Модуляция метастатической активности клеток сирийского хомяка экзогенными онкогенами семейства Ras тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Мартынюк, Анна Васильевна

• Мартынюк, Анна Васильевна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мартынюк, Анна Васильевна

Оглавление.

Список основных сокращений.

I Введение.

II Обзор литературы.

II. 1.1 Белки семейства Ras. Общие сведения.

II. 1.2 Строение белков семейства Ras.

II. 1.3 Мутации генов ras.

II. 1.4 Функциональные области белков Ras.

II. 1.5 Ras и его мембранные транслокации.

II. 1.6 Регуляция активности Ras.

II. 1.6.1 GAP - негативные регуляторы Ras белков.

II. 1.6.2 GEF- положительные регуляторы Ras белков.

11.2 Ras зависимые пути передачи сигнала.

11.2.1 Общая характеристика Ras-ассоциированных сигнальных путей.

11.2.2 Эффекторы Ras.

11.2.2.1 Протеин киназа Rafl.

11.2.2.2 PI3K.

11.2.2.3 Другие эффекторы Ras.

11.3 Ral белки.

11.3.1 Общие сведения.

11.3.2 Белки, взаимодействующие с Ral.

11.3.3 Регуляция активности Ral.

11.3.3.1 Ras зависимая активация Ral.

11.3.3.2 Ras-независимая активация Ral.

11.3.4 Ral зависимые пути передачи сигнала.

II.3.4.1 Эффекторы Ral.

11.3.5 Ral А и RalB.

11.3.6 Основные направления действия Ral - зависимых сигналов.

11.3.6.1 Участие белков Ral в сортировке везикул.

11.3.6.2 Базолатеральная доставка мембранных белков в поляризованных клетках.

11.3.6.3 Нейросекреция.

11.3.6.4 Эндоцитоз.

11.3.6.5 Белки Ral и морфология клетки.

11.3.6.6 Белки Ral и экспрессия генов.

11.3.6.7 Ral белки, пролиферация клеток и онкогенная трансформация55 III Материалы и методы.

Растворы и среды.

Эукариотические клеточные линии.

Культивирование бактериальных клеток.

Трансформация.

Выделение плазмидной ДНК.

Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях.

Трансфекция эукариотических клеток.

Трансфекция вирусных векторов.

Инфицирование клеток вирусом.

Анализ метастатической активности in vivo.

Анализ экспериментальной метастатической активности (ЭМА).

Анализ спонтанной метастатической активности (СМА).

Анализ туморогенности клеток.

Приготовление клеточного лизата.

Вестерн-блот гибридизация.

Определение уровня активности Ral А.

Анализ уровня продукции ММР.

Анализ динамики роста клеток.

Определение интенсивности катаболизации перекиси вородода in vitro .72 Определение ЛД50 перикиси водорода для исследуемых клеточных линий

Определение скорости зарастания раны (wound healing assay).

Определение инвазивных характеристик клеток.

Определение способности образовывать колонии.

Статистическая обработка результатов.

IV Результаты.

Ha-Ras зависимая модуляция метастатической активности RSVтрансформированных фибробластов хомяка.

Супрессия метастатической активности клеток введением доминантно негативной мутантной формы RalA.

RalA зависимая индукция метастазирования.

Характеристика полученных культур In Vitro.

Динамика роста клеток.

Анализ способности клеток образовывать колонии.

Анализ подвижности клеток.

Анализ инвазивных характеристик клеток.

Анализ продукции секретируемых матриксных металлопротеаз.

Определение интенсивности катаболизации перекиси in vitro.

Определение устойчивости клеток к перекиси водорода.

Характеристика экспрессии различных белков в исследуемых клеточных линиях.

Экспрессия S100A4.

Экспрессия паксилина и фосфо-паксилина.

Экспрессия Erkl/Erk2.

Экспрессия Циклина D1.

V Обсуждение результатов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модуляция метастатической активности клеток сирийского хомяка экзогенными онкогенами семейства Ras»

Метастазирование - одно из опаснейших свойств злокачественных опухолей, являющееся основной причиной смертности от онкологических заболеваний.

Способность клетки к метастазированию - это результат отбора в популяции опухолевых клеток в процессе опухолевой прогрессии. Клетки должны приобрести способность выжить в условиях гипоксии, прорасти опухолевую массу, кровеносные и/или лимфатические сосуды, выйти в кровеносное русло, избежать гибели от иммунного ответа, прикрепиться к ткани во вторичном очаге и сформировать вторичный опухолевый узел.

На сегодняшний день имеется огромное количество данных о молекулярных механизмах отдельных составляющих этого процесса, однако они в значительной степени противоречивы. В этой связи особенно актуальным представляется использование биологических моделей, позволяющих изучать метастазирование как комплексный физиологический феномен in vivo.

Эти модели должны обладать свойством, позволящим при экспериментальном изменении какого-либо параметра опухолевой клетки (обработка различными химическими ингибиторами или стимуляторами, введение определенных генетических конструкций) оценить суммарное влияние на метастатический фенотип in vivo. Таким образом, на таких моделях возможно изучение как отдельных составляющих процесса метастазирования с помощью соответствующих тестов, так и целостного процесса. Одним из способов моделирования метастатического процесса является введение дополнительных генетических агентов. Такие агенты изменяют передачу внутриклеточных сигналов и влияют на функциональное состояние клетки. Сравнение молекулярно-биологических различий таких линий является одним из способов идентификации новых генетических маркеров метастазирования.

Одной из таких экспериментальных моделей является система линий трансформированных эмбриональных фибробластов сирийского хомяка. Эта модель уникальна тем, что включает в себя клеточные линии одинакового происхождения, но отличающиеся по метастатической активности in vivo. Она была получена в лаборатории противоопухолевого иммунитета ГУ РОНЦ им. Н.Н Блохина РАМН. Данная экспериментальная модель состоит из линий эмбриональных фибробластов сирийского хомяка, независимо трансформированных in vitro вирусом саркомы Рауса (RSV). Клетки этих линий обладают типично трансформированным фенотипом и различаются по ряду биологических характеристик, в том числе и по уровню метастатической активности. Все полученные линии имели типично трансформированный фенотип и были высокотуморогенны для сингенных животных. При внутривенном введении взрослым хомякам клетки всех линий демонстировали высокую экспериментальную метастатическую активность (ЭМА). Значительные отличия были обнаружены при исследовании спонтанной метастатической активности полученных линий (СМА). Следует отметить, что тест ЭМА представляет собой анализ способности трансформированных клеток, введенных в кровеносную систему, образовывать метастатические узелки в легких. При помощи же теста СМА оценивают метастазирование клеток опухолевой массы, сформировавшейся после введения анализируемых клеток животному подкожно. Таким образом, тест ЭМА отражает уровень выживаемости клеток в условиях противоопухолевой активности организма, тогда как тест СМА - это анализ способности клеток первичной опухоли инвазировать через стенки сосудов организма и образовывать очаги вторичного опухолевого роста. СМА - чрезвычайно важный показатель, так как условия теста наиболее близки к условиям естественного образования метсатазов и в большей степени отражают процесс истинного метастазирования опухолевых клеток. Таким образом, имеющаяся в нашем распоряжении модель дает возможность изучать характер влияния на метастазирование различных генетических агентов.

Онкогены семейства Ras, имея возможность широкого воздействия на передачу самых разнообразных клеточных сигналов, могут модулировать процессы, связанные с опухолевой прогрессией и метастазированием {Chambers A.F. ТискА.В. 1993).

Гены, кодирующие белки Ras, мутируют в 15% всех типов человеческих опухолей, при этом в большинстве опухолей обнаружены мутации только в одном из генов семейства ras (Almoguera С. et at, 1988).

В настоящее время накопилось большое число работ, посвященных роли Ha-Ras в злокачественной трансформации клеток. Однако механизм его влияния на метастазирование до сих пор не ясен.

Более того, конкретные механизмы и роль отдельных эффекторов HaRas в метастазировании варьируют в зависимости от используемых моделей. Получение разных результатов в разных моделях может зависеть от тканеспецифичности, видоспецифичности используемых моделей, а также от того, какой именно ген Ras использовался для модуляции метастазирования.

Ранее на использованной нами модели было показано, что введение активированного онкогена N-Ras не оказывает принципиального влияния на метастатический потенциал трансформированных фибробластов хомяка (:TopolL.Z; etal., 1993).

Вместе с тем, согласно литературным данным, среди представителей семейства Ras на метастазирование в наибольшей мере влияет Ha-Ras (Maruyama С. et at, 2001; Moon A. et al., 2000; Schlatter B. et at, 1992).

Поэтому в данной работе мы решили воспользоваться именно этим онкогеном для модуляции метастатического потенциала.

Целью данной работы является анализ влияния Ha-ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов сирийского хомяка и идентификация сигнальных путей, осуществляющих это влияние.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Трансфекция низкометастазирующих RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка мутантными вариантами активированного Ha-ras: (.Ha-rasV12, Ha-rasVl2G37, Haras VI2S35, Ha-rasV12C40) и сравнительный анализ метастатической активности полученных трансфектантов.

2. Трансфекция активной формы RalA в спонтанно трансформированные и RSV-трансформированные линии фибробластов хомяка. Трансфекция доминантно негативной формы RalA в высокометастазирующие спонтанно трансформированные и RSV-трансформированные линии фибробластов хомяка. Сравнительный анализ метастатической активности полученных линий.

4. Сравнительный анализ молекулярно-биологических характеристик полученных линий: подвижности клеток, скорости пролиферации, способности к инвазии in vitro и колониеобразования.

5. Определение в полученой панели клеточных линий экспрессии белков S100A4, фосфо-паксилина, Erkl/Erk2, ЦиклинаБ1.

6. Определение уровеня секреции металлопротеаз в исследуемых клеточных линиях.

7. Определение устойчивости к перекиси водорода и способности катаболизировать перекись водорода исследуемых клеточных линий.

В результате исследований впервые показано, что активация онкогена Ha-ras существенно увеличивает метастатическую активность RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка, при этом основной вклад вносит Ha-ras/Ral-GDS/Ral-ассоциированный сигнальный путь.

Показано, что в клетках сирийского хомяка, активация Raf киназы не приводит к увеличению метастатической активности.

Было показано, что экспрессия конститутивно активной формы RalA достоверно увеличивает метастатическую активность как RSV-трансформированных, так и спонтанно трансформированных линий эмбриональных фибробластов хомяка.

Впервые показано, что приобретение высокометастатического фенотипа в ходе селекции RSV-трансформированных клеток in vivo ассоциировано с увеличением количества активной формы RalA.

Показано отсутствие зависимости между метастатическим потенциалом исследуемых клеток и уровнем активности матриксных металлопротиеназ 1, 2 и 9 типов. Показано, что экспрессия экзогенной активной формы RalA приводит к снижению уровня экспрессии исследуемых металлопротиеназ.

Показано, что метастатическая активность клеток коррелирует с устойчивостью клеток к перикиси водорода.

Таким образом, получена уникальная модельная система клеточных культур, несущих различные экзогенные последовательности и отличающиеся метастатическим фенотипом. Дальнейшие эксперименты с полученными линиями позволят пролить свет на механизм реализации На-Ras- и RalA- опосредованной модуляции метастазирования в клетках RSV-трансформированных и спонтанно трансформированных фибробластов сирийского хомяка.

II Обзор литературы

Ras зависимые пути передачи сигнала

В данном обзоре литературы представлены современные данные о Ras-зависимых путях передачи сигнала в клетках и их участия в злокачественной трансформации. Особо рассмотрен Ral - ассоциированный путь, как имеющий непосредственное отношение к практической части наших исследований.

II. 1.1 Белки семейства Ras. Общие сведения.

Множество рецепторов различных типов, локализованных на поверхности клетки, обеспечивают широкий спектр ответов на различные сигналы, поступающие извне. Активация этих рецепторов ведет к потрясающему разнообразию биохимических реакций, в которых значительную роль играют малые ГТФазы (Bos L.J. 1998).

ГТФазы представляют собой обширный класс белков, гидролизующих ГТФ. Известно по крайней мере 140 ГТФаз, кодируемых человеческим геномом. Они разделяются на подклассы, в том числе Ras, Rho, Arf, Rab, Kir/Rem/Rad, Rab и Ran подсемейства. Их биологические функции широки и разнообразны, они влияют на пролиферацию, организацию цитоскелета, дифференцировку, нуклеоплазменный транспорт, везикулярный транспорт и экспрессию генов (Takai Y. et al., 2001).

Ras-семейство ГТФаз включает в себя Ras, Rap, R-ras, ТС21, Ral, Rheb (Bos L.J. 1997) и M-ras (R-ras3) (MatsumotoK. et al., 1997). Белки были классифицированы по сходству в эффекторном домене, который определяет взаимодействие с эффекторами.

Белки Ras в геноме позвоночных представлены в трех вариантах: На-Ras, Ki-Ras и N-Ras. У млекопитающих существуют три ras гена, кодирующих почти идентичные белки с молекулярной массой 21 кДа: ген N-ras , ген Ha-ras и ген Ki-ras. Названия двух последних происходят от штаммов вируса, в которых найдены гомологичные вирусные онкогены: Harwey и Kirsten. Гомолог третьего в вирусах не найден. Структуры, и функции этих белков высококонсервативны: белки млекопитающих гомологичны белкам Ras в дрожжах S. cerevisiae (Gibbs J. Marshall S. 1989). Сравнение этих генов на уровне нуклеиновых кислот показало, что их гомология выражена слабо (около 30%), однако их аминокислотные последовательности свидетельствуют о близком родстве этих генов (до 100% в консервативной области белка) (Wigler М. et al., 1984). Протоонкобелки На-Ras, N-Ras и Ki-Ras, имеют 58% гомологию с белками Ral, меньшую гомологию они сохраняют с Rap, (1 и 2), ТС21, M-Ras, R-Ras и Rheb (Bos J. L. 1998).

И Ras, и Ral принадлежат к Ras подобным малым ГТФ-азам, т.е. представляют собой белки, активность которых связана со способностью расщеплять молекулу ГТФ. Расщепив ГТФ и оставшись в ГДФ-связанном виде, они становятся неактивными. Белки, позволяющие малым ГТФ-азам освободиться от связанной молекулы ГДФ и помогающие связаться с активирующей молекулой ГТФ, названы GEF (guanine nucleotide exchange factors) факторами. Белки же, индуцирующие гидролиз связанной молекулы ГТФ до ГДФ, названы GAP (GTPase-activating protein) факторами. Таким образом, белки GEF активируют свои мишени-ГТФ-азы, GAP же -дезактивируют их (см. рис 1).

Нелсгишх* сктояши fl\

Гидрата ГТФ CAt' [ GEJ ] ^"Гстнд.

A ximpot cocrcmrif

Рисунок 1. Схема активации и дезактивации ГТФаз.

Специфический набор факторов GEF и GAP позволяет Ras белкам, активируясь, реагировать на уникальный спектр сигналов и играть важную роль в функционировании клетки,

11.1.2 Строение белков семейства Ras

Белки Ras (р21) являются сравнительно небольшими по размеру и содержат около 190 аминокислотных остатков (Mr=21kDa). Сравнение аминокислотных последовательностей белков RAS у человека выявило четыре области, отличающиеся по степени своей консервативности.

N-концевая область, составляющая примерно одну треть белка, является наиболее консервативной. Вторая область, расположенная в середине белка, составляющая сайты связывания нуклеотидов и эффекторный домен, демонстрируют несколько большую дивергенцию, но все еще сохраняют 85% гомологии, в то время как третья часть, С-конпевая последовательность белков Ras, отличается высокой степенью вариабельности. И, наконец, четвертая часть, С - концевой пептид, связанный с посттрансляционной модификацией, консервативен в пределах Ras-семейства (Taparowsky Е. et al, 1983).

П.1.3 Мутации генов ras

Гены, кодирующие белки Ras, мутируют в 15% всех типов человеческих опухолей (Bos J.L. 1989). При этом для новообразований разной локализации/гистогенеза характерна разная частота мутаций ras.

Как правило, наблюдаются аминокислотные замены в кодонах 12, 13 и 61, 65. Такие активирующие мутации приводят, в зависимости от положения, к двум основным биохимическим изменениям белковой молекулы: уменьшению ее ГТФ-азной активности и облегчению обмена ГДФ на ГТФ. Мутации Ras в кодонах 12, 13 и 61 делают белок постоянно активным в ГТФ связанной форме (Bos J. L. 1995). Эти мутации обуславливают онкогенный эффект белка Ras в 30 % случаев человеческих злокачественных новообразований.

Замены аминокислот в положениях 16, 17, 116, 117, 119, 144 и 146 ускоряют скорость обмена гуанинового нуклиотида и также приводят к повышению активности Ras.

Как правило, мутации ras обнаруживаются в эпителиальных опухолях и при миелолейкозах, тогда как в опухолях нейроэктодермального происхождения и различных лимфоидных новообразованиях они почти никогда не встречаются (Bos J.L. 1989). К опухолям, в клетках которых ras мутирует с наибольшей частотой, относятся аденокарциномы поджелудочной железы (90-95% всех случаев), множественные миеломы (5580%), аденомы и аденокарциномы толстого кишечника, при этом мутации разных генов ras неравномерно распределены в клетках опухолей различных локализаций. Так, в опухолях простаты и мочевого пузыря найдены мутации только в гене Ha-ras, в карциномах поджелудочной железы -преимущественно в гене Ki-ras, а в гемопоэтических новообразованиях - в reHeiV- ras (Almoguera С. etal., 1988; BreivikJ. etal., 1994).

11.1.4 Функциональные области белков Ras

Выделяют несколько функциональных областей белков Ras (см. рис. 2). Аминокислотные остатки с 10-ого по 16-ый и с 56-ого по 59-ый связываются с а и р фосфатными группами ГТФ. Аминокислотные остатки 116-119 и 152165 взаимодействуют непосредственно с гуанином. Аминокислотные остатки с 32-го по 40-ой участвует в связывании эффекторов белка Ras и GAP, Аминокислотные остатки с 60-го по 76-ой связывают у-фосфат ГТФ и также принимают участие во взаимодействии с различными эффекторами. Аминокислотные остатки с 32-го по 40-ой, которые входят в эффекторный домен, консервативны в семействе Ras белков, за исключением белка Ral. Различия в эффекторном домене определяют способность связываться с эффекторами и разницу в конформациях ГТФ и ГДФ- связанных форм белка.

Таким образом, область с первой по 165-ую аминокислоту является наиболее консервативной (85%), в то время как С - концевая область с 165ой по 185ую является гетерогенной в пределах семейства. С- концевой СААХ мотив задействован в пост трансляционной модификации белка и необходим для заякоривания на мембране, что является обязательным условием его нормального функционирования.

Коисерплтшшя область Гоымопш (85%> Гекрокшш

I 21 41 61 81 101 121 Ml 161 Ш вз]з n I f [ [J J JJ iDirtf Him и ]/ЙШ1Ш1 и JJ I ii nialt L^T PTIJID JT fujr Ш unjjf?flf I a MI mmff ш i i uui EftymiHii пштиг пп ]i ши nnn fl s r ir ■ E ^

Рисунок 2. Функциональные области белков Ras.

П.1.5 Ras и его мембранные транслокации

Основная локализация белков семейства Ras - плазматическая мембрана. Они синтезируются в цитозоле, а затем, пройдя ряд посттрансляционных модификаций, прикрепляются к плазматической мембране. Заякоривание белков Ras на мембране необходимо для его правильного функционирования.

Локализация Ras на плазматической мембране клетки осуществляется в несколько стадий. Ras синтезируется в цитозоле в виде предшественника, прикрепление которого к клеточной мембране обеспечивается специальной посттрансляционной модификацией, характерной для всех G-белков. СААХ мотив - триплет, кодирующий цистеин и две алифатические аминокислоты, является триплетом инициации модофикации, он консервативен для всех Ras белков (Willumsen В.М. et al., 1984). В начале фарензил-трансфераза, цитозольный белок, присоединяет фарнезил к цистеиновому остатку в СААХ мотиве. (.Reiss Y. et al., 1990). Затем фарнезилированный СААХ локализует Ras белок на цитозольной стороне эндоплазматического ретикулума, где эндопептидаза Reel удаляет ААХ трипептид (Kim Е. et al., 1999). И, наконец, альфа карбокси группа на фарнезилцистеине метилируется изопренилцистеин-карбоксил метилтрансферазой. (Dai Z. et al., 1998). Ki-Ras по неясным причинам метилируется с большей эффективностью, чем Ha-Ras и N-Ras (Choy Е. et al., 1999). После метилирования Ras занимает одну из двух позиций на клеточной мембране, которые определяются пептидным сигналом, локализованным на амино-конце фарнезилированного по цистеину белка (.Hancock J.F, Paterson Д Marshall C.J., 1990). Ha-Ras и N-Ras к тому же подвергаются пальмитилированию по цистеину в аппарате Гольджи и входят в экзоцитозный путь, проходя через него на мембрану. {Choy Е. et al.,1999). Ki-Ras, который имеет, наряду с цистеиновым остатком, полилизиновую последовательность, минует Гольджи и достигает мембраны, используя неясный пока механизм.

Будучи трансфицированным в клетки, Ha-Ras и N-Ras локализуются не только на эндоплазматической мембране, но и на мембранах аппарата Гольджи, на эндоплазматическом ретикулуме и даже в эндосомах {Howe C.L. et al., 2001). До сих пор остается открытым вопрос, участвует ли пул не связанных с цитоплазматической мембраной белков в передаче сигнала. В нескольких работах предложены варианты ответа на этот вопрос. Матсуда и коллеги показали, что Ras, активируемый EGF в трансформированных клетках зеленой мартышки Cos, локализуется на плазматической мембране и, в меньшей степени, в области складок клеточной мембраны, так называемых мембранных раффлов {Mochizuki et al., 2001; Ohba Y, Kurokawa K, Matsuda M., 2003). С другой стороны, другой белок Ras-семейства, Rap, активируется в ответ на EGF преимущественно в цитозоле {Mochizuki N. et al, 2001).

И. 1.6 Регуляция активности Ras

Как уже упоминалось выше, существует 2 группы факторов, взаимодействующих с ГТФазами: GEF и GAP. Известно множество GEF и несколько GAP, являющиеся, соответственно, положительными и отрицательными регуляторами активности Ras {Ehrhardt A. et al., 2002). При этом для каждого белка Ras семейства существует свой набор таких факторов, связывающихся с ним с разной степенью афинности. Эти различия в специфичности взаимодействия позволяют наборам GEF и GAP разных белков перекрываться между собой.

П.1.6.1 GAP - негативные регуляторы Ras белков

Факторы GAP - (GTPase-activating protein), катализируют гидролиз связанной G-белками молекулы ГТФ. При этом G белки переходят из активной формы в неактивную.

Для Ras белков известны следующие GAP: р120, NF1, RASAL, CAPRI, а также AIP1.

Все эти белки имеют сходное строение и состоят из N - концевого домена, соединяющего GAP с эффекторами, SH2 (Src homology 2) домена, соединяющегося с SH3 (Src homology 3) доменом, центрального Cal-В и РН (pleckstrin homology) домена, отвечающего за ассоциацию белка с мембраной и С-концевого каталитического GAP домена, инициирующего конверсию Ras - ГТФ на Ras - ГДФ (Gawle D. J. et al, 1995; Moran M.F. et al., 1990). pl20 - один из наиболее многофункциональных GAP для Ras. Он имеет вес 120kDa, его экспрессия в опухолях человека гетерогенна (McGlade J. et al., 1993).

В экспериментах по исследованию скорости зарастания «раны» р120 дефицитные клетки не были способны к установлению полярности и продвижению в «рану». Однако дальнейшие исследования показали, что для клеточной подвижности необходим не только Ras-GAP. Он важен для клеточной поляризации как регулятор актиновых стресс - фибрилл и реориентации фокальной адгезии, для чего необходим комплекс с другим GAP - р190 Rho-GAP (.Kulkarni S.V. et al, 2000). Есть сведения, что у р120 есть добавочная функция - предотвращение взаимодействия Ras и Ras-GEF (Giglione С. S. et al, 1997).

Кроме того, р120 - мембрано- ассоциированный субстрат Src киназы (Reynolds, А.В. et al., 1994). В клетках, трансформированных v-src, он фосфорилируется src киназой в ответ на сигналы ростовых факторов (Daniel, J.M. Reynolds, А.В. 1995). В клетке рр120 ассоциирован с комплексом Е-катгерина и р-катенина и способствует их взаимодействию с другими формами кадгеринов (Shimazui Т. et al., 1996). Связь р120 с цитоскелетом подтверждает и тот факт, что в клетках злокачественной астроцитомы р120 принимает участие в FAK- зависимой активации Ras (Fokal Adhesion Kinase) (HeckerT.P. etal., 2004).

Мутации ras в кодонах 12, 13, 59, 61 и 63 уменьшают ГТФ-азную активность и делают белок Ras нечувствительным к действию pl20GAP и NF1 СBarbacidM. 1990).

NF1 - нейрофибромин, член семейства Ras - подобных ГТФаз, является продуктом гена опухолевой супрессии nfl. Мутации этого гена вызывают нейрофиброматоз первого типа, распространенное заболевание, характеризующееся повышением риска образования злокачественных опухолей нервных тканей. Таким образом, NF1 обладает свойствами опухолевого супрессора.

Сходство каталитических доменов NF1 и р120 GAP заставило задуматься о том, что эти белки могут обладать сходными функциями. Действительно, NF1 связывает Ras с большой афинностью и вызывает гидролиз связанной с белком ГТФ (Hiatt К.К. et al, 2001).

Взаимодействие GAP домена NF1 и Ras было показано в экспериментах in vitro (Martin G.A. etal., 1990).

AIP1- недавно открытый белок, содержащий Ras-GAP домен, в результате чего его охарактеризовали как RasGAP. Он локализован на плазматической мембране в комплексе с TNFR1, осуществляющем передачу TNF-индуцированного сигнала по ASK1-JNK сигнальному пути. ASK1 (apoptosis signal regulating kinase-1) относится к семейству МАРЗ-киназ, ведущий МАРК каскад к активации jnk, но не NFkB (Zhang H.Z. et al., 2004).

CAPRI и RASAL недавно открытые Ras-GAP, функционирование которых зависит от концентрации кальция. RASAL активируется кальций-зависимо, будучи связанными с плазматической мембраной. CAPRI реагирует на концентрацию кальция слабее (Liu Q., et al., 2005). Они были открыты в экспериментах по скринированию библиотек по гомологии с фрагментом GAP домена (Allen М. et al., 1998).

Показано, что CAPRI блокирует передачу сигнала на Raf-MAPK путь, при активации внеклеточным введением кальция (Lockyer P.J. et al., 2001).

Аврора киназа (Aurora kinase)- член семейства серин-треониновых Аврора-киназ, играющих ключевую роль в митотической сегрегации хромосом. В экспериментах по поиску белков, связывающихся с Ras, с помощью дигибридной системы был найден GAP домен Аврора киназы (Gigoux V. et al, 2002).

Регуляция GAP осуществляется множеством способов, включая белок-белковые взаимодействия, фосфолипидные взаимодействия, фосфорилирование, внутриклеточные перемещения и протеолитическую деградацию (Bernards A. Settleman J. 2004).

Одним из механизмов регуляции таких важнейших дезактиваторов Ras, как NF1 и pl20Ras-GAP является липид-зависимый. Некоторые фосфолипиды (фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин и др.) и жирные кислоты (например, арахидоновая, линолиевая и миристиловая) оказывают мощное ингибирующее воздействие на каталитический домен этих белков (Tsai, М.Н. et al, 1989; Serth, J. et al, 1991). Однако эти эксперименты, проведенные исследователями in vitro, не дают основания полагать, что в физиологических условиях дело обстоит точно так же.

Для pl20Ras-GAP существует и положительная регуляция. После фосфорилирования, вызваного стимуляцией v-Src или EGF, pl90Rho-GAP связывается с SH2-доменом pl20Ras-GAP. Вследствие этого, Ras и Rho обнаруживают ГТФазную активность, тем самым способствуя диссоциации актиновых филаментов, так как переходят в неактивную ГДФ-связанную конформацию (Fincham V.J. etal., 1999).

11.1.6.2 GEF- положительные регуляторы Ras белков.

GEF (guanine nucleotide exchange factors) факторы, катализируют высвобождение молекулы ГДФ из связанного с G белком состояния. В результате G белок имеет возможность связать молекулу ГТФ и прийти в активное состояние. Как и GAP, GEF имеют общие мотивы в строении.

Классификация GEF основана на гомологии генов, кодирующих эти белки, с дрожжевыми генами, взаимодействующими с белками Ras (Camonis J. et al, 1986; Broek D. et al., 1987). К обширной группе GEF для Ras -подобных ГТФаз относятся такие белки, как CDC25 (ChantJ. et al, 1991), Ras-GRF (Shou С. et al, 1992), mSos-J и mSos-2 (Bowtell D. et al, 1992), а так же продукты генов млекопитающих: dbl (Eva A. et al., 1988; Adams J.M. et al, 1992), bcr (Hariharan I.K. Adams J.M. 1987), Ras-GRF (Shou C. et al, 1992), smgGDS, Sos (Bonfini L. et al, 1992)и дрожжевого гена cdc24 (Miyamoto S. et al, 1987). Белки, кодируемые этими генами, взаимодействуют с Ras белками, активируя их. Белок dbl проявляет GEF активность для CDC42-Hs ГТФазы (Hart M.J. et al, 1991); smgGDS имеет GEF активность для rhoA, K-ras4b, rapla, raplb и racl ГТФаз (KaibuchiK. et al, 1991; Mizuno T. et al.,1991; Hiraoka K. et al, 1992).

Факторы активации для, собственно, белка Ras - достаточно многочисленная группа белков: Sosl и 2, GRF1 и 2, Ost, VAV и др. (Quilliam L. A. et al., 2002).

GEF находятся в цитозоле, пока активация с помощью, например, ростовых факторов не заставляет их локализоваться на мембранах аппарата Гольджи и плазматической, где они взаимодействуют с Ras, активируя его. Причем некоторые GEF активируют разные изоформы Ras с разной эффективностью (Ehrhardt A. etal., 2002).

Активный Ras связывается с белками-мишенями, иначе называемыми эффекторами.

Наиболее изученые эффекторы в клетках млекопитающих - Raf киназа, PI3-K (фосфотидил-инозитол-3-киназа) и группа Ral-GEF белков. Другими эффекторами являются AF6, RASSAL, PLC, Tiaml и MTS-1 (Ehrhardt A. et al., 2002), МЕК1, Rinl, AF6/Rsbl (Lee C.H. et al, 1996). Более подробно эффекторы будут рассмотрении в части "Ras - зависимые пути передачи сигнала".

Таким образом, можно выделить три группы белков, взаимодействующих с Ras: активаторы GEF, дезактиваторы GAP и эффекторы (см. рис. 3).

Рисунок 3. Белки, взаимодействующие с Ras.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Мартынюк, Анна Васильевна

ВЫВОДЫ

1. Онкоген Ha-ras принципиально увеличивает метастатическую активность RSV-трансформированных фибробластов сирийского хомяка. Основной вклад в На-гаэ-зависимую стимуляцию метастазирования вносит Ral-GDS/Ral-ассоциированный сигнальный путь.

2. Экспрессия конститутивно активной формы RalA увеличивает спонтанную метастатическую активность низкометастазирующей RSV-трансформированной линии HET-SR, а так же спонтанную и экспериментальную метастатическую активность спонтанно трансформированной линии STHE. Экспрессия доминантно негативной формы RalA приводит к подавлению как спонтанной, так и экспериментальной метастатической активности клеток.

3. Приобретение высокометастатического фенотипа в ходе селекции RSV-трансформированных клеток in vivo ассоциировано с увеличением продукции активной формы RalA. Введение доминантно негативной формы RalA как в RSV- трансформированные, так и в спонтанно трансформированные клетки, прошедшие селекцию на животных, приводит к супрессии их метастатической активности.

4. Отсутствует зависимость между метастатической активностью клеток, экспрессирующих различные последовательности мутантных белков Ha-ras и RalA, со скоростью их пролиферации и подвижностью. Показано, что среди эффекторов Ha-ras наибольший вклад в скорость пролиферации и подвижность клеток вносят киназы Rafl и PI3-К.

5. Отсутствует связь между метастатическим потенциалом исследуемых клеток и уровнем активности матриксных металлопротеиназ 1, 2 и 9 типов. Показано, что экспрессия экзогенного RalA приводит к снижению активности исследуемых металлопротеиназ.

6. Метастатическая активность клеток ассоциированна с уровенем метаболизации перекиси водорода in vitro и с устойчивостью клеток к перекиси водорода.

7. Стимуляция RalA сигнального пути ассоциированна со снижением уровня экспрессии S100A4 в RSY-трансформированных клетках. Экспрессия доминантно негативной формы RalA приводит к увеличениею уровня фосфорилированной формы паксиллина. Уровень фосфорилирования Erkl/Erk2 не коррелирует с уровнем метастатического потенциала. Уровень экспрессии Циклина D1 повышается при стимуляции Rafl и Р13-К~зависимых сигнальных путей и понижается при стимуляции RalA-ассоциированного сигнального пути.

8. Получена модель обратимого регулирования метастазирования с помощью стимуляции или супрессии малой ГТФазы RalA.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мартынюк, Анна Васильевна, 2006 год

1. Брашишките Д.А. Татосян А.Г. Киселев Ф.Л. Кашлева Е.А. Дейчман Г.И. Различия в распределении провирусов в низко- и высокометастатических вариантах клеток хомяков, трансформированных вирусом Саркомы Рауса Мол. Биол. 1989;23(3):758-64.

2. Agapova L.S. Volodina J.L. Chumakov P.M. Adams J. M, Cory S. Oncogene co-operation in leukaemogenesis. Cancer Surv. 1992;15:119-41.

3. Aguirre-Ghiso J.A. Liu D. Mignatti A. Kovalski K. Ossowski L. Urokinase receptor and fibronectin regulate the ERK(MAPK) to p38(MAPK) activity ratios that determine carcinoma cell proliferation or dormancy in vivo. Mol. Biol. 2001. Cell 12, 863-879.

4. Albright C.A. Giddings B.W. Liu J. Vito M. Weinberg R.A. Characterization of a guanine nucleotide dissociation stimulator for a ras-related GTPase. EMBO J. 1993 Jan;12(l):339-47.

5. Allen, M.; Chu, S.; Brill, S.; Stotler, C.; Buckler, A. : Restricted tissue expression pattern of a novel human rasGAP-related gene and its murine ortholog. Gene 1998.218: 17-25,.

6. Almoguera C, Shibata D, Forrester K, Martin J, Arnheim N, Perucho M. Most human carcinomas of the exocrine pancreas contain mutant c-K-ras genes. Cell. 1988 May 20;53(4):549-54.

7. Andreasen PA, Egelund R, Petersen H.H. The plasminogen activation system in tumor growth, invasion, and metastasis. Cell Mol Life Sci. 2000 Jan 20;57(l):25-40.

8. Andreasen,P.A. Kjoller,L. Christensen,L. Duffy,MJ. 1997. The urokinase-type plasminogen activator system in cancer metastasis: a review. Int. J. Cancer 72, 1 -22.

9. Arteaga C.L. Johnson M.D. Todderud G. Coffey R.J. Carpenter G. Page D.L. Elevated content of the tyrosine kinase substrate phospholipase C-gamma 1 in primary human breast carcinomas. Proc Natl Acad Sci USA. 1991. Dec l;88(23):10435-9.

10. Azuma К, Tanaka M, Uekita T, Inoue S, Yokota J, Ouchi Y, Sakai R,Tyrosine phosphorylation of paxillin affects the metastatic potential of human osteosarcoma.Oncogene. 2005 Jul 14;24(30):4754-64.

11. Bai Y, Edamatsu H, Maeda S, Saito H, Suzuki N, Satoh T, Kataoka T.Crucial role of phospholipase Cepsilon in chemical carcinogen-induced skin tumor development. Cancer Res. 2004 Dec 15;64(24):8808-10.

12. Barbacid M. Ras oncogenes: their role in neoplasia. Eur J Clin Invest. 1990. 20(3):225-35.

13. Bellis S. L. Miller J. T. Turner С. E. Characterization of tyrosine phosphorylation ofpaxillin in vitro by focal adhesion kinase. J. Biol. Chem. 1995. 270,17437-17441.

14. Bernards A. Settleman J. GAP control: regulating the regulators of small GTPases TRENDS in Cell Biology 2004 Vol.14 No.7 July

15. Bernards R, Weinberg RA.A progression puzzle. Nature. 2002 Aug 22;418(6900):823.

16. Berstein G, Blank JL, Jhon DY, Exton JH, Rhee SG, Ross EM. Phospholipase C-beta 1 is a GTPase-activating protein for Gq/11, its physiologic regulator. Cell. 1992 Aug 7;70(3):411-8.

17. Bi K, Roth M G, Ktistakis N T. Phosphatide acid formation by phospholipase D is required for transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi complex. Curr Biol. 1997;7:301-307.

18. Bonfini L, Karlovich CA, Dasgupta C, Banerjee U. The Son of sevenless gene product: a putative activator of Ras. Science. 1992 Jan 31;255(5044):603-6.

19. Bonner, Т. I. S. В. Kerby, P. Sutrave, M. A. Gunnell, G. Mark, and U. R.Rapp. Structure and biological activity of human homologs of ther af/mil oncogene. Mol. Cell. Biol 1985. 5:1400-1407

20. Bos J.L. A target for phosphoinositide 3-kinase: Akt/PKB. Trends Biochem Sci. 1995 Nov;20(ll):441-2. Review. No abstract available.

21. Bos J. L. ras oncogenes in human cancer:.Cancer Res. 1989 Sep l;49(17):4682-9.

22. Bos,J.L. All in the family? New insights and questions regarding interconnectivity of Ras, Rapl and Ral. EMBOJ. 1998.17, 6776-6782.

23. Bowtell D, Fu P, Simon M, Senior P. Identification of murine homologues of the Drosophila son of sevenless gene: potential activators of ras. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Jul 15;89(14):6511-5.

24. Breivik J, Meling GI, Spurkland A, Rognum TO, Gaudernack G. K-ras mutation in colorectal cancer: relations to patient age, sex and tumour location. Br J Cancer. 1994 Feb;69(2):367-71.

25. Broek D, Toda T, Michaeli T, Levin L, Birchmeier C, Zoller M, Powers S, Wigler M. The S. cerevisiae CDC25 gene product regulates the RAS/adenylate cyclase pathway. Cell 1987 Mar 13;48(5):789-99.

26. Brown H A, Gutowski S, Moomaw С R, Slaughter C, Sternweis P C. ADP-ribosylation factor, a small GTP-dependent regulatory protein, stimulates phospholipase D activity. Cell 1993;75:1137-1144

27. Brymora,A. Valova,V.A. Larsen,M.R. Roufogalis,B.D. Robinson,P.J. The brain exocyst complex interacts with RalA in a GTP-dependent manner. Journal of Biological Chemistry 2001. 276, 29792-29797

28. Burack M.A, Silverman MA, Banker G. The role of selective transport in neuronal protein sorting. Neuron. 2000 May;26(2):465-72.

29. Burbee, D.G. Forgacs,E. Zochbauer-Muller,S. Shivakumar,L. Fong,K. Gao,B. Randle,D. Kondo,M. Virmani,A. Bader,S. Sekido,Y. Latif,F. Milchgrub,S. Toyooka,S. Gazdar,A.F. Lerman,M.I. Zabarovsky,E. White,M. Minna,J.D.

30. Epigenetic inactivation of RASSF1A in lung and breast cancers and malignant phenotype suppression. J. Natl. Cancer Inst. 2001 93, 691-699.

31. Camonis J.H, Kalekine M, Gondre B, Garreau H, Boy-Marcotte E, Jacquet M. Characterization, cloning and sequence analysis of the CDC25 gene which controls the cyclic AMP level of Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 1986 Feb;5(2):375-80.

32. Camonis J.H, White MA. Ral GTPases: corrupting the exocyst in cancer cells. Trends Cell Biol. 2005 Jun;15(6):327-32

33. Cantor,S.B. Urano,T. Feig,L.A. Identification and characterization of Ral-binding protein 1, a potential downstream target of Ral GTPases. Mol. Cell Biol. 1995.15, 4578-4584.

34. Chambers, A.F. Tuck, A.B. Ras-responsive genes and tumor metastasis. CritRev Oncog. 1993 4, 95-114

35. Chang,C. Werb,Z. The many faces of metalloproteases: cell growth, invasion, angiogenesis and metastasis. Trends Cell Biol. 2001.11, S37-S43.

36. Chant J, Corrado K, Pringle JR, Herskowitz I. Yeast BUD5, encoding a putative GDP-GTP exchange factor, is necessary for bud site selection and interacts with bud formation gene BEM1. Cell. 1991 Jun 28;65(7):1213-24.

37. Chardin and A Tavitian The ral gene: a new ras related gene isolated by the use of a synthetic probe. EMBO J. 1986 Sep;5(9):2203-8.

38. Charles F.Albright, Barton W.Giddings,Joana Liu, Maja Vito and Robert A.Weinberg' Characterization of a guanine nucleotide dissociation stimulator for a ras-related GTPase The EMBO J. 1993. vol. 1 2 no. 1 pp. 339 -347,

39. Chen LL, Narayanan R, Hibbs MS, Benn PA, Clawson ML, Lu G, Rhim JS, Greenberg B, Mendelsohn J.Altered epidermal growth factor signal transduction in activated Ha-ras-transformed human keratinocytes. Biochem BiophysRes Commun. 1993 May 28;193(l):167-74.

40. Chen Y.G, Siddhanta A, Austin C.D, Hammond S.M, Sung T C, Frohman M A, Morris A J, Shields D. Phospholipase D stimulates release of nascent secretory vesicles from the trans-Golgi network. J Cell Biol 1997;138:495-504

41. Chiang Y.J, Kole H.K, Brown K, Naramura M, Fukuhara S, Hu R.J, Jang IK, Gutkind JS, Shevach E, Gu H. Cbl-b regulates the CD28 dependence of T-cell activation. Nature. 2000 Jan 13;403(6766):216-20.

42. Chien,Y. White,M.A. RAL GTPases are linchpin modulators of human tumour-cell proliferation and survival. EMBO 2003. Rep. 4, 800-806.

43. Choy E, Chiu V.K, Silletti J, Feoktistov M, Morimoto T, Michaelson D, Ivanov I.E, Philips M.R. Endomembrane trafficking of ras: the CAAX motif targets proteins to the ER and Golgi. Cell 1999 Jul 9;98(l):69-80

44. Chung D.C, Brown SB, Graeme-Cook F, Seto M, Warshaw AL, Jensen RT, Arnold A. Overexpression of cyclin D1 occurs frequently in human pancreatic endocrine tumors. J Clin Endocrinol Metab 2000; 85: 4373-378

45. Clough,R.R. Sidhu,R.S. Bhullar,R.P. Calmodulin binds RalA and RalB and is required for the thrombin-induced activation of Ral in human platelets. Journal of Biological Chemistry 2002. 277, 28972-28980.

46. Cowley, S. H. Paterson, P. Kemp, and C. J. Marshall. Activation ofMAP kinase kinase is necessary and sufficient for PC 12 differentiation and for transformation of cells. Се//1994. 77:841-852

47. Cox,A.D. Der,CJ. The dark side of Ras: regulation of apoptosis. Oncogene 2003.22, 8999-9006.

48. Crossthwaite AJ, Hasan S, Williams RJ. Hydrogen peroxide-mediated phosphorylation of ERK1/2, Akt/PKB and INK in cortical neurones: dependence on Ca(2+) and PI3-kinase. JNeurochem. 2002 Jan;80(l):24-35.

49. Daniel J.M, Reynolds A.B. The tyrosine kinase substrate pl20cas binds directly to E-cadherin but not to the adenomatous polyposis coli protein or alpha-catenin. Mol Cell Biol. 1995 Sep;15(9):4819-24.

50. Davis R.J. The mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. J Biol Chem. 1993 Jul 15;268(20):14553-6.

51. Ebinu JO, Bottorff DA, Chan EY, Stang SL, Dunn RJ, Stone JC. RasGRP, a Ras guanyl nucleotide- releasing protein with calcium- and diacylglycerol-binding motifs. Science. 1998 May 15;280(5366):1082-6.

52. Ehrhardt A, Ehrhardt GR, Guo X, Schrader JW. Ras and relatives-job sharing and networking keep an old family together. Exp Hematol. 2002 0ct;30(10):1089-106.

53. Okan E, Drewett V, Shaw P. Jones P. The small-GTPase RalA activates transcription of the urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) gene via an API-dependent mechanism Oncogene 2001. 20, 1816 ± 1824

54. Emerson SD, Madison VS, Palermo RE, Waugh DS, Scheffler JE, Tsao KL, Kiefer SE, Liu SP, Fry DC. Solution structure of the Ras-binding domain of c-Raf-1 and identification of its Ras interaction surface. Biochemistry. 1995 May 30;34(21):6911-8.

55. Essers,M.A. Weijzen,S. Vries-Smits,A.M. Saarloos,I. de Ruiter,N.D. Bos,J.L. Burgering,B.M. 2004. FOXO transcription factor activation by oxidative stress mediated by the small GTPase Ral and JNK. EMBO J. 23, 4802-4812.

56. Eva A, Vecchio G, Rao CD, Tronick SR, Aaronson SA. The predicted DBL oncogene product defines a distinct class of transforming proteins. Proc Natl AcadSci USA. 1988 Apr;85(7):2061-5.

57. Exton J H. Regulation of phospholipase D. Biochim Biophys Acta. 1999;1439:121-133.

58. Feig LA. Ral-GTPases: approaching their 15 minutes of fame. Trends Cell Biol 2003 Aug;13(8):419-25.

59. Feig, L. A. and R. Emkey. Ral gene products and their regulation, Journal Cell Biol 1993. p. 247-258.

60. Feig,L.A. Buchsbaum,R.J. Cell signaling: life or death decisions of ras proteins. Curr. Biol. 2002. 12, R259-R261.

61. Fincham VJ, Chudleigh A, Frame MC. Regulation of pi90 Rho-GAP by v-Src is linked to cytoskeletal disruption during transformation. J Cell Sci. 1999 Mar; 112 (Pt 6):947-56

62. Foster,D. A. RalA requirement for v-Src- and v-Ras-induced tumorigenicity and overproduction of urokinase-type plasminogen activator: involvement of metalloproteases. Oncogene 1999.18, 4718-4725.

63. Fox, J. Goll, D. Reynolds, C. Phillips, D. Identification of two proteins (actin-binding protein and P235) that are hydrolyzed by endogenous Ca2+dependent protease during platelet aggregation. J. Biol. Chem. 1985 260, 1060— 1066;

64. Frankel,P. Aronheim,A. Kavanagh,E. Balda,M.S. Matter, K. Bunney,T.D. Marshall,C.J. RalA interacts with ZONAB in a cell density-dependent manner and regulates its transcriptional activity. EMBO J. 2005. 24, 5462.

65. Gawler DJ, Zhang LJ, Moran MF. Mutation-deletion analysis of a Ca(2+)-dependent phospholipid binding (CaLB) domain within pl20 GAP, a GTPase-activating protein for p21 ras. Biochem J. 1995 Apr 15;307 (Pt 2):487-91.

66. Gibbs J. B. Marshall M. S., The ras oncogene~an important regulatory element in lower eucaryotic organisms. Microbiol Rev. 1989. 53(2):171-85.

67. Gigoux V, L'Hoste S, Raynaud F, Camonis J, Garbay C.Identification of Aurora kinases as RasGAP Src homology 3 domain-binding proteins. J Biol Chem. 2002 Jun 28;277(26):23742-6. Epub 2002 Apr 25.

68. Goch G, Vdovenko S, Kozlowska H, Bierzynski A. Affinity of S100A1 protein for calcium increases dramatically upon glutathionylation. FEBS J. 2005 May;272(10):2557-65.

69. Goi,T. Rusanescu,G. Urano,T. Feig,L.A. Ral-specific cuanine nucleotide exchange factor activity opposes other Ras effectors in PC 12 cells by inhibiting neurite outgrowth. Mol Cell Biol. 1999.19, 1731 -1741.

70. Hahn,W.C. Counter,C.M. Lundberg,A.S. Beijersbergen,R.L. Brooks,M. W. Weinberg,R. A. Creation of human tumour cells with defined genetic elements. Nature 1999.400, 464-468.

71. Hahn,W.C. Dessain,S.K. Brooks,M.W. King,J.E. Elenbaas,B. Sabatini,D.M. DeCaprio,J.A. Weinberg,R.A. Enumeration of the simian virus 40 early region elements necessary for human cell transformation. Mol. Cell Biol. 2002. 22,2111-2123.

72. Hall A. G proteins and small GTPases: Distant relatives keep in touch. Science 1998.279:509.

73. Hamad, N.M. Elconin,J.H. Karnoub,A.E. Bai,W. Rich,J.N. Abraham,R.T. Der,C.J. Counter,C.M. Distinct requirements for Ras oncogenesis in human versus mouse cells. Genes Dev. 2002. 16, 2045-2057.

74. Hancock JF, Paterson H, Marshall CJ. A polybasic domain or palmitoylation is required in addition to the С A AX motif to localize p21ras to the plasma membrane. Cell. 1990 Oct 5;63(l):133-9.

75. Hariharan IK, Adams JM. cDNA sequence for human bcr, the gene that translocates to the abl oncogene in chronic myeloid leukaemia. EMBO J. 1987 Jan;6(l): 115-9.

76. Hart MJ, Shinjo K, Hall A, Evans T, Cerione RA.Identification of the human platelet GTPase activating protein for the CDC42Hs protein. J Biol Chem. 1991 Nov 5;266(31):20840-8.

77. Hecker TP, Ding Q, Rege ТА, Hanks SK, Gladson CL. Overexpression of FAK promotes Ras activity through the formation of a FAK/pl20RasGAP complex in malignant astrocytoma cells. Oncogene. 2004 May 13;23(22):3962-71

78. Henry,D.O. Moskalenko,S. A. Kaur,K.J. Fu,M.F. Pestell,R.G. Camonis,J.H. White,M.A. Ral GTPases contribute to regulation of cyclin D1 through activation of NF-kappaB. Mol Cell Biol. 2000. 20, 8084-8092.

79. Hesson,L. Dallol,A. Minna,J.D. Maher,E.R. Latif,F. NORE1A, a homologue of RASSF1A tumour suppressor gene is inactivated in human cancers. Oncogene 2003. 22, 947-954.

80. Hiatt KK6 Ingram DA6 Zhang Y6 Bollag G6 Clapp DWro Neurofibromin GTPase-activating protein-related domains restore normal growth inNfl-/- cells. J Biol Chem. 2001 Mar 9;276(10):7240-5. Epub 2000 Nov 15.

81. Hill CS, Treisman R. Differential activation of c-fos promoter elements by serum, lysophosphatidic acid, G proteins and polypeptide growth factors. EMBOJ. 1995 Oct 16;14(20):5037-47.

82. Hofer,F. Berdeaux,R. Martin,G.S. Ras-independent activation of Ral by a Ca2+-dependent pathway. Current Biology 1998. 8, 839-842.

83. Howe CL, Valletta JS, Rusnak AS, Mobley WC. NGF signaling from clathrin-coated vesicles: evidence that signaling endosomes serve as a platform for the Ras-MAPK pathway. Neuron. 2001 Dec 6;32(5):801-14.

84. Howe, L. R. S. J. Leevers, N. Gomez, S. Nakielny, P. Cohen, and C. J. Marshall. Activation of the MAP kinase pathway by the protein kinase raf. Cell 1992.71:335-342.

85. Hsu, S. С. Hazuka, С. D. Foletti, D. L. Scheller, R. H. Trends Cell Biol 1999. 9, 150-153

86. Hsu, M.Y. Meier,F. Herlyn,M. Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host. Differentiation 2002. 70, 522536.

87. Huang PS, Davis L, Huber H, Goodhart PJ, Wegrzyn RE, Oliff A, Heimbrook DC. An SH3 domain is required for the mitogenic activity of microinjected phospholipase C-gamma 1 .FEBSLett. 1995 Jan 30;358(3):287-92.

88. Ikeda,M. Ishida,0. Hinoi,T. Kishida,S. Kikuchi,A. Identification and characterization of a novel protein interacting with Ral-binding protein 1, a putative effector protein of Ral. Journal of Biological Chemistry 1998. 273, 814821.

89. Inoue M., Kishimoto A., Takai Y., Studies on a cyclic nucleotide-independent protein kinase and its proenzyme in mammalian tissues. Biol Chem. 1977 252, 7610-7616

90. Kee,Y. Yoo,J.S. Hazuka,C.D. Peterson,K.E. Hsu,S.C. Scheller,R.H. Subunit structure of the mammalian exocyst complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 1997. 94,14438-14443

91. Kikuchi A, Demo SD, Ye ZH, Chen YW, Williams LT. RalGDS family members interact with the effector loop of ras p21. Mol Cell Biol. 1994 Nov; 14(11):7483-91

92. Kim E, Ambroziak P, Otto JC, Taylor B, Ashby M, Shannon K, Casey PJ, Young SG. Disruption of the mouse Reel gene results in defective Ras processing and mislocalization of Ras within cells. J Biol Chem. 1999 Mar 26;274(13):8383-90.

93. Kim MJ, Kim E, Ryu SH, Suh PG. The mechanism of phospholipase C-gammal regulation. Exp Mol Med. 2000 Sep 30;32(3):101-9.

94. Kim U. Birkenkamp Paul J. Coffer FOXO Transcription Factors as Regulators of Immune Homeostasis: Molecules to Die for? The Journal of Immunology, 2003,171: 1623-1629

95. Kishida, K. Koyama,S. Matsubara,K. , Kikuchi,A. Colocalization of Ras and Ral on the membrane is required for Ras-dependent Ral activation through Ral GDP dissociation stimulator. Oncogene 1997. 15, 2899-2907.

96. Kopnin B.P. Activation of Ras-Ral pathway attenuates p53-independent DNA damage G2 checkpoint. J. Biol. Chem. 2004 279, 36382-36389

97. Kops,G.J. de Ruiter,N.D. Vries-Smits,A.M. Powell,D.R. Bos,J.L. Burgering,B.M. Direct control of the Forkhead transcription factor AFX by protein kinase B. Nature 1999. 398, 630-634.

98. Krueger JS, Keshamouni VG, Atanaskova N, Reddy KB. Temporal and quantitative regulation of mitogen-activated protein kinase (МАРК) modulates cell motility and invasion. Oncogene. 2001 Jul 12;20(31):4209-18.

99. Ktistakis N T, Brown H A, Waters M G, Sternweis P C, Roth M G. Evidence that phospholipase D mediates ADP ribosylation factor-dependent formation of Golgi coated vesicles. J Cell Biol 1996;134:295-306.

100. Kulkarni SV, Gish G, van der Geer P, Henkemeyer M, Pawson T. Role ofpl20 Ras-GAP in directed cell movement. J Cell Biol 2000 Apr 17;149(2):457-70.

101. Kyriakis, J.M. App, H. Zhang, X.F. Banerjee, P. Brautigan, D.L. Rapp, U.R. and Avruch, J. Raf-1 activates MAP kinase-kinase. Nature 1992. 358: 417421

102. Ladeda V, Frankel P, Feig LA, Foster DA, Bal de Kier Joffe E, Aguirre-Ghiso JA. RalA mediates v-Src, v-Ras, and v-Raf regulation of CD44 and fibronectin expression in NIH3T3 fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 2001 May 18;283(4):854-61.

103. Lambert, J.M. Lambert,Q.T. Reuther,G.W. Malliri,A. Siderovski,D.P. Sondek,J. Collard,J.G. Der,C.J. Tiaml mediates Ras activation of Rac by a PI(3)K-independent mechanism. Nat. Cell Biol. 2002. 4, 621-625.

104. Lee CH, Delia NG, Chew CE, Zack DJ.Rin, a neuron-specific and calmodulin-binding small G-protein, and Rit define a novel subfamily of ras proteins. JNeurosci. 1996 Nov l;16(21):6784-94.

105. Lee YH, Kim HS, Pai JK, Ryu SH, Suh PG. Activation of phospholipase D induced by platelet-derived growth factor is dependent upon the level of phospholipase C-gamma 1 .J Biol Chem. 1994 Oct 28;269(43):26842-7.

106. Lee,T. Feig,L. Montell,D.J. 1996. Two distinct roles for Ras in a developmentally regulated cell migration. Development 122,409-418.

107. Li H, He C, Zheng J, et al, Mechanism of the activation of extracellular signal-regulated kinase (ERK) in prostate cancer cell lines with different metastatic potential Zhonghua YiXue Za Zhi. 2001. V.81(4), P.197-200.

108. Li HG, Xie DR, Shen XM, Li HH, Zeng H, Zeng YJ.Clinicopathological significance of expression of paxillin, syndecan-1 and

109. EMMPRIN in hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol 2005 Mar 14;11(10):1445-51.

110. Lim KH, Baines AT, Fiordalisi J J, Shipitsin M, Feig LA, Cox AD, Der CJ, Counter CM. Activation of RalA is critical for Ras-induced tumorigenesis of human cells. Cancer Cell 2005 Jun;7(6):533-45.

111. Lin HJ, Wang X, Shaffer KM, Sasaki CY, Ma W. Characterization of H202-induced acute apoptosis in cultured neural stem/progenitor cells. FEBS Lett. 2004 Jul 16;570(l-3):102-6.

112. Liscovitch M, Czarny M, Fiucci G, Lavie Y, Tang X. Localization and possible functions of phospholipase D isozymes. Biochim Biophys Acta. 1999;1439:245-263;

113. Liu Q, Walker SA, Gao D, Taylor JA, Dai YF, Arkell RS, Bootman MD, Roderick HL, Cullen Lockyer PJ. CAPRI and RASAL impose different modes of information processing on Ras due to contrasting temporal filtering of Ca2+. J Cell Biol 2005 Jul 11

114. Llinas, R. J. A. Gruner, M. Sugimori, T. L. McGuinness, and P. Greengard. Regulation by synapsin I and Ca(2+)-calmodulin-dependent protein kinase II of the transmitter release in squid giant synapse. J. Physiol 1991. 436:257-282.

115. Lockyer, P. J.; Kupzig, S.; Cullen, P. J. : CAPRI regulates Ca(2+)-dependent inactivation of the Ras-MAPK pathway. Curr. Biol. 2001. 11: 981-986,

116. Lu, Z. Hornia,A. Joseph,T. Sukezane,T. Frankel,P. Zhong,M. Bychenok,S. Xu,L. Feig,L.A. Foster,D.A. Phospholipase D and RalA cooperate with the epidermal growth factor receptor to transform 3Y1 rat fibroblasts. Mol. Cell Biol. 2000. 20, 462-467.

117. Luo JQ, Liu X, Frankel P, Rotunda T, Ramos M, Flom J, Jiang H, Feig LA, Morris AJ, Kahn RA, Foster DA. Functional association between Arf and RalA in active phospholipase D complex. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Mar 31;95(7):3632-7

118. Malliri,A. van der Kammen,R.A. Clark,K. van,d. V, Michiels,F. Collard,J.G. Mice deficient in the Rac activator Tiaml are resistant to Ras-induced skin tumours. Nature 2002. 417, 867-871.

119. Mansour, S. J. W. T. Matten, A. S. Hermann, J. M. Candia, S. Rong, K.Fukasawa, G. F. Vande Woude, and N. G. Ahn. Transformation of mammalian cells by constitutively active MAP kinase kinase. Science 1994.265:966-970.

120. Mark,B.L. Jilkina,0. Bhullar,R.P. Association of Ral GTP-binding protein with human platelet dense granules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996.225,40-46.

121. Martin GA, Viskochil D, Bollag G, McCabe PC, Crosier WJ, Haubruck H, Conroy L, Clark R, O'Connell P, Cawthon RM, et al., The GAP-related domain of the neurofibromatosis type 1 gene product interacts with ras p21. Cell. 1990 Nov 16;63(4):843-9

122. Mathew L. Coleman, Christopher J. Marshall and Michael F. Olson Ras promotes p2lWafl/Cipl protein stability via a cyclin D1-imposed block in proteasome-mediated degradation The EMBO J. 2003 22, 2036-2046

123. Matsubara K. Kishida,S. Matsuura,Y. Kitayama,H. Noda,M. Kikuchi,A. Plasma membrane recruitment of RalGDS is critical for Ras-dependent Ral activation. Oncogene 1999. 18, 1303-1312.

124. Matsumoto K, Asano T, Endo T. Novel small GTPase M-Ras participates in reorganization of actin cytoskeleton. Oncogene. 1997 Nov 13;15(20):2409-17.

125. McCormick F, Wittinghofer A. Interactions between Ras proteins and their effectors. Curr Opin Biotechnol. 1996 Aug;7(4):449-56

126. McCormick F. Ras biology in atomic detail. Nat Struct Biol 1996. 3:653.

127. McGlade, J. Brunkhorst, B. Anderson, D. Mbamalu, G. Settleman, J. Dedhar, S. Rozakis-Adcock, M. Chen, L. B. Pawson, T. The N-terminal region of GAP regulates cytoskeletal structure and cell adhesion. EMBO J. 1993. 12, 30733081

128. Mirza AM, Gysin S, Malek N, Nakayama K, Roberts JM, McMahon M. Cooperative regulation of the cell division cycle by the protein kinases RAF and АКТ. Mol Cell Biol 2004 Dec;24(24): 10868-81.

129. Mittar,D. Sehajpal,P.K. Lander,H.M. Nitric oxide activates Rapl and Ral in a Ras-independent manner. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. 322, 203-209.

130. Miyamoto S, Ohya Y, Ohsumi Y, Anraku Y. Nucleotide sequence of the CLS4 (CDC24) gene of Saccharomyces cerevisiae. Gene. 1987;54(l):125-32.

131. Mochizuki N, Yamashita S, Kurokawa K, Ohba Y, Nagai T, Miyawaki A, Matsuda M. Spatio-temporal images of growth-factor-induced activation of Ras and Rapl. Nature. 2001 Jun 28;411(6841): 1065-8.

132. Moodie, S. А. В. M. Willumsen, M. J. Weber, and A. Wolfman. Complexes of Ras-GTP with Raf-1 and mitogen-activated protein kinase kinase. Science 1993. 260:1658-1661.

133. Moran MF, Koch CA, Anderson D, Ellis C, England L, Martin GS, Pawson T.Src homology region 2 domains direct protein-protein interactions in signal transduction. Proc Natl Acad Sci USA. 1990 Nov;87(21):8622-6.

134. Morrison DK, Cutler RE. The complexity of Raf-1 regulation. Curr Opin Cell Biol. 1997 Apr;9(2):174-9.

135. Moskalenko S, Tong C, Rosse C, Mirey G, Formstecher E, Daviet L, Camonis J, White MA. Ral GTPases regulate exocyst assembly through dual subunit interactions. J Biol Chem. 2003 Dec 19;278(51):51743-8. Epub 2003 Oct 2

136. Moskalenko,S. Henry,D.O. Rosse,C. Mirey,G. Camonis,J.H. White,M.A. The exocyst is a Ral effector complex. Nature Cell Biology 2002. 4, 66-72.

137. M'Rabet L, Coffer PJ, Wolthuis RM, Zwartkruis F, Koenderman L, Bos JL. Differential fMet-Leu-Phe- and platelet-activating factor-induced signaling toward Ral activation in primary human neutrophils. J Biol Chem. 1999 Jul 30;274(31):21847-52.

138. Muller,A. Homey,B. Soto, H. Ge,N. Catron,D. Buchanan,M.E. McClanahan,T. Murphy,E. Yuan,W. Wagner,S.N. Barrera,J.L. Mohar,A. Verastegui,E. Zlotnik,A. 2001. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. Nature 410, 50-56.

139. Nakashima,S. Morinaka,K. Koyama,S. Ikeda,M. Kishida,M. Okawa,K. Iwamatsu,A. Kishida,S. Kikuchi,A. Small G protein Ral and its downstream molecules regulate endocytosis of EGF and insulin receptors. EMBO J. 1999. 18, 3629-3642.

140. Nanney LB, Gates RE, Todderud G, King LE Jr, Carpenter G. Altered distribution of phospholipase C-gamma 1 in benign hyperproliferative epidermal diseases. Cell Growth Differ. 1992 Apr;3(4):233-9.

141. Naor Z, Benard O, Seger R. Activation of МАРК cascades by G-protein-coupled receptors: the case of gonadotropin-releasing hormone receptor. Trends Endocrinol Metab. 2000. 11(3), 91-9.

142. Nassar N, Horn G, Herrmann C, Scherer A, McCormick F, Wittinghofer A. The 2.2 A crystal structure of the Ras-binding domain of the serine/threonine kinase c-Rafl in complex with RaplA and a GTP analogue. Nature. 1995 Jun 15;375(6532):554-60.

143. Ngsee,J.K. Elferink,L.A. Scheller,R.H. A family of ras-like GTP-binding proteins expressed in electromotor neurons. J. Biol. Chem. 1991. 266, 2675-2680.

144. Norman,K.L. Hirasawa,K. Yang,A.D. Shields,M.A. Lee,P.W. Reovirus oncolysis: the Ras/RalGEF/p38 pathway dictates host cell permissiveness to reovirus infection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 2004. 101, 11099-11104.

145. Ohba Y, Kurokawa K, Matsuda M. Mechanism of the spatio-temporal regulation of Ras and Rapl. EMBOJ. 2003 Feb 17;22(4):859~69.

146. Ohta, Y. Hartwig, J. H. J. Phosphorylation of actin-binding protein 280 by growth factors is mediated by p90 ribosomal protein S6 kinase. Biol. Chem. 1996. 271,11858 11864

147. Ohta,Y. Suzuki,N. Nakamura,S. Hartwig,J.H. Stossel,T.P. The small GTPase RalA targets filamin to induce filopodia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A 1999. 96,2122-2128.

148. Okada S, Matsuda M, Anafi M, Pawson T, Pessin JE. Insulin regulates the dynamic balance between Ras and Rapl signaling by coordinating the assembly states of the Grb2-SOS and CrkII-C3G complexes. EMBO J. 1998 May l;17(9):2554-65.

149. Okan,E. Drewett,V. Shaw,P.E. Jones,P. The small-GTPase RalA activates transcription of the urokinase plasminogen activator receptor (uPAR) gene via an API-dependent mechanism. Oncogene 2001. 20,1816-1824.

150. Osada M, Tolkacheva T, Li W, Chan TO, Tsichlis PN, Saez R, Kimmelman AC, Chan AM. Differential roles of Akt, Rac, and Ral in R-Ras-mediated cellular transformation, adhesion, and survival. Mol Cell Biol. 1999 Sep;19(9):6333-44.

151. Osada S, Osada K, Carr BI. Tumor Cell Growth Inhibition and Extracellular Signal-regulated Kinase (ERK) Phosphorylation by Novel К Vitamins J Mol Biol 2001 V.314(4), P.765-772.

152. Otto JC, Kim E, Young SG, Casey PJ. Cloning and characterization of a mammalian prenyl protein-specific protease. J Biol Chem. 1999 Mar 26;274(13):8379-82.

153. Oxford G, Owens CR, Titus В J, Foreman TL, Herlevsen MC, Smith SC, Theodorescu D. RalA and RalB:antagonistic relatives in cancer cell migration. Cancer Res. 2005 Aug 15;65(16):7111-20

154. Park,S.H. Weinberg,R.A. A putative effector of Ral has homology to Rho/Rac GTPase activating proteins. Oncogene 1995. 11, 2349-2355.

155. Pawson T. Gish G. D. SH2 and SH3 domains: From structure to function. Cell 1992. 71:359.

156. Polzin,A. Shipitsin,M. Goi,T. Feig,L.A. Turner,TJ. Ral-GTPase influences the regulation of the readily releasable pool of synaptic vesicles. Mol Cell Biol 2002.22,1714-1722.

157. Pronk GJ, Bos JL. The role of p21ras in receptor tyrosine kinase signalling. Biochim Biophys Acta. 1994 Dec 30;1198(2-3):131-47

158. Quaroni,A. Paul,E.C.A. Cytocentrin is a Ral-binding protein involved in the assembly and function of the mitotic apparatus. J Cell Sci 1999.112, 707718.

159. Quilliam LA, Rebhun JF, Castro AF. A growing family of guanine nucleotide exchange factors is responsible for activation of Ras-family GTPases. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 2002;71:391-444.

160. Rabier,M. Chavis,C. Crastes,d.P. Damon,M. 15-Lipoxygenase products stimulate prolactin secretion from a cloned strain of rat pituitary cells. Neuroendocrinology 1988. 47, 323-328.

161. Reiss Y, Goldstein JL, Seabra MC, Casey PJ, Brown MS. Inhibition of purified p21ras farnesyl:protein transferase by Cys-AAX tetrapeptides. Cell. 1990 Jul 13;62(l):81-8.

162. Reynolds AB, Daniel J, McCrea PD, Wheelock MJ, Wu J, Zhang Z. Identification of a new catenin: the tyrosine kinase substrate pl20cas associates with E-cadherin complexes. Mol Cell Biol. 1994 Dec;14(12):8333-42.

163. Rodriguez-Viciana,P. Sabatier,C. McCormick,F. 2004. Signaling specificity by Ras family GTPases is determined by the full spectrum of effectors they regulate. Mol. Cell Biol. 24,4943-4954.

164. Romanova Y. L. Hashimoto S. Chay K. Blagosklonny M. Sabe H. Mushinski J. F. Phosphorylation of paxillin tyrosines 31 and 118 controls polarization and motility of lymphoid cells and is PMA-sensitive J Cell Sci 2004.117,3759-3768.

165. Rosario,M. Paterson,H.F. Marshall,C.J. Activation of the Ral and phosphatidylinositol 3 ' kinase signaling pathways by the ras-related protein TC21. Mol Cell Biol 2001.21, 3750-3762.

166. Rusanescu,G. Gotoh,T. Tian,X.J. Feig,L.A. Regulation of Ras signaling specificity by protein kinase C. Mol Cell Biol 2001.21, 2650-2658.

167. Ryu CH, Kim SW, Lee KH, Lee JY, Kim H, Lee WK, Choi BH, Lim Y, Kim YH, Lee KH, Hwang TK, Jun TY, Rha HK.The merlin tumor suppressor interacts with Ral guanine nucleotide dissociation stimulator and inhibits its activity. Oncogene. 2005 Jun 27;

168. Santolini,E. Salcini,A.E. Kay,B.K. Yamabhai,M. Di Fiore,P.P. The EH network. Exp. Cell Res. 1999. 253, 186-209.

169. Schlatter B, Waghorne CG. Persistence of Ha-ras-induced metastatic potential of SP1 mouse mammary tumors despite loss of the Ha-ras shuttle vector. Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Nov l;89(21):9986-90.

170. Serth, J. et al., The inhibition of the GTPase activating protein-Ha-ras interaction by acidic lipids is due to physical association of the C-terminal domainof the GTPase activating protein with micellarstructures. EMBO J. 1991. 10, 1325-1330

171. Sharma R, Singhal SS, Cheng J, Yang Y, Sharma A, Zimniak P, Awasthi S, Awasthi YC. RLIP76 is the major ATP-dependent transporter of glutathione-conjugates and doxorubicin in human erythrocytes. Arch Biochem Biophys. 2001 Jul 15;391(2):171-9.

172. Shen,Y.J. Xu,L.Z. Foster,D.A. Role for phospholipase D in receptor-mediated endocytosis. Mol Cell Biol 2001. 21, 595-602.

173. Shimazui T, Schalken JA, Giroldi LA, Jansen CF, Akaza H, Koiso K, Debruyne FM, Bringuier PP. Prognostic value of cadherin-associated molecules (alpha-, beta-, and gamma-catenins and pl20cas) in bladder tumors. Cancer Res. 1996 Sep 15;56(18):4154-8.

174. Shipitsin M, Feig LA. RalA but not RalB enhances polarized delivery of membrane proteins to the basolateral surface of epithelial cells. Mol Cell Biol 2004 Jul;24(13):5746-56.

175. Shou C, Farnsworth CL, Neel BG, Feig LA. Molecular cloning of cDNAs encoding a guanine-nucleotide-releasing factor for Ras p21. Nature. 1992 Jul 23;358(6384):351-4.

176. Smith MR, Liu YL, Kim SR, Bae YS, Kim CG, Kwon KS, Rhee SG, Kung HF. PLC gamma 1 Src homology domain induces mitogenesis in quiescent NIH 3T3 fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun. 1996 May 6;222(1): 186-93.

177. Spaargaren M, Bischoff JR. Identification of the guanine nucleotide dissociation stimulator for Ral as a putative effector molecule of R-ras, H-ras, K-ras, and Rap. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Dec 20;91(26): 12609- 13

178. Stevens,C.F. Sullivan,J.M. Regulation of the readily releasable vesicle pool by protein kinase C. Neuron 1998. 21, 885-893.

179. Sugihara,K. Asano,S. Tanaka,K. Iwamatsu,A. Okawa,K. Ohta,Y. The exocyst complex binds the small GTPase RalA to mediate filopodia formation. Nature Cell Biology 2002. 4, 73-78.

180. Suh MJ, Kim YS, Yoo YS. Application of capillary electrophoresis to determination of enzyme activity and other properties of phosphatidylinositol-specific phospholipase C. JChromatogr A. 1997 Sep 26;781(l-2):263-70.

181. Suzuki,J. Yamazaki,Y. Guang,L. Kaziro,Y. Koide,H. Involvement of Ras and Ral in chemotactic migration of skeletal myoblasts. Mol Cell Biol. 2000. 20,4658-4665.

182. Takai Y, Sasaki T, Matozaki Т. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 2001.81, 153-208

183. Takaya,A. Ohba,Y. Kurokawa,K. Matsuda,M. RalA activation at nascent lamellipodia of epidermal growth factor-stimulated Cos7 cells and migrating Madin-Darby canine kidney cells. Mol. Biol. Cell 2004.15, 2549-2557.

184. Takenaga K, Nakamura Y, Sakzyama S. Expression of antisense RNA to S100A4 gene encoding an SlOO-related calcium-binding protein suppresses metastatic potential of high-metastatic Lewis lung carcinoma cells. Oncogene. 1997 Jan 23;14(3):331-7.

185. Tall GG, Barbieri MA, Stahl PD, Horazdovsky BF. Ras-activated endocytosis is mediated by the Rab5 guanine nucleotide exchange activity of RIN1. Dev Cell. 2001 Jul;l(l):73-82.

186. Taparowsky E. Shimisu K. Goldfarb M. Wigler M. Structure and activation of the human N-ras gene. Cell, 1983. 34:581-586.

187. Tchevkina E, Agapova L, Dyakova N, Martinjuk A, Komelkov A, Tatosyan A. The small G-protein RalA stimulates metastasis of transformed cells. Oncogene. 2005 Jan 13;24(3):329-35

188. TerBush,D.R. Maurice,T. Roth,D. Novick,P. The Exocyst is a multiprotein complex required for exocytosis in Saccharomyces cerevisiae. EMBO 1996. J. 15, 6483-6494.

189. Tian X, Rusanescu G, Hou W, Schaffhausen B, Feig LA. PDK1 mediates growth factor-induced Ral-GEF activation by a kinase-independent mechanism. EMBO J. 2002 Mar 15;21(6):1327-38.

190. Tsai, M.H. et al., The effect of GTPase activating protein upon ras is inhibited by mitogenically responsive lipids. Science 1989 243, 522-526;

191. Urano T, Emkey R, Feig LA. Ral-GTPases mediate a distinct downstream signaling pathway from Ras that facilitates cellular transformation EMBOJ. 1996 Feb 15;15(4):810-6

192. Urano,T. Evidence for a Ras/Ral signaling cascade. Seikagaku 1998. 70,1180-1183.

193. Verheijen,M.H.G. Wolthuis,R.M.F. Defize,L.H.K. den Hertog,J. Bos,J.L. Interdependent action of RalGEF and Erk in Ras-induced primitiveendoderm differentiation of F9 embryonal carcinoma cells. Oncogene 1999. 18, 4435.4439.

194. Vivanco,I. Sawyers,C.L. The phosphatidylinositol 3-Kinase АКТ pathway in human cancer. Nat. Rev. Cancer 2002.2, 489-501.

195. Volknandt, W. J. Pevsner, L. A. Elferink, and R. H. Scheller. Association of three small GPT-binding proteins with cholinergic synaptic vesicles. FEBSLett. 1993. 317:53-56.

196. Vos MD, Martinez A, Ellis CA, Vallecorsa T, Clark GJ. The pro-apoptotic Ras effector Norel may serve as a Ras-regulated tumor suppressor in the lung. J Biol Chem. 2003 Jun 13;278(24):21938-43. Epub 2003 Apr 3.

197. Wang X, Zou S.The relationship of CyclinDl and estrogen receptor expression in the process of proliferation and metastasis in breast neoplasm. J Tongji Med Univ. 2001 ;21(3):231-2.

198. Wang,K.L. Khan,M.T. Roufogalis,B.D. 1997. Identification and characterization of a calmodulin-binding domain in Ral-A, a Ras-related GTP-binding protein purified from human erythrocyte membrane. J. Biol Chem. 272, 16002-16009.

199. Webb CP, Taylor GA, Jeffers M, Fiscella M, Oskarsson M, Resau JH, Vande Woude GF. Evidence for a role of Met-HGF/SF during Ras-mediated tumorigenesis/metastasis. Oncogene. 1998 Oct 22;17(16):2019-25.

200. Webb CP, Van Aelst L, Wigler MH, Woude GF. Signaling pathways in Ras-mediated tumorigenicity and metastasis Proc Natl Acad Sci USA. 1998 V.95(15), P.8773-8.

201. Welch DR, Sakamaki T, Pioquinto R, Leonard TO, Goldberg SF, Hon Q, Erikson RL, Rieber M, Rieber MS, Hicks DJ, Bonventre JV, Alessandrini A.

202. Transfection of constitutively active mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase kinase confers tumorigenic and metastatic potentials to NIH3T3 cells. Cancer Res. 2000 Mar 15;60(6):1552-6.

203. White,M.A. Vale,T. Camonis,J.H. Schaefer,E. Wigler,M.H. A role for the Ral guanine nucleotide dissociation stimulator in mediating Ras-induced transformation. Journal of Biological Chemistry 1996. 271,1643 9-16442.

204. Wigler M. Fasano V. Taparovsky E. et al., Structure and activation of ras genes. Canser Cells, 1984 v.2, p419-423

205. Willumsen BM, Norris K, Papageorge AG, Hubbert NL, Lowy DR. Harvey murine sarcoma virus p21 ras protein: biological and biochemical significance of the cysteine nearest the carboxy terminus. EMBO J. 1984 Nov;3(ll):2581-5.

206. Wolthuis, R.M.F. deRuiter,N.D. Cool,R.H. Bos,J.L. Stimulation of gene induction and cell growth by the Ras effector Rlf. EMBO J. 1997. 16, 67486761.

207. Wolthuis, R.M.F. Franke,B. van Triest,M. Bauer,B. Cool,R.H. CamonisJ.H. Akkerman,J.W.N. Bos,J.L. Activation of the small GTPase Ral in platelets. Mol Cell Biol. 1998 18, 2486-2491.

208. Yadav,S. Zajac,E. Singhal,S.S. Singhal,J. Drake,K. Awasthi,Y.C. Awasthi,S. POB1 over-expression inhibits RLIP76-mediated transport of glutathione-conjugates, drugs and promotes apoptosis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. 328, 1003-1009.

209. Yamaguchi,A. Urano,T. Goi,T. Feig,L.A. An eps homology (EH) domain protein that binds to the Ral-GTPase target, RalBPl. Journal of Biological Chemistry 1997. 272, 31230-31234.

210. Yamazaki,Y. Kaziro,Y. Koide,H. Ral promotes anchorage-independent growth of a human fibrosarcoma, HT1080. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001.280, 868-873.

211. Yu Q, Ciemerych MA, Sicinski P. Ras and Мус can drive oncogenic cell proliferation through individual D-cyclins. Oncogene. 2005 Aug 15

212. Yu,Y. Feig,L.A. Involvement of R-Ras and Ral GTPases in estrogen-independent proliferation of breast cancer cells. Oncogene 2002. 21, 7557-7568.

213. Zhang H, Zhang R, Luo Y, D'Alessio A, Pober JS, Min W.AIP1/DAB2IP, a novel member of the Ras-GAP family, transduces TRAF2-induced ASK1-JNK activation. J Biol Chem. 2004 Oct 22;279(43):44955-65. Epub 2004 Aug 13

214. Zwartkruis FJ, Wolthuis RM, Nabben NM, Franke B, Bos JL.Extracellular signal-regulated activation of Rapl fails to interfere in Ras effector signalling. EMBO J. 1998 Oct 15;17(20):5905-12