995]. Показано, что разрушение актиновых филаментов ведет к увеличению проницаемости эндотелиального монослоя для макромолекул и клеток крови [Phillips et al., 1989; Watanabe et al., 1991; Molony et al., 1991; Garcia, 1992; Hart et al., 1993], что может приводить к отеку и образованию тромба. Ишемия in vivo вызывает разрушение актинового цитоскелета [Armstrong and Gannote, 1993] и повышает проницаемость эндотелия сосудов и капилляров [Sunnergen and Rovetto, 1987; Svendsen et al., 1991]. Известно также, что истощение клеточного АТФ приводит к фрагментации и агрегации F-актина в культивируемых ЭК [Hinshaw et al., 1988; 1993; Watanabe, 1991; Kühne et al., 1993]. В то же время, было показано, что стресс-белок HSP27 влияет как на полимеризацию актина, так и на его резистентность к различным стрессам, причем эти функции HSP27 определяются его уровнем экспрессии, степенью фосфорилирования и структурной организацией. Мономеры нефосфорилированного HSP27 способны кэпировать актиновые филаменты [Benndorf et al., 1994], а гиперэкспрессия мутантного неспособного фосфорилироваться HSP27 коррелирует с пониженным содержанием F-актина в трансфицированных клетках [Lavoie et al., 1993Ь]. С другой стороны, повышенная экспрессия фосфорилированного HSP27 снижает чувствительность клеток

к повреждающему действию теплового шока [Lavoie et al., 1993а; 1995], окислителей [Huot et al., 1995; 1996] и цитохалазина D [Lavoie et al., 1993a; Guay et al., 1997]. Исходя из этого, а также принимая во внимание, что гиперэкспрессия HSP27 защищает трансфицированные кардиомиоциты от истощения АТФ, мы выдвигаем предположение, что устойчивость клеток к ишемическому стрессу связана с защитой HSP27 актинового цитоскелета.

Целью представляемой работы является исследование роли HSP27 в механизмах защиты ЗК от ишемического повреждения.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать экспериментальную in vitro модель ишемического повреждения ЭК сосудов человека.

2. Показать, как реагирует HSP27 в ЭК на имитирующий ишемию метаболический стресс.

3. Установить связано ли изменение степени фосфорилирования, структурной организации и локализации HSP27 с состоянием актинового цитоскелета в ЭК при экспериментальной ишемии in vitro.

4. Исследовать, как влияет предварительное накопление HSP27 в ЭК на их устойчивость к ишемическому повреждению.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: Белки теплового шока, истощение АТФ и толерантность к ишемии.

1. Белки теплового шока: свойства, функции, регуляция экспрессии.

1.1. Общая характеристика белков теплового шока.

Тепловой шок и такие стрессорные воздействия как ишемия, гипоксия, действие цитотоксических агентов стимулируют экспрессию ряда белков, называемых белками теплового шока (НБРэ) или стресс-белками. Одной из основных функций, выполняемых НЭРэ, является защита белков клетки от денатурации и агрегации (отсюда еще одно их название - молекулярные шапероны). Необходимость в шаперонах обусловлена существованием в клетке ряда факторов, способных приводить к спонтанной агрегации белков. К таким факторам относятся экстремально высокая концентрация белка (100-150 мг/мл) в цитозоле и компартментах, присутствие на рибосомах незавершенных полипептидных цепей, наличие у многих белков гидрофобных доменов. При повышении температуры и других стрессах риск агрегации внутриклеточных белков сильно увеличивается, что вызывает необходимость повышения концентрации НЭРэ. Кроме того, белки теплового шока участвуют в укладке вновь синтезированных полипептидов, контролируют распределение белков в клетке и перенос их через мембраны, деградацию белков, образование олигомерных комплексов и другие процессы. Члены семейства НЭРэ представлены в клетках всех ныне живущих организмов: от бактерий до высших растений и животных. По своему молекулярному весу, структуре и свойствам стресс-белки делятся на несколько классов.

1.2. Класс НБРЮР.

Класс НЭРЮО образован высоко консервативными белками с молекулярной массой 104-110 кДа. Они обнаружены как в прокариотических клетках, так и в клетках эукариот. Все белки данного класса являются АТФ-азами, имеющими два, реже - один АТФ-связывающий домен. Эти белки экспрессируются в ответ на стрессы и

конститутивно [Parsell et al. 1991, 1994а]. По крайней мере, часть представителей этого класса шаперонов участвует в процессах протеолиза поврежденных белков [Parsell and Lindquist, 1994а]. Активность HSP104 и HSP110 функционально связана с активностью HSP70 [Parsell et al., 1994b; Oh et al., 1997]. Гиперэкспрессия HSP110 защищает клетки от повреждения тепловым шоком, поддерживая денатурированные белки в растворимом состоянии до дальнейшего взаимодействия с другими представителями HSP [Parsell and Lindquist, 1994b; Oh et al., 1997].

1.3. Класс HSP90.

Белки класса HSP90 также представлены в прокариотических и в эукариотических клетках. При этом для E.coli показано, что делеция гена HSP90 не имеет драматических последствий [Brandwell, 1988], в то же время, HSP90 необходимы для существования эукариотических клеток [Parsell and Lindquist, 1994а] и их защиты от теплового шока [Bansal et al., 1991]. Это одни из основных цитозольных молекулярных шаперонов эукариот. In vitro HSP90 предотвращают денатурацию и агрегацию белков и ускоряют их переукладку [Wiech et al., 1994]. Белки этого класса взаимодействуют с несколькими протеинкиназами, включая pp60src, с рецепторами стероидных гормонов, факторами транскрипции, актином, тубулином и кальмодулином, выполняя регуляторную функцию [Koyasu et al., 1986; Lindquist and Craig, 1988; Gething and Sambrook,1992; Welch 1992]. В нестрессированных клетках для HSP90 показана также внутриядерная локализация, где они связываются с гистонами и, вероятно участвуют в конденсации хроматина [Csermely et al., 1994; 1997]. При тепловом шоке HSP90 фосфорилируются и накапливаются в ядре [Legagneux et al., 1991; Akner et al., 1992]. HSP90, наряду с HSP70, участвуют в негативной регуляции экспрессии шаперонов, связываясь с heat shock factor (HSF) (см. п.

1.4.), запускающим транскрипцию генов теплового шока [Nadeau et al., 1993]. Снижение уровня HSP90 в клетке приводит к активации HSF1; в свою очередь, последняя может быть подавлена добавлением очищенного HSP90 [Zou et al., 1998].

1.4. Класс HSP70.

1.4.1. Краткая характеристика класса HSP70.

Белки этого класса составляют большую группу молекулярных шаперонов, представленных во всех компартментах и органеллах прокариотических и эукариотических клеток [Lindquist and Craig, 1988; Welch, 1992; McKay et al., 1994]. Все они имеют высоко консервативный N-концевой домен и являются АТФ-азами. В клетках эукариот HSP70 является главным компонентом шаперонного механизма. У человека гены HSP70 локализованы в 1, 5, 6, 11, 14 и, предположительно, в 21 хромосомах [Favaier, 1997]. Они представлены генами HSP70-1 и HSP70-2, кодирующими одинаковые белковые продукты из 641 аминокислоты и геном HSP70-HOM. HSP70-1 и HSP70-2 отличаются З'-концевыми некодирующими сегментами. Все три гена имеют различную регуляцию. HSP70-1 экспрессируется конститутивно на низком уровне, а также в ответ на тепловой шок, HSP70-2 экспрессируется только в ответ на повышение температуры, HSP70-HOM экспрессируется в обоих случаях, но на низком уровне. Для каждого гена показан генный полиморфизм по определенным положениям. Экспрессия того или иного типа гена может быть ответом на определенный стресс, а также показана ее связь с определенными патологиями [Favatier et al., 1997]. В клетках эукариот шапероны данного класса локализованы в цитоплазме, а также в эндоплазматическом ретикулуме (ЭПР), где они представлены глюкозо-регулирующим белком 78 кДа (GRP 78) или BiP [Gething and Sambrook, 1992; Welch, 1992]. BiP осуществляет АТФ-зависимый перенос белков через мембрану эндоплазматического ретикулума и участвует в их сборке в просвете ЭПР [Brodsky and Schekman, 1994; Gething et al., 1994; Rassow et al., 1995а]. Этот белок экспрессируется конститутивно на высоком уровне, при этом его синтез может быть увеличен после теплового шока, гипоксии, отсутствия глюкозы и других стрессов, нарушающих посттрансляционную модификацию секретируемых белков [Gething et al., 1992; 1994]. Митохондриальный гомолог HSP70 - белок с массой 75 кДа кодируется ядерным геном [Bhattacharyya et al., 1995], транспортируется в

митохондрии и локализуется в матриксе последних. Здесь он играет важную роль в переносе и сборке митохондриальных белков [Gething and Sambrook, 1992; Langer and Neupert, 1994].

1.4.2. Функции HSP70.

Важнейшей функцией HSP70 является шаперонинг: связываясь с полипептидами на рибосомах, они контролируют свертывание вновь синтезированных белков [Beckmann et al., 1990; Frydman and Hartl, 1994].

Еще одной важной функцией HSP70 в нестрессированных клетках является транспорт и распределение белков между компартментами: HSP70 облегчает транспорт протеинов через мембраны и ядерные поры, а также участвует в везикулярном цикле, взаимодействуя с клатрином и высвобождая его из окаймленных везикул [DeLuca-Flaherty et al., 1990; Gething and Sambrook, 1992; Welch, 1992]. Транспортная функция HSP70 регулируется АТФ-зависимым способом, т. к. и НЗР70-опосредованное распределение белков и НЗР70-опосредованное раскрытие везикул требует гидролиза АТФ [DeLuca-Flaherty et al., 1990].

Некоторая часть HSP70 соединена с цитоскелетом. Показано, что стресс-белки этого класса связаны с актиновыми микрофиламентами, микротрубочками и промежуточными филаментами [La Thangue, 1984; Nover, 1991]. В Dictiostellium конститутивно экспрессирующийся HSP70 может влиять на актиновую полимеризацию АТФ-зависимым образом [Haus et al., 1993]. Взаимодействие HSP70 с промежуточными филаментами также требует присутствия АТФ [Liao et al., 1995]. Связь белков данного класса с цитоскелетом еще детально не изучена, но предполагают ее участие в механизме резистентности к стрессорным воздействиям [Gudi and Gupta, 1993].

HSP70 являются компонентами протеолитической системы клеток. Показано, что 73 кДа пептидраспознающий белок (ргр 73) участвует в селективном протеолизе коротко живущих белков [Gething and Sambrook, 1992; Dice et al., 1994].

Считают, что HSP70 является одним из самых важных регуляторов механизма клеточного ответа на стресс у эукариот. Конститутивно зкспрессируемый HSP70 ингибирует взаимодействие HSP-транскрипционного фактора (HSF) с ДНК, тем самым контролируя экспрессию целого ряда генов теплового шока [Baler et al., 1992; Mosser et al., 1993]. В многочисленных исследованиях с использованием сверхэкспрессии HSP70, антисмысловой трансформации и микроинъекции антител к HSP70 было показано, что этот стресс-белок может определять термотолерантность эукариотических клеток [Angelidis et al., 1991; Parsell et al., 1993; 1994a; Georgopoulos and Welch, 1993]. Гиперэкспрессия HSP70 in vivo защищает ряд ферментов от инактивации при нагревании. Известно, что предобработка клеток тепловым шоком вызывает накопление HSP70 в ядрах и ядрышках, что, вероятно, может способствовать восстановлению функций ядра после стрессорного воздействия [Laszlo, 1992]. Было также показано, что накопление в ядрах гиперэкспрессированного HSP70 защищает ядерные белки от вызываемой тепловым шоком агрегации [Stege et al., 1994].

1.5. Класс HSP60.

GroEL - представитель класса HSP60 в бактериальных клетках является основной частью шаперонового механизма прокариот. У эукариот HSP60 - основной митохондриальный шаперон. Он является продуктом ядерных генов, синтезируется в цитоплазме, а затем переносится в митохондрии, где участвует в АТФ-зависимой укладке синтезированных здесь белков [Frydman and Hartl, 1994; Langer and Neupert, 1994]. HSP60 абсолютно необходим эукариотическим клеткам для нормального биогенеза митохондрий [Agsteribbe et al., 1993]. Шапероновое действие HSP60 проявляется в кооперации с митохондриальными HSP70 и HSP10 [Frydman and Hartl, 1994; Langerand Neupert, 1994]. In vitro HSP60 предотвращает вызываемую нагреванием агрегацию ряда ферментов и восстанавливает их активность после снижения температуры в присутствии АТФ и HSP10 [Martin et al., 1992].

1.6. Семейство малых HSPs (HSP27 и альфа-кристаллины). 1.6.1. Краткая характеристика семейства малых HSPs.

Малые белки теплового шока/ альфа-кристаллины с молекулярной массой от 15 до 28 кДа характеризуются наличием консервативного СООН-концевого участка, называемого альфа-кристаллиновым доменом, а также сходством вторичной и третичной структуры. Обычно члены этого семейства подразделяются на два субсемейства: 25-28 кДа HSPs (или субсемейство HSP27) и, так называемые, альфа-кристаллины (15-22 Kfla). Представители обоих субсемейств экспрессируются конститутивно во многих эукариотических клетках, в том числе и у млекопитающих [Kabakov and Gabai, 1997]. В отличие от шаперонов других семейств, например HSP70, малые HSPs эукариот обладают низкой гомологией аминокислотных последовательностей [Waters, 1995; Caspers et al., 1995]. Для всех членов семейства малых HSPs характерно присутствие в клетках в виде олигомерных комплексов, включающих до 50 субъединиц и имеющих молекулярую массу 150-800 кДа [Chiesa et al., 1990; Behlke et al., 1991; Lee et al., 1995; Chang et al., 1996]. Недавно описанный A.Suzuki и др. myotonic kines binding protein (MKBP) авторы относят к представителям семейства малых HSPs. Этот белок не индуцируется тепловым шоком, но способен защищать ассоциированную с ним myotonic dystrophy протеин киназу от инактивации при нагревании in vitro [Suzuki et al., 1998].

Уровень экспрессии малых HSPs значительно варьирует в зависимости от типа клетки, стадии ее дифференцировки и пролиферативного статуса, а также стадии развития организма [Bond and Schlesinger, 1987; Bhat and Nagineni, 1989; Pauli et al., 1990; Kato et al., 1991; Kiemenz et al., 1993; Gernold et al., 1993]. В эндотелиальных клетках содержание HSP27 увеличивается в присутствии эстрагенов [Piotrowicz et al., 1995]. Повышение уровня экспрессии малых HSPs осуществляется в ответ на действие теплового шока и других стрессорных воздействий [Arrigo and Landry, 1994; Kontos et al.,

1996]. При этом происходят изменения в степени их фосфорилирования и образовании олигомерных комплексов [Arrigo et al., 1988; Coller et al., 1988; Kato et al., 1994а]. В свою очередь, фосфорилирование и структурная организация малых HSPs определяют их функциональную активность [Lavoie et al., 1993; Benndorf et al., 1994; Arrigo and Landry, 1994].

1.6.2. Фосфорилирование малых HSPs.

Малые HSPs млекопитающих модифицируются посттрансляционным фосфорилированием разных сериновых остатков. HSP27 человека фосфорилируется по 15, 78 и 82 остаткам [Landry et al., 1992; Ehrnsperger and Buchner, 1997a], мышиный HSP25 - no Ser-15 и 86 [Gaestel, 1991]. Бычий альфа А-кристаллин фосфорилируется по Ser-122 остатку, альфа В-кристаллин - по Ser-45 и 59 остаткам [Voorter et al., 1986; Chiesa et al., 1987]. Таким образом, каждый белок может быть представлен рядом изоформ. Например, HSP27 может присутствовать в клетках в виде восьми изоформ: Ser- 15,78,82; Ser- 15Р; Ser- 78Р; Ser- 82P; Ser- 15,78P; Ser- 15,82P, Ser- 78,82P; Ser-15,78,82P. Кроме того, выделяют четыре изоформы белка по степени его фосфорилирования: основную нефосфорилированную а-изоформу и Ь, с, d - моно-, ди- и трифосфорилированные изоформы [Lavoie et al., 1995]. Степень фосфорилирования малых HSPs увеличивается под действием факторов сыворотки, цитокинов, опухолевых промоторов, а также под действием стрессовых состояний: теплового шока, ишемического, окислительного и гидродинамического стрессов [Lee et al., 1992; Arrigo and Landry, 1994; van den IJssel et al., 1998; Kato et al., 1994b; Li et al., 1996; Huot et al.,

1997]. Повышение фосфорилирования малых белков теплового шока может происходить при обработке клеток фактором никроза опухолей (TNF-альфа) [Kaur et al., 1989; Arrigo, 1990; Saklatvala et al., 1991; Guesdon et al., 1994], интерлейкинами (IL): IL-1 [Saklatvala et al., 1991; Guesdon et al., 1994; Ahlers et al. 1994a; Bird et al., 1994; Freshney et al., 1994], IL-3 [Ahlers et al., 1994b], IL-6 [Belka et al., 1995], тромбином [Mendelsohn et

al., 1991; Zhu et al., 1994], гистамином [Santell et al., 1992], брадикинином [Saklatvala et al., 1991], форболовыми эфирами PMA [Welch, 1985; Regazzi et al., 1988; Michishita et al., 1991; Spector et al., 1993; Minowada and Welch, 1995] и TPA [Kasahara et al., 1993], кальциевым ионофором А23187 [Welch, 1985; Crete and Landry, 1990], окадаиковой кислотой [Guy et al., 1992; Kasahara et al., 1993] и др..

Степень фосфорилирования HSP27 влияет на его олигомерную структуру, растворимость и локализацию в клетке [Benndorf et al., 1994; Kato et al., 1994a; Lavoie et al., 1995].

Основными ферментами, непосредственно фосфорилирующими HSP25 и HSP27 являются МАРКАР киназы 2 [Stokoe et al., 1992а; 1992b; Ahlers et al., 1994b; Huot et al., 1995; Ludwig et al., 1996] и 3 [Sithanandam et al., 1996; McLaughlin et al., 1996]. В свою очередь, эти протеинкиназы активируются в результате их фосфорилирования р38 MAP киназой [Rouse et al., 1994; Freshney et al., 1994], являющейся центральным звеном каскада, запускаемого цитокинами [Kyriakis and Avruch, 1996], тепловым шоком [Rouse, 1994], окислительным стрессом [Ehrnsperger et al., 1997b] и ишемическим прекондиционированием [Maulik et al., 1996], и активирующейся киназами МККЗ и МКК6 [Raingeaud et al., 1996].

Степень модификации малых HSPs могут также регулировать протеинфосфатазы. Показано дефосфорилирование HSP27 in vivo протеинфосфатазой 2А (РР2А) [Cairns et al., 1994]. Активность РР2А, в свою очередь, также регулируется фосфорилированием [Chen et al., 1992; Guo et al., 1993a; 1993b]: она инактивируется при фосфорилировании тирозинкиназой [Chen et al., 1992]. Связывание цитокинов TNF-альфа и IL-1 с рецепторами приводит к инактивации протеинфосфатаз 1 и 2А [Guy et al., 1992; 1993; 1995; Menon et al., 1993]. Кроме того, PP2A может также косвенным образом влиять на фосфорилирование малых HSPs через инактивацию МАРКАР киназы 2 [Stokoe et al., 1992а; 1992Ь]. В тоже время, in vitro дефосфорилирование мышиного HSP25 может

осуществляться кадльцинейрином (кальций-зависимой фосфатазой 2В) [Gaestel et al., 1992].

1.6.3. Функции малых HSPs.

Несмотря на то, что белки этого семейства не являются АТФ-азами, они проявляют шапероновую активность, сохраняя ферменты от тепловой денатурации и агрегации и ускоряя их реактивацию [Jakob et al., 1993; Lee et al., 1997]. In vitro, вероятно, эта функция осуществляется ими в кооперации с другими, АТФ-зависимыми, шаперонами (HSP70) [Ehmsperger and Buchner, 1997а].

Малые HSPs участвуют в приобретении клетками термотолерантности: повышение устойчивости к тепловому шоку показано при накоплении HSP27 человека [Landry et al., 1989; Lavoie et al., 1993a], мышиного HSP25 [Knauf et al., 1993], альфа-A- и альфа-B кристаллинов [Aoyama et al., 1993; van den IJssel et al., 1994]. Гиперэкспрессия этих белков может также коррелировать с резистентностью к окислительному [Mehlen et al., 1995; Huot et al., 1995; 1996] и ишемическому стрессам [Martin et al., 1997], цитотоксическому действию цитохалазина D [Lavoie et al., 1993b; 1995], TNF-альфа [Mehlen et al., 1995] и некоторых антираковых препаратов [Oesterreich et al., 1993].

Известно, что малые HSPs участвуют в регуляции структуры и динамики актинового цитоскелета. В нестрессированных клетках млекопитающих HSP27 могут кэпировать "оперенный" конец филаментов, ингибируя актиновую полимеризацию [Miron, 1988; 1991]. Показано также, что в активированных форболовым эфиром эндотелиальных клетках аорты быка ассоциированный с мембраной HSP27 участвует в регуляции кортикального F-актина [Piotrowicz and Levin, 1997].

В то же время, повышенная экспрессия малых HSPs защищает микрофиламенты от разрушающего действия теплового шока [Lavoie et al., 1993; 1995], окислительного стресса [Huot et al., 1995; 1996] и действия цитохалазина D [Lavoie et al., 1995]. В отличие от шаперонной активности, влияние белков данного семейства на архитектуру

цитоскелета зависит от степени их фосфорилирования. Так фосфорилирование HSP27 через активацию р38 MAP киназы приводит к усиленной полимеризации актина и повышению его устойчивости к действию цитохалазина D [Guay et al., 1997]. С другой стороны, высокий уровень экспрессии нефосфорилируемого мутантного HSP27 не защищает микрофиламенты от разрушения при действии цитохалазина D и окислителей [Lavoie et al., 1995; Huot et al., 1996]. Структурная организация малых HSP также влияет на актиновую полимеризацию: ингибирующую активность проявляют нефосфорилированные мономеры HSP25, а нефосфорилированные мультимерные комплексы и фосфорилированные мономеры такой активностью не обладают [Benndorf et al., 1994]. Показана также способность HSP27 инкрустировать микрофиламенты в активированных форболовым эфиром (РМА) тромбоцитах [Zhu et al., 1994] и альфа-В-кристаллина в кардиомиоцитах при различных состояниях [Bennardini et al., 1992; Barbato et al., 1996]. Каков механизм этого процесса и какова его роль остается невыясненным. Для альфа-В-кристаллина показана также ассоциация с другим белком цитоскелета - десм и ном при ацидозе [Bennardini et al., 1992; Barbato et al., 1996].

Представители семейства вовлечены в различные патологические процессы, в частности, в процессы канцерогенеза [Ciocca et al., 1993; 1998; Gandour et al., 1998] и кардиопатологии [Knowlton et al., 1998] человека. Показано участие HSP27 в клеточной дифференцировке [Minowada and Welch, 1995; Mehlen et al., 1997a] и регуляции апоптоза [Mehlen et al. 1996, 1997а]. Выдвигается предположение, что HSP27 является "переключателем" между путями дифференцировки и апоптоза [Mehlen et al., 1997а], однако механизм этого процесса пока не ясен.

2.7. Убиквитин.

Убиквитин (Ub) - высоко консервативный белок с молекулярным весом примерно 8 кДа. Он экспрессируется конститутивно, и его синтез увеличивается после теплового шока [Parsell and Lindquist, 1994а; Welch, 1992]. Ub является частью протеолитической

системы эукариот, альтернативной лизосомальной системе. Молекулы Ub ковалентно связываются с белком перед его деградацией в протеосомах (протеазных комплексах 26S). Уровень Ub-белковых коньюгатов коррелирует с повреждением белков в клетках, подвергшихся тепловому шоку [Parag et al., 1987]. Ub играет важную роль при протеотоксических стрессах, связываясь с необратимо поврежденными белками и обусловливая их быструю деградацию в протеосомах [Parsell and Lindquist, 1994а].

2.8. Другие представители стресс-белков и шаперонов.

Наряду с представителями основных классов HSPs известен ряд белков, способных экспрессироваться в ответ на тепловой шок и другие стрессорные воздействия. К ним относится гемиоксигеназа или HSP32, индуцируемая нагреванием и окислительным стрессом во многих линиях клеток. Этот стресс-белок совместно с ферритином участвует в антиокислительной защите клеток [Vile et al., 1994]. Уровень коллаген-связывающего белка с массой 47 кДа (HSP47), представленного в продуцирующих матрикс клетках млекопитающих также увеличивается после теплового шока. HSP47, очевидно, участвует в процессинге проколлагена и формировании коллагеновых триплетов [Nakai et al., 1992]. Циклофилины или иммунофилины, пептидилпролилцис-транс изомеразы с молекулярной массой 56 и 20 кДа [Gething and Sambrook, 1992], участвуют в свертывании белков совместно с другими представителями HSPs [Rassow et al., 1995b], Стресс-белки HSP40 (DnaJ) и HSP10 (Gro ES) участвуют в шаперонинге белков совместно с HSP70 и HSP60, регулируя их АТФ-азную активность и взаимодействие с субстратом [Frydman and Hartl, 1994; Georgopoulos and Welch, 1993; Rassow et al., 1995b; Michels et al., 1997].

2.9. Индукция HSPs.

F. Ritossa в 1962 году впервые показал образование новых хромосомных пуффов (т. е. специфическую активность генов) в гигантских хромосомах слюнных желез

Drosophila в ответ на тепловую и химическую обработки [Ritossa, 1962]. Позже было показано, что стресс-белки экспрессируются при других стрессорных воздействиях. Активация транскрипции генов теплового шока опосредуется специфическим белком, известным как heat shock transcription factor (HSF). В нестрессированных клетках млекопитающих HSF присутствует в неактивном состоянии. Различные стрессорные воздействия вызывают активацию HSF и его накопление в ядре, где он связывается со специфической последовательностью ДНК, называемой heat shock element (HSE), что приводит к активации транскрипции генов теплового шока.

Семейство HSF представлено белками с консервативной первичной структурой и различной организацией доменов [Wu et al., 1994; Morimoto et al., 1994]. У Drosophila обнаружен один представитель семейства, в клетках цыпленка - три. У мыши и человека известны два фактора: HSF1 и HSF2. HSF1 активируется in vivo тепловым шоком и многими другими стрессорными воздействиями, в то время как ДНК-связывающая активность HSF2 наблюдается лишь во время эмбрионального развития и в ходе сперматогенеза [Wu et al., 1994; Morimoto et al., 1994]. Обладающий ДНК-связывающей активностью HSF1 представляет собой комплекс из трех мономеров. Он содержит регуляторный домен, который может репрессировать ДНК-связывающие домены. Таким образом, HSF1 имеет, по крайней мере, два уровня регуляции. Активация HSF1 тепловым шоком и другими стрессорными воздействиями включает и олигомеризацию неактивных мономеров, и приобретение специфической ДНК-связывающей активности [Westwood and Wu, 1993; Wu et al., 1994; Morimoto et al., 1994; Fernandes et al., 1994; Larson et al., 1995]. Показано, что стресс-зависимое фосфорилирование HSF по сериновым и треониновым остаткам может также модулировать транскрипционную активность генов теплового шока [Sorger, 1990; Sarge et al., 1993].

В регуляции активности HSF1 принимают участие стресс-белки HSP70 и HSP90. Известно, что высокое количество HSP70 в клетках (достигнутое предварительным нагреванием, трансфекцией или микроинъекцией) значительно подавляет активацию

HSF в ответ на тепловой шок [Baier et al., 1992; Mosser et at., 1993; Mifflin and Cohen, 1994]. HSP70 и HSP90 осуществляют негативную регуляцию транскрипции генов теплового шока, предотвращая связывание HSF с HSE. Предполагают, что при активации HSF протеотоксическими стрессами происходит диссоциация комплекса HSP70/HSP90-HSF, вызванная уменьшением пула свободных шаперонов в результате их связывания с денатурированными и агрегированными белками.

Недостаток HSP90 И

Активированный HSF

HSE

Инакгивированный

HSF t_

\ F HSP90

HSP70

Тепловой шок

HSP70

ген

Избыток

HSP90

Неактивация

при I связывании N с HSP70

IpPe'

HSE 1=

Транскрипция HSP70

Избыток HSP70

Восстановление после теплового шока

Рис. 1. Модель регуляции HSF стресс-белками.

После восстановления от стресса избыток HSP70/HSP90 опять связывается с HSF, что блокирует транскрипцию генов индуцибельных HSPs. Так комплексы HSP70 с активированным HSF1 обнаружены в экстрактах клеток, подвергшихся тепловому шоку [Abravaya et al., 1992; Baler et al., 1992]. В нестрессированных клетках присутствуют комплексы HSP70 и мономерного неактивного HSF1 [Baler et al., 1996]. При этом гиперэкспрессия HSP70 блокирует как активацию (тримеризацию) HSF1, так и диссоциацию гетеродимерного комплекса HSP70/HSF1, что непосредственно доказывает негативную регуляцию HSF1 этим шапероном [Baler et al., 1996] (рис. 1).

2. Истощение клеточного АТФ как "протеотоксический" стресс.

При ишемии в результате спазма, тромбоза или атеросклероза сосудов происходит нарушение кровоснабжения части органа. Прекращение поступления в клетки кислорода и глюкозы влечет за собой подавление синтеза АТФ, что приводит к быстрому снижению его уровня. Такое энергетическое голодание ведет к гибели клеток [Stromski et al., 1986; Weinberg, 1991], причем, уровень снижения АТФ определяет будут гибнуть клетки путем некроза или апоптоза. Так на клетках проксимальной части нефронов мыши показано, что падение АТФ до 15% и ниже от контрольного вызывает некроз, а снижение АТФ в интервале 25-70% - апоптоз клеток [Lieberthal et al., 1998].

Истощение клеточного АТФ на макромолекулярном уровне вызывает типичные эффекты протеотоксического стресса: 1) агрегацию белков, 2) разрушение и реорганизацию цитоскелета, 3) увеличение коньюгатов клеточных белков с убиквитином, 4) активацию генов HSP. Кроме того, происходящее при ишемии нарушение окислительной системы митохондрий приводит впоследствии к образованию свободных радикалов, вызывающих повреждение клеток при реперфузии [Dawson et al., 1993].

2.1. Энергетический баланс клетки.

АТФ является основным источником энергии для биосинтетических процессов клетки, а также для поддержания ее ионного баланса и подвижности. Определенная часть АТФ также расходуется на синтез других, неадениновых, нуклеозидтрифосфатов и креатинфосфата, которые совместно с АТФ образуют в клетке пул макроэргических фосфатов. АТФ синтезируется в результате гликолиза или окислительного фосфорилирования. В клетках млекопитающих преобладает второй, намного более эффективный путь, но в некоторых клетках (например, эритроцитах или клетках опухолей) основное поступление энергии может осуществляться путем гликолиза. Для сохранения энергетического баланса уровень синтеза АТФ в клетке должен соответствовать уровню его потребления, что наблюдается при некоторых физиологических состояниях (например, при сокращении мышечных волокон): при возрастании расхода энергии увеличивается производство АТФ и, таким образом, содержание его в клетке поддерживается на прежнем уровне. Тем не менее, при определенных патологических состояниях, таких как гипоксия, ишемия или гипогликемия, а также при действии ингибиторов окислительного фосфорилирования и гликолиза происходит истощение пула макроэргических фосфатов. Такое энергетическое голодание тормозит жизненные процессы в клетке и со временем приводит к ее гибели. В клетке существует несколько систем, позволяющих до некоторой степени поддерживать уровень АТФ при таких состояниях как гипоксия и ишемия.

Одной из них является креатин-фосфатная буферная система, генерирующая АТФ через креатинкиназную реакцию: КрФ + АДФ — креатин + АТФ. Эта система работает преимущественно в мышечных клетках, содержание КрФ в других тканях незначительно и может обеспечить поддержание исходного уровня АТФ в течение лишь нескольких минут.

Более значительной системой поддержания АТФ при ишемии и аноксии является гликолитическая система. Так некоторые клетки высших организмов при отсутствии окислительного фосфорилирования способны поддерживать необходимый уровень АТФ исключительно за счет гликолиза. Однако, для кардиомиоцитов показано, что КрФ буферная система и гликолиз могут обеспечить сохранение уровня АТФ лишь в течении первых 10 минут гипоксии [Noll et al., 1992]. Сходные результаты получены и для нервных клеток мозга мышей [Ueda et al., 1988].

Еще один путь, используемый клетками для поддержания энергетического баланса при неблагоприятных условиях - регуляторное подавление биосинтеза. Примером может служить инактивация синтеза липидов в гепатоцитах АМФ-активируемой протеинкиназой. Сдвиг соотношения АТФ/АДФ в сторону увеличения АДФ в клетке приводит к увеличению уровня АМФ, образующегося в результате аденилаткиназной реакции: 2 АДФ АМФ + АТФ. Увеличение концентрации АМФ, в свою очередь, ведет к активации АМФ-зависимой киназы, ингибирующей активность ключевых ферментов биосинтеза липидов (ацетил-коэнзим А карбоксилазы и З-гидрокси-З-метилглутарил-коэнзим А редуктазы) [Moore et al., 1991; Corton et al., 1994].

Подавление функционально-метаболической активности также является приспособлением для поддержания уровня АТФ при аноксии и ишемии. В качестве примера может служить уменьшение механической работы сердца при кратковременной ишемии [Bristow et al., 1991].

2.2. Падение уровня клеточного АТФ как причина ионного дисбаланса при ишемии.

В норме почти половина клеточного АТФ используется для работы ион-транспортирующих АТФ-аз, поддерживающих ионные градиенты по обе стороны плазмалеммы и мембран клеточных органелл. Падение уровня АТФ при ишемии неизбежно приводит к ионному дисбалансу между клеткой и внеклеточной средой и между цитоплазмой и органеллами. Так в энергетически-истощенных клетках

наблюдается рост концентрации Са2+, Na+, Н+, и падение содержания К+ [Trump and Berezesky, 1992; Pierce and Czubryt, 1995].

Наблюдаемое при истощении АТФ снижение концентрации К+ и накопление Na+ может быть результатом ингибирования Na+/K+ АТФ-азы [Trump and Berezesky, 1992]. Потеря К+ в АТФ-истощенных клетках может быть также результатом открывания АТФ-чувствительных К+-каналов, обнаруженных в ряде типов клеток (в частности в кардиомиоцитах) [Pierce and Czubryt, 1995]. Эти каналы остаются закрытыми при высоком уровне АТФ и открываются в ответ на его понижение и рост АДФ. Предполагают их участие в защитном механизме ишемического прекондиционирования кардиомиоцитов [Pierce and Czubryt, 1995; Terzic et al., 1995; Strasser et al., 1996]. Открывание этих каналов при действии препаратов никорандила и пинацидила защищает миокард при ишемии. Показано, что подавление Na+/K+ АТФ-азы специфическим ингибитором уабаином не имеет цитотоксического эффекта при нейтральных значениях pH и способно вызывать повреждение клеток при pH = 8.0 [Talbot et al., 1988], что может быть связано с осмотическим стрессом, ассоциированным с повышенным входом Na+ в клетку .

Происходящее при ишемии закисление цитоплазмы клеток может быть обусловлено образованием Н+ благодаря гидролизу АТФ [Gores et al., 1989], а также связано с накоплением лактата в результате активации гликолиза. Показано, что закисление цитоплазмы может активировать ДНК-азу II, приводя к разрывам ДНК и апоптозу [Barry and Estman, 1992; 1993]. Тем не менее, известно, что закисление цитоплазмы может играть защитную роль при аноксии, а также при некоторых других стрессорных воздействиях [Bond et al., 1991]. Истощение АТФ в кардиомиоцитах и гепатоцитах, проводившееся при рН=6.0-6.5 заканчивалось некрозом лишь малой доли клеток, в то время как падение АТФ при рН=7.3-7.4 приводило к гибели кардиомиоцитов и гепатоцитов [Gores et al., 1988; Bond et al., 1993]. Такой "рН-парадокс" при аноксии (ишемии) может быть связан с понижением концентрации неорганического фосфата в

клетках при кислых значениях рН [Marcussen, 1996] и являться результатом ингибирования протонами Ыа+/Н2Р04"-котранспортной системы [Bowen and Levinson, 1982] и/или стимуляции протонами НгРО^/СГ-обменной системы [Marcussen etal., 1994].

Поддержание 5000-10000 концентрационного градиента [Са2+] клеткой необходимо для его работы как вторичного мессенджера при действии гормонов. Выведение Са2+ из цитозоля осуществляется по механизму Na+/Ca2+ -обмена, посредством Са2+ АТФ-азы, а также путем наколления его в митохондриях и ЭПР. Происходящий при ишемии рост внутриклеточного Са2+ может быть обусловлен повышением его входа через плазмалемму, выбросом из деэнергизированных митохондрий и ЭПР, а также нарушением Na+/Ca2+ -обмена и работы Са2+ АТФ-азы. Тем не менее, еще не ясен вклад каждого фактора в нарушение Са2+ баланса при ишемии. Рост внутриклеточного Са2+ способен вызывать серьезные повреждения и гибель клетки, т. к. приводит к активации фосфолипаз, протеаз и нукпеаз [Orrenius et al., 1989]. Высокий уровень Са2+ может разрушать митохондрии, открывая неспецифические поры в их мембранах [Siesjo, 1989] и губительно действовать на цитоскелет (см. п. 2.4).

2.3. Агрегация и инактивация ферментов.

Важнейшим атрибутом протеотоксических стрессов является агрегация белков в клетке. Было показано, что энергетическое истощение усиливает вызываемую тепловым шоком агрегацию ряда энзимов [Martin et al., 1992; Nguyen and Bensaude, 1994]. Позже, образование нерастворимых агрегатов в результате снижения уровня АТФ, в частности, было описано для интерферон-индуцируемой 68кДа dsPHK-зависимой протеинкиназы (р68) в клетках HeLa и трансфицированных в фибробласты мыши сигнальных ферментов: люциферазы Photynus pyralis и бета-галактозидазы E.coli. Образование нерастворимых агрегатов люциферазы в энергетически истощенных клетках при 37° С сопровождалось ее инактивацией [Nguyen and Bensaude, 1994], что сходно с поведением данного фермента при тепловом шоке [Bensaude et al., 1990; 1996].

Обьяснить агрегацию цитозольных энзимов при снижении уровня АТФ тем, что молекулы АТФ-потребляющих ферментов, лишаясь своего субстрата (АТФ), становятся нестабильными и начинают коагрегировать друг с другом, вероятно, нельзя, так как этому предположению противоречит факт, что in vitro в буфере без АТФ люцифераза остается стабильной и сохраняет свою ферментативную активность. Кроме того, бета-галактозидаза, не являясь АТФ-связывающим белком, агрегирует при истощении АТФ, а такие АТФ-потребляющие энзимы как 42 кДа MAP киназа и 100 кДа (2 -5 ) Ап синтетаза остаются в растворенном состоянии при падении АТФ [Nguyen and Bensaude, 1994].

Существует гипотеза, позволяющая объяснить, почему при "энергетическом голодании" in vivo термолабильные ферменты более склонны к агрегации, чем термостабильные, основывающаяся на том, что переход молекулы фермента в "развернутое", как бы денатурированное состояние, может происходить стохастически, без протеотоксического стресса. Показано, что цитозольный шаперон HSP70 непосредственно связывается с денатурировавшими белками и после их ренатурации комплекс HSP70 с белком-субстратом диссоциирует при наличии АТФ и К+ [Palleros et al., 1991; 1993]. Отсюда можно предположить, что в клетках, лишенных АТФ, все случайно развернутые энзимы будут связываться с конститутивно экспрессированным HSP70, но из-за отсутствия АТФ их сворачивание и диссоциация шаперон-ферментных комплексов не будут происходить [Nguyen and Bensaude, 1994]. Такая индуцированная падением АТФ "ловушка" может сдвигать конформационное равновесие термолабильных белков в сторону денатурации, что, в свою очередь, будет способствовать их агрегации. Следовательно, при истощении АТФ конститутивный HSP70 может играть неожиданную роль протеотоксического фактора, опосредующего агрегацию термолабильных белков в клетке. В подтверждение этого предположения можно привести тот факт, что конститутивный HSP70 в энергетически истощенных клетках появляется в Тритон Х-100-нерастворимой фракции одновременно с энзимами люциферазой и вета-галактозидазой. Кроме HSP70 роль "ловушек" для цитозольных белков при истощении

АТФ могут играть такие структуры клеток как цитоскелет, хроматин и ядерный матрикс. Так показано, что происходящее в ишемизированных кардиомиоцитах крыс связывание глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с миофибриллами обусловлено истощением АТФ [Barbato etal., 1996].

Кроме того, АТФ и продукты его гидролиза являются субстратами и эффекторами для многих ферментов, структурных и регуляторных белков, включая АТФ-азы, киназы и фосфатазы, белки цитоскелета. Так истощение АТФ может приводить к инактивации тирозиновых киназ [Braunton et al., 1998]. Увеличение содержания АДФ и АМФ в ишемизированных клетках может вызывать дестабилизацию, как отдельных белковых субъединиц, так и олигомерных комплексов. Накопление неорганического фосфата вследствие истощения АТФ при аноксии/ишемии также является важным повреждающим фактором, приводящим к "пузырению" клеточной мембраны (блэббингу) и гибели клеток [Marcussen, 1996].

2.4. Дефосфорилирование белков.

Истощение АТФ вызывает дефосфорилирование многих клеточных белков (Табл. 1). Например, показано дефосфорилирование 20 «Да белка легких цепей миозина в гладкомышечных клетках (ГМК) легочных артерий при аноксии [Zhao et al., 1996] и в кардиомиоцитах при ишемии [Akiyama et al., 1997]. Дефосфорилирование белков при падении уровня АТФ может быть обусловлено смещением киназно-фосфатазного равновесия в клетке в результате инактивации протеинкиназ при сохранении активности и/или активации протеинфосфатаз. Так на клетках мозга крыс в модели аноксии in vitro показана инактивация тирозиновых протеинкиназ, в то время как активность тирозиновых протеинфосфатаз остается неизменной [Braunton et al., 1998]. С другой стороны, сопровождающий истощение АТФ рост внутриклеточного Са2+ может активировать Са2+/кальмодулин зависимую протеинфосфатазу 2В (кальцинейрин), что также будет вносить вклад в дефосфорилирование клеточных белков.

Таблица 1. Дефосфорилирование клеточных белков при аноксии/ишемии.

Тип клеток Воздействие Белок Ссылка

WEH-7 и WCL2 (из яичника китайского хомячка) истощение АТФ глкжокортикоидные рецепторы Hu etal., 1994

клетки проксимальной части нефронов кроликов аноксия эзрин Chen et al., 1995; Chen and Mandel, 1997

H4IIE (из гепатомы крыс) истощение АТФ 4 в полициклический ароматический гидрокарбон-связывающий белок Bhatetal., 1996

ГМК легочных артерий крыс аноксия 20 кДа белок легких цепей миозина Zhaoetal., 1996

ГМК коронарных артерий кроликов инфаркт миокарда Регуляторный белок легких цепей миозина Akiyama et al., 1997

клетки гиппокампуса крыс аноксия Существенное снижение фосфорилирования по тирозиновым остатакам многих белков Braunton et al., 1998

2.5. Разрушение и реорганизация цитоскелета.

Пространственная организация, движение клеток, а также перемещение клеточных компонентов обеспечиваются их цитоскелетом, образованным актиновыми микрофиламентами, промежуточными филаментами и микротрубочками. Акгиновые микрофиламенты (Р-актин) имеют диаметр 6 нм и образуются в результате полимеризации мономеров глобулярного белка актина (О-актин). Микротрубочки имеют диаметр 25 нм и состоят в основном из белка тубулина. Промежуточные филаменты (диаметр 10 нм) представлены в различных клетках четырьмя типами белков: тип I представлен кератинами в эпителиальных клетках, тип II - виментином в

мезенхимальных клетках (он также часто экспрессируется в эмбриогенезе и в культивируемых клетках) и глиальным фибриллярным белком в клетках глии мозга, тип III - белком нейрофиламентов в нейронах и тип IV - белками ядерной ламины во всех ядерных клетках.

2.5.1. Разрушение актиновых микрофила ментов при падении уровня АТФ.

Хорошо известно, что актиновый цитоскелет разрушается при истощении АТФ. Так Bershadsky и др. показали на эмбриональных фибробластах мыши, что ингибирование энергетического метаболизма (2,4-динитрофенолом или азидом натрия) приводит к распаду актиновых филаментов [Bershadsky et al., 1980]. Позже в работах на культурах различных клеток было подтверждено, что при энергетическом истощении происходит быстрое разрушение микрофиламентов, а также продемонстрирована обратимость этого процесса при временном снижении АТФ. Hlnshaw и др. определили пороговый уровень содержания АТФ (примерно 40% от контрольного), при котором происходит видимое нарушение нормальной архитектуры актинового цитоскелета в эндотелиальных клетках аорты быка [Hinshaw et al., 1993]. В двух эпителиальных линиях (MDSK и JTC) такой пороговый уровень был определен как 20% от исходного [Bacallao et al., 1994]. Известно также, что процесс разрыва микрофиламентов проходит в несколько стадий, а не по принципу "все или ничего". Истощение АТФ приводит к постепенной фрагментации стресс-фибрилл (пучков ассоциированных с миозином актиновых филаментов, закрепленных на мембране клетки) и последующему образованию в цитоплазме агрегатов F-актина [Bershadsky et al., 1983; Hinshaw et al., 1988a; 1988b; 1993; Kuhne et al., 1993; Bacallao et al., 1994]. Однако все факторы, участвующие в этом процессе, еще не ясны. Полагают, что происходящая при "энергетическом голодании" фрагментация актиновых филаментов может осуществляться акгин-связывающими белками [Bershadsky et al., 1983]. В частности, один из таких белков гельзолин может активироваться при повышении уровня

внутриклеточного Са2+ в АТФ-истощенных клетках и вызывать фрагментацию микрофиламентов. Действительно, на культивируемых ЭК аорты свиньи показано, что истощение АТФ и Са2+ ионофор А23187 вызывают сходный рост свободного Са2+ и разрушение нормальной архитектуры актинового цитоскелета в клетках [Kühne et al., 1993]. Кроме того, было показано, что способность гельзолина связывать и разрезать F-актин зависит от концентрации адениннукпеотидов [Laham et al., 1995] и может увеличиваться в энергетически истощенных клетках при уменьшении в соотношении АТФ/АД Ф.

Дестабилизация актиновых филаментов также может происходить в результате образования жестких акгин-миозиновых комплексов, наблюдаемых в энергетически истощенных и ишемизированных клетках [Wang, 1986; Ganóte and Armstrong, 1993]. Происходящая при падении уровня АТФ инактивация киназ и активация фосфатаз может влиять на взаимодействие актин-связывающих белков с актином, что, в свою очередь может дестабилизировать цитоскелет. Так ассоциированный с F-актином в клетках проксимальной части нефронов белок эзрин при аноксии подвергается дефосфорилированию и диссоциирует от актинового цитоскелета, который после этого разрушается. Такая диссоциация предотвращается ингибированием дефосфорилирования эзрина каликулином А (ингибитором серин/треониновых фосфатаз) [Chen et al., 1995; 1997].

При рассмотрении истощения клеточного АТФ как протеотоксического стресса особый интерес представляет происходящая при этом агрегация актина. Во многих выполненных in situ исследованиях показано преобразование актиновых филаментов в "комки" или "глыбки" F-актина при снижении уровня АТФ. Ультраструктурный анализ показал, что такие "комки" образуются за счет агрегации актина "бок к боку" с вовлечением в этот процесс как микрофиламентов, так и мономеров глобулярного актина [Hinshaw et al., 1988а; 1988Ь]. В культурах линий различных опухолевых клеток истощение АТФ приводило к значительному увеличению содержания Тритон Х-100-

нерастворимого актина [Kabakov and Gabai, 1993; 1994а]. Такая стресс-индуцированная нерастворимость актина не ингибировалась цитохалазином В, т. е. не была связана с полимеризацией [Gabai and Kabakov, 1993а]. Некоторые ассоциированные с актином белки, например винкулин и миозин, были вовлечены в агрегацию актина в лишенных АТФ опухолевых клетках [Gabai et at., 1992; Kabakov and Gabai, 1994а]. Так как уровень агрегации актина коррелировал с некротической гибелью клеток, авторы предположили, что стабильность актинового цитоскелета может определять резистентность клеток к энергетическому истощению. Тем не менее, механизм агрегации актина при истощении АТФ еще не ясен. Актин, как известно, является АТФ- и АДФ-связывающим белком, и, следовательно, индуцированное стрессом уменьшение соотношения АТФ/АДФ должно увеличивать содержание комплексов АДФ-акгин. Сообщалось, что филаменты, образованные актином, связанным с АДФ, менее плотно упакованы и более нестабильны, чем состоящие из АТФ-актина [Janmey et al., 1990]. Кроме того, истощение АТФ может стимулировать фосфорилирование актина по 53-ему тирозиновому остатку, который локализован в сайте, критическом для актиновой полимеризации [Jungbluth et al., 1996]. Вероятно, фосфорилирование и замена АТФ на АДФ приводят к изменению топологии и поверхностного заряда молекул актина, что ведет к агрегации G-актина и обломков микрофиламентов. Агрегация полимеризованного актина может также происходить благодаря таким следствиям истощения АТФ как закисление цитоплазмы и рост внутриклеточного Са2+. Показано, что in vitro F-актин легко агрегирует и формирует паракристаллы при кислых значениях рН и высокой концентрации бивалентных катионов [Strzeleska-Golaszewska et al., 1978; Bennardini et al., 1992]. Такие факторы, как дисфункция миозиновой АТФ-азы и отсоединение микрофиламентов от плазматической мембраны могут также способствовать агрегации актина в энергетически истощенных клетках.

Дезорганизация актинового цитоскелета при падении уровня АТФ также заключается в потере связи микрофиламентов с плазмалеммой, что является

результатом диссоциации комплексов, образованных кортикальными микрофиламентами и такими интегральными мембранными белками как Na+/K+- АТФ-азы и Е-кадгерин [Molitoris et al., 1991; Mandel 1994, et al.] и блэббинга клеточной поверхности [Ganóte et al., 1987; Gabai et al., 1992]. При длительном истощении АТФ такие нарушения приводят в конце концов к разрыву мембраны и некротической гибели клеток [Ganóte and Armstrong, 1993; Kabakov and Gabai, 1994b]. Молекулярные механизмы этого процесса пока не ясны. Вероятно, определенные белки, связывающие актин с его мембранными заякоривающими белками при стрессе подвергаются протеолизу и/или другим модификациям, что ведет к потере контакта между плазмалеммой и цитоскелетом и, в последствии, к блэббингу.

2.5.2. Влияние истощения АТФ на организацию микротрубочек.

Известно, что in vivo процессы сборки и разборки микротрубочек нуждаются в присутствии АТФ [Bershadsky et al., 1983], однако данные о влиянии на них истощения клеточного АТФ весьма противоречивы. Так Maro и Bornens (1982) сообщали, что блокирование синтеза АТФ митохондриями при разобщении окислительного фосфорилирования приводит к разрыву микротрубочек в клетках HeLa. В работах же Bershadsky и Gelfandt (1983) на мышиных эмбриональных фибробластах и Bacalao и др. (1994) на клеточной линии эпителия почек отмечалось, что истощение АТФ не влияет на целостность микротрубочек. Уменьшение интенсивности иммунофлуоресценции при использовании антител к тубулину наблюдали в кардиомиоцитах, подвергшихся ишемии или действию метаболических ингибиторов [Armstrong and Ganóte, 1992а], что говорит о перераспределении или деградации тубулина. Сходное уменьшение иммунореактивности тубулина и ассоциированного с ним белка МАР-2 (microtubule-associated protein) было показано для поврежденных ишемией нейронов [Raleysusman and Murata, 1995; Malinakand Silverstein, 1996].

2.5.3. Влияние истощения АТФ на промежуточные филаменты.

Для своей сборки или разборки промежуточные филаменты не нуждаются в присутствии АТФ. Тем не менее, они очень чувствительны к энергетическому истощению. Было показано разрушение этих цитоскелетных структур и скопление агрегировавшего виментина вокруг ядер в клетках HeLa при разобщении окислительного фосфорилирования [Maro et al., 1982]. Агрегацию промежуточных филаментов наблюдали в опухолевых клетках мыши при ингибировании дыхания ротеноном [Kabakov and Gabai, 1993]. Также, как и в случае актинового цитоскелета "энергетическое голодание" вызывает отделение промежуточных филаментов от клеточной мембраны. Потеря связи десминовых филаментов с сарколеммой и ядерной мембраной была показана в подвергшихся аноксии кардиомиоцитах, при этом также разрушалась связь промежуточных филаментов с мембраной митохондрий [Ganóte et al., 1987]. Разрушение связи десминовых филаментов с сарколеммой трактуется рядом исследователей как основное событие в механизме ишемического повреждения миоцитов [Ganóte and Armstrong, 1993]. Причины разрушения и отсоединения от мембран промежуточных филаментов при истощении АТФ пока не ясны. Вероятно здесь участвуют стресс-активируемые или Са2+-активируемые протеазы, подобные кальпаину. Возможно, что неспирализованные области промежуточных филаментов очень чувствительны к протеолизу, протеолиз же этих областей ведет к разборке филаментных структур.

2.6. Увеличение коньюгации внутриклеточных белков с убиквитином.

Так как in vivo Ub связывается со "старыми" и дефектными белковыми молекулами, предназначенными для АТФ-зависимой деградации в протеосомах, то увеличение Ub-белковых коньюгатов в постишемических клетках должно отражать протеотоксичность ишемического стресса. Сообщалось, что в начальный период реперфузии после короткой ишемии мозга происходило полутора кратное увеличение содержания Тритон Х-1 ОО-нерастворимых коньюгатов Ub и высокомолекулярных белков

[Hayashi et al., 1992]. Повышение уровня Ub-белковых коньюгатов при реперфузии также было показано на кардиомиоцитах свиньи [Andres et al., 1993]. Уровень убиквитинизации белков коррелировал с продолжительностью ишемии и степенью повреждения нейронов [Hayashi et al., 1993]. Это предполагает накопление поврежденных белков в нейронах при ишемии и, вероятно, последующую активацию опосредованного Ub протеолиза при восстановлении клеток. При использовании антител, распознающих in situ свободный и коньюгированный Ub, на СА1 нейронах гипокампуса было показано, что при временной ишемии истощается пул свободного Ub и не истощается пул коньюгированного [Morimoto et al., 1996]. Эти данные противоречат предположению, что образование Ub-белковых коньюгатов и восстановление пула свободного Ub происходят в клетке циклическим образом при эффективной деградации убиквитинированных белков. Объяснить, почему при ишемии в нейронах происходит только убиквитинизация белков и не происходит деградация коньюгатов можно, приняв во внимание происходящее при ишемии падение уровня АТФ, необходимого для протеолиза в протеосомах. Кроме того, при истощении АТФ активный 26S протеазный комплекс переходит в инактивированный комплекс 20S [Orino et al., 1991]. Активность 26S протеосом значительно подавляется через 10 минут ишемии [Kamikubo and Hayashi, 1996]. Ингибирование АТФ-зависимого перехода 20S комплекса в 26S, вероятно, является одной из причин такого накопления Ub-белковых коньюгатов. Следовательно, вызываемое ишемией падение уровня АТФ может быть причиной отсутствия как деградации связанных с Ub белков, так и оборота Ub в клетках при ишемии.

2.7. Истощение клеточного АТФ вызывает активацию генов теплового шока.

Общим свойством сублетальных протеотоксических стрессов является активация транскрипции генов теплового шока, приводящая к накоплению HSPs в период восстановления клеток. Повышение уровня экспрессии HSPs после ишемии описано для кардиомиоцитов, нервной, различных опухолевых и других тканей [Knowlton et al., 1998;

Aoki et al., 1993; Benjamin and Williams, 1994; Nowak and Abe, 1994; Kabakov and Gabai, 1997]. Однако, эти результаты нельзя считать доказательством активации генов теплового шока непосредственно ишемическим стрессом, так как происходящий при последующей реперфузии окислительный стресс также вызывает повышение экспрессии HSPs. Реперфузионный окислительный стресс, судя по всему, тоже является мощным протеотоксическим фактором, запускающим экспрессию HSPs в тканях при ишемии/реперфузии. Тем не менее, в работе Mestril и соавторов (1994а) была показана индукция HSP70 мРНК в крысиных кардиомиоцитах при ишемии без реперфузии и клетках линии Н9с2 при аноксии без реоксигенации. Также была показана значительная активация HSF1 в мозге крыс при ишемии до реперфузии [Higashi et al., 1995]. Сходный результат взаимосвязи между уровнем АТФ и индукцией HSP был получен на эпителии извитых канальцев почек [Van Why et al., 1994]. Авторы показали, что 50%-процентное снижение уровня АТФ в клетках уже приводит к активации транскрипции HSPs генов без участия реперфузии. Таким образом, первая активация транскрипции HSPs в случаях ишемии и аноксии происходит перед окислительным стрессом. Можно предположить, что индукцию HSPs будет вызывать происходящее при истощении АТФ закисление цитоплазмы клеток. Это предположение опровергается данными Benjamin (1992 г.) и др., показавших на линии клеток С2С12, что активация HSF1 происходит при падении уровня АТФ при различных значениях pH в клетке и не вызывается закислением цитоплазмы самим по себе. С другой стороны, в кардиомиоцитах крыс истощение АТФ вызывает индукцию HSP70 лишь при снижении pH до 6,2 [Heads et al., 1998].

В любом случае, временное истощение АТФ, прямо или косвенно, способно индуцировать активацию генов теплового шока при ишемическом стрессе. Очевидно, существует пороговый уровень снижения АТФ, при котором происходит активация HSF1, и этот уровень может варьировать в зависимости от типа клеток.

Инактивированный НЭР

НвР70

Истощение АТФ

Активация НБР

Активированный НБР

НЗР70

Предотвращение денатурации и агрегации белков

НБРэ

НвЕ гены

Транскрипция генов

НБРэ |

Трансляция мРНК НБРэ

Избыток

НБР70 §

\

Другие НБРэ

Рис. 2. Предполагаемая схема ответа клеток на истощение АТФ.

Истощение АТФ вызывает денатурацию белков и связывание с ними Н8Р70. Нехватка последнего вызывает диссоциацию комплекса НЗР-НЗР70. Диссоциировавший НБР образует тримеры, активируется и связывается с НЭЕ, запуская транскрипцию генов НЭРв.

3. Участие HSPs в защите клеток от ишемического повреждения.

Известно, что тепловая предобработка снижает чувствительность тканей к последующей ишемии. В работах B.Polla и J.Bonventre (1987), а также R.Currie и соавторами (1988) впервые было показано, что предварительный тепловой шок защищает клетки от энергетического голодания. В ряде экспериментов in vivo показано уменьшение зоны инфаркта миокарда у подвергшихся предварительному нагреванию животных по сравнению с контролем [Donnelly et al., 1992; Currie et al., 1993; Marber et al., 1993]. Прекондиционирование тепловым шоком также обусловливает более быстрое восстановление сократимости миокарда в изолированных и подвергнутых ишемии сердцах [Currie et al., 1988; 1990; Karmazyn et al., 1990; Yellon et al., 1992]. Наибольшая защита сердца от ишемии (по величине зоны инфаркта) наблюдается через 24 часа после нагревания и полностью исчезает к 40 часам восстановления [Currie et al., 1993]. Авторы предполагают, что наблюдаемый феномен обусловлен, по крайней мере частично, происходящим в этот период увеличением экспрессии HSPs, в частности, HSP70 [Currie, 1987; Mehta et al., 1988; Donnelly et al., 1992]. Сходные результаты защиты тепловым прекондиционированием от ишемического повреждения, а также индуцированное нагреванием накопление HSP70 были получены на ЭК коронарных сосудов крыс [Amrani, et al.; 1998], почке свиньи [Perdizet, 1993], печени и скелетных мышцах крыс [Saad, 1995; Garramone, 1994], а также на различных клеточных линиях [Kabakov and Gabai, 1993; Gabai and Kabakov, 1993; Wang, 1996; Borkan et al., 1997]. Индукция синтеза HSPs непосредственно самим ишемическим стрессом (п. 3.4) может быть вовлечена в механизм защиты коротким ишемическим прекондиционированием кардиомиоцитов и клеток мозга от последующей длительной ишемии. Индуцированная другими стимулами резистентность к ишемии также может быть обусловлена HSPs. В частности, защиту миокарда прекондиционированием короткими гипоксическими воздействиями связывают с накоплением в кардиомиоцитах HSP70 [Meerson et al., 1992; 1996]. В настоящий момент можно считать доказанным участие HSP70 в защите клеток

от ишемического повреждения. Об участии представителей других классов стресс-белков известно довольно мало. Показано, что гиперэкспрессия HSP90 и HSP60 не защищает нейроны и кардиомиоциты от ишемического стресса in vitro [Marber et al., 1994; Heads et al., 1995; Amin et al., 1996]. В тоже время, совместная гиперэкспрессия HSP60 и HSP10 (при использовании аденовирусных векторов) предотвращает повреждение культивируемых кардиомиоцитов при ишемии/реперфузии [Lau, 1996].

3.1. Участие HSP70 в защите клеток от ишемического стресса.

Выше было сказано о том, что защита различных тканей тепловой предобработкой совпадает с активацией транскрипции и трансляции HSP70. Наличие корреляции между количеством HSP70 и степенью защиты кардиомиоцитов при ишемии впервые было показано Hutter и др. [Hutter et al., 1994]. Протекторная роль HSP70 была также показана на различных клеточных линиях. Так клетки мыши с высоким уровнем экспрессии HSP70 человека и кардиомиоциты крыс, гиперэкспрессирующие экзогенный HSP70 имели более высокий процент выживания при имитирующем ишемию метаболическом стрессе [Williams et al., 1993; Mestril et al., 1994]. Защитная роль HSP70 при ишемии была подтверждена в экспериментах in vivo на трансгенных животных. Миокарды мышей с высоким уровнем экспрессии индуцибельного крысиного HSP70 имели значительно меньшие зоны инфаркта по сравнению с контрольными, а также отличались от последних низким уровнем высвобождения креатинкиназы во время реперфузии [Marber et al., 1995]. Аналогичный результат с незначительным высвобождением креатинкиназы, а также более быстрые по сравнению с контролем темпы восстановления сократимости миокарда были получены на трансгенных мышах с высоким уровнем экспрессии индуцибельного HSP70 человека [Plumier et al., 1995].

Молекулярный механизм защитного действия HSP70 от ишемического повреждения остается не известным. Вероятно, в непрекондиционированных клетках вызываемая падением уровня АТФ денатурация и агрегация белков создает ситуацию с

недостатком конститутивного HSP70 и избытком субстратов связывания, что, в свою очередь, запускает синтез стресс-белков. В клетках же с высоким уровнем HSP70 (полученным прекондиционированнием тепловым шоком или ишемическим стрессом, а также в результате трансфекции) шаперона будет достаточно для предотвращения агрегации белков. Этот вывод подтверждается данными А.Кабакова и др., показавших, что 2.5-кратное увеличение содержания HSP70 в опухолевых клетках мыши значительно снижает агрегацию белков при истощении АТФ [Kabakov and Gabai, 1995]. Сходным образом, HSP70 может взаимодействовать с цитоскелетом и предотвращать его разрушение при стрессе [Gudi and Gupta, 1993]. Возможно также, что HSP70 облегчает перенос вновь синтезированных белков от места трансляции в митохондрии [Langer and Neupert, 1994; Marber et al., 1994], что может облегчать восстановление последних после ишемического повреждения.

3.2. Участие малых HSPs в защите клеток от ишемического стресса.

Известно, что экспрессия HSP27 и альфа-В-кристаллинов возрастает после ишемии. Тем не менее, существует пока единственное непосредственное доказательство участия HSP27 в защите клеток от ишемического повреждения, полученное на трансфецированных крысиных кардиомиоцитах [Martin et al., 1997]. Показано, что высокий уровень экспрессии HSP27 человека и альфа-В-кристаллина крысы в эмбриональных кардиомиоцитах и кардиомиоцитах взрослых животных защищает клетки от имитирующего ишемию стресса. При этом, подавление синтеза эндогенного HSP25 делает крысиные клетки более чувствительными к ишемическому повреждению. Механизм защитной роли малых HSPs пока не ясен. Совокупность таких фактов, как то, что одним из основных повреждающих действий ишемии является нарушение целостности актиновых филаментов (п.1.4.1.), а также, что гиперэкспрессия HSP27 защищает актиновый цитоскелет от разрушающего действия теплового шока, окислительного стресса и действия цитохалазина D (п. 2.3.3.) наводит на мысль, что

протекторная роль НЭР27 при ишемическом повреждении обусловлена защитой им актинового цитоскелета.

Заключение

Анализ имеющихся в научной литературе данных позволяет заключить, что:

1. НБРв являются частью универсального механизма клеточного ответа на стресс. Они выполняют в клетке следующие основные функции: 1) контролируют правильное свертывание белков в нестрессированных клетках, 2) предотвращают денатурацию и агрегацию внутриклеточных белков при стрессорных воздействиях, 3) в стрессированных клетках ускоряют ренатурацию и дезагрегацию поврежденных белков, а также участвуют в деградации необратимо поврежденных белков. Уровень НЭРэ в клетках быстро повышается в ответ на стрессы, причем транскрипция генов НЭРэ находится под негативным контролем стресс-белков НЭР70 и НЭРЭО.

2. Истощение клеточного АТФ можно рассматривать как "протеотоксический" стресс, имеющий следующие эффекты: 1) агрегацию белков, 2) разрушение цитоскелета, 3) увеличение 11Ь-белковых коньюгатов, 4) активацию генов НЭРб. Падение уровня АТФ является также стрессом, вызывающим дефосфорилирование многих клеточных белков.

3. В результате ряда экспериментов на трансгенных животных было доказано, что гиперэкспрессия НЭР70 защищает клетки от ишемического повреждения. Работы, выполненные на трансфицированных кардиомиоцитах свидетельствуют о защите от повреждения деэнергезированных клеток гиперэкспрессией НЗР27, альфа В-кристаллина или совместной гиперэкспрессией НЭРбО и НБРЮ. Эти и другие данные позволяют заключить, что НБРв являются участниками эндогенного механизма защиты клеток от ишемического повреждения. Однако, остается неизвестным, каким образом НЭРэ осуществляют эту защиту.

Представляемая работа посвящена изучению механизмов индуцированной тепловым шоком толерантности ЭК сосудов человека к истощению АТФ, в частности, роли НЭР27 в защите этих клеток от "энергетического голодания".

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Выделение, культивирование и идентификация в культуре эндотелиальных клеток сосудов человека.

Все эксперименты были поставлены на культуруемых ЭК 0-3 пассажей, полученных из аорты и пупочной вены человека.

1.1. Выделение ЭК из пупочной вены человека осуществляли по методу M.Gimbrone (1976) в модификации, описанной А.Антоновым и др. (1981). В отмытую от крови вену вводился 0,15% раствор диспазы в среде 199. После инкубации с ферментом в течение 45 минут при 37°С ЭК вымывали из сосуда, собирали в пробирку и осаждали при скорости вращения ротора 1500 об/мин в течение 10 мин. Клетки высаживали с плотностью 3,5x104 клеток/см2 на чашки Петри, покрытые 0,2% раствором желатина.

1.2. Выделение ЭК из аорты человека проводили по методу A.Antonov и др. (1986). Для этого использовался аутопсийный материал - грудные отделы аорт человека, полученные не позднее шести часов после смерти. Сосуды освобождали от соединительной ткани, отмывали от крови и инкубировали с 0,15% раствором диспазы в среде 199 в течение двух часов при 37°С. Затем сосуды встряхивали и дважды промывали; полученную суспензию клеток собирали, осаждали и высаживали, как описано выше для ЭК из пупочной вены.

1.3. Культивирование ЭК сосудов человека проводили в среде роста 199 , содержащей 20 мМ HEPES, 2мМ L-глутамин, 1мМ пируват натрия, пенициллин (50 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), 10% эмбриональной бычьей сыворотки, фактор роста ЭК (ECGF) (200 мкг/мл) и гепарин (100 мкг/мл) в инкубаторе (37°С, 5% С02,). Смену среды культивирования осуществляли через каждые 48 часов. Культура ЭК достигала конфлуентного состояния через 7-9 суток после посадки, после этого ее использовали в эксперименте или пассировали с помощью раствора 0,05% трипсина - 0,02% ЭДТА.

1.4. Идентификацию ЭК в культуре проводили при помощи иммунофлуоресцентного выявления маркера эндотелиальных клеток - VIII фактора свертывания крови (фактора

фон Виллебранда) (рис. 3} с использованием поликлональных антител (Sigma). Чистота популяции ЭК в первичной культуре составляла 94-98%.

Рис. 3. Фактор фон Виллибранда в ЭК первичной культуры пупочной вены человека. Непрямое иммунофлуоресцентное выявление поликлональными AT к FV([[R:Ag. Увеличение х 250.

2. Имитирующий ишемию метаболический стресс.

Для имитации ишемического состояния, характеризующегося недостатком глюкозы, гипоксией и истощением АТФ в клетках, использовали модель экспериментальной ишемии in vitro, основанной на подавлении синтеза АТФ как за счет гликолиза, так и за счет окислительного фосфор и л и роаа ни я в митохондриях. Клетки инкубировали при 37°С в среде DMEM без глюкозы (Dulbecco's modified Eagle's minimal esential medium, Sigma) с

добавлением 3% эмбриональной бычьей сыворотки в присутствии 20 мкМ карбонилцианид m-хлорофенилгидразона (СССР) (разобщителя окислительного фосфорилирования) или 20 мкМ ротенона (ингибитора дыхательной цепи митохондрий).

3. Предобработки клеток.

Тепловой шок проводили при 45°С в течение 10 мин. Для этого герметично закрытые культуральные чашки погружали в водяную баню. Последующее восстановление клеток проводили при обычных условиях культивирования после смены среды в культурах. Для ингибирования фосфатаз /л vivo культуры клеток инкубировали с 1мкМ окадаиковой кислотой, с 0,2 мкМ кантаридином или со 100 мкМ ортованадатом натрия в течение 20 минут перед проведением ишемического стресса и во время последнего. Перед проведением экспериментальной ишемии инкубации проводили в среде роста, во время ишемического стресса ингибиторы вносили вместе с СССР (или ротеноном) в инкубационную среду без глюкозы. Для активации протеинкиназ, увеличивающих фосфорилирование HSP27 клетки инкубировали с тромбином (2 ед/мл) или гистамином (20 мкг/мл) в среде роста в течение 20 минут непосредственно перед инкубацией с разобщителем. Для активации р38 МАР киназы ЭК инкубировали при описанных выше условиях с TNF-альфа (10 нг/мл) или с IL-1-альфа (20 нг/мл). Ингибитор р38 МАР киназы SB 203580 вносили в среде роста за час до проведения теплового шока в концентрации 25 мкМ. Для подавления индуцированного тепловым шоком синтеза HSP27 при смене среды после тепловой предобработки вносили 50 мкМ цикпогексимид или 30 мкМ кверцетин. Повышение уровня HSP70 в ЭК достигалось инкубацией клеток с гербимицином А (2 мкл на 1 мл полной среды роста) в течение ночи, а также вирусной трансфекцией. Инкубация с вирусной конструкцией проводилась в среде роста в течение 24-39 часов. Трансфицированные ЭК выявлялись при помощи флуоресцентной микроскопии (фильтр 450-490 нм).

4. Измерение уровня АТФ в клетках.

Определение уровня АТФ в культивируемых эндотелиальных клетках проводили при помощи люциферин-люциферазного метода (Kabakov and Gabai, 1995), адаптированного для адгезированных клеток. Клетки высаживались на культуральные чашки диаметром 35 мм. При достижении культурой ЭК конфлуентного состояния количество клеток на чашку составляло 320-330 тысяч. Для экстрагирования внутриклеточного АТФ в каждую чашку вносили на холоду по 250 мкл раствора, содержащего 2,5% трихлоруксусной кислоты и 5мМ ЕДТА и быстро механически снимали клетки с пластика. Растворы с обломками клеток собирали и замораживали. Определение содержания АТФ в пробах проводили на люминометре (Wallac 1251, Финляндия), используя люциферин-люциферазный кит (Calbiochem).

5. Измерение внутриклеточного Са2+.

Измерение концентрации внутриклеточного Са2+ производилось по методу, описанному для ЭК аорты свиньи, с использованием флуоресцентного индикатора Са2+ фура-2 [Kühne et al., 1993]. Клетки сажали на покровные стекла и по достижении культурой конфлуентного состояния загружали индикатором. Для этого инкубировали ЭК с 5 мкМ ацетоксиметиловым эфиром фуры-2 в течение 50 минут. Затем стекла трижды отмывали, помещали в кюветы и анализировали на спектрофлуориметре (Shimadzu, Japan) (ex - 340-380 нм, em - 510 нм).

6. Флуоресцентная микроскопия.

Иммунофлуоресцентное исследование проводилось на клетках, растущих на покровных стеклах. После фиксации культур смесью 3,7% формальдегида и 0,1% Тритона Х-100 на PBS в течение 7 минут их обрабатывали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина на PBS в течение 20 минут. Затем клетки инкубировали с первыми антителами (AT) к HSP27 в течение 60 минут при комнатной температуре и со вторыми

AT, коньюгированными с техасским красным. Флуоресцентное выявление F-актина производили с использованием фаллоидина, связанного с тетраметилродаминизотиоцианатом (ТРИТЦ) или флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Препараты заключали в смесь глицерин/PBS (1:1), исследовали и фотографировали на флуоресцентном микроскопе (Opton III, Karl Zeiss, Germany).

7. Определение концентрации F-актина в ЭК на спектрофлуориметре.

Культуры клеток выращивали на чашках диаметром 35 см2. После экспериментов клетки фиксировали смесью 3,7% формальдегида и 0,1% Тритона Х-100 на PBS в течение 7 минут, отмывали буфером и инкубировали с ФИТЦ-фаллоидином в течение часа при комнатной температуре. Затем клетки трижды отмывали, механически снимали с пластика в 1 мл буфера, переносили в кюветы и анализировали на спектрофлуориметре (Shimadzu, Japan) (ex - 494 нм, em - 518 нм).

8. Клеточное фракционирование неионным детергентом Тритоном Х-100.

Клетки, растущие на культуральных чашках диаметром 35 мм лизировали на холоду в 100 мкл фосфатного буфера (PBS, pH 7.4) , содержащего 1% Triton Х-100 и 1 мМ фенилметилсульфонил флуорид. Клеточные лизаты центрифугировали при 4°С на 12000 g в течение 10 минут. Супернатант отбирали, вносили буфер для электрофореза, прогревали при 95°С в течение 3 минут и замораживали. Осадок отмывали в лизирующем буфере, центрифугировали, как описано выше, сливали супернатант, в осадок добавляли буфер для электрофореза, пипетировали, прогревали при 95°С до растворения осадка и замораживали. Далее ставили электрофорез и иммуноблоттинг с AT к HSP27.

9. Электрофорез и иммуноблоттинг.

Клетки, растущие на культуральных чашках диаметром 35 мм отмывали от среды роста и лизировали в буфере для образцов, содержащем 20 мМ трис-HCI (рН 8,0), 4% додецилсульфат натрия, 1% дитиотреитол, 4 мМ EDTA, 10% глицерин и 0,5 мМ фенилметилсульфонилфлуорид. Клеточные лизаты прогревали при 95°С в течении 5 минут. SDS-электрофорез проводили в системе Laemmli с 4% концентрирующим и 12,5% разделяющим полиакриламидными гелями. Разделенные белки переносили из геля на нитроцеллюлозный фильтр (0,45 мкм) и оставляли на 16-20 часов в блокирующем буфере: 25 мМ трис-буфер (рН 7,5), 0.1% Tween-20 и 1% BSA. Иммуноблоттинг ставили с анти-НЗР27 AT кролика или анти-НЗР70 AT мыши. Использовали разведение AT 1:1000 на блокирующем буфере, инкубацию проводили в течение полутора часов при комнатной температуре. После отмывок блоты инкубировали с анти-кроличьими IgG или анти-мышиными IgG, коньюгированными с пероксидазой. Для визуализации блоты обрабатывали диаминобензидином (ДАБ) или применяли ECL-метод. Для количественного определения HSPs в пробах блоты сканировали.

10. Анализ изоформного спектра HSP27.

Клетки высаживались на культуральные чашки диаметром 60 мм. При достижении культурой ЭК конфлуентного состояния количество клеток на чашку составляло около одного миллиона. Клетки отмывали от среды роста и лизировали в 100 мкл раствора, содержащего 8 M мочевину, 1% нонидет Р40, 2% бетта-меркаптоэтанол и 100 мкМ ортованадат Na. Изоэлектрическое фокуссирование (ИЭФ) образцов проводилось в трубочках с 5% полиакриламидным гелем, содержащим 8 M мочевину, 2% нонидет Р-40 и 2% амфолины (рН 5-7). ИЭФ проводилось при 500 V в течение ночи и в течение 1 часа при 1000 V. Затем, осуществлялся перенос белков из геля на нитроцеллюлозный фильтр [Zhou et al. 1993] и ставился иммуноблоттинг с AT к HSP27.

11. Статистическая обработка результатов.

Все данные были получены в нескольких независимых экспериментах на культурах клеток из аорты и пупочной вены человека. После количественного определения содержания АТФ, Са2+, F-актина , белков HSP27 и HSP70 (при сканировании блотов) вычисляли среднее значение параметров (М) и стандартную ошибку среднего (т). Значение среднего выражали как М + т. Достоверность различия между средними устанавливалась по непарному ¿-критерию Стьюдента.

12. Материалы.

В работе использовались культуральная среда 199, эмбриональная бычья сыворотка, HEPES , L-глутамин, пируват натрия, пенициллин и стрептомицин, произведенные фирмой HyClone (Cramlington, UK), культуральный пластик, выпущенный фирмой Costar (Cambridge, MA), следующие реагенты, произведенные фирмой Sigma Chemical Со (St. Louis, МО) : диспаза, бычий сывороточный альбумин, СССР, цикпогексимид, DMEM, анти-мышиные lg кролика и анти-кроличьи IgG козы, коньюгированные с пероксидазой, тромбин, фаллоидин, коньюгированный с ФИТЦ и ТРИТЦ. Анти-кроличьи IgG, коньюгированные с техасским красным были выпущены South Biotech. Assoc., Inc, гистамин и кверцетин - фирмой Serva (Heidelberg, Germany), окадаиковая кислота и АТФ-кит - Calbiochem (La Jolla, СА), фура-2/ацетометиловый эфир - Molecular Probes (Eugene, OR), ортованадат натрия - Aldrich Chemical Company (Milwaukee Wl) - Sandoz Pharma (Basel, Switzerland). Реактивы для электрофореза и нитроцеллюлоза были произведены Bio-Rad Lab. (Richmond, СА), амфолины - LKB (Uppsala, Sweden). Антитела к HSP27 были любезно предоставлены проф. Гастелом [Engel К. et al., 1991]. Антитела к HSP70i были произведены StressGen Biotech. Corp. (Victoria, Canada), анти-кроличьи IgG козы, коньюгированные с техасским красным - South Biotech. Associates (Birminghem, AL), SB203580 - Smith Kline Beecham Pharmaceuticals, реагенты и пленка для ECL - Amersham (Arlington Heights, IL).

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Архитектура актинового цитоскелета, распределение и статус HSP27 в культивируемых эндотелиальных клетках сосудов человека.

ЭК кровеносных сосудов образуют монослой, выполняющий функцию селективного барьера между кровью и подлежащими тканями, осуществление которой контролируется их актиновым цитоскелетом [Gotlieb et al., 1991; Garcia and Shaphorst, 1995]. Нарушение архитектуры актиновых филаментов (например, при имитирующем ишемию метаболическом стрессе, а также при действии тромбина, цитокинов или окислителей) ведет к увеличению проницаемости эндотелиального монослоя для макромолекул и клеток крови [Watanabe et al., 1991; Phillips et al., 1989; Garcia, 1992; Molony and Armstrong, 1991; Hart et al., 1993]. Известно, что актиновый цитоскелет ЭК артерий человека представлен в виде кольца микрофиламентов, окаймляющих клетку по периметру (кортикальный F-актин), и расположенных параллельно направлению кровотока, закрепленных на мембране стресс-фибрилл [Drenckhahn and Ness, 1997]. Архитектура актинового цитоскелета культивируемых ЭК примерно соответствует таковой in vivo до момента образования клетками плотного монослоя, так называемой "булыжной мостовой", когда клетки утрачивают стресс-фибриллы. Показательно, что при действии гидродинамического стресса (имитирующего действие кровотока) на такие культуры происходит восстановление стресс-фибрилл в клетках [Sato et al., 1990]. Таким образом, культуры ЭК, образовавших монослой, но еще не утративших стресс-фибриллы, являются наиболее адекватной in vitro моделью для изучения физиологических функций и патофизиологических состояний эндотелия.

В наших экспериментах в контрольных ЭК окрашивание фаллоидином, коньюгированным с флуоресцентным красителем ТРИТЦ, выявляло одновременное присутствие кортикального F-актина и стресс-фибрилл (рис. 4А).

Рис. 4, Архитектура актинового цитоскелета и распределение НЗР27 в ЭК пупочной вены

человека, культивируемых при нормальных условиях.

А - Флуоресцентное выявление Р-актина ТРИТЦ-фаллоидином.

Видны стресс-фибриллы и кортикальный Р-актин.

Увеличение х 375

Б - Непрямое иммунофлуоресцентное выявление НЭР27 (визуализация с помощью АТ, коньюгированных с техассшм красным).

Видны диффузное распределение НЭР27 в ядрах и цитоплазме, а также наличие мелких гранул стресс-белка в эндоплазме клеток. Увеличение х 960.

Иммунофлуоресцентное выявление HSP27 в ЭК показало диффузное распределение белка в ядре и цитоплазме, а также образование им многочисленных мелких гранул в эндоплазме (рис. 4Б). При экстракции клеток неионным детергентом Тритоном Х-100 основное количество HSP27 выявлялось в детергент-растворимой фракции и незначительная часть HSP27 - в детергент-не раствори мой фракции (рис, 13 (стр 62)). Анализ изоформного спектра HSP27 при помощи ИЭФ/иммуноблоттинга показал присутствие в клетках четырех иэоформ, что соответствует описанным s литературе данным (Lavoie et al., 1995]. В нестрессированных клетках преобладала нефосфорилированная а-изоформа HSP27, количество монофосфорилированной Ь-изоформы было примерно в два раза меньше, чем основной а-изоформы, а содержание ди- и трифосфорилированных с- и d-изоформ составляло примерно 1/4 и 1/8 от содержания а-изоформы (рис.11А (стр.60)).

2. Блокада энергетического метаболизма как in vitro модель ишемического повреждения эндотелия сосудов человека.

Используемые модели ишемического повреждения эндотелия in vitro основаны на снижении уровня АТФ в клетках путем ингибирования окислительного фосфорилирования при одновременном подавлении гликолиза. Так в работе Hinshaw и соавторов (1993), выполненной на эндотелии легочной артерии быка истощение клеточного АТФ достигалось инкубацией ЭК в лишенной глюкозы среде с ингибитором АТФ-синтетазы олигомицином. В работах группы N.M. Piper [Watanabe et al., 1991; Kühne et al-, 1993] быстрое падение клеточного АТФ в ЭК аорты свиньи происходило в результате блокирования дыхательной цепи митохондрий KCN при одновременном подавлении гликолиза 2-деокси-0-глюкозой. Все проведенные до настоящего времени работы по имитации ишемического повреждения эндотелия in vitro были выполнены на ЭК животных и не проводились на эндотелии сосудов человека.

В нашей модели ишемического повреждения ЭК сосудов человека in vitro мы использовали ротенон (ингибитор дыхательной цепи митохондрий) или карбонилцианид m-хлорфенилгидразон (СССР, разобщитель окислительного фосфорилирования), добавляемые в инкубационную среду без глюкозы. В отличие от KCN или азида выбранные нами ингибиторы энергетического метаболизма высоко специфичны и сами по себе не вызывали сильных и необратимых повреждений клеток. Использование же двух ингибиторое энергетического метаболизма с различным механизмом действия позволяет исключить ситуацию, когда обнаруживаемые эффекты будут обусловлены специфическим действием одного из них. В нашей модели мы не использовали 2-део кс и глюкозу, так как происходящее в результате эндогенного гликолиза накопление лактата вносит дополнительный вклад в стресс-индуцируемый ацидоз, что более адекватно имитирует ишемическое повреждение in vivo [Kabakov and Gabai, 1997].

В наших экспериментах на культивируемых ЭК при имитирующем ишемию стрессе происходило довольно быстрое падение АТФ. Так через 20 минут действия 20 мкМ СССР или 20 мкМ ротенона уровень АТФ в ЭК снижался на 65% и составлял примерно 20% от исходного через полтора часа (рис. 5). При этом, падение уровня АТФ было обратимым, он быстро возрастал почти до контрольного при добавлении в инкубационную среду глюкозы. Истощение клеточного АТФ под действием метаболических ингибиторов, так же как при ишемии in vivo, вызывало нарушение ионного баланса ЭК, в частности рост внутриклеточного свободного Са£~. Через 2,5 часа имитирующего ишемию стресса уровень АТФ составлял примерно 5% от исходного (рис. 6), а содержание свободного Са2+ в цитозоле повышалось почти в десять раз (рис. 7). Наши результаты согласуются с полученными ранее Hinshaw et al. (1988; 1993) и Kühne et al. (1993) в моделях ишемического повреждения in vitro на ЭК сосудов животных.

АТФ, %

120 -

0 40 80 120 160 200 г, шн

Рис.5. Изменения уровня АТФ в культуре ЭК, инкубированной в безглкжозной среде с СССР. | - инкубация в безглкжозной среде П - после добавления глюкозы

в

§ 50

х т

о &

с

й

л X О) ш о

о.

>

■

1

Шт

контрольные ЭК

ЭК после теплового шока

ЭК после теплового шока и восстановления

2.5 И

Начальный Время иметирующего ишемию метаболического стресса уровень

Рис. 6. Изменения уровня АТФ в ЭК при имитирующем ишемию метаболическом стрессе.

800 -

контрольные клетки ЭК после теплового шока Р§§§§ зк после теплового шока и восстановления

Ж

0.5 И 1 И

2.5 И

Л

J

Начальная время имитирующего ишемию метаболического стресса точка

Рис. 7 Изменения содержания внутриклеточного Са2+ в ЭК при имитирующем ишемию метаболическом стрессе.

Рис, 8, Разрушение актинового цитоскелета при истощении АТФ. А - контрольные ЭК. Б - 1 час истощения АТФ,

Фрагментация и образование агрегатов Р-актина.

В - 2 часа истощения АТФ.

Полное разрушение стресс-фибрилл.

Флуоресцентная микроскопия. Окрашивание ТРИТЦ-фаллоидином. Увеличение х 375.

3. Изменения морфологии, актинового цитоскелета и статуса HSP27 в ЭК сосудов человека, подвергнутых ишемическому стрессу in vitro.

Истощение клеточного АТФ в ЭК в течение 1,5-2 часов вызывало разрушение актинового цитоскелета: разрыв стресс-фибрилл с образованием более коротких фрагментов и дальнейшую деградацию последних, а также образование агрегатов F-актина (рис. 8 (стр. 57)). Количественный анализ содержания F-актина показал его достоверное снижение за это время более чем на 40% (рис. 9 (1)).

i

з

4

Рис. 9, Количественная оценка содержания F-актина в ЭК (%). J I - нестрессированные ЭК.

ЦЛИЯ - ЭК через 2 часа истощения АТФ,

1 - нетолерантные ЭК, 2 - поздняя защита, 3 - ранняя защита, 4 - ЭК, предобработанные кантаридином (0,2 мкМ).

Полученные нами результаты согласуются с многочисленными литературными данными о влиянии истощения АТФ на целостность актинового цитоскелета в культивируемых клетках, в частности, в ЭК [Hinshaw et ai., 1988; 1993; Watanabe et a!,, 1991; Kühne ei al., 1993], и отражают характерное для ишемии in vivo разрушение микрофиламентов [Ganóte and Armstrong, 1993].

Рис. 10. Морфологические изменения эндотелиального монослоя при истощении клеточного АТФ. А - контрольные ЭК.

Нормальный монослой ЭК: каждая клетка образует контакты с другими по всему своему периметру ("булыжная мостовая'). Б - 2 часа истощения АТФ,

Ретракция цитоплазмы, образование фестончатых краев и промежутков между клетками приводят к дезинтеграции эндотелиального монослоя. В - 3 часа истощения АТФ. ЭК ошаривагатся и отрываются от подложки. Фазово-контрастная микроскопия. Увеличение х 190.

Из литературы известно, что разрушение актинового цитоскелета в ЭК приводит к ретракции цитоплазмы, что, в свою очередь, нарушает барьерные свойства эндотелиального монослоя [Gotlieb et al., 1991; Watanabe eí al., 1991; Garcia and Shaphorst, 1995]. В наших экспериментах при имитирующем ишемию стрессе также происходили видимые нарушения клеточной морфологии. Наблюдалась ретракция цитоплазмы ЭК, края клеток становились фестончатыми, что приводило к дезинтеграции эндотелиального монослоя. Через 2,5-3 часа истощения АТФ клетки начинали ошариваться и отрываться от подложки (рис. 10 (стр. 59)),

Нами впервые показано, что истощение клеточного АТФ влияет на статус HSP27. В наших экспериментах при имитирующем ишемию стрессе происходило дефосфорилирование HSP27, а также его перераспределение в клетках. В лизатах клеток, подвергавшихся действию метаболических ингибиторов в течение 2 часов, методом ИЭФ/иммуноблоттинга выявлялось исчезновение ди- и трифосфорилированных с- и d- изоформ, уменьшение монофосфорилированной Ь-изоформы и накопление нефосфорилированной а-изоформы HSP27 (рис. 11).

deba

i I • I А

(• в

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Локтионова, Светлана Анатольевна

выводы

1. Разработана экспериментальная in vitro модель ишемического повреждения эндотелиальных клеток сосудов человека.

2. Падение уровня АТФ в эндотелиальных клетках вызывает дефосфорилирование HSP27, а также перераспределение этого стресс-белка из цитоплазмы в ядра клеток и образование там крупных сферических гранул. Образование гранул в ядрах эндотелиальных клеток может служить in situ маркером длительного истощения АТФ.

3. Обнаружен ранний период индуцируемой тепловым шоком защиты эндотелиальных клеток от ишемического стресса, проведенного в пределах первых трех часов после теплового шока.

4. Поздний период защиты эндотелиальных клеток тепловым шоком совпадает со временем накопления HSPs, в частности HSP27 и HSP70. Ингибиторы синтеза белка отменяют защитный эффект теплового прекондиционирования. При этом, гиперэкспрессии одного только HSP70 не достаточно для защиты ЭК от ишемического повреждения.

5. Существует положительная корреляция между целостностью актиновых филаментов и поддержанием пула фосфорилированного HSP27 в лишенных АТФ эндотелиальных клетках. Ингибиторы протеинфосфатаз, блокирующие дефосфорилирование HSP27 in vivo, предотвращают образование гранул HSP27 в ядрах, разрушение актинового цитоскелета и повреждение нормальной морфологии ЭК при ишемическом стрессе.

VI. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования последних лет, направленные на выявление эндогенных механизмов клеточной защиты от ишемического стресса показали участие белков теплового шока в защите клеток от ишемии/реперфузии. Так гиперэкспрессия HSP70, HSP27, альфа В-кристаллина и совместная гиперэкспрессия HSP60 и HSP10 способна защитить клетки от ишемического стресса [Marber et al., 1995; Plumier et al., 1995; Martin et al., 1997; Lau et al., 1997]. Известно также, что клетки, подвергшиеся тепловому шоку, после определенного периода восстановления оказываются менее чувствительными к повреждающему действию ишемии [Currie et al., 1988; 1990; 1993; Donnelly, 1992; Yellon, 1992; Marber, 1993]. Период защиты тепловым прекондиционированием совпадает со временем накопления в клетках индуцибельной формы HSP70, а также ряда других HSPs. Таким образом, феномен такой перекрестной толерантности, по крайней мере частично, может быть обусловлен индукцией HSPs генов. Молекулярные механизмы защиты клеток стресс-белками от ишемического повреждения остаются не ясны. Одной из основных функций, выполняемых HSPs, является предотвращение денатурации и агрегации клеточных белков. Аналогично тепловому шоку ишемический стресс сильно увеличивает риск агрегации внутриклеточных белков [Nguyen and Bensaude, 1994], что вовлекает HSPs в механизм предотвращения такого рода повреждений. Другим существенным повреждением клеток при ишемии является разрушение актинового цитоскелета [Armstrong and Gannote, 1993]. При этом показано, что стресс-белок HSP27 влияет на полимеризацию актина [Benndorf et al., 1994], а также способен защищать микрофиламенты от действия теплового шока, окислительного стресса и цитохалазина D [Lavoie et al., 1993; 1995; Huot et al., 1996; Guay et al., 1997]. В этой связи наиболее интересным для нас оказался вопрос о возможном участии HSP27 в защите клеток от ишемии.

В данной работе на модели ишемического повреждения эндотелиальных клеток сосудов человека in vitro мы показали, что падение уровня АТФ в ЭК до 20% от исходного вызывает дефосфорилирование HSP27 и его перераспределение из цитоплазмы в ядро, где он образует крупные сферические Тритон-нерастворимые гранулы. Причем, дефосфорилирование и грануляция HSP27 положительно коррелируют с разрушением актинового цитоскелета ЭК.

Обнаружен феномен существования периода ранней защиты ЭК от истощения АТФ тепловым шоком. Установлено, что прогревание ЭК при 45° С в течение 10 минут непосредственно перед ишемическим стрессом предотвращает вызываемое истощением АТФ нарушение нормальной морфологии клеток и целостности эндотелиального монослоя. Показано, что обнаруженный защитный эффект не обусловлен замедлением падения АТФ или роста свободного Са2+ в прогретых ЭК. Иммунофлуоресцентный анализ и данные спектрофлуориметрии, а также результаты ИЭФ/иммуноблоттинга выявили положительную корреляцию между сохранением в предобработанных тепловым шоком клетках пула F-актина, с одной стороны, и предотвращением перераспределения/грануляции HSP27 и сохранением фосфорилированных с- и d-изоформ, с другой стороны.

Морфологическое и иммунофлуоресцентное исследования влияния тепловой предобработки с последующим восстановлением в течение 12-18 часов на поведение ЭК при ишемии in vitro показали защиту адаптированных таким образом клеток от истощения АТФ. Падение клеточного АТФ и рост свободного Са2+ в толерантных ЭК не отличался от контрольных. Результаты электрофореза/иммуноблоттинга показали, что период поздней защиты совпадал с периодом накопления HSP70i и HSP27 в ЭК. Отмена защитного эффекта тепловой предобработки инкубацией клеток с ингибиторами синтеза белка циклогексимидом и кверцетином свидетельствует о том, что наблюдаемый феномен обусловлен накоплением стресс-белков в толерантных ЭК. Так как эксперименты с повышением содержания HSP70i в ЭК при помощи вирусной трансфекции показали отсутствие защитного эффекта, а предварительная инкубация с нестрессовым индуктором HSP гербимицином А продемонстрировала очень слабую защиту, можно утверждать, что гиперэкспрессии одного только HSP70Í для защиты ЭК от ишемического стресса не достаточно.

Данные флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показали предотвращение разрушения стресс-фибрилл и сохранение пула F-актина в толерантных клетках при истощении АТФ. Параллельно с сохранением актинового цитоскелета в предварительно прогретых ЭК методом иммунофлуоресценции выявлялось подавление перераспределения и грануляции HSP27, а результаты ИЭФ/иммуноблоттинга продемонстрировали замедление дефосфорилирования этого стресс-белка в прекондиционированных клетках.

Инкубация ЭК перед ишемическим стрессом с ингибиторами протеинфосфатаз: Na3V04, окадаиковой кислотой или кантаридином, способных ингибировать РР2А in vivo (РР2А отвечает за дефосфорилирование HSP27) предотвращала дефосфорилирование и грануляцию HSP27, а также оказывала защитный эффект в клетках по морфологии и сохранности актинового цитоскелета, аналогичный периоду поздней защиты тепловым шоком.

В целом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что HSP27 участвует в защите ЭК от истощения АТФ, препятствуя разрушению актиновых филаментов клеток и, что эта функция осуществляется фосфорилированным HSP27. Полученные данные также позволяют считать, что предотвращение дефосфорилирования HSP27 во время ишемического стресса может обусловливать феномены как ранней, так и поздней защиты ЭК тепловым шоком.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Локтионова, Светлана Анатольевна, 1998 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Антонов А.С., Крушинский А.В., Николаева М.А., Флегель Х.-Г. первичная культура эндотелиальных клеток из пупочной вены человека: идентификация и характеристика растущей и конфлуентной культуры // Цитология.-1981.- Т. XXIII.- С. 1154-1159.

2. Меерсон Ф.З, Шнейдер А.Б., Устинова Е.Е. Сравнительная оценка защитного эффекта адаптации к периодической гипоксии и стрессорным воздействиям при инфаркте миокарда // Кардиология,- 1990,- N 9,- С. 67-69.

3. Меерсон Ф.З., Малышев И.Ю. Феномен адаптационной стабилизации структур и защита сердца.- М: Наука, 1993.

4. Abravaya К., Myers М.Р., Murphy S.P., Morimoto R.I. The human heat shock protein Hsp70 interacts with HSF, the transcription factor that regulates heat shock gene expression // Genes Dev.- 1992.-V. 6,- P. 1153-1164.

5. Agsteribbe E., Huckriede A., Veenhuis M. et al. A fatal, systemic mitochondrial disease with decreased mitochondrial enzyme activities, abnormal ultrastructure of heat shock protein 60 // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1993,- V. 193.- P. 146-154.

6. Ahlers A., Belka C., Gaestel M., Lamping N. et al. lnterleukin-1-induced intracellular signaling pathways converge in the activation of mitogen-activated protein kinase and mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 and subsequent phosphorylation of the 27-kilodalton heat shock protein in monocytic cells // Mol. Pharmacol.- 1994a.-V. 46.- P. 1077-1083.

7. Ahlers A., Engel K., Sott C., Gaestel M., Herrman F., Brach M.A. lnterleukin-3 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor induce activation of the MAPKAP kinase 2 resulting in vitro serine phosphorylation of the small heat shock protein (HSP27) // Blood.-1994b.-V. 83,-P. 1791-1798.

8. Akiyama K., Akopian G., Jinadasa P. et al. Myocardial infarction and regulatory myosin light chain // J. Mol. Cell Cardiol.- 1997.- V. 29,- P. 2641-2652.

9. Akner G., Mossberg K., Sundquist K-G et al. Evidence for reversible, non-microtubule and

non-microfilamerit-dependent nuclear translocation of HSP90 after heat shock in human fibroblasts // Eur. J. Cell. Biol.- 1992.- V. 58,- P. 356-364.

lO.Amin V., Cumming D.V., Latchman D.S. Over-expression of heat shock protein 70 protects astrocytes from combined oxygen-glucose deprivation // Neuroreport.- 1996,- V. 7.- P. 429432.

H.Amrani M., Latif N., Morrison K. et ai. Relative induction of heat shock protein in coronary endothelial cells and cardiomyocytes: implications for myocardial protection // J. Thorac. Cardiovasc. Surg.- 1998.-V. 115,- P. 200-209.

12.Andres J., Sharma H.S., Knoll R., Stahl J. etal. Expression of heat shock proteins in the normal and stunned porcine myocardium // Cardiovasc. Res.- 1993.- V. 27,- P. 14211429.

13.Angelidis C.E., Lazaridis I., Pagoulatos G.N. Constitutive expression of heat-shock protein 70 in mammalian cells confers thermoresistance // Eur. J. Biochem.-1991.- V. 199.- P. 3539.

14.Antonov A.S., Nikolaeva M.A., Klueva T.S. et al. Primary culture of endothelial cells from atherosclerotic human aorta. Part 1. Identification, morphologycal and ultrastructural characteristics of two endothelial cells subpopulations // Atherosclerosis.- 1986.- V. 59,- P. 1-19.

15.Aoki M., Abe K., Kawagoe J. et al. The preconditioned hippocampus accelerates HSP70 heat shock gene expression following transient ischemia in the gerbil II Neurosci Lett.-1993,-V. 155.-P. 7-10.

16.Aoyama A., Frohli E., Schafer R., Klemenz R. alfaB-crystallin expression in mouse NIH 3T3 fibroblasts: glucocorticoid responsiveness and involvement in thermal protection // Mol. Cell. Biol.- 1993.-V. 13,- P. 1824-1835.

17.Armstrong S.C. and Ganóte C.E. Flow cytometric analysis of isolated adult cardiomyocytes: vinculin and tubulin fluorescence during metabolic inhibition and ischemia // J. Mol. Cell. Cardiol.- 1992a.-V. 24,- 149-162.

18.Armstrong S.C. and Ganóte C.E. Effects of the protein phosphatase inhibitors okadaic acid and calyculin A on metabolically inhibited and ischaemic isolated myocytes // J. Mol. Cell. Cardiol.- 1992b.-V. 24,- P. 869-884.

19.Arrigo A.P., Suhan J.P., Welch W.J. Dynamic changes in the structure and intracellular locate of the mammalian low-molecular-weight heat shock protein // Mol. Cell. Biol.- 1988,-V. 8,-P. 5059-5071.

20.Arrigo A.P. Tumor necrosis factor alfa induces the rapid phosphorylation of the mammalian low molecular weight heat shock protein HSP28 // Mol. Cell. Biol.- 1990,- V. 10.- P. 12761280.

21.Arrigo A.P., Landry J. Expression and function of the low-molecular-weight heat shock proteins // The Biology of Stress Proteins and Molecular Chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 335-373.

22.Bacallao R., Gafinkel A., Monke S. et al. ATP depletion: a novel method to study junctional properties in epithelial tissues. I. Rearrangement of the actin cytoskeleton // J. Cell Sci.-1994,-V. 107,- P. 3301-3313.

23.Baler R., Welch W.J., Voellmy R. Heat shock gene regulation by nascent polypeptides and denatured proteins: HSP70 as a potential autoregulatory factor // J. Cell. Biol.- 1992,- V. 117,-P. 1151-1159.

24.Baler R., Zou J., Voellmy R. Evidence for a role of HSP70 in the regulation of the heat shock response in mammalian cells / Cell Stress Chaperones.-1996.- V. 1.- P. 33-39.

25.Bansal G.S., Notrton P.M., Latchman D.S. The 90-kDa heat shock protein protects mammalian cells from thermal stress but not from viral infection // Ex. Cell Res.- 1991,- V. 195.-P. 303-306.

26.Barbato R., Menabo R., Dainese P. et al. Binding of cytosolic proteins to myofibrils in ischemic rat hearts // Circ. Res.- 1996,- V. 78,- P. 821-828.

27.Barry M.A., Eastman A. Endonuclease activation during apoptosis: the role of cytosolic Ca2+

and pH // Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1992,-V. 186,- P. 782-789.

28.Barry M.A., Eastman A. Identification of deoxyribonuclease II as an endonuclease involved in apoptosis //Arch. Biochem. Biophys.- 1993,- V. 300,- P. 440-450.

29.Beckmann R.P., Mizzen L.A., Welch W.J. Interaction of HSP70 with newly synthesized proteins: Implications for protein folding and assembly // Science.- 1990,- V. 248,- P. 850854.

30.Behlke J., Lutsch G., Gaestel M., Bielka H. Supramolecular structure of the recombinant murine small heat shock protein HSP25 // FEBS Lett.-1991.- V. 288,- P. 119-122.

31.Belka C,, Ahlers A., Sott C. et al. Interleukin (IL)-6 signaling leads to the phosphorylation of the small heat shock protein (HSP)27 through activation of the MAP kinase and MAPKAP kinase 2 pathway in monocytes and monocytic leukemia cells // Leukemia.- 1995,- V. 9.- P. 288.

32.Benjamin I.J, Williams R.S. Expression and function of stress proteins in the ischemic heart // The Biology of stress heat shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 533-552.

33.Benjamin I.J., Horie S., Greenberg M.L.. et al. Induction of stress proteins in cultured myogenic cells: Molecular signals for the activation of heat shock transcription factor during ischemia //J. Clin. Invest.-1992,-V. 89.- P. 1685-1689.

34.Bennardini F., Wrzosek A., Chiesi M. aB-crystallin in cardiac tissue. Association with actin and desmin filaments // Circ. Res.-1992.-V. 71,- P. 288-294.

35.Benndorf R., Hayeb K., Ryazantsev S. et al. Phosphorylation and supramolecular organization of murine small heat shock protein HSP25 abolish its actin polymerization-inhibiting activity //J. Biol. Chem.-1994,-V. 269.- P. 20780-20784.

36.Bensaude O., Pinto M., Dubois M-F. et al. Protein denaturation during heat-shock and related stresses II Stress Proteins. Induction and Function / Ed. M.J. Schlesinger, G. Santoro, E. Garaci, Spinger Verlag, Berlin, 1990. P. 89-99.

37.Bensaude O., Bellier S., Dubois M-F. et al. Heat-shock induced protein modifications and modulation of enzyme activities // Stress-lnducible Cellular Responses / Ed. U.Feige, R.I. Morimoto, B. Polla Birkhauser Verlag, Basel, 1996. P. 199-219.

38.Bershadsky A.D., Gelfand V.l., Svitkina T.M., Tint I.S. Destruction of microfilament bundles in mouse embryo fibroblasts treated with inhibitors of energy metabolism // Exp. Cell Res.- 1980,-V. 127.-P. 421-429.

39.Bershadsky A.D., Gelfandt V.l. Role of ATP in the regulation of stability of cytoskeletal structures // Cell Biol. Int. Rep.- 1983,- V. 7,- P. 173-187.

40.Bhat R., Weaver J.A., Wagner C. et al. ATP depletion affects the phosphorylation state, ligand binding, and nuclear transport of the 4 S polycyclic aromatic hydrocarbon-binding protein in rat hepatoma cells //J. Biol. Chem.- 1996,- V. 271,- P. 32551-32556.

41.Bhat S.P., Nagineni C.N. alfaB subunit of lens-specific protein alfa-crystallin is present in othe ocular and non-ocular tissues // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1989,- V. 158,- P. 319-325.

42.Bhattacharyya T., Karnezis A.N., Muphy S.P. et al. Cloning and subcellular localization of human mitochondrial HSP70//J. Biol. Chem.- 1995,-V. 270.-P. 1705-1710.

43.Bird T.A., Schule H.D., Delaney P. et al. The interleukin-1-stimulated protein kinase that phosphorylates heat shock protein hsp27 is activated by MAP kinase // FEBS Lett.- 1994,-V. 338,-P. 31-36.

44.Bohen S.P. Yamamoto K.R. Modulation of steroid receptor signal transduction by heat shock proteins // The biology of heat shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 313-334.

45.Bond J.M., Herman B., Lemasters J.J. Protection by acidotic pH against anoxia/reoxigenation injury to rat neonatal cardiac myocytes // Biochem. Biophys. Res. Comm.-1991,-V. 179.- P. 798-803.

46.Bond J.M., Chacon E., Herman B. et al. Intracellular pH and Ca2+ homeostasis in the pH paradox of reperfusion injury to neonatal rat cardiac myocytes // Am. J. Physiol.- 1993,- V.

265.-P. C129-C137.

47.Bond U., Schlesinger M.J. Heat-shock proteins and development // Adv. Genet.- 1987.- V. 24,- P. 1-29.

48.Borkan S.C., Wang Y-H., Lieberthal W. et al. Heat stress ameliorates ATP depletion-induced sublethal injury in mouse proximal tubule cells //Am. J. Physiol.- 1997,- V. 272,- P. F347-F355.

49.Bowen J. W., Levinson C. Evidence for monovalent phosphate transport in Ehrlich ascites tumor cells//J. Cell. Physiol.- 1983,-V. 116,- P. 142-148.

50.Brandwell J.C.A., Craig E.A. Ancient heat shock gene is dispensable // J. Bacterid.- 1988,-V. 170,-P. 2977-2983.

51.Braunton J.L., Wong V., Wang W. et al. Reduction of tyrosine kinase activity and protein tyrosine dephosphorylation by anoxic stimulation in vitro // Neuroscience.- 1998.- V. 82.- P. 161-170.

52.Bristow J.D., Arai A.E., Anselone C.G. et al. Response to myocardial ischemia as a regulated process // Circulation.-1991.- V. 84,- P. 2580-2587.

53.Brodsky J.L., Schekman R. Heat shock cognate proteins and polypeptide translocation across the endoplasmic reticulum membrane // The biology of heat shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 85-109.

54.Cairns J., Qin S., Philp R., Tan Y.H., Guy G.R. Dephosphorylation of the small heat shock protein HSP27 in vivo by protein phosphatase 2A // J. Biol. Chem.-1994,- V. 269,- P. 91769183.

55.Carlier M-F, Jean C., Rieger K.J. et al. Modulation of the interaction between G-actin and thymosin b4 by the ATP/ADP ratio: Possible implication in the regulation of actin dynamics // Proc. Natl. Acad. Sci. USA - 1993.- V. 90,- P. 5034-5038.

56.Caspers G.J., Leunissen J.A., de-Jong W.W. The expanding small heat-shock protein family, and structure predictions of the conserved "alfa-crystallin domain" // J. Mol. Evol.-

1995.-V. 40,-P. 238-248.

57.Chang Z., Primm T.P., Jakana J. et al. Mycobacterium tuberculosis 16-kDa antigen (HSP16.3) functions as an oligomeric structure in vitro to suppress thermal aggregation // J. Biol. Chem.-1996,- V. 271.- P. 7218-7223.

58.Chen J., Martin B.L., Brautigan D.L. Regulation of protein serine-threonine phosphatase type-2A by tyrosine phosphorylation // Science.-1992.- V. 257,- P. 1261-1264.

59.Chen J., Cohn J., Mandel L. Dephosphorylation of ezrin as an early event in renal microvillar breakdown and anoxic injury // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1995,- V. 92.- P. 7495-7499.

60.Chen J., Mandel L. Unopposed phosphatase action initiates ezrin dysfunction: potential mechanism for anoxic injury//Am. J. Physiol.- 1997,-V. 273,- p. c710-C716.

61.Chiesa R., Gawinowicz-Kolks M.A., Kleiman N.J., Spector A. The phosphorylation sites of the B2 chain of bovine alfa-crystallin // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1987,- V. 144,-P. 1340-1347.

62.Chiesa R., McDermott M.J., Mann E., Spector A. The apperent molecular size of native alfa-crystallin B in non-lenticular tissues// FEBS Lett.- 1990,- V. 268.- P. 222-226.

63.Chiesi M., Longoni S., Limbruno U. Cardiac alpha-crystallin. Involvement during heart ischemia // Mol. Cell. Biochem.- 1990,-V. 97,- P. 129-136.

64.Ciocca D.R., Oesterreich S., Chamness G.C. et al. Biological and clinical implication of heat shock protein 27000 (HSP27): a review//J. Natl. Cancer lns.-1993.- V. 85,- P. 1558-1570.

65.Ciocca D.R., Green S., Elledge R.M. et al. Heat shock proteins HSP27 and HSP70: lack of correlation with response to tamoxifen and clinical course of disease in estrogen receptor-positive metastatic breast cancer // Clin. Cancer. Res.- 1998.- V. 4.- P. 1263-1266.

66.Collier N.C., Heuser J., Levy M.A., Schlesinger M.J. Ultrastructural and biochemical analysis of the stress granules in chicken embryo fibroblasts // J. Cell. Biol.- 1988.- V. 106.-P. 1131-1139.

67.Conde A.G., Lau S.S., Dillmann W.H., Mestril R. Induction of heat shock proteins by

tyrosine kinase inhibitors in rat cardiomyocytes and myogenic cells confers protection against simulated ischemia // J. Mol. Cell Cardiol.- 1997,- V. 29.- P. 1927-1938.

68.Corton J.M., Gillespie J.G. Hardie D.G. Role of the AMP-activated protein kinase in the cellular stress response // Current Biology.-1994.- V. 4,- P. 315-324.

69.Crawford L.E., Milliken E.E., Irani K. et al. Superoxide-mediated actin response in post-hypoxic endothelial cells // J. Biol. Chem.- 1996,- V. 271.- P. 26863-26867.

70.Crete P., Landry J. Induction of HSP27 phosphorylation and thermoresistance in Chinese hamster cells by arsenite, cycloheximide, A23187, and EGTA // Radiat. Res.- 1990,- V.-121.- P. 320-327.

71.Csermely P., Kajtar J., Hollosi M. et al. The 90 kDa heat shock protein (hsp90) induces the condensation of the chromatin structure // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1994,- V. 202,-P. 1657-1663.

72.Csermely P., Miyata Y., Soti C., Yahara I. Binding affinity of proteins to HSP90 correlates with both hydrophobicity and positive charges. A surface plasmon resonance study // Life Sci.-1997,- V. 61.- P. 411-418.

73.Currie R.W. Effects of ischemia and perfusion temperature on the synthesis of stress-induced (heat shock) proteins in isolated and perfused rat hearts // J. Mol. Cell Cardiol.-1987.-V. 19.-P. 795-808.

74.Currie R.W., Karmazyn M., Kloc M., Mailer K. Heat shock response is associated with enhanced post-ischemic ventricular recovery // Circ. Res.- 1988,- V. 63,- P. 543-549.

75.Currie R.W., Karmazyn M. Improved post-ischemic ventricular recovery in the absence of changes in energy metabolism in working rat hearts following heat shock // J. Mol. Cell Cardiol.- 1990.-V. 22,- P. 631-636.

76.Currie R.W., Tanguay R.M., Kingma J.G. Heat-shock response and limitation of tissue necrosis during occlusion/reperfusion in rabbit hearts // Circulation.- 1993,- V. 87.- P. 963971.

77.Dawson T.L., Gores G. J., Nieminen A-L. et al. Mitochondria as a source of reactive oxygen

species during reductive stress in rat hepatocytes // Am. J. Physiol.- 1993,- V. 264,- P. C961-C967.

78.DeLuca-Flaherty C., McKay D.B., Parham P., Hill B.L. Uncoating protein (hsp70) binds a conformationally labile domain of clathrin light chain LC to stimulate ATP hydrolysis // Cell.-1990.-V. 62.- P. 875-887.

79.Dice J.F., Agarraberes F., Kirven-Brooks M. et al. Heat shock 70-kDa proteins and lysosomal proteolysis // The biology of heat shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1i. P.137-151.

80.Donnelly T.J., Sievers R.E., Vissern F.L.J, et al. Heat shock protein induction in rat hearts: A role for improved myocardial salvage after ischemia and reperfusion // Circulation.- 1992,-V. 85.- P. 769-778.

81.Drenckhahn D., Ness V. The endothelial contractile cytoskeleton // Vascular endothelium / Eds. Born G.V.R., Schwartz c.J.- Stuttgart, 1997. P. 1-25.

82.Engel K., Ahlers A., Brach M.A. et al. MAPKAP kinase 2 is activated by heat shock and TNF-alpha: in vivo phosphorylation of small heat shock protein results from stimulation of the MAP kinase kaskade // J. Cell. Biochem.- 1995,- V. 57,- P. 321-330.

83.Ehrnsperger M., Buchner J. Structure and function of small heat-shock proteins // Molecular shaperones in the life cycle of proteins / Ed. Fink A.I., Goto Y. NY, 1997(a). P. 533-575.

84.Ehrnsperger M., GraberS., Gaestel M., Buchner J. Binding of non-native protein to HSP25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation // EMBO J.-1997(b).-V. 16,-P. 221-229.

85.Favatier F, Bornman L., Hightower L.E.. et al. Variation in HSP gene expression and HSP polymorphism: do they contribute to differential disease susceptibility and stress tolerance // Cell Stress and Chaperones.- 1997.-V. 2.- P. 141-155.

86.Fernandes M., O'Brien T., Lis J.T. Structure and regulation of heat shock gene promoters // The biology of heart shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 375-393.

87.Freshney N.W., Rawlinson L., Guesdon F. et al. lnterleukin-1 activates a novel protein kinase cascade that results in the phosphorylation of Hsp27 // Cell.- 1994,- V. 78,- P. 10391049.

88.Frydman J., Hartl F.U. Molecular chaperone functions of HSP70 and HSP60 in proteins folding // The biology of heart shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 251-283.

89.Gabai V.L., Kabakov A.E., Mosin A.F. Association of blebbing with assembly of cytoskeletal proteins in ATP-depleted EL-4 ascites tumour cells//Tissue & Cell.- 1992.-V.- 24.-P. 171-177.

90.Gabai V.L., Kabakov A.E. Tumor cell resistance to energy deprivation can be determined by the actin skeleton stability // Cancer Lett.- 1993a.- V. 70,- P. 25-31.

91.Gabai V.L., Kabakov A.E. Rise in heat-shock protein level confers tolerance to energy deprivation // FEBS Lett.- 1993b.- V. 327,- P. 247-250.

92.Gabai V.L., Meriin A.B., Mosser D.D. et al. Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance // J. Biol. Chem.- 1997,- V. 272.- P. 1803318037.

93.Gaestel M., Schroder W., Benndorf R. et al. Identification of the phosphorylation sites of the murine small heat shock protein HSP25 //J. Biol. Chem.-1991,-v. 266.- P. 14721-14724.

94.Gaestel M., Benndorf R., Hayess K. et al. Dephosphorylation of the small heat shock protein HSP25 by calcium/calmodulin-dependent (type 2B) protein phosphatase // J. Biol. Chem.-1992,- V. 267,- p. 21607-21611.

95.Gandour E.R., Trock B.J., Gumeriock P., Donald P.J. Heat shock protein and p53 expression in head and neck squamous cell carcinoma // Otolaryngol. Head Neck. Surg.-1998.-V. 118,- P. 610-615.

96.Ganóte C.E., Vander Heide R.S. Cytoskeletal lesions in anoxic myocardial injury: a conventional and high voltage electron microscopic and immunofluorescence study // Am. J. Pathol.- 1987.-V.-129,- P. 327-344.

97.Ganóte C., Armstrong S. Ischaemia and the myocyte cytoskeleton: review and speculation // Cardiovasc. Res.-1993,-V. 27.- P. 1387-1403.

98.GarramoneR.R.J.; Winters R.M., Das D.K. et al. Reduction of skeletal muscle injury through stress conditioning using the heat-shock response // Plastic Reconstructive Surgery.- 1994.-V. 93.-P. 1242-1247.

99.Garcia J.G.N. Molecular mechanisms of trombin-induced human and bovin endothelial cell activation // J. Lab. Clin. Med.- 1992,- V. 120,- P. 513-529.

100.Garcia J.G.N., Schaphorst K.L. Regulation of endothelial cell gap formation and paracellular permeability // J. Investig. Med.- 1995,- V. 43.- P. 117-126.

101.Georgopouios C., Welch W.J. Role of major heat shock proteins as molecular shaperones // Annu. Rev. Cell. Biol.- 1993,- V. 9,- P. 601-634.

102.Gernold M., Knauf U., Gaestel M., Stahl J., Kloetzel P.M. Development and tissue-specific distribution of mouse small heat shock protein HSP25 // Dev. Genet.- 1993.- V. 14.- P. 103111.

103.Gething M.J., Sambrook J. Protein folding in the cell // Nature.-1992,- V.- 355,- P. 33-45.

104.Gething M.J., Blond-elguindi S., Mori K., Sambrook J.F. Structure, function, and regulation of the endoplasmic reticulum chaperone, BiP // The biology of heat shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 11-135.

105.Gimbrone M.A. Culture of vascular endothelium // Prog. Hemostas. Thromb.- 1976,- V. 3.-P. 1-28.

106.Gores G.J., Nieminen A-L, Fleishman K.E. et al. Extracellular acidosis delays onset of cell death in ATP-depleted hepatocytes//Am. J. Physiol.- 1988,-V. 255.- P. C315-C322.

107.Gores G.J., Nieminen A-L., Wray B.E. et al. Intracellular pH during "chemical hypoxia" in cultured rat hepatocytes // J. Clin. Invest.-1989,- V. 83.- P. 386-396.

108.Gotlieb A.I., Langille B.L., Wong M.K.K., Kim D.W. Biology of disease. Stucture and function of the endothelial cytoskeleton // Lab. Invest.-1991,-V. 65.- P. 123-137.

109.Guay J,, Lambert H., Gingras-Breton G. et al. Regulation of actin filament dynamics by p38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J. Cell Sci.- 1997,- V. 110.-P. 357-368.

HO.Gudi T., Gupta C. HSP70-like protein in rhesus erythrocyte cytosol and its interactions with membrane skeleton under heat and pathologic stress // J. Biol. Chem. 1993,- V. 268,-P. 21344-21350.

111.Guesdon F., Waller R.J. Saklatvala J. Specific activation of beta-casein kinase by the inflammatory cytokines interleukin 1 and tumor necrosis factor // Biochem. J.- 1994,- V. 304,- P. 761-768.

112.Guo H., Damuni Z. Autophosphorylation-activated protein kinase phosphorylates and inactivates protein phosphatase 2A // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1993a.- V. 90.- P. 25002504.

113.Guo H., Reddy S.A., Damuni Z. Purification and characterization of an autophosphorylation-activated protein serine threonine kinase that phosphorylates and inactivates protein phosphatase 2A // J. Biol. Chem.- 1993b.- V. 268,- P. 11193-11198.

114.Guy G.R., Cao X., Chua S.P., Tan Y.H. Ocadaic acid mimics multiple changes in early protein phosphorylation and gene expression induced by tumor necrosis factor or interleukin-1 II J. Biol. Chem.-1992,-V. 267,- P. 1846-1852.

115.Guy G.R., Cairns J., Ng S.B., Tan Y.H. Inactivation of redox-sensitive protein phosphatase during the early events of tumor necrosis factor/interleukin-1 signal trunsduction // J. Biol. Chem.-1993,- V. 268,- P. 2141-2148.

116.Guy G.R., Philp R., Tan Y.H. Activation of protein kinases and the inactivation of protein phosphatase 2A in tumor necrosis factor and interleukin-1 signal trunsduction pathways // Eur. J. Biochem.- 1995,- V. 229,- P. 503-511.

117.Hart C.M., Andrteoli S.P., Patterson C.E., Garcia J.G.N. Oleac acid supplimentation reduces oxidant-mediated dysfunction of cultured porcine pulmonary artery endothelial cells // J. Cell. Physiol.-1993,- V. 156,- p. 24-34.

118.Haus U., Trommer P., Fisher P.R. et al. The heat shock cognate protein from Dictyostellium affects actin polymerization through interaction with the actin-binding protein cap32/34 // EMBO J.- 1993.-V. 12,- p. 3763-3771.

119.Hayashi Т., Takada K., Matsuda M. Post-transient ischemia increase in ubiquitin conjugates in the early reperfusion // Neuroreport.- 1992,- V. 3,- P. 519-520.

120.Hayashi Т., Tanaka J., Kamikubo T. et al. Increase in ubiquitin conjugates dependent on ischemic damage // Brain Res.- 1993.-V. 620.- P. 171-173.

121.Heads R.J., Yellon D.M., Latchman D.S. Differential cytoprotection against heat stress hypoxia following expression of specific stress protein genes in myogenic cells II J. Mol. Cell Cardiol.- 1995,- V. 27,- P. 1669-1678.

122.Heads R.J., Punn A., Marber M. The role of МАРК signal trunsduction pethways in the regulation of heat shock protein expression in myogenic cells and cardiac myocites // Abstracts. Molecular chaperones and the heat shock response. Cold Spring Harbor, USA, May 6-10 1998, P. 98.

123.Hegde R.S., Zup J., Voellmy R., Welch W. Short circuiting stress protein expression via a tyrosine kinase inhibitor, herbimycin A//J. Cell. Physiol.- 1995,-V. 165,- P. 186-200.

124.Higashi Т., Nakai A., Uemura Y. Activation of heat shock factor 1 in rat brain during cerebral ischemia or after heat shock // Mol. Brain Res.-1995.- V. 34,- P. 262-270.

125.Hinshaw D.B., Armstrong B.C., Beals T.F., Hyslop P.A. A cellular model of endothelial cell ischemia II J. Surg. Res.- 1988а,- V. 44,- P 527-537.

126.Hinshaw D.B., Armstrong B.C., Burger J.M. et al. ATP and microfilaments in cellular oxidant injury//Am. J. Pathol.- 1988b.-V. 132.- P. 479-488.

127.Hinshaw D.B., Burger J.M., Miller M.T. et al. ATP depletion induces an increase in the assembly of a labile pool of polymerized actin in endothelial cells // Am. J. Physiol.- 1993.-V. 264.-P. C1171-C1179.

128.Hoch В., Lutsch G., Schlegel W-P. et al. HSP25 in isolated perfused rat heart: localization and response to hyperthermia II Mol. Cell. Biochem.-1996,- V. 160/161.- P. 231-239.

129.Hu L.M., Bodwell J., Hu J.M. et al. Glucocorticoid receptors in ATP-depleted cells. Dephosphorylation, loss of hormone binding, HSp90 dissociation, and ATP-dependent cycling //J. Biol. Chem.-1994.-V. 269,- P. 6571-6577.

130.Huot J., Lambert H., Lavoie J.N. et al. Characterization of 45-kDa/54-kDa HSP27 kinase, a stress-sensitive kinase which may activate the phosphorylation-dependent protective function of mammalian 27-kDa heat-shock protein HSP27 // Eur. J. Biochem.- 1995,- V. 227,-P. 416-427.

131.Huot J., Houle F., Spitz D.R., Landry J. HSP27 phosphorylation-mediated resistance against actin fragmentation and cell death induced by oxidative stress // Cancer Res.-1996,- V. 56,- P. 273-279.

132.Huot J., Houle F., Marceau F., Landry J. Oxidative stress-induced actin reorganization mediated by the p38 mitogen-activated protein kinase/heat shock protein 27 pathway in vascular endothelial cells // Circ. Res.- 1997,- V. 80,- P. 3830392.

133.Hutter M.M., Sievers R.E., Barbosa V., Wolfe C.L. Heat-shock protein induction in rat hearts. A direct correlation between the amount of heat-shock protein induced and the degree of myocardial protection // Circulation.- 1994,- V. 89.- P. 355-360.

134.Jakob U., Gaestel M., Engel K., Buchner J. Small heat shock proteins are molecular chaperones // J. Biol. Chem.- 1993,- V. 268,- P. 1517-1520.

135.Janmey P.A., Hvidt S., Oster G.F. et al. Effect of ATP on actin filament stiffness // Nature (London).- 1990,- V. 347,- P. 44-49.

136.Jungbluth A., Eckerskorn C., Gerisch G. et al. Stress-induced tyrosine phosphorylation of actin in Dictyostelium cells and localization of the phosphorylation site to tyrosine-53 adjacent to the DNase I binding loop // FEBS Lett.- 1996.- V. 375,- P. 87-90.

137.Kabakov A.E., Gabai V.L. Protein aggregation as primary and characteristic cell reaction to various stresses // Experientia.-1993.- V. 49,- P. 706-710.

138.Kabakov A.E., Gabai V.L. Stress-induced ^solubilization of certain proteins in ascites tumor cells//Arch. Biochem. Biophys.- 1994a.-V. 309,- P. 247-253.

139.Kabakov A.E., Gabai V.L. Heat-shock proteins maintain the viability of ATP-deprived cells: what is the mechanism? // Trends Cell Biol.- 1994b.- V. 4,- P. 193-196.

140.Kabakov A.E., Gabai V.L. Heat shock-induced accumulation of 70-kDa stress-protein (HSP70) can protect tumor cells from necrosis // Exp. Cell Res.-1995.- V. 217,- P. 15-21.

141.Kabakov A.E. and Gabai V.L. // Heat Shock Proteins and Cytoprotection: ATP-Deprived Mammalian Cells / The Molecular Biology Intelligence Unit series, R.G. Landes Company.-Austin, TX, 1997.

142.Kamikubo T., Hayashi T. Changes in proteasome activity following transient ischemia // Neurochem. Int.- 1996,-V. 28,- P. 209-212.

143.Karmazyn M., Mailer K., Currie R.W. Acquisition and decay of heat-shock-enhanced postishemic ventricular recovery // Am. J. Physiol.- 1990.- V. 259,- P. H424-H431.

144.Kasahara K., Ikuta T., Chida K. et al. Rapid phosphorylation of 28-kDa heat-shock protein by treatment with okadaic acid and phorbol ester of BALM/MK-2 mouse keratinocytes // J. Biochem.- 1993,- V. 213.- P. 1101 -1107.

145.Kato K., Shinovada H., Kurobe N., Inaguma Y., Shimizu K., Ohshima K Tissue distribution and developmental profiles of immunoreactive alfa B-crystallin in the rat determined with a sensitive immunoassay system // Biochem. Biophys. Acta.-1991.- V. 1074.- P. 201-208.

146.Kato K., Hasegava K., Goto S., Inaguma Y. Dissociation as a result of phosphorylation of an aggregated form of the small stress protein, HSP27 // J. Biol. Chem.- 1994a.- V. 269,- P. 11274-11278.

147.Kato H., Liu Y., Kogure K., Kato K. Induction of 27-kDa heat shock protein following cerebral ischemia in a rat model of ischemic tolerance // Brain Res.- 1994b.- V. 634,- P. 235-244.

148.Kaur P., Welch W.J., Saklatvala J. Interleukin 1 and tumour necrosis factor increase phosphorylation of the small heat shock protein. Effects in fibroblasts, Hep G2 and U937 cells // FEBS Lett.- 1989,- V. 258,- P. 269-273.

149.Klementz R., Andres A.C., Frohli E., Schafer R., Aoyama A. Expression of the murine

small heat shock protein HSP25 and alfa B-crystallin in the absence of stress // J. Cell. Biol.- 1993,-V. 120,- P. 639-645.

150.Knauf U., Bielka H., Gaestel M. Over-expression of the small heat shock protein HSP25 inhibits growth of Ehrlich ascites tumor cells // FEBS Lett.- 1992.- V. 309,- P. 297-302.

151.Knauf U., Jakob U., Engel K. et al. Stress- and mitogen-induced phosphorylation of the small heat shock protein Hsp25 by MAPKAP kinase 2 is not essential for chaperone properties and cellular thermoresistance // EMBO J.-1994.- V. 13,- P. 54-60.

152.Knowlton A.A., Kapadia S., Torre-Amione G. et al. Different expression of heat shock proteins in normal and failing human hearts // J. Mol. Cell. Cardiol.- 1998,- V. 30,- P. 811818.

153.Kontos M., Shipley J.B., Kukreja R.C. Heat stress improves functional recovery and induces synthesis of 27- and 70-kDa heat shock proteins without preserving sarcoplasmic reticulum function in the ischemic rat heart // J. Mol. Cell. Cardiol.- 1996,- V.- 28,- P. 18851894.

154.Koyasu S., Nishida E,, Kadowaki T., Matsuzaki F. et al. Two mammalian heat shock proteins, HSP90 and HSP100, are actin-binding proteins // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1986,- V. 83,- P. 8054-8058.

155.Kuhne W., Besselmann M., Noll T. et al. Disintegration of cytoskeletal structure of actin filaments in energy-depleted endothelial cells //Am. J. Physiol.- 1993,- V. 264,- P. H1599-H1608.

156.Kyriakis J.M., Avruch J. Protein kinase cascades activated by stress and inflammatory cytokines // BioEssayes.- 1996.-V. 18,- P. 567-577.

157.Laham L.E., Way M., Yin H.L., Janmey P.A. Identification of two sites in gelsolin with different sensitivities to adenine nucleotides // Eur. J. Biochem.-1995,- V. 234,- P. 1-7.

158.Landry J., Chretien P., Lambert H., Hickey E., Weber L.A. Heat shock resistance conferred by expression of the human HSP27 gene in rodent cells // J. Cell. Biol.- 1989,- V. 109,- P. 7-15.

159.Landry J., Lambert H., Zhou M., Lavoie J.N., Hickey E., Weber L.A., Anderson C.W. Human HSP27 is phosphorylated at serines 78 and 82 by heat shock and mitogen-activated kinases that recognize the same amino acid motif as S6 kinase II // J. Biol. Chem.-1992.-V. 267,- p. 794-803.

160.Langer T., Neupert W. Chaperoning mitochondrial biogenesis // The biology of heat shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.-Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 53-83.

161.Larson J.S., Schuets T.J., Kingston R.E. In vitro activation of purifaed human heat shock factor by heat // Biochemistry.- 1995,- V. 34.- P. 1902-1911.

162.Laszlo A. The effects of hyperthermia on mammalian cell structure and function // Cell Prolif.- 1992,- V. 25,- P. 59-87.

163.La Thangue N.B. A major heat-shock protein defined by a monoclonal antibody // EMBO J.-1984,-V. 3.-P. 1871-1879.

164.Lau S., Patnaik N., Sayen M.R., Mestril R. Simultaneous overexpression of two stress proteins in rat cardiomyocytes and myogenic cells confers protection against ischemia-induced injury // Circulation.-1997.- V. 96,- P. 2287-2294.

165.Lavoie J.N., Hickey E., Weber L.A., Landry J. Modulation of actin microfilament dynamics and fluid phase pinocytosis by phosphorylation of heat shock protein HSP27 // J. Biol. Chem.- 1993a.-v. 268,- p. 3420-3429.

166.Lavoie J.N., Gingras-Breton G., Tanguay R.M., Landry J. Induction of Chine hamster HSP27 gene expression in mouse cells confers resistance to heat shock // J. Biol. Chem.-1993b.- V. 268.- P. 3420-3429.

167.Lavoie J.N., Lambert H., Hickey E. et al. Modulation of cellular termoresistance and actin filament stability accompanies phosphorylation of heat shock protein 27. // Mol. Cell. Biol. -1995-V. 15-P. 505-516.

168.Lee G.J., Pokala n., Vierling E. Structure and in vitro molecular chaperone activity of cytosolic small heat shock proteins from pea // J. Biol. Chem.- 1995.-V. 270,- P. 10432-

10438.

169.Lee G.J., Roseman A.M., Saibil H.R., Vierling E. A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state //EMBO J.-1997.-V. 16,-P. 659-671.

170.Lee Y.J., Hou Z., Curetty L., Corry P. Expression, synthesis, and phosphorylation of HSP28 family during development and decay of thermotolerance in CHO plateau-phase cells// J. Cell. Physiol.- 1992,-V. 150,- P. 441-446.

171.Legagneux V., Morange M., Bensaude O. Heat shock increases turnover of 90-kDa heat shock protein phosphate groups in HeLa cells // FEBS Lett.-1991,-V. 291.- P. 359-362.

172.Li G.C., Li L., Liu Y.K. et al. Thermal response of rat fibroblasts stably transfected with the human 70-kDa heat shock protein-encoding gene // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1991.- V. 88.-P. 1681-1685.

173.Li S., Piotrowicz R.S., Levin E.G. et al. Fluid shear stress induces the phosphorylation of small heat shock proteins in vascular endothelial cells // Am. J. Physiol.- 1996,- V. 271.- P. C994-C1000.

174.Li Y-M., Casida J.E. Cantharidin-binding protein: identification as protein phosphatase 2A // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992,-V. 89,- P. 11867-11870.

175.Liao J., lowthert L.A., Ghori N., Omary M.B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner // J. Biol. Chem.- 1995.-V. 270,-P. 915-922.

176.Lieberthal W., Menza S.A., Levine J. Graded ATP depletion can cause necrosis or apoptosis of cultured mouse proximal tubular cells // Am. J. Physiol.- 1998.- V. 274,- P. F315-F327.

177.Lindquist S., Craig E.A. The heat-shock proteins // Annu. Rev. Genet.- 1988.- V. 22.- P. 631-637.

178.Ludwig S., Engel K., Hoffmeyer A. et al. 3pK, a novel MAP kinase activated protein kinase is targeted by MAP kinase pethways // Mol. Cell. Biol.- 1996,-V. 16,- P. 6687-6697.

179.Malinak C., Silverstein F.S. Hypoxic-ischemic injury acutely disrupts microtubule-associated protein 2 immunostaining in neonatal rat brain // Biology Neonate.- 1996,- V. 69.- P. 257-267.

180.Mandel L.J., Doctor R.B., Bacallao R. ATP depletion: a novel method to study junctional properties in epithelial tissues. II. Internalization of Na+,K+- ATPase and E-cadherin // J. Cell Sci.- 1994.-V. 107,- P. 3315-3324.

181.Marber M.S., Latchman D.S., Walker J.M., Yellon D.M. Cardiac stress protein elevation 24 hours after brief ischemia or heat stress is associated with resistance to myocardial infarction // Circulation.- 1993,- V. 88,- P. 1264-1272.

182.Marber M.S., Walker J.M., Latchman D.S., Yellon D.M. Myocardial protection after whole body stress in the rabbit is dependent on metabolic substrate and is related to the amount of the inducible 70-kD heat stress protein // J. Clin. Invest.-1994,- V. 93,- P. 1087-1094.

183.Marber M.S., Mestril R., Chi S.H. et al. Overexpression of the rat inducible 70-kD heat stress protein in a transgenic mouse increases the resistance of the heart to ischemic injury //J. Clin. Invest.- 1995.-V. 95.- P. 1446-1456.

184.Marcussen M. Induction of cell surface blebbing by increased cellular Pi concentration // Biochem. J.-1996,-V. 318,- P. 955-958.

185.Marcussen M., Jvergaard-Hansen K., Rlenov H. Net uptake of orthophosphate in Ehrlich ascites tumor cells in the presence of purine riboside may be rate limiting for the expansion of the pool of ribonucleotides // Biochem. Biophys. Acta.-1994,-V. 1194,- P. 197-202.

186.Maro B., Bornens M. Reorganization of HeLa cell cytoskeleton induced by an uncoupler of oxidative phosphorylation // Nature (London).- 1982.- V. 295,- P. 334-336.

187.Martin J., Horwich A.L., Hartl F.U. Prevention of protein denaturation under heat stress by the chaperonin Hsp60 // Science.-1992,- V. 258,- P. 995-998.

188.Martin J.L, Mestril R., Hilal-Dandan R., Brunton L.L., Dillmann W.H. Small heat shock proteins and protection against ischemic injury in cardiac myocytes // Circulation.- 1997.- V. 96,- P. 4343-4348.

189.Maulik N., Watanabe M., Zu Y-L. et al. Ischemic preconditioning triggers the activation of MAP kinases and MAP KAP kinase 2 in rat heats // FEBS Letters.- 1996,- V. 396,- P. 233237.

190.McKay D.B., Wilbanks S.M., Flaherty K.M. et al. Stress-70 proteins and their interaction with nucleotides // The biology of heat shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C,- Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 153-177.

191.McLaughlin M.M., Kumar S., McDonnell P.C. et al. Identification of mitogen-activated protein (MAP) kinase-activated protein kinase-3, a novel substrate of CSBP p38 MAP kinase //J. Biol. Chem.- 1996.-V. 271,- P. 8488-8492.

192.Mechlen P., Schulze-Osthoff K., Arrigo A-P. Small stress proteins as novel regulator of apoptosis // J. Biol. Chem.- 1996.-V. 271,-P. 16510-16514.

193.Meerson F.Z., Malyshev I.Yu., Zamotrinsky A.V. Differences in adaptive stabilization of structures in response to stress and hypoxia relate with the accumulation of HSP70 isoforms // Mol. Cell Biochem.-1992,- V. 111,- P. 87-95.

194.Meerson F.Z., Malyshev I.Yu., Zamotrinsky A.V., Kopylov Yu.N. The role of HSP70 and IP3-DAG mechanism in the adaptive stabilization of structures and heart protection // J. Mol. Cell Cardiol.- 1996,-V. 28.- P. 835-843.

195.Mehlen P., Mehlen A., Guillet d et al. Tumor necrosis factor-alfa induces changes in in the phosphorylation, cellular localization and oligomerization of human HSP27, a stress protein that confers cellular resistence to this cytokine // J. Cell. Bioche.-1995,- V. 58.- p. 248-259.

196.Mehlen P., Kretz-Remy C., Preville X., Arrigo A-P. Human HSP27, Drosophila HSP27 and alpha-crystallin expression-mediated increase in glutathione is essential for the protective activity of these proteins against TNF-alpha-induced cell death // EMBO J.-1995,- V. 15,- P. 2695-2706.

197.Mehlen P., Mehlen A., Godet J., Arrigo A.P. Hsp27 as a switch between differentiation and apoptosis in murine embryonic stem cells // J. Biol. Chem.- 1997a.- V. 272.- P. 3165731665.

198.Mehlen P., Hickey E., Weber L.A., Arrigo A.P. Large unphosphorylated aggregates as the active germ of HSP27 which controls intracellular reactive oxygen species and glutathione levels and generates a protection against TNF-alfa in NIH-3T3-ras cells // Biochem. Biophys. Res. Comm.- 1997b.-V. 241,- P. 187-192.

199.Mehta H.B., Popovich B.K., Dillman W.H. Ischemia induces changes in the level of mRNAs coding for stress protein 71 and creatine kinase M // Circ. Res.- 1988.- V. 63,- P. 512-517.

200.Mendelsohn M.E., Zhu Y., O'Neill S. The 29-kDa proteins phosphorylated in thrombin-activated human platelets are forms of the estrogen receptor-related 27-kda heat-shock protein //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1991,- V. 88.- P. 11212-11216.

201.Menon S.D., Qin S., Guy G.R., Tan Y.H. Differential induction of nuclear NF-kb by protein phosphatase inhibitors in primary and transformed human cells // J. Biol. Chem.- 1993,- V. 268.-P. 26805-26812.

202.Mestril R., Chi S-H, Sayen M.R. Dillmann W.H. Isolation of a novel inducible rat heat-shock protein (HSP70) gene and its expression during ischaemia/hypoxia and heat shock// Biochem. J.- 1994a.- V. 298,- P. 561-569.

203.Mestril R., Chi S-H, Sayen M.R. et al. Expression of inducible stress protein 70 in rat heart myogenic cells confers protection against simulated ischemia-induced injury // J. Clin. Invest.- 1994b.-V. 93,- P. 759-767.

204.Michels A.A., Kanon B., Konings A.W.T. et al. HSP70 and HSP40 chaperone activities in the cytoplasm and the nucleus of mammalian cells // J. Biol. Chem.- 1997.- V. 272.- P. 33283-33289.

205.Michishita M., Satoh M., Yamaguchi M. et al. Phosphorylation of the stress protein HSP27 is an early event in murine myelomonocytic leukemic cell differentiation induced by leukemia inhibitory factor/D-factor // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1991,- V. 176.- P. 979-984.

206.Mifflin L.C., Cohen R.E. HSC70 moderates the heat shock (stress) responce in Xenopus

laevis oocytes and binds to denatured protein inducers // J. Biol. Chem.- 1994.- V. 269.- P. 15718-15723.

207.Minowada G., Welch W. Variation in the expression and/or phosphorylation of the human low molecular weight stress protein during in vitro cell differentiation // J. Biol. Chem.- 1995,-V. 270,- P. 7047-7054.

208.Miron T., Wilchek M. and Geiger B. Characterization of an inhibitor of actin polymerization in vinculin-rich fraction of turkey gizzard smooth muscle. Eur. J. Biochem. 1988.- V. 178,- P. 543-553.

209.Miron T., Vancompernolle K., Vandekerckhove J. et al. A 25-kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein. J. Cell Biol. 1991,- V. 114,- P. 255-261.

210.Molitoris B.A., Geerdes A., Mclntoch J.R. Dissociation and redistribution of Na+,K+-ATPase from its surface membrane actin cytoskeletal complex during cellular ATP depletion // J. Clin. Invest.-1991,- V. 88.- P. 462-469.

211.Molony L., Armstrong L. Cytoskeletal reorganizations in human umbilical vein endothelial cells as a result of cytokine exposure // Exp. Cell. Res.-1991.- V. 196,- P. 40-48.

212.Moore F., Weekes J., Hardie D.G. Evidence that AMP triggers phosphorylation as well as direct allosteric activation of rat liver AMP-activated protein kinase // Eur. J. Biochem.-1991,-V. 199,- P. 691-697.

213.Morimoto R.I., Jurivich D.A., Kroeger P.E. et al. Regulation of heat shock gene transcription by a family of heat shock factors // The biology of heart shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 417-455.

214.Morimoto T., Ide T., Ihara Y. et al. Transient ischemia depletes free ubiquitin in the gerbil hippocampal CA1 neurons //Am. J. Pathol.- 1996,-V. 148,- P. 249-257.

215.Morris et al. Specific induction of the 70-kD heat stress proteins by the tyrosine kinase inhibitor herbimycin-A protects rat neonatal cardiomyocytes. A new pharmacological route

to stress protein expression // J. Clin. Invest.- 1996,- V. 97,- P. 706-712.

216.Mosser D.D., Duchaine J., Massie B. The DNA-binding activity of the human heat shock transcription factor is regulated in vivo by HSP70 / Mol. Cell. Biol.- 1993,- V. 13,- P. 54275438.

217.Murakami Y., Uehara Y,, Yamamoto C. et al. Induction of HSP72/73 by herbimycin A, an inhibitor of transformation by tyrosine kinase oncogenes // Exp. Cell Res.-1991,- V. 195,- P. 338-344.

218.Nadeau K., Das A., Walsh S.T. HSP90 chaperonins process ATP-ase activity and bind heat shock transcriptional factor and peptidyl prolyl isomerases // J. Biol. Chem.- 1993,- V. 268,- P. 1479-1487.

219.Nakai A., Satoh M., Hirayoshi K., Nagata K. Involvement of the stress protein HSP47 in procollagen processing in the endoplasmic reticulum // J. Cell. Biol.- 1992,- V. 117.- P. 903914.

220.Nguyen V.T., Bensaude O. Increased thermal aggregation of proteins in ATP-depleted mammalian cells // Eur. J. Biochem.-1994,- V. 220,- P. 239-246.

221.Nobes C.D., Hall A. Rho, rac, and cdc42 GTPases regulate the assembly of multimolecular focal complexes associated with actin stress fibers, lamellipodia, and filopodia //Cell.- 1995,-V. 81.- P. 53-62.

222.Noll T, Koop A, Piper H.M. Mitochondrial ATP-synthase activity in cardiomyocytes after aerobic-anaerobic metabolic transition //Am. J. Physiol.-1992.-V. 262.-P. C1297-C1303.

223.Nover L. // Heat Shock Response / Boca Raton: CRC Press, Inc.-1991. P. 509.

224.Nowak T.S., Abe H. Postischemic stress response in brain // The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones / Eds. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 553-576.

225,Oesterreich S., Weng C.N., Qiu M. et al. The small heat shock protein HSP27 is correlated with growth and drug resistance in human breast cancer cell lines // Cancer Res.- 1993,- V. 53,- P. 4443-4448.

226.Oh H.Ju., Chen X., Subjeck J.R. HSP110 protects heat-denatured proteins and confers cellularthermoresistence //J. Biol. Chem.- 1997.- V. 272.- P. 31636-31640.

227.0rino E., Tanaka K., Tamura T. et al. ATP-dependent reversible association of proteasomes with multiple protein components to form 26S complexes that degrade ubiquitinated proteins in human HL-60 cells // FEBS Lett -1991.- V. 284,- P. 206-210.

228.0rrenius S., Mc Conkey D.J., Bellomo G. et al. Role of Ca2+ in toxic cell killing // Trends Pharm. Sci.- 1989,- V. 10.- P. 281-285.

229.Palleros D.R., Welch W.J., Fink A.L. Interaction of hsp70 with unfolded proteins: Effects of temperature and nucleotides on the kinetics of binding // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1991,-V. 88.- P. 5719-5723.

230.Palleros D.R., Reid K.L., Shi L. et al. ATP-induced protein-Hsp70 complex dissociation requires K+ but not ATP hydrolysis//Nature (London).- 1993,-V. 365,-P. 664-666.

231.Parag H.A., Raboy B., Kulka R.G. Effect of heat shock on protein degradation in mammalian cells: involvement of the ubiquitin system // EMBO J.- 1987.- V. 6,- P. 55-61.

232.Parsell D.A., Sanchez Y., Stitzel J.D., Lindquist S. HSP104 is a highly conserved protein with two essential nucleotide-binding sites // Nature.-1991.- V. 353,- P. 270-273.

233.Parsed D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins // Annu. Rev. Genet.- 1993.-V. 27,- P. 437-496.

234.Parsell D.A., Lindquist S. Heat shock proteins and stress tolerance // The biology of heat shock proteins and molecular shaperones / Eds. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1994a.- P. 457-494.

235.Parsell D.A., Kowal A.S., Singer M.A., Lindquist S. Protein disaggregation mediated by heat-shock protein HSP104 // Nature.- 1994b.- V. 372.- P. 475-478.

236.Pauli D., Tonka C.H., Tissieres A., Arrigo A.P. Tissue-specific expression of the heat shock protein HSP27 during Drosophila me/anogaster development // J. Cell. Biol.- 1990,-V. 111,-P. 817-828.

237.Phillips P.G., Lum H., Malik A.B., Tsan M-F. Phallacidin prevents thrombin-induced increases in endothelial permeability to albumin // Cell. Physiol.- 1989,- V. 26.- P. C562-C567.

238.Pierce G.N., Czubryt M.P. The contribution of ionic imbalance to ischemia/reperfusion-induced injury//J. Mol. Cell. Cardiol.- 1995,-V. 27,- P. 53-63.

239.Piotrowicz R.S., Weber L.A., Hickey E., Levin E.G. Accelerated growth and senescence of arterial endothelial cells expressing the small molecular weight heat-shock protein HSP27 // FASEB J. 1995,-V. 9.- P. 1079-1084.

240.Piotrowicz R.S., Levin E.G. Basoiateral membrane-associated 27-kDa heat shock protein and microfilament polymerization //J. Biol. Chem.- 1997.- V. 272.- P. 25920-25927.

241.Plumier J-C.L., Ross B.M., Currie R.W. et al. Transgenic mice expressing the human HSP70 have improved post-ischemic myocardial recovery // J. Clin. Invest.- 1995,- V. 95,-P. 1854-1860.

242.Plumier J-C., Currie R.W. Heat shock-induced myocardial protection against ischemic injury: a role for Hsp70? // Cell Stress and Chaperones.- 1996.-V. 1,- P. 13-17.

243.Polla B., Bonventre J.V. Heat shock protects cells dependent on oxidative metabolism from inhibition of oxidative phosphorylation // Clin. Res.-1987.- V. 35,- P. 555A.

244.Preville X., Schultz H.; Knauf U. et al. Analysis of the role of HSP25 phosphorylation reveales the importance of the oligomerization state of this small heat shock protein in its protective function against TNF-alpha- and hydrogen peroxide-induced cell death // J. Cell. Biochem.- 1998,- V. 69,- P. 436-452.

245.Raingeaud J., Whitmarsh A.J., Barrett T. et al. MKK3 and MKK6 regulated gene expression is mediated by the p38 mitogen activated protein kinase signal transduction pathway// Mol. Cell. Biol.- 1996,-V. 16,- 1247-1255.

246.Raleysusman K.M., Murata J. Time course of protein changes following in vitro ischemia in the rat hippocampal slice // Brain Res.-1995.- V. 694.- P. 94-102.

247.Rasio E.A., Bendayan M., Goresky C.A., Alexander J.S., Shepro D. Effect of falloidine on

structure and permeability of rete capillares in the normal and hypoxic state // Circ. Res.-1989,-V. 65.-P. 591-599.

248.Rassow J., Voos W., Pfanner N. Partner proteins determine multiple functions of HSP70 // Trends Cell Biol.- 1995a.- V. 5,- P. 207-212.

249.Rassow J., Mohrs K., Koidl S., Barthelmess I.B. et al. Cyclophilin 20 is involved in mitochondrial protein folding in cooperation with molecular shaperones HSP70 and HSP60 // Mol. Cell. Biol.- 1995b.-V. 15.- P. 2654-2662.

250.Regazzi R., Eppenberg U., Fabbro D. The 27,000 dalton stress proteins are phosphorylated by protein kinases C during the tumor promoter-mediated growth inhibition of human mammary carcinoma cells // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1988.- V. 152.-P. 62-68.

251.Ridley A.J., Hall A. The small GTP-binding protein rho regulates the assembly of focal adhesions and actin stress fibers in response to growth factors // Cell.- 1992,- V.- 70,- P. 389-399.

252.Ridley A.J., Hall A. Signal transduction pathways regulating rho-mediated stress fiber formation: requirement for a tyrosine kinase // EMBO J.-1994,- V. 13,- P. 2600-2610.

253.Rouse J., Cohen P., Trigon S. et al. A novel kinase cascade triggered by stress heat shock that stimulates MAPKAP kinase-2 and phosphorylation of the small heat shock proteins // Cell.-1994,- v. 78,- P. 1027-1037.

254.Ritossa F. A new puffing pattern induced by heat shock and DNP in Drosophila H experientia.- 1962,-v. 18.- p. 571-573.

255.Saad S., Kanai M., Awane M. et al. Protective effect of heat shock pretreatment with heat shock protein induction before hepatic warm ischemic injury caused by Pringle's maneuver //Surgery.-1995,-V. 118,-P. 510-516.

256.Saklatvala J., Kaur P., Guesdon F. Phosphorylation of the small heat-shock protein is regulated by intrleukin-1, tumor necrosis factor, growth factors, bradykinin and ATP // Biochem. J.-1991,-V. 277.- P. 635-642.

257.Santell L., Bartfeld N.S., Levin E.G. Identification of a protein transiently phosphorylated by activators of endothelial cell function as the heat-shock protein HSP27. A possible role for protein kinase C // Biochem J.- 1992.- v. 284,- P. 705-710.

258.Sarge K., Murphy S.P., Morimoto R.I. Activation of heat shock transcription by HSF1 involves oligomerization, acquisition of DNA-binding activity, and nuclear localization and occur in the absence of stress // Mol. Cell. Biol.- 1993.- V. 13.- P. 1392-1407.

259.Sato M., Theret D.P., Wheeler L.T. et al. Application of the micripipette technique to the measurement of cultured porcine aortic endothelial cell viscoelastic properties // J. Biomech. Eng.- 1990.-V. 112,- P. 263-268.

260.Shasby D.M., Shasby S.S., Sullivan S.M., Peach M.J. Role of endothelial cell cytoskeleton in the control of endothelial permeability // Circ. Res.- 1982,- V. 51.- P. 657-661.

261.Siesjo B.K. Calcium and cell death // Magnesium.- 1989.-V. 8.- P. 223-237.

262.Sithanandam G., Latif F., Duh F.M. et al. 3pK, a new mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase located in the small cell lung cancer tumor suppresser gene region // Mol. Cell. Biol.-1996,-V. 16,- P. 868-876.

263.Sorger P.K. Yeast heat shock factor contains separably transient and sustained response transcriptional activators // Cell.- 1990,- V. 62,- P. 793-805.

264.Spector N.L., Ryan C., Samson W., Levine H., Nadler L.M., Arrigo A.P. Heat shock protein is a unique marker of growth arrest during macrophage differentiation of HL-60 cells // J. Cell. Physiol.- 1993,-V. 156.- P. 619-625.

265.Stege G.J.J., Li L., Kampinga H.H. et al. Importance of the ATP-binding domain and nucleolar localization domain of HSP72 in the protection of nuclear proteins against heat-shock aggregation II Exp. Cell. Res.- 1994,-V. 214,- P. 279-284.

266.Stokoe D., Campbell D.G., Nakienly S. et al. MAPKAP kinase-2; a novel protein kinase activated by mitogen-activated protein kinases // EMBO J.- 1992a.- V. 11.- P. 3985-3994.

267.Stokoe D., Engel K., Campbell D.G., Cohen P., Gaestel M. Identification of MAPKAP kinase 2 as a major enzyme responsible for the phosphorylation of the small mammalian

heat shock proteins//FEBS Lett.-1992b.-V. 313,-P. 307-313.

268.Strasser R., Vogt A., Schaper W. Ischemic preconditioning. Experimental results and clinical studies // Zeit Kardiol.- 1996,-V. 85,- P. 79-89.

269.Stromski M.E., Cooper K., Thylin G. et al. Chemical and functional correlates of postischemic renal ATP levels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1986.- V. 83.- P. 6124-6145.

270.Strzeleska-Golaszewska H., Prochniewicz E., Drabikowsky W. Interaction of actin with divalent cations: The effect of various cations on the physical state of actin // Eur. J. Biochem.- 1978,- V. 88.- P. 219-227.

271.Suzuki A., Sugiyama Y., Hayashi Y. et al. MKBP, a novel member of the small heat shock protein family, binds and activates the myotonic dystrophy protein kinase // J. Cell. Biol.-1998,-V. 140,-P. 1113-1124.

272.Sunnergen K.P., Rovetto M.J. Myocyte and endothelial injury with ischemia reperfusion in isolated rat hearts //Am. J. Physiol.- 1987,-V. 252,- P. H1211-H1217.

273.Svendsen J.H., Bjerrum P.J., Haunso S. Myocardial capillary permeability after regional ischemia and reperfusion in the in vivo canine heart // Circ. Res.-1991,- V. 68.- P. 174-184.

274.Talbot N., Tagliaferri P., Yanagihara K. et al. A pH-dependent differential cytotoxicity of ouabain for human cells transformed by certain oncogenes // Oncogene.- 1988.- V. 3.- P. 23-26.

275.Terzic A., Jahangir A., Kurachi Y. Cardiac ATP-sensitive K+ channels: Regulation by intracellular nucleotides and K+ channel-opening drugs // Am. J. Physiol.- 1995.- V. 38,- P. C525-C545.

276.Trump B.F., Berezesky I.K. Cellular and molecular basis of toxic cell injury // Cardiovascular toxicology / Ed. Acosta D.Jr.- New York, 1992. P. 75-113.

277.Ueda H., Hashimoto T., Furuya E. et al. Changes in aerobic and anaerobic ATP-synthesizing activities in hypoxic mouse brain // J. Biochem. -1988.- V. 104,- P. 81-86.

278.Van den IJssel P.R., Overkamp P., Knauf U., Gaestel M., Jong W.W. alfaA-Crystallin confers cellular thermoresistence // FEBS Lett.-1994,-V. 355,- P. 54-56.

279.Van den IJssel P.R.L.A., Overkamp P., Bloemendal H., de Jong W.W. Phosphorylation of alpha B-crystallin and HSP27 is induced by similar stressors in HeLa cells // Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1998,-V. 247,- P.518-523.

280.Van Why S.K., Mann A.S., Thulin G. et al. Activation of heat-shock transcription factor by graded reductions in renal ATP, in vivo, in the rat // J. Clin. Invest.-1994,- V. 94.- P. 1518-1523.

281.Vile G.F., Basu-Modak S,, Waltner C., Tyrrell R.M. Hemeoxygenase 1 mediates an adaptive response to oxidative stress in human skin fibroblasts // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994.-V. 91.- P. 2607-2610.

282.Voorter C.E., Mulders J.W., Bloemendal H., Jong W.W. Some aspects of the phosphorylation of alfa-crystallin A// Eur. J. Biochem.- 1986,-V. 160,- P. 203-210.

283.Wang Y.L. Reorganization of a-actinin and vinculin in living cells following ATP depletion and replenishment // Exp. Cell Res.- 1986.- V. 167.- P. 16-28.

284.Watanabe H., Kuhne W., Spahr R. et al. Macromolecular permeability of coronary and aortic endothelial monolayers under energy depletion // Am. J. Physiol.- 1991.- V. 260.- P. H1344-H1352.

285.Waters E.R. The molecular evolution of the small heat-shock proteins in plants // Genetics.- 1995,-V. 141.- P. 785-795.

286.Weinberg J.M. The cell biology of ischemic renal injury // Kidney Int.- 1991,- V. 39.- P. 476-500.

287.Welch W. Phorbol ester, calcium ionophore, or serum added to quiescent rat embryo fibroblast cells all result in the elevated phosphorylation of two 28,000-dalton mammalian stress proteins // J. Biol. Chem.- 1985,- V. 260.- P. 3058-3062.

288.Welch W.J. Mammalian stress response: cell physiology, sructure/function of stress proteins, and implications for medicine and disease // Physiol. Rev.- 1992,- V. 72.- P. 10631081.

289.Westwood J.T., Wu C. Activation of Drosophila heat shock factor: conformational change

associated with a monomer-to-trimer transition // Mol. Cell. Biol.- 1993,- V. 13.- P. 34813486.

290.Wiech H., Buchner J., Zimmermann R., Jacob U. HSP90 chaperones protein folding in vitro II Nature.- 1992.- V. 358.- P. 169-170.

291.Williams R.S., Thomas J.A., Fina M. et al. Human heat shock protein 70 (HSP70) protects murine cells from injury during metabolic stress // J. Clin. Invest.-1993.- V. 92,- P. 503-508.

292.Wong M.K. K., Gotlieb A.I. Endothelial monolayer integrrity. I. Characterization of dense peripheral band of microfilaments // Arteriosclerosis.- 1986,- V. 6,- P. 212-219.

293.Wu C., Clos J., Giorgi G., Haroun R.I. et al. Structure and regulation of heat shock transcription factor II The biology of heart shock proteins and molecular chaperones / Ed. Morimoto R.I., Tissieres A., Georgopoulos C.- Cold Spring Harbor, NY, 1994. P. 395-416.

294.Yellon D.M., lliodromitis E., Latchman D.S. et al. Whole body heat stress fails to limit infarct size in the reperfused rabbit heart // Cardiovasc. Res.-1992,- V. 26,- P. 342-346.

295.Zhao Y., Rhoades R.A., Packer C.S. Hypoxia-induced pulmonary arterial contraction appears to be dependent on myosin light chain phosphorylation // Am. J. Physiol.- 1996,- V. 271,-P. I768-L774.

296.Zhou M., Lambert H., Landry J. Transient activation of a distinct serine protein kinase is responsible for 27-kDa heat shock protein phosphorylation in mitogen-stimulated and heat-shocked cells // J. Biol. Chem.-1993.- V. 268.- p. 35-43.

297.Zhu Y., O'Neill S., Saklatvala J., Tassi L., Mendelsohn M.E. Phosphoryiated HSP27 associates with the activation-dependent cytoskeleton in human platelets // Blood.- 1994,-V. 84,- P. 3715-3723.

298.Zou J., Guettouche T., Guo Y., Smith D.F., Voellmy R. In vitro model of heat shock factor 1 activation identifies chaperone HSP90 as the molecular sensor of stress // Abstracts of papers presented at the meeting on Molecular chaperones and the heat shock response.-Cold Spring Harbor, NY, 1998.