Влияние холестерина и его эфиров на синтез лейкотриенов 5-липоксигеназой клеток млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Александров, Дмитрий Андреевич

• Александров, Дмитрий Андреевич
• кандидат химических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат химических наук Александров, Дмитрий Андреевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

II.1. 5-ЛИПОКСИГЕНАЗА: РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА В

КЛЕТКЕ И СИНТЕЗ ЛЕЙКОТРИЕНОВ /ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ/

II. 1.1. 5-Липоксигеназа: реакции

II. 1.2. 5-LO: структура гена и регуляция экспрессии

II. 1.3.Факторы, регулирующие активность 5-LO 1 б

II. 1.3.1. Кальций

II. 1.3.2. АТР

II.1.3.3. Фосфолипиды

II. 1.3.4. Липидные гидропероксиды

II. 1.3.5. Стимуляция клеточными белками

II. 1.3.6. 5-Ш-активирующий белок (FLAP)

II. 1.4. Внутриклеточное распределение 5-LO. Роль FLAP

II. 1.5. Регуляция активности 5-LO в клетке

II. 1.5.1. Активация 5-LO фосфорилированием

II. 1.5.2. Эндогенные ингибиторы 5-липоксигеназного пути

П.1.5.3. Белковые взаимодействия 5-LO 37 II. 1.6. Роль лейкотриенов в воспалительных процессах и пути подавления лейкотриенового синтеза

II. 1.6.1. Биологическое действие лейкотриенов

II. 1.6.2. Направленное генетическое подавление 5-LO

II.1.6.3. Ингибиторы биосинтеза лейкотриенов

II. 1.6.3.1. Ингибиторы FLAP

II. 1.6.3.2. Прямые ингибиторы 5-LO

II. 1.6.3.2.1. Окислительно-восстановительные ингибиторы 44 II.1.6.3.2.2. Fe-лигандные со слабыми окислительно-восстановите льными свойствами 44 II. 1.6.3.2.3. «Не окислительно-восстановительные» конкурентные ингибиторы 5-LO

II.2. СУЛЬФАТ ХОЛЕСТЕРИНА: БИОСИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

11.2.1. СХ в плазме крови

11.2.2. Распределение СХ в тканях

11.2.3. Синтез и метаболизм СХ

11.2.4. Холестериновые сульфотрансферазы

11.2.5.Физиологическая значимость СХ

11.2.5.1. Синтез стероидов

11.2.5.2. Метаболизм липидов

11.2.5.3. Мембранные эффекты СХ

11.2.5.4. Участие СХ в регуляции ферментов 55 III. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ХОЛЕСТЕРИНА И ЕГО ЭФИРОВ НА

СИНТЕЗ ЛЕЙКОТРИЕНОВ 5-ЛИПОКСИГЕНАЗОЙ КЛЕТОК

МЛЕКОПИТАЮЩИХ /РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ/ 58 III. I Действие холестерина и его производных на синтез продуктов 5-LO активности в нейтрофилах человека в суспензии и при взаимодействии с различными биологическими поверхностями. 59 ULI. 1. Подавление синтеза лейкотриенов свободным холестерином и его производными в PMNL

111.1.2. Экзогенная АА нивелирует ингибирующее воздействие X и СХ на синтех лейкотриенов

111.1.3. СХ стимулирует адгезию PMNL к коллагену и эндотелию

111.1.4. Влияние СХ на доступность субстрата для 5-LO

111.1.4.1. СХ препятствует высвобождению АА в PMNL

111.1.4.2. СХ вытесняет cPLA2 из ядерной мембраны PMNL 70 IUI.5. СХ препятствует транслокации 5-LO к ядерной мембране PMNL 71 Ш.1.6. СХ подавляет активность 5-LO в цитозольной фракции PMNL 72 III.L7. Исследование роли отрицательного заряда эфиров холестерина в подавлении синтеза лейкотриенов.

111.1.7.1. Синтез фосфата холестерина (ФХ)

111.1.7.2. Сравнение эффективности СХ и ФХ на разных типах клеток 74 III.I.8. Изучение кинетических закономерностей ингибирования 5-LO анионными производными холестерина

III.I.8.1. СХ и ФХ подавляют синтез LTs в суспензионных клетках и клеточных гомогенатах

Ш.1.8.2. Получение кинетических характеристик ингибирования 5-ЬО под действием ФХ 78 III.II. Синтез лейкотриенов зависит от содержания холестерина в клеточных мембранах

III.II. 1. Холестерин и СХ оказывают кумулятивное воздействие на синтез лейкотриенов 82 Ш.П.2. Действие МрСБ

Ш.П.2.1. МрСБ увеличивает высвобождение АА из состава мембран 83 Ш.П.2.2. Подавление синтеза лейкотриенов под действием СХ снимается при помощи МрСБ

Ш.П.З. Действие комплекса ПЭГ-холестерин

Ш.П.4. Эффект СХ чувствителен к ингибиторам эндоцитоза 87 Ш.Ш. Влияние эфиров холестерина на экспрессию 5-ЬО в различных клетках Гипотеза о роли ядерных рецепторов в регуляции экспрессии 5-ЬО на уровне транскрипции

Ш.1П.1. СХ способен подавлять экспрессию 5-ЬО в РМЫЬ 90 Ш.Ш.2. Гипотеза об участии ретиноидных ядерных рецепторов 11СЖа1 в регулировании экспрессии 5-ЬО

IV. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 96 1У.1. Реактивы и материалы

Буферные растворы

Подготовка рабочих препаратов

Синтез фосфата холестерина

1У.2. Методы исследования.

Выделение нейтрофилов

Культивирование клеточных линий КВЬ-1 и ММ

Выделение и культивирование эндотелиальных клеток

Приготовление коллагенированных поверхностей

Адгезия нейтрофилов к эндотелию и коллагену

Определение количества продуктов 5-ЬО активности в клетках

Синтез 5-липоксигеназных продуктов в клетках.

Синтез5 -липоксигеназных продуктов в клеточных гомогенатах

Анализ 5-липоксигеназных продуктов

Подготовка проб к хроматографии

Хроматографический анализ продуктов

Радиоактивно меченые РММ,

Определение внутриклеточной локализации 5-липоксигеназы

Фракционирование нейтрофилов

Электрофорез

Влажный перенос на трансблоттере

Проявление мембраны

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние холестерина и его эфиров на синтез лейкотриенов 5-липоксигеназой клеток млекопитающих»

Лейкотриены (LTs) представляют собой группу физиологически активных соединений, играющих важную роль как в системе защиты организма, так и в развитии воспалительных процессов (рис. 1). Установлено, что лейкотриены являются медиаторами таких заболеваний как аллергия, экзема, бронхиальная астма, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, псориаз и другие. Кроме того, лейкотриены используются лейкоцитами в качестве молекул межклеточного взаимодействия и влияния на функцию других клеток. Лейкотриены являются продуктами диоксигенирования арахидоновой кислоты (АА). В нейтрофилах человека (polymorphonuclear leukocytes, PMNL) ключевым ферментом синтеза лейкотриенов является 5-липоксигеназа (5-LO, КФ 1.13.11.34). Основными метаболитами АА в нейтрофилах являются лейкотриен В4 (LTB4) и 5-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (5-НЕТЕ).

Арахидоновая кислэта

СООН

5-LO

Лейкотриены В4, С4, D4, Е4

Аспиа

Псориаз

Атеросклероз

ИБС

Защитная функция организма

Рис. 1 Лейкотриены - участники защитной системы организма и заболеваний воспалительной природы.

Как уже упоминалось, лейкотриены участвуют в развитии множества заболеваний воспалительной природы. Так, роль лейкотриенов в общей патофизиологии астмы характеризуется участием в развитии бронхоспазма, нарушении проницаемости сосудов, секреции слизи, жизнедеятельности воспалительных клеток. Лейкотриены являются одними из основных индукторов артритных воспалений, причем к настоящему времени установлена прочная взаимосвязь между воспалительными процессами при артрите различной этиологии и развитием сердечнососудистых заболеваний. Так, при ассоциации ревматоидного артрита с дислипидемией, в анамнезе большой части пациентов наблюдается раннее развитие ишемической болезни сердца (ИБС). Один из основных продуктов метаболизма А А -лейкотриен В4 имеет существенное значение в развитии гнойного воспаления, и является мощным хемоаттрактантом.

Учитывая широкий спектр биологического действия лейкотриенов, подробное изучение механизмов регуляции их синтеза является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины.

При развитии атеросклероза синтез лейкотриенов в лейкоцитах может модулироваться холестерином, огромное значение которого в атерогенезе является общепризнанным. В атеросклеротических бляшках обнаружен также сульфат холестерина (СХ), однако его биологическая роль пока мало изучена. Исследование механизмов регуляции активности 5-ЬО под действием холестерина и его эфиров особенно актуально в свете недавнего открытия того, что в атеросклеротических зонах резко повышена экспрессия 5-ЬО. В этой связи, исследование действия сульфата и других производных холестерина на синтез лейкотриенов представляет несомненный интерес.

Синтез лейкотриенов - процесс, осуществляемый целым набором ферментов и вспомогательных факторов. Информация о наиболее важных участниках синтеза лейкотриенов приводится в таблице 1.

5-липоксигеназа ПАР ЬТА4-гидролаза ЬТС4-синтаза

78 кДа 18 кДа 69 кДа 18 кДа

Цитозольный белок Мембранный белок Цитозольный белок Мембранный белок

Диоксигеназная активность переводит АА в 5-НрЕТЕ Связывает АА Переводит LTA4 в LTB4 Переводит LTA4 в LTC4

Дегидратазная активность переводит 5-НрЕТЕ в LTA4 Необходим для активации 5-ЬО в клетке

Несмотря на активные изыскания, к настоящему времени больших результатов в лечении воспалительных процессов путем подавления синтеза лейкотриенов или блокации их рецепторов пока не достигнуто. Обнадеживающие данные получены только по немногим областям, таким как лечение некоторых форм астмы, защита тканей сердца от последствий воздействия ионизирующего излучения при лучевой терапии и ряд других. Большинство известных ингибиторов 5-липоксигеназы, хотя и многообещающие in vitro, оказываются неприменимыми in vivo. Чаще всего это происходит из-за высокой токсичности и ряда опасных побочных эффектов.

Цель работы состояла в изучении эффектов холестерина и его эфиров на активность 5-LO, определении основных закономерностей взаимодействия указанных веществ с этим ферментом и другими участниками метаболического каскада АА.

В данной работе для изучения подавления активности 5-LO и синтеза лейкотриенов были выбраны физиологичные соединения - холестерин и его эфиры. Использование холестерина позволило моделировать условия начальных стадий развития атеросклероза с использованием эндотелиальных клеток и нейтрофилов и именно в этих условиях изучать синтез лейкотриенов. Полученные данные выявили важную роль отрицательно заряженных эфиров холестерина в подавлении синтеза лейкотриенов.

В диссертационной работе впервые показано, что анионные производные холестерина являются регуляторами синтеза лейкотриенов в нейтрофилах человека. Согласно полученным в данной работе результатам, СХ действует на синтез лейкотриенов по нескольким механизмам.

СХ ингибировал высвобождение АА, т.е. снижал концентрацию субстрата для синтеза лейкотриенов. Показано, что СХ частично вытеснял сРЬА2 из состава ядерных мембран. Кроме того, согласно данным иммуноблоттинга, СХ ингибировал транслокацию и связывание 5-ЬО с ядерной мембраной РМЫЪ, что снижало активность фермента и синтез лейкотриенов в клетках.

Продемонстрирован прямой ингибирующий эффект сульфата и фосфата холестерина на 5-ЬО в гомогенатах клеток. На примере фосфата холестерина было показано, что анионные эфиры холестерина являются прямыми ингибиторами 5-ЬО, подавляющими активность фермента по неконкурентному механизму. Определена константа ингибирования К; 5-ЬО фосфатом холестерина, составившая 110 мкМ. Открытое в данной работе свойство СХ подавлять синтез лейкотриенов указывает на возможную регуляторную роль сульфотрансфераз и сульфатаз в образовании 5-ЬО продуктов в организме.

Изучено влияние на синтез лейкотриенов, оказываемое различными агентами, регулирующими содержание холестерина и его эфиров в клетке. Показано, что холестерин увеличивает ингибирующий эффект СХ. В то же время, агенты способные экстрагировать холестерин, такие как метил-(3-циклодекстрин (М(ЗСБ), значительно ослабляют ингибирующее действие холестерина и СХ, оказываемое ими на активность 5-ЬО и синтез лейкотриенов.

Обнаружено, что СХ подавляет экспрессию 5-ЬО в клетках ММ6. Предложена модель этого процесса, в которой экспрессия гена 5-ЬО контролируется на уровне транскрипции посредством связывания СХ с ретиноидными ядерными рецепторами 1иЖа1.

Полученные в данной работе данные могут быть использованы при разработке новых методов диагностики и терапии воспалительных процессов.

II.1. 5-ЛИПОКСИГЕНАЗA: РЕГУЛЯЦИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА В КЛЕТКЕ И СИНТЕЗ ЛЕЙКОТРИЕНОВ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ/

5-липоксигеназа (5-L0) является ключевым ферментом в синтезе лейкотриенов -физиологически активных соединений, играющих важную роль как в системе защиты организма, так и в развитии воспалительных процессов. Синтез лейкотриенов происходит в основном в гранулоцитах, моноцитах/макрофагах и тучных клетках. Для эффективного синтеза лейкотриенов в клетке важно четко режиссированное взаимодействие группы ферментов и кофакторов.

После стимуляции клетки 5-LO активируется при повышении внутриклеточной концентрации кальция, либо путем сигнального фосфорилирования. При этом происходит и активация фосфолипазы А2 (cPLA2), которая осуществляет высвобождение арахидоновой кислоты (АА) из состава фосфолипидов клеточных мембран. АА метаболизируется 5-LO в неустойчивое промежуточное производное -лейкотриен А4 (LTA4). В дальнейшем LTA4 может превращаться в лейкотриен В4 (LTB4) лейкотриен А4 гидролазой или связываться с глутатионом и превращаться в LTC4 лейкотриен С4 синтазой (рис. 2). Нейтрофилы и моноциты в основном продуцируют LTB4, в то время как эозинофилы, базофилы и тучные клетки в основном синтезируют LTC4. Выход LTC4 в межклеточное микроокружение и последующее расщепление глутатиона приводят к образованию LTD4, а затем LTE4. LTA4 также может транспортироваться в соседние клетки, где претерпевает дальнейшие превращения. Например, клетки, неспособные самостоятельно синтезировать LTA4, но обладающие ЬТС4-синтазой (тромбоциты, эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры сосудов) или ЬТА4-гидролазой (эритроциты), могут участвовать в таком «трансклеточном» синтезе лейкотриенов и липоксинов .

Информация о клеточной биологии 5-LO и всего арахидонового каскада пока достаточно скудна и много вопросов, связанных с регуляцией 5-липоксигеназной активности, остается без ответа. Ясно, что такие факторы как редокс потенциал

Л I мембран клетки, количество АА, уровень Са , наличие 5-Ш-активирующего белка (FLAP) и активирующей киназы МАРК, внутриклеточная локализация самой 5-LO имеют основное влияние на продукцию лейкотриенов. Понять взаимосвязь этих факторов и определить высокоселективные способы воздействия на каждый из них в отдельности - вот задача, которую предстоит еще решить для успешного фармакологического вмешательства в синтез лейкотриенов.

Мембранные фосфолипиды сРЪА2 арахидоновая кислота (АА)

5-ЬО I соон

53-НрЕТЕ

ЬТА4

ЬТСЛ синшаза

ЪТС4 I

ЪТЭ4 I

ЬТЕ4

5Б-НЕТЕ

БЗДгЗИ-сИНЕТЕз Цзо-ЬТВ4) соон со-ОН-ЬТВ4 I й-СООН-ЬТВ4

Рис. 2 Общая схема клеточного метаболизма АА по 5-липоксигеназному пути.

П.1.1. 5-Липоксигеназа: реакции

5-Липоксигеназа была открыта в 1976 году, когда обнаружилось, что метаболизм АА в полиморфноядерных лейкоцитах (РМЖ) кролика приводит к образованию 5(8)-гидроперокси-6-/и/7йнс-8,11,14-г/мс-эйкозатетраеновой кислоты (5-НрЕТЕ) и соответствующего гидроксильного производного 5(8)-гидрокси-6-шрш/с-8,11,1 А-цис-эйкозатетраеновой кислоты (5-НЕТЕ) [1]. Это открытие привлекло большое внимание, поскольку совместное образование 5-НЕТЕ и ЬТВ4 также наблюдалось в лейкоцитах человека [2]. Также было обнаружено, что субстанция из клеток, испытавших анафилактический шок, состоит из смеси цистеиниловых лейкотриенов С4, Б4 и Е4, которые также являются продуктами 5-ЬО пути метаболизма АА [3].

На сегодняшний день известно, что 5-ЬО является диоксигеназой, проявляющей две ферментативные активности, ведущие к образованию ЬТА4. Оксигеназная активность проявляется в том, что 5-ЬО осуществляет встраивание молекулярного кислорода в АА. Последующее образование неустойчивого эпоксида - ЬТА4 -осуществляется благодаря ЬТА4-синтазной активности этого фермента [4, 5]. 5-ЬО сначала катализирует отщепление про-8 атома водорода в положении С7 АА. После этого следует присоединение молекулярного кислорода по положению С5. Таким образом образуется 5-НрЕТЕ [6]. Последующая трансформация 5-НрЕТЕ в ЬТА4 включает отщепление про-11 водорода в позиции СЮ и аллильный сдвиг радикала на С6 с образованием 5,6-эпоксида [7]. При восстановлении пероксида 5-НрЕТЕ происходит образование 5-НЕТЕ (рис.2).

В реакциях 5-ЬО ключевую роль играет не-гемовый атом железа активного центра, координированный №^-367, Н1б-372, Н1з-550 и С-концевым Не. Этот атом железа служит донором/акцептором электронов при катализе. С помощью ПМР было показано, что в неактивном ферменте железо находится в полувосстановленном состоянии (+2), а при обработке гидропероксидами жирных кислот оно переходит в окисленную форму +3 [8, 9]. Затем восстанавливающие агенты снова переводят железо активного центра в форму +2. Локализация иона железа в молекуле 5-ЬО показана на структурной модели фермента (рис. 3).

С-2 подобный домен

Каталитический домен

5-LO: структурная организация N

Ион железа акт ивного центра

Участки связывания с мембраной

Реакционный профиль 5-ЬО состоит из стадии инициации, в ходе которой окисляется железо активного центра фермента, стадии линейного развития, на которой достигается наибольшая скорость превращения и стадии необратимой инактивации. Интересно, что жирные гидропероксиды, необходимые для перевода фермента в активное состояние, могут быть причиной быстрой инактивации 5-ЬО [10].

Рис. 3 Внешний вид 5-ЬО. Модель построена на основе структуры 15-ЬО кролика. Видна 2-доменная структура, отмечены места связывания железа активного центра и ионов Са2+. Розовыми стрелками отмечены участки связывания 14-концевого С2-подобного домена, отвечающие за При восстановлении 5- взаимодействие с ядерной мембраной. НрЕТЕ проявляется псевдопероксидазная активность 5-ЬО [11-13]. Показано, что такие ингибиторы 5-ЬО как ]М-гидроксимочевины, гидроксамовые кислоты снижают именно псевдопероксидазную активность. Это показывает, что в некоторой степени эффективность этих ингибиторов может быть обусловлена частичным восстановлением железа +3 в железо +2 [13].

II.1.2. 5-LO: структура гена и регуляции экспрессии кДНК 5-LO была клонирована из человеческих, мышиных, крысиных клеток и клеток хомячка. Оказалось, что она кодирует зрелый белок длиной 672-673 АК [14]. Выделенный из лейкоцитов различных организмов, белок оказался растворимой мономерной молекулой и имел молекулярную массу от 72 до 80 кДа [15]. Однако, кристаллическая форма белка так и не была получена и информация по структурной организации все еще является ограниченной.

Ген 5-LO человека расположен в 10 хромосоме и содержит 14 экзонов, в промоторной области обнаружены типичные TATA и ССААТ последовательности.

Промоторная область богата набором G+C и содержит несколько сайтов связывания факторов транскрипции таких как c-myb, АР-2, NF-kB, Spl, Sp3, Egr-2. Также в промоторной области имеются участки связывания ядерных ретиноидных рецепторов: RZRalpha и RZR-связанный орфановый рецептор RORalpha. Особое внимание привлекают 5 GC-тандемных последовательностей, которые способны специфически связывать факторы транскрипции Spl и Egr-1, активируя таким образом промоторные конструкты 5-LO [16, 17]. Показано, что RZR и ROR могут подавлять экспрессию 5-LO в В-лимфоцитах под воздействием мелатонина. В то же время, в моноцитах и гранулоцитах, лишенных этих рецепторов, экспрессия 5-LO при введении мелатонина не снижается [18].

Экспрессия 5-LO в основном ограничена миелоидными кетками, включая гранулоциты, моноциты/макрофаги, тучные клетки, и В-лимфоциты. При этом в клетках, активно экспрессирующих 5LO, обычно наблюдается высокий уровень экспрессии 5-ЬО-активирующего белка (FLAP), роль которго в синтезе лейкотренов будет подробно рассмотрена ниже. Тем не менее, хотя Т-клетки экспрессируют FLAP, они являются негативными по 5-LO. Красные кровяные клетки и тромбоциты, так же как клетки эндотелия, не экспрессируют ни 5-LO, ни FLAP. 5-LO и FLAP были обнаружены и в некоторых других тканях и типах клеток, таких как дифферецированные кератиноциты кожи человека [19], эпидермальные клетки Лангерханса [20], многие участки мозга крысы, особенно гиппокампус и церебеллум [21].

Регуляция экспрессии 5-LO изучалась в паренхимальных клетках и на различных линиях миелоидных клеток. Так, показано, что в клетках HL60 и ММ6 под влиянием TGFJ3 и VD3 резко увеличивается активность мРНК 5-LO и последущий синтез белка. После тщательного изучения этого эффекта оказалось, что TGFJ3 и VD3 не только увеличивают экспрессию 5-LO, но и влияют на уровень его активности в клетке. В HL60 эффект TGF усиливался в присутствии TNFa или GM-CSF. В человеческих PMNL, моноцитах и моноцитарной линии ТНР-1 GM-CSF увеличивал экспрессию как 5-LO, так и FLAP [15].

Увеличение экспрессии 5-LO под воздействием TGF(3 и VD3 также происходит в керотиноцитарной линии НаСаТ при трансформации этих клеток. В меньшей степени этот эффект проявляется и в нормальных кератиноцитах. В клетках эпидермиса человека (CD34+) GM-CSF и TNFa вызывали резкое увеличение экспрессии 5-LO и способствовали повышенному образованию продуктов 5-LO активности в ответ на стимуляцию клеток Са-ионофором [22].

ПЛ.З.Факторы, регулирующие активность 5-ЬО

II.1.3.1. Кальций

Поскольку синтез лейкотриенов в клетках был обнаружен при стимуляции клеток

2+

Са-ионофором, влияние ионов Са на активацию 5-ЬО стало объектом тщательного изучения [2, 23]. На сегодня принято считать, что после стимуляции клеток ионофором, увеличение внутриклеточной концентрации кальция является важнейшим шагом в активации синтеза лейкотриенов. Для очищенного препарата 5-ЬО полуактивация фермента достигается в присутствии 1-2 мкМ Са2\ Максимальная активность 5-ЬО достигается при 4-10 мкМ Са2+ [24-26]. Более низкие концентрации Са2+ порядка 200 нМ оказываются достаточными для инициации 5-ЬО активности в интактных клетках

Рис.4 Модель С2-подобного домена 5-ЬО на основе соответствующего домена а токсина из С. Рефи^ет. Показаны остатки, участвующие в связывании с мембраной и 2 иона кальция [Ки1кагш, 2002].

27]. Считается, что взаимодействие Са2+ с 5-ЬО увеличивает гидрофобность фермента

28] и способствует связыванию с фосфатидилхолиновыми везикулами [24]. Более того,

9+

Са стимулирует транслокацию 5-ЬО к клеточной мембране и последующее связывание с ней [24, 29-31]. Поэтому считается, что Са повышает активность 5-LO, способствуя ее ассоциации с ядерной мембраной. Такой механизм является обычным для многих Са2+ -связывающих белков, таких как cPLA2 или протеинкиназа С [32].

Несмотря на то, что Са2+-связывающий мотив в первичной структуре 5-LO не обнаружен, само обратимое связывание кальция было подтверждено множеством экспериментов: гельфильтрацией в присутствии Са , титрованием равновесным диализом, по изменению подвижности в геле при электрофорезе [28]. Эти эксперименты позволили определить константу связывания Са2+ в районе 6 мкМ, что хорошо согласуется с концентрацией кальция, необходимой для наиболее эффективной активации фермента in vitro. Стехиометрически на одну молекулу 5-LO приходится 2 иона связанного Са2+ (рис. 4). На основе структуры 15-LO кролика, моделирования [3

9+ сэндвичевых структур С2 доменов других Са -связывающих белков был смоделирован N-концевой домен 5-LO (рис. 5) (1-114 АК) [33].

Мутации N43, D44 и Е46 в этом домене приводили к затруднению связывания

Са2+ и увеличению концентрации Са2+, необходимой для активации ферментативной активности 5-LO [33]. Было высказано предположение, что этот (3-баррельный участок может действовать как Са2+-регулируемый якорь, необходимый для связывания 5-LO с клеточными мембранами [34].

В некоторых работах было обнаружено, что присутствие Са2+ не является необходимым условием для проявления активности выделенной и очищенной 5-LO [7, 35-37]. Интересно, что среди прочих двухвалентных катионов только Mg2+ может в некоторой степени заменить кальций с точки зрения связывания с 5-LO и ее дальнейшей активации. Так, если максимальная активация 5-LO кальцием наблюдается при 4-10 мкМ Са2+, то концентрация магния для достижения аналогичного эффекта должна быть порядка 4 мМ Mg2+. При этом даже 2 мМ Mg2+ не способен вытеснить Са из его комплекса с ферментом [33, 37]. Магний, также как и кальций вызывает дополнительную гидрофобизацию 5-LO [37]. Поскольку внутриклеточная концентрация магния достаточно высока (порядка 1 мМ) этот эффект магния может быть интересен с точки зрения изучения базальной активности 5-LO в интактных клетках.

При исследовании активности 5-ЬО в РМШ, было показано, что в присутствии экзогенного субстрата (АА) Са2+ необходим только отчасти [27]. В существующей ныне модели АА-индуцированного синтеза лейкотриенов принято считать, что начальный всплеск активности 5-ЬО является Са -независимым [38].

Рис. 5 Сравнение 1Ч-концевого домена 5-ЬО (модель на основе 15-ЬО кролика) с С2-доменом сРЬА2. Осттки в составе 5-ЬО, предположительно отвечающие за связывание Са2' выделены серым цветом. Остатки, выполняющие эту функцию в сРЬА2 выделены красным [НаттегЬег& 2000].

И.1.3.2. АТР

Каталитическая активность 5-LO стимулируется АТР и, в меньшей степени, также и другими нуклеотидами, включая ADP, AMP, сАМР, СТР и UTP [39-41]. Степень активации 5-LO под действием 0.1-2 мМ АТР варьирует от 2 до 6 раз, Ка была определена в районе 30-100 мкМ [35, 42]. Показано, что для эффективной активации 5-LO под действием АТР требуется присутствие Са2+ [26, 35, 39], хотя и в присутствии Mg2"1", и даже без двухвалентных катионов активация имеет место [36, 37]. Эксперименты с негидролизируемым y-S-ATP показали, что для активации и катализа гидролиз АТР не требуется. Таким образом, при превращении АА в LTB4 не происходит ни потребления энергии, ни автофосфорилирования фермента [40]. In vivo АТР присутствует внутри клетки в миллимолярных концентрациях, в основном в виде комплекса с магнием, и именно такой комплекс, а не свободный АТР, следует, скорее всего, рассматривать как наиболее вероятный стимул [37].

С помощью АТР-афинной хроматографии было показано, что 5-LO из разных источников способна связывать АТР [43-45]. Похоже, что среди всех липоксигеназ только 5-LO способна связывать АТР и активироваться нуклеотидами. Интересно, что при анализе последовательности 5-LO не было выявлено АТР- или нуклеотид-связывающих сайтов, однако было показано, что два остатка триптофана, W75 и W201, специфически могут связывать аналоги АТР. Взаимодействие этих аналогов с белком блокировало АТР-опосредованную активацию 5-LO [46]. Са2+ не оказывал влияния на взаимодействие АТР с 5-LO. Стехиометрически взаимодействие АТР с 5-LO происходит эквимолярно.

II. 1.3.3. Фосфолипиды

Ранние исследования выявили фракции клеточных мембран, которые увеличивали активность 5-LO и которые могли быть заменены искусственными липидными везикулами фосфатидилхолина (PC) [26, 47, 48]. Среди всех протестированных фосфолипидов, только PC был способен увеличивать каталитическую активность 5-LO. Фосфатидилсерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозитол или диацилглицерин оказались неэффективны [26]. Примечательно, что PC оказывал стимулирующее действие как в присутствии, так и в отсутствие Са2+ [36, 37]. Установлено, что каталитический акт 5-LO протекал на границе раздела фаз вода-липид и оказалось, что соотношение АА/РС в липидных мембранах является существенным для эффективного катализа. На основе этих фактов был сделан вывод, что 5-LO может осуществлять межфазные реакции подобно cPLA2 [49, 50].

Установлено, что кальциевые петли С2-подобного домена 5-LO содержат в своем составе остатки Тгр 13, 75 и 102. Показано, что именно эти участки ответственны за селективное связывание с фосфатидилхолином клеточных мембран. Так, при использовании мутантных С2-подобных доменов W75A и W102A Kd при взаимодействии с PC-содержащими мембранами снижалась в 9 и 20 раз, соответственно. При этом введение таких мутаций влияло не только на селективность, но и на эффективность связывания С2-подобного домена с мембраной, что было показано в экспериментах по внутриклеточной локализации С2-подобного домена 5-LO. В интактных клетках НЕК293 С2-подобный домен, конъюгированный с GFP, транслоцировался к ядерной мембране при стимуляции клеток иономицином (рис. 6а). Рис. 6а Внутриклеточное распределение С2-подобного домена 5-Ш. Слева -интактные клетки, справа - после стимуляции иономицином. Видно, что при стимуляции клеток происходит накопление 5-ЬО у поверхности ядерной мембраны, в то время как в интактных клетках фермент рассредоточен внутри ядра и в цитозоле [Ки1кагт, 2002].

В то же время, мутантные формы С2-подобного домена в значительно меньшей степени оказались способны к такой транслокации (рис. 66).

А/75А

А/102А

Рис. 66 Внутриклеточное распределение мутантных форм С2-подобного домена 5-ЬО. Слева -интактные клетки, справа - после стимуляции иономицином. После стимуляции клеток накопление 5-Ш около ядерной мембраны клеток происходит менее активно, сем в случае С2-подобного домена дикого типа [Ки1кагш, 2002].

II. 1.3.4. Липидные гидропероксиды

Активация 5-ЬО требует окисления железа активного центра. Показано, что такие гидропероксиды как 5-НрЕТЕ, 12-НрЕТЕ и 13-НрСЮЕ стимулируют 5-ЬО в клеточных гомогенатах. В то же время, такие соединении как трет-бутил-гидропероксид или куменовый гидропероксид не проявляют активирующего эффекта [9, 51]. В настоящее время известно, что липидные гидропероксиды способны сокращать лаг-фазу 5-ЬО, которая может наблюдаться после добавления субстрата к ферменту в гомогенате или к очищенному препарату 5-ЬО. На лейкоцитах показано, что условия, способствующие перекисному окислению липидов, также стимулируют активность 5-ЬО [52].

11.1.3.5. Стимуляция клеточными белками

5-LO, выделенная из различных источников, является чрезвычайно неустойчивым ферментом, наполовину теряя активность за 24 часа при 2°С [42]. По-видимому, такая инактивация является следствием окислительной деструкции, вызываемой активными формами кислорода (ROS), такими как перекись водорода и липидные гидропероксиды. Химически их действие заключается во взаимодействии с железом активного центра и потере его ферментом. Установлено, что очищенная 5-LO может быть стабилизирована в присутствии тиолов, глутатионпероксидазы и супероксиддисмутазы, способных понижать уровень ROS [53].

Когда очищенная 5-LO инкубируется с АА, активность фермента достаточно низкая и даже в присутствии Са2+ и АТР составляет не более 1-4% от максимальной. При выделении 5-LO из лейкоцитов, совместно с ней были выделены три недиализируемых стимулирующих фактора: один мембранно-связанный и два цитозольных [47, 48]. Интересно, что термостабильный мембранно- связанный фактор может быть заменен на искусственные РС-везикулы [26]. Хотя механизм такого действия неизвестен, было показано, что лейкоцитарные факторы увеличивают активность 5-LO, стабилизируя фермент в ходе преинкубации [44] и с успехом могут быть заменены неспецифическими белками-носителями и DTT [25].

11.1.3.6. 5-ЬО-активирующий белок (FLAP)

18 кДа белок FLAP был обнаружен при игибировании синтеза лейкотриенов в клетках под действием МК886 [54]. Оказалось, что МК886 способен эффективно ингибировать синтез лейкотриенов в цельных лейкоцитах, однако оказывается неэффективным в клеточных гомогенатах.

FLAP был выделен в чистом виде, а его кДНК была клонирована из человека и крысы. Оказалось, что она кодирует 161-АК белок с тремя трансмембранными участками и двумя гидрофильными петлями [55]. Любопытно, что имеется значительное сходство (31%) по всей длине АК-последовательности и в структуре лиганд-связывающих доменов между FLAP и также 18 кДа ЕТС4-синтазой [56].

Экспрессия FLAP наблюдается в тех же клетках, где присутствует 5-LO, таких как гранулоциты, моноциты/макрофаги, В-лимфоциты и интенсивность экспрессии коррелирует с таковой для самой 5-LO [57, 58]. Например, повышенная экспрессия FLAP и 5-LO наблюдалась в PMNL под действием GM-CSF [59] и в моноцитах при обработке дексаметазоном [60], GM-CSF или IL-3 [61]. С другой стороны, клетки, в которых отсутствует 5-LO, часто экспрессируют FLAP. Таковы лимфобластоидная линия Т клеток, недифференцированные Mono Mac 6 (ММ6) [62] или DMSO-дифференцированные U937 [63]. Экспрессия FLAP может регулироваться независимо от 5-LO. Например, IL-5 или дексаметазон увеличивают экспрессию FLAP в эозинофилах крови человека, не затрагивая уровень экспрессии 5-LO [64]. Альвеолярные макрофаги проявляют гораздо большую по сравнению с 5-LO индуцибельность экспрессии FLAP в процессе созревания, что дает основания считать FLAP скорость лимитирующим фактором в синтезе лейкотриенов из эндогенного субстрата в этих клетках [65].

Необходимость FLAP для внутриклеточного синтеза лейкотриенов может быть обнаружена в экспериментах по трансфекции линии человеческих клеток остеосаркомы [55]. Котрансфекция 5-LO и FLAP строго необходима для синтеза лейкотриенов при стимуляции ионофором, в случае, если синтез может быть подавлен под действием МК886. Клетки, трансфецированные только 5-LO, оказываются неспособны к синтезу лейкотриенов, хотя сам фермент активен в клеточных гомогенатах. Также не было обнаружено синтеза лейкотриенов в марофагах, негативных по FLAP, из нокаутных мышей [66]. Таким образом, принято считать, что FLAP является абсолютно необходимым участником внутриклеточного синтеза лейкотриенов из эндогенного субстрата. В то же время, в клеточных гомогенатах активный синтез лейкотриенов наблюдается и в отсутствие FLAP [67]. Однако, в тех случаях, когда синтез лейкотриенов в клетках стимулируется в присутствии экзогенной АА [68] и МК886 неспособна подавить его в этих условиях, наличие FLAP не является необходимым [65, 69, 70]. С другой стороны, было показано, что FLAP также стимулирует 5-LO метаболизм экзогенной АА [68]. FLAP способен связывать АА и другие цис-ненасыщенные жирные кислоты, из чего можно предположить, что FLAP служит агентом, доставляющим АА к 5-LO и создающим таким образом оптимальные условия для синтеза LTA4 [68, 71]. Была предложена модель, в которой АА-связывающий FLAP формирует гетеродимер с 5-LO, причем увеличение концентрации ионов Са2+ существенно способствует этому взаимодействию [58].

II.1.4. Внутриклеточное распределение 5-LO. Роль FLAP

На протяжении многих лет внутриклеточная компартментализация белков-участников синтеза лейкотриенов оставалась неизвестной. При фракционировании лейкоцитов было обнаружено, что cPLA2 и 5-LO находятся среди растворимых белков, в то время как FLAP оказался среди мембранно-связанных [54]. После стимуляции cPLA2 и 5-LO Са2+ зависимым образом продвигались к мембране [29, 72]. Объединив это наблюдение с тем фактом, что лейкотриены секретируются во внеклеточное пространство, сначала возобладало мнение, что синтез лейкотриенов происходит на плазматической мембране. В этой модели FLAP рассматривался как якорный белок, обеспечивающий связь 5-LO с ядерной мембраной, поскольку ингибитор FLAP МК886 подавлял ассоциацию 5-LO с мембраной во многих клетках [67, 73, 74]. Однако, в альвеолярных макрофагах МК886 не влиял на взаимодействие 5-LO с мембраной, но при этом синтез лейкотриенов подавлялся [65, 75]. Когда дефицитные по FLAP клетки остеосаркомы трансфецировались 5-LO, стимуляция ионофором приводила к связыванию 5-LO с мембранами, в том числе в присутствии МК886. В то же время, при совместной трансфекции 5-LO и FLAP транслокация 5-LO к мембране в присутствии МК886 подавлялась [76]. Все эти данные были получены достаточно грубыми методами клеточного разрушения и фракционирования. Интересно, однако, что последующие исследования с помощью микроскопии также обнаружили взаимодействие 5-LO с мембраной в присутствии МК886, притом что синтез лейкотриенов был подавлен [77, 78]. Таким образом, FLAP более не рассматривается как непременный медиатор связывания 5-LO с мембраной.

Когда локализация 5-LO, FLAP и cPLA2 была проверена более точными методами фракционирования и микроскопии, оказалось, что FLAP локализован в ядерной мембране, причем как в интактных, так и в активированных клетках [79, 80]. Кроме того, было показано, что 5-LO и cPLA2 после активации клеток продвигаются именно в направлении ядерной мембраны [79, 81].

Локализация 5-LO до активации в разных клетках различна. В периферических нейтрофилах крови и моноцитах [77], дифференцированных HL-60 [76] и ММ6 [82], а также в перитонеальных макрофагах [79] 5-LO в основном располагается в цитоплазме. В альвеолярных макрофагах [77], RBL [83], клетках Лангерханса кожи человека [20] 5-LO частично или полностью локализована в растворенном виде в ядрах. Ядерная локализация наблюдалась также для 5-LO, трансфецированной в различные клетки и клеточные линии: RAW макрофаги, немиелоидные линии, такие как НЕК 293, COS, СНО и NIH-3T3 [84, 85]. Так или иначе, вне зависимости от локализации в интактных клетках, при активации 5-LO продвигается к ядерной мембране [79, 80, 86]. Тем не менее остается непонятным, связывается ли цитозольная 5-LO с ядерной мембраной с цитоплазматической стороны, или сначала она проходит внутрь ядра и лишь затем взаимодействует с ядерной мембраной изнутри.

Можно выделить два этапа ядерной локлизации: импорт цитозольной 5-LO в ядро и связывание с ядерной мембраной. Ясно, что импорт зависит от наличия сигналов ядерной локализации (NLS) и не связан с синтезом лейкотриенов. Вероятно, NLS расположены как в N-концевом домене 5-LO, так и вблизи С-конца (рис. 7) [84, 85].

Ядерный импорт наблюдался в перитонеальных нейтрофилах крысы после обработки воспалительными агентами in vivo, или при адгезии нейтрофилов к стеклу in vitro. При этом последующая активация клеток ионофором приводила к повышенному синтезу лейкотриенов [87]. Аналогично, миграция моноцитов в легочную альвеолу (но не в перитонеум) приводила к вызывала повышенную способность клеток к синтезу лейкотриенов [88]. Интересно, что для альвеолярных макрофагов и рекрутированных PMNL требовались повышенные концентрации ионофора для синтеза лейкотриенов, в сравнении с сответствующими клетками с цитозольной 5-LO [87, 89]. В противоположность адгезионным PMNL, адгезионные эозинофилы синтезировали гораздо меньшее количество лейкотриенов, a 5-LO в них не транслоцировалась к ядерной мембране [90].

2+

Стимуляция клеток приводит к Са зависимой транслокации 5-LO к внешней стороне ядерной мембраны [30]. За этим следует активный синтез лейкотриенов. В

2| присутствии ионов С а 5-LO связывается с клеточной мембраной [29-31] и такую же роль играют PC-везикулы in vitro [24, 26]. Есть данные, свидетельствующие о важности флюидизации мембран для связывания с ними 5-LO. В искусственной системе в экспериментах с мультиламеллярными везикулами показано, что эффективность связывания 5-LO с мембраной и ее ферментативная активность совместно возрастают обратимому перераспределению 5-LO в ядрах и

Рис. 7 Модель 5-ЬО на основе структуры 15-ЬО кролика. Стрелкой показана последовательность аминокислот, предположительно формирующих N1^. заметному увеличению активности 5-ЬО [92]. На основании полученных в этих исследованиях данных была предложена модель взаимодействия 5-ЬО с фосфолипидными мембранами, представленная на рисунке 8 .

Мембранная ассоциация 5-ЬО наблюдается после стимуляции клеток различными агентами, при увеличении доли z/ионенасышенных введение кардиолипина и 1-пальметоил-2-олеил-5«-глицеро-3-фосфохолина (РОРС), приводило к жирных кислот в составе мембран [91] Так, вызывающими всплеск внутриклеточной концентрации кальция. Впервые этот эффект был обнаружен в периферических лейкоцитах крови [31]. Связывание

5-ЬО именно с ядерной мембраной было показано в работах [93-95]. Так, после стимуляции нейтрофилов ионофором А23187 в течение 10 мин происходила

Рис. 8 Модель 5-LO, встроенной в фосфолипидную мембрану, построенная с учетом взаимной угловой ориентации участков фермента [Pande, 20051. транслокация и концентрирование 5-ЬО вокруг ядерной мембраны (рис. 9).

Интересно, что хелатирование Са2+ ЕОТА обращает мембранное связывание в альвеолярных макрофагах [78]. Существуют и другие стимулы, помимо ионофора, вызывающие мембранное связывание 5-ЬО. Таковы М1Р в 0М80-дифференцированных НЬ-60 и нейтрофилах человека, зимозан или !МЬР в альвеолярных макрофагах [78], ^Е/антиген

Рис. 9 Транслокация 5-LO в нейтрофилах при активации клеток кальциевым ионофором А23187. а -интактные клетки, б - клетки через 10 мин после стимуляции ионофором [Brock, 1995]. в тучных клетках или в RBL-2H3 [73]. Исследования на альвеолярных макрофагах показали необратимость мембранной ассоциации 5-LO и инактивации фермента при длительной стимуляции ионофором (более 5 мин). В то же время, добавление EGTA ранее чем через 5 мин после активации ионофором, обращало мембранное связывание и 5-LO оставалась активна [78].

Недавно было обнаружено, что Са2+-связывающий (3-баррельный домен вовлечен в ионофор-индуцированную ассоциацию 5-LO с ядерной мембраной [34]. Характерно, что этот участок белка имеет в основном отрицательный поверхностный заряд (рис. 10).

Это, вероятно, должно способствовать его взаимодействию с положительно заряженными остатками фосфатидилхолина ядерных мембран. Участие С2 домена в связывании с мембраной было также показано для cPLA2 и РКС [32]. Синтетический пептид, состоящий из гидрофобной сигнальной последовательности и присоединенный к 5-LO NLS (остатки 566-577) блокировал ионофор-стимулированную транслокацию 5-LO к ядерной мембране в HL-60. Это указывает, что NLS может быть важен также и для агонист-опосредованного перераспределения 5-LO в клетке [96]. Возможно также, что белки, взаимодействующие с 5-LO, могут влиять на ее внутриклеточное распределение и ядерный импорт. Наконец, фосфорилирование 5-LO может быть также одним из факторов, влияющих на транслокацию этого фермента к ядру или в него [82, 97, 98].

Существуют исследования, показывающие что транслокация 5-LO к ядерной мембране не является обязательным условием для активного синтеза лейкотриенов в клетках. Исследования необходимости транслокации 5-LO к ядерной мембране для синтеза лейкотриенов были проведены на различных фагоцитах [82]. В моноцитарных ММ6 5-LO локализована в цитозоле, в то время как FLAP находится на ядерной мембране. После обработки ионофором, высвобождается существенное количество эндогенной АА, но синтез лейкотриенов остается низким и транслокации 5-LO к ядерной мембране не наблюдается. И хотя добавление экзогенной АА приводит к

Рис. 10 Электростатический потенциал С2-подобного домена 5-ЬО. Красные зоны соответствуют значениям до -25 мВ, синие до +25 мВ в условиях 100 мМ КС1 и двух связанных ионах Са2+ [Ки1каггм, 2002]. стимул тотальной активации синтеза лейкотриенов, практически вся 5-LO все еще остается в цитозоле. Таким образом, синтез лейкотриенов имеет место в цитозоле, где 5-LO осуществляет конверсию доступного субстрата. В отсутствие экзогенной АА 5-LO должна была бы транслоцирваться к ядерной мембране для получения достаточного количества эндогенной АА, высвобождаемой cPLA2. Поскольку этого не происхоит, синтез лейкотриенов остается низким. Примечательно, что предобработка клеток РМА с последующей активацией ионофором приводила к существенному перераспределению 5, межклеточное пространство

LO и параллельному r г увеличению синтеза лейкотриенов из эндогенной АА.

Сходные результаты были получены на

PMNL человека, стимулированных ионофором в концентрациях, недостаточных для оптимальной активации 5LQ и синтеза ^ Обобщенная схема регуляции 5-LO и синтеза лейкотриенов (0.1 мкМ) лейкотриенаA4 в клетке.

82]. Аналогично, прединкубация клеток с LPS увеличивала fMLP-индуцированную транслокацию 5-LO к ядерной мембране и синтез лейкотриенов. Интересно, однако, что уровень высвобожденной эндогенной АА оставался при прединкубации с LPS столь же низким, как и без нее [99].

II.1.5. Регуляция активности 5-LO в клетке

На основе сказанного выше, приведем простую и ставшую уже классической схему регуляции активности 5-LO в клетке (рис. 11).

Как уже упоминалось, накопление внутриклеточного Са2+ является важным этапом в активации 5-LO (как in vivo так и in vitro) и транслокации 5-LO к ядерной

2+ мембране. Стимулы, вызывающие активацию 5-LO, включают в себя: Са мобилизующие агенты, такие как ионофоры или тапсигаргин, растворимые агонисты, такие как ЬТВ4, £МЬР и С5а, цитокины, такие как 1Ь-8, и фагоцитируемые частицы, такие как зимозан, мочевинные или фосфатные кристаллы. На самом деле, все эти стимулы в той или иной степени вызывают всплеск концентрации Са2+. По-видимому,

94

Са ионофоры вызывают активный синтез 5-ЬО продуктов, в то время как природные агенты, лишь незначительно увеличивающие внутриклеточный уровень Са2+, действуя через поверхностные клеточные рецепторы, оказываются гораздо менее эффективны.

Среди нескольких изотипических фосфолипаз А2, 85 кДа сРЬА2 играет центральную роль в обеспечении синтеза лейкотриенов, предоставляя АА для 5-ЬО

100]. Ряд работ подтверждает вовлеченность сРЬА2 в образование лейкотриенов в нейтрофилах и макрофагах. Важность сРЬА2 для образования эйкозаноидов была показана и в двух независимых исследованиях на сРЬА2-нокаутных мышах [101]. Было показано, что Са2+ и/или фосфорилирование 8ег-505 в сРЬА2 при помощи МАРК может активировать транслокацию сРЬА2 к ядерной мембране и последующее высвобождение АА [102]. Таким образом, стимулы, которые приводят к фосфорилированию сРЬА2, вызывают высвобождение АА даже при базальном уровне

Са2+. С другой стороны, Са2+ ионофоры стимулируют высвобождение АА даже когда фосфорилирование сРЬА2 блокировано [102]. Однако, фосфорилирование оказывалось существенным в тех случаях, когда наблюдался только незначительный рост 2+ концентрации Са (например, при стимуляции клеток зимозаном) [103]. Для синтеза лейкотриенов доступность АА является критическим параметром и, таким образом, связывает 5-ЬО с активностью сРЬА2. Следовательно, малая активность синтеза лейкотриенов, индуцированного природными лигандами, может объясняться низкой доступностью АА, субстрата для 5-ЬО. Правильность такого предположения подтверждалась экспериментами с добавлением экзогенной АА при активации клеток такими слабыми стимулами как ШЬР, РАБ, С5а в РМ№, [27, 104, 105]. Синтез лейкотриенов при добавлении АА значительно увеличивался.

Необходимо рассмотреть так называемый эффект праймирования, ярко проявляющийся в регуляции синтеза лейкотриенов. Этот эффект наблюдается, когда клетки предварительно инкубируются с различными агентами, влияющими на разнообразные внутриклеточные процессы, и только затем стимулируется синтез лейкотриенов. Показано, что предобработка лейкоцитов так называемыми праймирующими агентами, включая факторы роста, цитокины, форболовые эфиры, LPS и вирус Эпштейна-Барра (EBV), которые сами по себе не индуцируют синтез лейкотриенов, приводила к существенному увеличению синтеза при последующей стимуляции клеток природными лигандами. Ввиду комплексной регуляции 5-LO различными кофакторами и вовлеченности в 5-липоксигеназный путь синтеза эйкозаноидов многих ферментов, эти эффекты праймирования могут достигаться через воздействие на многих этапах и объектах. Например, во всех этих случаях увеличивалось высвобождение АА и остается непонятным, происходило ли увеличение синтеза лейкотриенов за счет увеличения количества доступного субстрата или за счет увеличения активности самой 5-LO. В таблице 2 собраны данные по различным праймирующим агентам, стимулирующим высвобождение АА.

Таблица 2

Праймирующий агент Стимул Тип клеток

GM-CSF fMLP нейтрофилы

PAF

LTB4 ионофор

TNF ALPHA fMLP

LPS fMLP

Цельная кровь, РВМС

РМА ионофор Нейтрофилы, ММ6, альвеолярные макрофаги fMLP нейтрофилы

EBV Ионофор, fMLP, зимозан моноциты

PAF ионофор нейтрофилы

Также некоторыми авторами повышенный синтез лейкориенов объяснялся за счет усиления экспрессии FLAP [59, 64, 65].

Праймирование нейтрофилов GM-CSF и последующее стимулирование fMLP, PAF, С5а, зимозаном, IL-8 или ионофором всегда вело к повышенному синтезу лейкотриенов по сравнению с непраймированными клетками (табл. 2). В то же время само по себе праймирование клеток GM-CSF не вызывало синтеза лейкотриенов [104, 105]. Аналогичный эффект GM-CSF наблюдался и на цельной крови [106].

Увеличение синтеза лейкотриенов можно объяснить увеличением высвобождения АА, однако эффект GM-CSF сохраняется и при использовании экзогенной АА [104, 105].

Было показано, что инкубация нейтрофилов с GM-CSF в течение 30 мин приводила к увеличению экспрессии 5-LO и FLAP [59]. Высказывается предположение, что GM-CSF увеличивает внутриклеточную концентрацию свободного Са2+ в нейтрофилах, стимулированных PAF [104]. Однако, в других работах сообщалось о том, что GM-CSF не влияет на внутриклеточный уровень Са2+ в PMNL, обработанных fMLP или иономицином, однако позволяет cPLA2 эффективно работать уже при более

94низких концентрациях Са [107]. Эти эффекты GM-CSF могут быть мимикрированы форболовым эфиром и обращаются под действием стауроспорина, ингибитора РКС [107].

Предполагается, что фосфорилирование cPLA2, индуцированное праймированием

94

PMNL или макрофагов, делает фермент более восприимчивым к Са . Именно это позволяет получать тот же выход АА, что и при высоких концентрациях Са в экспериментах без праймирования [99,107].

Похожим образом праймирование нейтрофилов TNFa увеличиает выход АА и синтез лейкотриенов в ответ на fMLP или зимозан, но не влияет на fMLP-индуцированной изменение концентрации Са2+. Таким образом, при праймировании GM-CSF и TNFa должны действовать иные механизмы, отличные от простого

94накопления Са . Дополнительные эффекты TNFa и GM-CSF наблюдались на цельной крови после стимуляции С5а, PAF, зимозаном или ионофором [106].

Прединкубация цельной крови или изолированнх из нее лейкоцитов с LPS более 30 мин перед стимуляцией fMLP, С5а или IL-8 серьезно увеличивала выход АА и синтез лейкотриенов, дополнительные эффекты были получены совместно с TNFa . По аналогии с TNFa и GM-CSF, праймирование с LPS не влияло на агонистиндуцированный рост внутриклеточной концентрации Са , но приводило к фосфорилированию cPLA2 [99]. В таких LPS-праймированных клетках cPLA2 также как 5-LO транслоцировалась к ядерной мембране после стимулирования клеток ÍMLP и происходил повышенный выход АА и синтез лейкотриенов [99]. В непраймированных клетках этого не наблюдалось. Таким образом, перераспределение 5-LO может быть альтернативным механизмом, по которому действуют праймирующие агенты, увеличивающие синтез лейкотриенов. Более того, активация нейтрофилов при адгезии либо другая подобная процедура (которая напоминает праймирование) вызывала перераспределение цитозольной 5-LO и ее миграцию в растворимый локус ядер параллельно с увеличением синтеза лейкотриенов [87].

Ранние исследования показали, что праймирование с форболовыми эфирами или диацилглицеролами увеличивает клеточный биосинтез лейкотриенов в нейтрофилах и макрофагах [108-110]. В других исследованиях было показано, что эти агенты способствуют ионофор-индуцированному высвобождению АА. Интересно, что праймирование форболовым эфиром фагоцитов перед стимуляцией ионофором также увеличивало количество транслоцированной к ядерной мембране 5-LO. Синтез лейкотриенов при этом повышался, в том числе и в присутствии экзогенной АА [82]. Наконец, было высказано предположение, что праймирование с РМА может также увеличивать активность 5-LO по таким механизмам как фосфорилирование 5-LO [82, 108].

II.1.5.1. Активация 5-LO фосфорилированием

Фосфорилирование белков является регуляторным механизмом, обеспечивающим передачу экстраклеточных сигналов бесчисленному количеству клеточных белков и факторов транскрипции. В первичной структуре 5-LO присутствуют последовательности для фосфорилирования РКС, Са2+/кальмодулин-зависимой киназой (CaMKII), МАРКАРК, МК-2, -3, Só-киназой, МАРК 1/2 и Cdc2. Однако надо помнить, что белковое фосфорилирование не только требует наличия определенной последовательности, но и зависит также от общих структурных особенностей белка-мишени.

Фосфорилирование совместно с ростом концентрации Са2+ имеет важное значение для активности cPLA2, а также других ферментов, например РКС. Для 5-LO накопление Са2+ длительное время считалось вполне достаточным для активации и связывания с ядерной мембраной. Так, активация 5-LO через фосфорилирование рассматривалось как маловероятное событие и полагали даже, что фосфорилирование 5-LO в клетке вообще не имеет места [31]. Только в 1996 году было показано наличие небольшого количества фосфорилированной 5-LO в ядрах DMSO-трансформированных HL-60 [97]. Эта 5-LO была обнаружена только в ядрах ионофор-индуцированных клеток, но не детектировалась в клетках интактных. Более того, ингибиторы тирозин-киназы подавляли ионофор-индуцированную транслокацию 5-LO к ядру и ингибировали синтез лейкотриенов в гранулоцитах. Поскольку активность самого фермента была также подавлена, разумно было предположить, что эти вещества могут напрямую взаимодействовать с 5-LO [97]. На основании исследований, проведенных с использованием специфических ингибиторов МАРК киназыШ, PD98059 и U0126, было высказано предположение, что МАРК вовлечена в активацию 5-LO. Так, PD98059 блокировал транслокацию 5-LO и синтез лейкотриенов в ионофор-стимулирванных HL-60 [98]. U0126 препятствовал транслокации 5-LO в fMLP-стимулированных человеческих нейтрофилах. Тем не менее, было показано, что МАРК не фосфорилирует изолированную 5-LO in vitro [97]. Недавно были получены данные о том, что ингибитор Янус киназы III блокирует транслокацию 5-LO и синтез лейкотриенов в RBL, но точная роль JAK/STAT в активации 5-LO остается неизвестной

1И].

С использованием внутригелевого киназного теста, методики, позволяющий определить активность киназы в отношении конкретного субстрата, было обнаружено, что МКЗ и МК2, регулируемые р38 МАРК из стимулированных лейкоцитов, фосфорилируют 5-LO in vitro [112]. Среди трех больших семейств МАРК, р38 МАРК активируются не только воспалительными стимулами, хемотактическими факторами, форболовыми эфирами и Са2+ мобилизующими агентами, но итакже и в ответ на разнообразные клеточные стрессы, такие как осмотический шок, ген-токсический шок (под действием арсенита натрия), УФ излучение и термический шок [113]. Р38 МАРК активирует следующие по каскаду киназы и факторы транскрипции. В фагоцитах р38 рассматриваться как возможная мишень для фармакологического вмешательства при лечении

МАРКАР киназа 2 (МК2)

Ser 271 в LERQLS

ERK2

Ser 663 в YLSP

МАРК активация приводит к продукции 1Ь-1 и ЮТа, в РМ1ЧЬ р38 МАРК вовлечена в развитие хемотаксиса, адгезии, дегрануляции и окислительного (кислородного) взрыва. Таким образом, р38

Участки фосфорилирования 5-LO

МАРК может воспалительных заболеваний. MKs фосфорилируют серин субстратов в

Рис. 12 Участки регуляторного фосфорилирования 5LO. последовательности

Стрелками отмечены остатки Ser, фосфорилируемые МК2 и ERK2. hyd-Xaa-Arg-Xaa-Xaa

Ser, где hyd - крупный гидрофобный остаток. Такой мотив имеется и в 5-LO (266: LERQLS) с Ser 271 как сайтом фосфорилирования (рис. 12).

Интересно, что такие агенты как ионофор, тапсигаргин, С5а и fMLP, индуцирующие синтез лейкотриенов, активируют р38 МАРК и следующие по каскаду МК в лейкоцитах. Точно также и праймирующие агенты, такие как TNFa, GM-CSF, LPS и форболовые эфиры, являются сильными активаторами р38 МАРК-каскада. Таким образом, р38 МАРК-регулируемое фосфорилирование 5-LO может активировать синтез лейкотриенов. Например, в ионофор-обработанных клетках ММ6 или PMNL, праймирование форболовым эфиромувеличивало продукцию лейкотриенов и степень ядерной локализации 5-LO и стимулировало фосфорилирование 5-LO посредством МК2 и МКЗ. Интересно, что при блокировании активности МК капьфостином С также оказывалась блокированной и активация 5-LO. Более того, кальфостин С понижал синтез лейкотриенов, транслокацию 5-LO и активацию МК2 и МКЗ даже в PMNL, обработанных высокими концентрациями ионофора.

Вовлеченность р38 МАРК в транслокацию 5-LO была показана в исследованиях на rat-2 фибробластах, трансфецированных GFP-5-LO [114]. В трансфецированных клетках, экспрессирующих доминантный негативный Racl мутант (необходимый для эффективной активации р38 МАРК) транслокация 5-LO оказывалась пониженной при обработке иономицином. Тот же эффект наблюдался при введении в клетки р38 МАРК ингибитора SB203580.

Интересные результаты были получены на нейтрофилах. В этих клетках PAF является слабым активатором как 5-LO так и МК. При совместном введении PAF и арсенита натрия, мощного аткиватора р38 МАРК, наблюдалось не только существенное фосфорилирование 5-LO, но и четырехкратное увеличение синтеза лейкотриенов при введении экзогенной АА [112]. Поскольку в этих условиях активность cPLA2 не являлась скорость лимитирующим фактором, разумно предполагать, что эффект арсенита натрия направлен непосредственно на активность 5-LO.

Увеличение синтеза лейкотриенов под действием клеточного стресса по р38 МАРК зависимому пути наблюдалось также на линии B-лимфоцитов (BL41-E95-A) [115]. Стимуляция этих клеток ионофором и экзогенной АА приводила лишь к незначительному синтезу лейкотриенов и не вызывала активации р38 МАРК или фосфорилирования 5-LO. Однако, при оксидативном стрессе (Н2О2), осмотическом шоке (NaCl, сорбитол), химическом стрессе (NaAs), и под воздействием цитокинов (ILl/TNFa) наблюдалась резкая активация 5-LO и синтеза лейкотриенов, особенно при введении экзогенной АА совместно с ионофором [115, 116]. Одновременно активировались р38 МАРК и зависимые МК, происходило фосфорилирование 5-LO. Введение сорбитола самого по себе было достаточно для активного синтеза лейкотриенов в присутствии экзогенной АА и стимуляция ионофором при этом не требовалась. Наконец, ингибирование р38 МАРК SB203580 нивелировало стресс-индуцированный синтез лейкотриенов в клетках. При этом активность самой 5-LO не затрагивалась, и в гомогенате синтез лейкотриенов наблюдался. Таким образом, на настоящий момент можно представить себе участников регуляции 5-LO посредством фосфорилирования следующей схемой (рис. 13)

Киназы\ РЙАК MNK1 кипам 86 Е1Ы /

Адгезия Дегрануляция

МАРКАР-2/3

Хемотаксис

ТАПСИГАРГИН ИОНОФОР А23181

ОСМОТИЧЕСКИЙ И ТЕПЛОВОЙ ШОК УФ

I Рис. 13 Сводная схема регуляции 5-ЬО в клетке с участием МАРКАР-2/3 и р38 МАРК.

И.1.5.2. Эндогенные ингибиторы 5-липоксигеназного пути

Поскольку продукты 5-ЬО активности являются физиологически активными соединениями, ингибирование их образования часто оказывается весьма желательным. Среди всех процессов, участвующих в регуляции активации 5-ЬО и последующего синтеза лейкотриенов, внутриклеточные механизмы подавления активности 5-ЬО все еще остаются наименее изученными.

Известно, что селен-зависимые глутатион-пероксидазы являются мощными ингибиторами 5-ЬО, поскольку снижают уровень липидных гидропероксидов [117]. Такая регуляторная роль пероксидаз была впервые обнаружена для 12-ЬО в экспериментах на тромбоцитах. Клетки из селен-дефицитных крыс производили гораздо больше 12-НРЕТЕ из АА по сравнению с контрольными. Эксперименты с ОБН-понижающими агентами, такими как 1-хлор-2,4-динитробензол или диамид, показали наличие окислительно-восстановительного механизма регуляции 5-ЬО в РМ1\ПЬ. Это послужило основой для выдвижения гипотезы о вовлеченности селен-зависимых глутатионпероксидаз в подавление активности. Так, в лейкоцитах из селен-дефицитных крыс наблюдался в 7 раз более активный синтез лейкотриенов, по сравнению с контролем [117]. Было также показано, что фосфолипид-гидропероксидная глутатионпероксидаза (PhGPx) подавляет активность 5-0 в клетках А431, а суперэкспрессия PhGPx в RBL-2H3 приводит к снижению синтеза лейкотриенов.

В В-лимфоцитах и незрелых миелоидных клетках PhGPx также в основном ответственна за подавление активности 5-L0. В-лимфоциты экспрессируют 5-L0 и в гомогенатах этих клеток образуются значительные количества лейкотриенов. В то же время, при стимуляции клеток стандартными стимулами (ионофор и экзогенная АА) наблюдался лишь слабый синтез лейкотриенов. Во всех случаях при снижении активности GPx происходила активация 5-L0 и образование значительных количеств лейкотриенов в ответ на стимуляцию ионофором и АА [70, 116]. В гомогенатах BL41-Е95-А активность 5-LO существенно подавлялась при восстановлении и увеличении активности GP добавлением миллимолярных количеств тиолов. По сравнению с фагоцитами, В-лимфоциты синтезируют лишь незначительные количества эндогенного супероксида после стимуляции, поэтому уровень супероксида в BL41-E95-A было трудно достоверно зафиксировать [116]. Примечательно, что ROS, синтезированные экзогенной ксантиноксидазой или митохондриями при обработке антимицином А, существенно увеличивали активность 5-LO в BL41-E95-A [116]. Одновременное введение каталаз (но не супероксиддисмутаз) нивелировало эти эффекты, что указывает на участие в активации 5-LO гидропероксидов или Н202, а не собственно супероксида. Совместная инкубация BL41-E95-A со стимулированными PMNL показала, что ROS из PMNL способен активировать 5-LO в В-лимфоцитах. В свою очередь, это может инициировать активный синтез лейкотриенов В-клетками в очагах воспаления in vivo [116]. Следует также отметить, что при оксидативном стрессе происходит активация р38 и последующих МК, фосфорилирующих 5-LO в BL41-E95-A и ингибирование р38 МАРК с помощью SB203580 уменьшает активацию 5-LO, вызванную Н2О2 [115]. Таким образом, резонно предположить, что про-оксидативные агенты могут стимулировать 5-LO по двум путям: ростом фосфорилирования 5-LO, ведущему к GP-нечувствительной активации и переводом железа активного центра 5-LO в окисленное состояние.

По аналогии с BL41-E95-A, в гомогенате HL60, дифференцированных DMSO, активность 5-LO также является высокой, но подавляется при обработке тиолами как в гомогенатах, так и в интактных клетках. Дифференцировка клеток в присутствии YD3 и TGFP увеличивает внутриклеточный синтез лейкотриенов и активность 5-LO в тиол-обработанных гомогенатах без подавления активности GPx [118]. При смешении супернатантов дифференцированных гранулоцитов с супернатантом BL41-E95-A было обнаружено, что высокая активность 5-LO в дифференцированных клетках обусловлена высокой устойчивостью каталитической активности 5-LO против пероксидаз, но не низкой активностью самих GP. В клетках ММб дифференцировка TGFß или VD3 по отдельности приводила к экспрессии малоактивной 5-LO. При этом было показано, что GPx-1 является мощным внутриклеточным ингибитором 5-LO [118]. Для ингибирования не требовались высокие концентрации тиолов и оно поддерживалось даже меркаптоэтанолом. Также как было показано для HL60, клеточная активность GPx в ММ6 не меняется в процессе дифференцировки TGFß и VD3 и 5-LO из зрелых гранулоцитов обладает гораздо большей устойчивостью к GPx-1 по сравнению с 5-LO из В-лимфоцитов [118]. Обобщая приведенные факты можно сказать, что GP-нечувствительная активность 5-LO, по-видимому, возникает в процессе дифференцировки/созревания клеток и приводит к высокоэффективному синтезу лейкотриенов в зрелых моноцитах/макрофагах и гранулоцитах.

Необходимо сказать несколько слов о воздействии на активность 5-LO аденозина и окиси азота. Аденозин способен регулировать великое множество клеточных функций. Так, в PMNL он ингибирует продукцию супероксида, фагоцитоз и адгезию. Накопление аденозина в клетке либо его введение извне подавляет стимулированный fMLP синтез LTB4 в цельной крови. Включение аденозиндеаминазы или специфического антагониста А2 рецептора нивелировало этот эффект и увеличивало синтез LTB4 в изолированных PMNL после стимуляции. Ингибирование синтеза лейкотриенов аденозином зависит от типа клеток и используемого стимула [119]. Например, активация А2а рецептора приводит к накоплению сАМР, способного блокировать высвобождение АА. Это приводит к подавлению синтеза лейкотриенов в PMNL, стимулированных PAF или тапсигаргином [119].

Другим важным регулятором развития воспалительного процесса является окись азота (NO). N0 способен инактивировать многие L0, переводя железо активного центра из окисленной в восстановленную форму [176]. Длительное выдерживание альвеолярных макрофагов в присутствии LPS приводит к подавлению синтеза лейкотриенов, не затрагивая при этом эффективность высвобождения АА или количество 5-L0 или FLAP вклетке. В то же время, при этом наблюдается значительная активация N0 синтазы. Такое LPS-индуцированное ингибирвание 5-L0 может быть имитировано NO-донорами, а снято - ингибиторами NO-синтазы [120]. Интересные данные получены при исследовании влияния 15(S)-HETE на синтез LTB4. Повышенный уровень 15(S)-HETE наблюдается при хроническом бронхите. Оказалось, что это вещество подавляет активность 5-L0 и снижает количество образующегося LTB4 в макрофагах и нейтрофилах [121]. Характерно, что количество высвобождаемой

АА при этом не снижалось [122]. Таким образом, было показано, что продукты 15-LO активности подавляют метаболизм А А по 5-липоксигеназному пути.

II.1.5.3. Белковые взаимодействия 5-LO

Несмотря на то, что многие экспериментальные данные указывают на возможность взаимодействия 5-LO и FLAP, их прямая ассоциация так и не была доказана.

5-LO была обнаружена в иммунопреципитатах NF-кВ из лизатов HL60 [96]. Количество 5-LO в таких преципитатах было высоко в случае стимулированных ионофором клеток, в которых 5-LO транслоцировалась к ядру. В случае, когда транслокация блокировалась, количество 5-LO в преципитатах было весьма низким. Отсюда был сделан вывод, что 5-LO может играть роль в чувствительности клеток к NF-kB.

Взаимодействие 5-LO с тремя клеточными белками предсказано при двугибридном скрининге библиотеки кДНК человеческого легкого. Ими оказались коактозин-подобный белок (CLP), TGFp рецептор-1-связанный белок I (TRAP-I) и белок с высокой гомологией к хеликазе К12Н4.8. Поскольку TGF0 сильно увеличивает экспрессию и активность 5-LO при созревании миелоидных клеток, кажется возможной функциональная связь между TRAP-I и 5-LO. Взаимодействие с К12Н4.8 предполагает для 5-LO роль, отличную от синтеза лейкотриенов. CLP показывает высокую степень гомологии с коактозином, актин-связывающим белком, и было показано, что CLP способен связывать актин в филаментах. По последним данным, прямое взаимодействие между 5-LO и CLP было показано in vitro и in vivo. 5-LO связывает CLP, независимо от присутствия Са2+, в эквимолярном соотношении, причем это связывание не оказывает существенного влияния на каталитическую активность 5-LO. Тем не менее не было обнаружено 5-LO-CLP-aicTHHOBbix комплексов, но 5-LO может конкурировать с F-актином за связывание с CLP и способна блокировать полимеризацию актина in vitro. Связь между 5-LO и актином предполагалась и ранее, поскольку было обнаружено, что 5-LO может связываться с актином и альфа-актинином [123]. Таким образом, 5-LO способна функционировать как регулятор актиновой динамики в клетках.

Рассмотрим теперь биологическую роль продуктов 5-липоксигеназной активности и известные пути ингибирования самого фермента.

П.1.6. Роль лейкотриенов в воспалительных процессах и пути подавления лейкотриенового синтеза

Биологическое действие лейкотриенов опосредуется специфическими рецепторами. ЬТВ4 осуществляет свое действие через связывание с рецепторами ВЬТ1 и ВЬТ2. Эти рецепторы представляют собой О-белок-спаренные рецепторы, содержащие семь трансмембранных участков, с высокой гомологией (до 45%), но различным распределением по тканям и фармакочувствительностью. Вдобавок, ЬТВ4 связывается с пероксисомным пролифератор-активируемым рецептором у (фактором транскрипции, отвечающим за развитие воспалительных ответов) и активирует его. Это позволяет предположить, что ЬТВ4 может использоваться в регуляции воспалений [124].

Недавно были клонированы два гетерогенных Суя-ЬТ-связывающих рецептора, СузЬИ и СуэЦП. Есть указания на существование двух подклассов СузЬТ! и СузЬТ2 и предполагается существование третьего класса СуэЬТ рецепторов. СузЬТ2 гораздо более распространен в различных тканях, чем СуэЬТ1 и нечувствителен к классическим антагонистам СуэЬТ рецепторов.

ПЛ.6.1. Биологическое действие лейкотриенов

Лейкотриены являются мощными биологическими медиаторами в патофизиологии воспалительных процессов и реакций системы защиты организма [3]. 1ЛВ4 действует как мощный хемотактический и хемокинетический агент, стимулирующий миграцию и активацию гранулоцитов, ведущую к адгезии гранулоцитов к стенкам сосудов, дегрануляции, высвобождению супероксида и лизосомальных ферментов [125]. Было показано активирующее воздействие ЬТВ4 на фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов. Активированные макрофаги генерируют кислородные радикалы, что приводит к развитию местной воспалительной реакции, для подавления которой требуется введение антиоксидантов [126, 127]. В лимфоцитах ЬТВ4 стимулирует секрецию ^Е, ^О и ^М и экспрессию низкоаффинных рецепторов к ^Е [125]. ЬТВ 4 связывают с повышенной продукцией интерлейкинов, ускорением транскрипции. Эти свойства придают ЬТВ4 важнейшее значение в развитии патогенеза таких воспалительных состояний как острые и хронические аллергические ответы, артриты, астма, псориаз и другие. Последние данные свидетельствуют, что подавление синтеза ЬТВ4 и его взаимодействия с со своими рецепторами существенно облегчает симптоматические проявления некоторых видов астмы [128]. На рисунке 14 представлена совокупность воздействий, которые оказывает лейкотриен В4 на различные клетки.

Большое число патофизиологических свойств было описано для СузЬТ, например повышенное слизеотделение, N

СI %

Дендритные клетки - хемотаксис -продукция IL-6

--/

Макрофаги

- хемотаксис

- продукция 11.-1,6,8 и ТИРа

- экспрессия рецептора И-2

- продукция Н202

- опухолевая цитотоксичность

- фагоцитоз I

LTB4

Т-клетки

- продукция IL-2,4,5,10

- пролиферация CD4 клеток i

- снижение пролиферации CDS клеток V )

В-клетки

- ди фферен циров ка

- стимуляция продукции IgE через IL-4

- экспрессия антигена CD23

NK-клетки -увеличение клеточной активности - экспрессия IL-2R |3 1

Нейтрофилы

- хемотаксис

- адгезия

- секреция лизосомальных ферментов

- проду кция 1403

- продукция И-8

- экспрессия рецептора СЗЬ -усиления реакции на<М1Р

- миграция к очагу воспаления вазоконстрикция и другие [125].

Контрактильные эффекты СуэЬТ, оказываемых на мягкую мышцу в дыхательных путях, оказались в 1000 раз сильнее, чем от воздействия гистамина. Из-за таких свойств и основываясь на успешной терапии с использованием антилеикотриеновых препаратов, принято считать, что СувЬТ играют особую роль в развитии астмы [125]. Таблица 3 дает краткое представление о биологическом действии, оказываемом СуэЬТ и ЬТВ4 на фагоциты.

II.1.6.2. Направленное генетическое подавление 5-LO

Для получения дополнительных данных о патофизиологической роли 5-ЬО и лейкотриенов были специально выведены нокаутные мыши. Эти мыши фертильны, нормально развиваются и живут, у них не наблюдается отличий в строении костной ткани и составе крови, распределении иммунных клеток. Хотя в нокаутных организмах

Таблица 3

CysLT LTB4

Синтез

Макрофаги Нейтрофилы Действие

Макрофаги Фагоцитоз

Антимикробная защита Продукция цитокинов

Нейтрофилы Миграция к очагу инфекции Фагоцитоз

Антимикробная защита Продукция цитокинов + + + + + + + + + часто развиваются компенсирующие изменения, в этих 5LO-/- мышах клетки не способны к синтезу лейкотриенов и не найдено никаких существенных изменений в других ферментах и рецепторах, связанных с метаболизмом лейкотриенов.

Роль лейкотриенов в воспалениях стала очевидной в нескольких моделях с использованием мышей, например АА-индуцированное воспаление уха или зимозан-индуцированный перитонит. Однако, не было замечено изменений в РМА-индуцированном ответе в -/- мышах, и гликоген индуцированная миграция в перитонеальную полость не предотвращалась. Макрофаги из -/- мышей обнаружили пониженную способность к фагоцитозу Klebsiella pneumoniae и повышенную последующую летальность, приводящую к развитию пневмонии. Этот результат ярко демонстрирует вовлеченность лейкотриенов в систему антибактериальной защиты организма. Особая роль 5-LO и лейкотриенов заметна при PAF-индуцированном шоке, когда -/- мыши после неоднократной индукции шока оставались живы, в то время как контрольные особи были гораздо сильнее подвержены летальному воздействию PAF.

Наконец, при исследовании воспалений дыхательных путей, -/- мыши показали значительно пониженную гиперчувствительность по сравнению с контрольными мышами, и число эозинофилов в них также оказалось значительно меньше контрольного. Подводя итог, отметим, что проведенные к настоящему времени исследования ясно показывают важнейшую роль 5-LO и лейкотриенов в патофизиологии воспалений. Дальнейшие работы в этом направлении, несомненно, помогут открыть новые пути лечения многих заболеваний этого типа.

Рассмотрим теперь известные пути подавления синтеза лейкотриенов.

IL1.6.3. Ингибиторы биосинтеза лейкотриенов

Виду своих свойств, описанных нами выше, лейкотриены рассматриваются как многообещающие мишени при терапевтическом вмешательстве в развитие множества аллергических и воспалительных процессов. Сегодня антилейкотриеновая терапия состоит из двух частей: подавление синтеза лейкотриенов и блокирование лейкотриеновых рецепторов. Для целей нашей работы остановимся на первом варианте.

Синтез лейкотриенов может быть подавлен тремя способами:

- ингибированием фосфолипаз, поставляющих АА, субстрат для 5-LO;

- ингибированием FLAP;

- и, наконец, прямым ингибированием 5-LO. ! Г .

Рассмотрим последние два пути более подробно.

П.1.6.3.1. Ингибиторы FLAP

Первым известным ингибитором FLAP стал МК886 (рис. 15). Это соединение эффективно ингибирует образование продуктов 5-LO активности в интактных лейкоцитах (IC50 2.5 нМ), но менее эффективно в цельной крови (IC50 1.1 мкМ). В гомогенатах клеток и при воздействии на очищенный препарат 5-LO МК886 совершенно не влияет на синтез лейкотриенов [129]. Показано, что МК886 частично подавляет синтез LTB4 ex vivo в цельной крови, снижает общий уровень лейкотриенов в воспалительных экссудатах и бронхоконстрикцию [129].

Было обнаружено, что индольные и хинолиновые структуры, а также их гибриды способны связываться с FLAP и ингибировать синтез лейкотриенов в интактных клетках [130]. Так, например, хинолин Bay Х1005 (рис. 15) является мощным ингибитором продукции лейкотриенов в изолированных лейкоцитах крысы (IC50 26 нМ) и человека (IC50 220 нМ) [131], понижает образование лейкотриенов в дыхательных путях человека и ингибирует аллерген-индуцированный синтез лейкотриенов и бронхоконстрикцию при астме. Связывание Bay XI005 с FLAP коррелирует с подавлением синтеза LTB4. Индол-хинолиновый гибрид МК0591 (рис. 15) имеет тот же сайт связывания с FLAP, что и МК886, и эффективно ингибирует синтез лейкотриенов как in vitro так и in vivo. К сожалению, в клинических испытаниях на пациентах МК0591 показал только незначительную активность [130].

Так же как и МК886, МК0591 и Bay Х1005 проявляют значительную активность только в экспериментах на интактных клетках. При использовании цельной крови и клеточных гомогенатов эти вещества оказываются в 50-200 раз менее активными [131]. Возможные объяснения пониженной эффективности ингибиторов FLAP в экспериментах на цельной крови могут опираться на то предположение, что им

С ООН

Bay Х1005 соон

МК-886 соон

МК-0591

Рис. 15 Ингибиторы FLAP. ингибирует антиген-индуцированную приходится конкурировать с АА и другими цис-ненасыщенными жирными кислотами за возможность взаимодействия с FLAP [71]. Так, высокие концентрации цис-ненасыщенных жирных кислот в случае цельной крови (100-150 мкМ свободной олеиновой кислоты в плазме) могут сдвигать IC50 в область более высоких значений. Кроме того, введение экзогенной АА в инкубацию с гранулоцитами или В-лимфоцитами, стимулированными ионофором, значительно понижает эффективность МК886 по сравнению с контрольными клетками, стимулированными ионофором в отсутствие экзогенной АА [69, 70, 132]. Вполне возможно также, что в тех условиях, когда имеется повышенная концентрация свободной АА, (как, например, в очагах воспаления), FLAP может иметь не столь большое значение для внутриклеточного синтеза лейкотриенов. В этом случае ингибирование FLAP не будет приводить к ингибированию синтеза лейкотриенов.

Интересно, что ингибиторы FLAP оказались эффективными регуляторами других клеточных процессов, не связанных напрямую с синтезом лейкотриенов. Так, например, они способны ингибировать респираторный взрыв в нейтрофилах [131] и подавлять активность ЕТС4-синтазы [56]. Поскольку цис-ненасыщенные жирные кислоты могут модулировать некоторые клеточные сигнальные пути и оказывать воздействие на многие ферменты, такие как фосфолипазы, протеин киназы, G-белки, аденилат- и гуанилатциклазы или влиять на ионные каналы, можно предположить, что ингибиторы FLAP могут также конкурировать с жирными кислотами за сайты связывания этих сигнальных молекул. Это, в свою очередь, заставляет нас предположить, что фармакологическое действие этих препаратов окажется не всегда легко предсказуемым.

II.1.6.3.2. Прямые ингибиторы 5-LO

Этот тип ингибиторов можно подразделить на три класса:

- окислительно-восстановительные ингибиторы;

- Fe-лигандные со слабыми окислительно-восстановительными свойствами;

- и «не окислительно-восстановительные» конкурентные ингибиторы 5-LO.

II.1.6.3.2.1. Окислительно-восстановительные ингибиторы

Изначально поиск среди природных и синтетических соединений привел к мысли, что липофильные восстанавливающие агенты будут служить прямыми ингибиторами

5-L0, поскольку смогут восстанавливать железо активного центра и снижать таким образом каталитическую активность фермента. Так, напрмер, фенолы, такие как нордигидрогуаровая кислота, кофейная кислота, флавоноиды, кумарины или соединения фенидонового типа действительно являются весьма эффективными ингибиторами 5-LO in vitro и in vivo [133]. К сожалению, эти вещества обладают низкой селективностью по отношению к 5-LO и обладают множеством побочных эффектов, в том числе и крайне неприятных (например, стимулция образования метемоглобина). Это обусловлено тем, что ингибиторы данного типа легко включаются в биологические

Ti 'он о

LDP-977 (СМ1-977)

BWA4C ингибиторы 5-LO. окислительно-восстановительными свойствами, например FF-861, BW755C и ICI-207968. Тем не менее, все эти вещества так и не получили широкого применения в клинической практике из-за недостаточной специфичности действия и ряда побочных эффектов [133].

II.1.6.3.2.2. Fe-лигандные со слабыми окислительно-восстановительными свойствами

Ингибиторы этой группы содержат в своем составе остаток гидроксамовой кислоты или N-гидроксимочевинную группу (рис. 16).

Один из них, BW А4С, является селективным ингибитором 5-LO с IC50 40 нМ. Недостатком этого соединения является его склонность к быстрой инактивации и образованию токсичных нитроксидных радикалов. Поиск более стабильных лигандных групп привел к созданию гидролитически устойчивых N-гидроксимочевинных производных. Одно из таких соединений, зилеутон (А-64077), используется теперь в США при клинической терапии астмы. В исследованиях на клетках различных животных (крыса, мышь, морская свинка, обезьяна) и человека, зилеутон действовал с IC50 от 0.5 до1 мкМ, независимо от активирующего стимула [134].

Клинические исследования показали, что зилеутон эффективен при острых и хронических заболеваниях дыхательной функции, некоторых астматических каскады других окислительно-восстановительных систем, либо продуцируют большие количества активных форм кислорода. Дальнейшее развитие этого направления привело к разработке мощных потенциальных ингибиторв 5-ЬО с пониженными NH К

Zileuton (А-64077)

Abt-761

Рис. 16 Fe-лигандные симптомах,. Несмотря на то, что зилеутон обнаружил потенциал при лечении астмы, он оказался мало эффективен в случае других заболеваний, таких как аллергические риниты, ревматоидные артриты, и воспаления кишечника. В случае колитов зилеутон оказался совершенно неэффективен. Попытки улучшить данное соединение привели к получению АВТ-761, ингибирующего 5-LO активность в нейтрофилах с IC50 23 нМ. В животных моделях при лечении бронхоспазмов он оказался в 5 раз эффективнее зилеутона и препятсвовал развитию бронхоспазмов, вызванных физической нагрузкой, а также снижал уровень LTE4 в выделениях больных астмой.

LDP-977 (CMI-977) также является сильным ингибитором N-гидроксимочевинной серии с IC50 120 и 100 нМ в экспериментах на цельной крови и легочной ткани человека, соответственно. Таким образом, по сравнению с зилеутоном это соединение показывает в 5-10 раз более сильное действие, к тому же, более длительное по времени.

II.1.6.3.2.3. «Не окислительно-восстановительные» конкурентные ингибиторы 5-LO

Поиск возможных ингибиторов 5-LO, не обладающих окислительно-восстановительными свойствами, позволил создать целую серию соединений, принцип действия которых основан на конкурировании с АА за связывание с активным центром фермента. К этой группе относятся различные метоксиалкилтиазолы и метокситетрагидропираны (рис. 17) [135]. Так, например, ZM211965 подавляет активность 5-LO в макрофагах мыши и цельной крови человека с IC50 В и 400 нМ, соответственно. Понятно, что препятствием на пути использования этих соединений стали большая гидрофобность и недостаточная стабильность. Действительно, из-за малой растворимости в воде и небольшого времени жизни в условиях организма, эти ингибиторы оказались весьма мало эффективными in vivo. Структурная оптимизация ZM211965 позволила создать более биологически стабильные ZD2138 и его этильный аналог ZM230487. В самом деле, ZM230487 ингибировал 5-LO в цельной крови человека с IC50 20-50 нМ, оказавшись таким образом в 10 раз эффективнее своего предшественника [135].

Фирма Merck, также путем скрининга, пришла к созданию гибридного ингибитора, состоящего из метоксиалкилтиазольных или метокситетрагидропирановых

ML-3000

ZD 2138, R=Me ZD 230487, R=Et

KSs

L-739,010

L-697198

ZM 211965

Рис. 17 Ингибиторы 5-LO «не окислительно-восстановительного» типа. и нафтален-лигнан-лактоновых группировок. Одно из этих соединений, L-697,198, оказалось удовлетворительным ингибитором 5-LO. В нейтрофилах человека оно блокировало образование LTB4 с IC501.5 нМ [136].

К сожалению, как и в случае ингибиторов других классов, на пути успешного клинического применения встает низкая эффективность или недостаточная селективность in vivo. Так, ZD2138, несмотря на многообещающие результаты в экспериментах ex vivo и in vitro, оказался практически неспособен подявлять синтез лейкотриенов в очагах хронического воспаления [137]. Любые эксперименты in vivo требовали значительно больших концентраций действующего вещества по сравнению с ex vivo, для достижения того же эффекта. Например, у пациентов, страдающих астмой ZD2138 вопреки ожиданиям не препятствовал развитию аллерген-индуцированного астматического ответа и оказался неэффективным при воспалении легких и развитии гиперчувствительности дыхательных путей. Если обобщить имеющиеся данные по клиническим испытаниям, можно отметить, что применение этих ингибиторов оказываются полезным при острых воспалительных ответах, но совершенно не имеет смысла при процессах, имеющих хронический характер.

Особо интересно отметить, что в случае ZD2138 обнаружилось большое различие между ингибированием синтеза лейкотриенов в цельных клетках и в очищенном препарате 5-LO. Так, если в интактных клетках (крысы и человека) IC50 составила порядка 20-30 нМ, то в случае очищенного препарата 5-LO IC50 поднялась до 3.8 мкМ [137]. С использованием in vitro дифференцированных моноцитарных клеток линии ММ6 и гранулоцитарной линии HL60 были получены аналогичные результаты:

ZD230487 эффективно ингибировал 5-LO в клетках, с IC50 45 и 15 нМ, соответственно, в то время как в супернатанте лизированных клеток после центрифугирования при 100000 g он оказал в 20-100 раз более слабое действие [132]. Было обнаружено, что потеря эффективности ZD230487 или сходного ингибитора Merck L-739,010 в гомогенатах PMNL из крови человека, не связана с доступностью АА. Напротив, ингибирующий эффект может быть усилен при добавлении глутатиона или дитиотреитола, а эффективное ингибирование синтеза лейкотриенов в очищенном препарате 5-LO требует присутствия активной глутатионпероксидазы.

Интересно, что в условиях, вызывающих окислительный стресс и повышающих уровень пероксида, эффективность ZM230487 в интактных клетках снижается. При использовании других классов ингибиторов 5-LO (МК886, BW-A4C) такой редокс-зависимости не наблюдалось. Кинетический анализ ZD230487 обнаружил конкурентный характер ингибирования 5-LO в невосстанавливаюпщх условиях, в то время как при понижении гидропероксидного тонуса тип ингибирования менялся на неконкурентный.

Основываясь на описанных результатах, «не окислительно-восстановительные» ингибиотры 5-LO рассматриваются как эффективные только при низком уровне пероксида. Эта точка зрения легко объясняет низкую эффективность, например, ZD2138 в клинических исследованиях. В самом деле, воспалительные процессы, такие как воспаление легких или гиперчувствительность дыхательных путей, характеризуются высоким уровнем пероксида, что и приводит к снижению активности данного типа ингибиторов.

Остановимся теперь вкратце на некоторых новых подходах в поиске ингибиторов синтеза лейкотриенов и развития воспалительных процессов вообще, Наиболее популярным направлением в этой области стало стремление одновременно блокировать активность как циклооксигеназ (СОХ), так и 5-LO. Среди подобных соединений следует отметить ML-3000, ингибирующее 5-LO в гранулоцитах быка и человека с IC50 0.18 и 0.23 мкМ, соответственно [138].

Интересный подход представляет подавление 5-LO ацетил-11-кето-босвелловой кислотой, АКВА, изомером природной босвелловой кислоты. Она воздействует непосредственно на 5-LO, но в сайте, отличном от каталитического центра, связывающего АА. АКВА ингибирует активность 5-LO в интактных PMNL человека и в клеточном гомогенате с IC501.5 и 7 мкМ, соответственно, не оказывая воздействия на циклооксигеназу или другие липоксигеназы [139].

Итак, завершая рассмотрение биологической роли и функций 5-LO и продуктов ее активности, отметим, что данные, полученные из самых разных источников и в самых разнообразных условиях, ясно показывают глубокую вовлеченность 5-LO и лейкотриенов в развитие и патогенез воспалительных процессов в организме. Хотя антилейкотриеновая терапия достигла на сегодняшний день некоторых успехов в лечении астмы, другие заболевания, имеющие воспалительную природу, еще очень плохо поддаются лечению. Для 5-LO и FLAP было разработано множество ингибиторов, разнообразных по механизму действия и многообещающих in vitro, но оказавшихся неэффективными in vivo. Тем не менее, богатый опыт, накопленный за прошедшее время, позволяет надеяться на успешное решение этой непростой медико-биологической задачи.

II.2. СУЛЬФАТ ХОЛЕСТЕРИНА: БИОСИНТЕЗ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

В данной работе мы обнаружили действие сульфата (СХ) и других анионных производных холестерина на активность 5-LO, синтез лейкотриенов и внутриклеточную локализацтю 5-LO и cPLA2. Учитывая, что СХ является природным соединением, в данном разделе необходимо уделить внимание месту этого вещества в организме и клетке, его роли и путям его метаболизма.

Отметим, что сульфатирование биологических молекул является метаболическим путем большой значимости. Соединения, содержащие в своем составе сульфатную группу встречаются как среди макромолекул (гликозаминогликаны, секреторные и мембранные белки), так и среди малых внутриклеточных молекул, участников сигнальных каскадов, нейротрансмиттеров и гормонов [140]. Важнейшую роль играет сульфатирование в метаболизме лекарственных средств и ксенобиотиков. Все эти соединения участвуют во множестве таких процессов как взаимодействие с белками экстраклеточного матрикса, адгезионными рецепторами, функционирование систем свертывания крови, ионный транспорт и многих других [141]. Особую роль сульфатирование играет в биотрансформации низкомолекулярных внутриклеточных соединений, в том числе катехоламинов, иодотиронинов, витамина С. Точно также, с помощью сульфатирования осуществляется модификация кислот желчи, витамина D, стероидов и, наконец, холестерина и его производных. На нем и остановимся подробнее. Хотя сульфатирование стероидов было открыто еще в конце 1930-х годов, первое сообщение о сульфатной трансформации предшественника всех стероидов холестерина, появилось гораздо позднее - только в 1964 году [142]. Тогда впервые удалось выделить сульфат холестерина из биологических объектов: адренальных гланд быка, а затем из различных органов и тканей человека.

За обнаружением сульфата холестерина последовали попытки определить его биологические пути. Изначально СХ вызывал интерес как субстрат для синтеза сульфатированных стероидов. Только с течением времени СХ стал привлекать внимание как важное само по себе вещество. Особый интерес вызвало открытие, что СХ является регуляторной молекулой. Одной из наиболее изученных на настоящий момент функций СХ является его участие в дифференцировке кератиноцитов и развитии эпидермального барьера.

Теперь, прежде чем обратиться к рассмотрению метаболических путей и биологических функций СХ, необходимо понять, где и в каких количествах он распределен в организме.

II.2.1. СХ в плазме крови

При первом выделении из плазмы крови человека в 1965 году концентрация СХ была определена как 300 мкг/ЮОмл [142]. В более поздних экспериментах, использовавших большое число здоровых доноров, содержание СХ варьировало от 118 до 322 мкг/мл у мужчин и от 117 до 253 мкг/мл у женщин [143-146].

В плазме СХ локализован в основном в липопротенинах низкой плотности (ЛПНП), причем его количество может значительно возрастать при определенных патологиях, таких как цирроз печени, гиперхолестеринемия, гипотироидизм. При рецессивном Х-связанном ихтиозисе содержание СХ в клетках кожи может возрастать более чем на порядок величины [146, 147]. Повышение плазматической концентрации СХ сопровождается ростом его концентрации и в стратум корнеум эпидермиса. Интересно, что эти изменения носят весьма специфический характер. Так, например, содержание второго наиболее распространенного сульфатированного стероида, сульфата дегидроэпиандростерона (DHEAS), в этих условиях не изменяется [146, 147]. Вообще, исследования показывают, что метаболические пути этих веществ весьма сильно различаются [147]. Существенным различием между ними является и то, что содержание DHEAS в организме с возрастом сокращается, в то время как уровень СХ, похоже, не зависит от возраста [143].

Наконец, надо отметить, что концентрация СХ в плазме резко увеличивается во время беременности, однако причины и биологический смысл такого явления только исследуются

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Александров, Дмитрий Андреевич

выводы

1. Анионные производные холестерина ингибируют синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека и других клетках. Показана роль отрицательного заряда боковых эфирных групп эфиров холестерина в подавлении синтеза лейкотриенов.

2. Анионные производные холестерина ингибируют синтез лейкотриенов в клетке на уровне субстратной доступности, затрудняя высвобождение АА из состава липидов мембран, и препятствуют активации 5-ЬО путем ингибирования ее транслокации к ядерной мембране клетки.

3. Установлено, что анионные производные холестерина являются прямыми ингибиторами 5-ЬО. На примере ФХ показан неконкурентный механизм ингибирования 5-ЬО и определена К; = 110 мкМ.

4. Обнаружено, что СХ способен регулировать экспрессию 5-ЬО в клетках ММ6. Предложена модель, согласно которой регуляции может осуществляться на уровне транскрипции при участии ретиноидных ядерных рецепторов 1Ю11а1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Александров, Дмитрий Андреевич, 2006 год

1. Borgeat, P., M. Hamberg, and B. Samuelsson, Transformation of arachidonic acid and homo-gamma-linolenic acid by rabbit polymorphonuclear leukocytes. Monohydroxy acids from novel lipoxygenases. J Biol Chem, 1976. 251(24): p. 781620.

2. Borgeat, P. and B. Samuelsson, Arachidonic acid metabolism in polymorphonuclear leukocytes: effects of ionophore A23187. Proc Natl Acad Sci USA, 1979. 76(5): p. 2148-52.

3. Samuelsson, B., Leukotrienes: mediators of immediate hypersensitivity reactions and inflammation. Science. 1983. 6(220) p.568-75.

4. Shimizu, T., 0. Radmark, and B. Samuelsson, Enzyme with dual lipoxygenase activities catalyzes leukotriene A4 synthesis from arachidonic acid. Proc Natl Acad Sci US A, 1984. 81(3): p. 689-93.

5. Rouzer, C.A., T. Matsumoto, and B. Samuelsson, Single protein from human leukocytes possesses 5-lipoxygenase and leukotriene A4 synthase activities. Proc Natl Acad Sci USA, 1986. 83(4): p. 857-861.

6. Corey E.J., Chemical studies on slow reacting substances/leukotrienes. Experientia. 1982. 38(11) p. 1259-75.

7. Shimizu, T., et al., Characterization of leukotriene A4 synthase from murine mast cells: evidence for its identity to arachidonate 5-lipoxygenase. Proc Natl Acad Sci U S A, 1986. 83(12): p. 4175-9.

8. Hammarberg, T., et al., EPR investigation of the active site of recombinant human 5-lipoxygenase: inhibition by selenide. Biochemistry, 2001. 40(21): p. 6371-8.

9. Aharony, D., et al., Kinetic studies on the inactivation of 5-lipoxygenase by 5(S)~ hydroperoxyeicosatetraenoic acid. Prostaglandins, 1987. 33(1): p. 85-100.

10. Riendeau, D., et al., Pseudoperoxidase activity of 5-lipoxygenase stimulated by potent benzofuranol and N-hydroxyurea inhibitors of the lipoxygenase reaction. Biochem J, 1991. 274 (Pt 1): p. 287-92.

11. Rouzer, C.A., et al., Inhibition of human leukocyte 5-lipoxygenase by a 4-hydroxybenzofuran, L-656,224. Evidence for enzyme reduction and inhibitor degradation. Biochem Pharmacol, 1991. 41(9): p. 1365-73.

12. Falgueyret, J.P., et al., N-(4-chlorophenyl)-N-hydroxy-N'-(3-chlorophenyl)urea, a general reducing agent for 5-, 12-, and 15-lipoxygenases and a substrate for their pseudoperoxidase activities. Biochem Cell Biol, 1992. 70(3-4): p. 228-36.

13. Funk, C.D., The molecular biology of mammalian lipoxygenases and the quest for eicosanoidfunctions using lipoxygenase-deficient mice. Biochim Biophys Acta, 1996. 1304(1): p. 65-84.

14. Radmark, O.P., The molecular biology and regulation of 5-lipoxygenase. Am J Respir Crit Care Med, 2000.161(2 Pt 2): p. SI 1-5.

15. In, K.H., et al., Naturally occurring mutations in the human 5-lipoxygenase gene promoter that modify transcription factor binding and reporter gene transcription. J Clin Invest, 1997. 99(5): p. 1130-7.

16. Silverman, E.S., et al, Egr-1 and Spl interact functionally with the 5-lipoxygenase promoter and its naturally occurring mutants. Am J Respir Cell Mol Biol, 1998. 19(2): p. 316-23.

17. Steinhilber, D., et al., The nuclear receptor for melatonin represses 5-lipoxygenase gene expression in human В lymphocytes. J Biol Chem, 1995. 270(13): p. 7037-40.

18. Janssen-Timmen, U., et al., Expression of 5-lipoxygenase in differentiating human skin keratinocytes. ProcNatl Acad Sci USA, 1995. 92(15): p. 6966-70.

19. Spanbroek, R., et al., 5-Lipoxygenase expression in Langerhans cells of normal human epidermis. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(2): p. 663-8.

20. Lammers, C.H., et al., Arachidonate 5-lipoxygenase and its activating protein: prominent hippocampal expression and role in somatostatin signaling. J Neurochem, 1996. 66(1): p. 147-52.

21. Spanbroek, R., et al., 5-lipoxygenase expression in dendritic cells generated from CD34(-Jr) hematopoietic progenitors and in lymphoid organs. Blood, 2000. 96(12): p. 3857-65.

22. Bach, M.K. and J.R. Brashler, In vivo and in vitro production of a slow reacting substance in the rat upon treatment with calcium ionophores. J Immunol, 1974. 113(6): p. 2040-4.

23. Noguchi, M., et al., Human 5-lipoxygenase associates with phosphatidylcholine liposomes and modulates LTA4 synthetase activity. Biochim Biophys Acta, 1994. 1215(3): p. 300-6.

24. Percival, M.D., et al., Investigation of the mechanism of non-turnover-dependent inactivation of purified human 5-lipoxygenase. Inactivation by H202 and inhibition by metal ions. Eur J Biochem, 1992. 210(1): p. 109-17.

25. Puustinen, T., M.M. Scheffer, and B. Samuelsson, Regulation of the human leukocyte 5-lipoxygenase: stimulation by micromolar Ca2+ levels and phosphatidylcholine vesicles. Biochim Biophys Acta, 1988. 960(3): p. 261-7.

26. Schatz-Munding, M., A. Hatzelmann, and V. Ullrich, The involvement of extracellular calcium in the formation of 5-lipoxygenase metabolites by human polymorphonuclear leukocytes. Eur J Biochem, 1991.197(2): p. 487-93.

27. Hammarberg, T. and O. Radmark, 5-lipoxygenase binds calcium. Biochemistry, 1999. 38(14): p. 4441-7.

28. Rouzer, C.A. and B. Samuelsson, Reversible, calcium-dependent membrane association of human leukocyte 5-lipoxygenase. Proc Natl Acad Sci USA, 1987. 84(21): p. 7393-7.

29. Wong, A., et al., Interactions of 5-lipoxygenase with membranes: studies on the association of soluble enzyme with membranes and alterations in enzyme activity. Biochemistry, 1988. 27(18): p. 6763-9.

30. Rouzer, C.A. and S. Kargman, Translocation of 5-lipoxygenase to the membrane in human leukocytes challenged with ionophore A23187. J Biol Chem, 1988. 263(22): p. 10980-8.

31. Clark, J.D., et al., A novel arachidonic acid-selective cytosolic PLA2 contains a Ca(2+)-dependent translocation domain with homology to PKC and GAP. Cell, 1991. 65(6): p. 1043-51.

32. Hammarberg, T., et al., The N-terminal domain of 5-lipoxygenase binds calcium and mediates calcium stimulation of enzyme activity. J Biol Chem, 2000. 275(49): p. 38787-93.

33. Chen, X.S. and C.D. Funk, The N-terminal "beta-barrel" domain of 5-lipoxygenase is essential for nuclear membrane translocation. J Biol Chem, 2001. 276(1): p. 811-8.

34. Aharony, D. and R.L. Stein, Kinetic mechanism of guinea pig neutrophil 5-lipoxygenase. J Biol Chem, 1986. 261(25): p. 11512-9.

35. Skorey, K.I. and M.J. Gresser, Calcium is not requiredfor 5-lipoxygenase activity at high phosphatidyl choline vesicle concentrations. Biochemistry, 1998. 37(22): p. 8027-34.

36. Reddy, K.V., T. Hammarberg, and O. Radmark, Mg2+ activates 5-lipoxygenase in vitro: dependency on concentrations of phosphatidylcholine and arachidonic acid. Biochemistry, 2000.39(7): p. 1840-8.

37. Ochi, K., et al., Arachidonate 5-lipoxygenase of guinea pig peritoneal polymorphonuclear leukocytes. Activation by adenosine 5'-triphosphate. J Biol Chem, 1983. 258(9): p. 5754-8.

38. Noguchi, M., M. Miyano, and T. Matsumoto, Physiochemical characterization of ATP binding to human 5-lipoxygenase. Lipids, 1996. 31(4): p. 367-71.

39. Falgueyret, J.P., et al., Characterization of the arachidonate and ATP binding sites of human 5-lipoxygenase usingphotoaffinity labeling and enzyme immobilization. Biochemistry, 1995.34(41): p. 13603-11.

40. Ueda, N., et al., Purification of arachidonate 5-lipoxygenase from porcine leukocytes and its reactivity with hydroperoxyeicosatetraenoic acids. J Biol Chem, 1986. 261(17): p. 7982-8.

41. Wiseman, J.S., Alpha-secondary isotope effects in the lipoxygenase reaction. Biochemistry, 1989. 28(5): p. 2106-11.

42. Denis, D., et al., Characterization of the activity ofpurified recombinant human 5-lipoxygenase in the absence and presence of leukocyte factors. J Biol Chem, 1991. 266(8): p. 5072-9.

43. Furukawa, M., et al., Studies on arachidonate 5-lipoxygenase of rat basophilic leukemia cells. Biochim Biophys Acta, 1984. 795(3): p. 458-65.

44. Zhang, Y.Y., et al., Analysis of a nucleotide-binding site of 5-lipoxygenase by affinity labelling: binding characteristics and amino acid sequences. Biochem J, 2000. 351 Pt 3: p. 697-707.

45. Rouzer, C.A. and B. Samuelsson, On the nature of the 5-lipoxygenase reaction in human leukocytes: enzyme purification and requirement for multiple stimulatory factors. Proc Natl Acad Sci USA, 1985. 82(18): p. 6040-4.

46. Rouzer, C.A., T. Shimizu, and B. Samuelsson, On the nature of the 5-lipoxygenase reaction in human leukocytes: characterization of a membrane-associated stimulatory factor. Proc Natl Acad Sci USA, 1985. 82(22): p. 7505-9.

47. Riendeau, D., et al., Interfacial catalysis and production of a high ratio of leukotriene A4 to 5-HPETE by 5-lipoxygenase in a coupled assay with phospholipase A2. J Lipid Médiat, 1993. 6(1-3): p. 23-30.

48. Noguehi, M., et al., Interfacial kinetic reaction of human 5-lipoxygenase. Eur J Biochem, 1994. 222(2): p. 285-92.

49. Rouzer, C.A. and B. Samuelsson, The importance of hydroperoxide activation for the detection and assay of mammalian 5-lipoxygenase. FEBS Lett, 1986. 204(2): p. 293-6.

50. Riendeau, D., et al., Stimulation of 5-lipoxygenase activity under conditions which promote lipid peroxidation. Biochem J, 1989. 263(2): p. 565-72.

51. Zhang, Y.Y., et al., Stabilization of purified human 5-lipoxygenase with glutathione peroxidase and superoxide dismutase. Anal Biochem, 1994. 220(1): p. 28-35.

52. Miller, D.K., et al., Identification and isolation of a membrane protein necessary for leukotriene production. Nature, 1990. 343(6255): p. 278-81.

53. Dixon, R.A., et al., Requirement of a 5-lipoxygenase-activating protein for leukotriene synthesis. Nature, 1990. 343(6255): p. 282-4.

54. Lam, B.K., et al., Expression cloning of a cDNA for human leukotriene C4 synthase, an integral membrane protein conjugating reduced glutathione to leukotriene A4. Proc Natl Acad Sci USA, 1994. 91(16): p. 7663-7.

55. Steinhilber, D., 5-Lipoxygenase: enzyme expression and regulation of activity. Pharm Acta Helv, 1994. 69(1): p. 3-14.

56. Vickers, P.J., 5-Lipoxygenase-activatingprotein (FLAP). J Lipid Mediat Cell Signal, 1995.12(2-3): p. 185-94.

57. Pouliot, M., et al., Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor stimulates the expression of the 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) in human neutrophils. J Exp Med, 1994.179(4): p. 1225-32.

58. Riddick, C.A., et al., Dexamethasone increases expression of 5-lipoxygenase and its activating protein in human monocytes and THP-1 cells. Eur J Biochem, 1997. 246(1): p. 112-8.

59. Ring, W.L., et al., Lymphocytes stimulate expression of 5-lipoxygenase and its activating protein in monocytes in vitro via granulocyte macrophage colony-stimulating factor and interleukin 3. J Clin Invest, 1996. 97(5): p. 1293-301.

60. Claesson, H.E., et al., Expression of 5-lipoxygenase and biosynthesis ofleukotriene B4 in human monomorphonuclear leukocytes. J Lipid Mediat, 1993. 6(1-3): p. 15-22.

61. Kargman, S., et al., Leukotriene synthesis in U937 cells expressing recombinant 5-lipoxygenase. J Lipid Mediat, 1993. 7(1): p. 31-45.

62. Cowburn, A.S., S.T. Holgate, and A.P. Sampson, IL-5 increases expression of 5-lipoxygenase-activatingprotein and translocates 5-lipoxygenase to the nucleus in human blood eosinophils. J Immunol, 1999.163(1): p. 456-65.

63. Byrum, R.S., et al., Role of the 5-lipoxygenase-activating protein (FLAP) in murine acute inflammatory responses. J Exp Med, 1997.185(6): p. 1065-75.

64. Rouzer, C.A., et al, MK886, a potent and specific leukotriene biosynthesis inhibitor blocks and reverses the membrane association of 5-lipoxygenase in ionophore-challenged leukocytes. J Biol Chem, 1990. 265(3): p. 1436-42.

65. Abramovitz, M., et al., 5-lipoxygenase-activatingprotein stimulates the utilization of arachidonic acid by 5-lipoxygenase. Eur J Biochem, 1993. 215(1): p. 105-11.

66. Steinhilber, D., et al., Serum factors regulate 5-lipoxygenase activity in maturating HL60 cells. Biochim Biophys Acta, 1993.1178(1): p. 1-8.

67. Jakobsson, P.J., et al., Studies on the regulation and localization of 5-lipoxygenase in human B-lymphocytes. Eur J Biochem, 1995. 232(1): p. 37-46.

68. Mancini, J. A., et al., 5-lipoxygenase-activating protein is an arachidonate binding protein. FEBS Lett, 1993. 318(3): p. 277-81.

69. Channon, J.Y. and C.C. Leslie, A calcium-dependent mechanism for associating a soluble arachidonoyl-hydrolyzingphospholipase A2 with membrane in the macrophage cell line RAW 264.7. J Biol Chem, 1990. 265(10): p. 5409-13.

70. Wong, A., et al., Stimulation of leukotriene production and membrane translocation of 5-lipoxygenase by cross-linking of the IgE receptors in RBL-2H3 cells. Biochemistry, 1992. 31(16): p. 4046-53.

71. Kargman, S., P.J. Vickers, and J.F. Evans, A23187-induced translocation of 5-lipoxygenase in osteosarcoma cells. J Cell Biol, 1992.119(6): p. 1701-9.

72. Coffey, M., et al., Membrane association of active 5-lipoxygenase in resting cells. Evidence for novel regulation of the enzyme in the rat alveolar macrophage. J Biol Chem, 1992.267(1): p. 570-6.

73. Woods, J.W., et al., 5-Lipoxygenase is located in the euchromatin of the nucleus in resting human alveolar macrophages and translocates to the nuclear envelope upon cell activation. J Clin Invest, 1995. 95(5): p. 2035-46.

74. Brock, T.G., R.W. McNish, and M. Peters-Golden, Capacity for repeatable leukotriene generation after transient stimulation of mast cells and macrophages. Biochem J, 1998. 329 (Pt 3): p. 519-25.

75. Peters-Golden, M. and R.W. McNish, Redistribution of 5-lipoxygenase and cytosolic phospholipase A2 to the nuclear fraction upon macrophage activation. Biochem BiophysRes Commun, 1993.196(1): p. 147-53.

76. Woods, J. W., et al., 5-lipoxygenase and 5-lipoxygenase-activatingprotein are localized in the nuclear envelope of activated human leukocytes. J Exp Med, 1993. 178(6): p. 1935-46.

77. Pouliot, M., et al., Colocalization of cytosolic phospholipase A2, 5-lipoxygenase, and 5-lipoxygenase-activating protein at the nuclear membrane ofA23187-stimulated human neutrophils. Eur J Biochem, 1996. 238(1): p. 250-8.

78. Werz, 0., et al., Phorbol ester up-regulates capacities for nuclear translocation and phosphorylation of 5-lipoxygenase in Mono Mac 6 cells and human polymorphonuclear leukocytes. Blood, 2001. 97(8): p. 2487-95.

79. Brock, T.G., R. Paine, 3rd, and M. Peters-Golden, Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem, 1994. 269(35): p. 22059-66.

80. Chen, X.S., Y.Y. Zhang, and C.D. Funk, Determinants of 5-lipoxygenase nuclear localization using green fluorescent protein/5-lipoxygenase fusion proteins. J Biol Chem, 1998. 273(47): p. 31237-44.

81. Healy, A.M., et al, Identification of a bipartite nuclear localization sequence necessary for nuclear import of 5-lipoxygenase. J Biol Chem, 1999. 274(42): p. 29812-8.

82. Brock, T.G., R.W. McNish, and M. Peters-Golden, Translocation and leukotriene synthetic capacity of nuclear 5-lipoxygenase in rat basophilic leukemia cells and alveolar macrophages. J Biol Chem, 1995. 270(37): p. 21652-8.

83. Brock, T.G., et al., Rapid import of cytosolic 5-lipoxygenase into the nucleus of neutrophils after in vivo recruitment and in vitro adherence. J Biol Chem, 1997. 272(13): p. 8276-80.

84. Covin, R.B., et al., Altered expression and localization of 5-lipoxygenase accompany macrophage differentiation in the lung. Am J Physiol, 1998. 275(2 Pt 1): p. L303-10.

85. Peters-Golden, M., et al., Alterations in the pattern of arachidonate metabolism accompany rat macrophage differentiation in the lung. J Immunol, 1990.144(1): p. 263-70.

86. Brock, T.G., et al., Decreased leukotriene C4 synthesis accompanies adherence-dependent nuclear import of 5-lipoxygenase in human blood eosinophils. J Immunol, 1999.162(3): p. 1669-76.

87. Pande A.H., Q.S., Tatulian S.A., Membrane Fluidity Is a Key Modulator of Membrane Binding, Insertion,and Activity of 5-Lipoxygenase. Biophysical Journal, 2005. 88: p. 4084-4094.

88. Pande A.H., M.D., Nemec K.N., Qin S., Tan S., Tatulian S.A., Modulation of human 5-lipoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry, 2004. 43: p. 14653-14666.

89. Brock, T.G., McNish, W., Peters-Golden, M., Translocation and Leukotriene Synthetic Capacity of

90. Nuclear 5-Lipoxygenase in Rat Basophilic Leukemia

91. Cells and Alveolar Macrophages. J Biol Chem, 1995. 270(27): p. 21652-21658.

92. Luo, M., Jones, M.S., Peters-Golden, M., Brock, T.G., synthetic capacity 4 Nuclear localization of 5-lipoxygenase as a determinant ofleukotriene B. PNAS, 2003.100: p. 12165-12170.

93. Woods, J.W., Coffey, M.J., Brock, T.G., Singer, I., Petes-Golden, M., 5-Lipoxygenase Is Located in the Euchromatin ofthe Nucleus in Resting HumanAlveolar Macrophages and Translocates to the Nuclear Envelope. J Clin Invest, 1995. 95: p. 2035-2046.

94. Lepley, R.A. and F.A. Fitzpatrick, 5-Lipoxygenase compartmentalization in granulocytic cells is modulated by an internal bipartite nuclear localizing sequence and nuclear factor kappa B complex formation. Arch Biochem Biophys, 1998. 356(1): p. 71-6.

95. Lepley, R.A., D.T. Muskardin, and F.A. Fitzpatrick, Tyrosine kinase activity modulates catalysis and translocation of cellular 5-lipoxygenase. J Biol Chem, 1996. 271(11): p. 6179-84.

96. Lepley, R.A. and F.A. Fitzpatrick, Inhibition of mitogen-activatedprotein kinase kinase blocks activation and redistribution of 5-lipoxygenase in HL-60 cells. Arch Biochem Biophys, 1996. 331(1): p. 141-4.

97. Surette, M.E., et al., Mechanisms of the priming effect oflipopolysaccharides on the biosynthesis ofleukotriene B4 in chemotactic peptide-stimulated human neutrophils. Faseb J, 1998.12(14): p. 1521-31.

98. Leslie, C.C., Properties and regulation of cytosolic phospholipase A2. J Biol Chem, 1997. 272(27): p. 16709-12.

99. Uozumi, N., et al, Role of cytosolic phospholipase A2 in allergic response and parturition. Nature, 1997. 390(6660): p. 618-22.

100. Qiu, Z.H., et al., The role of calcium and phosphorylation of cytosolic phospholipase A2 in regulating arachidonic acid release in macrophages. J Biol Chem, 1998. 273(14): p. 8203-11.

101. DiPersio, J.F., et al, Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and other cytokines prime human neutrophils for enhanced arachidonic acid release and leukotriene B4 synthesis. J Immunol, 1988.140(12): p. 4315-22.

102. Palmantier, R., et al., Priming for the synthesis of 5-lipoxygenase products in human blood ex vivo by human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and tumor necrosis factor-alpha. Lab Invest, 1994. 70(5): p. 696-704.

103. Schatz-Munding, M. and V. Ullrich, Priming of human polymorphonuclear leukocytes with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor involves protein kinase C rather than enhanced calcium mobilisation. Eur J Biochem, 1992. 204(2): p. 705-12.

104. Peters-Golden, M., et al., Basal activation of protein kinase C in rat alveolar macrophages: implications for arachidonate metabolism. Am J Physiol, 1991. 261(6 Pt 1): p. L462-71.

105. Bauldry, S.A., R.L. Wykle, and D.A. Bass, Phospholipase A2 activation in human neutrophils. Differential actions of diacylglycerols and alkylacylglycerols in priming cells for stimulation by N-formyl-Met-Leu-Phe. JBiol Chem, 1988. 263(32): p. 1678795.

106. Shamsuddin, M., W. Hsueh, and L.J. Smith, Production ofleukotrienes and thromboxane by resident and activated rat alveolar macrophages: a possible role of protein kinase C. J Lab Clin Med, 1992.120(3): p. 434-43.

107. Werz, 0., et al., 5-lipoxygenase isphosphorylated by p38 kinase-dependent MAPKAP kinases. Proc Natl Acad Sci USA, 2000. 97(10): p. 5261-6.

108. Rouse, J., et al., A novel kinase cascade triggered by stress and heat shock that stimulates MAPKAP kinase-2 and phosphorylation of the small heat shock proteins. Cell, 1994. 78(6): p. 1027-37.

109. Eom, Y.W., et al., Rac andp38 kinase mediate 5-lipoxygenase translocation and cell death. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 284(1): p. 126-32.

110. Werz, 0., et al., p38 MAP kinase mediates stress-induced leukotriene synthesis in a human B-lymphocyte cell line. J Leukoc Biol, 2001. 70(5): p. 830-8.

111. Werz, 0., D. Szellas, and D. Steinhilber, Reactive oxygen species released from granulocytes stimulate 5-lipoxygenase activity in a B-lymphocytic cell line. Eur J Biochem, 2000. 267(5): p. 1263-9.

112. Weitzel, F. and A. Wendel, Selenoenzymes regulate the activity of leukocyte 5-lipoxygenase via the peroxide tone. J Biol Chem, 1993. 268(9): p. 6288-92.

113. Straif, D., et al., Glutathione peroxidase-1 but not -4 is involved in the regulation of cellular 5-lipoxygenase activity in monocytic cells. Biochem J, 2000. 349(Pt 2): p. 455-61.

114. Flamand, N., et al., Adenosine, a potent natural suppressor of arachidonic acid release and leukotriene biosynthesis in human neutrophils. Am J Respir Crit Care Med, 2000.161(2 Pt 2): p. S88-94.

115. Coffey, M.J., S.M. Phare, and M. Peters-Golden, Prolonged exposure to lipopolysaccharide inhibits macrophage 5-lipoxygenase metabolism via induction of nitric oxide synthesis. J Immunol, 2000.165(7): p. 3592-8.

116. Profita, M., Sala, A., Siena, L., Henson, P.M., Murphy R.C., Paterno, A., Bonanno, A., Rioccobono, L., and A. Mirabella, Bonsignore,G., Vignola, A.M., Leukotriene B4 Production in Human Mononuclear Phagocytes

117. Modulated by Interleukin-4-Induced 15-Lipoxygenase. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2002. 300(3): p. 868-875.

118. Lepley, R.A. and F.A. Fitzpatrick, 5-Lipoxygenase contains a functional Src homology 3-binding motif that interacts with the Src homology 3 domain of Grb2 and cytoskeletalproteins. J Biol Chem, 1994. 269(39): p. 24163-8.

119. Devchand, P.R., et al., The PPARalpha-leukotriene B4pathway to inflammation control. Nature, 1996. 384(6604): p. 39-43.

120. Claesson, H.E. and S.E. Dahlen, Asthma and leukotrienes: antileukotrienes as novel anti-asthmatic drugs. J Intern Med, 1999. 245(3): p. 205-27.

121. Ланкин B.3., T.A.K., Беленков Ю.Н. Кардиология, 2000. 40(7): p. 48-61.

122. Garcia Garcia, M.L., et al., Montelukast, compared with fluticasone, for control of asthma among 6- to 14-year-old patients with mild asthma: the MOSAIC study. Pediatrics, 2005.116(2): p. 360-9.

123. Gillard, J., et al., L-663,536 (MK-886) (3-l-(4-chlorobenzyl)-3-t-butyl-thio-5-isopropylindol-2-yl.-2,2 dimethylpropanoic acid), a novel, orally active leukotriene biosynthesis inhibitor. Can J Physiol Pharmacol, 1989. 67(5): p. 456-64.

124. Depre, M., et al., Pharmacokinetics and pharmacodynamics of multiple oral doses of MK-0591, a 5-lipoxygenase-activatingprotein inhibitor. Clin Pharmacol Ther, 1994. 56(1): p. 22-30.

125. Fruchtmann, R., et al., In vitro pharmacology of BAY XI005, a new inhibitor of leukotriene synthesis. Agents Actions, 1993. 38(3-4): p. 188-95.

126. Werz, O., et al., A test system for leukotriene synthesis inhibitors based on the in-vitro differentiation of the human leukemic cell lines HL-60 and Mono Mac 6. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1997. 356(4): p. 441-5.

127. Ford-Hutchinson, A.W., M. Gresser, and R.N. Young, 5-Lipoxygenase. Annu Rev Biochem, 1994. 63: p. 383-417.

128. Carter, G.W., et al., 5-lipoxygenase inhibitory activity of zileuton. J Pharmacol Exp Ther, 1991.256(3): p. 929-37.

129. Crawley, G.C., et al., Methoxytetrahydropyrans. A new series of selective and orally potent 5-lipoxygenase inhibitors. J Med Chem, 1992. 35(14): p. 2600-9.

130. Ducharme, Y., et al., Naphthalenic lignan lactones as selective, nonredox 5-lipoxygenase inhibitors. Synthesis and biological activity of (methoxyalkyl)thiazole and methoxytetrahydropyran hybrids. J Med Chem, 1994. 37(4): p. 512-8.

131. Smith, W.G., et al., Characterization of 5-lipoxygenase inhibitors in biochemical and functional in vivo assays. J Pharmacol Exp Ther, 1995. 275(3): p. 1332-8.

132. Laufer, S., et al., Pharmacological profile of a new pyrrolizine derivative inhibiting the enzymes cyclo-oxygenase and 5-lipoxygenase. Arzneimittelforschung, 1994. 44(5): p. 629-36.

133. Safayhi, H., et al., Boswellic acids: novel, specific, nonredox inhibitors of 5-lipoxygenase. J Pharmacol Exp Ther, 1992. 261(3): p. 1143-6.

134. Strott, C.A., Sulfonation and molecular action. Endocr Rev, 2002. 23(5): p. 703-32.

135. Vos, J.P., M. Lopes-Cardozo, and B.M. Gadella, Metabolic and functional aspects of sulfogalactolipids. Biochim Biophys Acta, 1994.1211(2): p. 125-49.

136. Drayer, N.M. and S. Lieberman, Isolation of Cholesterol Sulfate from Human Blood and Gallstones. Biochem Biophys Res Commun, 1965.18: p. 126-30.

137. Muskiet, F.A., et al., Gas-chromatographic determination of cholesterol sulfate in plasma and erythrocytes, for the diagnosis of recessive X-linked ichthyosis. Clin Chem, 1983. 29(7): p. 1404-7.

138. Serizawa, S., T. Nagai, and Y. Sato, Simplified method of determination of serum cholesterol sulfate by reverse phase thin-layer chromatography. J Invest Dermatol, 1987. 89(6): p. 580-7.

139. Tamasawa, N., A. Tamasawa, and K. Takebe, Higher levels of plasma cholesterol sulfate in patients with liver cirrhosis and hypercholesterolemia. Lipids, 1993. 28(9): p. 833-6.

140. Serizawa, S., et al, Simplified determination of serum cholesterol sulfate by gas-liquid chromatography combined with cyclohexylsilane-bondedphase column purification. Arch Dermatol Res, 1989.281(6): p. 411-6.

141. Bergner, E.A. and L.J. Shapiro, Increased cholesterol sulfate in plasma and red blood cell membranes of steroid sulfatase deficient patients. J Clin Endocrinol Metab, 1981. 53(1): p. 221-3.

142. Blache, D., M. Becchi, and J. Davignon, Occurrence and biological effects of cholesteryl sulfate on blood platelets. Biochim Biophys Acta, 1995.1259(3): p. 291-6.

143. Bleau, G., et al., Cholesterol sulfate. I. Occurrence and possible biological function as an amphipathic lipid in the membrane of the human erythrocyte. Biochim Biophys Acta, 1974. 352(1): p. 1-9.

144. Moser, H.W., A.B. Moser, and J.C. Orr, Preliminary observations on the occurrence of cholesterol sulfate in man. Biochim Biophys Acta, 1966.116(1): p. 146-55.

145. Drayer, N.M. and S. Lieberman, Isolation of cholesterol sulfate from human aortas and adrenal tumors. J Clin Endocrinol Metab, 1967. 27(1): p. 136-9.

146. Elias, P.M., et al., Stratum corneum lipids in disorders of cornification. Steroid sulfatase and cholesterol sulfate in normal desquamation and the pathogenesis of recessive X-linked ichthyosis. J Clin Invest, 1984. 74(4): p. 1414-21.

147. Epstein, E.H., Jr., Williams, M.L., Elias. P.M.,, The epidermal cholesterol sulfate cycle. J. Am. Acad. Dermatol., 1984.10: p. 866-868.

148. Ponec, M. and M.L. Williams, Cholesterol sulfate uptake and outflux in cultured human keratinocytes. Arch Dermatol Res, 1986. 279(1): p. 32-6.

149. Serizawa, S., et al., Cholesterol sulphate levels in the hair and nails of patients with recessive X-linked ichthyosis. Clin Exp Dermatol, 1990.15(1): p. 13-5.

150. Gurpide, E., et al, Studies on the metabolism of blood-borne cholesterol sulfate. Biochemistry, 1966. 5(10): p. 3352-62.

151. Nagata, K. and Y. Yamazoe, Pharmacogenetics of sulfotransferase. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2000. 40: p. 159-76.

152. Javitt, N.B., et al., Cholesterol and hydroxycholesterol sulfotransferases: identification, distinction from dehydroepiandrosterone sulfotransferase, and differential tissue expression. Endocrinology, 2001.142(7): p. 2978-84.

153. Hochberg, R.B., S. Ladany, and S. Lieberman, Cholesterol sulfate: some aspects of its biosynthesis and uptake by tissues from blood. Endocrinology, 1974. 94(1): p. 207-13.

154. Jiang, Y.J., Kim, P., Elias, P.M., Feingold, K.R., LXR and PPAR activators stimulate cholesterol sulfotransferase type 2 isoform lb in numan keratinocytes. Journal of Lipid Research, 2005. 46: p. 2657-2666.

155. Parenti, G., G. Meroni, and A. Ballabio, The sulfatase gene family. Curr Opin Genet Dev, 1997. 7(3): p. 386-91.

156. Ballabio, A., Shapiro, L.J., Steroid sulfatase deficiency andX-linked ichtyosis. 1995. New York: p. 2999-3022.

157. Mason, J.I. and P.G. Hemsell, Cholesterol sulfate metabolism in human fetal adrenal mitochondria. Endocrinology, 1982.111(1): p. 208-13.

158. Tuckey, R.C., Side-chain cleavage of cholesterol sulfate by ovarian mitochondria. J Steroid Biochem Mol Biol, 1990. 37(1): p. 121-7.

159. Williams, M.L., M. Hughes-Fulford, and P.M. Elias, Inhibition of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase activity and sterol synthesis by cholesterol sulfate in cultured fibroblasts. Biochim Biophys Acta, 1985. 845(3): p. 349-57.

160. Nakagawa, M. and S. Kojima, Effect of cholesterol sulfate and sodium dodecyl sulfate on lecithin-cholesterol acyltransferase in human plasma. J Biochem (Tokyo), 1976. 80(4): p. 729-33.

161. Bleau, G., A. Chapdelaine, and K.D. Roberts, The assay of cholesterol sulfate in biological material by enzymatic radioisotopic displacement. Can J Biochem, 1972. 50(3): p. 277-86.

162. Cheetham, J. J., et al., Cholesterol sulfate inhibits the fusion of Sendai virus to biological and model membranes. J Biol Chem, 1990. 265(21): p. 12404-9.

163. Blache, D., Enhanced arachidonic acid and calcium metabolism in cholesteryl sulfate-enriched rat platelets. J Lipid Mediat Cell Signal, 1996.13(2): p. 127-38.

164. Shimada, T., et al., Activation of factor XII andprekallikrein with cholesterol sulfate. Thromb Res, 1985. 38(1): p. 21-31.

165. Denning, M.F., et al, Cholesterol sulfate activates multiple protein kinase C isoenzymes and induces granular cell differentiation in cultured murine keratinocytes. Cell Growth Differ, 1995. 6(12): p. 1619-26.

166. Kuroki, T., et al., Cholesterol sulfate, an activator of protein kinase C mediating squamous cell differentiation: a review. Mutat Res, 2000. 462(2-3): p. 189-95.

167. Okano, M., et al., Biochemical characterization of cholesterol-3-sulfate as the sole effector for the phosphorylation of HMGI by casein kinase I in vitro. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 281(5): p. 1325-30.

168. Iwamori, M., Y. Iwamori, and N. Ito, Regulation of the activities of thrombin and plasmin by cholesterol sulfate as a physiological inhibitor in human plasma. J Biochem (Tokyo), 1999.125(3): p. 594-601.

169. Woscholski, R., et al., Modulation of the substrate specificity of the mammalian phosphatidylinositol 3-kinase by cholesterol sulfate and sulfatide. Biochemistry, 1995. 34(36): p. 11489-93.

170. Iwamori, M., Y. Iwamori, and N. Ito, Sulfated lipids as inhibitors of pancreatic trypsin and chymotrypsin in epithelium of the mammalian digestive tract. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 237(2): p. 262-5.

171. Sato, J., et al., Cholesterol sulfate inhibits proteases that are involved in desquamation of stratum corneum. J Invest Dermatol, 1998.111(2): p. 189-93.

172. Ito, N., et al., Inhibition of pancreatic elastase by sulfated lipids in the intestinal mucosa. J Biochem (Tokyo), 1998.123(1): p. 107-14.

173. Iwamori, M., et al., Shedding of sulfated lipids into gastric fluid and inhibition of pancreatic DNase I by cholesterol sulfate in concert with bile acids. Biochim Biophys Acta, 2000.1487(2-3): p. 268-74.

174. Pande, A.H., Qin, S., Tatulian, S.A., Membrane fluidity is a key modulator of membrane binding, insertion, and activity of 5-lipoxygenase. Biophys. J., 2005. 88: p. 4084-4094.

175. Pande, A.H., Moe, D., Nemec, K.N., Qin, S., Tan, S., Tatulian, S.A., Modulation of human 5-lpoxygenase activity by membrane lipids. Biochemistry, 2004. 43: p. 1465314666.

176. Brown, W.H., Organic Chemistry. 1995. Fort Worth(Sounders College Publishing): p. 1006-1020.

177. Mehrabian, M., Allayee, H., 5-lipoxygenase and atherosclerosis. Curr. Opin. Lipidol., 2003.14: p. 447-457.

178. May, C., Hohne, M., Gnau, P., Schwennesen, K., Kindl, H., The N-terminal betabarrel structure of lipid body lipoxygenase mediates its binding to liposomes and lipid bodies. Eur J Biochem, 2000. 267: p. 1100-1109.

179. Kulkarni, S., Das, S., Funk, C.D., Murray, D., Cho, W., Molecular basis of the spicific subcellular localisation of the C2-like domain of 5-lipoxygenase. J Biol Chem, 2002. Ill-, p. 13167-13174.

180. Burket, E., Arnold, C., Hammarberg, T., Radmark, 0., Steinhilber, D., Werz, 0., The C2-like beta-barrel domain mediates the Ca2+ -dependent resistance of 5-lipoxygenase activity against inhibirion by glutatione. J Biol Chem, 2003. 278: p. 42846-42853.

181. Yau, W.M., Wimley, W.C., Gawrisch, K., White, S.H., The preference of tryptophan for membrane interactions. Biochemistry, 1998. 37: p. 14713-14718.

182. Peters-Golden, M., et al., Translocation of cytosolic phospholipase A2 to the nuclear envelope elicits topographically localized phospholipid hydrolysis. Biochem J, 1996. 318 (Pt 3): p. 797-803.

183. Boden, S.E., Schweizer, S., Bertsche T., Dufer, M., Drews, G., Safayhi, H., Stimulation ofleukotriene synthesis in intact polynorphonuclear cells by the 5-lipoxygenase inhibitior 3-oxo-tirucallic acid. Mol Pharmacol, 2001. 60: p. 267-273.

184. Tulenko, T.N., Constanyinescu, D., Kikuchi, T., Cox, R.H., Santamore, W.P., Mutual interaction of vasoconstriction and endothelial damages in stenoic arteries. Am. J. Physiol., 1989. 256: p. H881-H889.

185. McMullen, T.P., Wong, B.C., Tham, E.L., Lewis, R.N., McElhaney, R.N., Differential scanning calorimetric study of the interaction of cholesterol with the major lipids of the Acholeplasma laidlawii B membrane. Biochemistry, 1996. 35: p. 16789-16798.

186. Scherer, P.G., Seeling, J., Electric charge effects onphospholipd headgroupsA phosphatidylcholine in mixtures with cationic and anionic amphiphiles. Biochemistry, 1989.28: p. 7720-7728.

187. Van der Bergh, B.A., Wertz, P.W., Junginger, H.E., Bowstra, J.A., Elasticity of vesicles assessed by electron spin resonance, electron microscopy and extrusion measurements. Int. J. Pharm., 2001. 217: p. 13-24.

188. Flamand, N., Lefevre, J., Surette, M.E., Picard, S., Borfeat, P., Arachidonic acid regulates the translocation of 5-lipoxygenase to the nuclear membranes in human neutrophyls. J Biol Chem, 2005.

189. Kallen, J., et al., Crystal structure of the human RORalpha Ligand binding domain in complex with cholesterol sulfate at 2.2 A. J Biol Chem, 2004. 279(14): p. 14033-8.

190. Carlberg, C., Wiesenberg, I., The orphan receptor family RZR/ROR, melatonin and 5-lopixygenase: an unexpected relationship. J Pineal Res, 1995.18(4): p. 171-178.

191. Sundvold, H., Lien, S., Identification of a novel peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) gamma promoter in man and transactivation by the nuclear receptor RORalpha I. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 287(2): p. 383-390.

192. Yanai, H., Javitt, N.B., Higashi, Y., Fuda, H., Strott, C.A., Expression of cholesterol sulfotransferase (SULT2Blb) in human platelets. Circulation, 2004.109: p. 92-96.