Пептидная регуляция роста, микроокружения и ангиогенеза в экспериментальных опухолях у старых животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.53, кандидат биологических наук Барыкина, Ольга Павловна

• Барыкина, Ольга Павловна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Барыкина, Ольга Павловна

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Молекулярные иейроиммуноэндокриниые механизмы опухолевого роста.

Глава 2. Материал и методы исследования.

2.1. Изучение действия вилона на карциному легких Льюис у старых мышей.

2.2 Изучение действия вилона и эпиталона на саркому Му старых крыс.

2.3. Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 3. Пептидная регуляция роста, микроокружения и ангиогенеза в карциноме легких Лыоис у старых мышей.

3.1. Изучение кинетики роста карциномы легких Лыоис.

3.2. Светооптическое исследование карциномы легких Льюис и внутренних органов у старых мышей.

3.2.1. Животные - опухоленосители (контрольная группа).

3.2.2. Действие вилона на карциному легких Льюис у старых мышей

3.2.3. Действие циклофосфана на карциному легких Льюис у старых мышей.

3.2.4. Сочетанное действие вилона и циклофосфана на карциному легких Льюис у старых мышей.

Глава 4. Пептидная регуляция роста, микроокружения и ангиогенеза в саркоме М-1 у старых крыс.

4.1. Изучение кинетики роста саркомы М-1.

4.2. Светооптическое исследование саркомы М-1 у старых крыс.

4.2.1. Интактные животные.

4.2.2. Действие эпиталона на саркому М-1 у старых крыс.

4.2.3. Действие ионизирующей радиации.

4.2.4. Действие радиации и эпиталона.

4.2.5. Действие вилона на кинетику роста, ангиогенез и микроокружение саркомы М-1 у старых крыс.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Пептидная регуляция роста, микроокружения и ангиогенеза в экспериментальных опухолях у старых животных»

Актуальность работы

В связи с увеличением средней продолжительности жизни и доли пожилых людей в общей численности населения, особое внимание уделяется исследованиям механизмов развития возрастной патологии, в частности опухолей, и разработке новых геропротекторных препаратов.

Известно, что одной из важных особенностей злокачественных новообразований является их автономный рост, регулируемый локально продуцируемыми факторами [7,24]. К таким аутокринпым и паракринным регуляторам пролиферации опухолевых клеток относят «факторы микроокружения» опухолей, продуцируемые как самими опухолевыми клетками, так и клетками окружающей их стромы [30]. Продуцируемые эндотелиальными клетками, моноцитами, макрофагами, лимфоцитами и тучными клетками иитерлейкины, простагландины, регуляторные пептиды прямо или косвенно влияют на пролиферацию и индуцированную гибель опухолевых клеток.

Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о непосредственном участии клеток микроокружения опухолей в патогенезе злокачественного роста и их влиянии на чувствительность и ответ опухолевых клеток к той или ииой методике лечения [26, 159]. В процессе злокачественной трансформации клеток белковые продукты аберрантной экспрессии мутантных генов потенциально иммуногенны и могут служить в качестве антигенов отторжения. Однако, несмотря на то, что опухолевые клетки несут антигены, способные активировать цитотоксические Т-лимфоциты и вызывать образование антител, многие опухоли способны избегать механизмов иммунного надзора и не разрушаться факторами иммунной системы. Помимо множественных механизмов «ухода» от иммунных факторов, существуют механизмы защиты опухолевых клеток, основанные на индукции иммуносупрессии [171]. Расшифровка и молекулярный анализ механизмов, лежащих в основе ухода опухолей от иммунного надзора, приведет к развитию новых стратегий для предотвращения у онкологических больных Т-клеточной иммуносупрессии, развитию новых иммунотерапсвтических мероприятий, способных предотвращать прогрессию злокачественных новообразований и их развитие.

Одним из перспективных направлений терапевтических мероприятий в онкологии является применение биомодуляторов, повышающих иммунную защиту организма и усиливающих эффект противоопухолевых химиопрепаратов [111-113]. Перспективными синтетическими пептидами, обладающими иммуномодулирующими свойствами и оказывающими влияние на клеточный и гуморальный иммунитет, неспецифическую резистентность организма, являются вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly), полученные в Санкт-Петербургском институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН [10]. Исследование онкомодифицирующих свойств вилона и эпиталона, их влияния на ангиогенез и микроокружеиие экспериментально индуцированных опухолей позволит более глубоко понять механизмы действия пептидов как биологических модификаторов, способных активировать эндогенные противоопухолевые защитные механизмы.

Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение онкомодифицирующих свойств вилона и эпиталона, их влияния на ангиогенез и микроокружение экспериментально индуцированных опухолей у старых крыс.

Для достижения указанной цели были поставлены и последовательно решены следующие задачи:

1. изучить действие вилона на продолжительность жизни старых мышей -опухоленосителей эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис (KJLJ1);

2. определить способность вилона влиять на пролиферативную активность опухолевых клеток и уровень апоптоза в KJ1JT;

3. оценить эффекты действия вилона на KJ1JI при сочетанном применении с циклофосфаном;

4. изучить эффекты вилона при иммуносупрессорном действии опухоли на организм старых мышей;

5. исследовать влияние вилона и эпиталона на рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс и их онкомодифицирующее действие в условиях нарушенного ангиогенеза и пострадиационной гипоксии.

Научная новизна

В работе впервые получены новые данные о пролиферотропных и онкомодифицирующих свойствах синтетических пептидов - вилона и эпиталона, их влиянии на микроокружение экспериментально индуцированных опухолей и на продолжительность жизни старых животных - опухоленосителей. Установлены молекулярно-клеточные механизмы действия пептидов на пролиферацию эндотелиальных клеток, функциональное состояние иммунокомпетентных клеток и ангиогенез.

Практическая ценность работы

Полученные данные об ингибировании роста экспериментальных опухолей под действием пептидов, снижении иммуносупрессорного действия опухоли на организм под их влиянием, коррекции вилопом тимусзависимого иммунодефицита создают основу для дальнейшего изучения синтетических коротких пептидов, как естественных онкомодифицирующих факторов и разработки новых методов биотерапии опухолей в пожилом и старческом возрасте.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Синтетический пептид вилон оказывает онкомодифицирующее действие на рост эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис у старых мышей, при этом эффективность его действия на опухоль зависит от дозы и продолжительности применения.

2. Выявленное снижение иммуносупрессорного действия опухоли на организм старых животных и коррекция вилоном тимусзависимого иммунодефицита создают основу для изучения его применения в качестве стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных пожилого и старческого возраста иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.

3. При сочетанием применении вилона и циклофосфана тормозящее действие циклофосфана на рост опухолей менее выражено, чем при его изолированном применении и сопровождается повышением пролиферативной активности клеток нормальных тканей, что предполагает нецелесообразность одновременного применения вилона и цитостатических препаратов.

4. Действие вилона на рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухоли проявляется лишь после введения вилона в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции вилона в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияют на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия.

5. Синтетический пептид эпиталон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли - саркомы М-1 у старых крыс. По механизму действия исследованный препарат можно отнести к классу модификаторов биологических реакций, при этом эффект его действия реализуется через сосудистое русло опухолей.

6. Полученные данные свидетельствуют об актуальности дальнейших исследований по изучению синтетических коротких пептидов как естественных биологических модификаторов опухолевого роста в пожилом и старческом возрасте.

Апробация и реализация диссертации

Материалы диссертации доложены на конференции Белорусской Академии Наук, (Минск, 2003), на конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), 2-ом съезде геронтологов России (Москва, 2003), Международном экологическом форуме «Окружающая среда и здоровье человека» (Санкт-Петербург, 2003).

Результаты диссертации используются в научной, клинической и педагогической деятельности Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Минздрава РФ, НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования Минздрава РФ.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Связь с научно-исследовательской работой Института

Диссертация выполнена по основному плану научно-исследовательских работ Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, заключения, выводов и указателя литературы. Глава 1 (обзор литературы) представляет собой анализ современного состояния проблемы биорегуляции злокачественного роста, роли регуляторных пептидов в онкогенезе и коррекции иммунного статуса при опухолевом процессе. Глава 2 посвящена описанию материалов и методов, примененных в данном исследовании. Главы 3 и 4 являются изложением полученных экспериментальных данных и их обсуждением.

Заключение диссертации по теме «Геронтология и гериатрия», Барыкина, Ольга Павловна

ВЫВОДЫ

1. Синтетический пептид вилоп оказывает онкомодифицирующсе действие на рост эпителиоидной опухоли - карциномы легких Льюис у старых мышей. Эффективность действия вилона зависит от дозы и продолжительности его применения.

2. Морфологическим отражением модифицирующего действия вилона является усиление пролиферативной активности опухолевых клеток и снижение уровня апоптоза, индуцированного факторами физиологического стресса. Эффект вилона реализуется через функциональную активизацию эндотелия сосудистого русла новообразований и усиление ангиогенеза.

3. При сочетанием применении вилона и циклофосфана у старых мышей регистрируется двухфазный ответ опухолей на комбинированное воздействие препаратов. В первой фазе проявляется синхронизация ответа опухолей на тормозящее действие цитостатика с последующим ускорением роста новообразований и снижением продолжительности жизни животных. Эти данные свидетельствуют о нецелесообразности одновременного применения вилона и цитостатических препаратов.

4. Снижение иммуносупрессорного действия опухолей на организм и коррекция тимусзависимого иммунодефицита под действием вилона создают основу для применения вилона как стимулятора иммунной системы при лечении у онкологических больных иммунных нарушений, в том числе и в реабилитационный период после химиотерапии.

5. Действие вилона на рост саркомы М-1 у старых животных зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухоли проявляется лишь после введения вилона в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции вилона в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияют на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия.

6. Эпиталон достоверно замедляет рост солидной соединительнотканной опухоли -саркомы М-1 у старых крыс, при этом эффект его действия реализуется через сосудистое русло опухолей. Морфологическим отражением ингибирующего действия эпиталона является развитие геморрагического некроза опухолей.

7. Эпиталон снижает интенсивность проявления ранних лучевых реакций кожи у старых мышей с саркомой М-1, что свидетельствует о перспективности дальнейшего изучения его применения в качестве модификатора радиотерапии опухолей.

8. Проведенные исследования на двух моделях опухолей у старых животных показали разнонаправленные эффекты действия двух разных синтетических пептидов - вилона и эпиталона, что свидетельствует о разных механизмах их биологического действия.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Одним из направлений в развитии методов лечения злокачественных новообразований является комбинированная терапия с использованием основных радикальных методов воздействия: хирургическое лечение, лучевая терапия и химиотерапия. В конце XX века в клинической практике нашли реальное применение и методы биологической терапии, основанные на применении естественных для организма модификаторов клеточных реакций, повышающих иммунную защиту и снижающих токсическое воздействие используемых препаратов на здоровые ткани. В настоящее время биологическая терапия рассматривается как четвертая методика лечения опухолевой болезни [48, 112], основным направлением которой является уход от неспецифического воздействия на иммунные механизмы к применению биопрепаратов, которые способны активировать эндогенные защитные механизмы организма специфическим действием на иммунную систему [114].

Обращает внимание, что введение испытуемого препарата опухоленосителям снижает инфицирование слизистой оболочки желудка патогенной флорой у подопытных животных, оказывает позитивное воздействие на клеточную и внутриклеточную репарацию секреторных клеток и покровного эпителия этого органа и, что особенно примечательно, сохраняет и даже усиливает функциональную активность нейронов интрамуральных ганглиев. Есть все основания полагать, что стимулирующее действие вилона на иммунитет и резистентность организма реализуется через его влияние на Т-лимфоциты [10]. Согласно результатам наших исследований, введение вилона сопровождается цитологическими признаками активизации функциональной активности эпителиальных клеток, что может свидетельствовать о реализации некоторых эффектов этого препарата через эпителиальный компартмент вилочковой железы.

Общепризнанно, что тимус представляет собой лимфоэпителиальный орган, который специализирован исключительно на развитии Т-лимфоцитов и миелоидных элементов собственного микроокружения. Эпителиальные клетки тимуса является стабильной составляющей местного происхождения, а лимфоидные элементы являются транзиторными. Их предшественники мигрируют в тимус из костного мозга, а основная часть созревших Т-лимфоцитов эмигрируют в периферический отдел иммунной системы, где включаются в функциональный пул Т-клеток. Клеточные и гуморальные факторы микроокружения, создаваемого элементами стромы и эпителием вилочковой железы, воздействуют на предшественники Т-лимфоцитов и контролируют созревание Т-клеток, их дифференцировку на субпопуляции и селекцию клонов [26, 164]. Есть данные, что дополнительно к ключевой роли тимуса в регулировании иммунных функций, этот орган расширяет свое влияние и на неиммунологические компоненты организма, включая нейроэндокринную систему. Поэтому считается, что ранее начало инволюции тимуса может действовать как запускающее событие, которое инициирует постепенное ухудшение гомеостатического потенциала организма и ускоряет процесс старения [74, 82, 100]. Эндокринология тимуса характеризуется действием многих гормонов и гормоноподобных веществ на клеточные компоненты тимуса, включая тимоциты, эпителиальные клетки и клетки стромы. Внутритимусное микроокружение характеризуется комплексной сетью паракринных, аутокринных и эндокринных сигналов, включая интерлейкины и пептиды тимуса. С возрастом и клеточным иммунным старением эти эндокринные влияния снижаются, что способствует развитию болезней и канцерогенезу [79, 87]. Инволюцию тимуса у млекопитающих считают одним из ведущих регуляторов старения. Экспериментальные данные показывают, что инволюцию тимуса и снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов можно частично восстановить путем трансплантации ткани тимуса или введением тимусных гормонов [36].

Полученные нами данные о стимулирующем влиянии вилона на репаративные процессы в тимусе в условиях острой акцидентальной инволюции при опухолевом росте предполагают перспективность применения этого синтетического пептида в гериатрии.

Согласно результатам морфо-кинетических исследований вилон оказывает неоднозначное действие на рост имплантированной эпителиоидной опухоли. При этом онкомодулирующее действие этого препарата зависит от дозы и продолжительности его применения. Введение вилона в разовых дозах 2 мкг/мышь в период активной фазы роста карциномы легких Льюис практически не влияло на ее кинетические параметры, но достоверно увеличило продолжительность жизни животных. Однако, как и при изучении действия вилона на соединительно-тканную опухоль - саркому М-1, обнаружено, что при больших дозах вилон активизирует ангиогенез и ускоряет рост новообразований. Примечательно, что стимулирующий эффект фармакологических доз вилона на рост карциномы регистрируется даже при совместном применении этого препарата с цитостатиком. Стимуляцию опухолевого роста и снижение токсико-дистрофических изменений в цитоплазме опухолевых клеток, вызванных действием циклофосфана, по-видимому, можно объяснить своеобразным «трофическим и антигипоксическим» действием вилона, который реализуется путем функциональной активизации эндотелия сосудистого русла новообразований. Этим можно объяснить и двухфазный характер ответа опухолей на совместное применение двух совершенно разных по механизму действия препаратов. Очевидно, что «синхронизация» ответа опухолей на циклофосфан в первой фазе обусловлена активирующим действием вилона на микроциркуляторное русло опухолей, снижением факторов действия физиологического стресса и улучшением доставки цитостатика в паренхиму новообразований.

Возвращаясь к вопросу о факторах физиологического стресса, необходимо отметить, что уникальная физиология солидных опухолей, обусловленная неполноценностью ангиогенеза, создает специфические условия для устойчивости к лучевой терапии и противоопухолевым химиопрепаратам [41, 163], а также для формирования стрессорного ответа опухолевых клеток, обычно регулируемого глюкозой. Есть данные, что именно стрессорный ответ ведет к индукции множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Кроме того, низкий уровень содержания кислорода, низкий внеклеточный рН, высокое содержания лактата и низкий уровень глюкозы в массе солидных опухолей являются факторами, оказывающими существенное влияние на отбор злокачественных фенотипов с потенциалом к метастазированию. Гипоксия может индуцировать точковые мутации и разрывы нитей ДНК, усиливая эпигенетическую и геномную нестабильность, обеспечивать физиологические условия для отбора клеток путем амплификации генов и усиления экспрессии продуктов, вовлеченных в метастатический каскад [143] и вести к злокачественной прогрессии с потерей чувствительности к индукции апоптоза [88]. Гибель клеток по механизму апоптоза рассматривают и как специфическую реакцию на физиологические и патологические стрессы, которые разрушают сбалансированные темпы пролиферации и элиминации клеток [15, 57]. В условиях противоопухолевой терапии апоптоз выступает как один из ведущих факторов, определяющих эффективность лечения [57, 102, 117].

Одним из актуальных направлений мультимодальной терапии рака является поиск агентов, обладающих способностью повышать эффективность цитостатической терапии [20] и в этом плане зарегистрированный «синхронизирующий» эффект вилона еще предстоит осмыслить. Однако следует учитывать и то, что во второй фазе стимулирующее и детоксикогенное влияние вилона начинает превалировать над действием цитотоксического препарата, что, в свою очередь, сопровождается ускорением роста опухолей.

Считаем необходимым специально подчеркнуть детоксикационное, ангиогенное и стимулирующее действие вилона, в том числе, и на соединительно-тканные клетки периваскулярной стромы, в частности фибробласты, играющие ключевую роль в процессах заживления ран. Стимуляция ангиогенеза играет особо важную роль в разработке эффективных методов лечения при заживлении ран и коллатеризации сосудистого русла при ишемических состояниях [55, 73]. Современные ангиогенные терапевтические стратегии включают не только подавление аберрантного ангиогенеза, который наблюдается в опухолях, но и его активизацию в условиях ишемии.

Стимулирующее действие вилона на ангиогенез в фармакологических дозах может найти применение для коррекции нарушенной гемодинамики, ускорения заживления ран и трофических расстройств. Не исключено, что восстановление тока крови в зоны ишемии путем стимуляции ангиогенеза может дать эффект «биологического шунтирования» при лечении сердечно-сосудистых заболеваний.

В заключение следует подчеркнуть также следующее положение. В последние годы теоретические представления, что дефицит в иммунных функциях организма способствует опухолевому росту, получили экспериментальное подтверждение открытием различных биохимических дефектов в Т-лимфоцитах, которые инфильтрируют злокачественные новообразования, но лишены функции цитотоксического действия на опухолевые клетки. Снижение экспрессии некоторых факторов, включенных в сигнальную транедукцию Т-клеток, позволяет опухолям избегать иммунного надзора. Предполагается, что реверсирование этих дефектов в эффекторной функции цитотоксических Т-лимфоцитов потенциально позволило бы проводить успешную иммунотерапию опухолей [139].

Использованная в данной работе в качестве экспериментальной модели опухолевого роста карцинома легких Льюис обладает выраженным иммуносупрессорным действием на организм. В настоящее время механизмы иммунодепрессивного действия, которые сопровождаются акцидептальной инволюцией тимуса хорошо изучены [80, 81, 96, 97]. Установлено, что прогрессивный рост карциномы легких Лыоис вызывает кроветворные изменения в виде анемии и нейтрофилии [81], что приводит к конкурентной стимуляции миелопоэза и появлению иммуносупрессорных CD34+ клеток костного мозга, обладающих естественной супрессорной активностью против цитотоксических Т лимфоцитов [72, 173,174].

Следует особо отметить, что зарегистрированные нами в этих условиях морфологические признаки стимуляции иммунной системы, снижение иммуносупрессорного действия карциномы на организм и замедление процесса гипоплазии тимуса свидетельствуют о специфической иммуномодулирующей роли вилона в активации иммунологической реактивности организма и перспективности его применения в комплексных методах биологической терапии опухолей

Основной задачей при создании новых противоопухолевых препаратов является получение веществ, которые могут избирательно угнетать пролиферацию и/или усиливать гибель опухолевых клеток, минимально повреждая нормальные клетки и здоровые ткани организма. Большинство существующих химиотерапевтических препаратов такой избирательностью не обладают [153]. Кроме того, существуют злокачественные опухоли, малочувствительные или нечувствительные к химиотерапии [24]. Поэтому в последние годы большие надежды возлагают на модификаторы биологических реакций, способные активировать эндогенные защитные механизмы.

Результаты комплексного морфо-кинетического исследования показали, что пептид эпифиза эпиталон обладает ингибирующим действием на рост саркомы М-1 с сохранением эффекта в течение около 2 недель после окончания курса введения препарата. По показателям пролиферативной активности, объективно регистрируемое замедление экспансии не связано с прямым цитостатическим действием этого препарата на опухолевые клетки. Морфологические признаки развития геморрагического некроза опухолей свидетельствуют о специфическом механизме действия, реализующимся через микроциркуляторное русло. Следует отметить, что сосудистое русло злокачественных новообразований является важным структурно-функциональным компонентом, который в значительной мере определяет характер роста и эффективность лечения опухолей [8]. Известно, что эндотелий сосудов опухолей весьма чувствителен к действию различных повреждающих агентов и оптимизация некоторых методов лечения зависит от возможности дополнительно воздействовать на стромальные и сосудистые компоненты опухоли с целью эффективного подавления ее роста и разрушения.

Не исключено, что в «пусковой механизм» сосудисто-стромальных изменений в опухолях, регистрируемых после введения эпиталона, вовлечены вазоактивные медиаторы и, следует полагать, прежде всего, биологически активный амин — серотонин. Ранее проведенные исследования [106] показали, что эпиталон оказывает модулирующее действие на синтез серотонина в энтерохромаффинных клетках основных депо его содержания в организме. Однако по условиям проведения тех экспериментов (пролонгированное введение препарата), дать количественную оценку влияния эпиталона на секреторную фазу деятельности ЕС клеток было практически невозможно. Биологические процессы синтеза и секреции являются взаимосвязанной системой событий, однако их выраженность определяется не только прямым действием исследуемых субстанций на рецепторный аппарат клетки, но и компенсаторно-адаптационным ответом системной реакции организма в целом. В связи с этим, для изучения механизма каскадных реакций, определяющих конечный эффект, считаем целесообразным рекомендовать провести фундаментальные исследования испытуемых препаратов в «острых опытах».

В основе физиологических процессов лежит координированное, функциональное взаимодействие регуляторных систем, основанное на химической общности восприятия и передачи информации. Согласно современным представлениям, в интеграции адаптационных механизмов ключевая роль принадлежит регуляторным пептидам и биогенным аминам, выполняющим функции посредников химической информации в качестве нейротрансмиттеров, гормонов, иммуно- и цитокиномодуляторов. Изучение функциональной морфологии клеток, продуцирующих эти физиологически активные соединения, в ранние сроки после введения фармакологических доз препаратов позволит проследить основные закономерности развития компенсаторно-приспособительной реакции организма. На базе таких исследований можно спрогнозировать, а затем верифицировать возможность и целесообразность применения испытуемых препаратов для лечения той или иной патологии.

По данным комплексного анализа, на фоне выраженных радиационных эффектов терапевтическое действие эпиталона практически полностью нивелируется. По-видимому, в условиях радиационного повреждения сосудистой сети, подавленной неоваскуляризации и развития гипоксии в опухолях отсутствует структурно-функциональная основа для проявления действия испытуемого препарата.

Общепризнанно, что состояние кровоснабжения опухолей является одним из основных факторов, определяющих уровень оксигенации и, следовательно, радиочувствительности опухолевых клеток. Судя по механизму действия, эпиталон, усиливая некроз паренхимы опухолей, создает предпосылки для повышения фракции гипоксических клеток, являющихся, как известно, наиболее резистентными к лучевой терапии. Поэтому, использовать этот препарат в традиционных схемах радиотерапии злокачественных новообразований, на наш взгляд, неоправданно. Однако следует обратить внимание на некоторые способы повышения эффективности радиационного воздействия на опухоли при сочетании облучения и ингибировании кровотока. Так, при сочетании облучения с последующей гипергликемией эффект может был усилен введением мексамина, причем чем сильнее было угнетено кровоснабжение в опухоли, тем большего противоопухолевого эффекта можно достичь [172]. Современные методы планирования и проведения лучевой терапии, применение радиомодификаторов и защита нормальных тканей позволяют свести к минимуму возможное развитие лучевых повреждений. Тем не менее, для некоторых радиорезистентных опухолей суммарная очаговая доза при использовании схем динамического фракционирования достигает 80 Гр. При таких дозах возникает реальная опасность превышения толерантности нормальных тканей и развития ранних и отдаленных лучевых осложнений. Поэтому по-прежнему актуальны вопросы разработки эффективных методов их профилактики и лечения.

Мы не случайно обратили внимание на снижение выраженности лучевого дерматита в группе животных, леченых эпиталоном. Известно, что в патогенезе ранних лучевых реакций ведущим является острое нарушение гемодинамики в здоровых тканях, преимущественно функционального характера [6, 8]. Несмотря на некоторую субъективность визуальной оценки радиационной травмы по кожным лучевым реакциям, отмеченная тенденция к снижению остроты их проявления свидетельствует о перспективности испытания этого пептида как модификатора биологических реакций для коррекции воспалительных процессов.

Результаты кинетических и морфофункциональных исследований свидетельствуют о том, что пептид вилочковой железы вилон оказывает неоднозначное действие на рост имплантированной соединительнотканной опухоли. Проявление его эффекта зависит от вводимой дозы и стадии развития опухоли. Объективно регистрируемый эффект ингибирования роста опухоли проявился лишь после введения этого препарата в достаточно малых дозах в латентном периоде формирования новообразования. Инъекции препарата в аналогичных дозах в период активной фазы роста опухоли практически не влияли на ее кинетические параметры. Увеличение разовой дозы исследуемого препарата до 5,0 мкг может сопровождаться как усилением, так и инвертированием ингибирующего действия. Результаты морфофункционального анализа свидетельствуют, что после пролонгированного введения вилона в больших дозах основные события развертываются в периваскулярной строме и связаны с активизацией ангиогенеза. В этих условиях поддержание клеточного баланса в опухоли будет, по-видимому, определяться соотношением усиленной пролиферации опухолевых клеток и их индуцированной гибели. Результаты количественного анализа свидетельствуют, что уровень апоптоза опухолевых клеток после инъекций вилона во всех экспериментальных группах выше, чем в контрольной группе животных. При этом обращает внимание активизация стромальных клеток микроокружения - тучных клеток, гранулоцитов и моноцитов. Не исключено, что полученный положительный эффект вилона может еще более усиливаться в условиях терапевтических мероприятий, направленных на ингибирование ангиогенеза в опухолях. Вместе с тем, не вызывает сомнения актуальность дальнейшего изучения вилона, как препарата, оказывающего стимулирующее действие на пролиферацию эндотелиальных клеток и ангиогенез. Последнее может найти применение для коррекции нарушенной гемодинамики, ускорения заживления вяло текущих ран и трофических расстройств.

Полученные нами результаты микроскопического исследования свидетельствуют о формировании в паренхиме опухолей животных, леченых эпиталоном, как морфологических проявлений геморрагического некроза, так и усиление апоптоза опухолевых клеток. Можно было бы попытаться объяснить увеличение апоптотической гибели опухолевых клеток за счет нарастающей гипоксии. Между тем, существуют веские иммуногиетохимические доказательства, что в зонах гипоксии пролиферативный потенциал опухолевых клеток снижается. Иммуноокрашивание ядер клеток на PCNA в зоне локализации маркера гипоксии CCI-103F проявляется слабее, либо поля гипоксии и активной пролиферации клеток не перекрываются. Количественный анализ свидетельствует об отрицательной корреляционной связи между связыванием гипоксического маркера пимонидазола и иммунолокализацией PCNA [140,143]. В данной работе определение пролиферативной активности и апоптотической гибели опухолевых клеток было проведено на серийных гистологических срезах. Если бы зарегистрированная нами индукция апоптоза была обусловлена только гипоксией, то и пролиферативная активность опухолевых клеток также должна была существенно снизиться. Однако полученные данные не подтверждают это предположение. Анализ литературы по этому вопросу позволяет предположить, что эпиталон может модулировать функциональную активность клеток, продуцирующих факторы инициации апоптоза.

Таким образом, совокупность результатов проведенных исследований показала, что регистрируемый после введения эпиталона эффект торможения роста саркомы М-1 обусловлен развитием геморрагического некроза и усилением апоптоза опухолевых клеток. По показателям пролиферативной активности замедление роста опухолей не было связано с прямым цитостатическим действием этого препарата на опухолевые клетки. Морфологические признаки свидетельствуют о специфическом механизме действия, который реализуется через сосудистое русло опухолей. Полученные данных и анализ литературы позволяют предположить, что регистрируемый после введения эпиталона эффект развития геморрагического некроза саркомы М-1 обусловлен комплексным действием ряда перечисленных выше факторов и реализуется через микроциркуляторное русло опухолей. По-видимому, в механизме запуска сосудистой реакции определенную роль могут играть тучные клетки и экспрессия в них серотонина. Полученные данные об усилении индуцированной гибели опухолевых клеток после введения эпиталона свидетельствуют о принципиальной возможности применения этого пептида в качестве потенциального противоопухолевого препарата, особенно в пожилом и старческом возрасте.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Барыкина, Ольга Павловна, 2004 год

1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. -М.: Медицина, 1990.-384с.

2. Бобро Л.И. Особенности тучноклеточной реакции в динамике развития опухолей молочных желез у крыс, индуцированных 9,10-диметил-1,2-бензантраценом // Онкология,- Киев, 1974.- Вып. 6.- С. 23-29.

3. Забежипский М.А., Коваленко А.Л., Кветной И.М., Южаков В.В. и др. Влияние циклоферона на метастазирование карциномы легких Льюис у мышей и рабдомиосаркомы РА-23 у крыс. Вопросы онкологии. 1 999.- Т. 45, № 6.- С. 650-654.

4. Кветной И.М., Южаков В.В. Окрашивание ткани эндокринных желез и элементов АПУД-системы // Микроскопическая техника: Руководство / Ред.: Д.С.Саркисов, Ю.Л.Перов.- М., Медицина, 1996.- С. 375 418.

5. Киселева Е.П., Огурцов Р.П., Попова О.Я., Фрейдлин И.С., Малинин В.В., Хавипсоп В.Х. Сравнительная характеристика двух пептидных иммуномодуляторов // Иммунология.- 1999.- № 2.- С. 23-26.

6. Лопунова Ж.К. Характеристика тучных клеток дермы крысы при развитии в ней опухолевого роста // Морфология, клиника, диагностика и лечение предопухолевых процессов и опухолей.- Краснодар, 1981,- С. 112-114.

7. Мамаев Н.Н., Мамаева С.Е., Либуркина И.Л., Козлова Т.В., Медведева Н.В., Макаркина Г.Н. Активность ядрышковых организаторов нормальных илейкозных клеток костного мозга человека // Цитология.- 1984.- Т. 26, №1.- С. 46-51.

8. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики.- СПб.: Наука, 2000.- 158 с.

9. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы: Пер. с англ.- М.: Мир, 1987.- 74с.

10. Потапов Ю.Н., Халеев Д.В., Крутова Т.В. Морфофункциональная оценка иммуномодулирующего действия нитрозометилмочевины // Эксперим. и клин, фармакол.- 1995.- Т. 58, № 3.- С. 48-50.

11. Райхлин Н.Т.,Смирнова Е.А., Перевощиков А.Г. Апоптоз и его роль в механизмах регуляции роста опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью// Арх.пат.-1996.-Т.58, вып. 4.-С.22-28.

12. Сопоцинская Е.Б., Лисняк И.А., Балицкий К.П. Влияние воздействий, ингибирующих неоваскуляризацию, на метастазирование карциномы легких Льюис // Эксперим. онкология.- 1985.- Т. 7, № 5,- С. 68-71.

13. Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Чалисова Н.И., Григорьев Е.И. Тканеспецифическое действие пептидов в культуре тканей крыс разного возраста//Усп.геронтологии -2002.-Вып.9.- С.95-100.

14. Цыплаков Д.Э., Зиганшина Л.Е. Роль микроциркуляторных факторов в метастазировании рака// Вопросы онкологии.- 1988.- Т. 34, № 8.- С. 932- 936.

15. Чердынцева Н.В., Литвяков Н.В., Смольянинов Е.С., Белявчкая В.А., Масычева В.И. Модуляция противоопухолевой активности циклофосфана2124,25,26,27.