Влияние каротиноидов на обмен холестерина в клетках человека in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Малахова, Майя Владимировна

• Малахова, Майя Владимировна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Малахова, Майя Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Каротиноиды -многофункциональные соединения

1.2. Метаболизм каротиноидов в организме

1.3. Биологическая активность каротиноидов

1.3.1. Аятиоксидантное действие каротиноидов

1.3.2. Антиканцерогенное действие каротиноидов

1.3.3. Каротиноиды и сердечно-сосудистые заболевания

1.3.4. Каротиноиды и обмен холестерина

1.4. Окисленные производные р-каротина

1.5. Клеточные культуры - экспериментальные модели

для изучения каротиноидов

1.6. Способы солюбилизации каротиноидов

Глава 2. Материалы и методы исследования

Глава 3. Результаты и обсуждение собственных исследований

3.1. Исследование свойств различных форм солюбилизации каротиноидов

3.1.1. Липосомальная форма каротиноидов

3.1.2. Водорастворимая форма каротиноидов, стабилизированная Проксанолом-268

3.2. Изучение влияния каротиноидов на содержание и биосинтез холестерина в клетках культуры

3.3. Изучение окисленных производных р-каротина

3.3.1. Биологическая активность продуктов

автоокисления р-каротина

3.3.2. Выделение, характеристика и биологическая активность продуктов, образующихся в результате окисления р-каротина с радикальным инициатором

3.3.3. Идентификация билогически активных продуктов окисления Р-каротина

Глава 4 Заключение

Выводы

Список литературы

Список сокращений.

А1ВМ- азо-бис-изобутиронитрил

ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография

ЛВП - липопротеины высокой плотности

ЛНП - липопротеины низкой плотности

ЛОНП липопротеины очень низкой плотности

ЛПС - липосомы

ПАВ- поверхностно-активные вещества

ПОЛ - перекисное окисление липидов СФ-метрия - спектрофотометрия

ТГФ- тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФЛ - фосфолипиды

ФХ - фосфатидилхолин

ХС - холестерин

ЭТС- эмбриональная телячья сыворотка

УЗ- ультразвук

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние каротиноидов на обмен холестерина в клетках человека in vitro»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования.

Каротиноиды - природные пигменты, изопреноидной природы, которые синтезируются растениями [Бриттон, 1986] и микроорганизмами [Феофилова, 1974]. В организме человека и животных каротиноиды не синтезируются de novo, а поступают с растительной пищей. Ранее в исследованиях биологической роли каротиноидов в организме человека и животных доминировала «провитаминная концепция», согласно которой эти пигменты рассматривались как предшественники витамина А [Goodwin, 1952, Goodwin, 1980]. В последние годы изучение каротиноидов позволило сформулировать концепцию об их биологических невитаминных функциях в организме человека и животных [Olson, 1989]. Опубликованы результаты исследований, демонстрирующие роль каротиноидов в регуляции иммунного ответа [Bendich, 1989], в уменьшении риска онкологических заболеваний [Albanes et al., 1995], увеличении устойчивости к. радиации [Беляев с соавт., 1992], профилактике заболеваний сердечно-сосудистой системы [Gaziano et al., 1992].

Антиатерогенное действие каротиноидов установлено в ряде эпидемиологических исследований [Eicholzer et al, 1992; Gey et al., 1993]. Данный эффект принято связывать с их антиоксидантными свойствами и, прежде всего, с защитой ЛНП от окисления свободными радикалами [Jialal et al., 1991]. Известно, что окисление Л HIT является важным фактором в патогенезе атеросклероза [Лопухин и др., 1983]. Исследования последних лет указывают на возможность существования других механизмов антиатерогенного действия каротиноидов. В ряде работ показано, что высокое содержание р~каротина в диете снижает степень поражения сосудов, но при этом не защищает ЛНП от окисления [Shaish et al., 1995]. Появились данные о влиянии изопреноидных продуктов на активность ОМГ-КоА-редуктазы - ключевого фермента биосинтеза холестерина в животных клетках [Brown & Goldstein, 1980]. Недавно было показано, что |3-каротин ингибирует экспрессию ОМГ-КоА-редуктазы в печени крыс по пост-транскрипционному механизму, снижая трансляцию м-РНК фермента [Moreno et al., 1995], одновременно снижая содержание холестерина в ЛНП [Elson & Qureshi, 1995]. Эти данные подтверждают предположение о непосредственном влиянии каротиноидов на обмен холестерина в животных клетках.

Изучение биологической активности каротиноидов имеет ряд трудностей, обусловленных строением молекулы этих веществ. В основе структуры этих углеводородов лежит полиеновая цепь сопряженных двойных связей, которая определяет два важных химических свойства молекулы каротиноида : гидрсфобность и реакционноспособность. Из-за

высокой гидрофобности каротиноиды практически нерастворимы в воде, что сильно затрудняет их исследование как в системе in vitro, так и in vivo.

Поэтому по-прежнему актуальны исследования, позволяющие выявить метод солюбилизации каротиноидов, который можно не только использовать для исследования биологических функций каротиноидов в системе in vitro, но и рекомендовать этот метод для создания лекарственного препарата для последующего применения в диетологии и медицине.

Другое очень существенное свойство каротиноидов - высокая реакционноспособность. Они очень чувствительны к действию света, воздуха, температуры, при этом каротиноиды разрушаются и образуются их окисленные производные. В организме человека и животных в процессе антиоксидантной защиты каротиноиды взаимодействуют со свободными радикалами также с образованием продуктов окисления. Часть продуктов, образующихся в результате этих процессов, была идентифицирована [Handelman et al., 1991; Kennedy & Liebler, 1992], однако, биологическая активность этих веществ исследована не была. Также было показано, что, подвергаясь в организме человека и животных действию ферментов диоксигеназ, провитаминные каротиноиды могут расщепляться не только по центральной связи с образованием ретиналя, но и по другим двойным связям с образованием апо-р-каротиналей [Wang et al., 1991]. Ферменты, осуществляющие окислительное расщепление каротиноидов, найдены в цитозоле клеток кишечника, печени и почек различных животных [Колотилова и Глушанков, 1976].

На основании вышеизложенного мы предположили, что антиатерогенное действие каротиноидов может быть связано не только с их антиоксидантным эффектом на ЛНП, но и с собственной биологической

активностью каротиноидов, а также, образующихся в организме, продуктов

их

Окисления.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлось выяснение механизма влияния каротиноидов на метаболизм холестерина в культивируемых клетках человека. В работе решались следующие конкретные задачи:

1. Оценить адекватность использования различных способов введения каротиноидов в клеточную культуру для исследования биологических функций каротиноидов.

2. Изучить влияние Р-каротина и ликопина на содержание и биосинтез холестерина в клетках культуры.

3. Разработать метод выделения производных р-каротина из смеси продуктов, образующихся в результате автоокисления Р-каротина.

4. Изучить влияние окисленных производных Р-каротина на биосинтез холестерина и пролиферацию клеток культуры.

Научная новизна работы

Решение поставленных задач позволило показать, что способ солюбилизации каротиноидов с помощью Проксанола-286 позволяет получать коллоидные дисперсии каротиноидов, которые нетоксичны и обеспечивают высокий уровень включения каротиноида в клетки культуры. Впервые было обнаружено, что коллоидные дисперсии ликопина и (3-каротина, стабилизированные Проксанолом-286, снижают содержание и синтез холестерина в клетках культуры. Впервые было показано, что окисленные производные Р-каротина, относящиеся к апо-Р-каротиналям, ингибируют биосинтез холестерина в системе in vitro, и их биологическая активность определяется наличием в молекуле карбонильной группы.

Научная и практическая ценность.

Полученные данные позволяют детализировать механизм влияния каротиноидов на обмен холестерина в клетках человека, показывая роль ликопина, p-каротина и его окисленных производных как ингибиторов синтеза холестерина в культивируемых клетках. Метод солюбилизации каротиноидов с использованием Проксанола-286 позволяет получать нетоксичный препарат с концентрацией каротиноида 0,5-0,6%, являясь достаточно простым методически и легко воспроизводимым. Результаты тестирования препаратов каротиноидов позволяют рекомендовать данный метод для применения в медицинской промышленности и сельском хозяйстве. Разработан метод выделения окисленных производных Р-каротина. Данные об ингибировании синтеза холестерина окисленными производными Р-каротина - апо-Р-каротиналям и - могут являться предпосылкой для разработки новых фармакологических препаратов для профилактики и лечения больных атеросклерозом.

1. Литературный обзор.

1.1. Каротиноиды - многофункциональные соединения.

Каротиноиды привлекают внимание исследователей с тех пор, как они были впервые выделены Wackenroder в 1831 году из моркови [Wackenroder, 1831], а затем М.С.Цвет, используя созданный им метод хроматографии, установил множественность каротинов и ксантофилов и ввел обобщающее их понятие каротиноиды [Цвет, 1910].

Долгие годы знания об их структуре, стереохимии и синтезе заметно обгоняли изучение как их биологических функций в животных клетках, так и основные пути их обмена.

В исследованиях биологической роли каротиноидов доминировала провитаминная теория, согласно которой эти пигменты в организме человека и животных рассматривались как предшественники витамина А [Goodwin, 1952, Goodwin, 1980, Krinsky, 1991]. Однако, сейчас обнаружено множество других биологических свойств каротиноидов, показанных как в модельных экспериментах, так и в эпидемиологических исследованиях.

Установлено, что использование диеты, обогащенной каротиноидами, способствует [Olson, 1989]:

- укреплению иммунной системы, особенно при стрессовых перегрузках или при иммунодефицитах,

- уменьшению риска онкологических заболеваний,

- увеличению устойчивости к радиации,

- уменьшению риска атеросклероза,

- уменьшению риска таких заболеваний как катаракта и сахарный диабет.

На современном этапе уже не возникает сомнений в их исключительной многофункциональности, обусловленной особенностями строения. Согласно Гудвину [Гудвин, 1954], каротиноидами являются пигменты алифатического или алициклического строения, состоящие из изопреновых остатков, соединенных таким образом, что две ближайшие к центру молекулы метальные группы находятся в положении 1:6, тогда как все другие боковые группы стоят в положении 1:5, а серия сопряженных двойных связей составляет хромофорную систему каротиноидов. Применение современных методов исследования структуры веществ значительно расширило представление о каротиноидах. Были подробно изучены типы концевых групп каротиноидов и обнаружен новый класс арил-каротиноидов, имеющих ароматические кольца в качестве концевых групп. Установлено также, что, помимо полиеновых связей, в основной цепи могут иметься алленовые и ацетиленовые связи [Zechmeister, 1962].

Строение концевых групп каротиноидов [Карнаухов, 1988].

17 1Д

16 г м б

Р

t7_

2 Г

зКч

fr is

19 20 I , , v , 7 I? (Г к «> 5 /?'

'ft 8 10 12 М Л5-' I/J /Г|£ 7

»3

17 К

R

Z0' 19'

I

R' <П7 17' 16'

XJi

- is'

у

X

1.2. Метаболизм каротиноидов в органшзме.

Всасывание.

Поступающие с пищей каротиноиды эмульгируются желчными кислотами внутри тонкого кишечника. Соли желчных кислот играют основную роль как в абсорбции каротиноидов, так и .в их последующем превращении в витамин A [Olson, 1996]. Кроме солюбшшзирующего эффекта, желчные соли могут также играть важную роль но включении каротиноидов в клетки кишечника [El-Gorab, 1975]. Прием Iшюхолестеринемических агентов, относящихся к iруине секвестраптов желчных кислот, например, холестипола, приводит к снижению концентрации общих каротиноидов в сыворотке крови на 30% [Probstfield et al., 1985]. Авторы считают, что снижение концентрации каротиноидов в сыворотке при приеме холестипола обусловлено снижением всасывания каротиноидов в кишечнике из-за связывания желчных кислот.

Всасывание каротиноидов, представленных в виде коммерческих гранул или в масле, более эффективно, чем. в составе таких продуктов, как морковь, брокколи или томатный сок. Количество всосавшихся каротиноидов возрастает в 3-4 раза, если они употребляются к составе жирной нищи. Вшеп с соавт. определили, что при дозе 15 мг (:V-каротина, представленного в виде водной дисперсии ("llofman La .Roche"), абсорбировалось 15% каротина в отсутствии нищи и 47% в присутствии жирной нищи [Воwen et al., 1993].

Для наиболее важных с точки зрения диеты каротиноидов проводили измерение "^концентрации в плазме после приема определенной дозы каротиноида в различной форме. После поглощения определенных доз [3-каротина (12-30 мг) как в виде специальных капсул, так и в составе овощей, концентрация Р-каротина в плазме крови увеличивалась в 2-4 раза у большинства испытуемых и достигала максимума на второй день, а затем медленно снижалась [Broun et al., 1979, Bowen et al., 1993]. Более продолжительное исследование показало, что прием в течение 2 месяцев 20мг в день p-каротина вызывает примерно 10-кратное увеличение уровня каротиноида в крови : с 0,53+0,32мкМ до 4,99+2,47мкМ. Возвращение к исходному уровню Р-каротина в крови (0,61+0,15мкМ) было зафиксировано только через 12 недель [Albanes et al., 1992]. Лишенная каротиноидов диета вызывает незначительное снижение концентрации каротиноидов в крови. Предполагают, что существуют механизмы компенсаторной мобилизации каротиноидов из тканей, однако, они пока не изучены [Bendich & Olson, 1989].

Кинетика всасывания одного из известных апо-каротиналей (Р-аио-81-каротиналя) и еще двух модельных каротиноидов (этил-р-апо-8-каротиноата и 4,4-диметокси-р-каротина) была исследована in vivo в опытах на добровольцах. После однократного употребления дозы 100 цмоль каротиноида в составе орехового масла у испытуемых исследовали кровь в течение 50 дней. Максимальная концентрация этих каротиноидов в крови достигалась через 5-11 часов, 16 часов и 27 часов соответственно [Zeng et al., 1992]. Zeng и Olson считают, что абсорбция и скорость плазменного клиренса различных каротиноидов в организме человека заметно отличается.

Транспорт.

Основная часть поглощаемых каротиноидов метаболизируется клетками тонкого кишечника. Неметаболизированные каротиноиды через мукозные клетки тонкого кишечника включаются в хил омикроны и поступают в лимфу. Хиломикроны очень быстро разрушаются липопротеин-липазой внутри кровотока и продукты распада хиломикронов удаляются печенью и другими тканями.

Основными переносчиками каротиноидов в плазме являются ЛНП, но они также представлены и в других липопротеидах. Соотношение общих каротиноидов в плазме примерно 14%, 55% и 31% между ЛОНП, ЛНП и ЛВП [Clevidence & Bierri, 1993]. Углеводородные каротиноиды такие, как каротины и ликопин в основном локализованы в ЛНП, тогда как ксантофилы, например, лютеин или зеаксантин, преимущественно обнаружены в ЛВП [Clevidence & Bierri, 1993, Cornwell et al., 1962]. Таким

образом, распределение каротиноидов в липопрогеинах плазмы во многом подобно распределению ХС.

Каротиноиды найдены не только в плазме, но и в других тканях организма. Основным местом депонирования каротиноидов являются жировая ткань (80-85%) и печень (8-12%) [Olson, 1989]. В наибольшей концентрации они присутствуют в желтом теле (бОмкг/г) и надпочечниках (20мкг/г), тогда как в печени и жировой ткани их концентрация только 10мкг/г.

В сыворотке обычно содержится примерно 1% от общего количества каротиноидов организма, что составляет примерно 0,4-1,5мкг/мл (0,8-8 мкМ). Основные идентифицированные в человеческой плазме каротиноиды - это а- и p-каротин, ликопин, лютеин и криптоксантин [Packers, 1989]. В меньших концентрациях присутствуют зеаксантин и другие ксантофилы и полиены, такие как фитофлюен и фитоен. Используя ВЭЖХ в сыворотке крови, определяют до 18 каротиноидов и еще 20 присутствуют в следовых количествах. Р-Каротин составляет 15-30% всех сывороточных каротиноидов.

Основные каротиноиды, найденные в крови.

В основном, содержание каротиноидов в тканях отражает концентрацию их в крови, но некоторые ткани обладают способностью выборочно извлекать каротиноиды из плазмы. Так, каротиноиды были обнаружены в сетчатке и шишковидной железе, но не были обнаружены в стволе головного мозга [Handelman et al., 1988, Shi et al., 1991]. Распределение каротиноидов в тканях зависит от их химических свойств и

Распределение в тканях.

ликопин

НО

особенностей строения. В сетчатке обнаружены лютеин и зеаксантин в примерно эквивалентных концентрациях, но не найдены другие каротиноиды [Handelman et al., 1988]. Напротив, основной каротиноид, выделенный из шишковидной железы - p-каротин [Shi et al., 1991]. Каротиноиды, будучи гидрофобными и нерастворимыми в воде соединениями, связаны преимущественно с липидными структурами тканей человека и, прежде всего, с мембранами клеток.

Метаболизм.

Каротиноиды являются высоко реакционноспособными соединениями благодаря системе сопряженных двойных связей. Причем обнаружено, что каротиноиды, имеющие кето-группу в составе молекулы, более стабильны, чем p-каротин и, тем более, ликопин [Woodal et al., 1997]. Локализованные в липидных структурах животных и растительных клеток каротиноидные молекулы могут быть атакованы по различным позициям, в частности, по двум циклогексеновым кольцам, по метальным группам и по различным двойным связям в коньюгированной цепочке. Существуют различные ферменты, которые катализируют эти реакции. К сожалению, превращение каротиноидов в растениях, рыбах и птицах изучено значительно лучше, чем у млекопитающих, в частности, у человека. Основное внимание уделялось превращению p-каротина и других провитаминных каротиноидов в витамин А.

С тех пор, как Glover в 1960 году предложил два возможных механизма образования ретиналя из р-каротина, продолжаются споры о роли центрального и эксцентричного расщепления [Glover, 1960]. Фермент, расщепляющий p-каротин до ретиналя, был идентифицирован в цитозоле клеток печени и кишечника крыс [Goodman & Huang, 1965, Olson & Hayaishi, 1965]. Этот белок, работающий по центральному механизму был назван р-каротин-15,15'-диоксигеназа. Последние работы, посвященные изучению механизма расщепления провитаминных каротиноидов в организме, свидетельствуют, что реакция более сложная. Предполагают, что существуют диоксигеназы, которые могут присоединять молекулу кислорода к любой двойной связи в коньюгированной цепи [Wang et al., 1991], что приводит, в итоге, к образованию целого спектра апо-Р-каротиналей. Wang & Krinsky в опытах in vitro с гомогенатами кишечника и других тканей человека и животных обнаружили образование р-апо-12'-каротиналя, p-апо-Ю'-каротиналя и р-апо-8'-каротиналя, кроме ретиналя и ретиноевой кислоты. Причем скорость образования каротиналей была в 7-14 раз выше, чем скорость образования ретиноидов [Wang et al., 1991].

Практически, ничего не известно о метаболизме не провитамин-А каротиноидов, таких,как ликопин, лютеин, зеаксантин.

1.3. Биологическая активность каротиноидов.

В 1989 году Olson сгруппировал биологические активности каротиноидов по следующим категориям: функции, действия и корреляции [Olson, 1989].

Роль, которую каротиноиды играют в условиях, когда их отсутствие нарушает нормальную жизнедеятельность организма, называется функцией. Физиологический или фармакологический ответ на прием каротиноидов рассматривают как их действие на организм. Действие каротиноидов часто не отделяют от корреляции между приемом каротинодов и некоторыми физиологическими и медицинскими событиями.

Наиболее подробно в литературе описаны функции каротиноидов. Мы ограничимся несколькими примерами. Функции каротиноидов в качестве дополнительных пигментов при фотосинтезе рассмотрены в обзоре Cogdel и Frank [Cogdel & Frank, 1987]. Mathews-Roth [Mathews-Roth, 1987] и Will и Scovell [Will & Scovel, 1989] подробно описали различные аспекты способности каротиноидов выступать в качестве эффективной ловушки синглетного кислорода для защиты от фотосенсибилизации. Принципы каротиноидной защиты против фотосенсибилизации были успешно применены в клинике для лечения эритропоэтической протопорфирии [Mathews-Roth et al., 1970].

Метаболизм провитаминных каротиноидов до ретинола и ретиноевой кислоты рассматривается как функция. Ранее считалось, что провитаминные каротиноиды превращаются в витамин А за счет гидролитического расщепления молекулы каротиноида по центральной двойной связи с формированием двух молекул ретинола. Работы последних лет продемонстрировали, что существует асимметричное расщепление Р-каротина, в ходе которого образуются апо-каротинали [Wang et al., 1991]. Метаболизм других провитамин-A каротиноидов мало исследован, предполагают, что они превращаются в витамин А как по центральному, так и по асимметричному механизму.

1.3.1. Антиоксидантное действие каротиноидов.

Каротиноидные пигменты давно считаются антиоксидантами, но только в последние 15 лет исследователи приступили к изучению свободнорадикальных реакций, протекающих в присутствии каротиноидов в гомогенных растворах или в мембранных системах. Часто для изучения

антиоксидантной роли каротиноидов применяют модельные системы in vitro (с использованием ЛНП) или in vivo (на животных).

Наряду с сообщениями об антиоксидантной активности каротиноидов появляются сведения о возможных прооксидантных свойствах (3-каротина при определенных условиях. В частности, Vile и Winterbroun [Vile & Winterbourn,1988] показали, что Р-каротин был лучшим антиоксидантом, чем ос-токоферол в обработанных адриамицином микросомах печени крысы, тогда как Lomnitski с соавт. [Lomnitski et al., 1991] сообщили, что у крыс, содержащихся на диете с добавлением окисленного соевого масла, при добавлении p-каротина происходит увеличение уровня МДА и липоксигеназной активности. Авторы считают, что добавленный р-каротин ведет себя в этом случае как прооксидант.

Различные исследователи указывают, что антиоксидантная активность этих пигментов зависит от химической структуры каротиноида, наличия других антиоксидантов и концентрации кислорода в среде.

В 1989 году Тегао впервые обнаружил, что структура каротиноида играет важную роль в его антиоксидантной активности. Он сравнил способность кето-каротиноидов и p-каротина ингибировать образование гидроперекисей метил-линолеата в радикал-инициированной системе. Антиоксидантная активность кето-каротиноидов была выше, чем активность p-каротина [Тегао, 1989]. Miki также наблюдал увеличение антиоксидантной активности каротиноидов, имеющих коньюгированные кето-группы в составе молекулы [Miki, 1991].

Palozza и Krinsky продемонстрировали на микросомальных мембранах усиление антиоксидантного действия p-каротина при совместной инкубации с ос-токоферолом, одним из основных жирорастворимых антиоксидантов [Palozza & Krinsky, 1992]. Kennedy и Liebler полагают, что а-токоферол увеличивает антиоксидантную активность Р-каротина благодаря уменьшению его степени автоокисления [Kennedy & Liebler, 1991].

В 1984г Burton сообщил о влиянии различного парциального давления кислорода (15-760торр) и концентрации P-каротина на радикал-индуцированное окисление метил-линолеата. При низких давлениях кислорода (15торр) p-каротин действовал как эффективный антиоксидант, но при высоких давлениях (760торр) его действие описывалось как прооксидантное [Burton & Ingold, 1984]. Palozza и Krinsky получили сходные результаты, используя гексановый раствор липидов, выделенных из мембран микросом печени крысы. Используя для количественного определения перекисного окисления липидов образование диеновых коньюгатов и малонового диальдегида (МДА), они показали, что ос-токоферол примерно в 40-50 раз более эффективный антиоксидант, чем р-

каротин на воздухе (150торр). Однако, когда давление кислорода уменьшалось до 20 торр, различие в эффективности уменьшалось до 40%, что подтверждает усиление антиоксидантной активности (3-каротина при низком давлении кислорода [Palozza & Krinsky, 1991]. Kennedy и Liebler также исследовали зависимость антиоксидантной активности Р-каротина от давления кислорода и заключили, что он достаточно эффективный антиоксидант при физиологическом давлении кислорода 15 торр ( в тканях млекопитающих давление кислорода обычно не более 20 торр) [Kennedy & Liebler, 1991]. Однако, в условиях высокого давления кислорода они могут быть и прооксидантами.

Два фактора делают чрезвычайно важным вопрос о том, ведут ли себя каротиноиды как антиоксиданты в липопротеинах низкой плотности (ЛНП). Во-первых, хорошо известно, что ЛНП являются главными переносчиками Р-каротина у человека [Clevidence & Bierri, 1993] и, во-вторых, окислительную модификацию ЛНП сейчас относят к важному фактору инициации атеросклероза [Steinberg, 1991]. Однако, актуальная роль p-каротина как антиоксиданта в ЛНП остается спорной. Jialal с соавт. сообщили, что Р-каротин в присутствии ЛНП в 20 раз эффективнее, чем эквивалентное количество а-токоферола, ингибировал перекисное окисление липидов в экспериментальной системе [Jialal et al., 1991]. Было показано, что добавление ЮОмг/день Р-каротина в течение 3 недель в пищу добровольцев может снижать устойчивость ЛНП к окислению [Gaziano et al., 1995]. Несмотря на пятикратное увеличение уровня р-каротина в ЛНП, при тестировании в системе in vitro происходило укорочение lag-фазы при Си2+-индуцированном перекисном окислении ЛНП.

Navab с соавт. изучали действие p-каротина и а-токоферола на трансформацию моноцитов при совместной инкубации ЛНП и клеток человеческой аорты. Они продемонстрировали, что окисление ЛНП на поверхности клеток аорты ингибируется тогда, когда антиоксиданты находятся в клетках, а не в ЛНП [Navab et al., 1991]. Недавнее исследование Shaish, проведенное на кроликах с экспериментальным атеросклерозом, показало, что влияние Р-каротина на атерогенез может быть отделено от устойчивости ЛНП к окислению [Shaish et al., 1995]. Каротин не влиял на окисление ЛНП in vivo, но при этом ингибировал повреждение аорты более эффективно, чем пробукол, использованный в качестве контроля. Авторы предположили, что метаболические производные p-каротина ингибируют атерогенез по неантиоксидантному механизму.

Другое исследование, проведенное на кроликах с экспериментальным атеросклерозом^ продемонстрировало, что добавление в диету 0,6г/кг р-каротина еженедельно в течение 28 недель сохраняет нормальную

эндотелий-зависимую артериальную релаксацию, связанную с сосудистым включением p-каротина, но не коррелирует с уровнем липопротеинов в плазме, с функцией гладкомышечных клеток или степенью атеросклероза [Keaney J.F. et.al., 1993]. Авторы полагают, что диетические добавки р-каротина могут помогать пациентам с атеросклерозом за счет защиты вазодилятаторной функции эндотелия благодаря механизму, основанному на накоплении антиоксидантов в сосудистой ткани и не отражать исследованную в системе in vivo устойчивость ЛНП к окислению.

1.3.2. Антиканцерогенное действие каротиноидов.

Установлено, что каротиноиды могут защищать от злокачественной трансформации клеточные культуры [Krinsky, 1991 Krinsky, 1992]. Сообщения об ингибировании образования опухолей у животных, содержавшихся на обогащенной каротиноидами диете [Peto et al. 1981], послужили основанием для использования р-каротина в качестве диетического антиканцерогена у людей. Проведенные эпидемиологические исследования подтвердили, что диета, насыщенная содержащими каротиноиды фруктами и овощами, снижает риск различных видов рака [Bendich, 1994]. Обнаружено также действие на иммунную систему, состояние которой тесно связано с возможностью развития рака, в частности, показано, что, каротин-содержащая диета блокирует УФ-индуцированное угнетение иммунного ответа [Bendich, 1989].

Однако, в последние годы были опубликованы результаты длительных исследований, которые отрицают защитную роль p-каротина в развитии различных раковых заболеваний. Авторы длительного (5-8 лет) "Alpha-Tocopherol, Beta-Carotene Cancer Prevention Study" (ATBC исследования), проведенного в Финляндии на примерно 30 тысячах курящих мужчин в возрасте 50-69 лет, утверждают, что прием ежедневно 20мг/день p-каротина не оказывает большого влияния на появление неопластических изменений в желудке обследованных пациентов с трофическим гастритом [Varis К. et. al., 1998]. Было показано, что в группе, получавшей p-каротин, случаи рака простаты были на 15% чаще, чем в группе, получавшей "плацебо" [Heinonen О.Р., et.al., 1998 ].

В результате АТВС-исследования не было обнаружено защитного эффекта добавок P-каротина на развтие других видов рака : рака легкого [Albanes D. et. al., 1996], прямой кишки [Albanes D. et. al., 1995]. Авторы объясняют отсутствие защитного эффекта P-каротина курением обследованных пациентов, которое является известным фактором риска развития рака и, возможно, делает бесполезными питательные добавки р-каротина. Подводя итоги этого исследования, они утверждают, что Р-каротин может быть вреден из-за способности при некоторых

обстоятельствах усиливать канцерогенез. Неясный механизм такого действия требует дополнительного изучения роли антиоксидантов в росте и дифференцировке клеток [Rautalahti М. et. al., 1997].

1.3.3. Каротиноиды и сердечно-сосудистые заболевания.

Как известно, растительная пища обладает ХС-супрессирующей активностью, которую приписывают нестерольным пост-мевалонатным продуктам [Bradfute & Simoni, 1994]. Эпидемиологические исследования последних лет показывают снижение риска сердечно-сосудистых заболеваний в популяции с высоким потреблением каротиноидов. Street с соавт. обнаружили 60% снижение риска инфаркта миокарда у 125 пациентов с высоким уровнем p-каротина в крови по сравнению с 125 контрольными пациентами [Street et al., 1994]. В работе Gaziano показана обратная связь между диетой, богатой каротиноидами и последующим риском сердечно-сосудистых заболеваний: в контингенте из 1299 пожилых мужчин было обнаружено снижение заболеваемости на 45% [Gaziano et al., 1992]. Данные "Basel Heart Study" показали, что индивидуумы с низким потреблением p-каротина и витамина С имели более чем четырехкратное увеличение вероятности развития инфаркта миокарда и почти двукратное увеличение риска развития сердечно-сосудистых заболеваний [Gey et al., 1987].

Результаты 12-летнего "Prospective Basel Study" на 2974 больных также показали, что низкий уровень p-каротина в крови связан с увеличением риска сердечно-сосудистых заболеваний и цереброваскулярной смерти [Eicholzer et al., 1992]. Анализ данных, полученных в ряде эпидемиологических исследований (MONICA Vitamin Substudy, Edinburgh Angina-Control Study, Basel Prospective Study),позволил авторам утверждать, что при низком уровне антиоксидантов в плазме увеличивается риск развития сердечно-сосудистых заболеваний и инфаркта миокарда [Gey K.F. et.al., 1993]. В частности, снижение риска развития этих заболеваний благодаря пищевым добавкам возможно, если концентрация p-каротина в плазме больше, чем 0,4-0,5 мкмоль/л.

В исследовании, включавшем 10 европейских стран, изучали взаимосвязь между развитием инфаркта миокарда и уровнем каротиноидов в жировой ткани, принимая во внимание ряд параметров, включая возраст, массу тела, социально-экономический статус, курение, гипертонию, историю болезни. Было обнаружено, что ликопин оказывал защитное действие, тогда как другие применявшиеся каротиноиды, включая Р-каротин, практически не проявляли протективных свойств [Kohlmeier L. et.al., 1997].

Способность каротиноидов снижать риск развития сердечнососудистых заболеваний связывают с их действием на различные звенья

патогенеза атеросклероза. Известно, что каротиноиды могут изменять функцию макрофагов [Bendich & Olson, 1989] и усиливать щелевые контакты, связывающие эндотелиальные клетки [Zhang et al., 1992], ß-каротин может блокировать активность липоксигеназы, а также высокое содержание каротиноидов в диете вызывает увеличение концентрации ЛВП в сыворотке пациентов [Hughes et al., 1994].

Часть исследователей не поддерживает гипотезу о превентивном влиянии каротиноидов на риск развития сердечно-сосудистых заболеваний. Vandevijver с соавторами утверждают, что пищевые добавки ß-каротина не связаны со снижением риска сердечно-сосудистых заболеваний и его использование в качестве защитного агента не оправдано [Vandevijver L.P.L. et.al., 1997]. Другие авторы также считают, что эпидемиологические исследования хоть и демонстрируют некоторые интригующие результаты, не показывают определенно, что высокое употребление таких антиоксидантов, как витамины Е и С и ß-каротин, приводит к снижению риска сердечно-сосудистых заболеваний [Vanpoppel G. et.al., 1994].

В АТВС-исследовании здоровых курящих мужчин 50-69 лет, принимавших ежедневно 20мг ß-каротина или 50мг витамина Е, не было обнаружено их влияния на развитие нефатального инфаркта миокарда, ß-каротин не оказывал эффекта на частоту развития сердечно-сосудистых заболеваний со смертельным исходом [Virtamo J. et. al., 1998]. Среди 1862 мужчин, уча ствовавших в этом исследовании и перенесших ранее инфаркт миокарда, увеличилась смертность от сердечно-сосудистых заболеваний в группах, получавших ß-каротин и комбинацию ß-каротина и витамина Е по сравнению с группой "плацебо". Поэтому авторы не рекомендуют использовать добавки ß-каротина и витамина Е в пищу курящих пациентов, ранее перенесших инфаркт миокарда [Rapóla et. al., 1997].

1.3.4. Каротиноиды и обмен холестерина.

Существует возможность непосредственного влияния каротиноидов на обмен холестерина в животных клетках. Еще в 1975 году Gainer и Jones опубликовали данные о том, что водорастворимый политерпеноид кроцетин способен значительно снижать концентрацию холестерина в сыворотке лабораторных животных, находящихся на холестериновой диете [Gainer & Jones, 1975]. Однако, механизм этого феномена остался невыясненным, хотя и были высказаны предположения о возможном метаболическом влиянии этого пигмента на обмен холестерина. В связи с этим необходимо упомянуть об эффектах, которые исследователи отмечали в клинике при испытании и применении родственных

соединений - синтетических терпеноидов. Так, использование в клинике таких синтетических терпеноидов, как этритинат и изотретинион снижает удельное содержание ЛОНП и ЛНП в среднем на 15% и увеличивает содержание ЛВП на 20-35%, то есть приводит к снижению индекса атерогенности [УаЬЦь^ е! а1., 1985]. Результаты, представленные Магзёеп с соавт., свидетельствуют о снижении уровня холестерина в ЛНП с 14.7 до 9.5, а в ЛВП с 11.2 до 4.0 моль холестерин/моль фосфолипидов [МагБёеп е! а1., 1985]. Исследование гиполипид-емического действия эритрината на культуре клеток эпидермальных кератиноцитов позволило установить, что это соединение является ингибитором биосинтеза холестерина в используемых в работе клетках и приводит к снижению общего содержания стеролов в плазматической мембране [Ропес, 1985].

Также было показано, что такие пигменты как ликопин и нейроспорин могут эффективно извлекать холестерин из плазматической мембраны клеток [Говорун и Капитанов, 1992]. Говорун В.М. и Капитанов А.Б. исследовали кинетику переноса холестерина из холестериндонорных липосом в мультиламелярные везикулы, содержащие яичный фосфатидилхолин и различные фракции липидов из плазматической мембраны клеток А.Ыс11а\уй, и обнаружили, что фракция каротиноидов наиболее активна при взаимодействии с холестериндонорными липосомами. Пигменты плазматической мембраны клеток А.1а1с11а\¥п нейроспорин и З^-гидроксинейроспорин проявляли наибольшую активность при адсорбции холестерина из везикул. Кроме пигментов плазматической мембраны клеток А.1а1с11а\уп авторы исследовали кинетику переноса холестерина в везикулы, где вместо пигментов плазматической мембраны клеток А.1а1с11а\уп был использован ликопин - линейный каротиноид, структурно похожий на нейроспорин. Авторы обнаружили сравнимое с нейроспорином сродство ликопина по отношению к холестерину, что позволило им предполагать, что в связывании холестерина с мембраной этого микроорганизма и в его дальнейшем встраивании в мембрану главную роль играет центральная часть молекулы пигмента - цепочка сопряженных двойных связей.

Гиперхолестеринемия - главный фактор риска при атеросклерозе и снижение концентрации холестерина в плазме диетическими добавками каротиноидов может снижать риск сердечно-сосудистых заболеваний [Бшёегтап е! а1., 1980]. 1У^1тс1а81ап с соавт. показали, что диетическая добавка фитостерола мышам, дефицитным по апо-протеину Е, снижает у них концентрацию холестерина в плазме и ингибирует развитие атеросклероза [Мо§11аёаз1ап е! а1., 1996]. Внутривенные иньекции (3-каротина (25мг/кг) в течение 8 недель кроликам, находившимся на атерогенной диете, при водили к значительному снижению общего и ЛНП-холестерина, области атеросклеротического поражения аорты и отсутствию утолщения интимы сосудов, но не влияли на устойчивость

ЛНП к окислению [Sun J.D. et. al., 1997]. Было показано, что синтетические и природные изопреноиды, такие как токотриенолы, обладают гипохолестерин емическим эффектом [Parker et al., 1993, Pearce et al., 1992] Можно полагать, что механизм гипохолестеринемического действия каротиноидов основан на общности первых стадий биосинтеза каротиноидов и холестерина. Известно, что холестерин, являясь важным компонентом мембран животных клеток, поступает в клетку из ЛНП крови посредством рецепторного эндоцитоза [Brown & Goldstein, 1986] и за счет синтеза de novo [Brown & Goldstein, 1980]. Фермент ОМГ-КоА-редуктаза катализирует основную стадию, лимитирующую скорость биосинтеза мевалоната [Goldstein & Brown, 1990], а холестерин является конечным продуктом этого биосинтетического пути. Активность ОМГ-КоА-редуктазы может регулироваться как стерольными, так и не стерольными продуктами мевалонатного пути [Brown & Goldstein, 1980]. ОМГ-КоА-редуктаза, являясь ключевым ферментом также и биосинтеза изопреноидов, определяет не только скорость синтеза холестерина в животных клетках, но и каротиноидов в растительных клетках. Основываясь на общности первых стадий биосинтеза холестерина и каротиноидов и способности конечных продуктов эффективно регулировать ключевой фермент ОМГ-КоА-редуктазу, можно предположить, что ß-каротин и другие изопреноиды могут эффективно ингибировать синтез холестерина в животных клетках.

Недавно было показано, что ß-каротин ингибирует экспрессию ОМГ-КоА-редуктазы в печени крыс по пост-транскрипционному механизму, снижая трансляцию м-РНК фермента [Moreno et al., 1995]. Также продемонстрировано, что ОМГ-КоА-редуктазная активность может регулироваться на пост-транскрипционном уровне нестерольными метаболитами мевалонатного пути [Bradfute et al., 1994]. Различные монотерпены, сесквитерпены, каротиноиды и токотриенолы могут ингибировать активность ОМГ-КоА-редуктазы на пост-транскрипционном уровне снижая синтез холестерина и попутно снижая холестерин в ЛНП [Elson & Qureshi, 1995]

Известно, что неметаболизировавшиеся в клетках кишечника каротиноиды доставляются с помощью ЛНП крови к другим тканям. Wang и Krinsky, исследуя гомогенаты различных тканей, обнаружили, что в тканях печени, почек, легких и жировой ткани человека и животных превращение ß-каротина в ano-ß-каротинали даже более значительно, чем в клетках кишечника [Wang et al., 1991]. Эти данные позволяют предположить, что гипохолестеринемическое действие ß-каротина и ликопина может быть обусловлено в большей степени не "нативной" молекулой каротиноида, а продуктами, образующимися при их всасывании в кишечнике и превращении в других тканах.

Схема образования апо-Р-карогиналей при окислении Р-каротина. /3-каротин

/3-ano -15- каротин ал ь

р-апо- № - к а рот и на ль

.fi-ano-12 '-карогпиналь

/3-апо- ю'-кйротиналь

Ji~ano -в'-каротаналь

по-видимому, p-апо-каротинали, являясь естественными гидрофильными продуктами, образующимися в организме из гидрофобных каротиноидов, могут быть алостерическими регуляторами синтеза холестерина в животных клетках. Поэтому применение чистых [3-апо-каротиналей может оказывать более значительный антиатерогенный эффект.

1.4. Окисленные производные р-каротина.

Р-Каротин часто используется как краситель в различных областях пищевой промышленности, при этом подвергаясь действию высоких температур, особенно в кондитерской продукции. Производные Р-каротина - p-апо-каротинали были обнаружены в процессе промышленной переработки пищевых продуктов.

Исследуя устойчивость пигментов к тепловой обработке Lee с соавг. обнаружили, что Р-каротин и кантаксантин были относительно нестабильны при высокоскоростной переработке продуктов [Lee el al., 1978]. Копе и Berset показали, что процесс деградации пигментов начинается во время промышленной обработки и продолжается при хранении пищевых продуктов [Копе & Berset, 1982].

fr /5 i'i /2 W в б [\ А у 7' ^

Ouyang с соавторами показали, что, в процессе дезодорации пальмового масла под вакуумом при 210°С в течение 4 часов, образуются Р-апо-13-каротинон и два Р-апо-каротиналя : р-апо-15-каротиналь и р-апо-М^каротиналь [Ouyang et al., 1980].

Marty и Berset исследовали процессы, происходящие при высокоскоростном перемалывании продуктов, которое широко применяется в пищевой промышленности и сопровождается кратковременным нагреванием до 180°С [Marty & Berset, 1986, 1988]. Они продемонстрировали, что этот процесс также сопровождается окислительной деградацией каротиноидов и идентифицировали среди продуктов окисления Р-каротина следующие соединения : 5,6-эпокси-Р-каротин и ЗДЗ^-диэпокси-р-каротин, 5,8-эпокси-Р-каротин и 5,8,5',8'-диэпокси-Р-каротин, ЗДЗ^-диэпокси-Р-каротин, р-каротин-4-он, Р-каротин-3,Зу-диол, 5,8,5',%'- диэпокси-Р-каротин-3(4)-ол и пять апо-каротиналей с количеством углеродных атомов в цепи от 20 до 30 : от Р-апо-15-каротиналя до Р - а п о - 8 - кар от и ¡ i ал я.

Другие исследователи, моделируя промышленное производство или антиоксидантное действие каротиноидов, проводили их окисление в различных условиях с целью выяснения образующихся продуктов. Например, Onyevu с соавторами, моделируя дезодорацию масла и глубокую жарку жира, нагревали раствор Р-каротина в глицерине до 210°С. Они показали, что нагревание в течение 4 часов до 210°С приводит к практически полному разрушению Р-каротина, сокращение времени нагревания (1ч, 15мин., 5мин.) вызывало меньшее разрушение каротиноида. Исследуя образующиеся при этим производные Р-каротина, они обнаружили продукты углеводородного типа с очень короткой полиеновой системой и наличием гидроксильной или кетоновой группы или комбинации этих двух функциональных групп. Среди этих продуктов присутствовало соединение, относящееся к полициклическим ароматическим углеводородам и только один полиеновый карбонил : Р-апо-13-каротинон [Onyevu et al., 1986].

Для ускорения образования окисленных продуктов каротиноидов Е1-Tinay и Chichester использовали радикальный инициатор, азо-бис-изобутиронитрил (AIBN) [El-Tinay & Chichester, 1970]. Эти соединения при нагревании (37°С) разрушаются до радикалов (R), которые быстро реагируют с кислородом, образуя пероксильные радикалы (R-OO), что позволяет более точно смоделировать процессы, происходящие при антиоксидантном действии каротиноидов in vivo.

В 1984году Burton и Ingold, изучая механизм антиоксидантного действия Р-каротина в системе с радикальным инициатором AIBN, показали, что Р-каротин способен тушить оба типа радикалов как (ROO) так и (R) [Burton & Ingold, 1984]. При этом, окисление каротиноида

является сложным цепным процессом подобно перекисному окислению полиненасыщенных жирных кислот.

Они предложили схему взаимодействия (ROO) радикала с системой коньюгированных двойных связей р-каротина. По их мнению, в результате

образуется промежуточный продукт углерод-центрированный радикал :

ROO* 4

резонансно-стабилизированный

В 1958 году была опубликована одна из первых работ, в которой описываются продукты, образующиеся при антиоксидантном действии каротиноидов [Friend, 1958]. Friend использовал двойную систему окисления для оценки влияния Р-каротина на автоокисление линолеата, катализируемое фталоцианином железа. Он показал, что в этих условиях образуются кроме цис-изомеров Р-каротина также 5,6-эпокси-Р-каротин и 5,6,5/,6/-диэпокси-р-каротин и соединение со спектральными свойствами аурохрома, позднее идентифицированное как 5,8,5/,8/-диэпокси-р-каротин. Также в этой системе им были обнаружены р-апо-13-каротинон и рад коньюгированных полиеновых альдегидов или кетонов. Два из них имели

спектральные свойства

р-апо-Ю^каротиналя и р-апо-^-каротиналя, а

одно ретро-р-апо-9 -каротинона.

Изучая продукты, образующиеся при антиоксидантном действии каротиноидов, El-Tinay и Chichester предложили гипотезу, в соответствии с которой, первыми в процессе автоокисления Р-каротина образуются 5,6-эпоксиды, которые последовательно разрушаются до других окисленных продуктов [El-Tinay & Chichester, 1970]. В частности, они, используя ТСХ, выделили 5,6-эпокси-Р-каротин, 5,8-эпокси-р-каротин и 5,6,5/,6/-диэпокси-p-каротин. Также они обнаружили полиеновые карбонилы, но не охарактеризовали их подробно.

Моделируя антиоксидантное действие p-каротина, Handelman с соавторами исследовали продукты, образующиеся при спонтанном автоокислении Р-каротина, атакже при действии радикального инициатора [Handelman et al., 1991]. Авторы предполагают, что радикальный инициатор может взаимодействовать с любой из 11 коньюгированных двойных связей как в полиеновой цепи, так и в р-иононовом кольце. Для подтверждения своей гипотезы они провели исследование кинетики автоокисления Р-каротина методом ВЭЖХ. Они продемонстрировали, что

на хроматограмме, сделанной уже через 5мннут после начала реакции, присутствуют пики, соответствующие как эпоксидам, так и карбонилам. Анализ хроматограмм, сделанных через 20мин. и 50мин., показал, что последующее накопление этих продуктов происходит примерно с одинаковой скоростью. По их мнению, это свидетельствует о том, что инициация радикальной цепной реакции окисления Р-каротина может происходить в различных участках молекулы каротиноида. Используя методы ВЭЖХ и масс-спектрометрии они идентифицировали среди продуктов окисления Р-каротина как ^Дб^эпокси-р-каротин и 5,6-эпокси-Р-каротин, так и ряд карбонилов от Р-апо-13-каротинона до P-ano-lO7-каротиналя.

Kennedy и Liebler также показали, что 5,6-эпокси-Р-каротин и 15Д57-эпокси-Р-каротин и полярные продукты образуются одновременно в начальной стадии окисления Р-каротина в модельной системе с использованием радикального инициатора AIBN [Kennedy & Liebler, 1991]. В ходе дальнейшего окисления эпоксиды также окисляются до более полярных соединений. По их мнению, образование эпоксидов может быть результатом взаимодействия пероксильных радикалов с полиеновой цепью каротиноида, что приводит к формированию резонансно-стабилизированного пероксильного радикала (1). В результате разрыва пероксильной связи может образовываться эпоксид и освобождаться алкокси радикал (2).

ROO* + -р-каротин ROO-p-каротин* (1)

ROO-P-каротин* -»• RO"+ 5,6-эпокси-Р-каротин (2)

15,15'-эпокси-р-каротин

Авторы считают, что образование эпоксидов играет важную роль в антиоксидантном действии каротиноидов, и 5,6-эпокси-Р-каротин и 15,15'-эпокси-Р-каротин могут быть биохимическими маркерами, свидетельствующими о взаимодействии каротиноидов с пероксильными радикалами в биологических системах.

Krinsky в обзоре, посвященном антиоксидантным свойствам каротиноидов, приводит схему окисления Р-каротина до 5,6-эпокси-р-каротина в результате радикальной атаки по терминальной связи между 5-м и 6-м атомами углерода [Krinsky, 1989].

V, I ROO* RODH w i х/ 1 1

Uk y ЦС x M°v ' x

ГАЕ X = / ^ W W W W ^

Оиуапд с соавторами обнаружили карбонильные соединения, образующиеся из р-каротина в процессе дезодорации пальмового масла [Ouyang е! а1., 1980]. Используя методы инфракрасной- и масс-спектрометрии, они идентифицировали эти соединения как : Р-апо-13-каротинон, р-апо-15-каротиналь и р-апо-М'-каротиналь. Они предположили, что эти вещества образуются в результате атаки кислорода по 13,14-, 15,157- и И^М7-двойным связям в молекуле р-каротина. Для объяснения появления этих продуктов авторы применили предложенный ОЫо1¥ механизм образования карбонильных соединений через диоксетановый промежуточный продукт.

СНз

I о

о'

Эти данные позволяют заключить, что, как при промышленной обработке пищевых продуктов, так и при антиоксидантном действии каротиноидов происходит их ^ окислительная деградация и среди идентифицированных продуктов присутствуют различные эпокси-производные p-каротина и полиеновые карбонилы с длиной цепи от 18 до 30 углеродных атомов.

1.5. Клеточные культуры - экспериментальные модели для изучения каротиноидов.

Экспериментальные исследования действия каротиноидов в биологических системах ограничиваются отсутствием адекватной животной модели, позволяющей точно интерпретировать результаты исследований in vivo. Известно, что наиболее распространенные лабораторные животные - крысы и мыши - являются плохими объектами для изучения абсорбции и тканевого распределения каротиноидов у человека вследствие их физиологических особенностей, в частности, они плохо абсорбируют каротиноиды из пищи [Goodwin, 1980].

Использование для этих целей клеточных культур, являющихся признанными моделями для первичных скрининговых исследований, позволяет изучать непосредственное влияние каротиноидов на клетки человека. Клеточные культуры используют для выявления возможного токсического действия препаратов, а также влияния на пролиферацию клеток. Культуры клеток являются удобным обьектом для предварительного изучения биологической активности и исследования молекулярного механизма действия различных веществ.

Чаще всего клеточные культуры используют для изучения антимутагенного действия каротиноидов. Bertram с соавт. продемонстрировали на культуре клеток, что p-каротин, кантаксантин, а также а-каротин и ликопин могут снижать злокачественную трансформацию, индуцированую метилхолантреном или рентгеновскими лучами [Bertram et al., 1991]. Та же группа авторов использовала культуру клеток СЗН/10Т1/2 для изучения влияния каротиноидов на состояние щелевых контактов и обнаружила, что молекулярное действие этих пигментов связано с регуляцией по типу обратной связи гена коннексина 43, ответственного за выработку одного из важных компонентов щелевого контакта [Zhang et al., 1992].

Эти работы были продолжены на фибробластах и кератиноцитах человека эпидермального происхождения [Acevedo&Bertram, 1995]. Было показано, что p-каротин и криптоксантин вызывают зависимый от времени и дозы эффект усиления щелевых контактов и экспрессию гена коннексина 43 в культуре фибробластов. В случае монослойной культуры кератиноцитов оба каротиноида не влияли на измерямые параметры. При этом и в фибробластах, и в кератиноцитах наблюдался высокий уровень абсорбированных каротиноидов.

Hazuka с соавт. добавляли P-каротин и другие антиоксиданты к культуре клеток В-16 меланомы мыши и наблюдали морфологическую дифференцировку в этих клетках с ингибированием роста и уменьшением выживаемости [Hazuka et al., 1990]. Schwartz с соавт. изучали ингибирование каротиноидами роста опухолевых клеток в культурах. Добавление Р-каротина или кантаксантина до 700мкМ ингибировало пролиферацию клеток культуры карциномы легких (SC-25) или ротовой полости (SK-MES) человека, но не влияло на рост нормальных кератиноцитов человека [Schwartz et al., 1990].

Zhang с соавт. использовали культуру клеток СЗН/10Т1/2 для изучения антиоксидантного действия каротиноидов [Zhang et al., 1991]. Они добавляли различные каротиноиды и а-токоферол к клеткам, а затем контролировали продукцию МДА для измерения скорости перекисного окисления липидов.

Кроме того, клеточные культуры являются удобным обьектом для исследования механизма синтеза холестерина, действия ингибиторов и поиска новых веществ, влияющих на синтез холестерина в организме человека.

Panini с соавт. изучали регуляцию активности фермента ОМГ-КоА-редуктазы стерольными и нестерольными продуктами мевалонатного пути в клетках яичника китайского хомячка, а также влияние этих продуктов на активность двух других ферментов биосинтеза мевалоната : ацетоацетил-КоА-тиолазы и ОМГ-КоА-синтазы [Panini et al., 1989]. Они показали, что нестерольная регуляция специфична только для ОМГ-КоА-редуктазы, в противоположность плеотропной регуляции двух других ферментов биосинтеза стеролов.

Swaminathan с соавт. использовали клеточную линию СНО-К1 для анализа влияния ингибиторов синтеза стеролов на активность фермента ОМГ-КоА-редуктазы. Они показали, что 15-кетостеролы и их 24-гидрокси-и 25-гидрокси-аналоги эффективно снижают уровень активностиОМГ-КоА-редуктазы в фибробластах яичника китайского хомячка [Swaminathan et al., 1992].

Gupta с соавт. применяли в своей работе клеточные линии, характеризующиеся различным составом мембранных липидов и профилем белков : клетки эпителия кишечника (линия 1ЕС-6), фибробласты кожи человека (линия GM-43), трансформированные клетки человеческой печени (линия Hep-G2) и мышиные перитонеальные макрофаги (линия J-774) для изучения действия производных витамина Дз на синтез холестерина и активность ОМГ-КоА-редуктазы [Gupta et al., 1989]. Они обнаружили, что витамин Д3, 25-гидрокси-витамин Дз, 1,25-дигидрокси-витамин Д3, 24,25-дигидрокси-витамин Д3 действуют как ингибиторы биосинтеза холестерина на двух различных уровнях регуляции. Причем, все гидрокси-производные, в отличие от самого витамина Дз, действуют на уровне деметилирования ланостерола, и все исследованные соединения, кроме 1,25-дигидрокси-витамина Дз ингибируют ОМГ-КоА-редуктазу в культивируемых клетках. Характер воздействия этих соединений на различные клеточные линии был примерно одинаков, наблюдались отличия лишь в величине эффекта.

Уже упоминавшаяся в главе 1.3.4. работа Fuhrman с соавторами, посвященная влиянию ликопина и [3-каротина на эндогенный синтез холестерина и активность клеточных рецепторов к ЛНП, также была проведена на культуре макрофаго-подобных клеток (линия J-774 А.1) [Furman et al., 1997].

1.6. Способы солюбилизации каротиноидов.

Введение каротиноидов - липофильных, нерастворимых в воде соединений, в клетки и организм в целом также является серьезной методической проблемой, с которой сталкиваются исследователи при изучении каротиноидов. Применение техники получения в водной фазе жидкокристаллических липидных структур, впервые описанных Bangham в 1965году и названных липосомами,позволило решить проблему доставки в клетки этих нерастворимых в воде пигментов [Bangham, 1965].

Krinsky и Deneke ввели использование липосом для изучения влияния Р-каротина и кантаксантина на перекисное окисление липидов, инициируемое радикалами, и сейчас многие исследователи используют эти модельные мембраны [Krinsky & Deneke, 1982]. Например, Cabrini с соавт. опубликовали работу, посвященную ингибированию окисления липидов липосом с помощью Р-каротина [Cabrini et al., 1986]. Kennedy & Liebler также применяли липосомы для изучения влияния различного парциального давления кислорода на антиоксидантные свойства Р-каротина [Kennedy & Liebler, 1992]. Lim с соавт. с помощью модельных липосом проводили сравнение способности различных каротиноидов : астаксантина, зеаксантина, кантаксантина и Р-каротина инактивировать пероксильные радикалы [Lim et al., 1992].

Применение липосом заметно продвинуло вперед исследование противоопухолевой активности каротиноидов, частично разрешив проблему нерастворимости в воде и связанную с этим сложность введения их в клетки. В частности, Schwartz с соавт. вносили в культуральную среду р-каротин и кантаксантин в липосомальной форме, когда изучали ингибирование каротиноидами роста опухолевых клеток в культурах [Schwartz et al., 1990]. В работах Krinsky также описывается антиканцерогенное действие каротиноидных липосом на клеточные культуры [Krinsky, 1991, Krinsky, 1992].

Grolier с соавт. исследовали возможность использования различных водорастворимых форм каротиноидов для введения в клеточные культуры [Grolier et al., 1992]. Они показали, что исследованные ими липосомы и субмикроэмульсии не токсичны для культуры гепатоцитов крысы. Они обнаружили, что включение Р-каротина в клетки культуры при использовании эмульсии в 2 раза выше, чем при внесении каротиноида в липосомальной форме. Зеаксантин, также использованный в этой работе, гораздо лучше, чем p-каротин абсорбируется культивируемыми клетками. Авторы считают, что это связано с наличием двух полярных ОН-групп на концах молекулы. Изучая механизм взаимодействия пигментов с клетками, авторы показали, что абсорбированные каротиноиды проникают внутрь клеток и предполагают, что механизм абсорбции может быть

энергетически зависим. Данные Lee с соавт. подтверждают гипотезу о рецептор-опосредованном эндоцитозе, включающем определенный мембранный компонент, который узнает и связывает отрицательно заряженные полярные головки липосомальных фосфолипидов [Lee et al., 1992].

Несмотря на широкое применение липосом в лабораторной практике, возникающие в процессе их приготовления проблемы по прежнему не решены. Известно, что по мере увеличения времени озвучивания, препараты однослойных липосом становятся более однородными, однако при этом увеличивается и степень разложения фосфолипидов. Кроме того, озвучивание фосфолипидов приводит к их гидролизу и окислению. Барсуков с соавт. указывают, что уже кратковременное озвучивание яичного лецитина при 5°С в течение 10 минут сопровождается значительным разложением фосфолипидов [Barsucov et al., 1980]. Содержание образующихся из яичного лецитина перекисей несколько снижается при проведении озвучивания в присутствии токоферола, но даже в этих условиях не удается полностью избежать перекисного окисления [Barsucov et al., 1980]. Однако, ряд авторов утверждает, что при тщательно контролируемых условиях яичный лецитин удается озвучить без заметного разложения [Huang, 1972, Litman, 1973, Newman&Huang, 1975].

Липосомы, содержащие полиненасыщенные липиды, в присутствии кислорода подвергаются автоокислению. Основными стадиями процесса автоокисления являются: миграция двойных связей с образованием сопряженных систем, образование гидроперекисей, циклизация и последующее расщепление цепей с образование малонового диальдегида, альдегидов и кислот с укороченными цепями. Процесс инициируется отщеплением водорода от сх-метиленовых групп с образованием свободных радикалов.

Другие, известные из литературы, биологически-доступные формы каротиноидов включают в себя суспензии и растворы в растительном масле [Bukin et al., 1993], водные дисперсии [Leo et al., 1992], стабилизированные додецилсульфатом натрия мицеллы [Pryor et al., 1988], растворы каротиноидов в различных растворителях, таких как этанол или диметилсульфоксид [Abril et al., 1989, Hazuka et al., 1990]. К недостаткам этих препаратов относится : низкая концентрация каротиноида в "растворе", большие размеры частиц в дисперсии, которые обуславливают слабое включение каротиноидов в клетки, а также токсичность и независимый эффект дополнительных компонентов этих препаратов.

Для исследования биологических функций каротиноидов в системе in vitro наиболее предпочтительным методом их солюбилизиции является "раствор" в органическом растворителе тетрагидрофуране (ТГФ). В работе

Bertram с еоавт. обосновывается преимущество использования данного метода для введения каротиноидов в клеточные культуры [Bertram et al., 1991]. Исследуя возможность применения в этом качестве различных растворителей, они обнаружили, что при внесении в культуральную среду гексан не смешивался с водой и испарялся с поверхности, приводя к низкой биодоступности каротиноидов, хлороформ был токсичен, диметилсульфоксид (ДМСО) и смесь ацетон-ДМСО не позволяли получить достаточно высокую концентрацию каротиноидов. Они продемонстрировали, что выбранный ими ТГФ, являясь одним из лучших растворителей каротиноидов [Khachik et al., 1988], позволял эффективно доставлять каротиноиды в клетки. При этом токсического эффекта на клетки ЮТ 1/2 при добавлении до 10"5М P-каротина они не обнаружили. Также они определили включение в клетки и стабильность в культуральной среде различных каротиноидов : ликопина, p-каротина, а-каротина, лютеина, кантаксантина, метилбиксина, репиерапурпурина.

Bertram с соавт. охарактеризовали физико-химические свойства водного "раствора" p-каротина, который получается в результате внесения концентрированного раствора Р-карогина в ТГФ в водную среду [Bertram et al., 1991]. Они показали, что фильтрация через фильтр с размером пор 0,8мкм происходит с 100% эффективностью, а через фильтр с размером пор 0,2мкм с 81% эффективностью. Это доказывает, что р-каротин представлен не в микрокристаллической форме и такой "раствор" возможно стерилизовать фильтрованием. Авторы обнаружили сдвиг в коротковолновую область спектра поглощения водного "раствора" Р-каротина (1% ТГФ в воде) относительно спектра в ТГФ, что свидетельствует о высоко-упорядоченном состоянии молекулы. При экстракции каротиноида из водного "раствора" органическим растворителем не были обнаружены ни химическая трансформация, ни цис-транс изомеризация p-каротина. Авторы предлагают возможное обьяснение обнаруженных фактов : ТГФ формирует оболочку вокруг одной или более молекул p-каротина, которая поддерживает "жидкое" состояние каротиноида. Предполагают, что кислородные атомы молекулы ТГФ направлены наружу к водному окружению, тогда как неполярные участки молекулы ТГФ солюбилизируют каротиноид [Bertram et al., 1991]. Несмотря на явные достоинства этого метода солюбилизации каротиноидов, его применение ограничивается системой in vitro.

Водорастворимые формы каротиноидов появились относительно недавно, но уже ясны их несомненные преимущества. Кроме применения в экспериментальной работе в качестве способа введения каротиноидов в культуральную среду, использование стабилизаторов позволяет решить проблему всасывания в кишечнике этих сильногидрофобных соединений и

удовлетворения суточной потребности организма человека и животных в витамине А и каротиноидах в целом.

Известно, что биодоступность каротиноидов, содержащихся в пище и коммерческих препаратах, сильно варьирует. Например, только 5% всех каротиноидов из сырых овощей абсорбируется в кишечнике, тогда как из коммерческих гранул всасывается 50% и более [Olson, 1994]. Содержащиеся в пищевых продуктах пектиновые вещества препятствуют эффективному всасыванию каротиноидов. Таким образом, физическая форма, в которой каротиноид представлен в мукозных клетках тонкого кишечника, является круциально важной.

Исследование фармакокинетики всасывания и усвоения пигментов показало в значительной мере нелинейный характер их усвоения из пищевых продуктов. Поэтому, для экспериментальных работ на уровне организма представляется предпочтительным использовать те водорастворимые препараты каротиноидов, при введении которых присходит более эффективное усвоение, и отмечается практически линейная зависимость между количеством используемого препарата и концентрацией каротиноида в крови.

Несколько ведущих химико-фармацевтических концернов, таких как BASF, Hoffman-La Roche, выпускают водорастворимые формы каротиноидов, в основном, как витаминные добавки для сельского хозяйства и пищевой промышленности. В России фирма Аква-МДТ производит водорастворимый препарат р-каротина - "Веторон". Несмотря на использование "Веторона" в некоторых препаратах, эта форма имеет ряд существенных недостатков. Использование Твин-80 в качестве детергента определяет токсичность данного препарата. Поэтому ведущие западные фирмы применяют схемы солюбилизации каротиноидов, используя менее токсичные поверхностно-активные вещества (ПАВ). Например, в методе разработанном фирмой Hoffman-La Roche, каротиноиды включаются в белковый матрикс, образуя микрогранулы, смешивающиеся с водой. Однако, использование этих препаратов в исследовательской работе ограничивается по двум причинам : во-первых, кроме р-каротина и криптоксантина, другие каротиноиды не представлены в виде коммерческих препаратов, во-вторых, входящие в состав препаратов другие химические составляющие могут оказывать эффект независимо от каротиноидов.

В настоящей работе в качестве водорастворимой формы р-каротина и ликопина используется коллоидная дисперсия каротиноида, стабилизированная Проксанолом-268, со средним размером частиц около 200нм. Этот полимер известен как эмульгатор перфторированных углеводородов, входящих в состав так называемой "голубой крови" -отечественного препарата - искусственного кровезаменителя, выполняющего кислородпереносящую функцию гемоглобина. Проксанол-

268 (производство НПО НИОПиК) представляет собой трех-блочный блок-сополимер полиэтиленоксида и полипропиленоксида с молекулярной массой 6000-8000. Гидрофильность полиэтиленоксида (ПЭО) и гидрофобность полипропиленоксида (ППО) определяют

солюбилизирующие свойства проксанола.

Зарубежным аналогом Проксанола-268 является Pluronic F-68 ("Sigma") - неионный сурфактант с молекулярной массой 8400 [Schmolka, 1977]. Известно, что Pluronic F-68 может стимулировать рост культуры клеток человеческих лимфоцитов [Mizrahi, 1975, 1984], куриных фибробластов и клеток меланомы сирийского хомячка [Bentley et al., 1989]. Pluronic F-68 также был использован для защиты культуры клеток млекопитающих от механического повреждения, вызванного обычными методами аэрации [Handa et al., 1989, Mizrahi 1975]. Структурные свойства молекулы Pluronic, которые отвечают за ее защитный эффект, были недавно идентифицированны Murhammer и Goochee [Murhammer & Goochee, 1990].

Хотя точный механизм действия Pluronic на культивируемые клетки не ясен, предполагают, что его стимулирующий эффект на рост клеток может быть связан с увеличением потребления клетками питательных веществ [Mizrahi, 1975, 1984]. Проверяя это предположение, Cawrse с соавторами обнаружили, что 0,05% добавка Pluronic в культуральную среду стимулирует поглощение клетками 2-деоксиглюкозы на 20-30% и увеличивает включение аминокислот на 200% по сравнению с контрольным уровнем в клетках культуры куриных эмбриональных фибробластов [Cawrse et al., 1991].

Указанные свойства Проксанола-268 позволяют предположить, что данное ПАВ может быть использовано для получения не токсичного препарата каротиноидов, удобного не только для исследования биологических функций каротиноидов в системе in vitro, но и для применения в качестве лекарственного средства.

Подводя итог вышесказанному, можно заключить, что каротиноиды -исключительно многофункциональные соединения. Они проявляют не только антиоксидантную и провитаминную активность, но и способны стимулировать иммунную систему и снижать риск развития сердечнососудистых заболеваний. Из-за отсутствия адекватной животной модели метаболизм каротиноидов в животных клетках и в организме человека в целом изучен недостаточно. Поэтому исследование взаимодействия каротиноидов и клеток человека является актуальной задачей.

Обнаруженное в различных эпидемиологических исследованиях гиполипидемическое действие каротиноидов имеет огромное практическое значение. Однако, механизм их антиатерогенного действия изучен недостаточно. Только антиоксидантными свойствами каротиноидов нельзя объяснить их гиполипидемическое действие. Последние данные позволяют предположть, что одним из механизмов гипохолестеринемического действия каротиноидов может быть влияние на ОМГ-КоА-редуктазу -ключевой фермент биосинтеза холестерина в животных клетках.

Известный факт, что каротиноиды являются чрезвычайно нестабильными соединениями, позволяет предполагать, что биологическая активность медицинских препаратов на основе р-каротина может включать также дополнительные эффекты, обусловленные окислением каротиноида. Окисленные производные р-каротина образуются при промышленном производстве и хранении препаратов, а также при взаимодействии с пероксильными радикалами в организме после приема препарата пациентами. Все эти факты обусловливают важность разработки и биохимической характеристики способа солюбилизации каротиноидов с минимальным числом компонентов и максимально щадящим способом приготовления.

Биологическая активность окисленных производных Р-каротина, в частности возможное воздействие на холестериновый обмен, не обсуждается в литературе. Поэтому гипотеза об ингибировании производными Р-каротина - апо-Р-каротиналями биосинтеза холестерина в клетках человека нуждается в экспериментальной проверке. Понимание механизмов влияния окисленных производных р-каротина на обмен холестерина в клетках человека может послужить в дальнейшем для разработки новых гиполипидемических средств.

2. Материалы и методы исследования 2.1. Культивирование клеток

В работе использовали культуру эпидермоидных клеток человека линия А-431, полученную из банка клеточных культур Института Цитологии РАН. Клетки культивировали на смеси сред Игла и 199 в соотношении 1:1 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), 50мкг/мл гентамицина. Для пассирования клетки снимали смесью растворов Версена (0,02% раствор ЭДТА) и трипсина (0,25% раствор) в соотношении 2:1.

В тесте на жизнеспособность клетки выращивали почти до конфлюентного состояния (90-95%) и получали их суспензию в растворе Хенкса. Опытные пробы инкубировли с исследуемыми препаратами в течение 2 часов при 37°С при перемешивании на шейкере. Жизнеспособность клеток оценивали методом исключения витального красителя, используя 0,5% раствор трипанового синего, который окрашивает мертвые клетки в синий цвет [Методы культивирования клеток, 1988].

Для изучения влияния препаратов на пролиферацию и синтез ДНК клетки высевали в культуральные чашки диаметром 60мм в количестве 500 тыс. клеток на чашку в основной среде роста. Через сутки изменяли содержание ЭТС с 10% до 6,5%, меняя культуральную среду и одновременно внося препарат. Концентрацию ЭТС снижали для увеличения продолжительности фаз роста культуры. Для оценки пролиферации в определенные моменты времени в культурах подсчитывали в гемоцитометре число выросших клеток, а также измеряли содержание белка методом Лоури [Lowry, 1951].

Для изучения влияния каротиноидов на содержание холестерина в клетках посев проводили так же. Через сутки инкубации с препаратом в среде с 6,5% ЭТС клетки промывали раствором Хенкса 3 раза по 2мл и экстрагировали липиды.

Для определения влияния каротиноидов на синтез холестерина клетки высевали на культуральные чашки диаметром 35мм в количестве 400 тыс. клеток на чашку в основной среде роста. Через сутки изменяли содержание ЭТС с 10% до 0,5%, меняя культуральную среду и одновременно внося анализируемый препарат. Через 18 часов инкубирования с препаратом вносили меченый ацетат натрия. Минимальное количество сыворотки в среде роста использовали для стимуляции в клетках синтеза холестерина de novo.

2.2. Внесение каротиноидов в культуральную среду

Липосомы и водные дисперсии каротиноидов после стерилизации фильтрацией вносили в культуральную среду одновременно со сменой среды. Концентрация каротиноидов в среде, в основном, не превышала 2х10"3мМ, т.к. при увеличении их концентрации происходит преципитация при внесении препарата в культуральную среду. В случае раствора каротиноида в ТГФ производилось очень быстрое впрыскивание этого раствора в культуральную среду стерильно на магнитной мешалке.

2.3. Определение коньюгированных диенов гидроперекисей липидов

Метод основан на свойствах сопряженных двойных связей, входящих в состав липидных гидроперекисей, интенсивно поглощать в УФ-области с характерными максимумами [Шведова и Полянский, 1992].

Экстракт липидов из липосом упаривали и растворяли в этаноле. Затем регистрировали спектр поглощения в диапазоне длин волн 200-ЗООнм. Поглощение в области 232-234нм связывают с наличием в исследуемом образце коньюгированных диенов. Поглощение при 204-210нм соответствует -С=С- связям в исследуемом образце. По отношению оптических плотностей Д232/Д206 можно судить о степени окисленности липидов.

2.4. Определение синтеза ДНК

Клетки А-431 выращивали, как описано ранее. На вторые сутки инкубации с препаратом в среду культивирования вносили [3Н]-тимидин в концентрации 1 мкКи/мл и инкубировали при 37°С в течение 18 часов. После обработки охлажденной трихлоруксусной кислотой клетки растворяли в Змл 0,Ш ШОН, отбирали аликвоту обьемом ЗООмкл и вносили в сцинтилляционные флаконы с 5мл сцинтиллятора на основе толуола и Тритона Х-100 для водных растворов [Остерман, 1983]. Уровень радиоактивности измеряли в жидкостном сцинтилляционном счетчике ЭЬ 30 "ЫеЛесЬпщие".

2.5. Экстракция липидов

Для экстракции липидов клеточный монослой в чашке Петри диаметром 35мм трижды промывали раствором Хенкса и экстрагировали 2мл смеси гексана и изопропанола в соотношении 3:2. Для удаления нелипидных компонентов экстракты промывали 1,5мл раствора безводного №2804, приготовленного из расчета 1г безводной соли на 15мл воды. После раздела фаз гексановую фракцию отбирали, упаривали под

вакуумом и перерастворяли в необходимом для дальнейшего анализа растворителе [Нага & Radin., 1978].

Липиды из каротиноид-фосфатидилхолиновых липосом экстрагировали смесью хлороформ:метанол (2:1) по методу [Folch et al., 1957].

Каротиноиды из водной дисперсии и из среды культивирования экстрагировали следующим образом : отбирали аликвоту обьемом 401 ООмкл, добавляли 0,6мл этанола и 3 мл гексана или петролейного эфира. После перемешивания добавляли Змл дистиллированной воды и центрифугировали при 1,6 Tbic.g в течение 5 мин. Гексановую фракцию отбирали для последующего спектрофотометрического определения концентрации каротиноидов.

2.6. Тонкослойная хроматография липидов

Экстракты липидов перерастворяли в небольшом обьеме хлороформа и наносили на пластины Keiselgel 60 F-254 "Merck". Разделение липидов, экстрагированных из липосом, проводили в системе растворителей гексан:диэтиловый эфир:метанол:ледяная уксусная кислота (9:2:0,2:0,3) [Кейтс, 1975]. Разделение общих липидов проводили в системе растворителей гексан: диэтиловый эфир: ледяная уксусная кислота (7:3:0,1) [Нага & Radin, 1978]. Проявление хроматограмм проводили в парах йода. Для этого пластины после разделения высушивали на воздухе и помещали в эксикатор с кристаллами йода на 3-5 мин.

Элюирование каротиноидов проводили в системе растворителей хлороформ:метанол (3:2). Элюирование фосфолипидов проводили в системе растворителей хлороформ : метанол : 14N NH4OH (5,6:4,2:0,2).

2.7. Определение содержания фосфолипидов

Определение фосфолипидов проводили по неорганическому фосфору [Vaskovsky et al., 1975]. Элюат, содержащий фосфолипиды, упаривали на водяной бане при температуре 50°С, а затем разлагали в присутствии НСЮ4 при нагревании. В качестве стандарта при построении калибровочной кривой использовали раствор КН2РО4 в пределах от 1мкг до 5мкг фосфора в пробе.

2.8. Определение концентрации каротиноидов

Определение концентрации каротиноидов проводили спектрофотометрически по поглощению экстракта каротиноида в гексане или петролейном эфире, используя коэффициент экстинкции (Е^) 2550 при длине волны 45Ihm для 1% раствора Д-каротина и 3450 при длине

волны 470 нм для 1% раствора ликопина. Спектры каротиноидов регистрировались на спектрофотометре Брекогё М 40.

2.9. Получение ликопина из томатной пасты

Для выделения каротиноидов использовали предварительно лиофилизированную томатную пасту (производства Болгарии). К 10-15 г высушенной томатной пасты добавляли ацетон и проводили экстракцию пигментов, растирая препарат в фарфоровой ступке со стеклянным порошком. После трехкратной экстракции общим объемом растворителя 600-700мл раствор пигментов в ацетоне промывали 0,02% СаСЬ, добавляя 0,2 обьема этого раствора к органической фазе. Затем добавляли 0,4 обьема хлороформа, и органическую фазу отделяли на делительной воронке. Из водной фазы еще дважды экстрагировали липиды хлороформом и объединенный экстракт упаривали на роторном испарителе при 40°С и перерастворяли в хлороформе. Концентрированный раствор каротиноидов в хлороформе наносили на колонку 3x10см с силикагелем Ке1зе1§е1 60, уравновешенную хлороформом. Пигменты элюировали хлороформом, собирая первую окрашенную зону в объеме от 40 до 100мл элюента. Препарат ликопина упаривали и перерастворяли в хлороформе до концентрации 100-150 мг/мл. К концентрированному раствору ликопина добавляли 5 объемов холодного этанола (-20°С), выдерживали при -20°С в течение часа, а затем центрифугировали 5 мин. при 14тыс.об./мин. для отделения выпавших кристаллов ликопина. Чистота полученного ликопина контролировалась хроматографически.

2.10. Приготовление каротиноид/фосфатидилхолиновых липосом

Раствор ликопина или р-каротина в хлороформе смешивали с раствором фосфатидилхолина в этаноле и упаривали досуха на роторном испарителе. После образования пленки липида на стенках круглодонной колбы добавляли 5мл раствора Хенкса на 25мг липида. Количество фосфолипида и каротиноида брали в соотношении 1:1. Водную суспензию липидов озвучивали на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-2Т на ледяной бане. Максимальное время озвучивания было 15мин. Хотя увеличение времени озвучивания и приводило к возрастанию встраивания каротиноидов в липосомы, но при этом вызывало значительное окисление остатков жирных кислот, входящих в состав фосфатидилхолина. Липосомы стерилизовали фильтрацией (диаметр пор 0,45мкм), хранили при +4°С не более 2 дней до использования в экспериментах.

Состав стерильных липосом определяли перед внесением в культуральную среду. При этом экстракцию и разделение липидов с помощью ТСХ проводили,как описано ранее. Концентрацию каротиноидов

определяли епектрофотометричееки, концентрацию фосфатидилхолина-по неорганическому фосфору.

2.11. Приготовление коллоидной дисперсии каротиноидов

Для получения водной дисперсии каротиноида, стабилизированной Проксанолом-268, к 100мл дистилированной воды, нагретой до 70°С, добавляли 50мл 2% раствора каротиноида в хлороформе, содержащего 10% проксанола-268 и нагретого до 50°С [Говорун с соавт., 1993]. При термостатировании (70°С) и интенсивном перемешивании удаляли хлороформ под вакуумом. Избыток каротиноида, выпавший в осадок в виде кристаллов, отфильтровывали. Концентрацию каротиноидов в коллоидных дисперсиях определяли епектрофотометричееки, используя соответствующие коэффициенты экстинкции, как описано ранее. После стерилизации фильтрацией (диаметр пор 0,45мкм) концентрация каротиноида в полученном "растворе" составляла 0,5-0.6%. Размеры частиц определяли по светорассеиванию методом фотон-корреляционной спектроскопии на лазерном нефелометре Autusizer 2с malvern (He-Ne лазер, 633hm, 10мВт).

2.12. Определение накопления холестерина клетками А-431

Клеточный монослой трижды промывали раствором Хенкса, подсушивали и экстрагировали смесью гексана и изопропанола в соотношении 3:2. Количество холестерина в пробах определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке Диасорб 200 С16Т (4x250мм) ("ЭЛСИКО") в режиме изократической элюции в системе ацетонитрил:изопропанол (60:40), при скорости элюции 1 мл/мин с помощью насоса Gilson модель 802С. Детектирование осуществлялось на спектрофотометре Gilson модель 116 по оптическому поглощению при 210нм. Количество холестерина рассчитывали по площади пиков на хроматограмме, используя метод внешнего стандарта и программный пакет фирмы "Gilson" - GME 714.

2.13. Определение синтеза холестерина клетками А-431

Для изучения влияния каротиноидов на синтез холестерина клетки выращивали, как описано ранее. Через 18ч инкубации с препаратом добавляли [14С]-ацетат натрия (3,ЗмкКи/мл) и инкубировали еще 5часов. После экстракции липидов смесью гексан:изопропанол (3:2) монослои растворяли в 0,1 N NaOH и аликвоту отбирали на определение белка методом Лоури [Lowry, 1951]. Из-за наличия в пробах щелочи был изменен состав реактива А: вместо 0,1N NaOH использовали 0,08N NaOH.

Экстракт липидов упаривали под вакуомом. Холестерин выделяли методом ТСХ в системе для общих липидов в присутствии свидетеля, как было описано ранее. Пятна холестерина вырезали и помещали в сцинтилляционные флаконы с 5мл толуольного сцинтиллятора [Остерман, 1983]. Уровень радиоактивности измеряли в жидкостном сцинтилляцион-ном счетчике SL 30 "Intertechnique".

2.14. Окисление Р-каротина

Автоокисление p-каротина (2мг/мл, 3,7мМ) проводили в растворе хлороформа при 37°С в течение 7 суток в темноте с доступом воздуха. Окисление с радикальным инициатором перекисного окисления азо-бис-изобутиронитрилом (AIBN) (0,05мг/мл, 0,ЗмМ) проводили в растворе хлороформа при комнатной температуре во флаконе темного стекла с доступом воздуха в течение трех суток. Скорость окисления контролировали по уменьшению концентрации Р-каротина и появлению окисленных продуктов. Каждые 12-24ч отбирали аликвоту на спектрофотометрическое определение концентрации Р-каротина и аликвоту на исследование с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.

2.15. Колоночная хроматография производных Р-каротина

Деление смеси, полученной при окислении p-каротина, проводили на препаративной колонке 1,5x10см, сорбент Keiselgel 60Н ("Merck"), уравновешенной хлороформом. Элюцию осуществляли хлороформом, скорость элюции 0,5мл/мин. Основываясь на визуальной детекции, получали три окрашенные фракции объемом 7мл, 4,2мл, 5,3мл. Их упаривали на роторном испарителе и перерастворяли в ТГФ для испытания биологической активности на клеточной культуре.

Колоночная хроматография использовалась также как первый этап двуступенчатой очистки окисленных производных каротина. Окисленную смесь упаривали, перерастворяли в 10% диэтиловом эфире в гексане и наносили на колонку 1,5x8см, заполненную в качестве сорбента о^Ьью аллюминия (активность по Brockman и Schodder - I, тип WN-3: нейтральный, "Sigma") и уравновешенную гексаном. Производные Р-каротина разделяли ступенчатым градиентом диэтилового эфира в гексане ( 20мл - 10%, 25мл - 30%, 30мл - 40%, 25мл - 60%, 25мл - 100% и 10мл метанола), при скорости элюции 1мл/мин. [Marty & Berset, 1986]. Были получены 12 фракций, каждая обьемом 10мл. Каждую фракцию характеризовали по спектру поглощения в диапазоне 250-600нм. Фракции упаривали под вакуумом, перерастворяли в гексане для дальнейшего

анализа методом ВЭЖХ и растворяли в ТГФ для исследования влияния на биологическую активность клеточных культур.

Окисленную смесь упаривали под вакуумом и перерастворяли в метаноле перед нанесением на колонку Zorbax ODS (4,6x150мм) для проведения обращенно-фазовой ВЭЖХ. Элюцию осуществляли в изократической системе ацетонитрил:метанол:изопропанол (60:10:30) со скоростью 1 мл/мин [Handelman et al., 1991]. Детектирование проводилось на спектрофотометре Gilson модель 116 по оптическому поглощению при длине волны 380нм. С помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в тех же условиях контролировали чистоту используемых в работе каротиноидов : ß-каротина и ликопина, а также скорость окисления ß-каротина в присутствии радикального инициатора AIBN.

На втором этапе двуступенчатого разделения окисленных производных каротина использовали прямофазную ВЭЖХ на колонке Силасорб SPH 600 (4,6x250мм) ("ЭЛСИКО"). Для выделения индивидуальных веществ из фракций, полученных на препаративной колонке, был использован индивидуальный режим разделения. Фракцию N4, с препаративной колонки, разделяли 2% этилацетатом (ЭА) в гексане, фракцию N5-3% ЭА в гексане, фракцию N6 - 4% ЭА в гексане, фракцию N7 - 5% ЭА в гексане. Детекция осуществлялась на двух длинах волн 380нм и 350нм.

Тест основан на способности карбонильной группы каротиноидов восстанавливаться до спиртовой в присутствии боргидрида калия (КВН4) [СгксЫеу е! а1., 1958]. У карбонильных производных каротиноидов и ретиноидов это приводит к уменьшению полиеновой системы, ведущему к заметному изменению спектральных характеристик. Восстановление карбонильной группы приводит к расщеплению однопикового спектра, характерного для карбонилов, до трехпикового и сдвигу максимума поглощения влево на 30-50нм.

2.16. Разделение производных ß-каротина методом ВЭЖХ

2.17. Тест на наличие карбонильной группы

А,

426 /V / \

отн.ед.

1 - ano-ß-8 -каротиналь

+ КВН4

2

250 длина волны, нм 550

Для проведения реакции окисленные производные |3-каротина растворяли в 1мл этанола, добавляли 50мкл воды и несколько кристалликов КВН4 . Пробы инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 20мин. Получившиеся продукты экстрагировали гексаном. После добавления 1мл воды пробы центрифугировали при 1,6 Tbic.g в течение 5мин для разделения гексановой и водно-спиртовой фазы. Гексановую фазу отбирали и регистрировали спектр поглощения в диапазоне длин волн 250-500нм.

2.18. Тест на наличие 5,6-эпоксидной группы

Соединения, содержащие эпоксидную группировку в составе молекулы, быстро изомеризуются в соответствующие фураноидные оксиды в присутствии следов кислоты [Goodwin, 1980]. Эти структурные изменения вызывают гипсохромный сдвиг максимума спектра поглощения в этаноле: около 20нм для моноэпоксидных и около 40нм для диэпоксидных соединений.

Для проведения реакции анализируемое вещество перерастворяли в этаноле и добавляли Юмкл 0,Ш соляной кислоты. Через ЗОсек. регистрировали спектр поглощения в диапазоне длин волн от 250 до 500нм.

2.19. Тест на наличие 5,6-эпоксидной и 5,8-эпоксидной группы

Каротиноиды, имеющие как 5,6-эпоксидную, так и 5,8-эпоксидную группы в составе молекулы, дают голубую или зеленую окраску в присутствии концентрированной соляной кислоты. Причем, диэпоксиды дают зелено-голубой цвет, а моноэпоксиды - желто-зеленый. Реакцию проводили в смеси диэтиловый эфир, метанол, концентрированная соляная кислота в обьемном соотношении 10:9:1 [Каггег & Люкег, 1950]. Смесь встряхивали в течение часа и визуально регистрировали изменение окраски.

'SiWMfcitÄ

2.20. Определение гидрокси-производных каротиноидов.

Распределительный тест

Для обнаружения гидроксильной группы в составе молекулы использовали различное распределение каротиноидов между гексаном и 95% метанолом [De Ritter & Purcel, 1981]. Моногидроксикаротиноиды распределяются примерно одинаково между гексановым слоем и 95% метанолом, тогда как для углеводородных каротиноидов коэффициент распределения 10:1 между гексановым слоем и 95% метанолом. Исследуемые вещества растворяли в 2мл гексана и добавляли 2мл 95% метанола. После интенсивного перемешивания визуально наблюдали распределение окраски между слоями растворителей.

Реакция дегидратирования

В хлороформе, подкисленном с помощью соляной кислоты, происходит дегидратация каротиноидов, содержащих первичные, вторичные и третичные гидроксильные группы [Davis, 1976]. В случае гидроксильной группы в аллильном положении дегидратация вносит добавочную коньюгированную двойную связь в хромофор. В результате максимум поглощения сдвигается в сторону больших длин волн. При прохождении реакции на 100% в спектре поглощения обнаруживается сдвиг вправо на 16нм для каждой аллильной гидроксильной группы.

Для проведения реакции раствор каротиноида в хлороформе обрабатывают при дневном свете несколькими каплями насыщенного раствора соляной кислоты в хлороформе, приготовленного с помощью насыщения хлороформа концентрированной соляной кислотой. Конечная концентрация соляной кислоты в реакционной смеси была 0,03-0,003 М. Реакция продолжалась 15мин., результаты определяли спектрофото-метрически.

2.21. Статистическая обработка экспериментальных данных

Результаты экспериментов представлены следующим образом:

1. Средними значениями, как минимум, трех независимых экспериментов, отклонение от которых не превышало 5%.

2. Средними величинами и стандартным отклонением средней величины (х ±о-), рассчитанными по данным не менее пяти независимых испытаний.

3. Для проверки достоверности различий между средними арифметическими значениями параметров применяли критерий Стьюдента.

2.22. Использованные реактивы:

- среды Игла и 199 отечественного производства,

- раствор Версена, р-р Трипсина, р-р Хенкса отечественного производства,

- эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) фирмы "Gibco",

- [3Н]-тимидин (14,2 Ки/ммоль) фирмы "Amersham",

- [14С]-ацетат натрия (49 Ки/моль) отечественного производства,

- тетрагидрофуран (ТГФ) фирмы "Merck", дважды перегнанный,

- метанол, ацетонитрил, изопропанол для UV-спектроскопии фирмы "Merck",

- ацетон, гексан, петролейный эфир, хлороформ, толуол для UV-спектро-скопии производства "Лекбиофарм"

- холестерин, фосфатидилхолин фирмы "Sigma",

- соли фирмы "Merck"

- Проксанол-268 производства "НИИОПиК",

- |3-каротин синтетический производства "МЭВЗ", перекристаллизованный перед использованием,

- радикальный инициатор азо-бис-изобутиронитрил (AIBN) и боргидрид калия (КВН4) фирмы "Sigma".

3. Результаты и обсуждение

3.1. Исследование свойств различных форм

солюбилизации каротиноидов 3.1.1. Липосомальная форма каротиноидов

Основная проблема, возникающая при использовании каротиноидов в медицинских или исследовательских целях, связана с преодолением их нерастворимости в воде, обусловленной исключительной неполярностью молекулы пигмента. Одним из известных способов преодоления гидрофобности таких соединений является включение их в состав липосом, которые с 1973 года используют в качестве инструмента для изучения клеток и воздействия на них [Gregoriadis&Buckland, 1973]. Фосфолипидные липосомы как способ солюбилизации каротиноидов с 1982 года применяют в работах, посвященных исследованию их антиоксидантных свойств [Кишку &Оепеке, 1982]. Мы также использовали этот способ солюбилизации гидрофобных соединений для исследования биологических функций каротиноидов. В работе были использованы однослойные липосомы, которые получали УЗ-методом.

Для исследования взаимодействия каротиноидов и клеток человека мы использовали модельную систему на основе культуры эпидермоидных клеток (линия А-431). В качестве обоснования использования фосфолипидных липосом, содержащих каротиноиды, для изучения влияния каротинс^ов на обмен холестерина в культивируемых клетках, было проведено тестирование токсичности данной формы введения каротиноидов в клеточную культуру. Токсичность липосом определяли по влиянию на жизнеспособность и пролиферативную активность культивируемых клеток.

Влияние липосомальной формы р-каротина и ликопина на жизнеспособность клеток культуры определяли методом исключения витального красителя (Гл.2.1.). При этом клетки культуры инкубировали в течение 2-х часов в растворе Хенкса с липосомами, содержащими фосфатидилхолин (ФХ) и ликопин или р-каротин в молярном соотношении каротиноид/фосфолипид равном 0,02. В препаратах липосом концентрация каротиноида была 20мкг/мл, фосфатидилхолина 1мг/мл. В использованных в качестве контроля фосфолипидных липосомах концентрация фосфатидилхолина была 1 мг/мл.

Таблица 1 иллюстрирует влияние концентрации каротиноидных липосом в среде инкубации на жизнеспособность клеток культуры. При внесении в среду инкубации контрольных фосфолипидных липосом концентрация фосфатидилхолина в среде инкубации была такая же,как

при внесении каротиноидных липосом в наибольшей концентрации и составляла 200мкг/мл.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Малахова, Майя Владимировна

ВЫВОДЫ:

1. Фосфолипидные липосомы, содержащие каротиноды, оказывают токсический эффект на [культивируемые клетки за счет накопления токсичных продуктов окисления фосфатидилхолина и каротиноидов. Коллоидные дисперсии каротиноидов, стабилизированные Проксанолом-286, не оказывают токсического действия на культуру клеток и обеспечивают высокое включение каротиноида в клетки.

2. Коллоидные дисперсии ^-каротина и ликопина в концентрации 20мкг/мл снижают содержание холестерина в клетках культуры на 24-27% и ингибируют синтез холестерина на 58-71%.

3. Разработан метод 2-х этапного разделения смеси продуктов окисления /3-каротина, позволяющий получать биологически активные соединения.

4. Среди исследованных продуктов окисления Д-каротина наибольшей активностью обладают апо-$-каротинали, которые в концентрации 1 мкг/мл оказывают значительный ингибирующий эффект (на 68-83%) на синтез холестерина в клетках культуры, при этом не оказывая токсического эффекта на клетки.

Заключение

На современном этапе уже достаточно очевидно, что биологические функции каротиноидов не ограничиваются только их антиоксидантным действием. Обнаруженное в исследованиях эпидемиологов снижение риска атеросклероза, не связанное с антиоксидантным эффектом на ЛНП, окисление которых традиционно связывают с поражением сосудов, приводит к необходимости исследования механизма гиполипидемического действия каротиноидов на организм человека.

Серьезную проблему для исследователей каротиноидов представляет их нерастворимость в воде, обусловленная гидрофобными свойствами молекулы каротиноида. Поэтому выбор адекватной формы введения этих веществ в водную среду по-прежнему актуален. Для этого была проведена оценка различных способов солюбилизации каротиноидов в модельной системе на основе клеточной культуры эпидермоидной карциномы человека. Клеточная культура - удобный обьект, часто используемый для изучения каротиноидов. Было обнаружено, что липосомальная форма солюбилизации каротиноидов оказывает токсический эффект на культивируемые клетки. Фосфолипидные липосомы, содержащие р-каротин или ликопин, ингибировали жизнеспособность и пролиферацию клеток культуры. Исследование механизма токсического действия каротиноидных липосом показало, что ультразвуковая обработка в процессе приготовления липосом вызывает накопление коньюгированных диенов в фосфолипидах, входящих в состав липосом, и окисленных производных каротиноида, которые могут оказывать токсический эффект на культивируемые клетки. Кроме того, в липосомальной форме не удается достигнуть концентрации каротиноида в препарате более 20мкг/мл.

Разработанный в нашей лаборатории способ солюбилизации каротиноидов с помощью Проксанола-268 - мягкого ПАВ, входящего в состав «голубой крови», позволил получать препарат с концентрацией каротиноида до бмг/мл (11мМ). В результате изучения свойств коллоидных дисперсий каротиноидов, стабилизированных Проксанолом-268, в модельной системе на основе клеточной культуры было показано, что данная форма введения не оказывает токсического действия на культивируемые клетки, о чем свидетельствовали результаты тестирования влияния на жизнеспособность и пролиферацию клеток. Сравнение с другими водорастворимыми формами ("BASF", "Hoffman-La Roche", "Веторон") показало, что Р-каротин, стабилизированный Проксанолом-268, и препарат фирмы "Hoffman-La Roche" не токсичны вплоть до концентрации 100мкг/мл. Остальные формы обладали выраженной токсичностью при высоких концентрациях. Кроме того, данная солюбилизированная форма обеспечивает высокий уровень включения каротиноида в клетки, поэтому ее применение оправдано как в экспериментальной работе, так и для разработки новых лекарственных форм на основе каротиноидов.

В работах, посвященных исследованию механизма регуляции биосинтеза холестерина, было показано, что фермент ОМГ-КоА-редуктаза, который определяет скорость биосинтеза холестерина в животных клетках, может регулироваться как стерольными так и не стерольными продуктами мевалонатного пути [Goldstein & Brown, 1990]. Общность первых стадий метаболизма холестерина у животных и каротиноидов у растений позволяет высказать предположение о возможности регуляции каротиноидами синтеза холестерина в животных клетках.

В данной работе было исследовано влияние ß-каротина и ликопина (в форме коллоидной дисперсии, стабилизированной Проксанолом-268) на накопление и биосинтез холестерина в клетках культуры. Обнаруженное нами снижение содержания и синтеза холестерина в клетках, инкубированных с препаратом каротиноида, свидетельствует об ингибирующем влиянии ß-каротина и ликопина на активность ОМГ-КоА-редуктазы в животных клетках. Также было обнаружено иншбирующее влияние стабилизатора на биосинтез холестерина в клетках культуры, которое усиливало эффективность действующей субстанции. Полученные нами результаты нашли подтверждение в работе Fuhrman с соавт., в которой было показано, что ß-каротин и ликопин снижают биосинтез холестерина и увеличивают активность ЛНП-рецепторов в культивируемых макрофагах линии J-774 А.1. [Fuhrman et al., 1997]. Можно предположить, что каротиноиды, активируя рецепторное связывание клеток с ЛНП, могут, подобно статинам, известным ингибиторам ОМГ-редуктазы, снижать концентрацию холестерина в плазме и, следовательно, действовать как гипохолестеринемическая пищевая добавка.

Известно, что каротиноиды - высокоактивные соединения, которые легко окисляются как при нагревании, так и в процессе антиоксидантной защиты при попадании в организм человека. В литературе частично описаны производные ß-каротина, полученные в результате нагревания или реакции с радикальным инициатором перекисного окисления. Нами было обнаружено, что окисление ß-каротина вызывает увеличение его ингибирующей активности в отношении синтеза холестерина.

Эксперименты по разделению продуктов, образующихся при автоокислении ß-каротина, показали, что наибольшей активностью обладает фракция, содержащая карбонилы и спирты. После реакции с боргидридом калия, переводящей карбонилы в спиртовую форму, данная фракция на оказывала ингибирующего эффекта на биосинтез холестерина. Этот факт позволил сделать вывод о том, что наибольшей способностью снижать синтез холестерина в клетках культуры обладают карбонильные производные /5-каротина.

Чтобы получить наиболее активные продукты окисления /3-каротина, была разработана система разделения, основанная на принципе двухэтапности. Комбинация метода колоночной хроматографии на первом этапе и метода ВЭЖХ, в специально подобраных условиях, на втором этапе позволила выделить индивидуальные вещества из смеси окисленных производных Д-каротииа.

Полученные на первом этапе фракции обладали различной способностью ингибировать биосинтез холестерина и влиять на пролиферацию клеток культуры. Фракции, которые предположительно содержали карбонильные производные /3-каротина, ингибировали синтез холестерина на 30-45% и не оказывали токсического действия на культивируемые клетки. Среди веществ, выделенных на втором этапе с помощью ВЭЖХ, наибольшей активностью обладали 9 соединений, которые в концентрации 1мкг/мл ингибировали синтез холестерина в клетках культуры на 68-83%. Все соединения имели карбонильную группу, восстановление которой нивелировало их биологическую активность. Шесть активных соединений описаны в литературе [Marly & Berset, 1988; Handelman et al, 1991], для идентификации остальных трех требуются дополнительные исследования.

Подводя итог вышесказанному, можно заключить, что в результате анализа окисленных производных /S-каротиыа, были выделены соединения, относящиеся к карбонильным производным /3-каротина - апо-/3-каротиналям, которые оказывают выраженный ингибирующий эффект на биосинтез холестерина в клетках культуры, при этом не оказывая токсического действия на клетки. Причем, активность данных соединений в 70 раз превышает активность ^-каротина и сравнима с активностью в системе in vitro флувастатина [Fuhrman et al., 1997] вещества, относящегося к группе статинов, широко применяемых в клинике для профилактики атеросклероза.

Обнаруженная значительная биологическая активность окисленных производных /3-каротина позволяет предложить следующее обьяснение механизма влияния каротиноидов на обмен холестерина: в результате окислительной модификации каротиноидов в организме человека и животных под действием диоксигеназ, температуры тела или пероксильных радикалов образуются производные, незначительные количества которых могут определять биологический эффект каротиноидных препаратов,

Эти результаты позволяют по-новому взглянуть на механизм влияния каротиноидов на липидный метаболизм клеток человека. А также могут быть полезны для обнаружения новых гипохолестеринемических агентов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Малахова, Майя Владимировна, 1999 год

Список литературы.

1. Беляев И.К., Зарайский A.B., Лимберг В.К. и Вакулова Л.А. Модификация синтетическим ß-каротином резистентности организма к острым ионизирующим воздействиям. // Вопр. Мед. Химии. — 1992. — Том.38. - Стр.39-41

2. Бриттон Г. // Биохимия природных пигментов. - Москва. Мир. 1986.

3. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. И Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. Наука. М. 1972. М.

4. Говорун В.М. Структурно-функциональные перестройки плазматической мембраны меток A.laidlawii при адаптации к толуолу. // Диссертация на соискание ученой степени кандидита биологических наук. Москва. 1991.

5. Говорун В.М., Капитанов А.Б. Зависимость переноса холестерина из липосом в плазматические мембраны клеток A.laidlawii от содержания в мембранах каротиноидов. // Биологические мембраны - 1992. -Том.9. -N.9. - Р. 940-945

6. Говорун В.М., Осипова С В., Хотченков В.П. Способ получения липофильных витаминов и каротиноидов в водорастворимой форме. Заявка на получение патента : 93051608/050771 от.3.11.1993г., положительное решение от 29.06.1994г.

7. Грацианский H.A. Гиполигшдемические средства (Часть 1). // Кардиология. - 1994. - Том.34. -- Стр.49-63.

8. Грибанов Г.А. // Методы анализа липидов. Лабораторный практикум для студентов химико-биологического факультета. - Калинин. 1980

9. Гудвин Т. // Сравнительная биохимия каротиноидов. 1954.

Ю.Кейтс М. // Техника липидологии. - Москва. Мир. 1975.

П.Карнаухов В.Н. Функции каротиноидов в клетках животных. Наука.

1988. М.

12.Колотилова А.Е., Глушанков Е.П. // Витамины (химия, биохимия и физиологическая роль). - Ленинград. 1976.

1 З.Лопухин Ю.М., Арчаков А.И., Владимиров Ю.А., Коган Э.М. // Холестериноз. - Москва. Медицина. 1983.

Н.Методы культивирования клеток. Ленинград. Наука. 1988.

15.Орлова В.Ф., Бондарева Е.В., Волгина Т.В. с соавт. Изучение гиполипидемического действия in vitro препаратов на основе каротиноидов. // Научно-практическая конференция «Проблемы атеросклероза». Воронеж. Тезисы докладов, стр.74, 1994.

16.0стерман Л. А. /У Исследование биологических макромолекул электрофокусированием,, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. Наука. 1983. М.

17.Перфторуглеродные эмульсии. Препринт. Пущино, 1993.

18.Сергеев А.В. Вакулова Л,А., Шашкина М.Я. и Жидкова Т.А. Медико-биологические аспекты каротиноидов. // Вопр. Мед. Химии. — 1992. -Т.38. - С8-11

19.Феофилова Е.П. // Пигменты микроорганизмов. - Москва. Наука. 1974.

20.Цвет М.С. // Хромолипиды в растительном и животном мире. Варшава. 1910

21.Шведова А.А., Полянский Н.Б. Метод определения коньюгатов гидроперекисей лигшдов в экстрактах из тканей. // Исследование синтетических и природных антиоксиданто" in vitro и in vivo. Наука. 1992. М.

22.Abril E.R., Rybsky J.A., Scuderi P., Warson R.R. Beta-carotene stimulates human leukocytes to secrete a novel cytokine. // J. Leuk. Biol. - 1989. -Vol.45.-P.255-261

23.Acevedo P., Bertram J.S. Liarozole potentiates the cancer chemopreventive activity of and up-regulation of gap Junctional communication and connexin43 expression by retinoic acid and beta-carotene in 1 ОТ 1/2 cells. // Carcinogenesis - 1995. - Vol. 16. - P.2215-2222

24.Albanes D., Virtamo J., Rautalahti M. et al. Serum beta-carotene before and after beta-carotene supplementation, /'/ Eur. J. Clin. Nutr. - 1992. - Vol.46. -P. 15-24

25.Albanes D., Heinonen O.P., Huttunen J.K., Taylor P.R. et al. Effects of alpha-tocopherol ana beta- carotene supplements on cancer incidence in the Alpha-Tocopherol Beta-Carotene Cancer Prevention Study. // Am. J. Clin. Nutr. - 1995. - Vol.62. - P. 1427S -143 OS

26.Albanes D., Heinonen O.P., Taylor P.R. et al. Alpha-Tocopherol ana beta-carotene supplementation and lung cancer incidence in the alpha-tocopherol, beta-carotene cancer prevention study : effects of base-line cherecteristics and study compliance. // J. Natl. Cancer Inst. - 1996. - Vol.88. - P. 15601570

27.Bacer J.M., Dawidowicz E.A. Transmembrane movement of cholesterol in small unilamellar vesicles detected by cholesterol oxidase. // J. Biol. Chem. -1981. - Vol.256. - P.586-588

28.Bangham A.D., Standish. M.M., Watkins J.C. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids. // J. Mol. Biol. - 1965. -Vol.13.-P.238-252

29.Barsucov L.I., Victorov A.V., Vasiienco et al. Investigation of the inside-outside distribution, intermеглbrane exchange and transbilayer movement of phosoholioids in sonicated vesicles by shift reagent NMR. // Biochim. Biophys Acta. - 1980. - VoL598. - P.153-168

30.Bendich A. Carotenoids and the immune response. // J. Nutr. - 1989. -Vol.119.-P.l 12-115

31 .Bendich A. Recent advances in clinical research involving carotenoids. // Pure & Appl. Chem. - 1994, - Vol.66. - P. 1077-1024

32.Bendich A., Olson J A. Biological action of carotenoids. // FASEB - 1989. -Vol.3. -P.1927-1932

33.Bentley P.K., Gares R.M.C., Lowe K.C. et al. In vitro cellular responses to a non-ionic surfactant, Pluronic F-68. // Biotechnology Letters - 1989. -Vol.11.-P.265-268

34.Bertram J.S., Pung A., Churiey M. et al. Diverse carotenoids protect against chemically induced neoplastic transformation. // Carcinogenesis - 1991. -Vol.12.-P.671-678

35.Block and Graft Copolimerization., Vol.2., Ed. R.J.Ceresa; J.Wulley and Sons, L.,N.Y.,Sydney, Toronto. 1976, P. 180

36.Bradfute D.L., Simoni R.D. // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269. - P.6645-6650

37.Broun E.D., Micozzi M.S., Craft N.E.et al. Plasma carotenoids in normal mrn after single ingestion of vegetables or purified beta-carotene. // Am. J. Clin. Nutr.-1979.-Vol. 49.- P. 1258-1265

38.Brown M.S., Goldstein J.L. A receptor-mediated pathway for holesterol homeostasis. // Science. - 1986. Vol. 232. - P. 34-47

39.Brown M.S., Goldstein J.L. Multivalent feed-back regulation of HMG-CoA reductase, a control mechanism coordinating isoprenoid synthesis and cell growth. // J. Lipid. Res. - 1980. - Vol. 21. - P. 505-517

40.Bowen P.E., Mobarhan S., Smith j'.C. H Metods Enzimol. - 1993. - Vol. 214. - P. 3-17

41.Bukin Y.V., Zaridze D.Y., Draudin-Kiylenko V.A. et al. Effect of P-carotene supplementation on the activity of omitine decarboxylase (ODC) in stomach mucosa of patients with chronic atrophic gastritis. // Eur. J. Cancer Prev. -1993.-Vol.2.-P.61-68

42.Burton G.W., Ingold K.IJ. p-Carotene: an unusual tupe of lipid antioxidant. // Science. - 1984. - Vol. 224"- P. 569-573

43.Cabrini L., Pasquali P., Tadolini B. et al. Antioxidant behaviur of ubiquinone and p-carotene incorporated in model membranes. // Free Radic. Res. Cummun. - 1986. - Vol. 2 - P. 85-92

44.Cawrse N.W., de Pomerai D.I, Lowe K.C. Effects of Pluronic F-68 on 2-deoxyglucose uptake and amino acid incorporation into chick embryonic fibroblasts in vitro. // Biomedical Science. - 1991. - Vol.2. - P. 180-182.

45.Clevidence B.A., Bierri J.G. // Metods Enzimol. - 1993.- Vol. 214. - P.33-46

46.Cogdell R.J., Frank H.A. // Boichim. Biophys. Acta. - 1987. - Vol. 895. - P. 63-79

47.Cornwell D.G., Kruger F.A., Robinson H.B. Studies on the absorbtion of beta-carotene and the distribution of total carotenoid in human serum lipoproteins after oral administration. // J. Lipid Res. - 1962. - Vol. 3. - P. 6570

48.Davis B.H. Chemistry and Biochemistry of Plant Pigment. Ed. Britton. 1976. Vol.2.-P.38-165.

49.Dearden S.J., Hunter T.F., Philp J. A raoid method for the preparatios of microvesicles of egg yolk lecithin. // Biochim. Biophys. Acta. - 1982. -Vol.689.-P.415-418

50.De Ritter E., Purcel A.E. Carotenoids as Colorants and Vit A Precursors. 1981.

51.Di M.P., Kaiser S., Sies H. // Arch. Biochem. Biophys . - 1989. - Vol.274. -P.532-539

52.Eicholzer M., Stahelin K.B. and Gey K.F. Inverse correlation between ischemic heart disease and stroke respectively : 12-year follow-up of the Prospective Basel Study // EXS - 1992. - Vol.62. - P.398-410

53.El-Gorab M.J., Underwood B.A. and Loerch J.D.// Boichim. Biophys. Acta. -1975. -Vol.401. -P.265-277

54.Elson C.E., //J. Nutr. - 1995. - Vol.124. -P.1666-1672

55.Elson C.E., Qureshi A.A. Coupling the cholesterol- and tumor-suppressive action of palm oil to the impact of its minor constituents on 3-hydroxy-3-metylglutaryl coenzime A reductase activity. // Prostaglandins Leucot. Essent. Fatty Asids. - 1995. - Vol. 52, - P.205-207

56.E1-Tinay A.H., Chichester C.Ö. Oxidation of ß-carotene. Site of initial attak. // J. Org. Chem. - 1970. - Vol.35. - P.2290-2293

57.Folch J., Lees M.,Stenley G H.S. A simple metod for the isolation and purifications of total lipids from animal tissues. //J. Biol. Chem. - 1957. -Vol.226. - P.497-509

58.Friend J. The coupled oxidation of ß-carotene by linoleate-lipoxidase system and by autoxidizing linoleate. // Chem. Ind. (London) - 1958. - P.597-598

59.Fuhrman B., Avishay E., Aviram M. Hypoholesterolemic Effect of Lycopene and ß-carotene is related to suppression of cholesterol Synthesis and augmentation of LDL receptor activity in macrophages. // Boichem.& Biophys. Res. Com. - 1997. - Vol.233. - P.658-662

60.Fuller C.J., Faulker H., Benaich A. // Amer. J. Clin. Nutr. - 1992. - Vol.56. -P.654-690

61.Gainer J.L., Jones J.R. The use of crocetin in experimrntal atherosclerosis. // Experientia. - 1975. - Vol.31. - P.548-549

62.Gaziano J.M., Hatta A,, Flynn M. et al. Supplementation with beta-carotene in vivo and in vitro does not inhibit low density lipoprotein oxidation. // Atherosclerosis - 1995. - Vol. 112. - P. 187-195

63.Gaziano J.M., Manson I.E. Buring J.E. et al. Dietary antioxidants and cardiovascular disease. // Ann. N.Y. Acad. Sei. - 1992. - Vol.669. - P.249-259

64.Gey K.F., Moser U.K., Jordan P. et. al. Increased Risk of Cardiovascular Disease at Suboptimal Plasma Concentrations of Essential Antioxidants - An Epidemiological Update with Special Attention to Carotene and Vitamin-C.

// Am. J. Clin. Nutr. - 1993. - Vol.57. - P.787-797

65.Gey K.F., Brubacher G.B,, Staheiin H.B. Plasma levels of antioxidant vitamins in relation to ischemic heart diseasis and cancer. // Am. J. Clin. Nutr. - 1987. - Vol.45. - P. 1368-1377

66.Geyer R.P. Surfactants for use in blood replacement preparations. // In Perfluorochemical Oxigen Transport - 1975. - P.25-36

67.Glover J. in Vitamins and Hormones (R.S.Harris and D.J.Ingle, Eds.), N.Y., L.- 1960 - Vol.18.-P.371-386

68.Goldstein J.L., Brown M.S. Regulation of the mevalonate pathway. // Nature. - 1990.-Vol. 343.-P. 425-430

69.Goodman D.S., Huang H.S. Biosinthesis of vitamin A with ratintestinal enzymes. // Science. - 1965. - Vol. 149. - P. 879-880

70.Goodwin T.W. The comparative biochemistry of the carotenoids. L.: Chapman and Hall. 1952.

71.Goodwin T.W. The Biochemistry of the Carotenoids. Vol.1. London: Chapman and Hall. 1980.

72.Goodwin T.W. The Biochemistry of the Carotenoids. Vol.2. Animals. L.; N.Y.: Chapman and Hall. 1984.

73.Gregoriadis G., Buck land R. Enzyme containing liposomes allevate a model for storage disease. - Nature, 1973, Vol. 244. - P. 170-172

74.Grolier P., Azais-Braesco V., Zelmire L. and Fessi H. Incorporation of carotenoids in aqueus sistems: uptace by cultured rat hepatosytes. // Biochim. Biophys. Acta - 1992. - Vol.1111.- P. 135-138

75.Gupta A.K., Seton R. C. and Riidney H. Effect of vitamin D3 derivatives on cholesterol syntesis and HMG-CoA reductase activity in cultured cells. // J. Lipid Research. - 1989. - Vol.30. - P379-386

76.Handa A., Emery A.N.,Spier R.E. Effect ofgas-liquid interfaces on the growth of suspended mammalian cells: mechanisms of cell damage by bubbles. // Enzyme and Microbial Technology. - 1989. - Vol.11. - P. 230235.

77.Handelman G.J., Dratz E.A., Reay C.C., Van Kuijk F.J.G.M. Carotenoids in the human macula and whole retina. // Invest. Ophthalmol. Visual Sci. -1988. - Vol. 29. - P. 850-855

78.Handelman G.J., Van Kuijk F.J.G.M., Chatterjee A., Krinsky N.I. Caracterization of products during the autoxidation of (3-carotene. // Free Radical Biol. & Med. - 1991. - Vol 10. - P. 427-437

79.Hara A., Radin N.S. Lipid Extraction of Tissues with a Low-Toxicity Solvent. // Analitical biochemistry. - 1978. - Vol.90. - P.420-426

80.Hazuka M.B., Egwards-Prasad J., Newman F. et al. Beta-carotene induces morphological differentiation and decreases adenylate cyclase activity in melanoma cells in culture/ /7 J. Am. Coll. Nutr. - 1990. - Vol.9. - P. 143-149

81.Heinonen O.P., A1 banes D., Virtamo J. et al. Prostate cancer and supplementation with alpha-tocopherol ana beta-carotene : incidence and

mortaliti in controlled trial // J. Natl. Cancer Inst. - 1998. - Vol.90. - P.440-446

82.Huang C. Studies on phosphatidylcholine vesicles : Formation and physical characteristics. // Biochemistry. - 1979. - Vol.8. - P.344-359

83.Hughes G.S., Ringer T.V., Francom S.F. et al. Lac of effects of beta-carotene on lipids and sex steroid hormones in hyperlipidemics. //Am. J. Med. Sci. -1994. - Vol.308. - P. 16-22

84.Jana A.K., Agarwal S., Chatteqee S.N. // Radiat. Res. - 1990. - Vol.124. -P.7-15

85Jialal I., Norkus E.P., Cristol L., Grundy S.M. p-Carotene inhibits the oxidative modification of low-density lipoprotein. // Biochim. Biophys. Acta. -1991.-Vol.1086.-P.134-138

86.Johnston T.P., Palmer W.K. Effect of poloxamer 407 on the activity of microsomal 3-hydrixy-3-methylglutaryl CoA reductase in rats. // J. Cardiovascular Pharmacology - 1997. - Vol.29.-P.580-585

87.Kahlweit M. Microemulsions // Science - 1988. - Vol.240. - P.617-621

88.Kanasawud P., Crouzet J.C. Mechanism of formation of volatile compounds by thermal degradation of carotenoids in aqueous medium. 1. p-carotene degradation. // J. Agric. Food Chem. - 1990. - Vol.38. - P.240-243

89.Kaplan L.A., Lau J.M., Stein E.A. // Clin. Physiol. Biohem. - 1990. - Vol.8. -P. 1-10

90.Karrer P., Jucker E. Carotenoids; Edsevier: London. 1950.

91.Keaney J.F., Gaziano J.M., Xu, et.al. Dietary antioxidants preserve endothelium-dependent vessel relaxation in cholesterol-fed rabbits. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 1993,- Vol.90. - P. 11880-11884.

92.Kennedy T.A., Liebler D.C. Peroxyl radical oxidation of P-carotene: Formation of p-carotene epcxydes. // Chem. Res, Toxicol. - 1991. - Vol.4. -P.290-295

93.Kennedy T.A., Liebler D C. Peroxyl radical scvavenging by P-carotene in lipid bilayars. Effect of oxygen partial pressure. // J. Biol. Chem. - 1992. -Vol.267. - P.4658-4653

94.Khachik F., Beecher G.R., Vanderslice J.T. and Furrow G. Liquid Chromatographic Artifacts and Peak Distortion: Sample-Solvent Interactions in the Separation of Carotenoids. // Anal. Chem. - 1988. - Vol.60. - P.807-81131.

95.Kohlmeier L., Kark J.DGomezgracia E. et al. Lycopene and miocardial infarction rise in the EURAMIC Study.// Am. J. of Epidemiology - 1997. -Vol.146.-P.618-626

96.Kone T., Berset C. Stabilité du p-carotene après cuisson-extrusion dans un produit modele a base damidon de mais. // Sci. Aliments. - 1982. - Vol.2. -P.465-472

97.Krinsky N.l. Antioxidant function of carotenoids. // Free Radical Biol. & Med. - 1989. - Vol. 7. - P. 617-635

98.Krinsky N.I. Effects of carotenoids in cellular and animal sistems. // Am. J. Clin. Nutr. - 1991. - Vol. 53, - P. 238-246

99.Krinsky N.I. Anticarcinogemc activities of carotenoids in animals and cellular sistems. // In Free Radicals and Aging, ed. I. Emerit, B.Chance. -1992.- P.227-234

100. Krinsky N.L, Deneke S. The interaction of oxygen and oxyradicals with carotenoids. // JNCI - 1982. - Vol. 69. - P. 205-210

101. Leo M.A., Kim C., Love N., Liefoer C.S. // Hepatology - 1992. - Vol.15. -P.883-889

102. Lee T.C., Chen T., Alid G,, Chichester C.O. Stability of vitamin A and provitamin A in extrusion cooking processing. // AICHE Simposium Series 74- 1978.-Vol. 172.-P. 192-195

103. Lee K.D., Hong K., Papahadjopoulis D. // Biochim. Biophys. Acta. -1992. - Vol.1103. - P. 185-197

104. Lim B.P., Nagao A., Terao J. et al. Antioxidant activity of xanthophyllis on peroxyl radical-mediated phospholipid peroxidation. // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol.1126. - P. 178-184

105. Litman B.J. Lipid mode! membranes: Caracterization of mixed phospholipid vesicles.// Biochemistry. - 1973. - Vol.12. - P.2545-2554

106. Lomnitski L., Bergman M., Schon I., Grossman S. The effect of dietary vitamin E and P-carotene on oxidation processes in the rat testis. // Biochim. Biophys. Acta. - 1991. - Vol. 1082. - P. 101-107

107. Lowry O.H., Rosebrough NX, Farr a.l., Randall R.J. Protein measurment with Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol.193. - P.265-275.

108. Marsden J.R., Laker M.F., Sinister S. Biological effects of isotreionon. // Karger. - 1985.-P. 315-324

109. Marty C., Berset C. Degradation products of trans-P-carotene produced during extrusion cooking. //J, Food Sci. - 1988. - Vol. 53. - N.6. - P. 18801886

110. Marty C., Berset C. . Degradation of trans-P-carotene during heating in sealed glass tubes and extrusion cooking // J. Food Sci. - 1986. - Vol. 51. -N.3. -P.698-702

111. Marty C., Berset C. Factors affecting the termal degradation of all-trans-p-carotene. // J. Agric. Food Chem. - 1990. - Vol. 38. - N.4. - P. 1063-1067

112. Mathews-Roth M.M. Photoprotection by carotenoids. // Fed. Proc.- 1987. -Vol.46. - P. 1890-1893

113. Mathews-Roth M.M., Pathak M.A., Fitzpatrik T.B. et al. Beta-carotene as a photoprotective agent in erythropoietic protoporphyria. // N. Engl. J. Med. -1970. - Vol.282. - P. 1231-1234

114. Matsushita S., Terao J. Singlet oxygen-initiated photoxidation of unsaturated fatty asid esters and inhibitory affects of tocopherols and P-

carotene. In Simic M, Karei M. eds. Autoxidation of food and biological systems. N.Y.: Plenum. ■■ 1980, - P.27-44

115. Miki W. Biological functions and activities of animal carotenoids. // Pure Appl. Chem. - 1991. - Vol.63. P.141-146

116. Miller D.W., Batakova E.V., Waltner T.O. et al. Interactions of pluronic block copolymers wiht brain microvessel endothelial cells: Evidence of two potential pathways for drug absorption. // Bioconjugate Chemistry- 1997. -Vol.8. - P.649-657

117. Mizrahi A. Oxygen in human lvmphoblastoid cell line cultures and effect of polymers in agitated and aerated culture. // Developments in Biological Standartization. - 1984. - Vol.55. - F.93-102

118. Mizrahi A. Pluronic poliols in human lymphocyte cell line cultures. // J. Clinical Microbiology - 1975. - Vol.2. - P. 11-13

119. Moghadasian M.N., McManus B.M., Pritchard P.H. and Frohlich J.J. // Arterioscler. Thromb Vascular Biol. - 1996. - Vol. 17. - P. 119-126

120. Moreno F.S., Rosiello M.R., Manjeshwar S. et al. Effect of beta-carotene on the expression of on 3-hydroxy~3-metylglutaryl coenzime A reductase in rat liver. // Cancer Letters - 1995, - Vol.96. - P.201-208

121. Munshi N., Rapoport N.. Pitt W.G. Ultrasonic activated drug delivery from pluronic P-105 micelles. // Cancer Letters - 1997. - Vol.118. - P. 13-19

122. Murhammer D.W., Goochee C.F. Structural features of nonionic polyglycol polymer molecules responsible for the protective effect in sparged animal cell bioreactors. // Biotechnilogy Progress. - 1990. - Vol.6. - P. 142148.

123. Navab M., Imes S.S., Kama S.Y. et al. Monocyte transmigration inducad by modification of low density lipoprotein in cocultures of human aortic wall cells is due to induction of monocyte chemotactic protein 1 synthesis and is abolished by high density lipoprotein. // J. Clin. Invest. - 1991. - Vol.88. -P.2039-2046

124. Ness G.C., Zhao Z., Lopez D. /'/ Arch. Boichem. Biophys. - 1996. - Vol. 325. - P. 242-248

125. Newman G.C., Huang C. Structure studies of phosphatidylcholine-cholesterol mixed vesicles. // Biochemistry. - 1975. - Vol.14. - P.3363-3370

126. O'Brien D.L., Reiser R. // J. Nutr. - 1979. - Vol. 109. - P. 98-104

127. Ohno M., Sakai T., Tsuchida E. et al. Interaction of human erythrocyte ghosts or liposomes with polyethylene glycol detected by fluorescence polarization. //Biochem. and Biophys.Res. Communs. - 1981. - Vol.102. -P.426-431

128. Olson J.A., Hayaishi O, The enzymatic cleavege of beta-carotene into

vitamin A by soluble enzymes of rat liver and intestine. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1965. - Vol. 54. - P. 1364-1370

129. Olson J.A. Formation and function of vitamin A. // Biosynthesis of Isoprenoid Compounds. Porter, Spurgeos eds. - 1983. - Vol.2. - P.371-412,Wiley and Sons, N.Y.

130. Olson J.A. Boilogical actions of carotenoids. // J. Nutr. - 1989. - Vol. 119.

- P. 94-95

131. Olson J.A. Absorption, transport and metabolism of carotenoids in humans. // Pure & Appl. Chcm.- 1994. - Vol.66. - P. 1011-1016

132. Olson J.A. Benefits and liabilities of vitamin A and carotenoids. // J. Nutr.

- 1996. - Vol.126. - P. 1208-1212

133. Onuewu P.N., Ho C.-T., Baun H. Caracterization of P-carotene termal degradation products in a model food sistem. // JAOCS - 1986. - Vol. 63. -N. 11. - P.1437-1441

134. Ouyang J., Daun H., Chang S.,Ho C.-T. Formation of carbonyl compounds from P-carotene during palm oil deoderization. // J. Food Sci -1980. - Vol.43. - P. 1214-1219

135. Packer J.E., Mahood IS., Mora-Arellano V.O. et al. Free radicals and singlet oxygen scavengers: reaction of a peroxy-radical with P-carotene

-_diphenyl furan and 1 .4-diazobicyclo(2,2.2)-octane. // Biochem. Biophys. Res.

Commun. - 1981. - Vol 98,- P. 901-906

136. Palozza P., Krinsky N.I. Astaxantin and canthaxantin ara potent antioxidants in a membrane medel. // Arch. Biochem. Biophys. - 1992. - Vol. 297.-P. 184-187

137. Palozza P., Krinsky NX The inhubition of radical-initiated peroxidation of microsomal lipids by both p-carotene and a-tocopherol. // Free Radical Biol. Med. - 1991. - Vol. 11. - P. 407-414

138. Panini S.R., Schnirzer-Polokoff R., Spenser T.A. and Sinensky M. Sterol-independent Regulation of 3 -I lydroxy-3 -metylglutary 1-CoA Reductase by Mevalonete in Cinese Hamster Ovary Cells. // J. Biol. Chem. - 1989. -Vol.264.-P.l 1044-11052

139. Parker R.A., Pearce Br:., Clark R.W. et al // J. Biol. Chem. - 1993. -Vol.268.-P.11230-U238

140. Parkers R.S. Carotenoids in human blood and tissues. // J. Nutr. - 1989. -Vol. 119.-P.101-104

141. Pearce B.C., Parker R.A., Deason M.E. et al // J. Med. Chem. - 1992. -Vol.35.-P.3595-3606

142. Peto R., Doll R., Byckley ID., Sporn M.B. Can dietary beta-carotene materially reduce cancer rates? // Nature. - 1981. - Vol.290. - P.201-208

143. Pitt C.AJ. Vitamin A. In Carotenoids. Ed. O.Isler. 1971. P.717-742

144. Ponec M. Retinoid indused effects on lipids sinthesis human epidermal keratinocytes cultured at low and high calcium level. // Karger. - 1985. - P. 514-519

145. Probstfield J.L., Lin Tsai-Lien, Peters J.// Metabolism. - 1985. - Vol.34.

- P.88-91

146. Pryor W.A., Strickland T., Church D.F., comparison of the efficiencies of several natural and synthetic antioxidants in aqueous sodium dodecyl sulfate micelle solutions. // J. Am. Chern. Soc..- 1988. - Vol.110. - P.2224-2229

147. Rapola J.M., Virtamo I., Ripatii S. et al. Randomised trial of alpha-tocopherol ana beta-carotene supplements on incidence of major coronary events in men with previos myocardial infarction. // Lancet - 1997. — Vol.349(9067). - P. 1715-1720

148. Rautalahti M., Albanes D., Virtamo J. et al. Beta-carotene did not work : aftermath of the ATBC study. // Cancer Lett.- 1997. - Vol.114. - P.235-236

149. Roseman M., Litman B.J., Thompson T.E. Transbilayer exchenge of phoaphatidylethanoamine for phosphatidylcholine and N-acetimidoy phoaphatidylethanoamine in single-walled bilayer vesicles. // Biochemistry. -1975. - Vol.14. - P.4826-4830

150. Schmitz H.H., Poor C.L., Wellman R.B., Erdman J.M. // J. Nutr. - 1992. -Vol. 121.-P. 1613-1621

151. Schmolka I.R. A review of block polymer surfactants. // J. Am. Oil Chemists Society. - 1977. - Voi.54. -P. 110-116.

152. Shaish A., Daugherty A., O'Sullivan F. et al. Beta-carotene inhibits atherosclerosis in hyperholrsterolernic rabbits. // J. Clin. Invest. - 1995. -Vol.96. - P. 2075-2082

153. Shi H., Furr H.C., Olson J.A. // Brain Res. Bull. - 1991. - Vol. 26. - P.235-239

154. Sniderman A., Shapiro S., Marpole D. et al // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1980.-Vol. 77.-P. 604-608

155. Steinberg D. Antioxidants and atherosclerosis. A current assessment. // Circulatin. -1991. - Vol.84. - P. 1420-1425

156. Street D.A., Comstok G.W., Salkeld R.M. et al. Serum antioxidants and myocardial infarction - Are iow lewels of carotenoids and alpha tocopherol risk factors for myocardial infarction? // Circulation- 1994. - Vol.90. -P.l 154-1161

157. Sun J.D., Guraud D.W., Moxley R.A., Driscell J.A. Beta-carotene and alpha-tocopherol inhibit the development of atherosclerotic lesions in hyperholesterolemic rabbits.// Int. J. Vit. and Nutr. Res.- 1997. - Vol.67. -P.155-163

158. Swaminathan S., Pinkerton F.T., Numazawa S. et al. Inhibitors of sterol synthesis. Chemical synthesis, spectral propeties and effect on 3-hydroxy-3-metylglutaryl CoA reductase activity on CHO-K1 cells. // J. Lipid Research -1992. -Vol.33. -P. 1503-1515

159. Schwartz J.L., Singh R.P., Teicher B. et al. Induction of a 70-kg protein assosiated with the selecrive cytotoxicity of beta-carotene in human epidermal carcinoma. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1990. - Vol. 169.-P. 941-946

160. Terao J., Yamauchi R., Muracami H. et al. Inhibitory effects of tocopherols and P-carotene on singlet oxigen-initiated photoxidation of methyl linileate and soybean oil. //J. Food Proc. Preserv. - 1980. - Vol.4. -P.79-93

161. Terao J. Antioxidant activity of p-carotene-related carotenoids in solution. // Lipids. - 1989. - Vol.24. - P.659-661

162. Tsukida K., Zechmeister L. The stereoisomerization of p-carotene epoxides and the simulieneous formation of furanoid oxides. // Arch. Biochem. Biophys. - 1958. - Vol. 74. - P. 408-426

163. Vahlquist et al. Lipoprotein metabolism duting sequential trietment with etretinate and isotretinoin in man. // In Retinoids: New trends in research and therapy. Karger.- 1985. P.5I4-519.

164. Vandevijver L.P.L., Kardinaal A.F.M., Grobbe D.E. et al. Lipoprotein oxidation, antioxidants and cardiovascular rise : epidemiologic evidence. // Prostaglandin Leucot. Essent. Fatty Asids. - 1997. - Vol. 57. - P.479-487

165. Vanpoppel G., Kardinaal A., Princen H. and Kok F.J. Antioxidants and coronary heart disease.// Aim. Med. - 1994. - Vol.26. - P.429-434

166. Varis K., Taylor P.R., Sipponen P. et al. Gastritic cancer and prelignant lesions in atrophic gastrit is : controlled trial on the affect of supplementatin with alpha-tocopherol ana beta-carotene. The Helsinki Gastritis Study Group. // Scand. J. Gastroenterol. - 1998. - Vol.33. - P.294-300

167. Vile G.F., Winterbourn C.C, Inhibition of adriamycin-promoted microsomal lipid peroxidation by P-carotene, «-tocopherol and retinal at high and low oxygen partial pressures. // FEBS Lett. - 1988. - Vol.238. -P.353-356

168. Virtamo J., Rapola J.M., Ripatti S. et al. Effect of vitamin E and beta-carotene on incidence of primary nonfatal infarction and fatal coronary heart disease. // Arch. Intern. Med. - 1998. - Vol.158. - P.668-675

169. Wackenroder H. IJber das Oleum radicus Dance Aiterum, das Carotin. // Geiger's Mag. Pharm. 1981. Vol 33. P. 144-172.

170. Wang X.D., Tang G.W., Fox J.G. and Krinsky N.I. et al. Enzymatic conversion of p-carotene into p-apo-carotenals and retinoids by human, monkey, ferret and rat tissues. // Arch. Biochem. Biophys. - 1991. - Vol. 285. -P. 8-16

171. Wang X.D., Krinsky N.L, Tang G.W. and Russel R.M. Retinoic acid can be produced from excentrie clevage of P-carotene in human intestinal mucosa. // Biochemistry. - 1991. - Vol. 30. - P. 9829-9834

172. Watts A., Marsh D., Knowles P.E. Characterization of dymiristoylphosphatidylchoiine vesicles and their dimensional changes through thephase transition : molrcular control of membrane morphology. // Biochemistry. - 1978. - Vol 17. - P. 1792-1801

173. Will O.H., Scovel C.A. Photoprotective functions of carotenoids. // In Carotenoids: Chemistry and Biology. - 1989. - P.229-236

174. Woodal A.A., Lee S.W.,Weesie R.J. et al. Oxidation of cacotenoids by free radicals: relationship between structure and reactivity. // Biochim. Biophys. Acta - 1997. - Vol. 1336. - P.33-42.

175. Zeng S., Furr N.C., Olson J.A. Metabolism of Carotenoid Analogs in Humans. // Am. J.Clin. Nutr. - 1992. - Vol. 56. - P.433-439

176. Zhang L-X., Cooney R.V. and Bertram J.S. // Carcinogenesis. - 1991. -Vol.12. -P.2109-2114

177. Zhang L-X., Cooney R.V. and Bertram J.S. Carotenoids up-regulate connexin43 gene expression independent of pro-vitamin A or antioxidant properties. // Cancer. Res. - 1992. - Vol.52. - P.5707-5712

178. Zechmeister L. Cis-trans isomeric carotenoids, vitamins A and arylpolyens. Viena: Springer. 1962.